定点突变ApoE基因的方法
阅读：1017发布：2020-07-19
专利汇可以提供定点突变ApoE基因的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了定点突变ApoE基因的方法。本发明公开的定点突变ApoE基因的方法，包括向受体动物细胞中导入靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因与Cas9的编码基因，得到ApoE基因被定点突变的动物细胞；ApoE基因靶序列为 序列表 中序列1的核苷酸序列；靶向ApoE基因靶序列的gRNA的序列为将序列表中序列2中的T替换为U得到的序列。实验证明，本发明的靶向ApoE基因靶序列的gRNA能高效识别ApoE基因，对ApoE基因平均编辑效率达86％，表明本发明的方法可以用来定点突变ApoE基因。，下面是定点突变ApoE基因的方法专利的具体信息内容。
1.定点突变ApoE基因的方法，为采用CRISPR/Cas9方法进行定点突变，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法中使用的ApoE基因靶序列为如下A1)、A2)或A3)：
A1)序列表中序列1的核苷酸序列；
A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；
A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述定点突变ApoE基因的方法包括向受体动物细胞中导入靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因与Cas9的编码基因，得到ApoE基因被定点突变的动物细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因通过表达载体1导入所述受体动物细胞中，所述表达载体1为含有所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因的表达盒的表达载体；
所述Cas9的编码基因通过表达载体2导入所述受体动物细胞中，所述表达载体2为含有所述Cas9的编码基因的表达盒的表达载体。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的序列为将序列表中序列2中的T替换为U得到的序列；所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述受体动物细胞为下述H1或H2：
H1、哺乳动物细胞；
H2、猪细胞。
6.下述任一产品：
P1、权利要求1-3中任一所述gRNA；
P2、权利要求1-3中任一所述gRNA的编码基因；
P3、含有权利要求1-3中任一所述gRNA的编码基因的表达盒；
P4、含有权利要求1-3中任一所述gRNA的编码基因的重组载体。
7.定点突变ApoE基因的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂由权利要求6所述产品和下述M1-M3中的任一种组成；
M1、Cas9的编码基因；
M2、含有Cas9的编码基因的表达盒；
M3、含有Cas9的编码基因的表达载体。
8.下述任一应用：
X1、权利要求1所述ApoE基因靶序列在定点突变ApoE基因中的应用；
X2、权利要求6所述产品在定点突变ApoE基因中的应用；
X3、权利要求7所述成套试剂在定点突变ApoE基因中的应用；
X4、权利要求1所述ApoE基因靶序列在制备ApoE基因定点突变动物模型中的应用；
X5、权利要求6所述产品在制备ApoE基因定点突变动物模型中的应用；
X6、权利要求7所述成套试剂在制备ApoE基因定点突变动物模型中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述动物为哺乳动物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述哺乳动物为猪。
定点突变ApoE基因的方法
技术领域
背景技术
[0002] CRISPR/Cas是细菌和古细菌中一种有效的获得性免疫机制，CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，根据Cas位点基因组织源性、参与的Cas蛋白质的不同，CRISPR/Cas系统分为I型、II型和III型。II型CRISPR/Cas系统仅存在于细菌中，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，当机体抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，crRNA以及与crRNA重复序列互补的反式激活crRNA(tracrRNA)和Cas9三者组成复合体，最终识别、结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。II型CRISPR/Cas系统在各物种如：小鼠、大鼠、猪、牛、羊、狒狒、水稻、小麦、拟南芥等均得到了较为广泛的运用。其编辑效率较同源重组、ZFNs、TALEN等前几代基因编辑手段有较大的提高，并且实验环节少、周期短、费用更低。
