使用了蚯蚓干燥粉末的酪氨酸酶抑制剂及其制造方法
阅读：1029发布：2020-07-06
专利汇可以提供使用了蚯蚓干燥粉末的酪氨酸酶抑制剂及其制造方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供具有优异的酪 氨 酸酶抑制作用、且具备高安全性的酪氨酸酶 抑制剂 以及酪氨酸酶抑制剂的制造方法。一种酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其特征在于，具备如下工序：使粉末状羟基 羧酸 与活蚯蚓 接触 ，用 水 稀释而将pH调整至2～5，保持3～180分钟后，或者，使pH2～5的羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触，保持3～180分钟后，对活蚯蚓进行水洗、 磨碎 ，并将所得到的磨碎物 冷冻干燥 。，下面是使用了蚯蚓干燥粉末的酪氨酸酶抑制剂及其制造方法专利的具体信息内容。
1.一种酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其特征在于，具备如下工序:使粉末状羟基羧酸与活蚯蚓接触，用水稀释而将PH调整至2~5，保持3~180分钟后，或者，使PH2~5的羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触，保持3~180分钟后， 对活蚯蚓进行水洗、磨碎，并将所得到的磨碎物冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其具备如下工序:在使所述粉末状羟基羧酸或羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触之前，使活蚯蚓与选自由钾、钠、镁和钙组成的组中的至少一种金属的氯化物接触。
3.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其具备如下工序:在使所述粉末状羟基羧酸或羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触之前，将活蚯蚓在明亮处放置10~50小时后，剥离附着于体表的污物。
4.根据权利要求2所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其具备如下工序:在使所述氯化物与活蚯蚓接触之前，将活蚯蚓在明亮处放置10~50小时后，剥离附着于体表的污物，然后与所述金属的氯化物接触。
5.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其中，所述冷冻干燥是通过将磨碎物在_18°C~-35°C下冷冻20~240小时后，在真空下冷冻干燥而进行的。
6.根据权利要求2所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其中，所述冷冻干燥是通过将磨碎物在_18°C~_35°C下冷冻20~240小时后，在真空下冷冻干燥而进行的。
7.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其具备如下工序:将对所述磨碎物进行冷冻干燥而成的物质溶于水或乙醇水溶液，去除或分离不溶性级分。
8.根据权利要求2所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法，其具备如下工序:将对所述磨碎物进行冷冻干燥而成的物质溶于水或乙醇水溶液，去除或分离不溶性级分。
9.一种化妆品，其特征在于，其使用了通过权利要求1~8中任一项所述的酪氨酸酶抑制剂的制造方法而得到的酪氨酸酶抑制剂。
使用了蚯蚓干燥粉末的酪氨酸酶抑制剂及其制造方法
技术领域
[0001] 本发明涉及使用了蚯蚓干燥粉末的酪氨酸酶抑制剂及其制造方法，详细而言，涉及使用了安全且高效的蚯蚓干燥粉末的酪氨酸酶抑制剂及其制造方法。
背景技术
[0002] 近年来，随着社会老龄化的推进，对抗衰老的需求逐渐提高，另一方面，年轻人对肌肤原本的美的意识也显著高涨等，要求化妆品、尤其是提倡美白效果的化妆品所具备的作用正在变大。
[0003] 关于肌肤，由于年龄增加等的内在因素和紫外线、活性氧等外在因素，皮肤原本具有的多种功能降低，各种问题变得显著。强烈要求预防/消除的肌肤问题之一是由于斑点、雀斑、日晒等而出现的皮肤的色素沉着。作为色素沉着的主要原因，据称是皮肤内存在的酪氨酸因酶反应而成为黑色素前体，并通过氧化而生成黑色素。
