铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法
技术领域
[0001] 本
发明属于临床医学技术领域，尤其涉及一种铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法。
背景技术
[0002] 喉癌是
耳鼻喉外科常见
恶性肿瘤之一，尽管近年来恶性肿瘤的
治疗取得了重大的进展，但喉癌患者的术后复发问题及术后喉部功能下降仍然是喉癌的治疗
瓶颈，以手术为主的综合治疗是喉癌主要治疗模式。近年来伴随功能性喉癌外科手术概念的提出，喉癌的手术
切除范围有缩小趋势，术前术后的
放化疗对于减少手术切除范围及
预防术后复发的作用越来越突出，
放射治疗对局部组织及周围器官损伤较大，术前应用常引起局部的组织粘连、
纤维化及瘢痕化等，造成组织层次不清，加大手术难度，术前化疗能够有效的减少局部肿瘤的浸润程度，对微转移灶起到良好的杀伤作用，对局部的组织结构影响较小，而研究显示，术后的规律化疗也能明显延长患者的生存期。顺铂是临床常用的
化疗药物，在喉癌化疗中可以单独用药或者联合用药，虽然多数喉癌对顺铂敏感，但是全身化疗的严重的
副作用不可避免，同手术常构成对患者的双重打击，甚至部分体质较差的患者难以耐受足够
疗程的化疗，进而影响术后的生存时间，因此，减少化疗药物的毒副作用而增强化疗效果已经成为喉癌综合治疗中亟待解决的问题。
[0003] 伴随
纳米技术的发展，
纳米材料在医疗领域的应用取得了快速发展，纳米材料荷载药物对
疾病进行治疗取得了重大进展。纳米材料荷载药物后，能够在靶器官持续释放，维持靶器官部位足够的药物浓度，能够取得优于传统药物的治疗效果，铁碳纳米微粒是纳米材料的一种，铁碳纳米粒中纳米铁具有较强的
磁性及靶向性，碳
纳米晶的
比表面积大，具有极好的活性
吸附作用，能以足够小的粒子吸附大量药物，是一种较为理想的磁性纳米材料药物载体。可以搭载各种化疗药物，并获得理想的载药率。Rudge等制备出的铁碳复合纳米微粒可吸附包括阿霉素在内的多种化疗药物，其对载药率可达到120μg/mg，3h
解吸附率约为25％，能够在短时间能释放足够的药物浓度。黄广建等采用
活性炭与纳米四
氧化三铁制成铁碳复合磁性材料磁性载体搭载阿霉素，最大载药量可233.8mg/g，并且具有良好的释放效能及磁靶向性。Cao H等对包碳和包
硅的两种磁性载体与铁碳复合纳米微粒对阿霉素的吸附率和饱和磁强度对比发现，铁碳复合磁性载体粒径较均匀、饱和磁化强度较大、最大载药量也较高。众多的研究结果都表明，同其它纳米粒相比，铁碳纳米颗粒的磁响应性更高，载药量更大，其搭载药物更为稳定，在荷载阿霉素、卡铂等化疗药物对体外培养的肝癌细胞等恶性肿瘤细胞的干预试验表明，其对肿瘤细胞的杀伤及抑制效果优于其所荷载的单药，能够取得更好的效果。而且，铁碳纳米材料独特的热效应，也为其对恶性肿瘤的治疗提供的更为优良的特性。
[0004] 目前纳米材料介导化疗药物对喉癌细胞的杀伤作用国内外尚未见研究，磁性的铁碳纳米材料搭载顺铂的工艺国内外也未见报道。
[0005] 喉癌是临床常见恶性肿瘤，临床多采用以手术为主的综合治疗手段，但喉癌术后的并发症较多，如：咽瘘，言语障碍(严重声嘶或失声)，呼吸困难，喉狭窄致长期戴管或气管造瘘等等，严重影响患者
生活质量，且术后复发率较高；放疗和化疗不破坏喉部的解剖结构，可避免一些并发症。但喉癌放疗及化疗敏感性较差。
发明内容
[0006] 本发明
实施例的目的在于提供一种铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法，旨在解决目前纳米材料介导化疗药物对喉癌细胞的杀伤作用国内外尚未见研究，磁性的铁碳纳米材料搭载顺铂的工艺国内外也未见报道 的问题。
[0007] 本发明实施例是这样实现的，一种铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法，该铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法实现铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep-2细胞微观结够、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3 mRNA表达的影响，具体包括：
[0008] 步骤一，喉癌Hep-2细胞培养及传代：
[0009] 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min，佩戴
护目镜及防冻手套，从液氮保存罐中取出快速取出冻存管，放入4℃无菌蒸馏
水中水浴，快速摇晃，直至冻存液完全融化后置入4℃10％二甲基亚砜；应用移液器将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入10ml培养液，离心机1000r/min离心5min，分离喉癌细胞，0.25％胰蛋白酶恒温水浴箱预热20min，保持37℃，培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，培养于含100ml/L胎
牛血清、青霉素及
链霉素各100u/L的1640培养液中，37℃、体积分数为5％的CO2
培养箱传代培养，次日更换培养液；记录复苏日期，观察细胞生长情况；