[0003] ApoE蛋白是一种载脂蛋白，存在于极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)、乳糜微粒(chylomicrons,CM)、中间密度脂蛋白(Intermediate-density lipoprotein，IDLs)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)中，为富含甘油三酯的脂蛋白成分的正常代谢所必需的。人类ApoE基因缺陷或基因变异与心血管疾病、老年痴呆等疾病有关，是高胆固醇血症和动脉粥样硬化的主效基因。制备ApoE基因突变动物模型具有重要科研及医学价值。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何对ApoE基因进行定点突变。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了定点突变ApoE基因的方法，所述方法为采用CRISPR/Cas9方法进行定点突变，所述CRISPR/Cas9方法中使用的ApoE基因靶序列为如下A1)、A2)或A3)：
[0007] A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；
[0008] A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列。
[0009] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0010] 上述方法中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；
或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0011] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0012] 上述定点突变ApoE基因的方法可包括向离体的受体动物细胞中导入靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因与Cas9的编码基因，得到ApoE基因被定点突变的动物细胞。
[0013] 上述方法中，所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因可通过表达载体1导入所述受体动物细胞中，所述表达载体1为含有所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因的表达盒的表达载体。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述表达载体1为U6-sgRNA-ApoE2，U6-sgRNA-ApoE2为在pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin的序列中插入可识别序列1的寡核苷酸二聚体得到的重组载体。
[0015] 上述方法中，所述Cas9的编码基因可通过表达载体2导入所述受体动物细胞中，所述表达载体2为含有所述Cas9的编码基因的表达盒的表达载体。
[0016] 在本发明的一个实施例中，所述表达载体2为Addgene的货号为#44758的Cas9表达载体。
[0017] 上述方法中，所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的序列可为将序列表中序列2中的T替换为U得到的序列；所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
[0020] P1、所述gRNA；
[0021] P2、所述gRNA的编码基因；
[0022] P3、含有所述gRNA的编码基因的表达盒；
[0023] P4、含有所述gRNA的编码基因的重组载体。
[0024] 上述产品中，P3所述的含有所述gRNA的编码基因的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述gRNA的DNA，该DNA不但可包括启动所述gRNA的编码基因转录的启动子，还可包括终止所述gRNA的编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0025] 可用现有的表达载体构建含有所述gRNA的编码基因表达盒的重组载体。所述表达载体具体可为pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin。
[0026] 为解决上述技术问题，本发明还提供了定点突变ApoE基因的成套试剂，所述成套试剂由所述产品和下述M1-M3中的任一种组成；
[0027] M1、Cas9的编码基因；
[0028] M2、含有Cas9的编码基因的表达盒；
[0029] M3、含有Cas9的编码基因的表达载体。