[0004] 抑制黑色素生成的物质主要分为两大类。一类是直接抑制对黑色素生成产生影响的酪氨酸酶酶自身的活性；另一类是不直接显示对酪氨酸酶活性的抑制，但抑制色素细胞内的黑色素生成。另外，也观察到同时具备两种性质的物质。作为具有黑色素生成抑制作用、对色素沉着的预防和消除是有效的成分，作为物质而通常已知有抗坏血酸、谷胱甘肽、对苯二酚等，并提出了其它各种源自天然植物的成分等(例如，专利文献I和2)。
[0005] 另一方面，蚯蚓提取物、蚯蚓干燥粉末自古以来主要在东南亚各国中作为各种疾病的预防剂、治疗剂而被应用，迄今为止已知有作为膀胱内结石缩小剂和排出促进剂、黄疸治疗剂、分娩促进剂、强壮剂、生发剂、强精剂、解热剂、疫挛治疗剂、血液循环促进剂、半身不遂治疗剂、间接镇痛剂、利尿剂、支气管哮喘剂、高血压治疗剂的用途。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1:日本特开2011-032173号公报
[0010] 专利文献2:日本特开2011-037764号公报
[0011] 专利文献3:日本特开昭63-238009号公报
发明内容
[0012] 发明要解决的问题
[0013] 然而，在抑制黑色素生成的物质之中，抗坏血酸类在稳定性上存在问题，其在水系中不稳定而成为变色、变臭的原因。谷胱甘肽等硫醇系化合物存在异味强烈、容易氧化等问题。进而，对苯二酚在对于皮肤的安全性上存在问题。
[0014] 另外，在上述专利 文献3中记载的蚯蚓提取物之中，将蚯蚓加热并剁碎后用有机溶剂提取而成的物质存在残留有机溶剂的问题，利用水解提取(酶处理)法的物质毕竟要添加氯化十六烷基吡啶溶液或乙醇进行处理，从在用于皮肤的化妆品或皮肤外用剂中长期配混这一观点出发是不优选的。进而，通过专利文献3中记载的方法而得到的蚯蚓提取物的酪氨酸酶抑制活性尚无法满足。
[0015] 因而，本发明的目的在于，提供可获得具有优异的酪氨酸酶抑制作用、且具备高安全性的酪氨酸酶抑制剂的酪氨酸酶抑制剂的制造方法、以及使用了通过该制造方法而得到的酪氨酸酶抑制剂的化妆品。
[0017] 用于解决问题的方案
[0018] 即，本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法的特征在于，其具备如下工序:使粉末状羟基羧酸与活蚯蚓接触，用水稀释而将PH调整至2~5，保持3~180分钟后，或者，使PH2~5的羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触，保持3~180分钟后，对活蚯蚓进行水洗、磨碎，并将所得到的磨碎物冷冻干燥。
[0020] 另外，本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法优选的是，具备如下工序:在使前述粉末状羟基羧酸或羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触之前，将活蚯蚓在明亮处放置10~50小时后，剥离附着于体表的污物。
[0021] 本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法中，优选的是，前述冷冻干燥是通过将磨碎物在-18°C~-35°C下冷冻20~240小时后，在真空下冷冻干燥而进行的。
[0022] 本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法优选的是，还具备如下工序:将对前述磨碎物进行冷冻干燥而成的物质溶于水或乙醇水溶液，去除或分离不溶性级分。
[0023] 本发明的化妆品的特征在于，其使用了通过上述任一项的酪氨酸酶抑制剂的制造方法而得到的酪氨酸酶抑制剂。
[0024] 发明的效果
[0026] 图1是表示实施例1、2的结果的图。
[0027] 图2是表示实施例6的结果的图。
[0028] 图3是表示实施例7的结果的图。
[0029] 图4是表示实施例8的结果的图。[0030] 图5是表示实施例9的结果的图。
[0031] 图6是表示实施例10的结果的图。
[0032] 图7是表示实施例10的结果的图。具体实施方式
[0033] 本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法的特征在于，其具备如下工序:使粉末状羟基羧酸与活蚯蚓接触，用水稀释而将PH调整至2~5，保持3~180分钟后，或者，使pH2~5的羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触，保持3~180分钟后，对活蚯蚓进行水洗、磨碎，并将所得到的磨碎物冷冻干燥。
[0034] 另外，本发明的另一酪氨酸酶抑制剂的制造方法的特征在于，其具备如下工序:使活蚯蚓与选自由钾、钠、镁和钙组成的组中的至少一种金属的氯化物接触，
[0035] 其后，使粉末状羟基羧酸与活蚯蚓接触，用水稀释而将pH调整至2~5，保持3~180分钟后，或者，使pH2~5的羟基羧酸水溶液与活蚯蚓接触，保持3~180分钟后，对活蚯蚓进行水洗、磨碎，并将所得到的磨碎物冷冻干燥。
