[0001] 本
申请要求2016年3月25日提交的序列号为62/313621、2016年3月24日提交的序列号为62/312974和2016年3月28日提交的序列号为62/314366的美国临时申请的优先权，所有这些临时申请通过引用并入本文。
发明领域
[0002] 本发明的领域是改进的基于新表位的免疫
治疗的组合物和方法，特别是涉及用于
癌症治疗的重组病毒治疗剂的制备。
背景技术
[0003] 背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是
现有技术或与当前要求保护的发明相关、或者具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
[0004] 本文中所有出版物和
专利申请均通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。如果所并入的参考中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语的定义，并且不适用参考中的该术语的定义。
[0005] 靶向某些特定癌症常见的
抗原的
癌症免疫疗法在一些患者中已引起了显著响应。令人遗憾的是，尽管看似表达相同的抗原，但许多患者未能对这种免疫疗法产生响应。这种失败的一个可能原因可能是免疫系统的各种效应细胞可能已经不以足够的量存在，或者可能已经耗尽。此外，患者中的细胞内抗原加工和HLA变异性可能已经导致了抗原和/或抗原展示的不充分加工，从而导致治疗无效或没有响应。
[0006] 为了增加免疫治疗靶标的选择，最近已经考虑了随机突变，因为
肿瘤细胞中的一些随机突变可能产生独特的肿瘤特异性抗原(新表位)。因此，至少在概念上，新表位可以为免疫疗法提供独特的精确靶标。另外，已经显示出溶细胞性T细胞应答可以由非常少量的肽触发(例如，Sykulev等人，Immunity，第4卷，第6期，第565至571页，1996年6月1日)。此外，由于许多癌症中相对大量的突变，因此可能的靶标数量相对较高。鉴于这些发现，作为治疗靶标的癌症新表位的
鉴别引起了广泛关注。令人遗憾的是，目前的数据似乎表明所有或几乎所有癌症新表位对于患者和特定肿瘤是独特的，并且无法提供关于哪种新表位可用于在治疗上有效的免疫治疗剂的任何具体指示。
[0007] 为了克服与大量用于免疫治疗的可能靶标相关的至少一些问题，可以针对突变类型(例如，以确定错义突变或无义突变)、针对转录
水平以确认突变基因的转录并确认蛋白表达，从而筛选(fitler)新表位。此外，如WO 2016/172722中所述，可以针对与患者的HLA系统特异性结合来进一步分析如此筛选的新表位。虽然这种系统有利地减少了相对大量的潜在新表位，但这些新表位对于治疗结果的重要性仍不明确。更进一步地，尤其是在抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)中表达多种肽的情况下，为产生新表位而进行的前体蛋白的加工仍未被完全理解，因此导致了治疗成功的不可预测性。
[0008] 因此，尽管本领域中已知多种鉴别新表位和向各种细胞递送新表位的方法，但是这些方法中的全部或几乎全部仍存在各种缺点。因此，期望具有用于新表位选择和产生、增加免疫疗法中治疗响应可能性的改进系统和方法。
发明内容
[0009] 本发明的主题涉及各种免疫治疗组合物和方法，尤其是重组病毒表达系统，其中组合了多个
选定的新表位以形成合理设计的多肽，该多肽具有运输
信号以增加抗原加工和呈递从而使治疗效果最大化。
[0010] 在本发明主题的一个方面，
发明人考虑了产生用于免疫治疗的表达载体的方法。在优选的方面，此类方法包括构建重组核酸的步骤，该重组核酸具有编码多表位的序列，该多表位与驱动多表位表达的启动子可操作地连接，其中多表位包含多个被筛选的新表位序列。最典型地，多表位包括一个或多于一个的运输元件(trafficking element)以将所表达的多表位引导至特定的亚细胞
位置，例如
细胞质、蛋白酶体、再循环内体、分选内体、溶酶体或细胞外膜。或者，运输元件也可以将多表位引导至细胞外空间以进行分泌。
[0011] 最优选地，病毒表达载体是缺失E1和E2b基因的腺病毒表达载体，并且启动子是组成型启动子。或者，启动子也可以是诱导型启动子，尤其在肿瘤微环境中常见的条件下是可诱导的。因此，合适的启动子可以由缺
氧、IFN-γ、和/或IL-8诱导。
[0012] 关于适当的运输元件，考虑所有已知的运输元件都是合适的，然而，优选的运输元件包括可切割泛素、不可切割泛素、CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾和LAMP1-跨膜序列。此外，考虑通过比较同一患者的肿瘤与匹配的正常组织，通过确定对MHC
复合体具有等于或小于200nM的结合亲和
力来对被筛选的新表位序列进行筛选和/或针对已知的人类SNP和
