表位序列
阅读：612发布：2020-05-11
专利汇可以提供表位序列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开的是多肽，包括表位，聚簇，和 抗原 。还公开包括所述多肽的组合物和它们的使用方法。，下面是表位序列专利的具体信息内容。
1.分离的核酸，其编码包含来自肿瘤相关抗原PRAME(SEQ ID NO：77)的表位聚簇的多肽，所述聚簇定义为含有比表位平均密度更高的SEQID NO：77的区段，其中所述表位聚簇的表位密度比率大于1，其中所述多肽不同于PRAME的全长天然序列。
2.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇的表位密度比率大于1.3。
3.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇的表位密度比率大于2。
4.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇小于PRAME的氨基酸序列的80％。
5.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇选自以下组成的组：PRAME的氨基酸 18-59，33-47，71-81，78-115，99-108，126-135，222-238，224-246，290-303，305-324，
343-363，364-447，394-409，422-443，和459-487。
6.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇的长度小于约30个氨基酸。
7.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇是免疫活性的。
8.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇包含管家表位。
9.权利要求1的分离的核酸，其中所述表位聚簇包含免疫表位。
10.免疫原性组合物，其包含权利要求1的核酸。
11.免疫原性组合物，其包含权利要求1的所编码的多肽。
12.免疫原性组合物，其包含权利要求1的所编码的表位聚簇。
表位序列
[0003] 相关技术的描述
[0004] 瘤形成与免疫系统
[0005] 通常称为癌的肿瘤性疾病状态被认为是通常由一个生长不受控制的单细胞引起。不受控制的生长状态典型地由一个多级过程引起，其中一系列细胞系统衰竭，导致赘生性细胞的发生。产生的赘生性细胞迅速繁殖它自身，形成一种或多种肿瘤，最终可导致宿主的死亡。
[0006] 由于赘生性细胞的先祖共享宿主的遗传物质，赘生性细胞大多不受宿主免疫系统攻击。在免疫监视期间，该过程中宿主免疫系统监视和定位外源物质，在宿主免疫监视机器看来赘生性细胞为“自身”细胞。
[0007] 病毒与免疫系统
[0008] 与癌细胞相反，病毒感染涉及明显非自身抗原的表达。结果，免疫系统以最小的临床后遗症成功对付了许多病毒感染。此外，对于导致严重疾病的那些感染中的许多已经可以开发有效疫苗。已经成功使用多种疫苗方法来抗击各种疾病。这些方法包括亚单位疫苗，其由通过重组DNA技术生产的单独蛋白质组成。尽管有了这些进展，用作病毒疫苗的最小表位的选择和有效给药仍然有问题。
[0009] 除与表位选择有关的困难之外，存在已经进化逃避宿主免疫系统能力 的病毒的问题。许多病毒，特别是建立持久感染的病毒，如疱疹和痘病毒家族的成员，产生免疫调制分子，其允许病毒逃避宿主免疫系统。这些免疫调制分子对抗原呈递的作用可以通过将用于给药的选择表位作为免疫原性组合物的目标来克服。为了更好理解赘生性细胞和病毒感染细胞与宿主免疫系统的相互作用，下面接着讨论系统组分。
[0010] 免疫系统起将对于一种生物内源的分子(“自身”分子)从对于该生物外源或异质的物质(“非自身”分子)区别开来的作用。基于介导应答的组分，免疫系统具有两类针对外物的适应性应答：体液应答和细胞介导应答。体液应答是由抗体介导的，而细胞介导的应答涉及归类为淋巴细胞的细胞。近来的抗癌和抗病毒策略已集中在调动宿主免疫系统作为一种抗癌或抗病毒治疗或疗法的方法。
[0011] 免疫系统在三个阶段中起作用来保护宿主免受外物伤害：识别阶段，活化阶段和效应阶段。在识别阶段，免疫系统识别并发出信号体内存在外源抗原或侵入物。外源抗原可以是例如来源于赘生性细胞的细胞表面标记或病毒蛋白。一旦系统察觉到侵入物，响应于侵入物触发的信号，免疫系统的抗原特异性细胞增殖并分化。最后阶段是效应阶段，其中免疫系统的效应细胞应答并中和检测的侵入物。
[0012] 一系列效应细胞实施对侵入物的免疫应答。一类效应细胞，B细胞产生靶向宿主遇到的外源抗原的抗体。与补体系统结合，抗体指导携带靶抗原的细胞或生物的破坏。另一类效应细胞是天然杀伤细胞(NK细胞)，一类淋巴细胞，其具有同时识别和破坏多种病毒感染的细胞以及恶性细胞类型的能力。不大理解NK细胞识别靶细胞所使用的方法。 [0013] 另一类效应细胞，T细胞，具有分类为三亚类的成员，每亚类在免疫应答中发挥不同作用。辅助T细胞分泌细胞因子，其刺激产生有效免疫应答所必需的其它细胞的增殖，而抑制性T细胞下调免疫应答。第三类T细胞，细胞毒性T细胞(CTL)，能够直接溶解在它表面呈递外源抗原的靶细胞。
[0014] 主要组织相容性复合体和T细胞目标识别
[0015] T细胞是在对特异性抗原信号的应答中发挥作用的抗原特异性免疫细 胞。B淋巴细胞和它们产生的抗体也是抗原特异性的实体。然而，不同于B淋巴细胞，T细胞对游离或可溶形式的抗原不应答。为了T细胞对抗原应答，需要将抗原加工成肽，其然后与主要组织相容性复合体(MHC)中编码的呈递结构结合。该要求称为“MHC限制性”并且这是T细胞从“非自身”细胞区分“自身”的机制。如果一种抗原不为可识别的MHC分子所展示，T细胞将不识别和作用于该抗原信号。与可识别MHC分子结合的肽的特异性T细胞与这些MHC-肽复合体结合，并进入免疫应答的下一阶段。
[0016] 存在两类MHC，I类MHC和II类MHC。T辅助细胞(CD4+)主要与II类MHC蛋白质+相互作用，而溶细胞的T细胞(CD8)主要与I类MHC蛋白质相互作用。两类MHC蛋白质都是跨膜蛋白质，它们大部分结构在细胞外表面。此外，两类MHC蛋白质在它们的外部都具有肽结合裂缝(binding cleft)。内源或外源蛋白质的小片段被结合在该裂缝中并呈递于胞外环境中。
[0017] 称为“专职抗原呈递细胞”(pAPCs)的细胞利用MHC蛋白质将抗原展示给T细胞，但另外表达各种共同刺激分子，其取决于pAPC的分化/激活的具体状态。当与可识别MHC蛋白质结合的肽的特异性T细胞与pAPCs上的这些MHC-肽复合体结合时，作用于T细胞的特异性共刺激分子指导T细胞所采取的分化/激活途径。即，共刺激分子影响在未来遭遇中当它进入免疫应答的下一阶段时T细胞将如何作用于抗原信号。
[0018] 如上讨论，大多赘生性细胞被免疫系统忽略。大量努力正花在努力控制宿主免疫系统以帮助对抗宿主中赘生性细胞的存在。一个该研究领域涉及配制抗癌疫苗。 [0019] 抗癌疫苗
[0020] 患者的免疫系统是肿瘤学家抗癌的战斗中可利用的各种武器之一。在各种努力中已经进行工作以使免疫系统抗击癌症或肿瘤性疾病。不幸地，到此为止的结果大多是令人失望的。特别感兴趣的一个领域涉及生产和使用抗癌疫苗。
[0021] 为了生产疫苗或其它免疫原性组合物，必需将针对其可产生免疫应答 的抗原或表位引入受试者。尽管赘生性细胞是来源于正常细胞并因此在遗传水平上与正常细胞基本上相同，但已知许多赘生性细胞呈递肿瘤相关抗原(TuAAs)。理论上，受试者的免疫系统可以利用这些抗原来识别这些抗原并攻击赘生性细胞。然而，实际上赘生性细胞通常看来似乎为宿主的免疫系统所忽略。
[0022] 已经开发许多不同策略试图生产具有抗赘生性细胞活性的疫苗。这些策略包括使用肿瘤相关抗原作为免疫原。例如，美国专利号5,993,828描述了一种通过对受试者给药有效剂量的一种组合物来产生针对尿肿瘤相关抗原(Urinary Tumor Associated Antigen)特定亚基的免疫应答的方法，所述组合物包含在细胞表面具有尿肿瘤相关抗原的灭活肿瘤细胞和至少一种选自GM-2，GD-2，胎儿抗原和黑素瘤相关抗原的肿瘤相关抗原。因此，本专利描述将完整的灭活肿瘤细胞用作抗癌疫苗中的免疫原。
[0023] 使用抗癌疫苗的另一种策略涉及给药一种含有单独肿瘤抗原的组合物。在一种方法中，将MAGE-A1抗原性肽用作免疫原(参见Chaux，P.，等，“Identification of Five MAGE-A 1Epitopes Recognized by Cytolytic TLymphocytes Obtained by In Vitro Stimulation with Dendritic Cells Transduced with MAGE-A1，”J.Immunol.，163(5)：2928-2936(1999))。已经有几个将MAGE-A1肽用于接种的治疗实验，尽管该接种疗法的效th
力有限。在Vose，J.M.，“Tumor Antigens Recognized by T Lymphocytes，”10 European Cancer Conference，Day 2，Sept.14，1999中讨论了这些试验中的一些的结果。 [0024] 在另一个用作疫苗的肿瘤相关抗原的实例中，Scheinberg等使用5次注射I类相关的bcr-abl肽和辅助肽加上佐剂QS-21来治疗12位已经接受干扰素(IFN)或羟脲的慢性髓细胞性白血病(CML)患者。Scheinberg，D.A.，等，“BCR-ABL Breakpoint Derived Oncogene Fusion Peptide Vaccines Generate Specific Immune Responses in Patients with Chronic Myelogenous Leukemia(CML)[摘要1665]，American Society of Clinical th
Oncology 35 Annual Meeting，亚特兰大(1999)。引发了表示T-辅助细胞活性的增殖和迟发型超敏反应(DTH)T细胞应答，但在新鲜血样中未观测到溶细胞的杀伤T细胞活性。 [0025] 在Cebon等和Scheibenbogen等的近来工作中看到尝试鉴定用作疫苗的TuAAs的另外实例。Cebon等使用皮内给药的MART-126-35肽和以增大剂量皮下或静脉内给予的IL-12免疫具有转移性黑素瘤的患者。最初的15位患者中，注意到1位完全缓解，1位部分缓解，和1位混合应答。对于T细胞产生的免疫测定包括DTH，其在使用或不使用IL-12的患者中发现。在有临床益处(clinical benefit)迹象的患者中发现阳性CTL测定，但在没有肿瘤退化的患者中未发现。Cebon等，“Phase I Studies of Immunization with Melan-A and IL-12in HLA A2+Positive Patients with Stage III and IV Malignant Melanoma，”[摘th
要1671]，American Society of Clinical Oncology 35 Annual Meeting，亚特兰大
1999)。
力有限。在Vose，J.M.，“Tumor Antigens Recognized by T Lymphocytes，”10 European Cancer Conference，Day 2，Sept.14，1999中讨论了这些试验中的一些的结果。 [0024] 在另一个用作疫苗的肿瘤相关抗原的实例中，Scheinberg等使用5次注射I类相关的bcr-abl肽和辅助肽加上佐剂QS-21来治疗12位已经接受干扰素(IFN)或羟脲的慢性髓细胞性白血病(CML)患者。Scheinberg，D.A.，等，“BCR-ABL Breakpoint Derived Oncogene Fusion Peptide Vaccines Generate Specific Immune Responses in Patients with Chronic Myelogenous Leukemia(CML)[摘要1665]，American Society of Clinical th
Oncology 35 Annual Meeting，亚特兰大(1999)。引发了表示T-辅助细胞活性的增殖和迟发型超敏反应(DTH)T细胞应答，但在新鲜血样中未观测到溶细胞的杀伤T细胞活性。 [0025] 在Cebon等和Scheibenbogen等的近来工作中看到尝试鉴定用作疫苗的TuAAs的另外实例。Cebon等使用皮内给药的MART-126-35肽和以增大剂量皮下或静脉内给予的IL-12免疫具有转移性黑素瘤的患者。最初的15位患者中，注意到1位完全缓解，1位部分缓解，和1位混合应答。对于T细胞产生的免疫测定包括DTH，其在使用或不使用IL-12的患者中发现。在有临床益处(clinical benefit)迹象的患者中发现阳性CTL测定，但在没有肿瘤退化的患者中未发现。Cebon等，“Phase I Studies of Immunization with Melan-A and IL-12in HLA A2+Positive Patients with Stage III and IV Malignant Melanoma，”[摘th
要1671]，American Society of Clinical Oncology 35 Annual Meeting，亚特兰大
1999)。
[0026] Scheibenbogen等用4种I类HLA限制性酪氨酸酶肽免疫18位患者，其中16位患者用转移性黑素瘤免疫和用佐剂免疫2位患者。Scheibenbogen等“Vaccination with Tyrosinase peptides and GM-CSF in Metastatic Melanoma：a Phase II Trial，”[摘要th1680]，American Society of Clinical Oncology 35 Annual Meeting，亚特兰大(1999)。
在4/15患者中，其中2位用佐剂免疫和2位有肿瘤退化迹象的患者中观测到增强的CTL活性。如在Cebon等的试验中，患有进行性疾病(progressive disease)的患者未显示增强的免疫性。尽管到此为止花了各种努力来产生有效的抗癌疫苗，仍未开发出该组合物。 [0027] 抗病毒疫苗
在4/15患者中，其中2位用佐剂免疫和2位有肿瘤退化迹象的患者中观测到增强的CTL活性。如在Cebon等的试验中，患有进行性疾病(progressive disease)的患者未显示增强的免疫性。尽管到此为止花了各种努力来产生有效的抗癌疫苗，仍未开发出该组合物。 [0027] 抗病毒疫苗
[0028] 保护免患病毒病的疫苗策略已经取得许多成功。或许这些中最显著的是对抗疾病天花已取得的进步，天花已经被灭绝。脊髓灰质炎疫苗的成功具有类似的重要性。 [0029] 可将病毒疫苗分为三类：活减毒病毒疫苗，如对于天花的牛痘，萨宾脊髓灰质炎病毒疫苗，和麻疹流行性腮腺炎和风疹；完全杀死或灭活的病毒疫苗，如索尔克脊髓灰质炎病毒疫苗，甲型肝炎病毒疫苗和典型流感病毒疫苗；和亚单位疫苗，如乙型肝炎。由于它们缺乏完整的病毒基因组，亚单位疫苗比基于完整病毒的那些提供更大程度的安全性。 [0030] 成功的亚单位疫苗的范例是基于病毒包膜蛋白的重组乙型肝炎疫苗。 尽管许多学术者对将超越单个蛋白质的还原论者亚单位概念推至单独表位感兴趣，但该努力尚未产生许多成果。病毒疫苗研究也已集中在诱导抗体应答，尽管也发生细胞应答。然而，许多亚单位制剂在产生CTL应答方面特别差。
[0031] 发明概述
[0032] 引发专职抗原呈递细胞(pAPCs)展示靶细胞表位的先前方法已经简单依赖于使pAPCs表达靶相关抗原(TAAs)，或那些被认为具有对MHC I类分子高亲和力的抗原的表位。然而，这类抗原的蛋白酶体加工导致在pAPC上呈递的表位与靶细胞上的表位不相对应。 [0033] 利用有效的细胞免疫应答要求pAPCs呈递相同的由靶细胞呈递的表位的知识，本发明提供具有对MHC I高亲和力，并且与在周围细胞中活跃的管家蛋白酶体的加工特异性相对应的表位。这些表位因此与在靶细胞上呈递的那些相对应。将这类表位用于疫苗中可以激活细胞免疫应答来识别正确加工的TAA并可导致去除呈递这类表位的靶细胞。在一些实施方案中，这里提供的管家表位可与免疫表位结合使用，产生细胞免疫应答，其在干扰素诱导之前和之后都能够攻击靶细胞。在其它实施方案中将该表位用于诊断和监测靶相关疾病和用于生产针对这类目的的免疫试剂。
[0034] 本发明的实施方案涉及分离的(isolated)表位和包含表位的抗原或多肽。优选的实施方案包括含有表1中公开序列的表位或抗原。其它实施方案可包括一种包含源于表1的多肽的表位聚簇。此外，多个实施方案包括一种与已经提及的表位，多肽，抗原或聚簇基本类似的多肽。其它优选的实施方案包括一种与上述的任何一种功能相似的多肽。还有另外的实施方案涉及一种编码来自表1和这里提及的所述表位，聚簇，抗原和多肽中任何一种的多肽的核酸。为了下列总结的目的，当提到“表位”或“多种表位”时，本发明其它实施方案的讨论无限制地指的是所有前述形式的表位。
[0035] 表位可以是免疫活性的。包含表位的多肽长度可以小于大约30个氨基酸，更优选地，例如，多肽长度为8-10个氨基酸。物质(substantial)或功能的相似性可包括例如增加至少一个氨基酸，和至少一个附加的氨基酸 可以是在多肽的N-末端。物质或功能的相似性可以包括替代至少一个氨基酸。
[0036] 表位，聚簇或包含它的多肽可具有对HLA-A2分子的亲和力。该亲和力可以通过结合试验，表位识别限制性试验，预测算法等测定。表位，聚簇或包含它的多肽可具有对HLA-B7，HLA-B51分子等的亲和力。
[0037] 在优选的实施方案中，多肽可以是一种管家表位。该表位或多肽可对应于在肿瘤细胞上展示的表位，对应于在新脉管系统(neovasculature)细胞上展示的表位等。该表位或多肽可以是免疫表位。该表位，聚簇和/或多肽可以是核酸。
[0038] 其它实施方案涉及药物组合物，其包含包括来源于表1的表位，聚簇，或包含它的多肽的多种多肽，和药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。所述佐剂可以是多核苷酸。该多核苷酸可包括二核苷酸，其例如可以是CpG。所述佐剂可以为一种多核苷酸所编码。该佐剂可以是一种细胞因子，所述细胞因子例如可以是GM-CSF。
[0039] 药物组合物可另外包括一种专职抗原呈递细胞(pAPC)。pAPC例如可以是树突细胞。药物组合物可另外包括第二表位。第二表位可以是多肽，核酸，管家表位，免疫表位等。 [0040] 还有另外的实施方案涉及药物组合物，其包括这里讨论的任何核酸，包括编码包含来自表1的表位或抗原的多肽的那些核酸。这类组合物可包括药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。
[0041] 其它实施方案涉及包括如这里所描述的这种核酸的重组构建体，其包括编码包含来自表1的表位或抗原的多肽的那些核酸。构建体可另外包括质粒，病毒载体，人工染色体等。构建体可另外包括一种序列，其编码至少一种特征(feature)，例如，第二表位，IRES，ISS，NIS，遍在蛋白质等。
[0042] 另外的实施方案涉及纯化的抗体，其与至少一种表1中的表位特异性结合。其它实施方案涉及与一种肽-MHC蛋白质复合体特异性结合的纯化抗体，所述肽-MHC蛋白质复合体包含一种表1中公开的表位或任何其它适当的表位。来源于任何实施方案的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0043] 还有其它实施方案涉及多聚体MHC-肽复合体，其包括一种表位，如，例如一种表1中公开的表位。同样，考虑对复合体特异性的抗体。
[0044] 多种实施方案涉及表达对MHC-肽复合体特异性的T细胞受体的分离的T细胞。所述复合体可包括一种表位，如，例如表1中公开的表位。T细胞可以通过体外免疫生产并且可以从免疫动物中分离。多种实施方案涉及T细胞克隆，包括克隆的T细胞，如上面讨论的那些。多种实施方案还涉及T细胞的多克隆群体。该群体可包括例如如上所述的T细胞。 [0045] 还有另外的实施方案涉及药物组合物，其包括例如如上所述的那些的T细胞和药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。
[0046] 本发明的多种实施方案涉及分离的蛋白质分子，其包含对MHC-肽复合体特异性的T细胞受体的结合域。复合体可包括表1公开的表位。蛋白质可以是多价体。其它实施方案涉及编码该蛋白质的分离的核酸。还有另外的实施方案涉及包括该核酸的重组构建体。
[0047] 本发明的其它实施方案涉及表达如在这里描述的重组构建体的宿主细胞，所述重组构建体包括编码例如在表1公开的表位，聚簇或包含它的多肽的构建体。宿主细胞可以是树突细胞，巨噬细胞，肿瘤细胞，肿瘤衍生的细胞，细菌，真菌，原生动物等。多种实施方案还涉及药物组合物，其包括一种宿主细胞，如在这里讨论的那些，和一种药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。
[0048] 还有其它实施方案涉及疫苗或免疫治疗组合物，其包括至少一种组分，例如表1中公开或在这里另外描述的表位；包括该表位的聚簇，包括该表位的抗原或多肽；如上面和在这里描述的组合物；如上面和在这里描述的构建体，T细胞，或如上面和在这里描述的宿主细胞。
[0049] 另外的实施方案涉及治疗动物的方法。方法可包括对动物给药一种药物组合物，例如一种疫苗或免疫治疗组合物，其包括如上面和在这里公开的那些。给药步骤可包括一种送递方式，如，例如，经皮的，结节内的(intranodal)，结节周围的(perinodal)，口服的，静脉内的，皮内的，肌内的，腹膜内的，粘膜的，气溶胶吸入，滴注等。该方法可另外包括一测定步骤以测定一种靶细胞或多种靶细胞状态的特征表现。方法可包括第一测定步骤和第二测定步骤，其中第一测定步骤在给药步骤之前，并且其中 第二测定步骤在给药步骤之后。方法可另外包括一个比较第一测定步骤中测定的特性与第二测定步骤中测定的特性以获得一个结果的步骤。该结果可以是例如免疫应答的迹象，靶细胞数量的减小，包含靶细胞的肿瘤的质量或尺寸的减小，感染靶细胞的胞内寄生物数量和浓度的减小等。
[0050] 多种实施方案涉及评估疫苗或免疫治疗组合物的免疫原性的方法。该方法可包括对动物给药一种疫苗或免疫治疗，如上面和在这里别处描述的那些，和基于动物一种特性评估免疫原性。动物可以是HLA-转基因的动物。
[0051] 其它实施方案涉及评估免疫原性的方法，其包括用疫苗或免疫治疗组合物，如上面和在这里别处描述的那些，体外刺激T细胞，和基于T细胞的一种特性评估免疫原性。刺激可以是原发刺激(primary stimulation)。
[0052] 还有另外的实施方案涉及进行被动/过继免疫治疗的方法。该方法可以包括将T细胞或宿主细胞，如上面和在这里别处描述的那些，与药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等结合。
[0053] 其它实施方案涉及测定特异性T细胞频率的方法，并可以包括将T细胞与MHC-肽复合体或包含含有这样一种表位的聚簇或抗原的复合体接触的步骤，所述MHC-肽复合体包含表1中公开的表位。接触步骤可包含至少一种特征，例如，免疫，再刺激(restimulation)，检测，计数等。该方法可另外包括ELISPOT分析，有限稀释分析，流式细胞计量术，原位杂交，聚合酶链反应，它们的任何组合等。
[0054] 多种实施方案涉及评估免疫应答的方法。该方法可包括在免疫步骤之前和之后实行的测定特异性T细胞频率的上述方法。
[0055] 其它实施方案涉及评估免疫应答的方法。该方法可包括在用MHC-肽复合体刺激之前和之后测定T细胞的频率，细胞因子产生量或溶细胞活性，所述MHC-肽复合体包含一种表位，例如来自表1的表位，包含该表位的聚簇或多肽。
[0056] 另外的实施方案涉及诊断疾病的方法。方法包括将受试者组织与至少一种组分接触，所述组分包括，例如T细胞，宿主细胞，抗体，蛋白质，其包括上面和在这里别处描述的那些；和基于组织或组分的一种特征诊断疾病。接触步骤可以例如在体内或体外发生。 [0057] 还有其它实施方案涉及生产疫苗的方法。方法可以包括将至少一种组分，表位，组合物，构建体，T细胞，宿主细胞；其包括上面和在这里别处描述的那些中的任何一种，与药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等结合。
[0058] 多种实施方案涉及其上已经记录SEQ ID NOS：1-602中任何一种序列的计算机可读介质，其是在一种具有计算含有所述序列的分子的物理，生物化学，免疫学，分子遗传特性的硬件或软件等的机器中。
[0059] 还有其它实施方案涉及治疗动物的方法。方法可以包括结合治疗动物的方法，其包括对动物给药一种疫苗或免疫治疗组合物，例如上面和在这里别处所描述的，与至少一种治疗方式结合，所述治疗方式包括例如放射治疗，化学疗法，生物化学疗法(biochemotherapy)，外科手术等。
[0060] 另外的实施方案涉及包括一种表位聚簇的分离的多肽。在优选的实施方案中，该聚簇可以是来自含有如表25-44任何一个中所公开的序列的靶相关抗原，其中氨基酸序列包括至多约80％的抗原氨基酸序列。
[0061] 其它实施方案涉及疫苗或免疫治疗产品，其包括如上面和在这里别处描述的分离的肽。还有其它实施方案涉及一种分离的的多核苷酸，其编码如上面和在这里别处描述的多肽。其它实施方案涉及包括这些多核苷酸的疫苗或免疫治疗产品。该多核苷酸可以是DNA，RNA等。
[0062] 还有其它的实施方案涉及包含一种递送装置的试剂盒和任何在上面和在这里别处提及的实施方案。所述递送装置可以是导管，注射器，内泵或外泵，贮器，吸入器，微量注射器，膜片(patch)和适合任何递送途径的任何其它类似装置。如上所述，除了递送装置之外试剂盒还包括在这里公开的实施方案中的任一种。例如，无限制地，试剂盒可以包括分离的表位，多肽，聚簇，核酸，抗原，包括前述任何一种的药用组合物，抗体，T细胞，T细胞受体，表位-MHC复合体，疫苗，免疫治疗剂等。试剂盒还可包括物品如详细的使用说明书和其它任何类似的物品。
