一种肝脏高效表达调控序列及其应用
阅读：215发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种肝脏高效表达调控序列及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种肝脏高效表达 调控序列 及其应用，其目的是提供一种肝脏高效表达调控序列及其在肝脏中表达外源基因中的应用。该序列是含有肝脏特异性启动子AAT－1202－+45和增强子Aer及ApoE的表达调控序列。所述增强子Aer和ApoE在载体中位于启动子AAT－1202－+45的上游。本发明所提供的肝脏表达调控序列可调控外源基因地高效表达，弥补了低 水 平转录活性不强的缺点。本发明具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。，下面是一种肝脏高效表达调控序列及其应用专利的具体信息内容。
1、一种肝脏高效表达调控序列，是含有肝脏特异性启动子AAT-1202-+45和增强 子Aer及ApoE的表达调控序列。
2、根据权利要求1所述的肝脏高效表达调控序列，其特征在于：所述增强子Aer 和ApoE位于启动子AAT-1202-+45的上游。
3、根据权利要求2所述的肝脏高效表达调控序列，其特征在于：所述肝脏高效 表达调控序列具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。
4、根据权利要求2所述的肝脏高效表达调控序列，其特征在于：所述肝脏高效 表达调控序列具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。
5、含有权利要求1所述肝脏高效表达调控序列的肝脏表达载体。
6、根据权利要求5所述的肝脏表达载体，其特征在于：所述增强子Aer和ApoE在 载体中位于启动子AAT-1202-+45的上游。
7、根据权利要求5或6所述的肝脏表达载体，其特征在于：用于构建所述肝脏表 达载体的出发载体为PCI neo。
8、根据权利要求7所述的肝脏表达载体，其特征在于：所述肝脏表达载体为PCI neoAerApoEAATP。
9、权利要求1或2所述的肝脏高效表达调控序列在表达外源基因中的应用。
技术领域
本发明涉及一种高效表达调控序列及其应用，特别是涉及一种肝脏高效表达调控 序列及其在表达外源基因中的应用。
背景技术
一些遗传性疾病可使肝脏的蛋白合成功能发生障碍，目前临床上对这些疾病的治 疗方法非常有限，主要是通过反复注射缺失蛋白来进行治疗，但是这种治疗方式较为 昂贵，有感染疾病的危险，并且只能暂时减轻疾病的症状。肝脏移植可解决遗传性疾 病的血清蛋白质缺陷问题，但供体器官来源有限。随着分子生物学的发展出现了基因 疗法，可以显著改善很多遗传性疾病的治疗，由于肝脏所具有的蛋白翻译后的修饰功 能使其成为基因治疗遗传性血液病的重要靶器官，通过肝脏基因疗法将功能基因导入 基因缺陷的个体并使其在体内长期高效表达，但目前限制肝脏基因治疗的主要因素是 基因在肝脏内表达水平较低，例如通过逆转录病毒介导的因子E或人1抗胰蛋白酶 (hAAT)的表达水平只有正常水平的百分之一，造成低水平表达的原因之一是转录活性 不强，为加强基因在体内的高水平表达，构建肝脏高效表达调控序列成为必需。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝脏高效表达调控序列。
本发明所提供的肝脏高效表达调控序列，是含有肝脏特异性启动子AAT-1202-+45 和增强子Aer及ApoE的表达调控序列。
所述ApoE的Genebank号为：gi|975886|；所述Aer的Genebank号为：gi|24797079|； 所述AAT-1202-+45的Genebank号为：gi|1236244|。
所述增强子Aer和ApoE位于启动子AAT-1202-+45的上游，Aer及ApoE的前后顺序可 以改变。
所述肝脏高效表达调控序列具有序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2的DNA 序列。
含有上述肝脏高效表达调控序列的肝脏表达载体也属于本发明的保护范围。
用于构建所述肝脏表达载体的出发载体可为任何一种原核或真核表达载体，优选 为PCI neo。
其中，以PCI neo为出发载体构建的肝脏表达载体为PCI neoAerApoEAATP。
经实验验证，本发明所提供的肝脏高效表达调控序列，可调控外源基因地高效表 达，弥补了低水平转录活性不强的缺点。本发明具有较高的实际应用价值，在医学领 域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1A为注射后第1天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1B为注射后第4天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1C为注射后第11天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1D为注射后第27天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1E为注射后第54天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1F为注射后第87天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图2A为注射后第1天血清中SEAP浓度的检测结果
图2B为注射后第3天血清中SEAP浓度的检测结果
图2C为注射后第9天血清中SEAP浓度的检测结果
图2D为注射后第31天血清中SEAP浓度的检测结果
图2E为注射后第57天血清中SEAP浓度的检测结果
本发明所提供的肝脏高效表达调控序列，是含有肝脏特异性启动子AAT-1202-+45 和增强子Aer及ApoE的表达调控序列。
所述ApoE的Genebank号为：gi|975886|；所述Aer的Genebank号为：gi|24797079|； 所述AAT-1202-+45的Genebank号为：gi|1236244|。
所述增强子Aer和ApoE位于启动子AAT-1202-+45的上游，Aer及ApoE的前后顺序可 以改变。
所述肝脏高效表达调控序列具有序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2的DNA 序列。
含有上述肝脏高效表达调控序列的肝脏表达载体也属于本发明的保护范围。
用于构建所述肝脏表达载体的出发载体可为任何一种原核或真核表达载体，优选 为PCI neo。
其中，以PCI neo为出发载体构建的肝脏表达载体为PCI neoAerApoEAATP。
经实验验证，本发明所提供的肝脏高效表达调控序列，可调控外源基因地高效表 达，弥补了低水平转录活性不强的缺点。本发明具有较高的实际应用价值，在医学领 域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1A为注射后第1天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1B为注射后第4天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1C为注射后第11天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1D为注射后第27天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1E为注射后第54天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图1F为注射后第87天血清中hAAT浓度的ELISA法检测结果
图2A为注射后第1天血清中SEAP浓度的检测结果
图2B为注射后第3天血清中SEAP浓度的检测结果
图2C为注射后第9天血清中SEAP浓度的检测结果
图2D为注射后第31天血清中SEAP浓度的检测结果
图2E为注射后第57天血清中SEAP浓度的检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由博亚公司合成， 所用酶制剂均购自TaKaRa公司。
实施例1、肝脏高效表达调控序列的构建