体细胞变异对被筛选的新表位序列进行筛选。
[0013] 进一步考虑被筛选的新表位序列在多表位内具有排列，使得多表位具有低于预定
阈值的疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度。考虑的被筛选的新表位序列可以与MHC-I结合(通常具有小于200nM的亲和力)，同时运输元件将多表位引导至细胞质或蛋白酶体，或者被筛选的新表位序列可以与MHC-I结合(通常具有小于200nM的亲和力)，同时运输元件将多表位引导至再循环内体、分选内体或溶酶体，或者被筛选的新表位序列可以与MHC-II结合(通常具有小于200nM的亲和力)，同时运输元件将多表位引导至再循环内体、分选内体或溶酶体。
[0014] 在更进一步考虑的方面，重组核酸还可以包含编码第二多表位的序列，其中第二多表位包含将该第二多表位引导至不同的亚细胞位置的第二运输元件，并且其中第二多表位包含第二多个被筛选的新表位序列(例如，多个被筛选的新表位序列中的至少一些与第二多个被筛选的新表位序列中的至少一些是相同的)。
[0015] 需要时，重组核酸还可以包含编码一种或多于一种共刺激分子(例如，CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL、GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1、LFA3)、一种或多于一种免疫刺激细胞因子(例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-15超级激动剂(ALT803)、IL-21、IPS1和LMP1)、和/或一种或多于一种干扰或下调检查点抑制的
蛋白质(例如，CTLA-4、PD-1、TIM1受体、2B4、或CD160的
抗体或拮抗剂)的序列。
[0016] 从不同的
角度来看，发明人还考虑了用于免疫治疗的重组表达载体，该重组表达载体包含编码多表位(例如，包含多个被筛选的新表位序列)的序列，该多表位与驱动多表位表达的启动子可操作地连接。最典型地，多表位包含将多表位引导至亚细胞位置(例如，细胞质、再循环内体、分选内体、溶酶体、细胞外膜)的运输元件，或将多表位引导至细胞外空间以分泌多表位的运输元件。
[0017] 优选的重组表达载体是腺病毒表达载体，特别是缺失E1和E2b基因的腺病毒表达载体。这些和其他表达载体可具有组成型启动子或诱导型启动子(优选由缺氧、IFN-γ、或IL-8诱导的启动子)。如上所述，考虑运输元件是可切割泛素、不可切割泛素、CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾、和/或LAMP1-跨膜序列。
[0018] 关于被筛选的新表位序列，考虑通过比较同一患者的肿瘤与匹配的正常组织来对序列进行筛选、筛选出对MHC复合体具有等于或小于200nM的结合亲和力的序列、和/或针对已知的人类SNP和体细胞变异进行筛选。此外，被筛选的新表位序列优选地在多表位内具有排列，使得多表位具有低于预定阈值的疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度，从而避免错误引导多表位。
[0019] 例如，被筛选的新表位序列可以与MHC-I结合(通常具有小于200nM的亲和力)，同时运输元件将多表位引导至细胞质或蛋白酶体，或者被筛选的新表位可以与MHC-I结合(通常具有小于200nM的亲和力)，同时运输元件将多表位引导至再循环内体、分选内体或溶酶体，或者被筛选的新表位可以与MHC-II结合(通常具有小于200nM的亲和力)并且其中运输元件将多表位引导至再循环内体、分选内体或溶酶体。
[0020] 另外，考虑重组核酸还可以包含编码第二多表位的序列，其中第二多表位包含将第二多表位引导至不同的亚细胞位置的第二运输元件，并且其中第二多表位包含第二多个被筛选的新表位序列。例如，多个被筛选的新表位序列中的至少一些与第二多个被筛选的新表位序列中的至少一些是相同的。需要时，重组核酸还可以包含编码一种或多于一种共刺激分子(例如，CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL、GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1、LFA3)、一种或多于一种免疫刺激细胞因子(例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-15超级激动剂(ALT803)、IL-21、IPS1和LMP1)、和/或一种或多于一种干扰或下调检查点抑制的蛋白质(例如，CTLA-4、PD-1、TIM1受体、2B4、或CD160的抗体或拮抗剂)的序列。
[0021] 因此，发明人还考虑了包含如本文所述的重组载体的重组病毒。最典型地，该病毒是复制