[0064] 图1是NY-ESO-1与几个相似蛋白质序列的序列对比。
[0065] 图2图示用于递送核酸编码的表位的质粒疫苗主链。
[0066] 图3A和3B是显示酪氨酸酶207-215和酪氨酸酶208-216HLA-A2结合试验 结果的FACS曲线。
[0067] 图3C显示通过体外免疫诱导的人CTL针对酪氨酸酶表位的溶细胞活性。 [0068] 图4是由蛋白酶体切割SSX-231-68产生片段T＝120min时刻的质谱。
[0069] 图5显示HLA-A2：SSX-241-49与对照的结合曲线。
[0070] 图6显示来源于SSX-241-49免疫的HLA-A2转基因小鼠的CTL对SSX-241-49-脉冲目标的特异性溶解。
[0071] 图7A，B和C显示T＝60min时刻PSMA163-192蛋白酶体消化的等分部分N-末端池测序(pool sequencing)的结果。
[0072] 图8显示HLA-A2：PSMA168-177和HLA-A2：PSMA288-297与对照的结合曲线。 [0073] 图9显示T＝60min时刻PSMA281-310蛋白酶体消化的等分部分N-末端池测序的结果。
[0074] 图10显示HLA-A2：PSMA461-469，HLA-A2：PSMA460-469和HLA-A2：PSMA663-671与对照的结合曲线。
[0075] 图11显示检测PSMA463-471-反应性HLA-A1+CD8+T细胞的基于γ-IFN的ELISPOT试验结果。
[0076] 图12显示用抗-HLA-A1mAb封闭在图10中使用的T细胞的活性，其显示HLA-A1-限制性识别。
[0077] 图13显示HLA-A2：PSMA663-671与对照的结合曲线。
[0078] 图14显示HLA-A2：PSMA662-671与对照的结合曲线。
[0079] 图15.比较在用不同剂量DNA通过不同注射途径免疫后的抗-肽CTL应答(图显示未脉冲的EL4细胞<空心圆>和用gp33肽脉冲的EL4细胞(实三角)的裂解，符号表示单独的小鼠和显示三个类似实验中的一个)。
[0080] 图16.移植的gp33表达肿瘤在通过淋巴结内注射表达gp33表位的或对照，质粒而免疫的小鼠中的生长(对于用pEFGPL33A DNA(实圆)或对照pEGFP-N3 DNA(空心三角)免疫的小鼠显示平均肿瘤体积±1SD，括号的数字表示具有肿瘤的小鼠数/组中的小鼠总数，显示2个相似试验中的1个)。
[0081] 图17.分别在淋巴结内和肌内注射后的不同时间通过实时PCR检测的在注射或引流(draining)淋巴节中质粒DNA的量。
[0082] 优选实施方案的详述
[0083] 定义
[0084] 除非另外从使用这里的术语的上下文中清楚得知，为了本描述的目的下面列出的术语应该通常具有指明的含义。
[0085] 专职抗原呈递细胞(pAPC)——具有T细胞共刺激分子并能够诱导T细胞应答的细胞。完全表征的pAPCs包括树突细胞，B细胞和巨噬细胞。
[0086] 周围细胞——不是pAPC的细胞。
[0087] 管家蛋白酶体——通常在周围细胞中活跃的蛋白酶体，通常在pAPCs中不存在或没有强活性。
[0088] 免疫蛋白酶体——通常在pAPCs中活跃的蛋白酶体；免疫蛋白酶体在感染组织的一些周围细胞中也是活跃的。
[0089] 表位——能够刺激免疫应答的分子或物质。在优选的实施方案中，按照本定义的表位包括但不一定限于一种多肽和一种编码多肽的核酸，其中所述多肽能够刺激免疫应答。在其它优选的实施方案中，按照本定义的表位包括但不一定限于存在细胞表面的肽，所述肽非共价键地与I类MHC的结合裂缝结合，这样它们可以与T细胞受体相互作用。 [0090] MHC表位——对哺乳动物I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)分子具有已知或预测结合亲和力的多肽。
[0091] 管家表位——在一个优选的实施方案中，将管家表位定义为一种多肽片段，其是一种MHC表位，并且展示在其中管家蛋白酶体活性突出的细胞上。在另一个优选实施方案中，将管家表位定义为一种含有按照前述定义的管家表位的多肽，其侧邻一个至几个附加的氨基酸。在另一个优选实施方案中，将管家表位定义为一种编码按照前述定义的管家表位的核酸。
[0092] 免疫表位——在一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种多肽片段，其是一种MHC表位，并且展示在其中管家蛋白酶体活性突出的细胞上。在另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种含有按照前述定义的免疫表位的多肽，其侧邻一个至几个附加的氨基酸。在另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种包括一个表位聚簇序列，含有至少两个对I类MHC具有已知或预测亲和力的多肽序列的多肽。在还有的另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种编码按照上述定义中任何一种的免疫表位的核酸。 [0093] 靶细胞——被疫苗和本发明方法所靶向的细胞。按照本定义的靶细胞 的实例包括但不一定限于：赘生性细胞和含有胞内寄生物的细胞，例如病毒，细菌或原生动物。 [0094] 靶相关抗原(TAA)——在靶细胞中存在的蛋白质或多肽。
[0095] 肿瘤相关抗原(TuAA)——TAA，其中靶细胞是赘生性细胞。
[0096] HLA表位——对人I类或II类HLA复合体分子具有已知或预测结合亲和力的多肽。
[0097] 抗体——多克隆或单克隆天然免疫球蛋白(Ig)，或任何完全或部分由Ig结合域组成的分子，不管生物化学衍生的或通过使用重组DNA得到。实施例包括，尤其是F(ab)，单链Fv和Ig可变区-噬菌体外被蛋白融合。
[0098] 编码——可扩充的(open-ended)术语以致编码特定氨基酸序列的核酸可由确定那个(多)肽的密码子组成，但还可包含附加的序列，其是可译的或用于控制转录，翻译或复制，或便于操作一些宿主的核酸构建体。
[0099] 物质相似性——该术语用来指如通过检查序列判断以间接的方式不同于参考序列的序列。尽管在简并位置的差异或在长度或任何非编码区组成上的适度差异，编码相同氨基酸序列的核酸序列基本上相似。只是通过保守置换或小的长度变化而相异的氨基酸序列基本上是相似的。另外，包含在N-末端侧翼残基数量不同的管家表位，或在任一末端侧翼残基数量不同的免疫表位和表位聚簇的氨基酸序列基本上是相似的。编码基本上相似的氨基酸序列的核酸它们自己也基本上相似。
[0100] 功能相似性——该术语用于指如通过检测生物或生物化学特性判断以间接的方式不同于参考序列的序列，尽管序列可能不是基本上相似。例如，可将两种核酸用作针对相同序列但编码不同氨基酸序列的杂交探针。即使它们通过非保守氨基酸置换而相异(因此不符合物质相似性的定义)，诱导交叉反应性CTL应答的两种肽在功能上相似。识别相同表位的成对抗体或TCRs可以是在功能上彼此相似，尽管存在任何结构差异。在检验免疫原性的功能相似性中，通常用“改变的”抗原免疫个体并检 验引发应答(Ab，CTL，细胞因子产生等)识别靶抗原的能力。因此，可以设计在某些方面不同而保持相同功能的两种序列。该设计的序列变体在本发明的实施方案中。
[0101] 表1A.包括实施例1-7，13中的表位的SEQ ID NOS.*
[0102]
[0103]
[0104] 表1B.包括实施例14和15中的表位的SEQ ID NOS.*
[0105]SEQIDNO 身份 序列
70 GP100蛋白 **登记号：P40967
71 MAGE-1蛋白 登记号：P43355
72 MAGE-2蛋白 登记号：P43356
73 MAGE-3蛋白 登记号：P43357
74 NY-ESO-1蛋白 登记号：P78358
75 LAGE-1a蛋白 登记号：CAA11116
76 LAGE-1b蛋白 登记号：CAA11117
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78 PSA蛋白 登记号：P07288
79 PSCA蛋白 登记号：O43653
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89 GP100629-638 QLPHSSSHWL
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116 MAGE-1170-177 VLVTCLGL
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149 MAGE-2153-162 KASEYLQLVF
150 MAGE-2218-225 EEKIWEEL
151 MAGE-2216-225 APEEKIWEEL
152 MAGE-2216-223 APEEKIWE
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176 NY-ESO-193-102 AMPFATPMEA
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205 PRAME 218-227 MPMQDIKMIL
206 PRAME 428-436 QHLIGLSNL
207 PRAME 427-436 LQHLIGLSNL
208 PRAME 429-436 HLIGLSNL
209 PRAME 431-439 IGLSNLTHV
210 PRAME 430-439 LIGLSNLTHV
211 PSA 53-61 VLVHPQWVL
212 PSA 52-61 GVLVHPQWVL
213 PSA 52-60 GVLVHPQWV
214 PSA 59-67 WVLTAAHCI
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217 PSA 54-62 LVHPQWVLT
218 PSA 66-73 CIRNKSVI
219 PSA 65-73 HCIRNKSVI
220 PSA56-64 HPQWVLTAA
221 PSA 63-72 AAHCIRNKSV
222 PSCA 116-123 LLWGPGQL
223 PSCA 115-123 LLLWGPGQL
224 PSCA 114-123 GLLLWGPGQL
225 PSCA 99-107 ALQPAAAIL
226 PSCA 98-107 HALQPAAAIL
227 Tyr128-137 APEKDKFFAY
228 Tyr129-137 PEKDKFFAY
229 Tyr 130-138 EKDKFFAYL
230 Tyr 131-138 KDKFFAYL
231 Tyr205-213 PAFLPWHRL
232 Tyr 204-213 APAFLPWHRL
233 Tyr214-223 FLLRWEQEIQ
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235 Tyr191-200 GSEIWRDIDF
236 Tyr192-200 SEIWRDIDF
237 Tyr 473-481 RIWSWLLGA
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240 Tyr478-486 LLGAAMVGA
241 PSMA 4-12 LLHETDSAV
242 PSMA 13-21 ATARRPRWL
243 PSMA53-61 TPKHNMKAF
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245 PSMA69-77 NIKKFLH1NF
246 PSMA 68-77 ENIKKFLH1NF
247 PSMA 220-228 AGAKGVILY
248 PSMA468-477 PLMYSLVHNL
249 PSMA 469-477 LMYSLVHNL
250 PSMA 463-471 RVDCTPLMY
251 PSMA 465-473 DCTPLMYSL
252 PSMA 507-515 SGMPRISKL
253 PSMA 506-515 FSGMPRISKL
254 NY-ESO-1136-163R LTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWIT
255 NY-ESO-1150-177 SSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSG
1
217 PSA 54-62 LVHPQWVLT
218 PSA 66-73 CIRNKSVI
219 PSA 65-73 HCIRNKSVI
220 PSA56-64 HPQWVLTAA
221 PSA 63-72 AAHCIRNKSV
222 PSCA 116-123 LLWGPGQL
223 PSCA 115-123 LLLWGPGQL
224 PSCA 114-123 GLLLWGPGQL
225 PSCA 99-107 ALQPAAAIL
226 PSCA 98-107 HALQPAAAIL
227 Tyr128-137 APEKDKFFAY
228 Tyr129-137 PEKDKFFAY
229 Tyr 130-138 EKDKFFAYL
230 Tyr 131-138 KDKFFAYL
231 Tyr205-213 PAFLPWHRL
232 Tyr 204-213 APAFLPWHRL
233 Tyr214-223 FLLRWEQEIQ
234 TyR212-220 RLFLLRWEQ
235 Tyr191-200 GSEIWRDIDF
236 Tyr192-200 SEIWRDIDF
237 Tyr 473-481 RIWSWLLGA
238 Tyr 476-484 SWLLGAAMV
239 Tyr 477-486 WLLGAAMVGA
240 Tyr478-486 LLGAAMVGA
241 PSMA 4-12 LLHETDSAV
242 PSMA 13-21 ATARRPRWL
243 PSMA53-61 TPKHNMKAF
244 PSMA 64-73 ELKAENIKKF
245 PSMA69-77 NIKKFLH1NF
246 PSMA 68-77 ENIKKFLH1NF
247 PSMA 220-228 AGAKGVILY
248 PSMA468-477 PLMYSLVHNL
249 PSMA 469-477 LMYSLVHNL
250 PSMA 463-471 RVDCTPLMY
251 PSMA 465-473 DCTPLMYSL
252 PSMA 507-515 SGMPRISKL
253 PSMA 506-515 FSGMPRISKL
254 NY-ESO-1136-163R LTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWIT
255 NY-ESO-1150-177 SSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSG
1
[0110] 在SWISSPROT数据库中该H被报道为Y。
[0111] 2取决于数据库，位点274的氨基酸可以是Pro或Leu。这里展示的具体分析使用Pro。
[0112] 表1C.包括实施例14中的表位的SEQ ID NOS.*
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121] *在本发明的各种实施方案的任一个中可将SEQ ID NOS.1，8，9，11-23，26-29，32-44，47-54，56-63，66-68，88-253，和256-588中的任一个用作表位。如在本发明的各种实施方案中所描述，可将SEQ ID NOS.10，30，31，45，46，55，64，65，69，254，和255用作含有表位或表位聚簇的序列。
[0124] 在进行表位疫苗开发中，其他人已经产生基于MHC结合基序的预测表位列表。这类肽可以是免疫原性的，但可能不对应任何天然产生的抗原片段。因此，整个抗原将不引发类似的应答或使靶细胞对通过CTL的细胞溶解敏感。因此该列表不区分可以用作疫苗的那些序列和不可以用作疫苗的那些序列。测定这些预测表位中的哪些实际上是天然产生的努力已经经常依赖于筛选它们与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的反应性。然而，尽管肿瘤(和慢性感染细胞)将通常呈递管家表位，但TIL强烈偏向于识别免疫表位。因此，除非表位是由管家和免疫蛋白酶体两者生产，靶细胞将通常不为用TIL-鉴定的表位诱导的CTL所识别。相反，本发明的表位是通过特定蛋白酶体的作用产生，表明可以天然生产它们，并赋予它们适当的用途。在PCT出版物WO 01/82963A2中更充分地阐明了管家和免疫表位之间的差别对于疫苗设计的重要意义。
[0125] 本发明的表位包括或编码TAAs的多肽片段，其是通过管家或免疫 蛋白酶体进行蛋白酶体切割的前体或产物，并含有或包括对至少一个MHC I等位基因具有已知或预测亲和力的序列。在一些实施方案中，所述表位包括或编码长度约为6-25个氨基酸的多肽，其优选长度约为7-20个氨基酸，更优选长度约为8-15个氨基酸，还更优选长度约为9或10个氨基酸。然而，应当理解只要N-末端修剪可以产生MHC表位或它们不含有导致多肽被引导远离蛋白酶体或被蛋白酶体破坏的序列，所述多肽可以更大。对于免疫表位，如果更大的肽不含有这类序列，它们可以在pAPC中为免疫蛋白酶体所加工。如果通过免疫蛋白酶体作用序列适合于促进表位C-末端的释放，也可将管家表位内嵌于更长的序列中。上述讨论已经假定更长表位的加工通过pAPC免疫蛋白酶体的作用进行。然而，加工还可以通过设计一些其它机制来完成，如提供外源蛋白酶活性和适应的序列结果蛋白酶的作用释放MHC表位。可以对这些表位序列进行计算机分析以计算物理，生物化学，免疫学或分子遗传特性，如质量，等电点，预测电泳迁移率，预测与其它MHC分子的结合，核酸探针的解链温度，反向翻译，与其它序列的相似性或同源性等。
[0126] 在构建编码本发明多肽表位的多核苷酸中，可以使用相关TAA的基因序列，或者6
多核苷酸可以由任何对应的密码子组装。对于10个氨基酸的表位，这可以组成大约10 种不同序列，其取决于具体的氨基酸组成。尽管大，这是一种相异(distinct)的和容易定义
18
的集合，其表示＞10 该长度可能的多核苷酸中的一个很小部分，因此在一些实施方案中，在这里公开的具体序列的等价物包括在列表序列上的这类相异的和容易定义的变异。在选择这些序列中的具体一个用于疫苗过程中，如对于本领域技术人员将是明显的，可以利用条件如密码子使用，自身互补性，限制位点，化学稳定性等。
多核苷酸可以由任何对应的密码子组装。对于10个氨基酸的表位，这可以组成大约10 种不同序列，其取决于具体的氨基酸组成。尽管大，这是一种相异(distinct)的和容易定义
18
的集合，其表示＞10 该长度可能的多核苷酸中的一个很小部分，因此在一些实施方案中，在这里公开的具体序列的等价物包括在列表序列上的这类相异的和容易定义的变异。在选择这些序列中的具体一个用于疫苗过程中，如对于本领域技术人员将是明显的，可以利用条件如密码子使用，自身互补性，限制位点，化学稳定性等。
[0127] 本发明意图生产肽表位。具体地，这些表位来源于TAA序列，并对至少一个MHC I等位基因具有已知或预测的亲和力。这类表位典型地与在靶细胞或pAPCs上产生的那些相同。
[0128] 包含活性表位的组合物
[0129] 本发明的实施方案提供多肽组合物，其包括疫苗，治疗法，诊断学， 药理学和药物组合物。各种组合物包括新鉴定的TAAs的表位以及这些表位的变体。本发明的其它实施方案提供编码本发明多肽表位的多核苷酸。本发明另外提供用于表达适于纯化的多肽表位的载体。另外，本发明提供用作抗肿瘤疫苗的在APC中表达多肽表位的载体。可以使用来源于表1的任何表位或抗原，或编码它的核酸。其它实施方案涉及生产和使用各种组合物的方法。
[0130] 可以描述I类MHC-结合表位的总体结构，其在Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13：587-622，1995中已经被更全面地综述。许多结合能产生于MHC分子中的保守残基与肽的N-和C-末端之间的主链接触。产生另外的主链接触但在MHC等位基因中不同。序列特异性是由所谓的锚定残基的侧链与又在MHC等位基因中变化的口袋接触所赋予的。可以将锚定残基分为主要的(primary)和次要的(secondary)。主要锚定位点显示强烈优选相对严格定义的氨基酸残基组。次要位点显示较弱和/或较少严格定义的优选残基，所述严格定义的优选可经常根据较少优选而不是较多优选来更好地描述。另外，一些次要锚定位点中的残基根本不是总被定位与MHC分子上的口袋接触。因此，存在一种肽亚型，其与特定的MHC分子结合并在正在讨论中的位点处存在侧链-口袋接触，并且存在另一种亚型，其显示与相同MHC分子的结合，所述结合不依赖于肽在MHC分子肽-结合沟中呈现的构象。C-末端残基(P；ω)优选是主要锚定残基。对于许多研究更好的HLA分子(例如A2，A68，B27，B7，B35和B53)第二位置(P2)也是一个锚定残基。然而，也已经观察到中央b b
锚定残基，其包括HLA-B8中的P3和P5，以及分别在鼠MHC分子H-2D 和H-2K 中的P5和P(ω)-3。因为更稳定的结合通常将改善免疫原性，不管它们的位置，在设计变体中优选锚定残基是保守的或最优化的。
锚定残基，其包括HLA-B8中的P3和P5，以及分别在鼠MHC分子H-2D 和H-2K 中的P5和P(ω)-3。因为更稳定的结合通常将改善免疫原性，不管它们的位置，在设计变体中优选锚定残基是保守的或最优化的。
[0131] 由于锚定残基通常是位于表位末端附近，肽向上弯曲而到肽-结合沟以外，其允许长度上的一些变化。对于HLA-A68已经发现8-11个氨基酸的表位，对于HLA A2高达13个氨基酸。除锚定位置之间的长度变化之外，已经报道单个残基平截和延伸并且分别在N-和C-末端。在非锚定残基中，一些突出到沟以外，不与MHC分子发生接触但可以用来与TCR接触，对于HLA-A2最经常是P1，P4和P(ω)-1。其它非锚定残基可 以变成插入肽结合沟上边缘和TCR之间，与两者接触。这些侧链残基的精确定位，和如此它们对结合，MHC精细构象和最终免疫原性的影响是高度依赖序列的。对于高度免疫原性的表位，它必须不仅促进对于发生激活稳定的足够的TCR结合，而且TCR还必须具有足够高的脱离速率(off-rate)以便多个TCR分子可以顺序与相同的肽-MHC复合体相互作用(Kalergis，A.M.等，Nature Immunol.2：229-234，2001)。因此，在没有关于三元复合体另外信息的情况下，当设计变体时，在这些位置的保守和非保守置换都值得考虑。
[0132] 例如使用任何用于保守和非保守突变的技术和指南可以产生多肽表位变体。变体可以衍生于与天然序列比较的一个或多个氨基酸的置换，缺失或插入。氨基酸置换可以是用另一个具有相似结构和/或化学特性的氨基酸置换一个氨基酸的结果，例如用丝氨酸置换苏氨酸。该置换被称为保守氨基酸置换，并且所有适当的保守氨基酸置换被认为是一种发明的实施方案。插入或缺失可以任选为大约1-4，优选1-2个氨基酸。通常优选保持肽的“锚定位点”，其负责与正在讨论中的MHC分子结合。确实，在许多情形中通过在锚定位点置换更多的优选残基可以改善肽的免疫原性(Franco，等，Nature Immunology，1(2)：145-150，2000)。在保持与原表位充分的交叉反应性以构成有效疫苗的同时，通过用更大体积的氨基酸取代在非锚定位点发现的小氨基酸也经常可以改善肽的免疫原性。通过常规插入，缺失或置换序列中的氨基酸和检验产生的变体通过多肽表位显示的活性可以测定允许的变异。由于多肽表位经常是9个氨基酸，优选对最短的活性表位进行置换，例如9个氨基酸的表位。
[0133] 还可以通过将任何序列加至多肽表位变体的N末端产生变体。这类N-末端增加可以是从1个氨基酸直至至少25个氨基酸。因为肽表位经常被pAPC中活泼的N-末端外肽酶修剪，必须理解所增加序列中的变异可以对表位活性没有影响。在优选实施方案中，末尾的上游蛋白酶体切割位点与MHC表位N-末端之间的氨基酸残基不包括脯氨酸残基。Serwold，T.等，Nature Immunol.2：644-651，2001。因此，可以从比优选9-链节(9-mer)I类基序更大的前体产生有效表位。
[0134] 通常，就它们对应于在靶细胞或pACP表面上由MHC I实际展示的 表位而言肽是有效的。单个的肽对不同MHC分子可具有不同亲和力，与一些结合良好，有些适当结合，还有些一点也不结合(表2)。传统上已将MHC等位基因按照血清学反应性分类，所述血清学反应性不反映在相同类型的等位基因中可以不同的肽-结合沟的结构。类似地，跨越类型(across type)可以共享结合特性；已经将基于共享结合特性的类群称为超类型(supertype)。在人种群中存在许多MHC I等位基因；基于患者的基因型可以选择对某些等位基因特异性的表位。
[0135] 表2
[0136] 酪氨酸酶207-216(SEQ ID NO.1)与各种MHC类型的预测结合
[0137]MHC I类型 *解离半衰期(min)
A1 0.05
A*0201 1311.
A*0205 50.4
A3 2.7
A*1101(部分A3超类型) 0.012
A24 6.0
B7 4.0
B8 8.0
B14(部分B27超类型) 60.0
B*2702 0.9
B*2705 30.0
B*3501(部分B7超类型) 2.0
B*4403 0.1
B*5101(部分B7超类型) 26.0
B*5102 55.0
B*5801 0.20
B60 0.40
B62 2.0
A1 0.05
A*0201 1311.