本实施例构建了四种肝脏表达调控序列，分别为AerApoEAATP、ApoEAATP、AATP 和AlbEAATP，其中，AerApoEAATP含有肝脏特异性启动子AAT-1202-+45和增强子Aer 及ApoE，后三种为对照序列，用于实施例3和实施例4中AerApoEAATP表达效果的验 证实验。
根据AAT-1206-355(Genebank号：gi|1236244|)、AAT-348-+45(Genebank号： gi|177830|)、AAT-261-+45(Genebank号：gi|177830|)、Aer(Genebank号： gi|24797079|)、ApoE(Genebank号：gi|975886|)、AAT-1202-45(Genebank号： gi|1236244|)、Alb(Genebank号：gi|191868|)、ApoEAAT(Genebank号： gi|975886|+gi|177830|)和hAAT(Genebank号：gi|177828|)的cDNA序列设计PCR 扩增上述基因片段的引物，引物序列如下：
扩增AAT-1206-355的引物：
PA：(上游引物)5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’
PB：(下游引物)5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’
扩增AAT-348-+45的引物：
PC：(上游引物)5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增AAT-261-+45的引物：
PE：(上游引物)5’-CGGGGTACCCGCCACCCCCTCCACCTT-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增Aer的引物：
PF：(上游引物)5’-CCCAAGCTTACAGCCCCTAGAAAATAACCTGCGTT-3’
PG：(下游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’
扩增ApoE的引物：
PH：(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’
PI：(下游引物)5’-CCCAAGCTTCCCTCTCACACTACCTAAACCA-3’
扩增AAT-1202-45的引物：
PJ：(上游引物)5’-CGGCGTACCTGTGGGTCACTCGCCTGGTAGA-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增AlbE的引物：
PK：(上游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’
PL：(下游引物)5’-GGAAGATCTGTTCCTAGATTACATTACACAT-3’
扩增ApoEAAT的引物：
PM：(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增hAAT的引物：
PN：(上游引物)5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’
po：(下游引物)5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’
一、肝脏表达调控序列ApoEAATP的构建
以质粒载体pBC-hFIX-B[1](Eric C Olivares，Roger P.Hollis，Thomas W.Chalberg et al.Site-specific genomic integration produces therapeutic Factor IX levels in mice.nature，2002)为模板，在引物PM和PD的引导下，PCR扩 增ApoEAATP，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收该目的片段，并将其插 入到载体pGEM-T(Promega公司)后，转化大肠杆菌DH5α(博大泰克公司)，经蓝白斑 筛选和PCR鉴定后进行测序，将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为 T-ApoEAATP。将T-ApoEAATP用限制性内切酶IppoI和BglII双酶切后回收得到目的片 段ApoEAATP。
二、肝脏表达调控序列AATP的构建
以人肝脏的基因组DNA为模板，在引物PA和PB的引导下，PCR扩增AAT-1206-355， 在引物PC和PD的引导下，PCR扩增AAT-348-+45，将上述PCR产物进行1％琼脂糖 凝胶电泳检测后，回收目的片段AAT-1206-355和AAT-348-+45，将AAT-1206-355插 入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将 序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT-1206-355；将AAT-348-+45插入 到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将序 列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT-348-+45。将T-AAT-1206-355经Bgl II和ScaI双酶切后，回收大小为851bp的目的片段，将该片段命名为Bgl IIAAT1206-355ScaI；将T-AAT-348-+45经ScaI和IppoI进行双酶切后，回收大 小为303bp的目的片断，将大小为303bp的目的片段用T4 DNA连接酶与Bgl IIAAT1206-355ScaI进行连接，再以该连接产物为模板，在引物PA和PD的引导下， PCR扩增AAT-1206-+45，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收该目的片 段，并将其插入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后 进行测序，将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT-1206-+45。将质粒 载体T-AAT-1206-+45用限制性内切酶IppoI和BglII进行双酶切后，回收得到目 的片段AAT-1206-+45。
三、肝脏表达调控序列AerApoEAATP的构建
提取人肝脏的基因组DNA，并以此为模板，在引物PH和PI的引导下，PCR扩增 ApoE，在引物PF和PG的引导下，PCR扩增Aer，再以T-AAT-1206-+45为模板，在引 物PJ和PD的引导下，PCR扩增AAT-1202-+45，将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶 电泳检测，回收大小正确的目的片段，将ApoE、Aer、AAT-1202-+45插入到载体pGEM-T 后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将序列正确的阳性克 隆扩增后提质粒，将三种质粒载体命名为T-ApoE、T-Aer；T-AAT-1202-+45。将T-ApoE 经限制性内切酶ScaI和HindIII双酶切后回收ApoE片断，并将该片段与经同样酶 酶切处理的载体T-Aer连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定阳性克隆后提 取质粒，命名为T-AerApoE。将T-AAT-1202-+45经限制性内切酶KpnI和SacI双 酶切后回收AAT-1202-+45片断，并将该片段与经同样酶酶切处理的载体T-AerApoE 连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定阳性克隆后提质粒， 命名为T-AerApoEAAT，用限制性内切酶IppoI和BglII对T-AerApoEAAT进行酶切 后得到目的片断AerApoEAAT，对该DNA片段进行序列测定，测定结果表明AerApoEAAT 具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：1由1880个碱 基组成，自5’端第1-6位碱基为限制性内切酶BglII的识别位点，自5’端第7-326 位碱基为增强子ApoE，自5’端第327-332位碱基为限制性内切酶HindIII的识别 位点，自5’端第333-613位碱基为增强子Aer，自5’端第614-619位碱基为限制性 内切酶KpnI的识别位点，自5’端第620-1865位碱基为启动子AATP，自5’端第 1866-1880位碱基为限制性内切酶IppoI的识别位点。其中，增强子ApoE和Aer在 序列中的位置可调换，上述限制性内切酶识别位点也可根据实际需要进行更换。