[0010] 步骤二，培养喉癌细胞分为药物组、微粒药物组、空白组和空白微球组，各组加入相应的处理液；药物组的处理液为顺铂0.9％生理盐水溶液，微粒药物组为铁碳纳米粒顺铂0.9％生理盐水分散液，空白组是0.9％生理盐水，空白微球组是铁碳纳米微粒0.9％生理盐水分散液；
[0011] 步骤三，喉癌细胞生长抑制率检测：
[0012] 细胞传代至10-16代，选取对数生长期的喉癌Hep-2细胞，制成细胞浓度为3
4×10/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1ml，37℃、5％CO2培养，培养24h待细胞贴壁、进入对数生长期后，用无血清的RPMI-1640培养液清洗两次，换液；每孔加入90μml培养液和100μml处理液；药物组及微粒组最终浓度梯度为10、20、40、80、160mg/L，每亚组设5个平行孔；37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱培养，24、48、72h后，吸除各孔原液，每孔加入
100μlMTT液(5g/L)和900μl培养液，继续37℃、饱和湿度、5％CO2培养4h，吸除各孔原液900μl，每孔加 入900μl二甲基亚矾，振荡混匀30min，自动酶标读数仪测定570nm各孔A值；抑制率(fa)＝(1-实验组平均A值/空白组平均A值)×100％；
[0013] 步骤四，铁碳纳米粒顺铂抑制喉癌细胞形态学观察：
[0014] 将各组培养细胞浓度调整为透射电镜观察细胞在加药后的内在结构变化；扫描电镜观察细胞在加药后的表面形态变化及内部结构变化，重点在细胞膜形态及细胞核形态；
[0015] 步骤五，铁碳纳米粒顺铂对喉癌细胞caspase3mRNA、Survivin mRNA表达影响，具体包括以下步骤：
[0016] 第一步，总RNA提取：
[0017] 取各组细胞培养液加入1.5mlEP管中，加入Trizol 1ml，使细胞浓度为1×107/ml/Trizol，用玻璃棒
研磨，充分振荡混匀，加入氯仿0.2ml，盖紧
盖子，轻轻摇动15s，15-30℃孵育2-3min，低温离心机4℃12000r/min离心15min，取上清液至新的1.5mL Eppendorf管，加与上清液等体积的异丙醇，15-30℃孵育样品10min，4℃12000r/min离心10min，弃去上清液，保留总RNA在管底的白色沉淀，沉淀采用75％
乙醇1.0ml洗涤洗涤三次，1ml 75％乙醇/ml Trizol，4℃7500r/min离心5min，弃去上清液，沉淀
真空干燥
5-10min，保持适当湿度，以增加
溶解度，加DEPC处理水溶解RNA，加入2.5倍体积75％乙醇，-80℃保存备用；
[0018] 第二步，mRNA提取：总RNA标本解融后，取上述提取的总RNA到一个新的无RNase的EP管中，用无RNase的水定容到250ul，使RNA处于过饱和状态，加入Buffer OBB 250ul，Oligotex Suspension 15ul，用手弹匀，70℃水浴3分钟，RNA
退火，裂解RNA二级结构，室温条件下，静置10分钟，4℃12000r/min离心2分钟，小心吸走上清，A液，用Buffer OW2400ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟后将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液；将SPIN柱子移到一个新的EP管上， 加20-100ul热的(70℃)Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟后转入新的无RNase的EP管中，加入等体积异丙醇，4℃12000r/min离心2分钟，弃去上清，沉淀加入75％乙醇，室温干燥，融于250ul无RNase的EP管中，备用；
[0019] 第三步，mRNA引物合成：
[0020] 在GenBank上查找目的基因mRNA序列，采用Primer express 2.0
软件在CDS区设计特异性引物，采用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成引物，序列如下：
[0021] Survivin序列(扩增
片段AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，长度129bp)[0022] Forward primer：5’-AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3’
[0023] Reverse primer：5’-GAC AAC TGC GTC TCTG-3
[0024] Caspase3序列(扩增片段，长度101bp)
[0025] Forward Primer：5’-AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3’
[0026] Reverse Primer：5’-TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3’
[0027] 第四步，逆转录：