[0036] 本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法是能够以活蚯蚓作为原料来提供具有优异的酪氨酸酶抑制作用、且具备高安全性的酪氨酸酶抑制剂的制造方法。
[0037] 在本发明的制造方法中，优选的是，在进行将活蚯蚓置于不适环境下的处理之前、换言之使活蚯蚓与金属的氯化物或羟基羧酸接触之前，将活蚯蚓移动到面包箱之类的平箱中，在明亮处放置10~50小时，去除附着于体表的污物。放置在明亮处的时间更优选为12~24小时。此时的收容量优选为蚯蚓堆积成30~60mm的厚度、优选堆积成40~50mm的厚度左右的量。该平箱内不存在砂、泥之类的异物，另外，由于蚯蚓为夜行性，在暗处时生活活动变得活跃，从而可能消耗体力，因此优选夜间通过照明培养方式等保持明亮。通过该处置，使活蚯蚓发挥自我防御本能，排泄消化道内残留的消化物，并以该排泄物覆盖全身，从而防止水分蒸发来维持生活环境，因此，若重复利用适当手段剥除该覆盖的污物，即排泄物，可以最终去除消化道内的消化物和附着于体表的污物。
[0038] 附着于蚯蚓体表的污物的剥离例如可通过用无纺布包覆活蚯蚓，使污物吸附在无纺布上来进行。通过将该放置在明亮处和去除附着于体表的污物的处理、以及使活蚯蚓与金属氯化物和/或羟基羧酸接触的处理进行组合，可以期待排出、去除更多的蚯蚓体内的有毒物。
[0039] 本发明的另一酪氨酸酶抑制剂的制造方法中使用的金属的氯化物为选自由钾、钠、镁和钙组成的组中的至少一种金属的氯化物。即，选自由氯化钾、氯化钠、氯化镁和氯化钙组成的组中的至少I种。另外，也可以是它们的混合物，还可以是它们与可添加在食品中的其它无害成分的混合物。作为这种混合物，例如可列举出食盐、岩盐、晒制盐。上述金属的氯化物可以通过将粉末状的金属的氯化物撒到活蚯蚓上来使用，由此，发生蚯蚓与金属的氯化物的接触。
[0040] 在本发明的另一酪氨酸酶抑制剂的制造方法中，优选的是，在使活蚯蚓与金属的氯化物接触后，使活蚯蚓与羟基羧酸接触。另外，在本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法中，也可以不使蚯蚓与金属氯化物接触而进行羟基羧酸与蚯蚓的接触。
[0041] 关于蚯蚓与羟基羧酸的接触，可以通过将粉末状的羟基羧酸撒在活蚯蚓上来进行。另外，还可以将蚯蚓浸溃在PH2~5的羟基羧酸水溶液中。在经过蚯蚓与金属氯化物的接触后进行其与羟基羧酸的接触的情况下，蚯蚓与羟基羧酸的接触在与上述金属的氯化物接触后迅速进行。另外，优选在使活蚯蚓与羟基羧酸接触之前，对蚯蚓进行水洗。若通过水洗去除上述金属的氯化物后再使蚯蚓与羟基羧酸接触，则可获得酶活性高的蚯蚓干燥粉末。在使蚯蚓与羟基羧酸接触之前进行水洗的情况下，优选在与金属的氯化物接触开始后的30分钟以内、更优选在20分钟以内进行水洗。水洗方法没有特别限定，可以采用公知的方法。
[0042] 由于活蚯蚓与羟基羧酸粉末长时间接触会死亡，导致生活功能消失，从而变得不排泄消化道内的消化物，因此需要尽可能快地、优选在30秒以内、更优选20秒以内用水稀释羟基羧酸，将pH调整至2~5的范围内。
[0043] 羟基羧酸形成对于蚯蚓而言不适的生活环境，因此，活蚯蚓根据自我保存本能放出体液、排泄物来改善生活环境。另外，羟基羧酸具有杀菌性，因此可以期待其在发挥上述那样地促进消化器官内残留的消化物等的排泄的作用的同时，还发挥杀灭附着于蚯蚓上的杂菌的效果。
[0044] 本发明方法中使用的结晶状羟基羧酸只要是在使用条件下显示结晶状体的羟基羧酸即可，不论其羟基数或羧基数如何均可使用。即，可以是单羟基单羧酸、单羟基多羧酸、多羟基单羧酸、多羟基多羧酸的任何一种。
[0045] 作为本发明中使用的羟基羧酸，例如可列举出羟基乙酸、乳酸、醋酸、β_羟基丙酸、α-羟基正丁酸、羟基正丁酸、α-羟基正戊酸、β-羟基正戊酸、苹果酸、α-甲基苹果酸、α -羟基戊二酸、β -羟基戊二酸、柠檬酸、丙二酸和琥珀酸等。其中，从可在食品中使用且容易获得的观点考虑，优选乳酸、醋酸、苹果酸、柠檬酸、丙二酸和琥珀酸。羟基羧酸可以单独使用一种，也可以混合两种以上使用。
[0046] 活蚯蚓的组织中65%为水分。活蚯蚓的身体保护功能可以发挥一定的时间，但活蚯蚓若死亡，则酶发挥作用，因此，有必要慎重地控制在不适生活环境下放置的时间。该时间取决于条件，通常为3~180分钟的范围。
[0047] 在本发明中，将经羟`基羧酸处理的蚯蚓活体用水洗涤后，磨碎，制成液状~糊料状的磨碎物。洗涤优选用纯水进行。洗涤方法没有特别限定，可以采用公知的水洗方法。另外，磨碎前的处理工序的合计时间，即，从向蚯蚓上撒上金属的氯化物至用水洗涤羟基羧酸为止的时间优选合计在240分钟以内。