四、肝脏表达调控序列AlbEAATP的构建
以质粒载体EalbPα1AT-luc(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)为 模板，在引物PE和PD的引导下，PCR扩增AAT261-+45；以质粒载体EIIPα1AT-luc(M. Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol. 7，No.3，March 2003)为模板，在引物PK和PL的引导下，PCR扩增AlbE。将AAT261- +45插入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序， 将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT45-261。将AlbE插入到载体pGEM-T 后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将序列正确的阳性克 隆扩增后提质粒，命名为T-AlbE。将T-AlbE经限制性内切酶SacI和KpnI双酶切后回 收目的片断AlbE，将AlbE与经同样酶酶切处理的载体T-AAT45-261连接，将连接产物 转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定得到阳性克隆后提取质粒，命名为 T-AlbEAAT。将T-AlbEAAT用限制性内切酶IppoI和BglII酶切后回收得到目的片段 AlbEAAT。
实施例2、以PCI neo为出发载体构建的肝脏表达载体
将实施例一中得到的肝脏表达调控序列AerApoEAAT：ApoEAATP、AAT-1206-+45、 和AlbEAAT分别与经限制性内切酶IppoI和BglII酶切后的载体PCI neo(购于 Promega公司)相连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经PCR鉴定得到阳性克隆后 提取质粒，得到肝脏表达载体，命名为PCI neo-AerApoEAAT，用上述同样方法得到含 有AerApoEAAT的肝脏表达载体PCI neo-ApoEAATP，含有AAT-1206-+45的肝脏表达 载体PCI neo-AATP和含有AlbEAAT的肝脏表达载体PCI neo-AlbEAAT。
实施例3、以hAAT为报告基因验证肝脏高效表达调控序列的表达水平
一、含有基因hAAT的载体PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT和PCI neoAlbEAATP-hAAT的构建
从人肝脏组织中提取RNA，以PN/PO为引物，反转录PCR扩增hAAT基因片段。将 hAAT基因片段插入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定 后进行测序，将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-hAAT。将T-hAAT经限 制性内切酶EcoRI和SalI双酶切后回收目的片断hAAT，再将hAAT分别与经相同酶 酶切处理的载体PCI neo、PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和 PCI neoAlbEAATP连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定得到阳性克隆后提 取质粒，分别命名为PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、 PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT。
二、hAAT表达水平的验证
1、大量提取质粒PCI neo、PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT (M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)。
2、将40只昆明鼠分成8组(每组5只)，用水动力转染法给每只昆明鼠尾静脉 注射25μg质粒，注射的溶液量(生理盐水)相当于昆明鼠体重的10％，注射时间控 制在五秒钟以内，1-7组依次注射质粒PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、 EalbPα1AT-hAAT、PCI neo，第8组为空白对照。
3、分别于注射后第1、4、11、27、54、87天尾静脉采血，用ELISA法检测血清 中hAAT的浓度，检测方法包括以下步骤：
1)取hAAT(购自SIGMA公司)2mg溶于2mL PBS中，再加入2mL弗氏完全佐剂， 乳化后用肌肉注射法免疫日本大耳白兔，四周后再取1mg hAAT溶于1mL PBS中，加 入1mL弗氏不完全佐剂乳化后对上述经初次免疫的大耳白兔肌肉注射加强免疫，两周 后再进行第2次加强免疫。第2次加强免疫后10天，耳缘静脉采血，采用EIASA法 测定血清中的抗体滴度，抗体滴度高于10-6后心脏穿刺取血，离心取上清。
2)将步骤1)采集的兔血清先用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，再经蛋白G柱 (Promega公司)纯化后得到高纯度的抗-hAAT抗体，采用过碘酸钠法将辣根酶(HRP) 对抗-hAAT抗体进行标记。
3)用羊抗hAAT(5μg/mL，购自SIGMA公司)包被96孔板，4℃包被16小时后， 用PBST洗板，拍干，每孔加入130μL含10％胎牛血清的PBST，37℃温育1小时后 拍干，每孔再加入100μL待检测样品及已知浓度的经梯度稀释的hAAT标准品，37℃ 温育40分钟，用PBST洗板，拍干，每孔加入100μL经400倍稀释的步骤2)中的 HRP标记的抗hAAT抗体，37℃温育40分钟，用PBST洗板，拍干，显色，在450nm波 长下测其吸光度值，根据标准品的吸光度值计算出待检样品中hAAT的浓度。
结果如图1A-图1F所示，图中1-7分别表示注射PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、 PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、 EalbPα1AT-hAAT和PCI neo的组，8为空白对照。检测结果表明，由AerApoEAATP 调控的hAAT的表达水平明显高于其它组，表达时间可持续2-3个月。
实施例三、以SEAP为报告基因验证肝脏高效表达调控序列的表达水平。
一、含有基因SEAP的载体PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP的构建
将质粒载体PTAL-SEAP(CLONTECH公司)用EcoRI和SalI酶切后，回收大小约 为1.8kbp的SEAP片断，将SEAP片断分别与经过EcoRI和SalI双酶切处理的载体 PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和PCI neoAlbEAATP连接，将 连接产物转化大肠杆菌DH5α，经PCR鉴定阳性克隆后提质粒，分别命名为PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP和PCI neoAlbEAATP-SEAP。
二、SEAP表达水平的验证
1、大量提取质粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP和PCI neoAerApoEAATP-SEAP。用限制 性内切酶BglII将质粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP酶切消化成线状，将线性化的质 粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP命名为BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP。