[0030] 上述成套试剂中，M2所述的含有Cas9的编码基因的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达Cas9的DNA，该DNA不但可包括启动Cas9的编码基因转录的启动子，还可包括终止Cas9的编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0031] 可用现有的表达载体构建含有Cas9的编码基因表达盒的重组载体。所述含有Cas9的编码基因的表达载体具体可为Addgene的货号为#44758的Cas9表达载体。
[0032] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0033] X1、所述ApoE基因靶序列在定点突变ApoE基因中的应用；
[0034] X2、所述产品在定点突变ApoE基因中的应用；
[0035] X3、所述成套试剂在定点突变ApoE基因中的应用；
[0036] X4、所述ApoE基因靶序列在制备ApoE基因定点突变动物模型中的应用；
[0037] X5、所述产品在制备ApoE基因定点突变动物模型中的应用；
[0038] X6、所述成套试剂在制备ApoE基因定点突变动物模型中的应用。
[0039] 上述应用中，所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物具体可为猪。
[0040] 本发明中，pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin为addgene的货号为#51133的产品。
[0041] 实验证明，本发明的ApoE-gRNA能高效识别ApoE基因，在CAS9酶作用下实现准确切割，在cas9切割位点附近出现的突变类型有：单碱基插入、多碱基插入、单碱基删除和多碱基删除四种突变类型，对ApoE基因平均编辑效率达86％，其中，平均单等位基因(APOE-/+)编-/-辑效率为72％，平均双等位基因(APOE )编辑效率为14％，可以制造大量的ApoE基因突变类型，为后期对猪ApoE基因的突变及功能分析提供了实验基础。本发明的定点突变ApoE基因的方法可以用来定点突变ApoE基因，还可以用来制备ApoE基因缺陷疾病动物模型。
附图说明
附图说明
[0042] 图1为转染U6-sgRNA-ApoE2 48h后细胞混池PCR测序。图中黑色区域所示为gRNA设计位点。
[0043] 图2为细胞单克隆突变类型分析。
[0044] 图3为转染U6-sgRNA-LDLR1与U6-sgRNA-LDLR2 48h后细胞混池PCR测序。A：CAS9/U6-sgRNA-LDLR1转染后混池PCR测序峰图；B：CAS9/U6-sgRNA-LDLR2转染后混池PCR测序峰图；图中LDLR-E2-1与LDLR-E2-2分别表示LDLR1-gRNA与LDLR2-gRNA的识别位点。
[0045] 图4为转染U6-sgRNA-LDLR1与U6-sgRNA-LDLR2后细胞单克隆突变类型分析。其中，LDLR-e2-1与LDLR-e2-2分别表示转染U6-sgRNA-LDLR1与U6-sgRNA-LDLR2；“+”表示插入；“△”表示删除；“wt”表示野生型。
[0046] 图5为转染U6-sgRNA-LDLR1与U6-sgRNA-LDLR2以及U6-sgRNA-ApoE2 48h后细胞混池PCR测序。图中APOE-E2、LDLR-E2-1与LDLR-E2-2分别表示APOE-gRNA、LDLR1-gRNA与LDLR2-gRNA的识别位点。A与B分别为转染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1后细胞混池APOE和LDLR基因PCR测序峰图；C与D分别为转染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1后细胞混池APOE和LDLR基因PCR测序峰图。
[0047] 图6为细胞单克隆突变类型分析，其中，A为转染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1的结果，B为转染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR2后的结果；APOE-e2表示ApoE基因的突变结果；LDLR-e2-1与LDLR-e2-2分别表示转染U6-sgRNA-LDLR1与U6-sgRNA-LDLR2LDLR基因的突变情况；“+”表示插入；“△”表示删除；“wt”表示野生型；“#”为克隆编号。
具体实施方式
[0048] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0049] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0050] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0051] 下述实施例中的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast，PEF)按照如下方法制备：将巴马小型猪37日龄胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴FBS，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。其中，巴马小型猪为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所天津基地猪场饲养的猪。