[0028] 取4μl RNA模板做逆转录反应，仪器为ABI 9700仪，反应体系[5×逆转录buffer 4μl，下游引物(10pmol/μl)0.4μl，dNTPs(10mM)0.5μl，MMLV(200U/μl)1μl，DEPC水10.1μl，RNA模板；
[0029] 4μl，总体积20μl，逆转录buffer成分(50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，4mM MgCl2，10mM DTT)；
[0031] 采用标准曲线定量法制备阳性标准品，PCR扩增的阳性产物经过2％低熔点琼脂糖凝胶
电泳，含溴乙啶，用TAE缓冲液配制，在长波紫外下，割下目的条带；用回收
试剂盒回收纯化；测定OD值检验纯度，OD 260/280＞1.8，用OD260测定值和片段长度数据换算出浓度，即为阳性标准品；取阳性标准品5μl按10倍稀释，加水45μl并充分混匀，依次倍比梯度稀释，制备成阳性定量标 准品梯度；然后待测样本和阳性标准品PCR反应，反应条件93℃3分钟，然后93℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共40循环；反应体系[5×SYBR Green I PCR buffer10μl，上游引物F(10pmol/μl)1μl下游引物R(10pmol/μl)1μl，dNTPs(10mM)1μl，Taq酶 (3U/μl)1μl，cDNA5μl，ddH2O 31μl，总 体 积 50μl，PCR buffer成分：10mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，2mM MgCl2]；
[0032] 第六步，标准曲线的制备：
[0033] 标准品以去离子水依次稀释为4×102，4×103，4×104，4×105，4×106；每次扩增2 6
均使用标准品制备标准曲线，范围为每毫升10-10；拷贝；
[0034] 第七步，PCR产物定量的校正和判定分析：
[0035] 采用GAPDH作为内参照，Survivin mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数；用GAPDH的拷贝数作为校正基数，即目的基因mRNA精确含量＝目的基因CT值/内参照GAPDH CT值；以此比值做统计处理；根据FQ-PCR原理，被激发的荧光
信号达到一定
阈值后被荧光
探头采集，最后将其转换成CT值，该数值与扩增片段的实际拷贝数呈反比，即CT值越低，实际拷贝数含量越高。
[0036] 进一步，实现铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep-2细胞微观结够、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3 mRNA表达的影响之前需要进行以下步骤：
[0037] 步骤一，应用
电子天平称量四氧化三铁及
石墨粉；采用高能球磨技术制备铁碳纳米粒，球磨结束后用蒸馏水洗涤球磨罐，
磁铁吸附含铁微粒，所获洗涤液真空烘干待用，得到干燥铁碳纳米微粒；
[0038] 步骤二，采用超声乳化-
溶剂挥发法制备磁性铁碳纳米粒顺铂；将铁碳纳米粒和顺铂溶解在二氯甲烷中，超声乳化后所得混悬液置于磁铁上，洗涤，离心，并将所得沉淀物
冷冻干燥、真空干燥、照射灭菌，即得磁性铁碳纳米粒顺铂；
[0039] 步骤三，碳纳米粒顺铂载药量、包封率、磁性、
稳定性及释放性能考察。
[0040] 进一步，在步骤三中载药量及包封率考察：称取贴碳纳米微粒顺铂20mg于 10ml容量瓶中，20℃加入二甲基亚砜，超声水浴使其完全溶解，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀、过滤，采用分管光度计测定吸光度，并计算顺铂浓度及质量，取过滤液超低温20000r/min离心60min，使顺铂完全沉积于管底，获得澄清的游离顺铂溶液；采用分光光度计测定其吸光度，据标标准曲线公式求出其游离顺铂的浓度并计算质量；将顺铂总量减去离心后游离顺铂量，即得顺铂吸附量，据此做出计算载药量及包封率：
[0041]
[0042]
[0043] 进一步，在步骤三中磁性测定：
[0044] 称取纳米微球，通过VSM绘制纳米微粒的
磁滞曲线，外
磁场的磁场强度用横坐标表示，外磁场的方向用正负号表示，纵坐标表示磁场强度下样品的磁化强度，验证纳米粒的磁性。
[0045] 进一步，在步骤三中体外释放性能测定：
[0046] 称取适量铁碳纳米粒顺铂，悬浮于10ml PH7.4的
磷酸盐缓冲液中，0.02％Tween80温润剂，0.02％NaN3
抑菌剂，37℃水浴恒温条件下，
频率为100次/min
振荡器上振荡；设定时间梯度，在各设定时间点取出铁碳纳米粒分散液，12000r/min离心10min，除去上清液，剩余微球用二甲基亚砜完全溶解，1000r/min离心2min后，取上清液测定吸光度，计算铁碳纳米微球的顺铂体外释放性能。
[0047] 进一步，在步骤三中磁性纳米微球保存期间的稳定性试验：
[0048] 将当日制备的磁性铁碳纳米微球冻干粉，置于4℃保存，于0、1、2、3个月后取样，采用激光粒径仪检测铁碳纳米粒顺铂的粒径变化。