2、将45只昆明鼠分成9组(每组5只)，用水动力转染法给每只昆明鼠尾静脉 注射25μg质粒，注射的溶液量(生理盐水)相当于昆明鼠体重的10％，注射时间控 制在五秒钟以内，1-8组依次注射质粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP，第9组为空白对照。
3、分别于注射后第1、3、9、31、57天尾静脉采血，用的Phospha-LightTM System 试剂盒(A&B公司)测定血清中SEAP的浓度。
结果如图2A-图2E所示，图中1-8分别表示注射PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、 PCI neoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP的组，9为空白对照。 检测结果表明，由AerApoEAATP调控的SEAP的表达水平明显高于其它组，表达时间 可持续2-3个月，而且将表达载体线性化后可提高报告基因在体内的表达水平。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1880
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<400>1
agatctggct cagaggcaca caggagtttc tgggctcacc ctgccccctt ccaacccctc 60
agttcccatc ctccagcagc tgtttgtgtg ctgcctctga agtccacact gaacaaactt 120
cagcctactc atgtccctaa aatgggcaaa cattgcaagc agcaaacagc aaacacacag 180
ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg gcagaggtca gagacctctc tgggcccatg 240
ccacctccaa catccactcg accccttgga atttcggtgg agaggagcag aggttgtcct 300
ggcgtggttt aggtagtgtg agagggaagc ttacagcccc tagaaaataa cctgcgttac 360
agcatccact cagtatccct tgagcatgag gtgacactac ttaacatagg gacgagatgg 420
tactttgtgt ctcctgctct gtcagcaggg cactgtactt gctgatacca gggaatgttt 480
gttcttaaat accatcattc cggacgtgtt tgccttggcc agttttccat gtacatgcag 540
aaagaagttt ggactgatca atacagtcct ctgcctttaa agcaatagga aaaggccaac 600
ttgtctacgt ttaggtacct gtgggtcact cgcctggtag agccccaagg tggaggcata 660
aatgggactg gtgaatgaca gaaggggcaa aaatgcactc atccattcac tctgcaagta 720
tctacggcac gtacgccagc tcccaagcag gtttgcgggt tgcacagcgg gcgatgcaat 780
ctgatttagg cttttaaagg gattgcaatc aagtggggcc ccactagcct caaccctgta 840
cctcccctcc cctccacccc cagcagtctc caaaggcctc caacaacccc agagtggggg 900
ccatgtatcc aaagaaactc caagctgtat acggatcaca ctggttttcc aggagcaaaa 960
acagaaacag gcctgaggct ggtcaaaatt gaacctcctc ctgctctgag cagcctgggg 1020
ggcagactaa gcagagggct gtgcagaccc acataaagag cctactgtgt gccaggcact 1080
tcacccgagg cacttcacaa gcatgcttgg gaatgaaact tccaactctt tgggatgcag 1140
gtgaaacagt tcctggttca gagaggtgaa gcggcctgcc tgaggcagca cagctcttct 1200
ttacagatgt gcttccccac ctctaccctg tctcacggcc ccccatgcca gcctgacggt 1260
tgtgtctgcc tcagtcatgc tccatttttc catcgggacc atcaagaggg tgtttgtgtc 1320
taaggctgac tgggtaactt tggatgagcg gtctctccgc tctgagcctg tttcctcatc 1380
tgtcaaatgg gctctaacca ctctgatctc ccagggcggc agtaagtctt cagcatcaag 1440
cattttgggg tgactcagta aatggtagat cttgctacca gtggaacagc cactaaggat 1500
tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg 1560
ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatgactcct 1620
ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg 1680
ggcgactcag atcccagcca gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg 1740
accttggtta atattcacca gcagcctccc ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat 1800
acggacgagg acagggccct gtctcctcag cttcaggcac caccactgac ctgggacagt 1860
gaatcgctac cttaagagag 1880
<210>2
<211>1880
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<400>2
agatctacag cccctagaaa ataacctgcg ttacagcatc cactcagtat cccttgagca 60
tgaggtgaca ctacttaaca tagggacgag atggtacttt gtgtctcctg ctctgtcagc 120
agggcactgt acttgctgat accagggaat gtttgttctt aaataccatc attccggacg 180
tgtttgcctt ggccagtttt ccatgtacat gcagaaagaa gtttggactg atcaatacag 240
tcctctgcct ttaaagcaat aggaaaaggc caacttgtct acgtttaaag cttggctcag 300
aggcacacag gagtttctgg gctcaccctg cccccttcca acccctcagt tcccatcctc 360
cagcagctgt ttgtgtgctg cctctgaagt ccacactgaa caaacttcag cctactcatg 420
tccctaaaat gggcaaacat tgcaagcagc aaacagcaaa cacacagccc tccctgcctg 480
ctgaccttgg agctggggca gaggtcagag acctctctgg gcccatgcca cctccaacat 540