[0052] 实施例1、ApoE基因的定点突变
[0053] 本实施例所提供的特异识别猪ApoE基因gRNA(将其命名为ApoE-gRNA)从5’端到3’端依次为：19nt的碱基(与ApoE基因靶序列特异结合的序列，ApoE基因靶序列为序列表中序列1)，一个长42nt的发夹结构(负责与Cas9蛋白结合引导Cas9核酸酶对DNA进行切割)，3’端一个长40nt的转录终止子。ApoE-gRNA的序列为将序列表中序列2中的T替换为U得到的序列，ApoE-gRNA由序列表中序列2所示的DNA分子编码。在成熟的ApoE-gRNA的引导作用下Cas9结合到ApoE基因，并对其进行切割，引入双链断裂(DSB)，诱发DNA损伤修复，在靶位点附近引入突变，制造多种ApoE基因突变体。
[0054] 一、表达载体构建
[0055] 所用骨架载体为pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene产品，货号为#51133，以下简称U6-sgRNA)，gRNA表达载体具体构建过程如下：
[0056] 1、骨架载体制备
[0057] U6-sgRNA骨架载体酶切回收：50μl酶切体系如下：10μg U6-sgRNA，5μl BbsI(NEB)，5μl cutsmart buffer(NEB)，ddH2O补至50μl。
[0059] 反应体系如下：
[0060]
[0061] ApoE-e2-F与ApoE-e2-R的引物序列如表1所示。
[0062] 表1、ApoE-gRNA构建引物序列
[0063]名称 序列(5’-3’)
ApoE-e2-F ACCGgaggtgcacgtgtggtggg
ApoE-e2-R AAACcccaccacacgtgcacctc
ApoE-e2-F ACCGgaggtgcacgtgtggtggg
ApoE-e2-R AAACcccaccacacgtgcacctc
[0064] 混匀上述体系，使用PCR仪进行退火反应，程序如下：
[0065]
[0066] 3、U6-sgRNA-ApoE2的制备
[0067] 将步骤2得到的寡核苷酸二聚体与步骤1得到的骨架载体进行连接，16℃连接1h，得到重组载体。具体反应体系如下：50ng步骤1得到的骨架载体，步骤2得到的寡核苷酸二聚体(1:200稀释)，1μl 10×T4Ligase Buffer(TKARA)，1μl T4Ligase(TKARA)，ddH2O补至11μl。
[0068] 将连接产物转化大肠杆菌，并测序验证得到序列正确的表达ApoE-gRNA的重组载体，将其命名为U6-sgRNA-ApoE2。
[0069] 二、转染猪胎儿成纤维细胞及验证
[0070] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0071] 采用核转染的方法将步骤一得到的U6-sgRNA-ApoE2以及Cas9表达载体(Addgene产品，货号为#44758)各5μg转染猪胎儿成纤维细胞(约1×106个)，核转染严格按照试剂盒(Catalog Number：VPI-1002，Lonza)和细胞核转染仪(Amaxa公司)说明书操作，选用T-016程序。核转染后48h，利用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(bioteke，DP1901)提取细胞基因组DNA。
[0072] 以上述提取的DNA为模板，扩增包含ApoE-gRNA结合位点的ApoE基因，扩增引物如下表，回收约698bp PCR产物。扩增条件如下：预变性98℃3min，98℃10s，63℃15s，72℃40s，循环33次72℃5min再延伸。
[0073] 表2、ApoE扩增引物
[0074]名称 序列(5’-3’)
ApoE-F GCAGGGCGTGAGCATTAGAT
ApoE-R AGGACGGCAAGACTGACCCA
ApoE-F GCAGGGCGTGAGCATTAGAT
ApoE-R AGGACGGCAAGACTGACCCA
[0075] 对PCR产物进行测序，测序结果如图1所示，在cas9核酸酶切割位点下游开始出现套峰，证明cas9核酸酶成功对猪ApoE基因进行切割。图中黑色方框中所示为ApoE-gRNA结合位置，套峰显示该位点有多个碱基类型。
[0076] 三、克隆形成能力及克隆突变类型分析