A*0205 50.4
A3 2.7
A*1101(部分A3超类型) 0.012
A24 6.0
B7 4.0
B8 8.0
B14(部分B27超类型) 60.0
B*2702 0.9
B*2705 30.0
B*3501(部分B7超类型) 2.0
B*4403 0.1
B*5101(部分B7超类型) 26.0
B*5102 55.0
B*5801 0.20
B60 0.40
B62 2.0
[0138] *HLA肽结合预测(万维网超文本传输协议“访问bimas.dcrt. nih.gov/molbio/hla_bin”)。
[0139] 在本发明的另外实施方案中，可以将作为肽或编码多核苷酸的所述表位作为药物组合物给药，例如，疫苗或免疫原性组合物，单独或与各种佐剂，载体或赋形剂结合。应当指出，尽管术语疫苗可以贯穿这里的讨论中使用，该概念可以与包括在这里提及的那些的任何其它药物组合物一起施用或使用。特别有利的佐剂包括各种细胞因子和包含免疫刺激序列的寡核苷酸(如在这里参考的同时待审的申请中所更详细地阐明)。另外，可将编码表位的多核苷酸包含于病毒(例如牛痘或腺病毒)中或微生物宿主细胞(例如沙门氏菌属(Salmonella)或单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes))中，其随后被用作多核苷酸的载体(Dietrich，G.等Nat.Biotech.16：181-185，1998)。备选地，可以离体转化pAPC以表达所述表位，或用肽表位脉冲以其自身作为疫苗给药。为了提高这些方法的效率，可以用病毒或细菌载体携带编码的表位，或者与pAPC上发现的受体的配体络合。类似地，肽表位可以与pAPC配体络合或偶联。一种疫苗可以包括多于一个单个表位。 [0140] 在2000年4月28 号提 交的 题 为“EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS，”的美国专利申请号09/560,465中公开了对于将表位和/或表位聚簇结合至疫苗或药物组合物中的特别有利的策略。在2000年4月28号提交的题为“EPITOPE CLUSTERS”的美国专利申请号09/561,571中公开了与本发明共同使用的表位聚簇。 [0141] 本发明的优选实施方案是以使pAPC或pAPCs群体呈递对应于在特定靶细胞上展示的表位的管家表位的疫苗和方法为目标。例如可使用表1中的任何表位或抗原。在一个实施方案中，管家表位是由特定肿瘤类型的管家蛋白酶体加工的TuAA表位。在另一个实施方案中，管家表位是由感染病毒的细胞的管家蛋白酶体加工的病毒相关表位。这促进对靶细胞的特异性T细胞应答。因为它们展示管家表位或免疫表位，对应于不同诱导状态(攻击前或攻击后)pAPCs同时表达多种表位可以激发有效对抗靶细胞的CTL应答。
[0142] 通过含有在pAPC上呈递的管家和免疫表位，本实施方案可以最优化对靶细胞的细胞毒性T细胞应答。通过双重表位表达，当肿瘤细胞在由IFN 的诱导下从管家蛋白酶体转换至免疫蛋白酶体时，pAPCs可以继续维持对免疫类型表位的CTL应答，所述IFN例如可以通过肿瘤浸润CTLs产生。
[0143] 在一个优选实施方案中，使用包括管家表位的疫苗免疫患者。许多优选的TAAs专门与一种靶细胞相关，特别是在感染细胞的情形中。在另一个实施方案中，许多优选的TAAs是在转化细胞中解除控制(deregulated)的基因表达的结果，但在睾丸，卵巢组织和胎儿中也发现。在另一个实施方案中，有效的TAAs在靶细胞中比在其它细胞中更高水平地表达。在其它实施方案中，与其它细胞相比TAAs在靶细胞中不差异表达，但还是有效的，因为它们与细胞的一种特定功能有关并将靶细胞从大多数其它周围细胞区别开来；在这些实施方案中，也显示TAA的健康细胞可能被诱导的T细胞应答并联攻击，但该附带损害被认为远比靶细胞导致的情形优选。
[0144] 疫苗以导致pAPC或pAPCs群体展示管家表位的有效浓度包含一种管家表位。有利地，疫苗可包括多种管家表位或任选与一种或多种免疫表位结合的一种或多种管家表位。疫苗制剂以足以导致pAPCs呈递表位的浓度包含肽和/或核酸。制剂优选以大约1μg-1mg/100μl疫苗制剂的总浓度包含表位。本发明可使用适于肽疫苗和/或核酸疫苗的常规剂量和定量给药，该给药方法在本领域是被很好理解的。在一个实施方案中，对于成人的单剂量可便利地为大约1μl至大约5000μl的该组合物，一次或多次给药，例如间隔1周，2周，一个月或更长的2，3，4或更多剂量。参照结节内方法专利胰岛素泵(insulin pump)每小时送递1μl(最低频率)。
[0145] 这里公开的本发明的组合物和方法还意图将佐剂结合至制剂中以增强疫苗的性能。具体地，设计将佐剂加入制剂以增强pAPCs的表位送递或摄取。本发明考虑的佐剂为本领域中的技术人员已知并包括例如GMCSF，GCSF，IL-2，IL-12，BCG，破伤风毒素，骨桥蛋白和ETA-1。
[0146] 在本发明的一些实施方案中，疫苗可包括一种重组生物，如被遗传改造以在宿主中表达表位的病毒，细菌或寄生物。例如，单核细胞增生利斯特氏菌，一种革兰氏阳性，兼性胞内细菌，是一种将TuAAs靶向免疫系统的有效载体。在一个优选的实施方案中，可以改造该载体来表达一种管家表位以诱导治疗应答。该生物感染的正常途径是通过肠并且可以口服递 送。在另一个实施方案中，可以使用一种编码针对TuAA的管家表位的腺病毒(Ad)载体来诱导抗病毒或抗肿瘤应答。可以使用病毒构建体转导衍生于骨髓的树突细胞并随后注射，或者可以直接通过皮下注射将病毒递送至动物中以诱导有效的T-细胞应答。另一个实施方案使用一种重组牛痘病毒，其被改造来编码相应于针对TAA的管家表位的氨基酸序列。携带小基因构建体形式的含有适当核苷酸置换的构建体的牛痘病毒可以指导管家表位的表达，导致针对表位的治疗性T细胞应答。
[0147] 使用DNA免疫要求APCs摄取DNA并且表达编码的蛋白质或肽。可以在DNA上编码离散的I类肽。通过用该构建体免疫，可使APCs表达管家表位，其然后在细胞表面I类MHC上展示以刺激适当的CTL应答。在2000年4月28提交的题为EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-AS SOCIATED ANTIGENS的美国专利申请号09/561,572中已经描述了通常依赖于翻译终止或非蛋白酶体蛋白酶以产生适当的管家表位末端的构建体。
[0148] 如所提及的，理想的是在更大的蛋白质前后序列中表达管家肽。即使当少量的氨基酸存在表位末端以外也能检测到加工。小肽激素是通常从经常尺寸大小约为60-120个氨基酸的较长的翻译产物蛋白水解加工而来。该事实导致一些人设想这是可以有效翻译的最小尺寸。在一些实施方案中，可将管家肽内嵌在至少约60个氨基酸的翻译产物中。在其它实施方案中可将管家肽内嵌在至少约50，30或15个氨基酸的翻译产物中。
[0149] 由于有差别的蛋白酶体加工，pAPC的免疫蛋白酶体产生与由周围体细胞中的管家蛋白酶体产生的那些不同的肽。因此，在较大蛋白质的前后序列中表达管家肽过程中，优选在APC中在不同于它全长天然序列的前后序列中表达它，因为，作为管家表位，通常只能通过管家蛋白酶体从天然蛋白质有效加工，所述管家蛋白酶体在APC中不活跃。为了在编码较大蛋白质的DNA序列中编码管家表位，在编码表位的序列的任意一侧找到允许免疫蛋白酶体适当切割以释放管家表位的侧翼区域是有用的。改变所需管家表位N-末端和C-末端的侧翼氨基酸残基可以促进在APC中适当切割和产生管家表位。可以从新设计并筛选内嵌管家表位的序列以确定哪个可以被免疫蛋白酶体成功加工来释放管家表位。
[0150] 备选地，另一种策略对于鉴定允许在APC中产生管家表位的序列是非常有效的。一种邻接氨基酸序列可以从一种或多种管家表位从头至尾的排列产生。使用表达该序列的构建体免疫动物，并评估产生的T细胞应答以确定它对排列中一种或多种表位的特异性。
由定义，这些免疫应答显示在pAPC中被有效加工的管家表位。由此确定了该表位周围的必需的侧翼区域。使用期望肽任意一侧约4-6个氨基酸的侧翼区域可以提供促进通过免疫蛋白酶体的管家表位的蛋白酶体加工所必需的信息。因此，可以将保证表位同步化的约16-22个氨基酸的序列有效插入或融合至任何蛋白质序列以导致在APC中产生管家表位。在备选实施方案中，可以将整个头尾排列的表位，或只是紧邻着正确加工管家表位的表位类似地从测试构建体转移至疫苗载体。
由定义，这些免疫应答显示在pAPC中被有效加工的管家表位。由此确定了该表位周围的必需的侧翼区域。使用期望肽任意一侧约4-6个氨基酸的侧翼区域可以提供促进通过免疫蛋白酶体的管家表位的蛋白酶体加工所必需的信息。因此，可以将保证表位同步化的约16-22个氨基酸的序列有效插入或融合至任何蛋白质序列以导致在APC中产生管家表位。在备选实施方案中，可以将整个头尾排列的表位，或只是紧邻着正确加工管家表位的表位类似地从测试构建体转移至疫苗载体。
[0151] 在一个优选实施方案中，可以将管家表位内嵌在已知的免疫表位，或这样的区段之间，从而提供适于加工的前后序列。管家和免疫表位的接合点可以产生使免疫蛋白酶体释放管家表位所必需的前后序列，或优选包括正确C-末端的更大片段。筛选构建体以证实产生了所需表位是有用的。管家表位的结合点可以产生可以被免疫蛋白酶体切割的位点。本发明的一些实施方案使用已知表位侧邻测试底物中的管家表位；在其它实施方案中，使用如下所述的筛选来确定侧翼区域是任意序列还是天然侧翼序列的突变体，在设计底物中是否使用蛋白酶体切割优选的知识。
[0152] 尽管有利，在成熟表位N-末端的切割是不必需的，因为在细胞中存在多种N-末端修剪活性，其能够在蛋白酶体加工之后产生成熟的表位N末端。优选该N-末端延伸小于大约25个氨基酸长度，并进一步优选该延伸含有很少或没有脯氨酸残基。优选地，在筛选中，不仅对在表位末端(或至少在它的C-末端)的切割给予考虑，而且对确保在表位内部的有限切割给予考虑。
[0153] 可以将鸟枪法用于设计测试底物并可提高筛选效率。在一个实施方案中可以依次组合多种表位，单个表位可出现多次。可以筛选底物以确定可以产生哪种表位。在其中一种特定表位是所关心的情形中，可以设计其中它在多种不同前后序列中出现的底物。当将在多于一种前后序列中出现的单个表位从底物释放时，可以使用附加的第二测试底物来确定哪个是被释 放和真正构成保证表位同时化的序列，所述第二测试底物中表位的特殊实例(individual instances)被去除，禁止或是唯一的。
[0154] 存在几种容易实行的筛选。一种优选的体外筛选利用蛋白酶体消化分析，其使用纯化的免疫蛋白酶体，来确定所需的管家表位是否能从包含正在讨论中的该序列的合成肽中释放出来。可以通过技术如质谱，HPLC和N-末端池测序来测定获得切割的位置；如在题为METHOD OF EPITOPE DISCOVERY，EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGENPRESENTING CELLS的美国专利申请，题为EPITOPE SEQUENCES的两项临时美国专利申请中更详细地描述。
[0155] 备选地，可以使用体内筛选如免疫或目标敏化(target sensitization)。对于免疫使用可以表达正在讨论中的序列的核酸构建体。可以检验收获的CTL识别呈递正在讨论中的管家表位的靶细胞的能力。通过用含成熟管家表位的合成肽脉冲表达适当MHC分子的细胞极其容易获得这类靶细胞。备选地，可以使用已知表达管家蛋白酶体的细胞和抗原，从所述抗原可内源地或通过遗传工程衍生管家表位。为了将目标敏化用作筛子，可以使用识别管家表位的CTL，或优选CTL克隆。在该情形中，它是表达内嵌的管家表位的靶细胞(而不是在免疫期间的pAPC)并且它必须表达免疫蛋白酶体。通常，可以使用一种适当的核酸构建体转化靶细胞以赋予内嵌管家表位的表达。使用装载肽的脂质体或蛋白质转移试剂如TMBIOPORTER (Gene Therapy Systems，San Diego，CA)装载一种包含内嵌表位的合成肽代表一种备选方案。
[0156] 在2000年4月28日提交的题为“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-AS SOCIATED ANTIGENS”的美国专利申请号No.09/561,572中公开了关于用作依照本发明疫苗的核酸构建体的另外指导。此外，在11/7/2001提交的题为“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN”的美国专利申请号60/336,968(律师备案号(attorney docket number)CTLIMM.022PR)中公开了依照本发明有用的表达载体和关于它们设计的方法。
[0157] 本发明的一个优选实施方案包括给药包括一种表位(或多种表位)的 疫苗以诱导治疗性免疫应答的方法。将疫苗以与本领域已知的标准疫苗递送方案一致的方法对患者给药。给药TAAs表位的方法包括，不限于经皮的，结节内的，结节周围的，口服的，静脉内的，皮内的，肌内的，腹膜内的和粘膜给药，包括通过注射，滴注或吸入递送。在2002年1月17日颁发的澳大利亚专利号739189；标题都为“A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE，”的1999年9月1日提交的美国专利申请号09/380,534；和在2001年2月2日提交的其部分继续申请美国专利申请号09/776,232中公开了一种递送疫苗以引发CTL应答的特别有用的方法。
[0158] 试剂识别表位
[0159] 在本发明的另一方面，考虑对表位和/或表位-MHC分子复合体具有结合特异性的蛋白质，以及通过其可以表达它们的分离的细胞。在一组实施方案中，这些试剂采取免疫球蛋白的方式：多克隆血清或单克隆抗体(mAb)，生产其的方法在本领域是众所周知的。产生对肽-MHC分子复合体具有特异性的mAb在本领域是已知的。参见例如Aharoni等，Nature351：147-150，1991；Andersen 等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1820-1824，1996；
Dadaglio 等Immunity 6：727-738，1997；Duc 等 Int.Immunol.5：427-431，1993；Eastman等 Eur.J.Immunol.26：385-393，1996；Engberg 等 Immunotechnology 4：273-278，1999；
Porgdor 等 Immunity 6：715-726，1997；Puri 等 J.Immunol.158：2471-2476，1997； 和Polakova，K.，等J.Immunol.165342-348，2000。
Dadaglio 等Immunity 6：727-738，1997；Duc 等 Int.Immunol.5：427-431，1993；Eastman等 Eur.J.Immunol.26：385-393，1996；Engberg 等 Immunotechnology 4：273-278，1999；
Porgdor 等 Immunity 6：715-726，1997；Puri 等 J.Immunol.158：2471-2476，1997； 和Polakova，K.，等J.Immunol.165342-348，2000。
[0160] 在其它实施方案中，可将所述组合物用来体内和体外诱导和产生对任何表位和/或表位-MHC复合体特异的T-细胞。在优选实施方案中，表位可以是例如在表1中列出的那些中的任何一种或多种。因此，实施方案还涉及和包括分离的T细胞，T细胞克隆，T细胞杂交瘤或含有衍生于克隆基因的T细胞受体(TCR)结合域的蛋白质，以及表达该蛋白质的重组细胞。该TCR衍生的蛋白质可以仅仅是TCR的胞外域，或与另外一种蛋白质的部分的融合以赋予所需的性质或功能。该融合的一个实例是将TCR结合域附着在抗体分子的恒定区以便产生二价分子。已经报道按照该常规模式的分子的构建和活性，例如Plaksin，D.等J.Immunol.158：2218-2227，1997 和Lebowitz，M.S.等Cell Immunol.192：175-184，1999。在题为T CELL RECEPTORS AND THEIR USE IN THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC METHODS的美国专利5,830,755中也讨论了这类分子更多的常规构建和使用。
[0161] 通过标准免疫实验室动物可以容易地实现这类T细胞的生产，并且通过用人靶细胞免疫或通过用抗原/表位免疫HLA-转基因动物可以获得对人靶细胞的反应性。对于一些治疗方法，衍生于相同物种的T细胞是理想的。尽管该细胞可以通过例如将鼠TCR克隆于如上所考虑的人T细胞中产生，但体外免疫人细胞提供一种潜在地更快的选择。即使使用首次用于实验的供体(naive donors)，用于体外免疫的技术在本领域也是已知的，例如Stauss等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7871-7875，1992；Salgaller等Cancer Res.55：4972-4979，1995；Tsai等，J.Immunol.158：1796-1802，1997；和Chung等，J Immunother.22：279-287，1999。
[0162] 可以将这些分子的任一种与酶，放射化学试剂，荧光标签和毒素偶联，以便用于诊断(成象或其它检测)，监测和治疗与表位相关的致病疾病。因此可以给药毒素偶联物以杀死肿瘤细胞，放射化学试剂可以促进表位阳性肿瘤的成象，可将酶偶联物用于类似ELISA的试验来诊断癌症和证实在活体解剖组织中的表位表达。在另一个实施方案中，在通过用表位和/或细胞因子刺激完成扩增后，作为一种过继免疫治疗可以对患者给药如上阐明的这样的T细胞。
[0163] 包含表位的试剂
[0164] 本发明的另一方面提供分离的表位-MHC复合体。在本发明这方面的特别有利的实施方案中，复合体可以是可溶的，多亚基蛋白如在美国专利号5,635,363(四聚体)或美国专利号6,015,884(Ig-二聚体)中描述的那些。该试剂可用于检测和监测特异性的T细胞应答，和纯化这类T细胞。
[0165] 还可将与表位肽络合的分离的MHC分子结合至平面脂双层或脂质体中。这类组合物可用来体外或在脂质体的情形中，体内刺激T细胞。可将共同刺激分子(例如B7，CD40，LFA-3)结合于相同组合物中，或者特别是对于体外操作，可以通过抗-共同-受体的抗体(例如抗-CD28，抗-CD154， 抗-CD2)或细胞因子(例如IL-2，IL-12)来提供共同刺激。这样的T细胞刺激可以在免疫治疗中构成接种，驱动T细胞体外扩增以接下来融合，或构成T细胞功能测定中的一步。
[0166] 表位，或更直接地它与MHC分子的复合体可以是在激活或读出步骤或两者中抗原特异性T细胞的功能测定的重要组分。在当前本领域中T细胞功能的许多种测定中(详细的方法可以在标准免疫学参考如Current Protocols in Immunology 1999 John Wiley & Sons Inc.，N.Y中发现)可以定义两大类，测量许多细胞应答的那些和测量单独细胞应答的那些。尽管前者传达应答强度的总体测量，但后者允许测定应答细胞的相对频率。测量总体应答的试验的实例是细胞毒性测定，ELISA和检测细胞因子分泌的增殖测定。测量单独细胞(或衍生于它们的小克隆)应答的测定包括有限稀释分析(LDA)，ELISPOT，未分泌细胞因子的流式细胞仪检测(在题为“METHOD FOR ASSESSMENT OF THE MONONUCLEAR LEUKOCYTE IMMUNE SYSTEM”的美国专利号5,445,939和标题都为“METHOD FOR THE ASSESSMENT OF THE MONONUCLEAR LEUKOCYTE IMMUNE SYSTEM，”的美国专利号5,656,446；和5,843,689中描述，试剂是由Becton，Dickinson & Company以商品名‘FASTIMMUNE’出售并且用如上说明和提及的四聚体或Ig-二聚体检测特异性的TCR。在Yee，C.等Current Opinion in Immunology，13：141-146，2001中综述这些技术的相对优点。如对于本领域的一名技术人员将是明显的，通过多种建立的基于核酸的技术，特别是原位和单细胞PCR技术可以完成另外的检测特异性TCR的重排或表达。
[0167] 这些功能测定可用来评估免疫的内源水平，对免疫刺激(例如疫苗)的应答和监测贯穿疾病和治疗期间的免疫状态。除当测量免疫的内源水平时，这些测定的任何一种假定预先的免疫步骤，不管体内或体外，其取决于所论述问题的性质。使用上述本发明的各种实施方案或可以激发相似免疫的其它形式的免疫原(例如pAPC-肿瘤细胞融合)可以进行该免疫。除了能够检测关联TCR(cognate TCR)表达的PCR和四聚体/Ig-二聚体类型的分析以外，这些测定通常受益于一步体外抗原刺激，其可以方便地使用上述本发明的各种实施方案以便检测特定的功能活性(有时可以直接检测 高度溶细胞应答)。最后，检测溶细胞活性需要展示表位的靶细胞，其可以使用本发明的各种实施方案产生。对于任何具体步骤选择的具体实施方案取决于所论述的问题，使用的简易，成本等，但对于任何具体一组情形一个实施方案对另一种的优势对于本领域的一名技术人员来说将是明显的。 [0168] 在传统上已将在该部分描述的肽MHC复合体理解为是非共价结合。然而产生一个共价键是可能并且可以是有益的，例如通过编码作为单个蛋白的表位和MHC重链或表位，β2-微球蛋白，和MHC重链(Yu，Y.L.Y.，等，J.Immunol.168：3145-3149，2002；Mottez，E.，等，J.Exp.Med.181：493，1995；Dela Cruz，C.S.，等，Int.Immunol.12：1293，2000；Mage，M.G.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10658，1992；Toshitani，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：236，1996；Lee，L.，等，Eur.J.Immunol.24：2633，1994；Chung，D.H.，等，J.Immunol.163：3699，1999；Uger，R.A.和B.H.Barber，J.Immunol.160：1598，1998；Uger，R.A.，等，J.Immunol.162：6024，1999；和White，J.，等，J.Immunol.162：2671，1999。这类构建体可具有优越的稳定性并且克服了在加工-呈递途径中的困难。它们可用于已经描述的疫苗，试剂和类似方式的测定中。
[0169] 肿瘤相关抗原
[0170] 本发明的表位是衍生于TuAAs酪氨酸酶(SEQ ID NO.2)，SSX-2，(SEQ ID NO.3)，PSMA(前列腺-特异性膜抗原)(SEQ ID NO.4)，GP100，(SEQ ID NO.70)，MAGE-1，(SEQ ID NO.71)，MAGE-2，(SEQ ID NO.72)，MAGE-3，(SEQ ID NO.73)，NY-ESO-1，(SEQ ID NO.74)，PRAME，(SEQ IDNO.77)，PSA，(SEQ ID NO.78)，PSCA，(SEQ ID NO.79)，纤连蛋白ED-B结构域(SEQ ID NOS 589和590)，CEA(癌胚抗原)(SEQ ID NO.592)，Her2/Neu(SEQ ID NO.594)，SCP-1(SEQ ID NO.596)和SSX-4(SEQ IDNO.598)。从它们的cDNA或完全编码(cds)序列，分别为SEQ ID NOS.5-7，80-87，591，593，595，597，和599可以确定这十一种蛋白质的天然编码序列，或它们内部的任何区段。
[0171] 酪氨酸酶是一种黑色素生物合成酶，其被认为是黑色素细胞分化的最 特异性的标记之一。酪氨酸酶在很少的几种细胞类型中表达，主要在黑色素细胞中表达，并且经常在黑素瘤中发现高水平。在题为“METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUALS SUFFERING FROM A CELLULAR ABNORMALITY SOME OF WHOSE ABNORMAL CELLS PRESENT COMPLEXES OF HLA-A2/TYROSINASE DERIVED PEPTIDES，ANDMETHODS FOR TREATING SAID INDIVIDUALS”的美国专利5,747,271中教导了将酪氨酸酶用作TuAA。
[0172] GP100，也称为PMe117，也是一种在黑素瘤中高水平表达的黑色素生物合成蛋白质。在题为“MELANOMAANTIGENS AND THEIR USE IN DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC METHODS，”的美国专利5,844,075中公开了作为一种TuAA的GP100。
[0173] SSX-2，也称为Hom-Mel-40，是高度保守的癌-睾丸抗原家族的成员(Gure，A.O.等Int.J.Cancer 72：965-971，1997)。在题为“ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH ENCODE A MELANOMA SPECIFIC ANTIGEN AND USES THEREOF，”的美国专利6,025,191中教导了将其鉴定为一种TuAA。在多种肿瘤中发现癌-睾丸抗原，但通常在除睾丸以外的正常成人组织中不存在。已经发现在肿瘤细胞系中SSX家族的不同成员的表达不同。由于在SSX家族成员之间高度的序列同一性，将产生来自多于一个家族成员的相似表位并且其可以与MHC分子结合，因此指向该家族一个成员的一些疫苗可以交叉反应和对该家族的其它成员有效(参见下面实施例3)。
[0174] MAGE-1，MAGE-2，和MAGE-3是最初在黑素瘤(MAGE是黑素瘤相关抗原的缩写)中发现但在许多肿瘤中发现的的另一个癌-睾丸抗原家族的成员。在题为NUCLEOTIDE SEQUENCE ENCODING THE TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR，MAGE-1的美国专利5,342,774和许多后来专利中教导了将MAGE蛋白鉴定为TuAAs。当前在SWISS蛋白质数据库中存在17条关于(人)MAGE的记录。在这些蛋白质中存在广泛的相似性因此在许多情形中，来源于一种的表位可诱导针对其它家族成员的交叉反应性应答。还未在肿瘤中观测到这些中的一些，最显著地MAGE-H1和MAGE-D1，其分别在睾丸和脑，和骨髓基质细胞中表达。 由它们是在对其它MAGE蛋白质最小相似性之中的事实改善了在正常组织上交叉反应性的可能性。
[0175] NY-ESO-1，是一种在各种各样的肿瘤中发现的癌-睾丸抗原，也称为CTAG-1(癌-睾丸抗原-1)和CAG-3(癌抗原-3)。在题为ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING AN ESOPHAGEAL CANCERASSOCIATED ANTIGEN，THE ANTIGEN ITSELF，AND USES THEREOF的美国专利5,804,381中公开了作为一种TuAA的NY-ESO-1。编码具有广泛序列同一性的抗原的共生同源基因座(paralogous locus)，LAGE-1a/s(SEQ ID NO.75)和LAGE-1b/L(SEQ ID NO.76)已经在公众可利用的人基因组集群(assemblies)中公开，并且已经被推断是通过可变剪接(alternate splicing)产生的。另外，CT-2(或CTAG-2，癌-睾丸抗原-2)似乎是LAGE-1b/L的等位基因，突变体或测序差异。由于广泛的序列同一性，许多来源于NY-ESO-1的表位也可以诱导针对表达这些其它抗原的肿瘤的免疫性。参见图
1。蛋白质直至氨基酸70实际上是相同的。从71-134NY-ESO-1和LAGE之间相同的最长长度是6个残基，但存在潜在交叉反应序列。从135-180，NY-ESO和LAGE-1a/s除单个残基以外是相同的，但由于可变剪接LAGE-1b/L是不相关的。CAMEL和LAGE-2抗原似乎是来源于LAGE-1mRNA，但是源于可变的读框(alternate reading frame)，因此产生不相关的蛋白质序列。新近，GenBank登记号AF277315.5，人染色体X克隆RP5-865E18，RP5-1087L19，完全序列，报道了在该区域中的三个独立的基因座，其标记为LAGE1(对应于基因组集群的CTAG-2)，加上LAGE2-A和LAGE2-B(两者对应于基因组集群的CTAG-1)。
1。蛋白质直至氨基酸70实际上是相同的。从71-134NY-ESO-1和LAGE之间相同的最长长度是6个残基，但存在潜在交叉反应序列。从135-180，NY-ESO和LAGE-1a/s除单个残基以外是相同的，但由于可变剪接LAGE-1b/L是不相关的。CAMEL和LAGE-2抗原似乎是来源于LAGE-1mRNA，但是源于可变的读框(alternate reading frame)，因此产生不相关的蛋白质序列。新近，GenBank登记号AF277315.5，人染色体X克隆RP5-865E18，RP5-1087L19，完全序列，报道了在该区域中的三个独立的基因座，其标记为LAGE1(对应于基因组集群的CTAG-2)，加上LAGE2-A和LAGE2-B(两者对应于基因组集群的CTAG-1)。
[0176] PSMA(前列腺特异性膜抗原)，在题为“PROSTATE-SPECIFICMEMBRANES ANTIGEN”的美国专利5,538,866中描述的一种TuAA，是由正常前列腺上皮细胞表达，并且在前列腺癌中高水平表达。也已经发现它存在于非前列腺肿瘤的新脉管系统中。PSMA因此可以形成指向前列腺癌和其它肿瘤的新脉管系统两者的疫苗的基础。在2001年3月7日提交的题为“ANTI-NEOVASCULAR VACCINES FOR CANCER”的临时美国专利申请号60/274,063和在2002年3月7日提交的题为“ANTI-NEOVASCULAR PREPARATIONS FOR CANCER”的美国申请号 10/094,699，律师备案号CTLIMM.015A中更充分地描述这一后者概念。简短地，当肿瘤生长时，它们吸收(recruit)新血管的向内生长物(ingrowth)。这被认为对于维持生长是必需的，因为未血管化的肿瘤中心通常坏死并且已经报道血管发生抑制剂导致肿瘤退化。这些新血管，或新脉管系统，表达在建立的血管中未发现的抗原，因此可以被特异性地瞄准。通过诱导针对新血管抗原的CTL可以使血管破裂，中断养分流向肿瘤(和从肿瘤去除废弃物)，导致退化。
[0177] 如在题为“ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING ALTERNATIVELY SPLICED PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANES ANTIGEN AND USES THEREOF”的美国专利5,935,818中所述，PSMAmRNA的可变剪接还导致一种在Met58处含有明显起始的蛋白质，从而删除了假定的PSMA膜锚定区域。一种称为类PSMA蛋白的蛋白质，Genbank登记号AF261715，与PSMA的氨基酸309-750几乎相同并且具有不同的表达图谱(expression profile)。因此最优选的表位是含有位于氨基酸58-308的N-末端的那些。
[0178] PRAME，也称为MAPE，DAGE和OIP4，最初是被作为一种黑素瘤抗原观测。后来，它已被认为是一种CT抗原，但不像许多CT抗原(例如MAGE，GAGE，和BAGE)它在急性骨髓白血病中表达。PRAME是MAPE家族的一个成员，所述MAPE家族主要由假想蛋白质组成，PRAME与这些假想蛋白质共有有限的序列相似性。在题为“ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES CODING FOR TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR DAGE AND USES THEREOF”的美国专利5,830,753中教导了将PRAME用作一种TuAA。
[0179] PSA，前列腺特异性抗原，是激肽释放酶家族的一种肽酶和前列腺的一种分化抗原。也已经报道在乳房组织中的表达。替代的名称包括γ-seminoprotein，激肽释放酶3，seminogelase，seminin和P-30抗原。PSA具有与各种可变剪接产物前列腺/腺激肽释放酶-1和-2以及激肽释放酶4的高度序列同一性，其也在前列腺和乳房组织中表达。其它激肽释放酶通常共享更小的序列同一性和具有不同的表达图谱。但是，在设计疫苗时应该考虑可能通过任何特定表位激发的交叉反应性，以及表位将通过在非靶 组织中的加工(最通常由管家蛋白酶体加工)而被释放的可能性。
[0180] PSCA，前列腺干细胞抗原，也称为SCAH-2，是一种优选在前列腺上皮细胞中表达和在前列腺癌中过量表达的分化抗原。在包括消化道的神经内分泌细胞和肾的集合管的一些正常组织中发现低水平表达。在题为“HUMAN STEM CELL ANTIGENS”的美国专利5,856,136中描述了PSCA。
[0181] 联会复合体蛋白1(SCP-1)，也称为HOM-TES-14，是一种减数分裂相关蛋白并且也是一种癌-睾丸抗原(Tureci，O.，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：5211-5216，1998)。作为一种癌抗原，它的表达不是受细胞周期调节并且经常在神经胶质瘤，乳房，肾细胞和卵巢癌中发现它。它具有与肌球蛋白的一些相似性，但具有足够小的同一性以致交叉反应表位不可直接寻找(immediate prospect)。
[0182] 纤连蛋白的ED-B结构域也是一种潜在的目标。纤连蛋白进行受发育调节的可变剪接，主要在胎性癌组织中使用的单个外显子编码ED-B结构域(Matsuura，H.和S.Hakomori Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6517-6521，1985；Carnemolla，B. 等 J.Cell Biol.108：1139-1148，1989；Loridon Rosa，B.等Cancer Res.50：1608-1612，1990；Nicolo，G.等Cell Differ.Dev.32：401-408，1990；Borsi，L. 等 Exp.Cell Res.199：98-105，1992；Oyama，F.等Cancer Res.53：2005-2011，1993；Mandel，U.等APMIS 102：695-702，1994；Farnoud，M.R.等Int.J.Cancer 61：27-34，1995；Pujuguet，P.等Am.J.Pathol.148：579-592，1996；
Gabler，U.等Heart 75：358-362，1996；Chevalier，X.Br.J.Rheumatol.35：407-415，1996；