[0048] 上述磨碎方法没有特别限定，例如，使用均化器、混合机、均质混合器、擂溃机、加压型细胞破碎装置，通常在I~25°C下进行。从抑制蚯蚓构成成分分解的观点考虑，优选在低温下进行，优选2~15 °C的温度。
[0049] 将通过磨碎蚯蚓而得到的磨碎物容纳于例如不锈钢制托盘中，进行冷冻干燥。此时，蚯蚓活体中含有的酶虽然对活细胞没有作用，但对死细胞瞬时起作用，因此有可能产生腐败性气体，为了防止这种情况，优选瞬时骤冷/冷冻至_18°C~_35°C而抑制酶的作用后，进行冷冻干燥。
[0050] 这样，为了在不损害蚯蚓本来的药理作用的条件下进行粉末化，需要迅速冷冻，但另一方面，在过短时间内进行冷冻时，有时与作为蚯蚓糊料的主成分的蛋白质一起存在的杂质形成点状的不冷冻部分，无法分离，因此过快地冷冻是不优选的。因此，冷冻优选在-18°C~_35°C的低温下进行20~240小时，更优选进行50~170小时。
[0051] 在冷冻干燥时，重要的是选择可将杂质与水分一起去除而不残留的条件。因此，优选在50Pa以下的压力下、_60°C~+90°C的温度内，分阶段地升高温度，并控制在10~60小时的范围内进行。[0052] 作为冷冻干燥方法，例如，如上述那样地将磨碎物在_18°C~_35°C的温度下冷冻20~240小时，然后边在-60°C~+90°C的温度下，分多个阶段地升温，在压力25~40Pa下，分多个阶段减压，边冷冻真空干燥10~60小时，从而可获得无菌状态的淡黄色蚯蚓干燥粉末。
[0053] 本发明的酪氨酸酶抑制剂的制造方法优选的是，还具备如下工序:将对前述磨碎物进行冷冻干燥而成的物质溶于水或乙醇水溶液，去除或分离不溶性级分。去除或分离不溶性级分的工序可以与上述同样地通过基于放置的沉淀、离心、过滤等来进行。溶于水或乙醇水溶液的工序优选边搅拌或振荡边进行。在水中溶解所需的时间优选为1~120分钟、更优选为5~80分钟。乙醇水溶液的乙醇浓度没有特别限定，优选为10~70% (v/v)、更优选为30~60%。
[0054] 通过本发明的制造方法而得到的酪氨酸酶抑制剂的形状没有特别限定。即，可以将如上述那样溶于水或乙醇水溶液而成的物质的上清直接以水溶液的状态使用，也可以去除水分而以浓缩液的形式使用，还可以使其干燥而制成粉末状来使用。还可以将上清干燥并制成粉末状后溶于水来使用。另外，还可以直接使用对蚯蚓糊料进行冷冻干燥而成的粉末而不将其溶于水或乙醇水溶液。
[0055] 在本发明方法中，作为原料使用的蚯蚓没有特别限定，例如可以使用粉正虫引(Lumbricus rubellus)、陆正虫引(Lumbricus terrestris)、赤子爱胜虫引(Eiseniafoetida)、背暗异唇蝴(Allolobophora caliginosa)、八毛枝蝴(Dendrobaena octaedra)、Allolobophora japonica Michaelsen、Drawida hattamimizu Hata1、 Pheretimadivergens Michaelsen、Pheretima communissima、Pheretima agrestis、Pheretimasieboldi Horst>Pheretima hilgendorfi>PontodriIus matsushimensis Iizuka、Tubifexhattai Nomura、Limnodrilus gotoi Hatai = L.SocialisStephenson 等。
[0056] 本发明的化妆品的特征在于，其包含通过本发明的制造方法而得到的酪氨酸酶抑制剂。通过酪氨酸酶抑制剂的作用，抑制黑色素的生成，可以期待美肌效果、防止色素沉着的效果。
[0057] 本发明所述的化妆品的形态没有特别限定。根据上述酪氨酸酶抑制剂的有效成分所具有的作用效果，可适用于能够利用各作用效果的所有化妆品中。例如，可以将本发明所述的有效成分配混在各种化妆品基剂等中而适用于以下形态:乳霜、乳液、化妆水、面膜剂、洗面奶等各种基础化妆品；粉底、口红、腮红、粉等各种彩妆品；洗发材料、养发剂、香波、护发素等各种头发用化妆品；肥皂、美甲材料、古龙水；以及适用于化妆水、乳液、软膏、溶胶、凝胶、粉末、喷雾、固体物等。
[0058] 本发明所述的酪氨酸酶抑制剂相对于各种化妆品的配混量可以根据化妆品的实施方式、化妆品的使用形态等进行变动，没有特别限定。原则上，只要存在有效量即可，通常在化妆品组合物中，换算成干燥重量可利用0.0001~100质量％，优选为0.01~10质量％。
[0060] 实施例
[0061] 接着，通过实施例进一步详细说明本发明。本发明不受以下实施例的任何限定。[0062][蚯蚓干燥粉末的制备]
[0063](实施例1)
[0064] 将30kg在明亮处放置24小时后剥离附着于体表的污物的活粉正蚓以约5cm的厚度平铺在平皿上，在其上撒上250g柠檬酸后，用15秒添加30升纯水，进行稀释。