缺陷型病毒(例如腺病毒，优选缺失E1和E2b基因的腺病毒)。然后可将此类病毒包含在通常配制用于注射或鼻内施用的药物组合物中。不限于本发明的主题，这种重组病毒可以用于治疗癌症、和/或用于制备治疗癌症的药物。
[0022] 因此，发明人还考虑了治疗个体的方法，该方法通常包括用重组病毒
转染个体细胞的步骤，其中重组病毒包含编码多表位的序列，该多表位与驱动多表位在细胞中表达的启动子可操作地连接。多表位包含将多表位引导至的亚细胞位置的运输元件或将多表位引导至细胞外空间的运输元件，该亚细胞位置选自细胞质、再循环内体、分选内体、溶酶体和细胞外膜。最典型地，这种方法中的多表位包含多个被筛选的新表位序列。
[0023] 对于重组病毒、启动子、运输元件和被筛选的新表位序列，适用与上述相同的考虑方案。如上所述，考虑重组核酸还可以包含编码第二多表位的序列，其中第二多表位包含将第二多表位引导至不同的亚细胞位置的第二运输元件，并且其中第二多表位包含第二多个被筛选的新表位序列。
[0024] 在进一步考虑的方法中，可以包括用第二重组病毒转染个体的另一细胞的步骤，其中第二重组病毒包含编码第二多表位的第二序列，该第二多表位与驱动第二多表位在另一细胞中表达的启动子可操作地连接，其中第二多表位包含第二运输元件，该第二运输元件将多表位引导至第二亚细胞位置，该第二亚细胞位置选自细胞质、再循环内体、分选内体、溶酶体和细胞外膜，或其中运输元件将多表位引导至细胞外空间，并且其中亚细胞位置和第二亚细胞位置是不同的，并且其中第二多表位包含第二多个被筛选的新表位序列。例如，多个被筛选的新表位序列中的至少一些与第二多个被筛选的新表位序列中的一些可以是相同的。
[0025] 这些方法中考虑的重组病毒还可以包含编码一种或多于一种共刺激分子(例如，CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL、GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1、LFA3)、一种或多于一种免疫刺激细胞因子(例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-15超级激动剂(ALT803)、IL-21、IPS1和LMP1)、和/或一种或多于一种干扰或下调检查点抑制的蛋白质(例如，CTLA-4、PD-1、TIM1受体、2B4、或CD160的抗体或拮抗剂)的序列。
[0026] 从另一个角度来看，发明人还考虑了使针对个体中新表位的免疫应答朝CD4+偏倚免疫应答偏倚的方法。这种方法将通常包括用重组病毒转染个体细胞的步骤，其中重组病毒包含编码多表位的序列，该多表位与驱动多表位在细胞中表达的启动子可操作地连接，其中多表位包含新表位。最典型地，多表位包含将多表位引导至亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自再循环内体、分选内体和溶酶体。在进一步的步骤中，由所述
序列表达多表位，运输多表位并对多表位进行蛋白
水解加工，以在MHC-II复合体上呈递新表位，从而刺激CD4+T细胞。
[0027] 可以计算适合与MHC-I结合(通常具有小于200nM的亲和力)或与MHC-II结合(通常具有小于200nM的亲和力)的新表位，和/或合适的运输元件包含CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾、和LAMP1-跨膜序列。如上所述，重组病毒还可以包含编码共刺激分子、免疫刺激细胞因子、和干扰或下调检查点抑制的蛋白质中的至少一种的序列。
[0028] 同样地，发明人还考虑了使针对个体中新表位的免疫应答朝CD8+偏倚免疫应答偏倚的方法。这种方法将通常包括用重组病毒转染个体细胞的步骤，其中重组病毒包含编码多表位的序列，该多表位与驱动多表位在细胞中表达的启动子可操作地连接，其中多表位包含新表位。最典型地，多表位包含将多表位引导至蛋白酶体的运输元件。在进一步的步骤中，由所述序列表达多表位，运输多表位并对多表位进行蛋白水解加工，以在MHC-I复合体上呈递新表位，从而刺激CD8+T细胞。
[0029] 可以计算适合与MHC-I结合(通常具有小于200nM的亲和力)或与MHC-II结合(通常具有小于200nM的亲和力)的新表位，和/或合适的运输元件包含CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾、和LAMP1-跨膜序列。如上所述，重组病毒还可以包含编码共刺激分子、免疫刺激细胞因子、和干扰或下调检查点抑制的蛋白质中的至少一种的序列。
[0030] 在本发明主题的另一个方面，发明人考虑了产生用于免疫疗法的多表位的方法。这种方法优选包括获得多个新表位序列并产生一组多表位序列的步骤，每个多表位序列具有多个新表位序列的不同线性排列。在另一个步骤中，对于每个多表位序列计算得分，该得分代表疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度，并且在另一个步骤中，使用该得分对多表位序列进行评级。然后基于该评级来选择多个新表位序列的线性排列。