Midulla，M.Cancer Res.60：164-169，2000)。
Gabler，U.等Heart 75：358-362，1996；Chevalier，X.Br.J.Rheumatol.35：407-415，1996；
Midulla，M.Cancer Res.60：164-169，2000)。
[0183] ED-B结构域也在新脉管系统的纤连蛋白中表达(Kaczmarek，J.等Int.J.Cancer59：11-16，1994；Castellani，P. 等 Int.J.Cancer 59：612-618，1994；Neri，D. 等 Nat.Biotech.15：1271-1275，1997；Karelina，T.V. 和 A.Z.EisenCancer Detect.Prev.22：
438444，1998；Tarli，L.等Blood 94：192-198；1999；Castellani，P.等Acta Neurochir.(Wien)142：277-282，2000)。作为一种胎性癌结构域，除被新脉管系统表达以外一般在由赘生性细胞表达的纤连蛋白中发现ED-B结构域。因此，靶向ED-B结构域的CTL诱导疫苗可显示两 种作用机制：直接溶解肿瘤细胞和通过破坏肿瘤相关新脉管系统破坏肿瘤的血液供给。因为CTL活性在停用疫苗后迅速衰减，对正常血管发生的干扰可以最小。在题为“ANTI-NEOVASCULATURE VACCINES FOR CANCER”的临时美国专利申请号60/274,063和甚至在日期(2002年3月7日)与本申请一起提交的题为“ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER”的美国专利申请号10/094,699，律师备案号CTLIMM.015A中描述了设计和检验靶向新脉管系统的疫苗。在题为“HLA-TRANSGENIC MURINE TUMOR CELL LINE，”律师备案号CTLIMM.028PR，2002年3月7日提交的临时美国专利申请号60/363,131中公开了一种肿瘤细胞系。
438444，1998；Tarli，L.等Blood 94：192-198；1999；Castellani，P.等Acta Neurochir.(Wien)142：277-282，2000)。作为一种胎性癌结构域，除被新脉管系统表达以外一般在由赘生性细胞表达的纤连蛋白中发现ED-B结构域。因此，靶向ED-B结构域的CTL诱导疫苗可显示两 种作用机制：直接溶解肿瘤细胞和通过破坏肿瘤相关新脉管系统破坏肿瘤的血液供给。因为CTL活性在停用疫苗后迅速衰减，对正常血管发生的干扰可以最小。在题为“ANTI-NEOVASCULATURE VACCINES FOR CANCER”的临时美国专利申请号60/274,063和甚至在日期(2002年3月7日)与本申请一起提交的题为“ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER”的美国专利申请号10/094,699，律师备案号CTLIMM.015A中描述了设计和检验靶向新脉管系统的疫苗。在题为“HLA-TRANSGENIC MURINE TUMOR CELL LINE，”律师备案号CTLIMM.028PR，2002年3月7日提交的临时美国专利申请号60/363,131中公开了一种肿瘤细胞系。
[0184] 癌胚抗原(CEA)是一种典型的癌胚蛋白，其最初在1965年被首先描述(Gold和Freedman，J.Exp.Med.121：439-462，1965。更全的参考可以在Online Medelian Inheritance in Man；记录*114890中找到)。它已经正式改名为癌胚抗原相关细胞粘着分子5(CEACAM5)。它的表达与消化道和胎结肠中的上皮层(epithelial lining)的腺癌强烈相关。CEA是免疫球蛋白超基因家族的成员并且是CEA亚家族的定义成员(defining member)。
[0185] HER2/NEU与表皮生长因子受体相关的癌基因(van de Vijver，等，New Eng.J.Med.319：1239-1245，1988)，并且显然与c-ERBB2癌基因相同(Di Fiore，等，Science237：178-182，1987)。ERBB2的过量表达已经和前列腺癌的致瘤性转化牵连。作为HER2，它在其它肿瘤中的乳腺癌的25-30％中被扩增和过表达，所述其它肿瘤中表达水平与肿瘤的进攻性相关(Slamon，等，New Eng.J.Med.344：783-792，2001)。在Online Medelian Inheritance in Man；记录*164870中可获得更详细的描述。
[0186] 在2001年11月7 日提 交的 题 为“EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS，”的美国专利申请号10/005,905(律师备案号CTLIMM.021CP1)和2000年12月7日提交的其继续申请，美国申请号_/_，律师备案号CTLIMM.21CP1C，标题也为“EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS”中发现与本发明实施方案相关的另外的公开内容。
[0187] 如下列实施例中所描述鉴定和检验有效表位。然而这些实例是意图只 是用作说明目的，而不应该解释为是以任何方式限制本发明的范围。实施例
[0188] 具体的优选表位序列
[0189] 实施例1
[0190] 表位的制备
[0191] A.表位的人工生产
[0192] 使用FMOC或tBOC固相合成方法合成含有SEQ ID NO：1，8，9，11-23，26-29，32-44，47-54，56-63，66-68，88-253，或256-588中任一个的氨基酸序列的肽。合成后，在存在适当的保护清除剂的条件下，分别用三氟乙酸或氟化氢将肽从它们的载体上切开。在通过蒸发去除酸后，用醚萃取肽以去除清除剂，然后将粗制的沉淀的肽冻干。通过HPLC，序列分析，氨基酸分析，平衡离子含量分析和其它适当的方法测定粗制肽的纯度。如果粗制肽足够纯(大于或等于约90％纯度)，它们可以原样使用。如果要求纯化满足药物规范，使用下列各项的一种或组合来纯化肽：再沉淀；反相，离子交换，尺寸排阻或疏水相互作用色谱法；或逆流分布。
[0193] 药品制剂
[0194] 在肠胃外可接受的水，有机或水-有机缓冲液或溶剂系统中配制GMP-级的肽，其中它们保持物理和化学稳定以及生物有效性。通常，缓冲液或缓冲液的组合或缓冲液与有机溶剂的组合是适当的。pH值范围典型地为6-9。可以加入有机改性剂或其它赋形剂来帮助溶解和稳定肽。这些包括去污剂，脂类，共溶剂，抗氧化剂，螯合剂和还原剂。在冻干产品的情形中，可以加入蔗糖或甘露醇或其它冻干的酸类。通过膜过滤于它们最后的容器-密封系统之中将肽溶液灭菌并冻干以备临床中溶解或保存至使用。
[0195] B.构建用作核酸疫苗的表达载体
[0196] 下面介绍三类表位表达载体的构建。在题为“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF ARGET-ASSOCIATED ANTIGENS，”的美国专利申请号09/561,572中阐明了这些设计的具体优 势。
[0197] 于是用质粒转染适当的大肠杆菌菌株并涂布在选择性培养基上。几个克隆在悬浮培养中生长并且通过限制酶图谱鉴定阳性克隆。然后培养阳性克隆，等分于储存小瓶中并储存在-70℃。
[0198] 然后由这些细胞的样品进行质粒的小量制备(QIAprep Spin Mini-prep：Qiagen，Valencia，CA)并且使用自动荧光双脱氧测序分析证实构建体含有所需序列。
[0199] B.1构建pVAX-EP1-IRES-EP2
[0200] 综述：
[0201] 该构建体的起始质粒是购自Invitrogen(Carlsbad，CA)的pVAX1。表位EP1和EP2是由GIBCO BRL(Rockville，MD)合成。IRES是从购自Clontech(Palo Alto，CA)的pIRES切断的。
[0202] 步骤：
[0203] 1用EcoRI和NotI消化pIRES。通过琼脂糖凝胶电泳分离消化片段，并且从切断条带纯化IRES片段。
[0204] 2用EcoRI和NotI消化pVAX1，并凝胶纯化pVAX1片段。
[0205] 3然后将纯化的pVAX1和IRES片段连接在一起。
[0206] 4用连接混合物转化感受态的大肠杆菌菌株DH5α。
[0207] 5从产生的4个菌落进行小量制备。
[0208] 6对小量制备的DNA进行限制酶消化分析。将一个含有IRES插入片段的重组菌落用于进一步的EP1和EP2的插入。该中间构建体称为pVAX-IRES。
[0209] 7合成编码EP1和EP2的寡核苷酸。
[0210] 8将EP1亚克隆至pVAX-IRES的AfIII和EcoRI位点之间，以构造pVAX-EP1-IRES； [0211] 9将EP2亚克隆至pVAX-EP1-IRES的SalI和NotI位点之间，以构造最后的构建体pVAX-EP1-IRES-EP2。
[0212] 10通过DNA测序证实EP1-IRES-EP2插入片段的序列。
[0213] B2.构建pVAX-EP 1-IRES-EP2-ISS-NIS
[0214] 综述：
[0215] 该构建体的起始质粒是pVAX-EP1-IRES-EP2(实施例1)。引入该构建体的ISS(免疫刺激序列)是AACGTT，并且使用的NIS(代表核输入序列(nuclear import sequence))是SV4072bp重复序列。ISS-NIS是由GIBCO BRL合成。参见图2。
[0216] 步骤：
[0217] 1用NruI消化pVAX-EP1-IRES-EP2；凝胶纯化线性化的质粒。
[0218] 2合成ISS-NIS寡核苷酸。
[0219] 3将纯化的线性化pVAX-EP1-IRES-EP2和合成的ISS-NIS连接在一起。
[0220] 4用连接产物转化感受态的大肠杆菌菌株DH5α。
[0221] 5从产生的菌落进行小量制备。
[0222] 6进行小量制备的限制酶消化。
[0223] 7将含有插入片段的质粒测序
[0224] B3.构建pVAX-EP2-UB-EP1
[0225] 综述：
[0226] 该构建体的起始质粒是pVAX1(Invitrogen)。EP2和EP1是由GIBCOBRL合成。从酵母克隆在构建体中编码76个氨基酸的野生型遍在蛋白质。
[0227] 步骤：
[0228] 1使用酵母mRNA进行RT-PCR。设计引物来扩增酵母遍在蛋白质的完整编码序列。 [0229] 2使用琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR产物。凝胶纯化具有预测大小的条带。 [0230] 3将纯化的DNA条带在EcoRV位点亚克隆至pZERO1。将得到的克隆命名为pZERO-UB。
[0231] 4在进一步操作之前将几个pZERO-UB克隆测序以证实遍在蛋白质序列。 [0232] 5合成EP1和EP2。
[0233] 6将EP2，遍在蛋白质和EP1连接并且将插入克隆至pVAX1的BamHI和EcoRI位点中间，使它在CMV启动子的控制之下。
[0234] 7通过DNA测序证实插入片段EP2-UB-EP 1的序列。
[0235] 实施例2
[0236] 鉴定有效的表位变体
[0237] 10-链节的FLPWHRLFLL(SEQ ID NO.1)被鉴定为一种有效表位。基于该序列，制备许多变体。将在HLA结合试验(参见实施例3，部分6)中显示活性的变体鉴定为有效，并随后结合于疫苗中。
[0238] 已经评估FLPWHRLFLL长度变体的HLA-A2结合。蛋白酶体消化分析说明也产生9-链节FLPWHRLFL(SEQ ID NO.8)的C-末端。另外，9-链节LPWHRLFLL(SEQ ID NO.9)也可由10-链节的N-末端修剪产生。两者都被预测与HLA-A*0201分子结合，然而在这两个
9-链节中，FLPWHRLFL显示更显著的结合并是优选的(参见图3A和B)。
9-链节中，FLPWHRLFL显示更显著的结合并是优选的(参见图3A和B)。
[0239] 体外蛋白酶体消化和N-末端池测序说明酪氨酸酶207-216(SEQ ID NO.1)比酪氨酸酶207-215(SEQ ID NO.8)被更普遍地生产，然而较后的肽显示优越的免疫原性，其在实现最佳+疫苗设计中可能关注。将FLPWHRLFL，酪氨酸酶207-215(SEQID NO.8)用于HLA-A2 血液的体外免疫以产生CTL(参见下面CTL诱导培养)。在标准铬释放测定中将肽脉冲的T2细胞用作目标，发现由酪氨酸酶207-215(SEQ ID NO.8)诱导的CTL同样很好地识别酪氨酸酶207-216(SEQ +
ID NO.1)的目标(参见图3C)。这些CTL还识别HLA-A2 ，酪氨酸酶+肿瘤细胞系624.38-
和HTB64，但不识别624.28，624.38的HLA-A2 衍生物(图3C)。因此体内产生的这两种表位的相对数量在疫苗设计中不成为一个问题。
ID NO.1)的目标(参见图3C)。这些CTL还识别HLA-A2 ，酪氨酸酶+肿瘤细胞系624.38-
和HTB64，但不识别624.28，624.38的HLA-A2 衍生物(图3C)。因此体内产生的这两种表位的相对数量在疫苗设计中不成为一个问题。
[0240] CTL诱导培养
[0241] 通过在Ficoll-Hypaque中离心从血沉棕黄层(buffy coat)纯化来源于正常供体的PBMCs。使用自身血浆(AP)进行所有的培养以避免暴露于可能的异源病原体和FBS肽的识别。为了促进体外产生肽-特异性的CTL，我们使用自身树突细胞(DC)作为APCs。如同所描述，产生DC并且用 DC和来源于PBMCs的肽诱导CTL(Keogh等，2001)。简短地，用GM-CSF和IL-4培养富集单核细胞的细胞组分5天，并在含有2μg/ml CD40配体的培养基中另外培养2天以诱导成熟。在24孔平板中2ml补充有10％AP，10ng/ml IL-7和20IU/6 + 5
ml IL-2的RPMI中共培养2X10 富集CD8 的T淋巴细胞/孔和2x10 肽脉冲的DC/孔。在第7和第14天用自身辐射的肽脉冲的DC再刺激培养物。
ml IL-2的RPMI中共培养2X10 富集CD8 的T淋巴细胞/孔和2x10 肽脉冲的DC/孔。在第7和第14天用自身辐射的肽脉冲的DC再刺激培养物。
[0242] 如下构建FLPWHRLFL的序列变体。与来源于NIH/BIMAS MHC结合预测程序(参见下面实施例3中的参考)的结合系数表(参见表3)一致，通过将位置9的L，一个锚定位置改变成V可以改善结合。尽管通常在更小程度上，通过在非锚定位置的改变也可改变结合。通常参照表3，通过使用具有相对较大系数的残基可以提高结合。与它们对结合MHC的影响无关，序列的改变还可改变免疫原性。因此如下可以改善结合和/或免疫原性： [0243] 通过用F，L，M，W，或Y替换位置3的P；这些都是体积较大的残基，其也可以改善免疫原性而与对结合的影响无关。具有胺和羟基的残基，分别为Q和N，S和T，也可激发较强的交叉反应性应答。
[0244] 通过用D或E替换位置4的W以改善结合，这加入负电也可使表位更有免疫原性，而在一些情形中减小与天然表位的交叉反应性。备选地保守替换F或Y可以激发交叉反应性应答。
[0245] 通过用F替换位置5的H改善结合。可以将H视为部分带电，因此在一些情形中电荷的损失可阻碍交叉反应性。替换在该位置充分带电残基R或K可增强免疫原性而不破坏依赖电荷的交叉反应性。
[0246] 通过用I，L，M，V，F，W，或Y替换位置6的R。如位置5的相同告诫 (caveats)和备选适用于这里。
[0247] 通过用W或F替换位置7的L以改善结合。通过该模型(NIH算法)通常不预测在该位置V，I，S，T，Q，或N替换减少结合亲和力，然而如上所讨论可以是有利的。 [0248] Y和W，其是同等优选为位置1和8的Fs，可以激发有效的交叉反应性。最后虽然朝体积大的方向的替换通常是偏向于改善免疫原性，按照尺寸的对比，而不是本身体积大，是免疫原性的重要因素的理论，替换较小残基如位置3-7的A，S和C可以是有效的。C中巯基的反应性可以引入如在Chen，J.-L.，等J.Immunol.165：948-955，2000中所讨论的其它特性中。
[0249] 表3.对于HLA-A*0201*的9-链节系数表
[0250]
[0251] *将该表和公众可利用的其它可比较数据用于设计表位变体和确定一种特定变体是否是在物质上相似，或是在功能上相似。
[0252] 实施例3
[0253] 聚簇分析(SSX-231-68)
[0254] 1.表位聚簇区域预测：
[0255] 计 算 机 算 法：基 于 H.G.Rammensee，J.Bachmann 和S.Stevanovic 的 书“MHC Ligands and Peptide Motifs”SYFPEITHI(因 特 网 访 问 http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/Scripts/MHCServer.dll/EpPredict.htm)；和在Parker，K.C.，等，J.Immunol.152：163，1994中描述的HLA肽结合预测(NIH)(因特网访问http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bin)；用来分析SSX-2(GI：10337583)的蛋白质序列。如在2000年4月28日提交的题为“EPITOPE CLUSTERS，”的美国专利号09/561,571中所充分描述的那样定义表位聚簇(含有比具有高预测MHC亲和力的肽片段的平均密度高的区域)。使用表位密度比率的截止值(cutoff)为2，分别使用SYFPETHI和NIH算法定义5个和2个聚簇，并且肽记分截止值为16(SYFPETHI)和5(NIH)。使用NIH算法得分最高的肽，SSX-241-49，具有估计＞1000min的解离半衰期，在NIH分析中不重叠任何其它预测的表位但确实与SSX-257-65聚簇。
[0256] 2.肽合成和表征：
[0257] 通过MPS(Multiple Peptide Systems，San Diego，CA 92121)使用标准固相化学合成SSX-231-68，YFSKEEWEKMKASEKIFYVYMKRKYEAMT KLGFKATLP(SEQID NO.10)。按照提供的“分析证明书”，该肽的纯度为95％。
[0258] 3.蛋白酶体消化：
[0259] 使用在2000年4月28日提交的题为“METHOD OF EPITOPEDISCOVERY，”的美国专利申请号09/561,074中描述的蛋白酶体分离方案从人红细胞分离蛋白酶体。将SDS-PAGE，蛋白质印迹，和ELISA用作质量控制测定。蛋白酶体的最终浓度为4mg/ml，其是通过无干扰蛋白质测定法(Geno Technologies Inc.)测定的。将蛋白酶体-70℃保存在25μl等分试样中。
[0260] 将SSX-231-68溶解在Milli-Q水中，制备2mM母液，并将20μl等分试样保存在-20℃。
[0261] 从-70℃存储器取出1管蛋白酶体(25μl)并在冰上解冻。然后通过反复吸取(将样品保持在冰上)将它与12.5μL 2mM的肽彻底混合。在混合后立即取5μL样品并转移至含有1.25μL 10％TFA的试管中(TFA的终浓度为2％)；T＝0min样品。然后开始并在37℃程控热控制器中进行蛋白酶体消化反应。分别在15，30，60，120，180和240min取出另外的5μL样品，如以前通过将样品加入1.25μL 10％TFA中终止反应。将样品保持在冰上或冷冻直至通过MALDI-MS分析。为了HPLC分析和N-末端测序所有的样品被保留和储存在-20℃。将单独的肽(没有蛋白酶体)用作空白对照：2μL肽+4μL Tris缓冲液(20mM，pH 7.6)+1.5μL TFA。
[0262] 4.MALDI-TOF MS测量：
[0263] 对于每个时间点首先将0.3μL基质溶液(10mg/mlα-氰基-4-羟基肉桂酸的AcCN/H2O溶液(70∶30))施加于样品载玻片上，然后在载玻片上将等体积的消化样品与基质溶液轻轻混合。在获得质谱前使载玻片室温空气干燥3-5分钟。在用肽/蛋白质标样校准的Lasermat 2000MALDI-TOF质谱仪上进行MS。为了改善测量的准确度，将肽底物的分子+离子量(MH )用作内校准标准物。在图4中显示T＝120min.消化样品的质谱。
[0264] 5.MS数据分析和表位鉴定：
[0265] 为了指定测量的质量峰，使用计算机程序MS-Product，一种来源于UCSF Mass Spectrometry Facility(可 访 问 http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msprod.htm)的工具来产生所有可能的片段(N-和C-末端离子，和内部片段)和它们对应的分子量。由于质谱仪的灵敏度，使用平均分子量。如表4中总结，鉴定了在消化期间观测到的质量峰。
[0266] 选择通过SYFPEITHI或NIH算法预测与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C末端片段来进一步研究。方法的消化和预测步骤可以以任何顺序有效实行。尽管在此描述的蛋白酶体消化中使用的底物肽 是特别设计来包括预测的HLA-A2.1结合序列，但是可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果在表5中显示。
[0267] 表4.SSX-231-68质量峰鉴定
[0268]
[0269] 黑体序列对应于预测与MHC结合的肽。
[0270] *仅仅基于质量该峰也可指定为肽32-50，然而，蛋白酶体只去除N-末端氨基酸是不大可能的。N-末端测序(下面)证实确定为31-49。
[0271] **基于质量该片段也可能表示33-68。下面的N-末端测序与确定为31-65一致。 [0272] 表5.预测通过蛋白酶体产生片段的HLA结合
[0273]
[0274] 未预测
[0275] 如表5所示，将真实序列(authentic sequence)附加在表位N-末端可产生针对相同或不同MHC限制性元件的表位。特别注意(K)RKYEAMTKL(SEQ ID NOS 19和(20))与HLA-B14的配对，其中10-链节具有比共-C-末端9-链节更长的预测解离半衰期。还注意10-链节KYEAMTKLGF(SEQ ID NO.21)的情形，通过依赖于N-末端修剪以产生针对HLA-B*4403和-B*08的表位其可用作对几种MHC类别有效的疫苗。
[0276] 6.HLA-A0201结合测定：
[0277] 使用Stauss等的方法(Proc Natl Acad Sci USA 89(17)：7871-5(1992))的变体测定候选表位KASEKIFYYV，SSX-241-49，(SEQ ID NO.15)与HLA-A2.1的结合。具体地，在它们表面表达空的或不稳定MHC分子的T2细胞用Iscove的改进Dulbecco′s培养基5
(IMDM)洗涤两次，并于96孔平底平板中以3x10 细胞/200μl/孔的浓度在补充有3μg/ml人β2-微球蛋白的无血清AIM-V培养基(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)中培养过夜，并加入800，400，200，100，50，25，12.5和6.25μg/ml的肽。在分配至平板前通过反复吸取将肽与细胞混合(备选地可将肽加入单独孔)，轻轻摇动平板2分钟。在37℃5％CO2的培养箱中温育。次日通过用无血清RPMI培养基洗涤两次去除未结合的肽并加入饱和量的抗-I类HLA单克隆抗体，异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的抗-HLAA2，A28(One Lambda，Canoga Park，CA)。在4℃温育30分钟后，用补充有0.5％BSA，0.05％(w/v)叠氮化钠，pH
7.4-7.6(染色缓冲液)的PBS洗涤细胞3次。(备选地可以将W6/32(Sigma)用作抗-I类HLA单克隆抗体，用染色缓冲液洗涤细胞，与偶联异硫氰酸荧光素(FITC)的羊F(ab’)抗鼠-IgG(Sigma)4℃温育30min并如上洗涤3次)。将细胞再悬浮于0.5ml染色缓冲液中。
通过使用FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)的流式细胞仪进行通过肽结合稳定的表面HLA-A2.1分子的分析。如果流式细胞计量术不是立即实行，可以通过加入四分之一体积的2％低聚甲醛并暗处保存在4℃来固定细胞。
(IMDM)洗涤两次，并于96孔平底平板中以3x10 细胞/200μl/孔的浓度在补充有3μg/ml人β2-微球蛋白的无血清AIM-V培养基(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)中培养过夜，并加入800，400，200，100，50，25，12.5和6.25μg/ml的肽。在分配至平板前通过反复吸取将肽与细胞混合(备选地可将肽加入单独孔)，轻轻摇动平板2分钟。在37℃5％CO2的培养箱中温育。次日通过用无血清RPMI培养基洗涤两次去除未结合的肽并加入饱和量的抗-I类HLA单克隆抗体，异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的抗-HLAA2，A28(One Lambda，Canoga Park，CA)。在4℃温育30分钟后，用补充有0.5％BSA，0.05％(w/v)叠氮化钠，pH
7.4-7.6(染色缓冲液)的PBS洗涤细胞3次。(备选地可以将W6/32(Sigma)用作抗-I类HLA单克隆抗体，用染色缓冲液洗涤细胞，与偶联异硫氰酸荧光素(FITC)的羊F(ab’)抗鼠-IgG(Sigma)4℃温育30min并如上洗涤3次)。将细胞再悬浮于0.5ml染色缓冲液中。
通过使用FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)的流式细胞仪进行通过肽结合稳定的表面HLA-A2.1分子的分析。如果流式细胞计量术不是立即实行，可以通过加入四分之一体积的2％低聚甲醛并暗处保存在4℃来固定细胞。
[0278] 实验的结果在图5中显示。发现SSX-241-49(SEQ ID NO.15)与HLA-A2.1结合，其结合程度与用作阳性对照的已知A2.1结合物FLPSDYFPSV(HBV18-27；SEQ ID NO：24)类似。将HLA-B44结合肽， AEMGKYSFY(SEQ ID NO：25)用作阴性对照。从阴性对照获得的荧光与当在测定中不使用肽时获得的信号类似。阳性和阴性对照肽是选自Current Protocols in Immunology p.18.3.2，John Wiley和Sons，New York，1998的表18.3.1。
[0279] 7.免疫原性：
[0280] A.小鼠体内免疫
[0281] 麻醉并在尾底避开侧尾静脉，使用100μl含有100nmol的SSX-241-49(SEQ ID NO.15)和20μg用50μl IFA(不完全弗氏佐剂)乳化的PBS中的HTL表位肽皮下注射HHD1转基因A*0201小鼠(Pascolo，S.，等，J.Exp.Med.185：2043-2051，1997)。 [0282] B.制备刺激细胞(LPS胚细胞)
[0283] 对于每组免疫小鼠使用来源于2只稚鼠(naive mice)的脾，处死未免疫小鼠并将尸体放置于酒精中。使用无菌工具，刺穿小鼠左侧(较低的中间部分)皮肤的上皮层，暴露腹膜。用乙醇饱和腹膜，无菌取出脾。将脾放置于含有无血清培养基的培养皿中。通过使用来自3ml注射器的无菌柱塞捣碎脾来分离脾细胞。漂洗皿孔，将脾细胞收集在50ml锥形管中的无血清培养基中。将细胞离心(12000rpm，7min)并用RPMI洗涤一次。在RPMI-10％6
FCS(胎牛血清)中再悬浮新鲜脾细胞至浓度为每ml1x10 细胞。加入25g/ml脂多糖和
7μg/ml葡聚糖硫酸酯。在含有5％CO2的37℃T-75烧瓶中将细胞温育3天。将脾胚细胞
7
收集在50ml试管中，离心(pellet)(12000rpm，7min)，并在RPMI中再悬浮至3X10/ml。用
50μg/ml引发肽(priming peptide)室温脉冲胚细胞4小时，25μg/ml丝裂霉素C 37℃处理20min，并用DMEM洗涤三次。
FCS(胎牛血清)中再悬浮新鲜脾细胞至浓度为每ml1x10 细胞。加入25g/ml脂多糖和
7μg/ml葡聚糖硫酸酯。在含有5％CO2的37℃T-75烧瓶中将细胞温育3天。将脾胚细胞
7
收集在50ml试管中，离心(pellet)(12000rpm，7min)，并在RPMI中再悬浮至3X10/ml。用
50μg/ml引发肽(priming peptide)室温脉冲胚细胞4小时，25μg/ml丝裂霉素C 37℃处理20min，并用DMEM洗涤三次。
[0284] C.体外刺激
[0285] 在LPS刺激胚细胞3天后和肽加样的同一天，如上处死接触过抗原的小鼠(免疫6 6
后14天)以取出脾。将3x10 脾细胞与1x10LPS胚细胞/孔在DMEM培养基的24孔平板-5
中在5％CO2的条件下37℃共培养，所述 DMEM培养基补充有10％FCS，5x10 M β-巯基乙醇，100μg/ml链霉素和100IU/ml青霉素。在第3天向培养物加入5％(vol/vol)ConA上
51
清液并在第7天在 Cr-释放测定中测定溶细胞活性。
后14天)以取出脾。将3x10 脾细胞与1x10LPS胚细胞/孔在DMEM培养基的24孔平板-5
中在5％CO2的条件下37℃共培养，所述 DMEM培养基补充有10％FCS，5x10 M β-巯基乙醇，100μg/ml链霉素和100IU/ml青霉素。在第3天向培养物加入5％(vol/vol)ConA上
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清液并在第7天在 Cr-释放测定中测定溶细胞活性。
[0286] D.测量CTL活性的铬释放测定
[0287] 为了评估肽特异性溶解，将2x106T2细胞与100μCi铬酸钠加上50μg/ml肽一起37℃温育1小时。在温育期间，每15分钟将它们轻轻振荡。在标记和加样后，用10ml DMEM-10％FCS将细胞洗涤3次，在流出上清液后用新鲜的Kimwipe擦拭每个试管。将靶5
细胞再悬浮于DMEM-10％FBS浓度为1x10/ml。在DMEM-10％FCS中将效应细胞调整至1x
7
10/ml并在U-底96孔平板中制备100μl系列3倍稀释度的效应物。每孔加100μl靶细胞。为了测定自发释放和最大释放，对于每个靶子准备含有100μl靶细胞的6个附加孔。
通过将靶细胞与100μl培养基温育来显示自发释放；通过将靶细胞与100μl 2％SDS温育来显示最大释放。然后将平板600rpm离心5分钟并在5％CO2和80％湿度条件下37℃温育4小时。在温育后，然后将平板1200rpm离心5min。收获上清液并用γ计数器计数。如下测定特异性裂解：％特异性释放＝[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]x100。
细胞再悬浮于DMEM-10％FBS浓度为1x10/ml。在DMEM-10％FCS中将效应细胞调整至1x
7
10/ml并在U-底96孔平板中制备100μl系列3倍稀释度的效应物。每孔加100μl靶细胞。为了测定自发释放和最大释放，对于每个靶子准备含有100μl靶细胞的6个附加孔。
通过将靶细胞与100μl培养基温育来显示自发释放；通过将靶细胞与100μl 2％SDS温育来显示最大释放。然后将平板600rpm离心5分钟并在5％CO2和80％湿度条件下37℃温育4小时。在温育后，然后将平板1200rpm离心5min。收获上清液并用γ计数器计数。如下测定特异性裂解：％特异性释放＝[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]x100。
[0288] 在图6中显示证明肽脉冲的靶细胞特异性裂解的铬释放测定的结果。
[0289] 8.与其它SSX蛋白质的交叉反应性：
[0290] SSX-241-49(SEQ ID NO.15)与其它SSX蛋白质的相同区域共享高度序列同一性。周围区域也通常已经十分保守。因此在所有5个序列中管家蛋白酶体可以在V49之后切割。此外，预测SSX-241-49与HLA-A*0201结合(参见表6)。通过用SSX-241-49免疫产生的CTL与表达其它SSX蛋白质的肿瘤细胞交叉反应。
[0291] 表6.SSX41-49-A*0201预测结合
[0292]
[0293] 实施例4
[0294] 聚簇分析(PSMA163-192)
[0295] 在433A ABI肽 合 成 仪 上 使 用 标 准 固 相F-moc 化 学 合 成 一 种 肽，AFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDM，PSMA163-192，(SEQ ID NO.30)，其含有来源于前列腺特异性膜抗原的A1表位聚簇，PSMA168-190(SEQID NO.31)。在侧链脱保护和从树脂切割后，在反相制备HPLC C4柱上以下列条件：流速为4ml/min的线性AB梯度(5％B/min)，其中洗脱剂A是0.1％TFA水溶液并且洗脱剂B是0.1％TFA的乙腈溶液，运行首先溶解在甲酸中，然后稀释在30％乙酸中的肽。将根据质谱分析，在时间16.642min处的含有期望肽的组分汇集和冻干。然后基本上如上所述将该肽进行蛋白酶体消化和质谱分析。在表7中总结来源于质谱的显著峰。
[0296] 表7.PMSA163-192质量峰鉴定
[0297]
[0298]
[0299] 黑体序列对应于预测与MHC结合的肽，参见表8。
[0300] N-末端池测序(pool sequence)分析
[0301] 通过ABI 473A蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)将蛋白酶体消化一小时的一个等分试样(参见上述实施例3部分3)进行N-末端氨基酸序列分析。切割位点和效率的测定是基于测序循环(sequence cycle)，蛋白质测序仪的重复产率和在分析序列中唯一的氨基酸的相对产率的考虑。即如果唯一的(在分析序列中)残基X只出现在第n个循环中，在它N-末端方向n-1个残基之前存在一个切割位点。除帮助解析在将质量指定为序列中的任何错读，这些数据还提供一种比质谱更可靠的各种片段相对产率的指示法。
[0302] 对于PSMA163-192(SEQ ID NO.30)该池测序支持在V177后单一的主要切割位点和几个次要切割位点，特别是在Y179后的一个。综述在图7A-C中表示的结果显示下列各项： [0303] 第3循环的S表明底物N-末端的存在。
[0304] 第5循环的Q表明底物N-末端的存在。
[0305] 第1循环的N表明在V177后的切割。
[0306] 第3循环的N表明在V175后的切割。注意表7中的片段176-192。
[0307] 第5循环的T表明在V177后的切割。
[0308] 第1至第3循环的T表明在R181，A180和Y179后愈加普通的切割。
[0309] 只有这些的最后一项对应通过质谱检测的峰；163-179和180-192，参见表7。缺少其它可表明它们是在比质谱中检测更小的片段上。
[0310] 第4，第8，和第10循环的K表明分别在E183，Y179和V177后的切割，