[0065] 撒上柠檬酸粉末时，蚯蚓一下子放出黄色体液，用水稀释后，在该状态下保持20分钟。
[0066] 接着，从污浊的柠檬酸水溶液中取出活蚯蚓，水洗后，使用均化器在10°C下磨碎，制备蚯蚓糊料。接着，将该蚯蚓糊料抽吸脱气，去除其中含有的气体后，转移到不锈钢制托盘上，瞬时骤冷至-35°C，在该温度下维持50小时，缓慢冷冻。
[0067] 将冷冻的蚯蚓糊料在_35°C下保持OPa压力2小时后，升温至温度25°C，在40Pa下干燥10小时，接着在40°C、压力35Pa下干燥14小时，接着在65°C、压力35Pa下干燥12小时，最后将温度设定在80°C，在压力25Pa下保持6小时，由此进行真空冷冻干燥。通过该处理，获得含水量8质量％的淡黄色的蚯蚓干燥粉末。
[0068](实施例2)
[0069] 将30kg在明亮处 放置24小时后剥离附着于体表的污物的活粉正蚓以约5cm的厚度平铺在平皿上，在其上均匀地撒上氯化钠250g。20分钟后，对蚯蚓进行水洗。
[0070] 其后，同样地撒上250g柠檬酸后，用15秒添加30升纯水，进行稀释。此时，刚添加水后的PH为2.25，完全稀释时的pH为2.74。
[0071] 撒上柠檬酸粉末时，蚯蚓一下子放出黄色体液。用水稀释后，在该状态下保持20分钟。
[0072] 接着，从污浊的柠檬酸水溶液中取出活蚯蚓，水洗后，使用均化器在10°C下磨碎，制备蚯蚓糊料。接着，将该蚯蚓糊料抽吸脱气，去除其中含有的气体后，转移到不锈钢制托盘上，瞬时骤冷至-35°C，在该温度下维持50小时，缓慢冷冻。
[0073] 将冷冻的蚯蚓糊料在_35°C下保持OPa压力2小时后，升温至温度25°C，在40Pa下干燥10小时，接着在40°C、压力35Pa下干燥14小时，接着在65°C、压力35Pa下干燥12小时，最后将温度设定在80°C，在压力25Pa下保持6小时，由此进行真空冷冻干燥。通过该处理，获得含水量8质量％的淡黄色的蚯蚓干燥粉末。
[0074] 向上述得到的各蚯蚓干燥粉末Ig中添加离子交换水20mL，搅拌I小时。其后，进行离心分离(10000 X g、室温、15分钟)，分离上清来作为测定试样。
[0075][测定试剂]
[0076] 在测定酪氨酸酶抑制活性时，使用了以下试剂。
[0077] 磷酸盐缓冲液(磷酸+磷酸钠。0.05Μ、ρΗ6.8)
[0078] 酪氨酸酶(源自蘑燕(mushroom)、50U/mL在磷酸盐缓冲液中)
[0079] L-DOPA (2.5mM在磷酸盐缓冲液中)
[0080][测定方法]
[0081] 向磷酸盐缓冲液500 μ L中添加酪氨酸酶200 μ L并混合，进而添加上述测定试样或离子交换水(对照)100 μ L，以25°C孵育3分钟。其后，添加L-D0PA250 μ L并搅拌后，测定490nm的吸光度。测定开始后，标绘出每隔30秒钟的吸光度的值，测定10分钟。划出测定开始后与10分钟后的值之间的近似直线，算出其斜率。对将用离子交换水进行反应时(对照)的标绘的近似直线的斜率作为100时的斜率的比率制作图表。图表示于图1。
[0082] 如图1所明确那样，本发明所述的酪氨酸酶抑制剂强烈抑制酪氨酸酶的功能。酪氨酸酶具有将L-酪氨酸转化成L-D0PA、进而转化成L-多巴醌的作用。其后，由L-多巴醌经过多个阶段的反应而合成黑色素，因此抑制酪氨酸酶活性会抑制黑色素的合成。因此，本发明的酪氨酸酶抑制剂适合于化妆品、尤其是美白化妆品用途。
[0083](参考例I)
[0084] 按照日本特许第2090412号公报中记载的方法，得到蚯蚓的冷冻干燥粉末。[0085] 即，将30kg在明亮处放置24小时后剥离附着于体表的污物的活粉正蚓以约5cm的厚度平铺在平皿上，在其上添加30升水。添加水后，在该状态下保持20分钟。接着，从水中取出活蚯蚓，进行水洗后，使用均化器在10°C下磨碎，制备蚯蚓糊料。接着，将该蚯蚓糊料抽吸脱气，去除其中含有的气体后，转移至不锈钢制托盘上，瞬时骤冷至_35°C，在该温度下维持50小时,缓慢冷冻。
[0086] 将冷冻的蚯蚓糊料在_35°C下保持OPa压力2小时后，升温至温度25°C，在40Pa下干燥10小时，接着在40°C、压力35Pa下干燥14小时，接着在65°C、压力35Pa下干燥12小时，最后将温度设定在80°C，在压力25Pa下保持6小时，由此进行真空冷冻干燥。通过该处理，获得含水量8质量％的淡黄色的蚯蚓干燥粉末。
[0087] 将该冷冻干燥粉末以乙醇:冷冻干燥粉末达到20:1 (v/w)的方式溶解在50%乙醇水溶液中，在室温(25°C)下以1500rpm振荡I小时。其后，以4°C、10000Xg离心15分钟，分离出上清，以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末A-1。