ccactcgacc ccttggaatt tcggtggaga ggagcagagg ttgtcctggc gtggtttagg 600
tagtgtgaga gggggtacct gtgggtcact cgcctggtag agccccaagg tggaggcata 660
aatgggactg gtgaatgaca gaaggggcaa aaatgcactc atccattcac tctgcaagta 720
tctacggcac gtacgccagc tcccaagcag gtttgcgggt tgcacagcgg gcgatgcaat 780
ctgatttagg cttttaaagg gattgcaatc aagtggggcc ccactagcct caaccctgta 840
cctcccctcc cctccacccc cagcagtctc caaaggcctc caacaacccc agagtggggg 900
ccatgtatcc aaagaaactc caagctgtat acggatcaca ctggttttcc aggagcaaaa 960
acagaaacag gcctgaggct ggtcaaaatt gaacctcctc ctgctctgag cagcctgggg 1020
ggcagactaa gcagagggct gtgcagaccc acataaagag cctactgtgt gccaggcact 1080
tcacccgagg cacttcacaa gcatgcttgg gaatgaaact tccaactctt tgggatgcag 1140
gtgaaacagt tcctggttca gagaggtgaa gcggcctgcc tgaggcagca cagctcttct 1200
ttacagatgt gcttccccac ctctaccctg tctcacggcc ccccatgcca gcctgacggt 1260
tgtgtctgcc tcagtcatgc tccatttttc catcgggacc atcaagaggg tgtttgtgtc 1320
taaggctgac tgggtaactt tggatgagcg gtctctccgc tctgagcctg tttcctcatc 1380
tgtcaaatgg gctctaacca ctctgatctc ccagggcggc agtaagtctt cagcatcaag 1440
cattttgggg tgactcagta aatggtagat cttgctacca gtggaacagc cactaaggat 1500
tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg 1560
ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatgactcct 1620
ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg 1680
ggcgactcag atcccagcca gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg 1740
accttggtta atattcacca gcagcctccc ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat 1800
acggacgagg acagggccct gtctcctcag cttcaggcac caccactgac ctgggacagt 1860
gaatcgctac cttaagagag 1880
实施例1、肝脏高效表达调控序列的构建
本实施例构建了四种肝脏表达调控序列，分别为AerApoEAATP、ApoEAATP、AATP 和AlbEAATP，其中，AerApoEAATP含有肝脏特异性启动子AAT-1202-+45和增强子Aer 及ApoE，后三种为对照序列，用于实施例3和实施例4中AerApoEAATP表达效果的验 证实验。
根据AAT-1206-355(Genebank号：gi|1236244|)、AAT-348-+45(Genebank号： gi|177830|)、AAT-261-+45(Genebank号：gi|177830|)、Aer(Genebank号： gi|24797079|)、ApoE(Genebank号：gi|975886|)、AAT-1202-45(Genebank号： gi|1236244|)、Alb(Genebank号：gi|191868|)、ApoEAAT(Genebank号： gi|975886|+gi|177830|)和hAAT(Genebank号：gi|177828|)的cDNA序列设计PCR 扩增上述基因片段的引物，引物序列如下：
扩增AAT-1206-355的引物：
PA：(上游引物)5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’
PB：(下游引物)5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’
扩增AAT-348-+45的引物：
PC：(上游引物)5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增AAT-261-+45的引物：
PE：(上游引物)5’-CGGGGTACCCGCCACCCCCTCCACCTT-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增Aer的引物：
PF：(上游引物)5’-CCCAAGCTTACAGCCCCTAGAAAATAACCTGCGTT-3’
PG：(下游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’
扩增ApoE的引物：
PH：(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’
PI：(下游引物)5’-CCCAAGCTTCCCTCTCACACTACCTAAACCA-3’
扩增AAT-1202-45的引物：
PJ：(上游引物)5’-CGGCGTACCTGTGGGTCACTCGCCTGGTAGA-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增AlbE的引物：
PK：(上游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’
PL：(下游引物)5’-GGAAGATCTGTTCCTAGATTACATTACACAT-3’
扩增ApoEAAT的引物：
PM：(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’
PD：(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’
扩增hAAT的引物：
PN：(上游引物)5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’
po：(下游引物)5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’
一、肝脏表达调控序列ApoEAATP的构建
以质粒载体pBC-hFIX-B[1](Eric C Olivares，Roger P.Hollis，Thomas W.Chalberg et al.Site-specific genomic integration produces therapeutic Factor IX levels in mice.nature，2002)为模板，在引物PM和PD的引导下，PCR扩 增ApoEAATP，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收该目的片段，并将其插 入到载体pGEM-T(Promega公司)后，转化大肠杆菌DH5α(博大泰克公司)，经蓝白斑 筛选和PCR鉴定后进行测序，将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为 T-ApoEAATP。将T-ApoEAATP用限制性内切酶IppoI和BglII双酶切后回收得到目的片 段ApoEAATP。
二、肝脏表达调控序列AATP的构建