[0311] 所有这些对应通过质谱观测到的片段。参见表7。
[0312] 第1和第3循环的A分别表明底物N-末端的存在和在V177后的切割。
[0313] 在第4和第8循环的P表明底物N-末端的存在。
[0314] 第6和第10循环的G表明底物N-末端的存在。
[0315] 第7循环的M表明底物N-末端的存在和/或在F185后的切割。
[0316] 第15循环的M表明在V177后的切割。
[0317] 第1循环可以表明在D191后的切割，参见表7。
[0318] 第4和第13循环的R表明在V177后的切割。
[0319] 第2和第11循环的R表明在Y179后的切割。
[0320] 第2，第6和第13循环的V分别表明在V175，M169后的切割和底物N-末端的存在。注意表7中在176和170开始的片段。
[0321] 第1，第2和第14循环的Y分别表明在V175，V177后的切割和底物N-末端的存在。 [0322] 第11和第12循环的L分别表明在V177后的切割和底物N-末端的存在，是与其它数据最一致的解释。
[0323] 与质谱结果相比我们发现第2，第5和第9循环的L分别与在F186，E183或M169，和Y179后的切割一致。参见表7。
[0324] 表位鉴定
[0325] 选择通过SYFPEITHI或NIH算法预测与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C-末端片段进一步分析。方法的消化和预测步骤可以以任何顺序有效实行。尽管在此描述的蛋白酶体消化中使用的底物肽是特别设计来包括预测的HLA-A1结合序列，但是可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果在表8中显示。 [0326] 表8.通过蛋白酶体产生的片段预测HLA结合
[0327]
[0328]
[0329] 未预测
[0330] HLA-A*0201结合测定：
[0331] 基本上如实施例3中所述使用PSMA168-177，GMPEGDLVYV，(SEQID NO.33)进行HLA-A*0201结合研究。如图8所示，在即使比阳性对照肽更低的浓度下该表位也显示显著的结合。在该测定中(并贯穿本公开内容)用作对照的Melan-A肽，ELAGIGILTV实际上是天然序列(EAAGIGILTV)的一种变体并且在该测定中显示高亲和力。
[0332] 实施例5
[0333] 聚簇分析(PSMA281-310)
[0334] 在433A ABI肽合 成仪上 使用 标准固 相F-moc化学 合成另 一种 肽，RGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMG，PSMA281-310，(SEQ ID NO.45)，其含有来源于前列腺特异性膜抗原A1表位，PSMA283-307(SEQ ID NO.46)。在侧链脱保护和从树脂切割后，在反相制备HPLC C18柱上以下列 条件：流速为4ml/min的线性AB梯度(5％B/min)，其中洗脱剂A是0.1％TFA水溶液并且洗脱剂B是0.1％TFA的乙腈溶液，运行去离子水(ddH2O)中的肽。将根据质谱分析，在时间17.061min处的含有期望肽的组分汇集和冻干。然后基本上如上所述将肽进行蛋白酶体消化和质谱分析。在表9中总结来源于质谱的显著峰。
[0335] 表9.PSMA281-310质量峰鉴定
[0336]
[0337] 黑体序列对应于预测与MHC结合的肽，参见表10。
[0338] *只根据质量该峰也可以是296-310或288-303。
[0339] **只根据质量该峰也可以是298-307。HPLC与质谱的结合显示在一些较后的时间点该峰是两种物质的混合物。
[0340] 只根据质量该峰也可以是289-298。
[0341] 只根据质量该峰也可以是281-295或294-306。
[0342] §只根据质量该峰也可以是297-303。
[0343] 只根据质量该峰也可以是285-306。
[0344] #只根据质量该峰也可以是288-303。
[0345] N-末端池测序分析不支持任何这些备选的指定。
[0346] N-末端池测序分析
[0347] 通过ABI 473A蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)将蛋白酶体消化一小时的一个等分试样(参见上述实施例3部分3)进行N-末端氨基酸序列分析。切割位点和效率的测定是基于测序循环(sequence cycle)，蛋白质测序仪的重复产率和在分析序列中唯一的氨基酸的相对产率的考虑。即如果唯一的(在分析序列中)残基X只出现在第n个循环中，在它N-末端方向n-1个残基之前存在一个切割位点。除帮助解析在将质量指定为序列中的任何错读，这些数据还提供一种比质谱更可靠的各种片段相对产率的指示法。
[0348] 对于PSMA281-310(SEQ ID NO.45)该池测序支持在其它次要切割位点中的V287和I297后的两个主要切割位点。综述图9中表示的结果显示下列各项：
[0349] 第4和第11循环的S分别表明在V287后的切割和底物N-末端的存在。
[0350] 第8循环的H表明在V287后的切割。相对于在10至11存在的高度下降，在位置9和10处缺乏峰高的下降，而不是表示测序反应中潜伏状态的峰可提示在A286和E285后也切割。
[0351] 第2，第4和第7循环的D分别表明在Y299，I297和V294后的切割。
[0352] 在表10中的任何片段中或在下面注释的备选指定中未观测到这最后 的切割。 [0353] 第6循环的Q表明在I297后的切割。
[0354] 第10和第12循环的M分别表明在Y299和I297后的切割。
[0355] 表位鉴定
[0356] 选择通过SYFPEITHI或NIH算法预测与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C-末端片段进一步分析。方法的消化和预测步骤可以以任何顺序有效实行。尽管在此描述的蛋白酶体消化中使用的底物肽是特别设计来包括预测的HLA-A1结合序列，但是可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果在表10中显示。
[0357] 表10.
[0358] 通过蛋白酶体产生的片段：PSMA281-310预测HLA结合
[0359]
[0360] 未预测
[0361] 如表10所示，将真实序列附加在表位N-末端经常可以产生对相同或不同MHC限制性元件仍然有效，甚至更好的表位。注意例如(G)LPSIPVHPI与HLA-A*0201的配对，其中通过依赖于N-末端修剪以产生针对HLA-B7，-B*5101，和Cw*0401的表位，可以将10-链节用作对几种MHC类型有效的疫苗。
[0362] HLA-A*0201结合测定：
[0363] 基本上如上面实施例3和4中所述使用PSMA288-297，GLPSIPVHPI，(SEQ ID NO.48)进行HLA-A*0201结合研究。如图8所示，在即使比阳性对照肽更低的浓度下该表位也显示显著的结合。
[0364] 实施例6
[0365] 聚簇分析(PSMA454-481)
[0366] 通过MPS(纯度＞95％)合成另一种肽，SSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHLTKEL，PSMA454-481，(SEQ ID NO.55)，其含有来源于前列腺特异性膜抗原的表位聚簇，如上所述将其进行蛋白酶体消化和质谱分析。在表11中总结来源于质谱的显著峰。
[0367] 表11.PSMA454-481质量峰鉴定
[0368]
[0369] 黑体序列对应于预测与MHC结合的肽，参见表12。
[0370] *只基于质量该峰同样可以充分指定为肽455-472，然而蛋白酶体只去除N-末端氨基酸是不大可能的。如果问题重要可以通过N-末端测序解决它。
[0371] **基于质量该片段也可表示455-464。
[0372] 表位鉴定
[0373] 选择通过SYFPEITHI或NIH算法预测与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C-末端片段进一步分析。方法的消化和预测步骤可以以任何顺序有效实行。尽管在此描述的蛋白酶体消化中使用的底物肽是特别设计来包括预测的HLA-A2.1结合序列，但是可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果在表12中显示。
[0374] 表12.通过蛋白酶体产生的片段预测HLA结合
[0375]
[0376] 未预测
[0377] 如表12所示，将真实序列附加在表位N-末端经常可以产生对相同或不同MHC限制性元件仍然有效，甚至更好的表位。注意例如(L)RVDCTPLMY(SEQ ID NOS 62和(63))与HLA-B*2702/5的配对，其中10-链节具有具体的(substantial)预测解离半衰期而共-C-末端9-链节没有。还注意SIEGNYTLRV(SEQ ID NO 57)，一种预测的HLA-A*0201表位的情形， 通过依赖于N-末端修剪产生表位可以将其用作对HLA-B*5101有效的疫苗。 [0378] HLA-A*0201结合测定
[0379] 基本上如上面实施例3中所述使用PSMA460-469，TLRVDCTPL，(SEQID NO.60)进行HLA-A*0201结合研究。如图10所示，发现该表位和HLA-A2.1以与用作阳性对照的已知A2.1结合物FLPSDYFPSV(HBV18-27；SEQ ID NO：24)类似程度的结合。此外，PSMA461-469，(SEQ ID NO.59)几乎也结合。
[0380] ELISPOT分析：PSMA463-471，(SEQ ID NO.62)
[0381] 通过使用50μl/孔的4μg/ml在包被缓冲液(35mM碳酸氢钠，15mM碳酸钠，pH9.5)中的鼠抗人γ-IFN单克隆抗体在4℃温育过夜，用捕捉抗体将硝化纤维基底(nitrocellulose-backed)的微量滴定板的孔包被。通过用PBS洗涤4次5min去除未结合抗体。然后通过加入200μl/孔含有10％血清的RPMI培养基并在室温温育1小时封闭膜上的未结合位点。将抗原刺激的CD8+T细胞，以1∶3的系列稀释接种于微量滴定板的孔中，使用100μl/孔，从2x105细胞/孔开始。(先前的抗原刺激基本上是如Scheibenbogen，C.等Int.J.Cancer 71：932-936，1997中所述)。将PSMA462-471(SEQ ID NO.62)加至终浓度为10μg/ml，IL-2至100U/ml，并且在5％CO2，水饱和空气中37℃培养细胞40小时。在该温育后，用200μl/孔的含有0.05％吐温-20的PBS(PBS-吐温)洗涤6次。加入检测抗体，50μl/孔的2g/ml在PBS+10％胎牛血清中的生物素化的鼠抗人γ-IFN单克隆抗体，并将平板在室温温育2小时。通过用200μl PBS-吐温洗涤4次除去未结合的检测抗体。将100μl抗生物素蛋白偶联的辣根过氧化物酶(Pharmingen，San Diego，CA)加至每个孔，并在室温温育1小时。通过用200μl PBS-吐温洗涤6次去除未结合酶。通过将20mg 3-amino9-ethylcoarbasole药片溶解在2.5ml N，N-二甲基甲酰胺并将那个溶液加至47.5ml 0.05M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)来制备底物。在将以100μl/孔分配底物并于室温温育平板之前立即将25μl 30％H2O2加入底物溶 液中。在显色后(通常
15-30min)，通过用水洗涤平板终止反应。风干平板并使用立体显微镜对斑点计数。 [0382] 图11显示检测PSMA463-471(SEQ ID NO.62)-反应性HLA-A1+CD8+T细胞，其是先前+ +
在HLA-A1CD8T细胞与自身树突细胞加上肽的培养物中产生。从不含肽的培养物中未检
4
测到反应性(数据未显示)。在该情形中可以看到肽反应性T细胞是以2.2x10 分之一至
4
6.7x10 分之一的频率存在于培养物中。由抗-HLA-A1单克隆抗体阻断γ-IFN产生的能力证明这确实是一种HLA-A1-限制性应答；参见图12。
15-30min)，通过用水洗涤平板终止反应。风干平板并使用立体显微镜对斑点计数。 [0382] 图11显示检测PSMA463-471(SEQ ID NO.62)-反应性HLA-A1+CD8+T细胞，其是先前+ +
在HLA-A1CD8T细胞与自身树突细胞加上肽的培养物中产生。从不含肽的培养物中未检
4
测到反应性(数据未显示)。在该情形中可以看到肽反应性T细胞是以2.2x10 分之一至
4
6.7x10 分之一的频率存在于培养物中。由抗-HLA-A1单克隆抗体阻断γ-IFN产生的能力证明这确实是一种HLA-A1-限制性应答；参见图12。
[0383] 实施例7
[0384] 聚簇分析(PSMA653-687)
[0385] 通过MPS(纯度＞95％)合成另一种肽，FDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFY PSMA653-687，(SEQ ID NO.64)，其含有来源于前列腺特异性膜抗原的A2表位聚簇，PSMA660-681(SEQ ID NO 65)，并如上所述进行蛋白酶体消化和质谱分析。在表13中总结来源于质谱的显著峰。
[0386] 表13.PSMA653-687质量峰鉴定
[0387]
[0388]
[0389] 黑体序列对应于预测与MHC结合的肽，参见表13。
[0390] *仅仅基于质量该峰同样可以充分指定为在654开始的肽，然而蛋白酶体只去除N-末端氨基酸被认为不大可能。如果问题重要，可以通过N-末端测序解决它。 [0391] **仅仅基于质量这些峰可以已指定为内部片段，但考虑到消化的总体模式认为它不大可能。
[0392] 表位鉴定
[0393] 选择通过SYFPEITHI或NIH算法预测与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C-末端片段进一步分析。方法的消化和预测步骤可以以任何顺序有效实行。尽管在此描述的蛋白酶体消化中使用的底物肽是特别设计来包括预测的HLA-A2.1结合序列，但是可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果在表12中显示。
[0394] 表14.通过蛋白酶体产生的片段预测HLA结合
[0395]
[0396] 未预测
[0397] 如表14所示，将真实序列附加在表位N-末端经常可以产生对相同或不同MHC限制性元件仍然有效，甚至更好的表位。注意例如(R)MMNDQLMFL(SEQ ID NOS.66和(67))与HLA-A*02的配对，其中10- 链节保持显著的(substantial)预测结合潜力。
[0398] HLA-A*0201结合测定
[0399] 基本上如上面实施例3所述，使用PSMA663-671(SEQ ID NO.66)和PSMA662-671，RMMNDQLMFL(SEQ NO.67)进行HLA-A*0201结合研究。如图10，13和14所示，在即使比阳性对照肽(FLPSDYFPSV(HBV18-27)；SEQ ID NO：24)低的浓度下该表位也显示显著的结合。尽管不是平行进行，与对照的比较提示PSMA662-671(其在亲和力方面接近MelanA肽)具有这两种PSMA肽的优越结合活性。
[0400] 实施例8
[0401] 用表位疫苗接种。
[0402] 1.用肽疫苗接种：
[0403] A.结节内递送
[0404] 使用为胰岛素递送开发的微型泵系统(MiniMed；Northridge，CA)将一种制剂，其包含在含有抗菌剂，抗氧化剂和免疫调制细胞因子的水性缓冲剂中的肽，连续几天注射于腹股沟淋巴结。为了模拟在自然感染中抗原呈递的动力学选择该灌输周期。
[0405] B.控释
[0406] 使用本领域已知的可控PLGA微球体递送肽制剂，所述PLGA微球体改变肽的药物动力学和改善免疫原性。将该制剂注射或口服。
[0407] C.基因枪送递
[0408] 制备一种肽制剂，其中将肽粘附在本领域已知的金微粒上。在基因枪中递送颗粒，其被高速加速以便穿透皮肤，将颗粒携带至包含pAPCs的皮肤组织中。
[0409] D.气溶胶送递
[0410] 为了吸收于肺中适当的血管或淋巴组织之中将肽制剂作为一种本领 域已知的气溶胶吸入。
[0411] 2.用核酸疫苗接种
[0412] 使用微型泵系统，如MiniMed胰岛素泵将核酸疫苗注射于淋巴结中。为了模拟在自然感染中抗原呈递的动力学，经几天的灌输周期递送一种核酸构建体，其是在含有抗菌剂，抗氧化剂和免疫调制细胞因子的水性缓冲剂中配制。
[0413] 任选地，使用控释物质，如PLGA微球体或其它生物可降解物质递送核酸构建体。将这些物质注射或口服。使用口服送递给予核酸疫苗，通过吸收于GALT组织中引发免疫应答。备选地，使用基因枪递送核酸疫苗，其中将核酸疫苗粘附在微细金颗粒上。为了吸收于肺中适当的血管或淋巴组织之中，还可以将核酸构建体作为气溶胶吸入
[0414] 实施例9
[0415] 测定表位疫苗的效力
[0416] 1.四聚体分析：
[0417] 使用I类四聚体分析来测定给药管家表位之前和之后动物中的T细胞频率。对表位应答的T细胞克隆扩增表明表位由pAPCs呈递至T细胞。在对动物给药表位之前和之后测量针对管家表位的特异性T细胞频率，以确定表位是否呈递在pAPCs上。给药后表位特异性T细胞频率的增大表明表位是在pAPC上呈递。
[0418] 2.增殖测定：
[0419] 在用管家表位接种动物大约24小时后，使用为亲和纯化而固定在磁珠上的针对pAPCs上存在的特异性标记的单克隆抗体从PBMCs，脾细胞或淋巴结细胞收获pAPCs。使用该技术从粗血液或脾细胞制剂富集pAPCs。然后将富集的pAPCs用于针对T细胞克隆的增殖测定，所述T细胞克隆是已经产生并且对所关心管家表位是特异性的。将pAPCs与T细胞克隆共温育并通过测量T细胞放射性标记胸苷的掺入监测T细胞增殖活性。增殖表明对管家表位特异性的T细胞正被pAPCs上的表位所刺 激。
[0420] 3.铬释放测定：
[0421] 使用管家表位免疫人类患者或被遗传改造而表达人I类MHC的非人类动物。将来源于免疫受试者的T细胞用于标准铬释放测定，其使用人肿瘤目标或改造来表达相同I类MHC的目标。T细胞杀死目标表明患者中T细胞的刺激将有效杀死表达相似TuAA的肿瘤。 [0422] 实施例10
[0423] 通过淋巴结内免疫用裸DNA诱导CTL应答是有效的。
[0424] 为了定量比较由不同途径免疫诱导的CD8+CTL应答使用一种质粒DNA疫苗(pEGFPL33A)，其含有完全表征(well-characterized)的来源于LCMV-糖蛋白(G)(gp33；氨基酸33-41)(Oehen，S.，等.Immunology99，163-1692000)的免疫显性CTL表位，因为该系统允许广泛评估抗病毒CTL应答。用滴定剂量(200-0.02μg)的pEGFPL33A DNA或对照质粒pEGFP-N3免疫几组2只C57BL/6小鼠，其被i.m.(肌内)，i.d.(皮内)，i.spl.(脾内)，或i.ln.(淋巴结内)给药。阳性对照小鼠i.v.(静脉内)接收500pfuLCMV。免疫10天后，分离脾细胞并在体外第二次再刺激之后测定gp33特异性CTL活性。如图15所示，当给药高剂量的pEFGPL33A DNA(200μg)时，i.m.或i.d.免疫诱导微弱的可检测的CTL应答。相反，仅使用2μgpEFGPL33A DNA i.spl.和使用少至0.2μg pEFGPL33A DNA i.ln.给予来免疫引发有效的gp33特异性CTL应答(图15；符号表示个体小鼠，并且显示了三个类似实验中的一个)。使用对照pEGFP-N3DNA免疫未引发任何可检测的gp33特异性CTL应答(数据未显示)。
[0425] 实施例11
[0426] 淋巴结内DNA免疫引发抗肿瘤免疫性
[0427] 为了检验在i.ln.免疫后引发的有效CTL应答是否能够赋予针对外周肿瘤的保护，使用10μg pEFGPL33A DNA或对照pEGFP-N3DNA以6天的间隔免疫几组6只C57BL/6小鼠3次。在最后一次免疫5天后，将 小块表达gp33表位(EL4-33)的实体瘤s.c.转移至两胁腹并且每3-4天测量肿瘤的生长。尽管在已经反复用对照pEGFP-N3DNA免疫的小鼠中EL4-33肿瘤生长良好(图16)，用pEFGPL33A DNAi.ln.免疫的小鼠迅速铲除外周EL4-33肿瘤(图16)。
[0428] 实施例12
[0429] 淋巴结中DNA含量的差异反映在淋巴结内和肌内注射后CTL应答中的差异。 [0430] i.ln.或i.m.注射pEFGPL33A DNA，并在6，12，24，48小时和4和30天后通过实时PCR评估注射或引流淋巴结的质粒含量。i.m.注射后，在6，12和24小时，注射淋巴结的质粒DNA含量大约比引流淋巴结的质粒DNA含量大3个数量级。在随后的时间点在引流淋巴结中未检测到质粒DNA(图17)。这与i.ln.注射相比使用i.m.以取得相似水平的CTL-/-活性需要大3个数量级的剂量一致。同样i.ln.注射CD8 剔除小鼠，其不发展针对该表+
位的CTL应答，显示从淋巴结清除DNA不是因为CD8CTL在淋巴结中杀死细胞。该观察也支持i.ln.给药将不激发对淋巴结的免疫病理损伤的结论。
位的CTL应答，显示从淋巴结清除DNA不是因为CD8CTL在淋巴结中杀死细胞。该观察也支持i.ln.给药将不激发对淋巴结的免疫病理损伤的结论。
[0431] 实施例13
[0432] 对人给药针对黑素瘤的治疗疫苗DNA质粒制剂
[0433] 在1％苯甲醇，1％乙醇，0.5mM EDTA，柠檬酸盐-磷酸盐，pH 7.6中配制SYNCHROTOPE TA2M，一种黑素瘤疫苗，其编码HLA-A2-限制性酪氨酸酶表位SEQ ID NO.1和表位聚簇SEQ ID NO.69。为了装载至MINIMED 407C灌输泵中，制备80，160和320μg DNA/ml的等分试样。将SILHOUETTE灌输装置的导管置于通过超声成像显现的腹股沟淋巴结中。泵和灌输装置装配最初是设计用于将胰岛素递送至糖尿病患者，对于本申请用31mm导管替换通常的17mm导管。将灌输装置保持开放4天(约96小时)，灌输速率为大约25μl/小时，导致大约2.4ml的总灌输体积。因此对于上述的3种浓度，每种灌输的总给药剂量分别是约200和400μg；并可以为800μg。开始后来的灌输之前给灌输的受试者10天 的休息期。假定在给药后质粒DNA在淋巴结中持续滞留(如在实施例12中)和在抗原消失后CTL通常的应答动力学，该时间表将足以保持免疫CTL应答。
[0434] 实施例14
[0435] 附加表位
[0436] 已经将上述，特别是实施例3-7中的方法用于另外的合成肽底物，其导致鉴定如在下面表15-36中更多的表位。这里使用的底物是设计来鉴定管家蛋白酶体加工的产物，其产生HLA-A*0201结合表位，但是，如上所述，可以预测另外的MHC-结合反应性。然而公开了许多这样的反应性，这些列表意欲是示范的，而不是详尽的和限制性的。也如上讨论的，可将分析物的单独组分以变化的组合和顺序使用。消化NY-ESO-1底物136-163和150-177(分别为SEQ ID NOS.254和255)产生在MALDI-TOF质谱中飞行不好的片段。然而它们非常适合于N-末端肽池测序，由此允许鉴定切割位点。并不是所有底物必定满足实施例3中引用的表位聚簇的正式定义。一些聚簇如此大，例如NY-ESO-186-171，以致使用只跨越该聚簇一部分的底物更方便。在其它情形中，底物延伸至满足正式定义的聚簇以外以包括相邻的预测表位。在一些情形中，在设计合成底物之前实际结合活性可能已经确定制备什么底物，例如这里报道的MAGE表位，其中测定HLA结合活性来选择具有预测亲和力的肽。 [0437]
[0438]
[0439]
[0440]
[0441]
[0442]
[0443]
[0444]
[0445]
[0446]
[0447]
[0448]
[0449]
[0450]
[0451]
[0452]
[0453]
[0454]
[0455]
[0456]
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465]
[0466]
[0467]
[0468]
[0469]
[0470]
[0471]
[0472]
[0473]
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0478]
[0479]
[0480]
[0481]
[0482]
[0483] 实施例15
[0484] 评估表位对非靶组织的交叉反应性
[0485] 如上所提及，PSA是蛋白酶的激肽释放酶家族的一个成员，其自身是丝氨酸蛋白酶家族的一个亚型。虽然与PSA共享最大程度序列同一性的该家族成员也共享相似的表达图谱，但仍然可能具有显著不同表达图谱的蛋白质共享单独的表位序列。评估不希望有的交叉反应性的第一步是鉴定共享序列。完成这个的一种方法是使用“Search for short nearly exact matches”选项对SWISSPROT或Entrez非冗余肽序列数据库进行BLAST搜索表位序列；可在万维网(http://www)“ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.html”上访问超文本传输协议。因此对SWISSPROT搜索SEQ ID NO.214，WVLTAAHCI(局限于人的记录)，发现四个精确匹配，包括PSA。其它3个是来源于激肽释放酶1(组织激肽释放酶)，和弹性蛋白酶2A和2B。虽然这9个氨基酸区段是相同的，但侧翼序列完全不同，特别是C-末端一侧，提示可进行不同加工并因此从这些其它的蛋白质可能不释放相同的表位。(请注意激肽释放酶命名是混乱的)。因此激肽释放酶1[登记号P06870]是与在关于肿瘤-相关抗原部分中上面关于PSA段落中提及的那种[登记号AAD13817]不同的一种蛋白质)。
[0486] 可以以几种方法检验该可能性。可以将含有内嵌在这些蛋白质每一种的前后序列中的表位序列的合成肽进行如上所述的体外蛋白酶体消化和分析。备选地，为了确定表位+是否被加工和呈递，在利用识别该表位的CD8T细胞的细胞毒性(或类似的)测定中可以将通过天然或重组表达来表达这些其它蛋白质的细胞用作目标。
[0487] 实施例16
[0488] 表位聚簇
[0489] 已知和预测的表位通常在蛋白质抗原序列中不均匀分布。如上所述，我们已经将含有比(已知或预测)表位平均密度更高的序列区段定义为表位聚簇。在表位聚簇的使用中是将它们的序列结合至在这里描述的蛋白酶体消化分析中使用的底物肽中。还可将表位聚簇用作疫苗组分。在题为EPITOPE CLUSTERS的美国专利申请No.09/561,571中发现表位聚 簇定义和使用的更详尽的讨论。
[0490] 下列各表(37-60)表示使用SYFPEITHI和NIH算法预测HLA-A2结合的9-链节表位和重叠表位区域的表位密度，以及表位在整个蛋白中的表位密度，和这两个密度的比率。(由上述定义该比率必须超过1以成为簇；要求更高的这个比率值反映优选实施方案)。通过得分排列和通过它们在完整蛋白序列中的第一个氨基位置鉴定单独的9-链节。编号来源于蛋白质的每个可能的簇。将簇包含的完整序列内氨基酸位置范围表示为组成它的单独预测表位的等级。
[0491] 表37
[0492] gp 100的BIMAS-NIH/Parker算法结果
[0493]
[0494] 表38
[0495] gp100的SYFPEITHI(Rammensee算法)结果
[0496]
[0497] 表39
[0498] gp100的聚簇预测
[0499] 总AAs：661
[0500] 总9-链节：653
[0501] SYFPEITHI 16：1099-链节
[0502] NIH 5：409-链节
[0503]
[0504] *邻近但不重叠的表位
[0505] 表40
[0506] PSMA的BIMAS-NIH/Parker算法结果
[0507]
[0508] 表41
[0509] PSMA的SYFPEITHI(Rammensee算法)结果
[0510]
[0511] 表42
[0512] 前列腺特异性膜抗原(PSMA)的聚簇预测
[0513] 总AAs：750
[0514] 总9-链节：742
[0515] SYFPEITHI 16：889-链节
[0516] NIH 5：309-链节
[0517]
[0518] *邻近但不重叠的表位
[0519] 表43
[0520] PSA的BIMAS-NIH/Parker算法结果
[0521]
[0522] 表44
[0523] PSA的SYFPEITHI(Rammensee算法)结果
[0524]
[0525] 表45
[0526] 前列腺特异性抗原(PSA)的聚簇预测
[0527] 总AAs：261
[0528] 总9-链节：253
[0529] SYFPEITHI 16：369-链节
[0530] NIH 5：179-链节
[0531]
[0532] *这些聚簇在较不优选的聚簇#4的内部。
[0533] **包含一个邻近但不重叠的表位。
[0534] 表46
[0535] PSCA的BIMAS-NIH/Parker算法结果
[0536]
[0537] 表47
[0538] PSCA的SYFPEITHI(Rammensee算法)结果
[0539]
[0540] 表48
[0541] 前列腺干细胞抗原(PSCA)的聚簇预测
[0542] 总AAs：123
[0543] 总9-链节：115
[0544] SYFPEITHI 16：33；
[0545] SYFPEITHI 20：13
[0546] NIH 5：13
[0547]
[0548] *该聚簇是较不优选的聚簇#3的内部。
[0549] 在表49-60中将对于每种算法的表位预测和聚簇分析数据一起展示在单个表中。 [0550] 表49
[0551] MAGE-1聚簇预测(NIH算法)
[0552] 总AAs：309
[0553] 总9-链节：301
[0554] NIH 5：199-链节
[0555]
[0556] 表50
[0557] MAGE-1的聚簇预测(SYFPEITHI算法)
[0558] 总AAs：309
[0559] 总9-链节：301
[0560] SYFPEITHI 16：469-链节
[0561]
[0562] 表51
[0563] MAGE-2的聚簇预测(NIH算法)
[0564] 总AAs：314
[0565] 总9-链节：308
[0566] NIH＞＝5：209-链节
[0567]
[0568] 表52
[0569] MAGE-2的聚簇预测(SYFPEITHI算法)
[0570] 总AAs：314
[0571] 总9-链节：308
[0572] SYFPEITHI 16：529-链节
[0573]
[0574] 表53
[0575] MAGE-3的聚簇预测(NIH算法)
[0576] 总AAs：314
[0577] 总9-链节：308
[0578] NIH 5：229-链节
[0579]
[0580] 表54
[0581] MAGE-3的聚簇预测(SYFPEITHI算法)
[0582] 总AAs：314
[0583] 总9-链节：308
[0584] SYFPEITHI 16：479-链节
[0585]
[0586] 表55
[0587] PRAME的聚簇预测(NIH算法)
[0588] 总AAs：509
[0589] 总9-链节：501
[0590] NIH 5：409-链节
[0591]
[0592] 表56
[0593] PRAME的聚簇预测(SYFPEITHI算法)
[0594] 总AAs：509
[0595] 总9-链节：501
[0596] SYFPEITHI 17：809-链节
[0597]
[0598] PRAME的聚簇预测(SYFPEITHI算法)
[0599] 总AAs：509
[0600] 总9-链节：501
[0601] SYFPEITHI 17：809-链节
[0602]
[0603] 表57
[0604] CEA的聚簇预测(NIH算法)
[0605] 总AAs：702
[0606] 总9-链节：694
[0607] NIH 5：309-链节
[0608]
[0609] 表58
[0610] CEA的聚簇预测(SYFPEITHI算法)
[0611] 总AAs：702
[0612] 总9-链节：694
[0613] SYFPEITHI 16：819-链节
[0614]
[0615]
[0616] 表59
[0617] SCP-1的聚簇预测(NIH算法)
[0618] 总AAs：976
[0619] 总9-链节：968
[0620] NIH 5：379-链节
[0621]
[0622] 表60
[0623] SCP-1的聚簇预测
[0624] 总AAs：976
[0625] 总9-链节：968
[0626] Rammensee 16：1189-链节
[0627]
[0628]
[0629]
[0630] 本发明的实施方案适用于并且考虑在这里提供的靶抗原序列中的变异，其包括在可以通过万维网访问的各种数据库中公开的那些。具体地对于在这里公开的具体序列，通过使用提供的登记号访问关于每种抗原的信息可以发现序列中的变异。
[0631] 酪氨酸酶蛋白；SEQ ID NO 2
[0632] 1 MLLAVLYCLL WSFQTSAGHF PRACVSSKNL MEKECCPPWS GDRSPCGQLSGRGSCQNILL [0633] 61 SNAPLGPQFP FTGVDDRESW PSVFYNRTCQ CSGNFMGFNC GNCKFGFWGPNCTERRLLVR [0634] 121RNIFDLSAPE KDKFFAYLTL AKHTISSDYV IPIGTYGQMK NGSTPMFNDINIYDLFVWMH [0635] 181YYVSMDALLG GSEIWRDIDF AHEAPAFLPW HRLFLLRWEQ EIQKLTGDENFTIPYWDWRD [0636] 241AEKCDICTDE YMGGQHPTNP NLLSPASFFS SWQIVCSRLE EYNSHQSLCNGTPEGPLRRN [0637] 301PGNHDKSRTP RLPSSADVEF CLSLTQYESG SMDKAANFSF RNTLEGFASPLTGIADASQS [0638] 361SMHNALHIYM NGTMSQVQGS ANDPIFLLHH AFVDSIFEQW LRRHRPLQEVYPEANAPIGH [0639] 421NRESYMVPFI PLYRNGDFFI SSKDLGYDYS YLQDSDPDSF QDYIKSYLEQASRIWSWLLG [0640] 481AAMVGAVLTA LLAGLVSLLC RHKRKQLPEE KQPLLMEKED YHSLYQSHLSSX-2蛋白；SEQ ID NO 3
[0641] 1 MNGDDAFARR PTVGAQIPEK IQKAFDDIAK YFSKEEWEKM KASEKIFYVYMKRKYEAMTK [0642] 61 LGFKATLPPF MCNKRAEDFQ GNDLDNDPNR GNQVERPQMT FGRLQGISPKIMPKKPAEEG [0643] 121 NDSEEVPEAS GPQNDGKELC PPGKPTTSEK IHERSGPKRG EHAWTHRLRERKQLVIYEEI [0644] 181 SDPEEDDEPSMA蛋白；SEQ ID NO 4