[0031] 最优选地，使用权重矩阵和神经网络预测中的至少一种来计算得分，和/或通过MHC结合强度、已知的人类SNP和体细胞变异、以及比较同一患者的肿瘤与匹配的正常组织中的至少一种来筛选新表位序列。通常，每个多表位序列包含至少五个新表位序列。
[0032] 根据以下优选实施方案的详细描述以及
附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，附图中相同的附图标记表示相同的组分。
附图说明
[0033] 图1是各种新表位排列的示意图。
[0034] 图2是选择新表位的优选排列的示例性局部示意图。
[0035] 现有技术图3是细胞质中的抗原加工和MHC-I呈递的示意图。
[0036] 现有技术图4是溶酶体和内体区室中的抗原加工和MHC-II呈递的示意图。
[0037] 图5A至图5C是细胞质中的I类抗原加工和MHC-I呈递的示例性序列排列。
[0038] 图6A至图6C是细胞质中的I类抗原加工和MHC-II呈递的示例性序列排列。
[0039] 图7A至图7C是细胞质中的II类抗原加工和MHC-II呈递的示例性序列排列。
[0040] 图8是针对B16-F10黑素瘤的示例性的
预防性
疫苗接种方案。
[0041] 图9A至图9C是描绘使用疫苗皮下注射的抗肿瘤疫苗接种的示例性结果的图。
[0042] 图10A至图10C是描绘使用疫苗静脉注射的抗肿瘤疫苗接种的示例性结果的图。
具体实施方式
[0043] 发明人已经发现，通过将所表达的患者特异性和肿瘤特异性新表位靶向至加工和/或特定细胞表面呈递或甚至分泌，可以进一步改善基于新表位的免疫疗法，并且还可以使用检查点抑制、通过细胞因子的免疫刺激、和/或髓源抑制细胞(MDCS)、调节性T细胞(Treg)或M2巨噬细胞的
抑制剂进一步增强基于新表位的疗法。最优选地，这种治疗实体将在体内由重组核酸表达，特别合适的重组核酸包括质粒和病毒核酸。在使用病毒核酸的情况下，特别优选通过用
病毒感染患者或患者细胞来递送核酸。
[0044] 从不同的角度来看，应当理解，本文提供的组合物和方法将包括对患者和患者中的肿瘤具有特异性以允许靶向治疗的一种或多于一种新表位。此外，可以有利地调整这种治疗以实现一种或多于一种特异性免疫反应，包括CD4+偏倚免疫应答、CD8+偏倚免疫应答、抗体偏倚免疫应答、和/或受激免疫应答(例如，减少检查点抑制和/或使用细胞因子激活免疫潜能细胞)。最典型地，这种效果是在源自重组核酸的新表位的环境下实现的。
[0045] 新表位可以表征为在肿瘤细胞中表达的随机突变，该随机突变产生独特的和肿瘤特异性的抗原。因此，从不同的角度来看，可以通过考虑突变的类型(例如，缺失、插入、颠换、转换、易位)和突变的影响(例如，无义、错义、移码等)来鉴别新表位，从而可以作为通过其来消除沉默突变和其他非相关(例如，非表达)突变的内容筛选器(content filter)。还应理解，新表位序列可以定义为长度相对较短的序列段(例如，8mer至12mer或14mer至20mer)，其中这样的段将包括
氨基酸序列中的改变。最典型但非必要地，改变的氨基酸将位于中心氨基酸位置处或位于其附近。例如，典型的新表位可具有A4-N-A4、或A3-N-A5、或A2-N-A7、或A5-N-A3、或A7-N-A2的结构，其中A是蛋白原性野生型或正常(即，来自同一患者的相应健康组织)氨基酸，N是改变的氨基酸(相对于野生型或相对于匹配的正常型而言)。因此，本文考虑的新表位序列包括长度相对较短的序列段(例如，5mer至30mer，更通常8mer至
12mer、或14mer至20mer)，其中这样的段包括氨基酸序列中的改变。需要时，可以在改变的氨基酸的上游或下游放置额外的氨基酸，例如，以允许在细胞的各种区室中进行额外的抗原加工(例如，用于胞质溶胶中的蛋白酶体加工，或内体和/或溶酶体区室中的特异性蛋白酶加工)。
[0046] 因此，应当理解，根据所改变的氨基酸的位置，可以在包含改变的氨基酸的许多新表位序列中呈现单个氨基酸改变。有利地，这种序列可变性允许新表位的多种选择，并且因此增加潜在有用的靶标的数量，然后可以基于一种或多于一种期望特性(例如，对患者HLA类型的最高亲和力、最高结构
稳定性等)来选择该靶标。最典型地，经计算，新表位的长度为2至50个氨基酸，更通常为5至30个氨基酸，最通常为8至12个氨基酸、或14至20个氨基酸，同时所改变的氨基酸优选位于中心位置或以改善其与MHC的结合的方式
定位。例如，当由MHC-I复合体呈递表位时，典型的新表位长度将为约8至12个氨基酸，而通过MHC-II复合体呈递的典型新表位的长度将为约14至20个氨基酸。如将容易理解的，由于所改变的氨基酸在新表位中的位置可能不是中心位置，因此实际的肽序列和新表位的实际拓扑结构可能有很大差异，并且具有期望的对MHC-I或MHC-II呈递的结合亲和力的和/或具有期望的蛋白酶加工的新表位序列通常将决定特定序列。
