本发明涉及提取、纯化和酶促修饰β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)α’ 亚基的方法。

根据本发明，β-伴大豆球蛋白选择性提取自磨碎的脱脂大豆，然后用 含水乙醇处理而沉淀；接下来对富集的级分在变性条件下进行金属亲和层 析(MAC)以获得α’亚基。α’亚基用胰凝乳蛋白酶处理，然后进行进一步 的亲和层析步骤以重新得到该多肽的氨基端区域(MW 28,000Da)。

技术背景

大豆及其衍生物已知的胆固醇降低特性与异黄酮类的含量有关(Kirk 等人，1998)并与蛋白质的含量有关(Anderson等人，1995)。

大豆蛋白质主要由大豆球蛋白(11S级分)和β-伴大豆球蛋白(7S级 分)组成，后者由α、α’和β三个亚基组成(Thanh和Shibasaki，1976)。 对大豆蛋白质进行的研究表明7S级分(Lovati等人，1992，1996)，尤其是α’ 亚基(Manzoni等人，1998)能激活LDL受体，因此主要负责降低胆固醇血浆 水平。事实上，用7S球蛋白处理肝细胞系造成α和α’亚基的彻底降解和 对LDL受体活性的刺激，然而β亚基没有被降解，因此受体也没有激活。 此外，7S级分缺失α’亚基的大豆突变体不能改变受体活性，甚至在高浓 度下也不能改变受体活性。

基于这些实验观察的结果，需要一些方法用于获得纯化的β-伴大豆 球蛋白、以及回收和纯化α’亚基，由后者可通过酶促处理接下来可获得特 异的氨基酸序列，而不是通过多肽合成获得的。

Than等人(1975和1976)提出，后来经O′Keefe等人(1991)改进的一个 方法是用来根据大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白在不同pH值下不同的溶 解度来分离它们；但是交叉污染还是很严重，而且需要凝胶过滤和亲和层 析，这些方法花费昂贵，在工业规模下实施很困难。Nagano等人(1992)改 进的方法尽管允许提高级分的纯度，但还是一种花费昂贵只适用于实验室 规模的方法。

最近，Wu等人(1999)描述了一种在半工业试验规模下分离大豆球蛋白 和伴大豆球蛋白的方法。大豆球蛋白经连续两次水提取，pH为8.5，接着 将上清液用0.98g/l的亚硫酸氢盐溶液处理而沉淀，同时，向来自大豆球蛋 白沉淀的母液中加入0.25M NaCl，将pH值调到4.8而沉淀伴大豆球蛋白。 这种方法用来处理大量的起始材料，也提供高蛋白质产量，但是级分的纯 度仍然不理想；特别的是β-伴大豆球蛋白被降解，显然是在用水渗滤期 间发生的，渗滤是减少过量亚硫酸氢盐离子并去除盐的必要处理。

上述方法不仅没有产出纯的β-伴大豆球蛋白，而且最重要的是没有 考虑提取和纯化α’亚基。

根据本发明，按照常规方法通过在水介质中从磨碎的脱脂大豆提取来 制备β-伴大豆球蛋白中富含的固体级分，接下来上清液用含水乙醇沉淀； 所得的级分然后在变性条件下通过金属亲和层析(MAC)纯化，以产生纯 的α’亚基，α’亚基用胰凝乳蛋白酶处理以得到氨基端区域，它显然具有 最高的LDL受体活化活性。

发明详述

本发明涉及用于选择性提取、纯化和酶促修饰大豆的β-伴大豆球蛋白 α’亚基的方法，该方法包括以下步骤：

a)用亚硫酸氢钠水溶液在弱酸性pH下从磨碎的脱脂大豆中提取得到 β-伴大豆球蛋白富集的可溶性蛋白质级分；

b)用乙醇处理而沉淀来自步骤a)的β-伴大豆球蛋白级分；

c)在变性剂条件下通过金属亲和层析(MAC)纯化步骤b)得到的沉淀 级分，以分离α’亚基；

d)用蛋白水解酶酶促处理来自步骤c)的α’亚基，并进一步通过MAC 层析纯化；

e)用有机溶剂沉淀α’亚基。

β-伴大豆球蛋白的富集在图1中显示。起始材料是通过用溶剂去除 脂级分而脱脂的大豆粉。在弱酸性pH下用亚硫酸氢钠水溶液提取该起始 材料。使用14-16倍起始材料重量的溶液体积，优选14.5-15.5倍。亚硫 酸氢盐的浓度为0.80-1.20g/l，优选地为0.90-1.10g/l，最优选地为 0.95-1.05g/l。提取在温度-2-8℃进行14到18小时。根据本发明一个优选 的实施方案，提取是在0-4℃，pH值为6.4的0.98g/l 15倍体积亚硫酸氢 盐溶液中进行16小时。