[0049] 本发明提供的铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法，首次将纳米材料搭载药物引入到喉癌细胞的抑制及杀伤领域，通过铁碳纳米粒顺铂对喉癌细胞的干预，观察其对喉癌细胞的微观结构及肿瘤治疗过程中起决 定性作用的细胞凋亡因子Caspase3及Survivin的表达影响，在分子
生物学水平对喉癌细胞的凋亡进行探讨。本发明首次采用磁性纳米材料搭载顺铂，提供具有较强磁性及靶向性的化疗药物，应用于临床后，能够提高喉癌术前化疗效果，为功能性喉癌根治提供必要的、高效的化疗药物，同时能够应用于术后化疗，减少化疗药物的毒副作用，铁碳纳米材料良好的载药量、稳定的释放率及较强的靶向性也预示其能够在喉癌的临床推广应用后发挥重要的作用。
附图说明
[0050] 图1是本发明实施例提供的铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法
流程图。
具体实施方式
[0051] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0052] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0053] 如图1所示，本发明实施例的铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞株化疗敏感性影响的方法包括以下步骤：
[0054] S101：应用电子天平称量四氧化三铁及石墨粉；采用高能球磨技术制备铁碳纳米粒，球磨结束后用蒸馏水洗涤球磨罐，磁铁吸附含铁微粒，所获洗涤液真空烘干待用，得到干燥铁碳纳米微粒；
[0055] S102：采用超声乳化-溶剂挥发法制备磁性铁碳纳米粒顺铂；将铁碳纳米粒和顺铂溶解在二氯甲烷中，超声乳化后所得混悬液置于磁铁上，洗涤，离心，并将所得沉淀物冷冻干燥、真空干燥、照射灭菌，即得磁性铁碳纳米粒顺铂；
[0056] S103：碳纳米粒顺铂载药量、包封率、磁性、稳定性及释放性能考察：
[0057] S104：铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep-2细胞微观结够、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3 mRNA表达的影响。
[0058] 在步骤S103中，具体的方法：
[0059] 载药量及包封率考察：精密称取贴碳纳米微粒顺铂20mg于10ml容量瓶中，室温下(20℃)加入一定量二甲基亚砜，超声水浴使其完全溶解，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀、过滤，采用分管光度计测定其吸光度，并计算顺铂浓度及质量，取过滤液超低温20000r/min离心60min，使顺铂完全沉积于管底，获得澄清的游离顺铂溶液；采用分光光度计测定其吸光度，据标标准曲线公式求出其游离顺铂的浓度并计算质量；将顺铂总量减去离心后游离顺铂量，即得顺铂吸附量，据此做出计算载药量及包封率：
[0060]
[0061]
[0062] 磁性测定：
[0063] 精密称取适量纳米微球，通过VSM(vibrating sample magnetometer)绘制纳米微粒的磁滞曲线，外磁场的磁场强度用横坐标表示，外磁场的方向用正负号表示，纵坐标表示磁场强度下样品的磁化强度，验证纳米粒的磁性；
[0064] 体外释放性能测定：
[0065] 精密称取适量铁碳纳米粒顺铂，悬浮于10ml PH7.4的磷酸盐缓冲液中[内含0.02％Tween20(吸附
抑制剂)，0.02％Tween80(温润剂)，0.02％NaN3(抑菌剂)]，37℃水浴恒温条件下，频率为100次/min振荡器上振荡；设定时间梯度，在各设定时间点取出铁碳纳米粒分散液，12000r/min离心10min，除去上清液，剩余微球用二甲基亚砜完全溶解，
1000r/min离心2min后，取上清液测定吸光度，计算铁碳纳米微球的顺铂体外释放性能；
[0066] 磁性纳米微球保存期间的稳定性试验：
[0067] 将当日制备的磁性铁碳纳米微球冻干粉，置于4℃保存，于0、1、2、3个月后取样，采用激光粒径仪检测铁碳纳米粒顺铂的粒径变化。
[0068] 在步骤S104中，，具体包括：
[0069] 步骤一，喉癌Hep-2细胞培养及传代：
[0070] 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min，佩戴护目镜及防冻手套，从液氮保存罐中取出快速取出冻存管，立即放入4℃无菌蒸馏水中水浴，快速摇晃，直至冻存液完全融化后置入4℃10％二甲基亚砜；应用移液器将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入10ml培养液，离心机1000r/min离心5min，分离喉癌细胞，0.25％胰蛋白酶恒温水浴箱预热20min，保持37℃，培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，培养于含100ml/L胎牛血清、青霉素及链霉素各100u/L的1640培养液中，37℃、体积分数为5％的CO2培养箱传代培养，次日更换培养液；记录复苏日期，观察细胞生长情况；
[0071] 步骤二，细胞分组及干预：