[0645] 1 MWNLLHETDS AVATARRPRW LCAGALVLAG GFFLLGFLFG WFIKSSNEATNITPKHNMKA [0646] 61 FLDELKAENI KKFLYNFTQI PHLAGTEQNF QLAKQIQSQW KEFGLDSVELAHYDVLLSYP [0647] 121 NKTHPNYISI INEDGNEIFN TSLFEPPPPG YENVSDIVPP FSAFSPQGMPEGDLVYVNYA [0648] 181 RTEDFFKLER DMKINCSGKI VIARYGKVFR GNKVKNAQLA GAKGVILYSDPADYFAPGVK [0649] 241 SYPDGWNLPG GGVQRGNILN LNGAGDPLTP GYPANEYAYR RGIAEAVGLPSIPVHPIGYY [0650] 301 DAQKLLEKMG GSAPPDSSWR GSLKVPYNVG PGFTGNFSTQ KVKMHIHSTNEVTRIYNVIG [0651] 361 TLRGAVEPDR YVILGGHRDS WVFGGIDPQS GAAVVHEIVR SFGTLKKEGWRPRRTILFAS [0652] 421 WDAEEFGLLG STEWAEENSR LLQERGVAYI NADSSIEGNY TLRVDCTPLMYSLVHNLTKE [0653] 481 LKSPDEGFEG KSLYESWTKK SPSPEFSGMP RISKLGSGND FEVFFQRLGIASGRARYTKN [0654] 541 WETNKFSGYP LYHSVYETYE LVEKFYDPMF KYHLTVAQVR GGMVFELANSIVLPFDCRDY [0655] 601 AVVLRKYADK IYSISMKHPQ EMKTYSVSFD SLFSAVKNFT EIASKFSERLQDFDKSNPIV [0656] 661 LRMMNDQLMF LERAFIDPLG LPDRPFYRHV IYAPSSHNKY AGESFPGIYDALFDIESKVD [0657] 721 PSKAWGEVKR QIYVAAFTVQ AAAETLSEVA
[0658] (R)，mRNA；
[0659] Homo sapiens
[0660] ACCESSION NM_000372
[0661] VERSION NM_000372.1 GI：4507752
[0662] SEQ ID NO 2
[0663] /翻译＝″MLLAVLYCLLWSFQTSAGHFPRACVSSKNLMEKECCPPWSGDRSPCGQLSGRGSCQNILLSNAPLGPQFPFTGVDDRESWPSVFYNRTCQCSGNFMGFNCGNCKFGFWGPNCTERRLLVRRNIFDLSAPEKDKFFAYLTLAKHTISSDYVIPIGTYGQMKNGSTPMFNDINIYDLFVWMHYYVSMDALLGGSEIWRDIDFAHEAPAFLPWHRLFLLRWEQEIQKLTGDENFTIPYWDWRDAEKCDICTDEYMGGQHPTNPNLLSPASFFSSWQIVCSRLEEYNSHQSLCNGTPEGPLRRNPGNHDKSRTPRLPSSADVEFCLSLTQYESGSMDKAANFSFRNTLEGFASPLTGIADASQSSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPIFLLHHAFVDSIFEQWLRRHRPLQEVYPEANAPIGHNRESYMVPFIPLYRNGDFFISSKDLGYDYSYLQDSDPDSFQDYIKSYLEQASRIWSWLLGAAMVGAVLTALLAGLVSLLCRHKRKQLPEEKQPLLMEKEDYHSLYQSHL″
[0664] SEQ ID NO 5
[0665] 起始1 atcactgtag tagtagctgg aaagagaaat ctgtgactcc aattagccagttcctgcaga [0666] 61 ccttgtgagg actagaggaa gaatgctcct ggctgttttg tactgcctgctgtggagttt [0667] 121 ccagacctcc gctggccatt tccctagagc ctgtgtctcc tctaagaacctgatggagaa [0668] 181 ggaatgctgt ccaccgtgga gcggggacag gagtccctgt ggccagctttcaggcagagg [0669] 241 ttcctgtcag aatatccttc tgtccaatgc accacttggg cctcaatttcccttcacagg [0670] 301 ggtggatgac cgggagtcgt ggccttccgt cttttataat aggacctgccagtgctctgg [0671] 361 caacttcatg ggattcaact gtggaaactg caagtttggc ttttggggaccaaactgcac [0672] 421 agagagacga ctcttggtga gaagaaacat cttcgatttg agtgccccagagaaggacaa [0673] 481 attttttgcc tacctcactt tagcaaagca taccatcagc tcagactatgtcatccccat [0674] 541 agggacctat ggccaaatga aaaatggatc aacacccatg tttaacgacatcaatattta [0675] 601 tgacctcttt gtctggatgc attattatgt gtcaatggat gcactgcttgggggatctga [0676] 661 aatctggaga gacattgatt ttgcccatga agcaccagct tttctgccttggcatagact [0677] 721 cttcttgttg cggtgggaac aagaaatcca gaagctgaca ggagatgaaaacttcactat [0678] 781 tccatattgg gactggcggg atgcagaaaa gtgtgacatt tgcacagatgagtacatggg [0679] 841 aggtcagcac cccacaaatc ctaacttact cagcccagca tcattcttctcctcttggca [0680] 901 gattgtctgt agccgattgg aggagtacaa cagccatcag tctttatgcaatggaacgcc [0681] 961 cgagggacct ttacggcgta atcctggaaa ccatgacaaa tccagaaccccaaggctccc [0682] 1021ctcttcagct gatgtagaat tttgcctgag tttgacccaa tatgaatctggttccatgga [0683] 1081taaagctgcc aatttcagct ttagaaatac actggaagga tttgctagtccacttactgg [0684] 1141gatagcggat gcctctcaaa gcagcatgca caatgccttg cacatctatatgaatggaac [0685] 1201aatgtcccag gtacagggat ctgccaacga tcctatcttc cttcttcaccatgcatttgt [0686] 1261tgacagtatt tttgagcagt ggctccgaag gcaccgtcct cttcaagaagtttatccaga [0687] 1321agccaatgca cccattggac ataaccggga atcctacatg gttccttttataccactgta [0688] 1381cagaaatggt gatttcttta tttcatccaa agatctgggc tatgactatagctatctaca [0689] 1441agattcagac ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaacaagcgagtcg [0690] 1501gatctggtca tggctccttg gggcggcgat ggtaggggcc gtcctcactgccctgctggc [0691] 1561agggcttgtg agcttgctgt gtcgtcacaa gagaaagcag cttcctgaagaaaagcagcc [0692] 1621actcctcatg gagaaagagg attaccacag cttgtatcag agccatttataaaaggctta [0693] 1681ggcaatagag tagggccaaa aagcctgacc tcactctaac tcaaagtaatgtccaggttc [0694] 1741ccagagaata tctgctggta tttttctgta aagaccattt gcaaaattgtaacctaatac [0695] 1801aaagtgtagc cttcttccaa ctcaggtaga acacacctgt ctttgtcttgctgttttcac [0696] 1861tcagcccttt taacattttc ccctaagccc atatgtctaa ggaaaggatgctatttggta [0697] 1921atgaggaact gttatttgta tgtgaattaa agtgctctta tttt
[0698] 人滑膜肉瘤，X断裂点2(SSX2)，mRNA。
[0699] ACCESSION NM_003147
[0700] VERSION NM_003147.1 GI：10337582
[0701] SEQ ID NO 3
[0702] /翻译＝″MNGDDAFARRPTVGAQIPEKIQKAFDDIAKYFSKEEWEKMKASEKIFYVYMKRKYEAMTKLGFKATLPPFMCNKRAEDFQGNDLDNDPNRGNQVERPQMTFGRLQGISPKIMPKKPAEEGNDSEEVPEASGPQNDGKELCPPGKPTTSEKIHERSGPKRGEHAWTHRLRERKQLVIYEEISDPEEDDE″
[0703] SEQ ID NO 6
[0704] 起始1 ctctctttcg attcttccat actcagagta cgcacggtct gattttctctttggattctt [0705] 61 ccaaaatcag agtcagactg ctcccggtgc catgaacgga gacgacgcctttgcaaggag [0706] 121 acccacggtt ggtgctcaaa taccagagaa gatccaaaag gccttcgatgatattgccaa [0707] 181 atacttctct aaggaagagt gggaaaagat gaaagcctcg gagaaaatcttctatgtgta [0708] 241 tatgaagaga aagtatgagg ctatgactaa actaggtttc aaggccaccctcccaccttt [0709] 301 catgtgtaat aaacgggccg aagacttcca ggggaatgat ttggataatgaccctaaccg [0710] 361 tgggaatcag gttgaacgtc ctcagatgac tttcggcagg ctccagggaatctccccgaa [0711] 421 gatcatgccc aagaagccag cagaggaagg aaatgattcg gaggaagtgccagaagcatc [0712] 481 tggcccacaa aatgatggga aagagctgtg ccccccggga aaaccaactacctctgagaa [0713] 541 gattcacgag agatctggac ccaaaagggg ggaacatgcc tggacccacagactgcgtga [0714] 601 gagaaaacag ctggtgattt atgaagagat cagcgaccct gaggaagatgacgagtaact [0715] 661 cccctcaggg atacgacaca tgcccatgat gagaagcaga acgtggtgacctttcacgaa [0716] 721 catgggcatg gctgcggacc cctcgtcatc aggtgcatag caagtg
[0717] 人叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1(FOLH1)，mRNA。
[0718] ACCESSION NM_004476
[0719] VERSION NM_004476.1 GI：4758397
[0720] /翻译＝″MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQ LAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTOKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKT YSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA″
[0721] SEQ ID NO 7
[0722] 起始 1 ctcaaaaggg gccggatttc cttctcctgg aggcagatgt tgcctctctctctcgctcgg [0723] 61 attggttcag tgcactctag aaacact gctgtggtggaga aactggaccccaggtctgga [0724] 121 gcgaattcca gcctgcaggg ctgataagcg aggcattagt gagattgagagagactttac [0725] 181 cccgccgtgg tggttggagg gcgcgcagta gagcagcagc acaggcgcgggtcccgggag [0726] 241 gccggctctg ctcgcgccga gatgtggaat ctccttcacg aaaccgactcggctgtggcc [0727] 301 accgcgcgcc gcccgcgctg gctgtgcgct ggggcgctgg tgctggcgggtggcttcttt [0728] 361 ctcctcggct tcctcttcgg gtggtttata aaatcctcca atgaagctactaacattact [0729] 421 ccaaagcata atatgaaagc atttttggat gaattgaaag ctgagaacatcaagaagttc [0730] 481 ttatataatt ttacacagat accacattta gcaggaacag aacaaaactttcagcttgca [0731] 541 aagcaaattc aatcccagtg gaaagaattt ggcctggatt ctgttgagctagcacattat [0732] 601 gatgtcctgt tgtcctaccc aaataagact catcccaact acatctcaataattaatgaa [0733] 661 gatggaaatg agattttcaa cacatcatta tttgaaccac ctcctccaggatatgaaaat [0734] 721 gtttcggata ttgtaccacc tttcagtgct ttctctcctc aaggaatgccagagggcgat [0735] 781 ctagtgtatg ttaactatgc acgaactgaa gacttcttta aattggaacgggacatgaaa [0736] 841 atcaattgct ctgggaaaat tgtaattgcc agatatggga aagttttcagaggaaataag [0737] 901 gttaaaaatg cccagctggc aggggccaaa ggagtcattc tctactccgaccctgctgac [0738] 961 tactttgctc ctggggtgaa gtcctatcca gatggttgga atcttcctggaggtggtgtc [0739] 1021cagcgtggaa atatcctaaa tctgaatggt gcaggagacc ctctcacaccaggttaccca [0740] 1081gcaaatgaat atgcttatag gcgtggaatt gcagaggctg ttggtcttccaagtattcct [0741] 1141gttcatccaa ttggatacta tgatgcacag aagctcctag aaaaaatgggtggctcagca [0742] 1201ccaccagata gcagctggag aggaagtctc aaagtgccct acaatgttggacctggcttt [0743] 1261actggaaact tttctacacaa aaagtcaag atgcacatcc actctaccaatgaagtgaca [0744] 1321agaatttaca atgtgatagg tactctcaga ggagcagtgg aaccagacagatatgtcatt [0745] 1381ctgggaggtc accgggactc atgggtgttt ggtggtattg accctcagagtggagcagct [0746] 1441gttgttcatg aaattgtgag gagctttgga acactgaaaa aggaagggtggagacctaga [0747] 1501agaacaattt tgtttgcaag ctgggatgca gaagaatttg gtcttcttggttctactgag [0748] 1561tgggcagagg agaattcaag actccttcaa gagcgtggcg tggcttatattaatgctgac [0749] 1621tcatctatag aaggaaacta cactctgaga gttgattgta caccgctgatgtacagcttg [0750] 1681gtacacaacc taacaaaaga gctgaaaagc cctgatgaag gctttgaaggcaaatctctt [0751] 1741tatgaaagtt ggactaaaaa aagtccttcc ccagagttca gtggcatgcccaggataagc [0752] 1801aaattgggat ctggaaatga ttttgaggtg ttcttccaac gacttggaattgcttcaggc [0753] 1861agagcacggt atactaaaaa ttgggaaaca aacaaattca gcggctatccactgtatcac [0754] 1921agtgtctatg aaacatatga gttggtggaa aagttttatg atccaatgtttaaatatcac [0755] 1981ctcactgtgg cccaggttcg aggagggatg gtgtttgagc tagccaattccatagtgctc [0756] 2041ccttttgatt gtcgagatta tgctgtagtt ttaagaaagt atgctgacaaaatctacagt [0757] 2101atttctatga aacatccaca ggaaatgaag acatacagtg tatcatttgattcacttttt [0758] 2161tctgcagtaa agaattttac agaaattgct tccaagttca gtgagagactccaggacttt [0759] 2221gacaaaagca acccaatagt attaagaatg atgaatgatc aactcatgtttctggaaaga [0760] 2281gcatttattg atccattagg gttaccagac aggccttttt ataggcatgtcatctatgct [0761] 2341ccaagcagcc acaacaagta tgcaggggag tcattcccag gaatttatgatgctctgttt [0762] 2401gatattgaaa gcaaagtgga cccttccaag gcctggggag aagtgaagagacagatttat [0763] 2461gttgcagcct tcacagtgca ggcagctgca gagactttga gtgaagtagcctaagaggat [0764] 2521tctttagaga atccgtattg aatttgtgtg gtatgtcact cagaaagaatcgtaatgggt [0765] 2581atattgataa attttaaaat tggtatattt gaaataaagt tgaatattatatataaaaaa [0766] 2641aaaaaaaaaa aaa
[0767] 人黑素细胞特异性(pmel 17)基因，外显子2-5，和全cds。
[0768] ACCESSION U20093
[0769] VERSION U20093.1GI：1142634
[0770] SEQ ID NO 70
[0771] /翻译＝″MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGATKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAPVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQEAGLGQVPLIVGILLVLMAVVLASLIYRRRLMKQDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV″
[0772] SEQ ID NO 80
[0773] ORIGIN
[0774] 1 gtgctaaaaa gatgccttct tcatttggct gtgataggtg ctttgtggctgtgggggcta [0775] 61 caaaagtacc cagaaaccag gactggcttg gtgtctcaag gcaactcagaaccaaagcct [0776] 121 ggaacaggca gctgtatcca gagtggacag aagcccagag acttgactgctggagaggtg [0777] 181 gtcaagtgtc cctcaaggtc agtaatgatg ggcctacact gattggtgcaaatgcctcct [0778] 241 tctctattgc cttgaacttc cctggaagcc aaaaggtatt gccagatgggcaggttatct [0779] 301 gggtcaacaa taccatcatc aatgggagcc aggtgtgggg aggacagccagtgtatcccc [0780] 361 aggaaactga cgatgcctgc atcttccctg atggtggacc ttgcccatctggctcttggt [0781] 421 ctcagaagag aagctttgtt tatgtctgga agacctgggg tgagggactcccttctcagc [0782] 481 ctatcatcca cacttgtgtt tacttctttc tacctgatca cctttcttttggccgcccct [0783] 541 tccaccttaa cttctgtgat tttctctaat cttcattttc ctcttagatcttttctcttt [0784] 601 cttagcacct agcccccttc aagctctatc ataattcttt ctggcaactcttggcctcaa [0785] 661 ttgtagtcct accccatgga atgcctcatt aggacccctt ccctgtccccccatatcaca [0786] 721 gccttccaaa caccctcaga agtaatcata cttcctgacc tcccatctccagtgccgttt [0787] 781 cgaagcctgt ccctcagtcc cctttgacca gtaatctctt cttccttgcttttcattcca [0788] 841 aaaatgcttc aggccaatac tggcaagttc tagggggccc agtgtctgggctgagcattg [0789] 901 ggacaggcag ggcaatgctg ggcacacaca ccatggaagt gactgtctaccatcgccggg [0790] 961 gatcccggag ctatgtgcct cttgctcatt ccagctcagc cttcaccattactggtaagg [0791] 1021gttcaggaag ggcaaggcca gttgtagggc aaagagaagg cagggaggcttggatggact [0792] 1081gcaaaggaga aaggtgaaat gctgtgcaaa cttaaagtag aagggccaggaagacctagg [0793] 1141cagagaaatg tgaggcttag tgccagtgaa gggccagcca gtcagcttggagttggaggg [0794] 1201tgtggctgtg aaaggagaag ctgtggctca ggcctggttc tcaccttttctggctccaat [0795] 1261cccagaccag gtgcctttct ccgtgagcgt gtcccagttg cgggccttggatggagggaa [0796] 1321caagcacttc ctgagaaatc agcctctgac ctttgccctc cagctccatgaccccagtgg [0797] 1381ctatctggct gaagctgacc tctcctacac ctgggacttt ggagacagtagtggaaccct [0798] 1441gatctctcgg gcacctgtgg tcactcatac ttacctggag cctggcccagtcactgccca [0799] 1501ggtggtcctg caggctgcca ttcctctcac ctcctgtggc tcctccccagttccaggcac [0800] 1561cacagatggg cacaggccaa ctgcagaggc ccctaacacc acagctggccaagtgcctac [0801] 1621tacagaagtt gtgggtacta cacctggtca ggcgccaact gcagagccctctggaaccac [0802] 1681atctgtgcag gtgccaacca ctgaagtcat aagcactgca cctgtgcagatgccaactgc [0803] 1741agagagcaca ggtatgacac ctgagaaggt gccagtttca gaggtcatgggtaccacact [0804] 1801ggcagagatg tcaactccag aggctacagg tatgacacct gcagaggtatcaattgtggt [0805] 1861gctttctgga accacagctg cacaggtaac aactacagag tgggtggagaccacagctag [0806] 1921agagctacct atccctgagc ctgaaggtcc agatgccagc tcaatcatgtctacggaaag [0807] 1981tattacaggt tccctgggcc ccctgctgga tggtacagcc accttaaggctggtgaagag [0808] 2041acaagtcccc ctggattgtg ttctgtatcg atatggttcc ttttccgtcaccctggacat [0809] 2101tgtccagggt attgaaagtg ccgagatcct gcaggctgtg ccgtccggtgagggggatgc [0810] 2161atttgagctg actgtgtcct gccaaggcgg gctgcccaag gaagcctgcatggagatctc [0811] 2221atcgccaggg tgccagcccc ctgcccagcg gctgtgccag cctgtgctacccagcccagc [0812] 2281ctgccagctg gttctgcacc agatactgaa gggtggctcg gggacatactgcctcaatgt [0813] 2341gtctctggct gataccaaca gcctggcagt ggtcagcacc cagcttatcatgcctggtag [0814] 2401gtccttggac agagactaag tgaggaggga agtggataga ggggacagctggcaagcagc [0815] 2461agacatgagt gaagcagtgc ctgggattct tctcacaggt caagaagcaggccttgggca [0816] 2521ggttccgctg atcgtgggca tcttgctggt gttgatggct gtggtccttgcatctctgat [0817] 2581atataggcgc agacttatga agcaagactt ctccgtaccc cagttgccacatagcagcag [0818] 2641tcactggctg cgtctacccc gcatcttctg ctcttgtccc attggtgagaatagccccct [0819] 2701cctcagtggg cagcaggtct gagtactctc atatgatgct gtgattttcctggagttgac [0820] 2761agaaacacct atatttcccc cagtcttccc tgggagacta ctattaactgaaataaa [0821] //
[0822] 人激肽释放酶3，(前列腺特异性抗原)(KLK3)，mRNA。
[0823] ACCESSION NM_001648
[0824] VERSION NM_001648.1 GI：4502172
[0825] SEQ ID NO 78
[0826] /翻译＝″MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP″
[0827] SEQ ID NO 86
[0828] 起始 1 agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtgtc accatgtgggtcccggttgt [0829] 61 cttcctcacc ctgtccgtga cgtggattgg tgctgcaccc ctcatcctgtctcggattgt [0830] 121 gggaggctgg gagtgcgaga agcattccca accctggcag gtgcttgtggcctctcgtgg [0831] 181 cagggcagtc tgcggcggtg ttctggtgca cccccagtgg gtcctcacagctgcccactg [0832] 241 catcaggaac aaaagcgtga tcttgctggg tcggcacagc ctgtttcatcctgaagacac [0833] 301 aggccaggta tttcaggtca gccacagctt cccacacccg ctctacgatatgagcctcct [0834] 361 gaagaatcga ttcctcaggc caggtgatga ctccagccac gacctcatgctgctccgcct [0835] 421 gtcagagcct gccgagctca cggatgctgt gaaggtcatg gacctgcccacccaggagcc [0836] 481 agcactgggg accacctgct acgcctcagg ctggggcagc attgaaccag
[0837] aggagttctt
[0838] 541 gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacgtgtgtgcgca [0839] 601 agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctggacagggggcaa [0840] 661 aagcacctgc tcgggtgatt ctgggggccc acttgtctgt aatggtgtgcttcaaggtat [0841] 721 cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg ccttccctgtacaccaaggt [0842] 781 ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc aacccctgagcacccctatc [0843] 841 aaccccctat tgtagtaaac ttggaacctt ggaaatgacc aggccaagactcaagcctcc [0844] 901 ccagttctac tgacctttgt ccttaggtgt gaggtccagg gttgctaggaaaagaaatca [0845] 961 gcagacacag gtgtagacca gagtgtttct taaatggtgt aattttgtcctctctgtgtc [0846] 1021ctggggaata ctggccatgc ctggagacat atcactcaat ttctctgaggacacagatag [0847] 1081gatggggtgt ctgtgttatt tgtggggtac agagatgaaa gaggggtgggatccacactg [0848] 1141agagagtgga gagtgacatg tgctggacac tgtccatgaa gcactgagcagaagctggag [0849] 1201gcacaacgca ccagacactc acagcaagga tggagctgaa aacataacccactctgtcct [0850] 1261ggaggcactg ggaagcctag agaaggctgt gagccaagga gggagggtcttcctttggca [0851] 1321tgggatgggg atgaagtaag gagagggact ggaccccctg gaagctgattcactatgggg [0852] 1381ggaggtgtat tgaagtcctc cagacaaccc tcagatttga tgatttcctagtagaactca [0853] 1441cagaaataaa gagctgttat actgtg
[0854] //
[0855] 人自身免疫原性癌/睾丸抗原NY-ESO-1mRNA，全cds