以人肝脏的基因组DNA为模板，在引物PA和PB的引导下，PCR扩增AAT-1206-355， 在引物PC和PD的引导下，PCR扩增AAT-348-+45，将上述PCR产物进行1％琼脂糖 凝胶电泳检测后，回收目的片段AAT-1206-355和AAT-348-+45，将AAT-1206-355插 入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将 序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT-1206-355；将AAT-348-+45插入 到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将序 列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT-348-+45。将T-AAT-1206-355经Bgl II和ScaI双酶切后，回收大小为851bp的目的片段，将该片段命名为Bgl IIAAT1206-355ScaI；将T-AAT-348-+45经ScaI和IppoI进行双酶切后，回收大 小为303bp的目的片断，将大小为303bp的目的片段用T4 DNA连接酶与Bgl IIAAT1206-355ScaI进行连接，再以该连接产物为模板，在引物PA和PD的引导下， PCR扩增AAT-1206-+45，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收该目的片 段，并将其插入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后 进行测序，将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT-1206-+45。将质粒 载体T-AAT-1206-+45用限制性内切酶IppoI和BglII进行双酶切后，回收得到目 的片段AAT-1206-+45。
三、肝脏表达调控序列AerApoEAATP的构建
提取人肝脏的基因组DNA，并以此为模板，在引物PH和PI的引导下，PCR扩增 ApoE，在引物PF和PG的引导下，PCR扩增Aer，再以T-AAT-1206-+45为模板，在引 物PJ和PD的引导下，PCR扩增AAT-1202-+45，将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶 电泳检测，回收大小正确的目的片段，将ApoE、Aer、AAT-1202-+45插入到载体pGEM-T 后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将序列正确的阳性克 隆扩增后提质粒，将三种质粒载体命名为T-ApoE、T-Aer；T-AAT-1202-+45。将T-ApoE 经限制性内切酶ScaI和HindIII双酶切后回收ApoE片断，并将该片段与经同样酶 酶切处理的载体T-Aer连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定阳性克隆后提 取质粒，命名为T-AerApoE。将T-AAT-1202-+45经限制性内切酶KpnI和SacI双 酶切后回收AAT-1202-+45片断，并将该片段与经同样酶酶切处理的载体T-AerApoE 连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定阳性克隆后提质粒， 命名为T-AerApoEAAT，用限制性内切酶IppoI和BglII对T-AerApoEAAT进行酶切 后得到目的片断AerApoEAAT，对该DNA片段进行序列测定，测定结果表明AerApoEAAT 具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：1由1880个碱 基组成，自5’端第1-6位碱基为限制性内切酶BglII的识别位点，自5’端第7-326 位碱基为增强子ApoE，自5’端第327-332位碱基为限制性内切酶HindIII的识别 位点，自5’端第333-613位碱基为增强子Aer，自5’端第614-619位碱基为限制性 内切酶KpnI的识别位点，自5’端第620-1865位碱基为启动子AATP，自5’端第 1866-1880位碱基为限制性内切酶IppoI的识别位点。其中，增强子ApoE和Aer在 序列中的位置可调换，上述限制性内切酶识别位点也可根据实际需要进行更换。
四、肝脏表达调控序列AlbEAATP的构建
以质粒载体EalbPα1AT-luc(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)为 模板，在引物PE和PD的引导下，PCR扩增AAT261-+45；以质粒载体EIIPα1AT-luc(M. Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol. 7，No.3，March 2003)为模板，在引物PK和PL的引导下，PCR扩增AlbE。将AAT261- +45插入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序， 将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-AAT45-261。将AlbE插入到载体pGEM-T 后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后进行测序，将序列正确的阳性克 隆扩增后提质粒，命名为T-AlbE。将T-AlbE经限制性内切酶SacI和KpnI双酶切后回 收目的片断AlbE，将AlbE与经同样酶酶切处理的载体T-AAT45-261连接，将连接产物 转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定得到阳性克隆后提取质粒，命名为 T-AlbEAAT。将T-AlbEAAT用限制性内切酶IppoI和BglII酶切后回收得到目的片段 AlbEAAT。
实施例2、以PCI neo为出发载体构建的肝脏表达载体
将实施例一中得到的肝脏表达调控序列AerApoEAAT：ApoEAATP、AAT-1206-+45、 和AlbEAAT分别与经限制性内切酶IppoI和BglII酶切后的载体PCI neo(购于 Promega公司)相连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经PCR鉴定得到阳性克隆后 提取质粒，得到肝脏表达载体，命名为PCI neo-AerApoEAAT，用上述同样方法得到含 有AerApoEAAT的肝脏表达载体PCI neo-ApoEAATP，含有AAT-1206-+45的肝脏表达 载体PCI neo-AATP和含有AlbEAAT的肝脏表达载体PCI neo-AlbEAAT。
实施例3、以hAAT为报告基因验证肝脏高效表达调控序列的表达水平
一、含有基因hAAT的载体PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT和PCI neoAlbEAATP-hAAT的构建
从人肝脏组织中提取RNA，以PN/PO为引物，反转录PCR扩增hAAT基因片段。将 hAAT基因片段插入到载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和PCR鉴定 后进行测序，将序列正确的阳性克隆扩增后提质粒，命名为T-hAAT。将T-hAAT经限 制性内切酶EcoRI和SalI双酶切后回收目的片断hAAT，再将hAAT分别与经相同酶 酶切处理的载体PCI neo、PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和 PCI neoAlbEAATP连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定得到阳性克隆后提 取质粒，分别命名为PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、 PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT。
二、hAAT表达水平的验证
1、大量提取质粒PCI neo、PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT (M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)。