[0047] 当然，应当理解，新表位的鉴别或发现可以从各种
生物材料开始，包括新鲜活检、冷冻、或其他方式保存的组织或细胞样品、循环肿瘤细胞、外排体、各种体液(尤其是血液)等。因此，合适的组学分析方法包括核酸测序，特别是对DNA操作的NGS方法(例如，Illumina测序、离子流测序、454焦
磷酸测序、纳米孔测序等)、RNA测序(例如RNAseq、基于逆转录的测序等，以及在一些情况下的蛋白质测序或基于质谱的测序(例如，SRM、MRM、CRM等)。
[0048] 因此，特别是对于基于核酸的测序，应特别认识到肿瘤组织的高通量基因组测序将允许新表位的快速鉴别。然而，必须理解的是，在将如此获得的序列信息与标准参考进行比较的情况下，正常发生的患者间变异(例如，由于SNP、短的插入缺失、不同重复数目等所致)以及杂合性将导致相对大量的潜在
假阳性新表位。值得注意的是，在将患者的肿瘤样品与同一患者的匹配的正常(即，非肿瘤)样品进行比较的情况下，可以消除这种不准确性。
[0049] 在本发明主题的一个特别优选的方面，通过肿瘤和匹配的正常样品的全基因组测序和/或外显子组测序(通常在至少10x、更通常至少20x的
覆盖深度)来进行DNA分析。或者，DNA数据也可以由来自同一患者的先前序列测定的已建立序列记录(例如，SAM、BAM、FASTA、FASTQ或VCF文件)提供。因此，适用于本文的数据集包括未处理或已处理的数据集，示例性的优选数据集包括具有BAM格式、SAM格式、GAR格式、FASTQ格式或FASTA格式的数据集，以及BAMBAM、SAMBAM和VCF数据集。然而，特别优选的是，数据集以BAM格式或BAMBAM diff对象提供，如US2012/0059670A1和US2012/0066001A1中所述。此外，应当注意，数据集反映了同一患者的肿瘤和匹配的正常样品。因此，可以排除不产生肿瘤的遗传种系改变(例如，沉默突变、SNP等)。当然，应该认识到肿瘤样品可以来自初始肿瘤、来自治疗初期的肿瘤、来自复发性肿瘤和/或转移部位等。在大多数情况下，患者的匹配正常样品是血液、或来自与该肿瘤相同组织类型的非患病组织。
[0050] 同样，可以以多种方式进行序列数据的计算分析。然而，在最优选的方法中，经由计算机通过肿瘤和正常样品的位置导向的同步比对进行分析，例如，在US2012/0059670和US2012/0066001中公开的使用BAM文件和BAM
服务器。这种分析有利地减少了假阳性新表位并显著降低了对
存储器和计算资源的需求。
[0051] 应当注意，应该读取针对计算机的任何语言以包括任何合适的计算装置的组合，计算装置包括服务器、
接口、系统、
数据库、代理、对等、引擎、
控制器或单独或共同操作的其他类型的计算装置。应当理解，计算装置包括处理器，该处理器被配置为执行存储在有形的、非暂时性计算机可读存储介质(例如，
硬盘驱动器、固态驱动器、RAM、闪存、ROM等)上的
软件指令。软件指令优选地将计算装置配置为提供任务、职责或其他功能，如下面关于所公开装置的讨论。此外，所公开的技术可以体现为
计算机程序产品，该计算机程序产品包括存储软件指令的非暂时性计算机可读介质，该软件指令命令处理器执行与基于计算机的
算法、
进程、方法或其他指令的实现相关联的所公开的步骤。在特别优选的实施方案中，各种服务器、系统、数据库或接口使用标准化协议或算法交换数据，该标准化协议或算法可能基于HTTP、HTTPS、AES、公钥-私钥交换、web服务API、已知金融交易协议或其他
电子信息交换方法。装置之间的数据交换可以通过分组交换网、因特网、LAN、WAN、VPN或其他类型的分组交换网；
电路交换网；单元交换网；或其他类型的网络来进行。
[0052] 从不同的角度来看，可以建立经由计算机模拟的患者特异性和癌症特异性序列集合，该序列编码具有预定长度如5至25个氨基酸的新表位并且包括至少一个改变的氨基酸。对于每个改变的氨基酸，这种集合通常将包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个成员，其中改变的氨基酸的位置不相同。这种集合有利地增加了适合免疫治疗的潜在候选分子，然后可用于进一步的筛选(例如，通过亚细胞位置、转录/表达水平、MHC-I和/或MHC-II亲和力等)，如下更详细地描述。
[0053] 例如，使用对肿瘤和匹配的正常序列数据的同步位置导向分析，发明人之前鉴别了来自各种癌症和患者的各种癌症新表位，其包括以下癌症类型：BLCA、BRCA、CESC、COAD、DLBC、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PRAD、READ、SARC、SKCM、STAD、THCA、和UCEC。这些癌症的示例性新表位数据可以在