[0088](参考例2)
[0089] 除了使用离子交换水来代替50%乙醇以外，与上述参考例I同样操作，得到冷冻干燥粉末B-1。
[0090](参考例3)
[0091] 使用离子交换水来代替50%乙醇、未进行最后的减压浓缩，除此之外，与上述参考例I同样操作，得到冷冻干燥粉末c-Ι。
[0092](实施例3)
[0093] 将30kg通过水洗去除了附着于体表的污物的活粉正蚓以约5cm的厚度平铺在平皿上，在其上均匀地撒上250g柠檬酸后，用15秒添加30升纯水，进行稀释。
[0094] 接着，将该浸溃在稀释的柠檬酸中的蚯蚓在20°C下放置60分钟。接着，从污浊的柠檬酸水溶液中取出活蚯蚓，水洗后，使用均化器在10°c下磨碎，制备蚯蚓糊料。接着，将该磨碎物抽吸脱气，去除其中含有的气体后，转移至不锈钢制托盘上，瞬时骤冷至-30°c，在该温度下维持50小时，缓慢冷冻。
[0095] 将如此操作而冷冻的蚯蚓糊料在_30°C下减压至压力5Pa并保持10小时后，升温至温度20°C，在压力IOPa下干燥10小时、接着在40°C下干燥10小时，最后将温度设定为800C，在压力5Pa下保持5小时，从而结束真空冷冻干燥。通过该处理，获得含水量8质量％的淡黄色的蚯蚓的冷冻干燥粉末。
[0096] 将该冷冻干燥粉末以乙醇:冷冻干燥粉末达到20:1 (v/w)的方式溶解在50%乙醇水溶液中，在室温(25°C)下以1500rpm振荡I小时。其后，以4°C、10000Xg离心15分钟，分离出上清，以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末A-1I。[0097](实施例4)
[0098] 除了使用离子交换水来代替50%乙醇以外，与上述实施例3同样操作，得到冷冻干燥粉末B-1I。
[0099](实施例5)
[0100] 使用离子交换水来代替50%乙醇、未进行最后的减压浓缩，除此之外，与上述实施例3同样操作，得到冷冻干燥粉末C-1I。
[0101](实施例6) [0102] 与上述实施例2同样操作，得到淡黄色的冷冻干燥粉末。
[0103] 将该冷冻干燥粉末以乙醇:冷冻干燥粉末达到20:1 (v/w)的方式溶解在50%乙醇水溶液中，在室温(25°C)下以1500rpm振荡I小时。其后，以4°C、10000Xg离心15分钟，分离出上清，以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末A-1II。
[0104](实施例7)
[0105] 除了使用离子交换水来代替50%乙醇以外，与上述实施例6同样操作，得到冷冻干燥粉末B-1II。
[0106](实施例8)
[0107] 使用离子交换水来代替50%乙醇、未进行最后的减压浓缩，除此之外，与上述实施例6同样操作，得到冷冻干燥粉末C-1II。
[0108]关于上述的冷冻干燥粉末 A-1、A-11、A-1I1、B-1、B-11、B-1I1、C-1、C-11、C-1II，分别向冷冻干燥粉末0.1g中添加磷酸盐缓冲液，并调制成达到0.05g/ml。对该溶液进行振荡(1500rpm、25°C、I小时)，进而采取离心分离(10000 X g、4°C、15分钟)了的上清，作为测定样品。
[0109] 以磷酸盐缓冲液为基础，将酪氨酸酶(Sigma公司、源自蘑菇)、L-DOPA (NACALAITESQUE, INC.)用该缓冲液调制成规定浓度(2.5mM)。使用分光光度计，添加磷酸盐缓冲液0.5ml、酪氨酸酶(250U/ml)0.2ml以及测定样品0.1ml,以37°C孵育3分钟。在孵育开始2分48秒时开始测定，花费3分钟添加L-DOPA (2.5mM) 0.25ml,以37°C、吸光度490nm实施10分钟(每隔10秒钟)的测定。
[0110] 由测定结果计算下述公式所定义的酪氨酸酶活性抑制率(％)(下述公式为5分钟后的值的例子)。
[0111] At:包含酪氨酸酶和L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0112] Ac:包含酪氨酸酶但不包含L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0113] AtO:不包含酪氨酸酶但包含L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0114] AcO:不包含酪氨酸酶和L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0115]活性率(％) =([At]_[AtO])/ ([Ac]-[AcO]) XlOO
[0116] 酪氨酸酶活性抑制率(％) = 100-活性率