[0077] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0078] 采用核转染的方法将步骤一得到的U6-sgRNA-ApoE2以及Cas9表达载体(Addgene产品，货号为#44758)各5μg转染猪胎儿成纤维细胞(约1×106个)，核转染严格按照试剂盒和核转仪说明书操作，选用T-016程序。核转染后24h，加入1μg/mL嘌呤霉素处理，36h后用0.1％胰酶消化，收集细胞，接种到3个100mm细胞培养皿中(1×104个/皿)，细胞培养皿中含有DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，培养15天至单克隆形成，每两天更换新鲜培养基。挑取单克隆细胞，提取单克隆基因组，扩增ApoE基因并测序(PCR扩增条件同步骤二)。
[0079] 对挑取的单克隆做突变类型分析，在cas9切割位点附近出现单碱基插入、多碱基插入、单碱基删除和多碱基删除四种突变类型(图2)。图中绿色短线示意ApoE-gRNA识别序列在ApoE基因中的位置，红色短线示意PAM序列，序列对比图显示详细的突变类型情况，其中首行序列为野生型ApoE基因序列。
[0080] 表3、平均敲除效率
[0081]单等位基因敲除效率 双等位基因敲除效率 敲除效率总计
72％ 14％ 86％
72％ 14％ 86％
[0082] 结果显示，本发明的ApoE-gRNA能高效识别猪ApoE基因第二外显子，在CAS9酶作用下实现准确切割，结果(表3)显示，CAS9/U6-sgRNA-ApoE2系统对猪ApoE基因平均编辑效率为86％(即猪细胞两条染色体上的ApoE基因均被编辑(基因型为APOE-/-)的单克隆占总单克隆数的比例与一条染色体上的ApoE基因被编辑(基因型为APOE-/+)的单克隆占总单克隆数的比例之和)，其中，平均单等位基因编辑效率为72％(即猪细胞中只有一条染色体上的ApoE基因被编辑(基因型为APOE-/+)的单克隆占总单克隆数的比例)，平均双等位基因(基因型为APOE-/-)编辑效率为14％(即猪细胞中的两条染色体上的ApoE基因均被编辑的单克隆占总单克隆数的比例)。同时制造了大量的基因突变类型，为后期对猪ApoE基因的突变及功能分析提供了实验基础。
[0083] 实施例2、LDLR基因的定点突变
[0084] 本实施例提供提供了两个特异识别猪LDLR基因的gRNA，分别为LDLR1-gRNA与LDLR2-gRNA，LDLR1-gRNA与LDLR2-gRNA从5’端到3’端均依次为：19nt或20nt的碱基(与LDLR基因靶序列特异结合的序列，LDLR1-gRNA在LDLR基因中的靶序列为序列表中序列3，LDLR2-gRNA在LDLR基因中的靶序列为序列表中序列4)，一个长42nt的发夹结构(负责与Cas9蛋白结合引导Cas9核酸酶对DNA进行切割)，3’端一个长40nt的转录终止子。LDLR1-gRNA的序列为将序列表中序列5中的T替换为U得到的序列，LDLR1-gRNA由序列表中序列5所示的DNA分子编码；LDLR2-gRNA的序列为将序列表中序列6中的T替换为U得到的序列，LDLR2-gRNA由序列表中序列6所示的DNA分子编码。在成熟的LDLR1-gRNA或LDLR2-gRNA的引导作用下Cas9结合到LDLR基因，并对其进行切割，引入双链断裂(DSB)，诱发DNA损伤修复，在靶位点附近引入突变，制造多种LDLR基因突变体。
[0085] 一、表达载体构建
[0086] 所用骨架载体为pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene产品，货号为#51133，以下简称U6-sgRNA)，gRNA表达载体具体构建过程如下：
[0087] 1、骨架载体制备
[0088] 同实施例1步骤一中1。
[0089] 2、寡核苷酸二聚体形成及去磷酸化
[0090] 按照实施例1步骤一中2的方法，将ApoE-e2-F与ApoE-e2-R替换为LDLR-e2-1-F与LDLR-e2-1-R，其他步骤均不变，得到LDLR1寡核苷酸二聚体。
[0091] 按照实施例1步骤一中2的方法，将ApoE-e2-F与ApoE-e2-R替换为LDLR-e2-2-F与LDLR-e2-2-R，其他步骤均不变，得到LDLR2寡核苷酸二聚体。
[0092] LDLR-e2-1-F与LDLR-e2-1-R、LDLR-e2-2-F与LDLR-e2-2-R的序列如表4所示。
[0093] 表4、gRNA构建引物序列
[0094]
[0095]
[0096] 3、U6-sgRNA-LDLR1与U6-sgRNA-LDLR2的制备
[0097] 将步骤2得到的LDLR1寡核苷酸二聚体与步骤1得到的骨架载体进行连接，16℃连接1h，得到重组载体。具体反应体系如下：50ng步骤1得到的骨架载体，步骤2得到的LDLR1寡核苷酸二聚体(1:200稀释)，1μl 10×T4Ligase Buffer(TKARA)，1μl T4Ligase(TKARA)，ddH2O补至11μl。将连接产物转化大肠杆菌，并测序验证得到序列正确的表达LDLR1-gRNA的重组载体，将其命名为U6-sgRNA-LDLR1。
[0098] 将步骤2得到的LDLR2寡核苷酸二聚体与步骤1得到的骨架载体进行连接，16℃连接1h，得到重组载体。具体反应体系如下：50ng步骤1得到的骨架载体，步骤2得到的LDLR2寡核苷酸二聚体(1:200稀释)，1μl 10×T4Ligase Buffer(TKARA)，1μl T4Ligase(TKARA)，ddH2O补至11μl。将连接产物转化大肠杆菌，并测序验证得到序列正确的表达LDLR1-gRNA的重组载体，将其命名为U6-sgRNA-LDLR2。