国际申请PCT/US16/29244中找到，该申请通过引用并入本文。
[0054] 根据癌症的类型和阶段以及患者的免疫状态，应该认识到并非所有鉴别出的新表位都将必然在患者中产生治疗上同等有效的反应。实际上，本领域众所周知的是，只有一小部分新表位会产生免疫应答。为了增加治疗上期望应答的可能性，可以进一步筛选最初鉴别出的新表位。当然，应当理解的是，为了本文所提供方法的目的，下游分析不需要考虑沉默突变。然而，优选的突变分析除了特定类型的突变(例如，缺失、插入、颠换、转换、易位)之外还将提供突变影响的信息(例如，无义、错义等)并且可以因此用作通过其来消除沉默突变的第一内容筛选器。例如，可以选择新表位用于进一步考虑，其中突变是移码、无义和/或错义突变。
[0055] 在进一步的筛选方法中，也可以对新表位进行亚细胞位置参数的详细分析。例如，如果新表位被鉴别为具有膜相关位置(例如，位于细胞的细胞膜外侧)和/或如果经由计算机模拟的结构计算确认新表位可能暴露于
溶剂或是呈现结构上稳定的表位(例如，J Exp Med 2014)等，则可以选择该新表位序列用于进一步考虑。
[0056] 关于筛选新表位，通常考虑，当组学(或其他)分析显示出新表位得到实际表达时新表位特别适用于本文。可以以本领域已知的所有方式鉴别新表位的表达和表达水平，优选的方法包括定量RNA(hnRNA或mRNA)分析和/或定量蛋白质组学分析。最典型地，引入新表位的阈值水平将是相应的匹配正常序列的表达水平的至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的表达水平，从而确保(新)表位对免疫系统至少是潜在“可见的”。因此，通常优选组学分析还包括基因表达分析(转录组学分析)，以帮助鉴别具有突变的基因的表达水平。
[0057] 本领域有许多已知的转录组学分析方法，并且认为所有已知方法都适用于本文。例如，优选的材料包括mRNA和初级转录物(hnRNA)，并且RNA序列信息可以从逆转录的polyA+-RNA获得，该polyA+-RNA从肿瘤样品和匹配的同一患者的正常(健康)样品获得。同样地，应当注意，虽然polyA+-RNA通常优选作为转录物组的代表，但其他形式的RNA(hn-RNA、无多聚腺苷酸的RNA、siRNA、miRNA等)也被认为适用于本文。优选的方法包括定量RNA(hnRNA或mRNA)分析和/或定量蛋白质组学分析，尤其包括RNAseq。在其他方面，使用基于RNAseq、qPCR和/或rtPCR的方法进行RNA定量和测序，但各种替代方法(例如，基于固相杂交的方法)也被认为是合适的。从另一个角度来看，转录组学分析可以适合(单独或与基因组分析组合)用于对具有癌症特异性和患者特异性突变的基因进行鉴别和定量。
[0058] 类似地，可以以多种方式进行蛋白质组学分析以确定新表位的RNA的实际翻译，并且本文考虑了所有已知的蛋白质组学分析方式。然而，特别优选的蛋白质组学方法包括基于抗体的方法和质谱法。此外，应当注意，蛋白质组学分析不仅可以提供关于蛋白质本身的定性或定量信息，还可以包括蛋白质是否具有催化或其他功能活性的蛋白质活性数据。一种用于进行蛋白质组学测定的示例性技术描述于US 7473532中，其通过引用并入本文。对蛋白质表达进行鉴别甚至定量的其他合适的方法包括各种质谱分析(例如，选择性反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)和连续反应监测(CRM))。因此，应当理解，上述方法将提供患者和肿瘤特异性新表位，该新表位可以通过含有该新表位的蛋白质的亚细胞位置(例如，膜位置)、表达强度(例如，与匹配的同一患者的正常样品相比过表达)等被进一步筛选。
[0059] 在筛选的另一个方面，可以将新表位与包含已知人序列(例如，患者或患者集合)的数据库进行比较，以避免使用与人相同的序列。此外，筛选还可以包括去除由于患者中的SNP引起的新表位序列，其中SNP存在于肿瘤和匹配的正常序列中。例如，dbSNP(单核苷酸多态性数据库)是由国家生物技术信息中心(NCBI)与国家人类基因组研究所(NHGRI)合作开发和主办的关于不同物种内和不同物种间的遗传变异的免费公共档案。虽然数据库的名称仅表示一类多态性的集合(单核苷酸多态性(SNP))，但它实际上包含相对广泛的分子变异：(1)SNP、(2)短的缺失和插入多态性(插入缺失/DIP)、(3)微卫星标记或短
串联重复序列(STR)、(4)多核苷酸多态性(MNP)、(5)杂合序列、和(6)
指定的变体。dbSNP接受明显中性的多态性、对应于已知表型的多态性和无变异的区域。利用如上所述的这种数据库和其他筛选选项，可以筛选患者和肿瘤特异性新表位以除去那些已知序列，从而产生具有多个假阳性显著减少的新表位序列的序列集。