[0072] 培养喉癌细胞分为药物组、微粒药物组、空白组和空白微球组，各组加入相应的处理液；药物组的处理液为顺铂0.9％生理盐水溶液，微粒药物组为铁碳纳米粒顺铂0.9％生理盐水分散液，空白组是0.9％生理盐水，空白微球组是铁碳纳米微粒0.9％生理盐水分散液；
[0073] 步骤三，喉癌细胞生长抑制率检测：
[0074] 细胞传代至10-16代，选取对数生长期的喉癌Hep-2细胞，制成细胞浓度为3
4×10/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1ml，37℃、5％CO2培养，培养24h待细胞贴壁、进入对数生长期后，用无血清的RPMI-1640培养液清洗两次，换液；每孔加入90μml培养液和100μml处理液；药物组及微粒组最终浓度梯度为10、20、40、80、160mg/L，每亚组设5个平行孔；37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱培养，24、48、72h后，吸除各孔原液，每孔加入
100μlMTT液(5g/L)和900μl培养液，继续37℃、饱和湿度、5％CO2培养4h，吸除各孔原液900μl，每孔加入900μl二甲基亚矾，振荡混匀30min，自动酶标读数仪测定570nm各孔A值；抑制率(fa)＝(1-实验组平均A值/空白组平均A值)×100％；
[0075] 步骤四，铁碳纳米粒顺铂抑制喉癌细胞形态学观察：
[0076] 将各组培养细胞浓度调整为透射电镜观察细胞在加药后的内在结构变化；扫描电镜观察细胞在加药后的表面形态变化及内部结构变化，重点在细胞膜形态及细胞核形态；
[0077] 步骤五，铁碳纳米粒顺铂对喉癌细胞caspase3mRNA、Survivin mRNA表达影响：
[0078] 总RNA提取：
[0079] 取各组细胞培养液加入1.5mlEP管中，加入Trizol 1ml，使细胞浓度为1×107/ml/Trizol，用玻璃棒研磨，充分振荡混匀，加入氯仿0.2ml，盖紧盖子，轻轻摇动15s，15-30℃孵育2-3min，低温离心机4℃12000r/min离心15min，取上清液至新的1.5mL Eppendorf管，加与上清液等体积的异丙醇，15-30℃孵育样品10min，4℃12000r/min离心
10min，弃去上清液，保留总RNA在管底的白色沉淀，沉淀采用75％乙醇1.0ml洗涤(含DEPC水)洗涤三次(1ml 75％乙醇/ml Trizol)，4℃7500r/min离心5min，弃去上清液，沉淀真空干燥5-10min，保持适当湿度，以增加溶解度，加DEPC处理水溶解RNA，加入2.5倍体积
75％乙醇，-80℃保存备用；
[0080] mRNA提取：总RNA标本解融后，取上述提取的总RNA到一个新的无RNase的EP管中，用无RNase的水定容到250ul，使RNA处于过饱和状态，加入Buffer OBB 250ul，Oligotex Suspension 15ul，用手弹匀，70℃水浴3分钟，RNA退火，裂解RNA二级结构，室温条件下，静置10分钟，4℃12000r/min离心2分钟，小心吸走上清(A液)，用Buffer OW2400ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟后将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液；将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100ul热的(70℃)Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟后转入新的无RNase的EP管中，加入等体积异丙醇，4℃12000r/min离心2分钟，弃去上清，沉淀加入75％乙醇，室温干燥，融于250ul无RNase的EP 管中，备用；
[0081] mRNA引物合成：
[0082] 在GenBank上查找目的基因mRNA序列，采用Primer express 2.0软件在CDS区设计特异性引物，采用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成引物，序列如下：
[0083] Survivin序列(扩增片段AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，长度129bp)[0084] Forward primer：5’-AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3’
[0085] Reverse primer：5’-GAC AAC TGC GTC TCTG-3
[0086] Caspase3序列(扩增片段，长度101bp)
[0087] Forward Primer：5’-AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3’
[0088] Reverse Primer：5’-TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3’
[0089] 逆转录：
[0090] 取4μl RNA模板做逆转录反应，仪器为ABI 9700仪，反应体系[5×逆转录buffer 4μl，下游引物(10pmol/μl)0.4μl，dNTPs(10mM)0.5μl，MMLV(200U/μl)1μl，DEPC水10.1μl，RNA模板；