[0117] 结果不于下述表1~表3以及图2~图4。需要说明的是，在各表中，0.05M磷酸盐缓冲液PH6.8是指使用了磷酸盐缓冲液代替测定样品的对照。
[0118][表1]
[0120][表 2]
[0122][表 3]
[0124] 如上述表1~3和图2~4所明确那样，由通过本发明所述的制造方法得到的蚯蚓冷冻干燥粉末制成的酪氨酸酶抑制剂相对于酪氨酸酶显示抑制活性。尤其是，通过包含使磨碎处理前的活蚯蚓与金属盐和羟基羧酸接触的工序的方法而得到的物质，酪氨酸酶抑制活性高。
[0125](比较例I)
[0126] 按照日本特开昭63-238009号公报中记载的方法，将活蚯蚓(90.0g)以约80°C用热水烫20分钟，用自来水清洗。控干水分后，用搅拌器制成蚯蚓糊料状。
[0127] 将该糊料以乙醇:糊料达到10:1 (v/w)的方式溶解在50%乙醇水溶液中，在5~10°C的低温下边搅拌边放置2星期。其后，以4°C、10000 Xg离心15分钟，分离出上清，以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末D-1。
[0128](实施例9)[0129] 与上述实施例2同样操作，得到淡黄色的冷冻干燥粉末。
[0130] 将该冷冻干燥粉末以乙醇:冷冻干燥粉末达到10:1 (v/w)的方式溶解在50%乙醇水溶液中，在5~10°C的低温下边搅拌边放置2星期。其后，以4°C、10000 X g离心15分钟，分离出上清，以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末D-1I。
[0131](参考例4)
[0132] 与参考例I同样地按照日本特许第2090412号公报中记载的方法得到蚯蚓的冷冻干燥粉末。[0133] 将该冷冻干燥粉末以乙醇:冷冻干燥粉末达到10:1 (v/w)的方式溶解在50%乙醇水溶液中，在5~10°C的低温下边搅拌边放置2星期。其后，以4°C、10000 X g离心15分钟，分离出上清，以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末D-1II。
[0134] 关于上述的冷冻干燥粉末D-1、D-11、D-1II，分别向冷冻干燥粉末0.1g中添加磷酸盐缓冲液，调制成达到0.05g/ml。对该溶液进行振荡(1500rpm、25°C、l小时)，进而采取离心分离(10000Xg、4°C、15分钟)了的上清，作为测定样品。
[0135] 以磷酸盐缓冲液为基础，将酪氨酸酶(Sigma公司，源自蘑菇)、L-DOPA (NACALAITESQUE, INC.)用该缓冲液调制成规定浓度(2.5mM)。使用分光光度计，添加磷酸盐缓冲液0.5ml、酪氨酸酶(250U/ml)0.2ml以及测定样品0.1ml,以37°C孵育3分钟。在孵育开始2分48秒时开始测定，花费3分钟添加L-DOPA (2.5mM) 0.25ml,以37°C、吸光度490nm实施10分钟(每隔10秒钟)的测定。
[0136] 由测定结果计算下述公式所定义的酪氨酸酶活性抑制率(％)(下述公式为5分钟后的值的例子)。
[0137] At:包含酪氨酸酶和L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0138] Ac:包含酪氨酸酶但不包含L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0139] AtO:不包含酪氨酸酶但包含L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0140] AcO:不包含酪氨酸酶和L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0141]活性率(％) =([At]_[AtO])/ ([Ac]-[AcO]) XlOO
[0142] 酪氨酸酶活性抑制率(％) = 100-活性率
[0143] 结果示于下述表4和图5。需要说明的是，在各表中，0.05M磷酸盐缓冲液pH6.8是指使用了磷酸盐缓冲液代替测定样品的对照。
[0144] [表 4]
[0146] 如上述表4和图5所明确那样，由通过本发明所述的制造方法、尤其是包含使磨碎处理前的活蚯蚓与金属盐和羟基羧酸接触的工序的方法得到的蚯蚓冷冻干燥粉末制成的酪氨酸酶抑制剂(D-1I)与通过基于日本特开昭63-238009号公报中记载的方法的制造方法得到的(D-1)相比酪氨酸酶抑制活性高。
[0147](比较例2)
[0148] 按照日本特开昭63-238009号公报中记载的方法，将活蚯蚓(90.0g)以约80°C用热水烫20分钟，用自来水清洗。控干水分后，用搅拌器制成蚯蚓糊料状。