[0060] 一旦达到新表位的期望筛选水平(例如，通过比较肿瘤与正常组织、和/或表达水平、和/或亚细胞位置、和/或患者特异性HLA匹配、和/或已知变体来筛选的新表位)，则考虑进一步的筛选步骤，该步骤考虑了受新表位影响的基因类型。例如，合适的基因类型包括癌症驱动基因、与细胞分裂调节相关的基因、与细胞凋亡相关的基因和与信号转导相关的基因。然而，在特别优选的方面，癌症驱动基因是特别优选的(癌症驱动基因在功能上可以涵盖多种基因类型，包括受体基因、信号转导基因、转录调节基因等)。在进一步考虑的方面，合适的基因类型也可以是已知的过客基因(passenger gene)和参与代谢的基因。
[0061] 关于作为癌症驱动基因的基因的鉴别或其他确定(例如，预测)，各种方法和预测算法是本领域已知的，并且被认为适用于本文。例如，合适的算法包括MutsigCV(Nature 2014，505(7484)：495-501)、ActiveDriver(Mol Syst Biol 2013，9：637)、MuSiC(Genome Res 2012，22(8)：1589-1598)、OncodriveClust(Bioinformatics 2013，29(18)：2238-
2244)、OncodriveFM(Nucleic Acids Res 2012，40(21)：e169)、OncodriveFML(Genome Biol 2016，17(1)：128)、Tumor Suppressor and Oncogenes(TUSON)(Cell 2013，155(4)：
948-962)、20/20+(https：//github.com/KarchinLab/2020plus)、和oncodriveROLE(Bioinformatics(2014)30(17)：i549-i555)。替代地或另外地，癌症驱动基因的鉴别还可以采用已知癌症驱动基因的各种来源及其与特定癌症的关联。例如，驱动突变的Intogen目录(2016.5；URL：www.intogen.org)包含通过癌症基因组解释器(Cancer Genome
Interpreter)在28种肿瘤类型的泛癌组群的6792个外显子组中进行的驱动分析的结果。
[0062] 然而，尽管进行了筛选，但应该认识到并非所有新表位都对免疫系统可见，因为新表位还需要在存在于更大的环境(例如，在多表位内)的情况下被加工并且在患者的MHC复合体上呈递。在这种情况下，必须认识到，只有一部分新表位将具有足够的用于呈递的亲和力。因此，特别是在免疫治疗的环境下，显而易见的是，新表位在被适当地加工、与MHC复合体结合并由MHC复合体呈递的情况下更可能是有效的。从另一个角度来看，随着可通过MHC复合体呈递的新表位的数量增加，治疗成功率将增加，其中这种新表位对患者的HLA类型具有最小亲和力。因此，应当理解的是，有效结合和呈递是新表位序列和患者的特定HLA类型的组合功能。因此，通常需要确定患者组织的HLA类型。最典型地，HLA类型的确定包括至少三种MHC-I亚型(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C)和至少三种MHC-II亚型(例如，HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR)，优选地，每种亚型被确定达到至少2位数或至少4位数深度。然而，也可以考虑更大的深度(例如，6位数、8位数)。
[0063] 一旦确定了患者的HLA类型(使用已知的化学或计算机模拟确定)，就从数据库计算和/或获得HLA类型的结构解，然后将其用于经由计算机模拟的对接模型中以确定(通常被筛选的)新表位与HLA结构解的结合亲和力。如下面将进一步讨论的，适合于确定结合亲和力的系统包括NetMHC平台(参见例如，Nucleic Acids Res.2008年7月1日；36(Web Server issue)：W509-W512)。然后，结合对患者MHC-I/II亚型的认识，选择对预先确定的HLA类型具有高亲和力(例如，小于100nM、小于75nM、小于50nM)的新表位以用于疗法创建。
[0064] 可以使用本领域熟知的湿化学中的各种方法进行HLA确定，并且认为所有这些方法都适用于本文。然而，在特别优选的方法中，还可以使用包含大多数或所有已知和/或常见HLA类型的参考序列经由计算机模拟由组学数据预测HLA类型。例如，在根据本发明主题的一种优选方法中，通过数据库或测序仪提供相对大量的映射到
染色体6p21.3(或发现HLA等位基因的任何其他位置或该位置附近)的患者序列读取。最典型地，序列读取将具有约100至300个
碱基的长度并且包括元数据，该元数据包括读取
质量、比对信息、取向、位置等。
例如，合适的格式包括SAM、BAM、FASTA、GAR等。不限于本发明的主题，通常优选的是患者序列读取提供至少5x、更通常至少10x、甚至更通常至少20x、最通常至少30x的覆盖深度。
[0065] 除了患者序列读取之外，所考虑的方法还使用包括多种已知且不同的HLA等位基因序列的一种或多于一种参考序列。例如，典型的参考序列可以是合成(没有相应的人或其他