[0091] 4μl，总体积20μl，逆转录buffer成分(50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，4mM MgCl2，10mM DTT)；
[0092] 荧光定量PCR反应：
[0093] 采用标准曲线定量法制备阳性标准品，PCR扩增的阳性产物经过2％低熔点琼脂糖凝胶电泳(含溴乙啶，用TAE缓冲液配制)，在长波紫外下，割下目的条带；用回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回收纯化；测定OD值检验纯度(OD 260/280＞1.8)，用OD260测定值和片段长度数据换算出浓度(copy/μl)，即为阳性标准品；取阳性标准品5μl按10倍稀释(加水45μl并充分混匀)，依次倍比梯度稀释，制备成阳性定量标准品梯度；然后待测样本和阳性标准品PCR反应，反应条件93℃3分钟，然后93℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共40循环；反应体系[5×SYBR Green I PCR buffer10μl，上 游 引 物F(10pmol/μl)1μl 下 游 引 物 R(10pmol/μl)1μl，dNTPs(10mM)1μl，Taq酶(3U/μl)1μl，cDNA5μl，ddH2O 31μl，总体积50μl，PCR buffer成分：10mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，2mM MgCl2]；
[0094] 标准曲线的制备：
[0095] 标准品以去离子水依次稀释为4×102，4×103，4×104，4×105，4×106；每次扩增2 6
均使用标准品制备标准曲线，范围为每毫升10-10；拷贝；
[0096] PCR产物定量的校正和判定分析：
[0097] 采用GAPDH作为内参照，Survivin mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数；用GAPDH的拷贝数作为校正基数，即目的基因mRNA精确含量＝目的基因CT值/内参照GAPDH CT值(Survivin和GAPDH比值作为Survivin基因的表达水平)；以此比值做统计处理；根据FQ-PCR原理，被激发的荧
光信号达到一定阈值后被荧光探头采集，最后将其转换成CT值，该数值与扩增片段的实际拷贝数呈反比，即CT值越低，实际拷贝数含量越高。
[0098] 本发明的工作原理：
[0099] 本发明采用高能球磨技术制备铁碳纳米微粒，搭载顺铂，对体外培养的喉癌细胞株Hep-2进行干预，探讨铁碳纳米粒搭载顺铂对
细胞增殖抑制及SurvivinmRNA、caspase3 mRNA表达的影响，为提高喉癌临床化疗效果提供理论
基础；探讨铁碳纳米粒的制备工艺及对顺铂的搭载工艺，考察搭载后的药物性能、理化性能的变化及铁碳纳米粒载体的安全性；采用铁碳纳米粒顺铂及铁碳纳米粒载体对体外培养的喉癌Hep-2细胞进行干预，考察铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep-2细胞的增殖能
力的影响；采用高能球磨技术制备铁碳纳米粒，采用超声乳化-溶剂挥发技术搭载顺铂，考察贴碳纳米粒顺铂的搭载量、包封率、磁性、稳定性、释放性能及载体的安全性；采用铁碳纳米粒顺铂对体外培养的喉癌Hep-2细胞进行干预，采用扫描电镜及透射电镜观察其对细胞微观结构的影响；采用吩噻蓝
染色观察喉癌Hep-2细胞增值抑制的变化，考察铁碳纳米粒顺 铂对细胞增殖活性的影响；通过实时荧光定量PCR技术检测铁碳纳米粒顺铂干
预后喉癌Hep-2细胞Survivin、caspase3表达的变化，探讨铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep-2细胞生长抑制的机制。
[0100] 本发明的具体实施例：
[0101] 第一步，铁碳纳米粒的制备：
[0102] 应用电子天平称量四氧化三铁及石墨粉；采用高能球磨技术制备铁碳纳米粒，球磨结束后用蒸馏水洗涤球磨罐，磁铁吸附含铁微粒，所获洗涤液真空烘干待用，得到干燥铁碳纳米微粒；
[0103] 第二步，铁碳纳米粒搭载顺铂：
[0104] 采用超声乳化-溶剂挥发法制备磁性铁碳纳米粒顺铂；将铁碳纳米粒和顺铂溶解在二氯甲烷中，超声乳化后所得混悬液置于磁铁上，洗涤，离心，并将所得沉淀物冷冻干燥、真空干燥、照射灭菌，即得磁性铁碳纳米粒顺铂；
[0105] 第三步，碳纳米粒顺铂载药量、包封率、磁性、稳定性及释放性能考察：
[0106] 载药量及包封率考察：精密称取贴碳纳米微粒顺铂20mg于10ml容量瓶中，室温下(20℃)加入一定量二甲基亚砜，超声水浴使其完全溶解，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀、过滤，采用分管光度计测定其吸光度，并计算顺铂浓度及质量，取过滤液超低温20000r/min离心60min，使顺铂完全沉积于管底，获得澄清的游离顺铂溶液；采用分光光度计测定其吸光度，据标标准曲线公式求出其游离顺铂的浓度并计算质量；将顺铂总量减去离心后游离顺铂量，即得顺铂吸附量，据此做出计算载药量及包封率：