[0099] 二、转染猪胎儿成纤维细胞及验证
[0100] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0101] 按照实施例1步骤二中的核转染的方法将步骤一得到的U6-sgRNA-LDLR1以及Cas9表达载体(Addgene产品，货号为#44758)各5μg转染猪胎儿成纤维细胞(约1×106个)。核转染后48h，利用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA。
[0102] 以上述提取的DNA为模板，扩增包含LDLR1-gRNA结合位点的LDLR基因，扩增引物如下表5，回收约850bp PCR产物。扩增条件如下：预变性98℃3min，98℃10s，63℃15s，72℃40s，循环33次72℃5min再延伸。
[0103] 表5、LDLR扩增引物
[0104]名称 序列(5’-3’)
LDLR-F CCTCCACGATGTTGTTGGTT
LDLR-R GACCAGTTGGTAAGGGCTAT
LDLR-F CCTCCACGATGTTGTTGGTT
LDLR-R GACCAGTTGGTAAGGGCTAT
[0105] 按照实施例1步骤二中的核转染的方法将步骤一得到的U6-sgRNA-LDLR2以及Cas9表达载体(Addgene产品，货号为#44758)各5μg转染猪胎儿成纤维细胞(约1×106个)。核转染后48h，利用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA。利用LDLR-F与LDLR-R进行PCR扩增，扩增条件同上。
[0106] 测序结果如图3显示，转染U6-sgRNA-LDLR1在cas9核酸酶切割位点下游开始出现套峰(图3中A)，证明本实验成功对猪LDLR基因进行切割。gRNA结合位置和PAM序列如图所示，套峰显示该位点有多个碱基类型。其中U6-sgRNA-LDLR2套峰几乎不可见，图3中B。
[0107] 回收上述PCR产物，分别与PMD-18T载体(宝生物工程(大连)有限公司，D101A)连接后转化大肠杆菌，每组挑取40个克隆进行测序，根据阳性克隆数计算突变效率，转染U6-sgRNA-LDLR1的平均突变率为26.7％，转染U6-sgRNA-LDLR2的平均突变率为9.7％。
[0108] 三、克隆形成能力及克隆突变类型分析
[0109] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0110] 按照实施例1步骤二中的核转染的方法将步骤一得到的U6-sgRNA-LDLR1或U6-sgRNA-LDLR2与Cas9表达载体转染猪胎儿成纤维细胞，核转染后24h，加入1μg/mL嘌呤霉素处理，36h后用0.1％胰酶消化，收集细胞，接种到3个100mm细胞培养皿中(1×104个/皿)，细胞培养皿中含有DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，培养15天至单克隆形成，每两天更换新鲜培养基。挑取单克隆细胞，提取单克隆基因组，扩增ApoE基因并测序(PCR扩增条件同步骤二)。
[0111] 对挑取的单克隆做突变类型分析(图4)，在cas9切割位点附近出现单碱基插入、多碱基插入、单碱基删除和多碱基删除四种突变类型。图中下划线示意gRNA或gRNA的识别序列在LDLR基因中的位置，序列对比图显示详细的突变类型情况，其中首行序列为野生型LDLR基因序列。
[0112] 表6、平均敲除效率
[0113]名称 单等位基因敲除效率 双等位基因敲除效率 敲除效率总计
LDLR1 19％ 31％ 50％
LDLR2 32％ 14％ 46％
LDLR1 19％ 31％ 50％
LDLR2 32％ 14％ 46％
[0114] 结果显示，本发明的LDLR1-gRNA与LDLR2-gRNA均能高效识别猪LDLR基因第二外显子，在CAS9酶作用下实现准确切割，其中CAS9/U6-sgRNA-LDLR1系统对猪LDLR基因平均编辑效率为50％(即猪细胞两条染色体上的LDLR基因均被编辑的单克隆占总单克隆数的比例与一条染色体上的LDLR基因被编辑的单克隆占总单克隆数的比例之和)，其中，平均单等位基因编辑效率为19％(即猪细胞中只有一条染色体上的LDLR基因被编辑的单克隆占总单克隆数的比例(基因型为LDLR-/+))，平均双等位基因编辑效率为31％(即猪细胞中的两条染色体上的LDLR基因均被编辑的单克隆占总单克隆数的比例(基因型为LDLR-/-))；CAS9/U6-sgRNA-LDLR2系统对猪LDLR基因平均编辑效率为46％(即猪细胞两条染色体上的LDLR基因均被编辑的单克隆占总单克隆数的比例与一条染色体上的LDLR基因被编辑的单克隆占总单克隆数的比例之和)，其中，平均单等位基因编辑效率为32％(即猪细胞中只有一条染色体上的LDLR基因被编辑的单克隆占总单克隆数的比例)，平均双等位基因编辑效率为14％(即猪细胞中的两条染色体上的LDLR基因均被编辑的单克隆占总单克隆数的比例)。同时制造了大量的基因突变类型，为后期对猪LDLR基因的突变及功能分析提供了实验基础。