[0856] ACCESSION U87459
[0857] VERSION U87459.1 GI：1890098
[0858] SEQ ID NO 74
[0859] /翻译＝″MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR″
[0860] SEQ ID NO 84
[0861] 起始
[0862] 1 atcctcgtgg gccctgacct tctctctgag agccgggcag aggctccggagccatgcagg [0863] 61 ccgaaggccg gggcacaggg ggttcgacgg gcgatgctga tggcccaggaggccctggca [0864] 121ttcctgatgg cccagggggc aatgctggcg gcccaggaga ggcgggtgccacgggcggca [0865] 181gaggtccccg gggcgcaggg gcagcaaggg cctcggggcc gggaggaggcgccccgcggg [0866] 241gtccgcatgg cggcgcggct tcagggctga atggatgctg cagatgcggggccagggggc [0867] 301cggagagccg cctgcttgag ttctacctcg ccatgccttt cgcgacacccatggaagcag [0868] 361agctggcccg caggagcctg gcccaggatg ccccaccgct tcccgtgccaggggtgcttc [0869] 421tgaaggagtt cactgtgtcc ggcaacatac tgactatccg actgactgctgcagaccacc [0870] 481gccaactgca gctctccatc agctcctgtc tccagcagct ttccctgttgatgtggatca [0871] 541cgcagtgctt tctgcccgtg tttttggctc agcctccctc agggcagaggcgctaagccc [0872] 601agcctggcgc cccttcctag gtcatgcctc ctcccctagg gaatggtcccagcacgagtg [0873] 661gccagttcat tgtgggggcc tgattgtttg tcgctggagg aggacggcttacatgtttgt [0874] 721ttctgtagaa aataaaactg agctacgaaa aa
[0875] //
[0876] LAGE-1a蛋白(人)
[0877] ACCESSION CAA11116
[0878] PID g3255959
[0879] VERSION CAA11116.1 GI：3255959
[0880] SEQ ID NO 75
[0881] 起始1 mqaegrgtgg stgdadgpgg pgipdgpggn aggpgeagat ggrgprgagaarasgprgga [0882] 61 prgphggaas aqdgrcpcga rrpdsrllel hitmpfsspm eaelvrrilsrdaaplprpg [0883] 121 avlkdftvsg nllfirltaa dhrqlqlsis sclqqlsllm witqcflpvflaqapsgqrr [0884] 181
[0885] //
[0886] LAGE-1b蛋白(人)
[0887] ACCESSION CAA11117
[0888] PID g3255960
[0889] VERSION CAA11117.1 GI：3255960
[0890] SEQ ID NO 76
[0891] 起始
[0892] 1 mqaegrgtgg stgdadgpgg pgipdgpggn aggpgeagat ggrgprgagaarasgprgga [0893] 61 prgphggaas aqdgrcpcga rrpdsrllel hitmpfsspm eaelvrrilsrdaaplprpg [0894] 121avlkdftvsg nllfmsvwdq dregagrmrv vgwglgsasp egqkardlrtpkhkvseqrp [0895] 181gtpgppppeg aqgdgcrgva fnvmfsaphi
[0896] //
[0897] 人抗原(MAGE-1)基因，全cds，
[0898] ACCESSION M77481
[0899] VERSION M77481.1 GI：416114
[0900] SEQ ID NO 71
[0901] /翻译＝″MSLEQRSLHCKPEEALEAQQEALGLVCVQAATSSSSPLVLGTLEEVPTAGSTDPPQSPQGASAFPTTINFTRQRQPSEGSSSREEEGPSTSCILESLFRAVITKKVADLVGFLLLKYRAREPVTKAEMLESVIKNYKHCFPEIFGKASESLQLVFGIDVKEADPTGHSYVLVTCLGLSYDGLLGDNQIMPKTGFLIIVLVMIAMEGGHAPEEEIWEELSVMEVYDGREHSAYGEPRKLLTQDLVQEKYLEYRQVPDSDPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEYVIKVSARVRFFFPSLREAALREEEEGV″
[0902] SEQ ID NO 81
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[1110] /翻译＝″MKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPALGLLLWGPGQL″
[1111] SEQ ID NO 87
[1112] 起始 1 agggagaggc agtgaccatg aaggctgtgc tgcttgccct gttgatggcaggcttggccc [1113] 61 tgcagccagg cactgccctg ctgtgctact cctgcaaagc ccaggtgagcaacgaggact [1114] 121 gcctgcaggt ggagaactgc acccagctgg gggagcagtg ctggaccgcgcgcatccgcg [1115] 181 cagttggcct cctgaccgtc atcagcaaag gctgcagctt gaactgcgtggatgactcac [1116] 241 aggactacta cgtgggcaag aagaacatca cgtgctgtga caccgacttgtgcaacgcca [1117] 301 gcggggccca tgccctgcag ccggctgccg ccatccttgc gctgctccctgcactcggcc [1118] 361 tgctgctctg gggacccggc cagctatagg ctctgggggg ccccgctgcagcccacactg [1119] 421 ggtgtggtgc cccaggcctt tgtgccactc ctcacagaac ctggcccagtgggagcctgt [1120] 481 cctggttcct gaggcacatc ctaacgcaag tttgaccatg tatgtttgcaccccttttcc [1121] 541 ccnaaccctg accttcccat gggccttttc caggattccn accnggcagatcagttttag [1122] 601tganacanat ccgcntgcag atggcccctc caaccntttn tgttgntgtttccatggccc [1123] 661agcattttcc acccttaacc ctgtgttcag gcacttnttc ccccaggaagccttccctgc [1124] 721ccaccccatt tatgaattga gccaggtttg gtccgtggtg tcccccgcacccagcagggg [1125] 781acaggcaatc aggagggccc agtaaaggct gagatgaagt ggactgagtagaactggagg [1126] 841acaagagttg acgtgagttc ctgggagttt ccagagatgg ggcctggaggcctggaggaa [1127] 901ggggccaggc ctcacatttg tggggntccc gaatggcagc ctgagcacagcgtaggccct [1128] 961taataaacac ctgttggata agccaaaaaa
[1129] //
[1130] 腺激肽释放酶1前体(组织激肽释放酶)(肾/胰腺/唾液腺激肽释放酶)
[1131] ACCESSION P06870
[1132] PID g125170
[1133] VERSION P06870 GI：125170
[1134] SEQ ID NO 600
[1135] 起始
[1136] 1 mwflvlclal slggtgaapp iqsrivggwe ceqhsqpwqa alyhfstfqcggilvhrqwv [1137] 61 ltaahcisdn yqlwlgrhnl fddentaqfv hvsesfphpg fnmsllenhtrqadedyshd [1138] 121lmllrltepa dtitdavkvv elptqepevg stclasgwgs iepenfsfpddlqcvdlkil [1139] 181pndecekahv qkvtdfmlcv ghleggkdtc vgdsggplmc dgvlqgvtswgyvpcgtpnk [1140] 241psvavrvlsy vkwiedtiae ns
[1141] //
[1142] 弹性蛋白酶2A前体
[1143] ACCESSION P08217
[1144] PID g119255
[1145] VERSION P08217 GI：119255
[1146] SEQ ID NO 601
[1147] 起始 1 mirtlllstl vagalscgdp typpyvtrvv ggeearpnsw pwqvslqyssngkwyhtcgg [1148] 61 slianswvlt aahcisssrt yrvglgrhnl yvaesgslav svskivvhkdwnsnqiskgn [1149] 121 diallklanp vsltdkiqla clppagtilp nnypcyvtgw grlqtngavpdvlqqgrllv [1150] 181 vdyatcsssa wwgssvktsm icaggdgvis scngdsggpl ncqasdgrwqvhgivsfgsr [1151] 241 lgcnyyhkps vftrvsnyid winsviann
[1152] //
[1153] 胰弹性蛋白酶IIB[人]
[1154] ACCESSION NP_056933
[1155] PID g7705648
[1156] VERSION NP_056933.1GI：7705648
[1157] SEQ ID NO 602
[1158] 起始1 mirtlllstl vagalscgvs tyapdmsrml ggeearpnsw pwqvslqyssngqwyhtcgg [1159] 61 slianswvlt aahcisssri yrvmlgqhnl yvaesgslav svskivvhkdwnsnqvskgn [1160] 121diallklanp vsltdkiqla clppagtilp nnypcyvtgw grlqtngalpddlkqgrllv [1161] 181vdyatcsssg wwgstvktnm icaggdgvic tcngdsggpl ncqasdgrwevhgigsltsv [1162] 241lgcnyyykps iftrvsnynd winsviann
[1163] //
[1164] PRAME人黑素瘤中优选表达的抗原
[1165] ACCESSION NM_006115
[1166] VERSION NM_006115.1 GI：5174640
[1167] SEQ ID NO 77
[1168] /翻译＝″MERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVELAGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKAVLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDLRKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAEQPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLEVTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFLRGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLERASATLQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSISISALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPN″
[1169] SEQ ID NO 85
[1170] 起始1 gcttcagggt acagctcccc cgcagccaga agccgggcct gcagcccctcagcaccgctc [1171] 61 cgggacaccc cacccgcttc ccaggcgtga cctgtcaaca gcaacttcgcggtgtggtga [1172] 121actctctgag gaaaaaccat tttgattatt actctcagac gtgcgtggcaacaagtgact [1173] 181gagacctaga aatccaagcg ttggaggtcc tgaggccagc ctaagtcgcttcaaaatgga [1174] 241acgaaggcgt ttgtggggtt ccattcagag ccgatacatc agcatgagtgtgtggacaag [1175] 301cccacggaga cttgtggagc tggcagggca gagcctgctg aaggatgaggccctggccat [1176] 361tgccgccctg gagttgctgc ccagggagct cttcccgcca ctcttcatggcagcctttga [1177] 421 cgggagacac agccagaccc tgaaggcaat ggtgcaggcc tggcccttcacctgcctccc [1178] 481 tctgggagtg ctgatgaagg gacaacatct tcacctggag accttcaaagctgtgcttga [1179] 541 tggacttgat gtgctccttg cccaggaggt tcgccccagg aggtggaaacttcaagtgct [1180] 601 ggatttacgg aagaactctc atcaggactt ctggactgta tggtctggaaacagggccag [1181] 661 tctgtactca tttccagagc cagaagcagc tcagcccatg acaaagaagcgaaaagtaga [1182] 721 tggtttgagc acagaggcag agcagccctt cattccagta gaggtgctcgtagacctgtt [1183] 781 cctcaaggaa ggtgcctgtg atgaattgtt ctcctacctc attgagaaagtgaagcgaaa [1184] 841 gaaaaatgta ctacgcctgt gctgtaagaa gctgaagatt tttgcaatgcccatgcagga [1185] 901 tatcaagatg atcctgaaaa tggtgcagct ggactctatt gaagatttggaagtgacttg [1186] 961 tacctggaag ctacccacct tggcgaaatt ttctccttac ctgggccagatgattaatct [1187] 1021gcgtagactc ctcctctccc acatccatgc atcttcctac atttccccggagaaggaaga [1188] 1081gcagtatatc gcccagttca cctctcagtt cctcagtctg cagtgcctgcaggctctcta [1189] 1141tgtggactct ttatttttcc ttagaggccg cctggatcag ttgctcaggcacgtgatgaa [1190] 1201ccccttggaa accctctcaa taactaactg ccggctttcg gaaggggatgtgatgcatct [1191] 1261gtcccagagt cccagcgtca gtcagctaag tgtcctgagt ctaagtggggtcatgctgac [1192] 1321cgatgtaagt cccgagcccc tccaagctct gctggagaga gcctctgccaccctccagga [1193] 1381cctggtcttt gatgagtgtg ggatcacgga tgatcagctc cttgccctcctgccttccct [1194] 1441gagccactgc tcccagctta caaccttaag cttctacggg aattccatctccatatctgc [1195] 1501cttgcagagt ctcctgcagc acctcatcgg gctgagcaat ctgacccacgtgctgtatcc [1196] 1561tgtccccctg gagagttatg aggacatcca tggtaccctc cacctggagaggcttgccta
[1197] 1621tctgcatgcc aggctcaggg agttgctgtg tgagttgggg cggcccagcatggtctggct [1198] 1681tagtgccaac ccctgtcctc actgtgggga cagaaccttc tatgacccggagcccatcct [1199] 1741gtgcccctgt ttcatgccta actagctggg tgcacatatc aaatgcttcattctgcatac [1200] 1801ttggacacta aagccaggat gtgcatgcat cttgaagcaa caaagcagccacagtttcag [1201] 1861acaaatgttc agtgtgagtg aggaaaacat gttcagtgag gaaaaaacattcagacaaat [1202] 1921gttcagtgag gaaaaaaagg ggaagttggg gataggcagatgttgacttgaggagttaat [1203] 1981gtgatctttg gggagataca tcttatagag ttagaaatag aatctgaatttctaaaggga [1204] 2041gattctggct tgggaagtac atgtaggagt taatccctgt gtagactgttgtaaagaaac [1205] 2101tgttgaaaat aaagagaagc aatgtgaagc aaaaaaaaaa aaaaaaaa
[1206] 纤连蛋白的ED-B结构域
[1207] 1纤连蛋白基因ED-B结构域
[1208] ACCESSION X07717
[1209] VERSION X07717.1 GI：31406
[1210] SEQID NO 590
[1211] /翻译＝″CTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPEVPQLTDLSFVDITDSSIGLRWTPLNSSTIIGYRITVVAAGEGIPIFEDFVDSSVGYYTVTGLEPGIDYDISVITLINGGESAPTTLTQQTAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTW″SEQ ID NO 591
[1212] 起始
[1213] 1 ctgcactttt gataacctga gtcccggcct ggagtacaat gtcagtgtttacactgtcaa [1214] 61 ggatgacaag gaaagtgtcc ctatctctga taccatcatc ccaggtaatagaaaataagc [1215] 121tgctatcctg agagtgacat tccaataaga gtggggatta gcatcttaatccccagatgc [1216] 181ttaagggtgt caactatatt tgggatttaa ttccgatctc ccagctgcactttccaaaac [1217] 241caagaagtca aagcagcgat ttggacaaaa tgcttgctgt taacactgctttactgtctg [1218] 301tgcttcactg ggatgctgtg tgttgcagcg agtatgtaat ggagtggcagccatggcttt [1219] 361aactctgtat tgtctgctca catggaagta tgactaaaac actgtcacgtgtctgtactc [1220] 421agtactgata ggctcaaagt aatatggtaa atgcatccca tcagtacatttctgcccgat [1221] 481 tttacaatcc atatcaattt ccaacagctg cctatttcat cttgcagtttcaaatccttc [1222] 541 tttttgaaaa ttggatttta aaaaaaagtt aagtaaaagt cacaccttcagggttgttct [1223] 601 ttcttgtggc cttgaaagac aacattgcaa aggcctgtcc taaggataggcttgtttgtc [1224] 661 cattgggtta taacataatg aaagcattgg acagatcgtg tccccctttggactcttcag [1225] 721 tagaatgctt ttactaacgc taattacatg ttttgattat gaatgaacctaaaatagtgg [1226] 781 caatggcctt aacctaggcc tgtctttcct cagcctgaat gtgcttttgaatggcacatt [1227] 841 tcacaccata cattcataat gcattagcgt tatggccatg atgttgtcatgagttttgta [1228] 901 tgggagaaaa aaaatcaatt tatcacccat ttattatttt ttccggttgttcatgcaagc [1229] 961 ttattttcta ctaaaacagt tttggaatta ttaaaagcat tgctgatacttacttcagat [1230] 1021attatgtcta ggctctaaga atggtttcga catcctaaac agccatatgatttttaggaa [1231] 1081tctgaacagt tcaaattgta ccctttaagg atgttttcaa aatgtaaaaaatatatatat [1232] 1141atatatatat tccctaaaag aatattcctg tttattcttc tagggaagcaaactgttcat [1233] 1201gatgcttagg aagtcttttc agagaattta aaacagattg catattaccatcattgcttt [1234] 1261aacattccac caattttact actagtaacc tgatatacac tgctttattttttcctcttt [1235] 1321ttttccctct attttccttt tgcctccccc tccctttgct ttgtaactcaatagaggtgc [1236] 1381cccaactcac tgacctaagc tttgttgata taaccgattc aagcatcggcctgaggtgga [1237] 1441ccccgctaaa ctcttccacc attattgggt accgcatcac agtagttgcggcaggagaag [1238] 1501gtatccctat ttttgaagat tttgtggact cctcagtagg atactacacagtcacagggc [1239] 1561tggagccggg cattgactat gatatcagcg ttatcactct cattaatggcggcgagagtg [1240] 1621cccctactac actgacacaa caaacgggtg aattttgaaa acttctgcgtttgagacata [1241] 1681gatggtgttg catgctgcca ccagttactc cggttaaata tggatgtttcatgggggaag [1242] 1741tcagcaattg gccaaagatt cagataggtg gaattggggg gataaggaatcaaatgcatc [1243] 1801tgctaaactg attggagaaa aacacatgca atatcttcag tacactctcatttaaaccac [1244] 1861aagtagatat aaagcctaga gaaatacaga tgtctgctct gttaaatataaaatagcaaa [1245] 1921tgttcattca atttgaagac ctagaatttt tcttcttaaa taccaaacacgaataccaaa [1246] 1981ttgcgtaagt accaattgat aagaatatat caccaaaatg taccatcatgctcttccttc [1247] 2041taccctttga taaactctac catgctcctt ctttgtagct aaaaacccatcaaaatttag [1248] 2101ggtagagtgg atgggcattg ttttgaggta ggagaaaagt aaacttgggaccattctagg [1249] 2161ttttgttgct gtcactaggt aaagaaacac ctctttaacc acagtctggggacaagcatg [1250] 2221caacatttta aaggttctct gctgtgcatg ggaaaagaaa catgctgagaaccaatttgc [1251] 2281atgaacatgt tcacttgtaa gtagaattca ctgaatggaa ctgtagctctagatatctca [1252] 2341catgggggga agtttaggac cctcttgtct ttttgtctgt gtgcatgtatttctttgtaa [1253] 2401agtactgcta tgtttctctt tgctgtgtgg caacttaagc ctcttcggcctgggataaaa [1254] 2461taatctgcag tggtattaat aatgtacata aagtcaacat atttgaaagtagattaaaat [1255] 2521cttttttaaa tatatcaatg atggcaaaaa ggttaaaggg ggcctaacagtactgtgtgt [1256] 2581agtgttttat ttttaacagt agtacactat aacttaaaat agacttagattagactgttt [1257] 2641gcatgattat gattctgttt cctttatgca tgaaatattg attttacctttccagctact [1258] 2701tcgttagctt taattttaaa atacattaac tgagtcttcc ttcttgttcgaaaccagctg [1259] 2761ttcctcctcc cactgacctg cgattcacca acattggtcc agacaccatgcgtgtcacct [1260] 2821ggg
[1261] //
[1262] CEA人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，mRNA。
[1263] ACCESSION NM_004363
[1264] VERSION NM_004363.1 GI：11386170
[1265] SEQ ID NO 592
[1266] /翻译＝″MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI″
[1267] SEQ ID NO 593
[1268] 起始
[1269] 1 ctcagggcag agggaggaag gacagcagac cagacagtca cagcagccttgacaaaacgt [1270] 61 tcctggaact caagctcttc tccacagagg aggacagagc agacagcagagaccatggag [1271] 121tctccctcgg cccctcccca cagatggtgc atcccctggc agaggctcctgctcacagcc [1272] 181tcacttctaa ccttctggaa cccgcccacc actgccaagc tcactattgaatccacgccg [1273] 241ttcaatgtcg cagaggggaa ggaggtgctt ctacttgtcc acaatctgccccagcatctt [1274] 301tttggctaca gctggtacaa aggtgaaaga gtggatggca accgtcaaattataggatat [1275] 361gtaataggaa ctcaacaagc taccccaggg cccgcataca gtggtcgagagataatatac [1276] 421cccaatgcat ccctgctgat ccagaacatc atccagaatg acacaggattctacacccta [1277] 481cacgtcataa agtcagatct tgtgaatgaa gaagcaactg gccagttccgggtatacccg [1278] 541gagctgccca agccctccat ctccagcaac aactccaaac ccgtggaggacaaggatgct [1279] 601gtggccttca cctgtgaacc tgagactcag gacgcaacct acctgtggtgggtaaacaat [1280] 661cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg gcaacaggaccctcactcta [1281] 721ttcaatgtca caagaaatga cacagcaagc tacaaatgtg aaacccagaacccagtgagt [1282] 781gccaggcgca gtgattcagt catcctgaat gtcctctatg gcccggatgcccccaccatt [1283] 841tcccctctaa acacatctta cagatcaggg gaaaatctga acctctcctgccacgcagcc [1284] 901tctaacccac ctgcacagta ctcttggttt gtcaatggga ctttccagcaatccacccaa [1285] 961gagctcttta tccccaacat cactgtgaat aatagtggat cctatacgtgccaagcccat [1286] 1021aactcagaca ctggcctcaa taggaccaca gtcacgacga tcacagtctatgcagagcca [1287] 1081cccaaaccct tcatcaccag caacaactcc aaccccgtgg aggatgaggatgctgtagcc [1288] 1141ttaacctgtg aacctgagat tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaataatcagagc [1289] 1201ctcccggtca gtcccaggct gcagctgtcc aatgacaaca ggaccctcactctactcagt [1290] 1261gtcacaagga atgatgtagg accctatgag tgtggaatcc agaacgaattaagtgttgac [1291] 1321cacagcgacc cagtcatcct gaatgtcctc tatggcccag acgaccccaccatttccccc [1292] 1381tcatacacct attaccgtcc aggggtgaac ctcagcctct cctgccatgcagcctctaac [1293] 1441ccacctgcac agtattcttg gctgattgat gggaacatcc agcaacacacacaagagctc [1294] 1501tttatctcca acatcactga gaagaacagc ggactctata cctgccaggccaataactca [1295] 1561gccagtggcc acagcaggac tacagtcaag acaatcacag tctctgcggagctgcccaag [1296] 1621ccctccatct ccagcaacaa ctccaaaccc gtggaggaca aggatgctgtggccttcacc [1297] 1681tgtgaacctg aggctcagaa cacaacctac ctgtggtggg taaatggtcagagcctccca [1298] 1741gtcagtccca ggctgcagct gtccaatggc aacaggaccc tcactctattcaatgtcaca [1299] 1801agaaatgacg caagagccta tgtatgtgga atccagaact cagtgagtgcaaaccgcagt [1300] 1861gacccagtca ccctggatgt cctctatggg ccggacaccc ccatcatttcccccccagac [1301] 1921tcgtcttacc tttcgggagc gaacctcaac ctctcctgcc actcggcctctaacccatcc [1302] 1981ccgcagtatt cttggcgtat caatgggata ccgcagcaac acacacaagttctctttatc [1303] 2041gccaaaatca cgccaaataa taacgggacc tatgcctgtt ttgtctctaacttggctact [1304] 2101ggccgcaata attccatagt caagagcatc acagtctctg catctggaacttctcctggt [1305] 2161ctctcagctg gggccactgt cggcatcatg attggagtgc tggttggggttgctctgata [1306] 2221tagcagccct ggtgtagttt cttcatttca ggaagactga cagttgttttgcttcttcct [1307] 2281taaagcattt gcaacagcta cagtctaaaa ttgcttcttt accaaggatatttacagaaa [1308] 2341agactctgac cagagatcga gaccatccta gccaacatcg tgaaaccccatctctactaa [1309] 2401aaatacaaaa atgagctggg cttggtggcg cgcacctgta gtcccagttactcgggaggc [1310] 2461tgaggcagga gaatcgcttg aacccgggag gtggagattg cagtgagcccagatcgcacc [1311] 2521actgcactcc agtctggcaa cagagcaaga ctccatctca aaaagaaaagaaaagaagac [1312] 2581tctgacctgt actcttgaat acaagtttct gataccactg cactgtctgagaatttccaa [1313] 2641aactttaatg aactaactga cagcttcatg aaactgtcca ccaagatcaagcagagaaaa [1314] 2701taattaattt catgggacta aatgaactaa tgaggattgc tgattctttaaatgtcttgt [1315] 2761ttcccagatt tcaggaaact ttttttcttt taagctatcc actcttacagcaatttgata [1316] 2821aaatatactt ttgtgaacaa aaattgagac atttacattt tctccctatgtggtcgctcc [1317] 2881agacttggga aactattcat gaatatttat attgtatggt aatatagttattgcacaagt [1318] 2941tcaataaaaa tctgctctttgtataacag aaaaa