[0107]
[0108]
[0109] 磁性测定：
[0110] 精密称取适量纳米微球，通过VSM(vibrating sample magnetometer)绘制纳米微粒的磁滞曲线，外磁场的磁场强度用横坐标表示，外磁场的方向用正负 号表示，纵坐标表示磁场强度下样品的磁化强度，验证纳米粒的磁性；
[0111] 体外释放性能测定：
[0112] 精密称取适量铁碳纳米粒顺铂，悬浮于10ml PH7.4的磷酸盐缓冲液中[内含0.02％Tween20(吸附抑制剂)，0.02％Tween80(温润剂)，0.02％NaN3(抑菌剂)]，37℃水浴恒温条件下，频率为100次/min振荡器上振荡；设定时间梯度，在各设定时间点取出铁碳纳米粒分散液，12000r/min离心10min，除去上清液，剩余微球用二甲基亚砜完全溶解，
1000r/min离心2min后，取上清液测定吸光度，计算铁碳纳米微球的顺铂体外释放性能；
[0113] 磁性纳米微球保存期间的稳定性试验：
[0114] 将当日制备的磁性铁碳纳米微球冻干粉，置于4℃保存，于0、1、2、3个月后取样，采用激光粒径仪检测铁碳纳米粒顺铂的粒径变化；
[0115] 第四步，铁碳纳米粒顺铂对喉癌Hep-2细胞微观结够、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3 mRNA表达的影响，具体包括：
[0116] 步骤一，喉癌Hep-2细胞培养及传代：
[0117] 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min，佩戴护目镜及防冻手套，从液氮保存罐中取出快速取出冻存管，立即放入4℃无菌蒸馏水中水浴，快速摇晃，直至冻存液完全融化后置入4℃10％二甲基亚砜；应用移液器将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入10ml培养液，离心机1000r/min离心5min，分离喉癌细胞，0.25％胰蛋白酶恒温水浴箱预热20min，保持37℃，培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，培养于含100ml/L胎牛血清、青霉素及链霉素各100u/L的1640培养液中，37℃、体积分数为5％的CO2培养箱传代培养，次日更换培养液；记录复苏日期，观察细胞生长情况；
[0118] 步骤二，细胞分组及干预：
[0119] 培养喉癌细胞分为药物组、微粒药物组、空白组和空白微球组，各组加入相应的处理液；药物组的处理液为顺铂0.9％生理盐水溶液，微粒药物组为铁碳纳米粒顺铂0.9％生理盐水分散液，空白组是0.9％生理盐水，空白微球组是铁碳 纳米微粒0.9％生理盐水分散液；
[0120] 步骤三，喉癌细胞生长抑制率检测：
[0121] 细胞传代至10-16代，选取对数生长期的喉癌Hep-2细胞，制成细胞浓度为3
4×10/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1ml，37℃、5％CO2培养，培养24h待细胞贴壁、进入对数生长期后，用无血清的RPMI-1640培养液清洗两次，换液；每孔加入
90μml培养液和100μml处理液；药物组及微粒组最终浓度梯度为10、20、40、80、160mg/L，每亚组设5个平行孔；37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱培养，24、48、72h后，吸除各孔原液，每孔加入100μlMTT液(5g/L)和900μl培养液，继续37℃、饱和湿度、5％CO2培养4h，吸除各孔原液900μl，每孔加入900μl二甲基亚矾，振荡混匀30min，自动酶标读数仪测定
570nm各孔A值；抑制率(fa)＝(1-实验组平均A值/空白组平均A值)×100％；
[0122] 步骤四，铁碳纳米粒顺铂抑制喉癌细胞形态学观察：
[0123] 将各组培养细胞浓度调整为透射电镜观察细胞在加药后的内在结构变化；扫描电镜观察细胞在加药后的表面形态变化及内部结构变化，重点在细胞膜形态及细胞核形态；
[0124] 步骤五，铁碳纳米粒顺铂对喉癌细胞caspase3mRNA、Survivin mRNA表达影响：
[0125] 总RNA提取：
[0126] 取各组细胞培养液加入1.5mlEP管中，加入Trizol 1ml，使细胞浓度为1×107/ml/Trizol，用玻璃棒研磨，充分振荡混匀，加入氯仿0.2ml，盖紧盖子，轻轻摇动15s，15-30℃孵育2-3min，低温离心机4℃12000r/min离心15min，取上清液至新的1.5mL Eppendorf管，加与上清液等体积的异丙醇，15-30℃孵育样品10min，4℃12000r/min离心
10min，弃去上清液，保留总RNA在管底的白色沉淀，沉淀采用75％乙醇1.0ml洗涤(含DEPC水)洗涤三次(1ml 75％乙醇/ml Trizol)，4℃7500r/min离心5min，弃去上清液，沉淀真空干燥5-10min，保持适当湿度，以增加溶解度，加DEPC处理水溶解RNA，加入2.5倍体积
75％ 乙醇，-80℃保存备用；