[0115] 实施例3、ApoE基因与LDLR基因的定点突变
[0116] 本实施例利用实施例1的ApoE-gRNA与实施例2的LDLR1-gRNA或LDLR2-gRNA对ApoE基因与LDLR基因同时进行定点突变。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0117] 一、转染猪胎儿成纤维细胞及验证
[0118] 采用核转染的方法将实施例1的U6-sgRNA-ApoE2(2.5μg)与实施例2的U6-sgRNA-LDLR1(2.5μg)混合后分别与5μg Cas9表达载体(Addgene产品，货号为#44758)共转染猪胎儿成纤维细胞(约1×106个)，核转染严格按照试剂盒和核转仪说明书操作，选用T-016程序。核转染后48h，利用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(bioteke，DP1901)提取细胞基因组，将得到的基因组命名为基因组1。
[0119] 按照上述方法，将U6-sgRNA-LDLR1替换为U6-sgRNA-LDLR2，其他步骤不变，得到细胞基因组，将得到的基因组命名为基因组2。
[0120] 利用实施例1的ApoE-F与ApoE-R以及实施例2的LDLR-F与LDLR-R分别对基因组1与基因组2进行PCR扩增，条件同实施例1与实施例2。分别回收约698bp和850bp PCR产物进行测序。
[0121] 测序结果如图5显示，转染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1在cas9核酸酶切割位点下游，APOE基因和LDLR基因均出现套峰(图5中A和B)，证明本实验成功对猪APOE基因与LDLR基因进行定点切割，gRNA结合位置和PAM序列如图所示，套峰显示该位点有多个碱基类型。转染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR2中LDLR基因的套峰几乎不可见，图5中C和D。
[0122] 二、克隆形成能力及克隆突变类型分析
[0123] 采用核转染的方法将实施例1的U6-sgRNA-ApoE2(2.5μg)与实施例2的U6-sgRNA-LDLR1(2.5μg)混合后分别与5μg Cas9表达载体(Addgene产品，货号为#44758)共转染猪胎儿成纤维细胞，核转染严格按照试剂盒和核转仪说明书操作，选用T-016程序。核转染后24h，加入1μg/mL嘌呤霉素处理，36h后用0.1％胰酶消化，收集细胞，收集细胞，接种到3个
100mm细胞培养皿中(1×104个/皿)，细胞培养皿中含有DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，培养15天至单克隆形成，每两天更换新鲜培养基。挑取单克隆细胞，提取单克隆基因组，利用实施例1的ApoE-F与ApoE-R以及实施例2的LDLR-F与LDLR-R进行PCR扩增，条件同实施例1与实施例2。
100mm细胞培养皿中(1×104个/皿)，细胞培养皿中含有DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，培养15天至单克隆形成，每两天更换新鲜培养基。挑取单克隆细胞，提取单克隆基因组，利用实施例1的ApoE-F与ApoE-R以及实施例2的LDLR-F与LDLR-R进行PCR扩增，条件同实施例1与实施例2。
[0124] 按照上述方法，将U6-sgRNA-LDLR1替换为U6-sgRNA-LDLR2，其他均不变，对转染的得到的单克隆细胞进行检测。
[0125] 对挑取的单克隆做突变类型分析(图6)，在cas9切割位点附近出现单碱基插入、多碱基插入、单碱基删除和多碱基删除四种突变类型。图中下划线示意gRNA序列在APOE和LDLR基因中的位置，序列对比图显示详细的突变类型情况，其中首行序列为对应基因野生型序列。
[0126] 结果显示，本发明所述gRNA能同时高效识别猪APOE和LDLR基因第二外显子，在CAS9酶作用下实现准确切割，其中CAS9/U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1系统对猪APOE/LDLR两个基因同时完成编辑的双等位基因编辑效率为31％(即猪细胞的两条染色体上的APOE基因均被编辑以及两条染色体上的LDLR基因均被编辑的效率(基因型为APOE-/-/LDLR-/-))；CAS9/U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR2系统对猪APOE/LDLR基因平均双等位基因编辑效率为14％(基因型为APOE-/-/LDLR-/-)。同时获得了携带多种突变类型的LDLR基因与APOE基因均突变的细胞，为后期对猪APOE基因/LDLR基因的突变及功能分析提供了实验基础。
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