[1319] //
[1320] Her2/Neu人酪氨酸激酶型受体(HER2)mRNA，全cds
[1321] ACCESSION M11730
[1322] VERSION M11730.1 GI：183986
[1323] SEQ ID NO 594
[1324] /翻译＝″MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKC SKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIVSAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERAKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV″
[1325] SEQ ID NO 595
[1326] 来源染色体17q21-q22。
[1327] 1 aattctcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcgagggcgcgcg [1328] 61 cccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgggtccagccgg [1329] 121 agccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atggagctgg cggccttgtgccgctggggg [1330] 181 ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc gcgagcaccc aagtgtgcaccggcacagac [1331] 241 atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccgccacctctac [1332] 301 cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccaccaatgccagc [1333] 361 ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg cagggctacg tgctcatcgctcacaaccaa [1334] 421 gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg attgtgcgag gcacccagctctttgaggac [1335] 481 aactatgccc tggccgtgct agacaatgga gacccgctga acaataccacccctgtcaca [1336] 541 ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg cagcttcgaa gcctcacagagatcttgaaa [1337] 601 ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag ctctgctacc aggacacgattttgtggaag [1338] 661 gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct ctcacactga tagacaccaaccgctctcgg [1339] 721 gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag ggctcccgct gctggggagagagttctgag [1340] 781 gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt gccggtggct gtgcccgctgcaaggggcca [1341] 841 ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt gctgccggct gcacgggccccaagcactct [1342] 901 gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac agtggcatct gtgagctgcactgcccagcc [1343] 961 ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag tccatgccca atcccgagggccggtataca [1344] 1021ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc tacaactacc tttctacggacgtgggatcc [1345] 1081tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa gaggtgacag cagaggatggaacacagcgg [1346] 1141tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga gtgtgctatg gtctgggcatggagcacttg [1347] 1201cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat atccaggagt ttgctggctgcaagaagatc [1348] 1261tttgggagcc tggcatttct gccggagagc tttgatgggg acccagcctccaacactgcc [1349] 1321ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt gagactctgg aagagatcacaggttaccta [1350] 1381tacatctcag catggccgga cagcctgcct gacctcagcg tcttccagaacctgcaagta [1351] 1441atccggggac gaattctgca caatggcgcc tactcgctga ccctgcaagggctgggcatc [1352] 1501agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa ctgggcagtg gactggccctcatccaccat [1353] 1561aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg ccctgggacc agctctttcggaacccgcac [1354] 1621caagctctgc tccacactgc caaccggcca gaggacgagt gtgtgggcgagggcctggcc [1355] 1681tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc tggggtccag ggcccacccagtgtgtcaac [1356] 1741tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc gtggaggaat gccgagtactgcaggggctc [1357] 1801cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt ttgccgtgcc accctgagtgtcagccccag [1358] 1861aatggctcag tgacctgttt tggaccggag gctgaccagt gtgtggcctgtgcccactat [1359] 1921aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc cccagcggtg tgaaacctgacctctcctac [1360] 1981atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag ggcgcatgcc agccttgccccatcaactgc [1361] 2041acccactcct gtgtggacct ggatgacaag ggctgccccg ccgagcagagagccagccct [1362] 2101ctgacgtcca tcgtctctgc ggtggttggc attctgctgg tcgtggtcttgggggtggtc [1363] 2161tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag aagatccgga agtacacgatgcggagactg [1364] 2221ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg acacctagcg gagcgatgcccaaccaggcg [1365] 2281cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg aggaaggtga aggtgcttggatctggcgct [1366] 2341tttggcacag tctacaaggg catctggatc cctgatgggg agaatgtgaaaattccagtg [1367] 2401gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc cccaaagcca acaaagaaatcttagacgaa [1368] 2461gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca tatgtctccc gccttctgggcatctgcctg [1369] 2521acatccacgg tgcagctggt gacacagctt atgccctatg gctgcctcttagaccatgtc [1370] 2581cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag gacctgctga actggtgtatgcagattgcc [1371] 2641aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg ctcgtacaca gggacttggccgctcggaac [1372] 2701gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa attacagact tcgggctggctcggctgctg [1373] 2761gacattgacg agacagagta ccatgcagat gggggcaagg tgcccatcaagtggatggcg [1374] 2821ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc caccagagtg atgtgtggagttatggtgtg [1375] 2881actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc aaaccttacg atgggatcccagcccgggag [1376] 2941atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg ctgccccagc cccccatctgcaccattgat [1377] 3001gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg attgactctg aatgtcggccaagattccgg [1378] 3061gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc agggaccccc agcgctttgtggtcatccag [1379] 3121aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg gacagcacct tctaccgctcactgctggag [1380] 3181gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct gaggagtatc tggtaccccagcagggcttc [1381] 3241ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg ggcatggtcc accacaggcaccgcagctca [1382] 3301tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca ctagggctgg agccctctgaagaggaggcc [1383] 3361cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg gctggctccg atgtatttgatggtgacctg [1384] 3421ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc ctccccacac atgaccccagccctctacag [1385] 3481cggtacagtg aggaccccac agtacccctg ccctctgaga ctgatggctacgttgccccc [1386] 3541ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg aaccagccag atgttcggccccagccccct [1387] 3601tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc cgacctgctg gtgccactctggaaagggcc [1388] 3661aagactctct ccccagggaa gaatggggtc gtcaaagacg tttttgcctttgggggtgcc [1389] 3721gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag ggaggagctg cccctcagccccaccctcct [1390] 3781cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc tattactggg accaggacccaccagagcgg [1391] 3841ggggctccac ccagcacctt caaagggaca cctacggcag agaacccagagtacctgggt [1392] 3901ctggacgtgc cagtgtgaac cagaaggcca agtccgcaga agccctgatgtgtcctcagg [1393] 3961gagcagggaa ggcctgactt ctgctggcat caagaggtgg gagggccctccgaccacttc [1394] 4021caggggaacc tgccatgcca ggaacctgtc ctaaggaacc ttccttcctgcttgagttcc [1395] 4081cagatggctg gaaggggtcc agcctcgttg gaagaggaac agcactggggagtctttgtg [1396] 4141gattctgagg ccctgcccaa tgagactcta gggtccagtg gatgccacagcccagcttgg [1397] 4201ccctttcctt ccagatcctg ggtactgaaa gccttaggga agctggcctgagaggggaag [1398] 4261 cggccctaag ggagtgtcta agaacaaaag cgacccattc agagactgtccctgaaacct [1399] 4321 agtactgccc cccatgagga aggaacagca atggtgtcag tatccaggctttgtacagag [1400] 4381 tgcttttctg tttagttttt actttttttg ttttgttttt ttaaagacga
[1401] aataaagacc
[1402] 4441 caggggagaa tgggtgttgt atggggaggc aagtgtgggg ggtccttctc
[1403] cacacccact
[1404] 4501 ttgtccattt gcaaatatat tttggaaaac
[1405] //
[1406] 人SCP1蛋白mRNA
[1407] ACCESSION X9S654
[1408] VERSION X95654.1GI：1212982
[1409] SEQ ID NO 596
[1410] /翻译＝″MEKQKPFALFVPPRSSSSQVSAVKPQTLGGDSTFFKSFNKCTEDDLEFPFAKTNLSKNGENIDSDPALQKVNFLPVLEQVGNSDCHYQEGLKDSDLENSEGLSRVFSKLYKEAEKIKKWKVSTEAELRQKESKLQENRKIIEAQRKAIQELQFGNEKVSLKLEEGIQENKDLIKENNATRHLCNLLKETCARSAEKTKKYEYEREETRQVYMDLNNNIEKMITAHGELRVQAENSRLEMHFKLKEDYEKIQHLEQEYKKEINDKEKQVSLLLIQITEKENKMKDLTFLLEESRDKVNQLEEKTKLQSENLKQSIEKQHHLTKELEDIKVSLQRSVSTQKALEEDLQIATKTICQLTEEKETQMEESNKARAAHSFVVTEFETTVCSLEELLRTEQQRLEKNEDQLKILTMELQKKSSELEEMTKLTNNKEVELEELKKVLGEKETLLYENKQFEKIAEELKGTEQELIGLLQAREKEVHDLEIQLTAITTSEQYYSKEVKDLKTELENEKLKNTELTSHCNKLSLENKELTQETSDMTLELKNQQEDINNNKKQEERMLKQIENLQETETQLRNELEYVREELKQKRDEVKCKLDKSEENCNNLRKQVENKNKYIEELQQENKALKKKGTAESKQLNVYEIKVNKLELELESAKQKFGEITDTYQKEIEDKKISEENLLEEVEKAKVIADEAVKLQKEIDKRCQHKIAEMVALMEKHKHQYDKIIEERDSELGLYKSKEQEQSSLRASLEIELSNLKAELLSVKKQLEIEREEKEKLKREAKENTATLKEKKDKKTQTFLLETPEIYWKLDSKAVPSQTVSRNFTSVDHGISKDKRDYLWTSAKNTLSTPLPKAYTVKTPTKPKLQQRENLNIPIEESKKKRKMAFEFDINSDSSETTDLLSMVSEEETLKTLYRNNNPPASHLCVKTPKKAPSSLTTPGPTLKFGAIRKMREDRWAVIAKMDRKKKLKEAEKLFV″ [1411] SEQ ID NO 597
[1412] 起始
[1413] 1 gccctcatag accgtttgtt gtagttcgcg tgggaacagc aacccacggtttcccgatag [1414] 61 ttcttcaaag atatttacaa ccgtaacaga gaaaatggaa aagcaaaagccctttgcatt [1415] 121gttcgtacca ccgagatcaa gcagcagtca ggtgtctgcg gtgaaacctcagaccctggg [1416] 181aggcgattcc actttcttca agagtttcaa caaatgtact gaagatgatttggagtttcc [1417] 241atttgcaaag actaatctct ccaaaaatgg ggaaaacatt gattcagatcctgctttaca [1418] 301aaaagttaat ttcttgcccg tgcttgagca ggttggtaat tctgactgtcactatcagga [1419] 361aggactaaaa gactctgatt tggagaattc agagggattg agcagagtgttttcaaaact [1420] 421gtataaggag gctgaaaaga taaaaaaatg gaaagtaagt acagaagctgaactgagaca [1421] 481gaaagaaagt aagttgcaag aaaacagaaa gataattgaa gcacagcgaaaagccattca [1422] 541ggaactgcaa tttggaaatg aaaaagtaag tttgaaatta gaagaaggaatacaagaaaa [1423] 601taaagattta ataaaagaga ataatgccac aaggcattta tgtaatctactcaaagaaac [1424] 661ctgtgctaga tctgcagaaa agacaaagaa atatgaatat gaacgggaagaaaccaggca [1425] 721agtttatatg gatctaaata ataacattga gaaaatgata acagctcatggggaacttcg [1426] 781tgtgcaagct gagaattcca gactggaaat gcattttaag ttaaaggaagattatgaaaa [1427] 841aatccaacac cttgaacaag aatacaagaa ggaaataaat gacaaggaaaagcaggtatc [1428] 901actactattg atccaaatca ctgagaaaga aaataaaatg aaagatttaacatttctgct [1429] 961 agaggaatcc agagataaag ttaatcaatt agaggaaaag acaaaattacagagtgaaaa [1430] 1021cttaaaacaa tcaattgaga aacagcatca tttgactaaa gaactagaagatattaaagt [1431] 1081gtcattacaa agaagtgtga gtactcaaaa ggctttagag gaagatttacagatagcaac [1432] 1141aaaaacaatt tgtcagctaa ctgaagaaaa agaaactcaa atggaagaatctaataaagc [1433] 1201tagagctgct cattcgtttg tggttactga atttgaaact actgtctgcagcttggaaga [1434] 1261attattgaga acagaacagc aaagattgga aaaaaatgaa gatcaattgaaaatacttac [1435] 1321catggagctt caaaagaaat caagtgagct ggaagagatg actaagcttacaaataacaa [1436] 1381agaagtagaa cttgaagaat tgaaaaaagt cttgggagaa aaggaaacacttttatatga [1437] 1441aaataaacaa tttgagaaga ttgctgaaga attaaaagga acagaacaagaactaattgg [1438] 1501tcttctccaa gccagagaga aagaagtaca tgatttggaa atacagttaactgccattac [1439] 1561cacaagtgaa cagtattatt caaaagaggt taaagatcta aaaactgagcttgaaaacga [1440] 1621gaagcttaag aatactgaat taacttcaca ctgcaacaag ctttcactagaaaacaaaga [1441] 1681gctcacacag gaaacaagtg atatgaccct agaactcaag aatcagcaagaagatattaa [1442] 1741taataacaaa aagcaagaag aaaggatgtt gaaacaaata gaaaatcttcaagaaacaga [1443] 1801aacccaatta agaaatgaac tagaatatgt gagagaagag ctaaaacagaaaagagatga [1444] 1861agttaaatgt aaattggaca agagtgaaga aaattgtaac aatttaaggaaacaagttga [1445] 1921aaataaaaac aagtatattg aagaacttca gcaggagaat aaggccttgaaaaaaaaagg [1446] 1981 tacagcagaa agcaagcaac tgaatgttta tgagataaag gtcaataaattagagttaga [1447] 2041 actagaaagt gccaaacaga aatttggaga aatcacagac acctatcagaaagaaattga [1448] 2101 ggacaaaaag atatcagaag aaaatctttt ggaagaggtt gagaaagcaaaagtaatagc [1449] 2161 tgatgaagca gtaaaattac agaaagaaat tgataagcga tgtcaacataaaatagctga [1450] 2221 aatggtagca cttatggaaa aacataagca ccaatatgat aagatcattgaagaaagaga [1451] 2281 ctcagaatta ggactttata agagcaaaga acaagaacag tcatcactgagagcatcttt [1452] 2341 ggagattgaa ctatccaatc tcaaagctga acttttgtct gttaagaagcaacttgaaat [1453] 2401 agaaagagaa gagaaggaaa aactcaaaag agaggcaaaa gaaaacacagctactcttaa [1454] 2461 agaaaaaaaa gacaagaaaa cacaaacatt tttattggaa acacctgaaatttattggaa [1455] 2521 attggattct aaagcagttc cttcacaaac tgtatctcga aatttcacatcagttgatca [1456] 2581 tggcatatcc aaagataaaa gagactatct gtggacatct gccaaaaatactttatctac [1457] 2641 accattgcca aaggcatata cagtgaagac accaacaaaa ccaaaactacagcaaagaga [1458] 2701 aaacttgaat atacccattg aagaaagtaa aaaaaagaga aaaatggcctttgaatttga [1459] 2761 tattaattca gatagttcag aaactactga tcttttgagc atggtttcagaagaagagac [1460] 2821 attgaaaaca ctgtatagga acaataatcc accagcttct catctttgtgtcaaaacacc [1461] 2881 aaaaaaggcc ccttcatctc taacaacccc tggacctaca ctgaagtttggagctataag [1462] 2941 aaaaatgcgg gaggaccgtt gggctgtaat tgctaaaatg gatagaaaaaaaaaactaaa [1463] 3001 agaagctgaa aagttatttg tttaatttca gagaatcagt gtagttaaggagcctaataa [1464] 3061 cgtgaaactt atagttaata ttttgttctt atttgccaga gccacattttatctggaagt [1465] 3121 tgagacttaa aaaatacttg catgaatgat ttgtgtttct ttatatttttagcctaaatg [1466] 3181 ttaactacat attgtctgga aacctgtcat tgtattcaga taattagatgattatatatt [1467] 3241 gttgttactt tttcttgtat tcatgaaaac tgtttttact aagttttcaaatttgtaaag [1468] 3301 ttagcctttg aatgctagga atgcattatt gagggtcatt ctttattctttactattaaa [1469] 3361 atattttgga tgcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa
[1470] //
[1471] 人滑膜肉瘤，X断裂点4(SSX4)，mRNA。
[1472] ACCESSION NM_005636
[1473] VERSION NM_005636.1 GI：5032122
[1474] SEQ ID NO 598
[1475] /翻译＝″MNGDDAFARRPRDDAQISEKLRKAFDDIAKYFSKKEWEKMKSSEKIVYVYMKLNYEVMTKLGFKVTLPPFMRSKRAADFHGNDFGNDRNHRNQVERPQMTFGSLQRIFPKIMPKKPAEEENGLKEVPEASGPQNDGKQLCPPGNPSTLEKINKTSGPKRGKHAWTHRLRERKQLVVYEEISDPEEDDE″
[1476] SEQ ID NO 599
[1477] 起始
[1478] 1 atgaacggag acgacgcctt tgcaaggaga cccagggatg atgctcaaatatcagagaag [1479] 61 ttacgaaagg ccttcgatga tattgccaaa tacttctcta agaaagagtgggaaaagatg [1480] 121aaatcctcgg agaaaatcgt ctatgtgtat atgaagctaa actatgaggtcatgactaaa [1481] 181 ctaggtttca aggtcaccct cccacctttc atgcgtagta aacgggctgcagacttccac [1482] 241 gggaatgatt ttggtaacga tcgaaaccac aggaatcagg ttgaacgtcctcagatgact [1483] 301 ttcggcagcc tccagagaat cttcccgaag atcatgccca agaagccagcagaggaagaa [1484] 361 aatggtttga aggaagtgcc agaggcatct ggcccacaaa atgatgggaaacagctgtgc [1485] 421 cccccgggaa atccaagtac cttggagaag attaacaaga catctggacccaaaaggggg [1486] 481 aaacatgcct ggacccacag actgcgtgag agaaagcagc tggtggtttatgaagagatc [1487] 541 agcgaccctg aggaagatga cgagtaactc ccctcg
[1488] 所有在说明书中提及的专利和出版物表现出本发明所属本领域的那些技术人员的水平。
[1489] 可以缺乏在这里未具体公开的任何要素或多种要素，限制或多种限制实行在这里例证性适当描述的本发明。已经使用的术语和表述是用作描述术语而不是限制术语，没有打算在使用该术语和表述中表示排除显示和描述的特征的同等物或其部分。应当认识到在要求保护的本发明的范围内各种修饰是可能的。因此，应当理解尽管已经通过优选实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，在这里公开的概念的修饰和改变可被本领域那些技术人员所利用，这类修饰和改变被认为是在由后附权利要求所限定的本发明的范围内。
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