[0127] mRNA提取：总RNA标本解融后，取上述提取的总RNA到一个新的无RNase的EP管中，用无RNase的水定容到250ul，使RNA处于过饱和状态，加入Buffer OBB 250ul，Oligotex Suspension 15ul，用手弹匀，70℃水浴3分钟，RNA退火，裂解RNA二级结构，室温条件下，静置10分钟，4℃12000r/min离心2分钟，小心吸走上清(A液)，用Buffer OW2400ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟后将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液；将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100ul热的(70℃)Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟后转入新的无RNase的EP管中，加入等体积异丙醇，4℃12000r/min离心2分钟，弃去上清，沉淀加入75％乙醇，室温干燥，融于250ul无RNase的EP管中，备用；
[0128] mRNA引物合成：
[0129] 在GenBank上查找目的基因mRNA序列，采用Primer express 2.0软件在CDS区设计特异性引物，采用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成引物，序列如下：
[0130] Survivin序列(扩增片段AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，长度129bp)[0131] Forward primer：5’-AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3’
[0132] Reverse primer：5’-GAC AAC TGC GTC TCTG-3
[0133] Caspase3序列(扩增片段，长度101bp)
[0134] Forward Primer：5’-AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3’
[0135] Reverse Primer：5’-TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3’
[0136] 逆转录：
[0137] 取4μl RNA模板做逆转录反应，仪器为ABI 9700仪，反应体系[5×逆转录buffer 4μl，下游引物(10pmol/μl)0.4μl，dNTPs(10mM)0.5μl，MMLV(200U/μl) 1μl，DEPC水10.1μl，RNA模板；
[0138] 4μl，总体积20μl，逆转录buffer成分(50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，4mM MgCl2，10mM DTT)；
[0139] 荧光定量PCR反应：
[0140] 采用标准曲线定量法制备阳性标准品，PCR扩增的阳性产物经过2％低熔点琼脂糖凝胶电泳(含溴乙啶，用TAE缓冲液配制)，在长波紫外下，割下目的条带；用回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回收纯化；测定OD值检验纯度(OD 260/280＞1.8)，用OD260测定值和片段长度数据换算出浓度(copy/μl)，即为阳性标准品；取阳性标准品5μl按10倍稀释(加水45μl并充分混匀)，依次倍比梯度稀释，制备成阳性定量标准品梯度；然后待测样本和阳性标准品PCR反应，反应条件93℃3分钟，然后93℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共40循环；反应体系[5×SYBR Green I PCR buffer10μl，上游 引物F(10pmol/μl)1μl下 游引物 R(10pmol/μl)1μl，dNTPs(10mM)1μl，Taq酶 (3U/μl)1μl，cDNA5μl，ddH2O 31μl，总 体 积 50μl，PCR buffer 成 分：10mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，2mM MgCl2]；
[0141] 标准曲线的制备：
[0142] 标准品以去离子水依次稀释为4×102，4×103，4×104，4×105，4×106；每次扩增2 6
均使用标准品制备标准曲线，范围为每毫升10-10；拷贝；
[0143] PCR产物定量的校正和判定分析：
[0144] 采用GAPDH作为内参照，Survivin mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数；用GAPDH的拷贝数作为校正基数，即目的基因mRNA精确含量＝目的基因CT值/内参照GAPDH CT值(Survivin和GAPDH比值作为Survivin基因的表达水平)；以此比值做统计处理；根据FQ-PCR原理，被激发的荧光信号达到一定阈值后被荧光探头采集，最后将其转换成CT值，该数值与扩增片段的实际拷贝数呈反比，即CT值越低，实际拷贝数含量越高。
[0145] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