[0149] 将该糊料以离子交换水:糊料达到10:1 (v/w)的方式溶解在离子交换水中，进一步添加所添加的离子交换水的50%量的氯仿并振荡，其后在5~10°C的低温下放置24小时。取出水层，添加水层的量的90%量的50%乙醇并搅拌，在5~10°C的低温下放置24小时。其后，以4°C、10000Xg离心15分钟，分离出沉淀层，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末E-1。另一方面，将上清以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末F-1。
[0150](实施例 10)
[0151] 使用活蚯蚓90.0g，与上述实施例2同样操作，得到淡黄色的冷冻干燥粉末。
[0152] 将该冷冻干燥粉末以离子交换水:冷冻干燥粉末达到10:1 (v/w)的方式溶解在离子交换水中，进一步添加所添加的离子交换水的50%量的氯仿并振荡，其后在5~10°C的低温下放置24小时。取出水层，添加水层的量的90%量的50%乙醇并搅拌，在5~10°C的低温下放置24小时。其后，以4°C、10000Xg离心15分钟，分离出沉淀层，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末E-1I。另一方面，将上清以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末F-1I。
[0153](参考例5)
[0154] 与参考例I同样地按照日本特许第2090412号公报中记载的方法，得到蚯蚓的冷冻干燥粉末。
[0155] 将该冷冻干燥粉末以离子交换水:冷冻干燥粉末达到10:1 (v/w)的方式溶解在离子交换水中，进一步添加所添加的离子交换水的50%量的氯仿并振荡，其后在5~10°C的低温下放置24小时。取出水层，添加水层的量的90%量的50%乙醇并搅拌，在5~10°C的低温下放置24小时。其后，以4°C、10000Xg离心15分钟，分离出沉淀层，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末E-1II。另一方面，将上清以75°C减压浓缩15分钟，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末F-1II。
[0156] 关于上述的冷冻干燥粉末E-1、E-11、E-1I1、F-1、F_I1、F-1II，分别向冷冻干燥粉末0.1g中添加磷酸盐缓冲液，调制成达到0.05g/ml。对该溶液进行振荡(1500rpm、25°C、l小时)，进而采取离心分离(10000 X g、4°C、15分钟)了的上清，作为测定样品。
[0157] 以磷酸盐缓冲液为基础，将酪氨酸酶(Sigma公司，源自蘑菇)、L-DOPA (NACALAITESQUE, INC.)用该缓冲液制备成规定浓度(2.5mM)。使用分光光度计，添加磷酸盐缓冲液0.5ml、酪氨酸酶(250U/ml)0.2ml以及测定样品0.1ml,以37°C孵育3分钟。在孵育开始2分48秒时开始测定，花费3分钟添加L-DOPA (2.5mM) 0.25ml,以37°C、吸光度490nm实施10分钟(每隔10秒钟)的测定。
[0158] 由测定结果计算下述公式所定义的酪氨酸酶活性抑制率(％)(下述公式为5分钟后的值的例子)。
[0159] At:包含酪氨酸酶和L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0160] Ac:包含酪氨酸酶但不包含L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0161] AtO:不包含酪氨酸酶但包含L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0162] AcO:不包含酪氨酸酶和L-DOPA的测定溶液在测定开始后30秒~5分30秒后的吸光度的增加值。
[0163]活性率(％) =([At]_[AtO])/ ([Ac]-[AcO]) XlOO
[0164] 酪氨酸酶活性抑制率(％) = 100-活性率
[0165] 结果不于下述表5、6和图6、7。需要说明的是,在各表中，0.05M磷酸盐缓冲液PH6.8是指使用了磷酸盐缓冲液代替测定样品的对照。
[0166][表 5]
[0170] 如上述表5、6和图6、7所明确那样，由通过本发明所述的制造方法、尤其是包含使磨碎处理前的活蚯蚓与金属盐和羟基羧酸接触的工序的方法得到的蚯蚓冷冻干燥粉末制成的酪氨酸酶抑制剂(E-11、F-1I)与通过基于日本特开昭63-238009号公报中记载的方法的制造方法得到的 (E-1、F-1)相比酪氨酸酶抑制活性高。
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