在上述pH值和温度条件下，大豆球蛋白的溶解度很低，因此它们和 其它不可溶物质一起沉淀下来。沉淀物通过离心分离，将可溶的级分在20 ℃-30℃的温度，优选地在室温25℃，用35-60％(体积/体积)含水乙醇 处理，优选地为40％含水乙醇。将上清液离心去掉，并将主要由β-伴大 豆球蛋白组成的沉淀物冷冻干燥。得到的粉末进行下一步(图2)。

用金属亲和层析的方法(Ostrove和Weiss，1990)来分离和纯化α’亚基 的选择取决于该亚基与金属离子，如Zn2+和Ni2+的结合能力，因为该亚基 比起α亚基和β亚基来组氨酸含量更高(Thanh和Shibasaki，1978)。

使用与锌或镍，优选地使用与锌结合的基质。根据本发明一个优选的 实施方案，此基质由亚氨基二乙酸琼脂糖组成。将冷冻干燥的蛋白质在由 50mM Tris、0.5M NaCl、pH7.2组成的、含5-8M尿素，优选地含5M尿 素的变性缓冲液中悬浮。在这些条件下，α’亚基选择性地结合到基质上， α亚基和β亚基可以通过用上述缓冲液洗脱而去除；α’亚基随后用在相同 缓冲液或蒸馏水中含0.1M咪唑的溶液洗脱。

将富集α’亚基的蛋白质级分收集起来并用有机溶剂处理，使蛋白质沉 淀，优选地用冷丙酮处理。所使用的丙酮体积为级分体积的2-5倍，优选 地3-4倍，在-10--30℃，优选地在-15--25℃之间的温度。根据本发明 一个优选的实施方案，应用-20℃，3倍体积的丙酮。所得的沉淀物用离心 法分离，重悬在乙醇中，优选95％的乙醇，然后进一步离心、冷冻干燥。 冷冻干燥物包括94％的蛋白质，其α’亚基富集量是起始材料的十倍。

表1显示了从大豆粉提取出来的β-伴大豆球蛋白和α’亚基的产量。

                                                               表1    蛋白质级分    起始材料     提取产量(％重量)    β-伴大豆球蛋白    脱脂粉     18.7    α’亚基    β-伴大豆球蛋白     11.0    α’亚基    脱脂粉     2.1

α’亚基的多肽片段是将来自前面步骤的冷冻干燥物用蛋白水解酶进 行酶促处理制备得到的。根据本发明一个优选的实施方案，蛋白水解酶是 胰凝乳蛋白酶，且所得到的片段主要由分子量28,000Da的氨基端区域组 成。

流程如下所述：从前面几步得到的冷冻干燥物以5mg/ml溶解于pH值 7.5-8.5，含有1.6M尿素的0.2M NH4HCO3中。将胰凝乳蛋白酶以1∶10-1∶50 比例，优选地1∶25w/w加入上述底物中，在37℃搅拌温育24小时。接下 来实施前面所述的金属亲和层析这一步骤。

用咪唑洗脱下来的物质包含三个多肽片段，主要的一个具有分子量 28000Da，它组成α’亚基的N-末端区域。

将α’亚基和胰凝乳蛋白酶片段施与大鼠(表2)证明两者都显著降低 了胆固醇和总甘油三酯血浆水平。特别是胰凝乳蛋白酶片段被证明在降低 胆固醇水平方面它不仅比其他大豆成分更有效，而且比安妥明更有效，并 且它还提供了不相上下的对甘油三酯的结果。

该生物学实验的结果表明了根据本发明的方法获取的产品，特别是α’ 亚基及其片段可以用来作为药物，特别是用于治疗那些需要降低胆固醇和/ 或甘油三酯血浆水平的病症。所述化合物可以单独使用或与其它活性成分 组合，并与合适的载体混和，用来制备药物组合物，特别是用于治疗高脂 血症的药物组合物。此外，它们还可以用来在上面提到的条件下制备用于 膳食疗法的补充物或食品。