2、将40只昆明鼠分成8组(每组5只)，用水动力转染法给每只昆明鼠尾静脉 注射25μg质粒，注射的溶液量(生理盐水)相当于昆明鼠体重的10％，注射时间控 制在五秒钟以内，1-7组依次注射质粒PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、 EalbPα1AT-hAAT、PCI neo，第8组为空白对照。
3、分别于注射后第1、4、11、27、54、87天尾静脉采血，用ELISA法检测血清 中hAAT的浓度，检测方法包括以下步骤：
1)取hAAT(购自SIGMA公司)2mg溶于2mL PBS中，再加入2mL弗氏完全佐剂， 乳化后用肌肉注射法免疫日本大耳白兔，四周后再取1mg hAAT溶于1mL PBS中，加 入1mL弗氏不完全佐剂乳化后对上述经初次免疫的大耳白兔肌肉注射加强免疫，两周 后再进行第2次加强免疫。第2次加强免疫后10天，耳缘静脉采血，采用EIASA法 测定血清中的抗体滴度，抗体滴度高于10-6后心脏穿刺取血，离心取上清。
2)将步骤1)采集的兔血清先用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，再经蛋白G柱 (Promega公司)纯化后得到高纯度的抗-hAAT抗体，采用过碘酸钠法将辣根酶(HRP) 对抗-hAAT抗体进行标记。
3)用羊抗hAAT(5μg/mL，购自SIGMA公司)包被96孔板，4℃包被16小时后， 用PBST洗板，拍干，每孔加入130μL含10％胎牛血清的PBST，37℃温育1小时后 拍干，每孔再加入100μL待检测样品及已知浓度的经梯度稀释的hAAT标准品，37℃ 温育40分钟，用PBST洗板，拍干，每孔加入100μL经400倍稀释的步骤2)中的 HRP标记的抗hAAT抗体，37℃温育40分钟，用PBST洗板，拍干，显色，在450nm波 长下测其吸光度值，根据标准品的吸光度值计算出待检样品中hAAT的浓度。
结果如图1A-图1F所示，图中1-7分别表示注射PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、 PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、 EalbPα1AT-hAAT和PCI neo的组，8为空白对照。检测结果表明，由AerApoEAATP 调控的hAAT的表达水平明显高于其它组，表达时间可持续2-3个月。
实施例三、以SEAP为报告基因验证肝脏高效表达调控序列的表达水平。
一、含有基因SEAP的载体PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP的构建
将质粒载体PTAL-SEAP(CLONTECH公司)用EcoRI和SalI酶切后，回收大小约 为1.8kbp的SEAP片断，将SEAP片断分别与经过EcoRI和SalI双酶切处理的载体 PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和PCI neoAlbEAATP连接，将 连接产物转化大肠杆菌DH5α，经PCR鉴定阳性克隆后提质粒，分别命名为PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP和PCI neoAlbEAATP-SEAP。
二、SEAP表达水平的验证
1、大量提取质粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP和PCI neoAerApoEAATP-SEAP。用限制 性内切酶BglII将质粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP酶切消化成线状，将线性化的质 粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP命名为BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP。
2、将45只昆明鼠分成9组(每组5只)，用水动力转染法给每只昆明鼠尾静脉 注射25μg质粒，注射的溶液量(生理盐水)相当于昆明鼠体重的10％，注射时间控 制在五秒钟以内，1-8组依次注射质粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP，第9组为空白对照。
3、分别于注射后第1、3、9、31、57天尾静脉采血，用的Phospha-LightTM System 试剂盒(A&B公司)测定血清中SEAP的浓度。
结果如图2A-图2E所示，图中1-8分别表示注射PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、 PCI neoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP的组，9为空白对照。 检测结果表明，由AerApoEAATP调控的SEAP的表达水平明显高于其它组，表达时间 可持续2-3个月，而且将表达载体线性化后可提高报告基因在体内的表达水平。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1880
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<400>1
agatctggct cagaggcaca caggagtttc tgggctcacc ctgccccctt ccaacccctc 60
agttcccatc ctccagcagc tgtttgtgtg ctgcctctga agtccacact gaacaaactt 120
cagcctactc atgtccctaa aatgggcaaa cattgcaagc agcaaacagc aaacacacag 180
ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg gcagaggtca gagacctctc tgggcccatg 240
ccacctccaa catccactcg accccttgga atttcggtgg agaggagcag aggttgtcct 300
ggcgtggttt aggtagtgtg agagggaagc ttacagcccc tagaaaataa cctgcgttac 360
agcatccact cagtatccct tgagcatgag gtgacactac ttaacatagg gacgagatgg 420
tactttgtgt ctcctgctct gtcagcaggg cactgtactt gctgatacca gggaatgttt 480
gttcttaaat accatcattc cggacgtgtt tgccttggcc agttttccat gtacatgcag 540
aaagaagttt ggactgatca atacagtcct ctgcctttaa agcaatagga aaaggccaac 600
ttgtctacgt ttaggtacct gtgggtcact cgcctggtag agccccaagg tggaggcata 660
aatgggactg gtgaatgaca gaaggggcaa aaatgcactc atccattcac tctgcaagta 720
tctacggcac gtacgccagc tcccaagcag gtttgcgggt tgcacagcgg gcgatgcaat 780
ctgatttagg cttttaaagg gattgcaatc aagtggggcc ccactagcct caaccctgta 840
cctcccctcc cctccacccc cagcagtctc caaaggcctc caacaacccc agagtggggg 900
ccatgtatcc aaagaaactc caagctgtat acggatcaca ctggttttcc aggagcaaaa 960
acagaaacag gcctgaggct ggtcaaaatt gaacctcctc ctgctctgag cagcctgggg 1020
ggcagactaa gcagagggct gtgcagaccc acataaagag cctactgtgt gccaggcact 1080
tcacccgagg cacttcacaa gcatgcttgg gaatgaaact tccaactctt tgggatgcag 1140
gtgaaacagt tcctggttca gagaggtgaa gcggcctgcc tgaggcagca cagctcttct 1200
ttacagatgt gcttccccac ctctaccctg tctcacggcc ccccatgcca gcctgacggt 1260
tgtgtctgcc tcagtcatgc tccatttttc catcgggacc atcaagaggg tgtttgtgtc 1320
taaggctgac tgggtaactt tggatgagcg gtctctccgc tctgagcctg tttcctcatc 1380
tgtcaaatgg gctctaacca ctctgatctc ccagggcggc agtaagtctt cagcatcaag 1440
cattttgggg tgactcagta aatggtagat cttgctacca gtggaacagc cactaaggat 1500
tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg 1560
ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatgactcct 1620
ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg 1680
ggcgactcag atcccagcca gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg 1740
accttggtta atattcacca gcagcctccc ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat 1800
acggacgagg acagggccct gtctcctcag cttcaggcac caccactgac ctgggacagt 1860
gaatcgctac cttaagagag 1880
<210>2
<211>1880
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<400>2
agatctacag cccctagaaa ataacctgcg ttacagcatc cactcagtat cccttgagca 60
tgaggtgaca ctacttaaca tagggacgag atggtacttt gtgtctcctg ctctgtcagc 120
agggcactgt acttgctgat accagggaat gtttgttctt aaataccatc attccggacg 180
tgtttgcctt ggccagtttt ccatgtacat gcagaaagaa gtttggactg atcaatacag 240
tcctctgcct ttaaagcaat aggaaaaggc caacttgtct acgtttaaag cttggctcag 300
aggcacacag gagtttctgg gctcaccctg cccccttcca acccctcagt tcccatcctc 360
cagcagctgt ttgtgtgctg cctctgaagt ccacactgaa caaacttcag cctactcatg 420
tccctaaaat gggcaaacat tgcaagcagc aaacagcaaa cacacagccc tccctgcctg 480
ctgaccttgg agctggggca gaggtcagag acctctctgg gcccatgcca cctccaacat 540
ccactcgacc ccttggaatt tcggtggaga ggagcagagg ttgtcctggc gtggtttagg 600
tagtgtgaga gggggtacct gtgggtcact cgcctggtag agccccaagg tggaggcata 660
aatgggactg gtgaatgaca gaaggggcaa aaatgcactc atccattcac tctgcaagta 720
tctacggcac gtacgccagc tcccaagcag gtttgcgggt tgcacagcgg gcgatgcaat 780
ctgatttagg cttttaaagg gattgcaatc aagtggggcc ccactagcct caaccctgta 840
cctcccctcc cctccacccc cagcagtctc caaaggcctc caacaacccc agagtggggg 900
ccatgtatcc aaagaaactc caagctgtat acggatcaca ctggttttcc aggagcaaaa 960
acagaaacag gcctgaggct ggtcaaaatt gaacctcctc ctgctctgag cagcctgggg 1020
ggcagactaa gcagagggct gtgcagaccc acataaagag cctactgtgt gccaggcact 1080
tcacccgagg cacttcacaa gcatgcttgg gaatgaaact tccaactctt tgggatgcag 1140
gtgaaacagt tcctggttca gagaggtgaa gcggcctgcc tgaggcagca cagctcttct 1200
ttacagatgt gcttccccac ctctaccctg tctcacggcc ccccatgcca gcctgacggt 1260
tgtgtctgcc tcagtcatgc tccatttttc catcgggacc atcaagaggg tgtttgtgtc 1320
taaggctgac tgggtaactt tggatgagcg gtctctccgc tctgagcctg tttcctcatc 1380
tgtcaaatgg gctctaacca ctctgatctc ccagggcggc agtaagtctt cagcatcaag 1440
cattttgggg tgactcagta aatggtagat cttgctacca gtggaacagc cactaaggat 1500
tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg 1560
ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatgactcct 1620
ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg 1680
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acggacgagg acagggccct gtctcctcag cttcaggcac caccactgac ctgggacagt 1860
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| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于植物基因表达的终止子序列 | 2020-05-12 | 695 |
| 干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其用途 | 2020-05-12 | 348 |
| 用于提高表达的细菌前导序列 | 2020-05-13 | 773 |
| 在人类肝脏中表达的表达序列标签 | 2020-05-11 | 188 |
| 表达调控序列 | 2020-05-11 | 340 |
| 增强表达的内含子序列 | 2020-05-11 | 59 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签G组 | 2020-05-12 | 896 |
| 表达序列 | 2020-05-11 | 388 |
| 增强表达的内含子序列及其用途 | 2020-05-12 | 905 |
| 表达序列 | 2020-05-11 | 277 |
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