实施例

第一步：从大豆纯化7S球蛋白

起始材料是磨碎的大豆，根据索格利特法脱脂，使用戊烷做溶剂。

蛋白质用0.98g/l的亚硫酸氢钠溶液以15倍脱脂磨碎的大豆体积提取， 在温度0-4℃提取16小时，保持pH值为6.4。离心后，上清液用40％(体 积/体积)乙醇溶液在室温下处理。将得到的富集β-伴大豆球蛋白和含有 起始材料双倍浓度的α’亚基的沉淀物冷冻干燥。

第二步：α’亚基的纯化

β-伴大豆球蛋白富集级分在变性缓冲液(50mM Tris、0.5M氯化钠、 pH值为7.2)中重悬，缓冲液中含5M尿素，并在与锌结合的亚氨基二乙 酸琼脂糖基质(Sigma)上进行金属亲和层析纯化。未结合的蛋白质物质 用上述相同的缓冲液洗脱，结合的蛋白质物质主要由α’亚基组成，被含 0.1M咪唑的相同缓冲液或蒸馏水洗脱。

将富集α’亚基的级分用3-4倍体积的-20℃丙酮处理；所得的沉淀物 室温下在40％乙醇中悬浮，然后离心、冷冻干燥。所得到的粉末包含94 ％的蛋白质，并且α’亚基富集量是起始材料的十倍。

第三步：α’亚基的酶促处理

从前面几步得到的冷冻干燥物以5mg/ml的浓度在pH值7.5-8.5，含 有1.6M尿素的0.2M NH4HCO3中溶解。将胰凝乳蛋白酶以1∶25w/w比例 加入蛋白质底物中，温度37℃下搅动温育24小时，然后进行上述的金属 亲和层析纯化。被树脂滞留并用0.1M咪唑洗脱下来的物质包含三个多肽 片段，主要的一个具有分子量28000Da，它由α’亚基的N-末端区域组成。

生物学实验

动物

使用雄性大鼠CD SPF/VAF，重量为75-100g。这些动物饲养在聚碳 酸酯笼子里(每个笼子4-5只动物)，笼子放在自动控制光线(12小时明 /12小时暗的循环)、温度(21±1℃)、湿度(60±5％)的环境里。

实验方法

饲养七天后，将这些动物随机分成七组，每组20只大鼠(表2)。28 天期间之内，一组喂养正常饮食(cod.014RF25C；Mucedola S.r.l.，Settimo Milanese，MI，Italy)，而其他组喂养由1％胆固醇、0.5％胆酸和25％氢化 椰子油组成的高胆固醇饮食(批号为332000，2000.09.01制备；Laboratorio Dottori Piccioni，Gessate，MI，Italy)，自由获取水。该饮食每天(40g，上午 9:00)喂养它们，剩下没吃的称重。按照下面进行处理。

组1(对照)：给动物喂养正常饮食，用0.5％的羧甲基纤维素溶液口 服处理28天。

组2：给动物喂养高胆固醇饮食，用0.5％的羧甲基纤维素溶液口服处 理28天。

组3：给动物喂养高胆固醇饮食，用200mg/kg剂量的安妥明口服处 理28天。

组4：给动物喂养高胆固醇饮食，用200mg/kg剂量的大豆总蛋白质 提取物口服处理28天。

组5：给动物喂养高胆固醇饮食，用50mg/kg剂量的β-伴大豆球蛋 白口服处理28天。

组6：给动物喂养高胆固醇饮食，用10mg/kg剂量的α’亚基口服处理 28天。

组7：给动物喂养高胆固醇饮食，用1mg/kg剂量的α’亚基胰凝乳蛋 白酶片段口服处理28天。

总胆固醇和甘油三酯血浆水平在28天的处理和16小时的禁食后进行 检测。将动物用乙醚麻醉，使血液从下腔静脉流入含有EDTA(1mg/ml)的 试管中。在4℃，3000转/分离心15分钟后，血浆回收、冷冻，并储存在 -20℃温度，直到检测为止。

总胆固醇和甘油三酯血浆浓度(表2中报道)由常规的酶促鉴定法来 确定。

                                                                表2     处理     总胆固醇(mg/dL)    总甘油三酯(mg/dL)     组1     55.4±3    105.1±7.2     组2     284.1±10.3    226.9±12.6     组3     191.2±8.0    139.1±5.8     组4     236.1±10.2    176.9±8.1     组5     196.4±7.6    146.7±5.9     组6     182.2±12.1    150.1±9.8     组7     175.8±7.9    140.3±7.4

参考文献

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