哺乳动物对应物)序列，该合成序列包括具有HLA类型的多种HLA等位基因的至少一种HLA类型的序列区段。例如，合适的参考序列包括HLA-A的至少50种不同等位基因的已知基因组序列的集合。替代地或另外地，参考序列还可以包括HLA-A的至少50种不同等位基因的已知RNA序列的集合。当然，如下文进一步更详细讨论的，参考序列不限于HLA-A的50种等位基因，而是可以具有关于HLA类型和等位基因的数量/组成的替代组成。最典型地，参考序列将是计算机可读格式，并且将由数据库或其他数据存储装置提供。例如，合适的参考序列格式包括FASTA、FASTQ、EMBL、GCG、或GenBank格式，并且可以直接从公共数据储库(例如，IMGT，国际免疫遗传学信息系统，或等位基因
频率网络数据库，EUROSTAM，URL：www.allelefrequencies.net)的数据中获得或构建。或者，参考序列也可以基于一种或多于一种预定标准，例如等位基因频率、种族等位基因分布、常见或稀有等位基因类型等由个体已知的HLA等位基因构建。
[0066] 使用参考序列，患者序列读取现在可以穿过de Bruijn图以鉴别具有最佳拟合的等位基因。在这种情况下，应当注意，每个个体携带每种HLA类型的两个等位基因，并且这些等位基因可能非常相似，或者在某些情况下甚至是相同的。这种高度相似性使传统的对比方案遇到了重大问题。发明人现在已经发现，可以使用构建de Bruijn图的方法来解析HLA等位基因和甚至非常密切相关的等位基因，该方法通过将序列读取分解成相对小的k-mer(通常具有10至20个碱基的长度)并通过实施加权投票过程来进行，在所述加权投票过程中每个患者序列读取基于与等位基因序列匹配的序列读取的k-mer为每个等位基因提供投票(“定量读取支持”)。然后，等位基因的累积最高投票指示最可能被预测的HLA等位基因。另外，通常优选的是，与等位基因匹配的每个
片段也用于计算该等位基因的总覆盖度和覆盖深度。
[0067] 可以根据需要对评分进行进一步改进或细化，尤其是在许多最高匹配(hit)相似的情况下(例如，在其得分的很大一部分来自高度共享的k-mer组的情况下)。例如，得分细化可以包括加权方案，其中将与当前最高匹配基本上相似(例如，＞99％或其他预定值)的等位基因从未来考虑中移除。然后通过因数(例如，0.5)对当前最高匹配所使用的k-mer的计数进行重新加权，并且通过对这些加权计数求和来重新计算每个HLA等位基因的得分。重复该选择过程以找到新的最高匹配。使用允许鉴别由肿瘤表达的等位基因的RNA序列数据可以更进一步提高该方法的准确性，该等位基因有时可以仅是DNA中存在的2个等位基因中的1个。在所考虑系统和方法的进一步有利的方面，可以处理DNA或RNA、或DNA和RNA的组合以进行高度准确的HLA预测，并且DNA或RNA、或DNA和RNA的组合可以来源于肿瘤或血液DNA或RNA。在进一步的方面，用于高精确度计算机模拟HLA分型的合适方法和考虑因素描述于WO 2017/035392中，其通过引用并入本文。
[0068] 一旦鉴别出患者特异性和肿瘤特异性新表位以及HLA类型，可以通过计算机模拟例如使用NetMHC将新表位与HLA对接并确定最佳结合物(例如，最低KD，例如，小于500nM、或小于250nM、小于150nM、或小于50nM)从而进行进一步的计算分析。应当理解，这种方法不仅将鉴别出对患者和肿瘤而言真正的特异性新表位，而且还鉴别出最可能在细胞上呈递并因此最可能引起具有治疗效果的免疫应答的那些新表位。当然，还应当理解，在将编码表位的核酸作为有效负载引入病毒中之前，可以在体外对所鉴别的HLA匹配的新表位进行生物化学验证，如下面进一步讨论。
[0069] 当然，应当理解，可以使用除NetMHC之外的系统来进行患者的HLA类型与患者特异性和癌症特异性新表位的匹配，并且合适的系统包括NetMHC II、NetMHCpan、IEDB分析资源(URL immuneepitope.org)、RankPep、PREDEP、SVMHC、Epipredict、HLABinding等(参见例如J Immunol Methods 2011；374：1-4)。在计算最高亲和力时，应当注意，可以使用其中所改变氨基酸的位置被移动的新表位序列的集合(同上)。替代地或另外地，可以通过添加N末端和/或C末端修饰来实现对新表位的修饰，以进一步增加所表达的新表位与患者的HLA类型的结合。因此，新表位可以是如所鉴别出的天然的，或进一步修饰以更好地匹配特定的HLA类型。此外，如果需要，可以计算相应野生型序列(即没有氨基酸改变的新表位序列)的结合，以确保高的差异亲和力。例如，MHC对新表位的结合亲和力与MHC对该新表位相应的野生型序列的结合亲和力的特别优选的高差异为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍等。
[0070] 也可以使用各种系统和方法在体外确定结合亲和力，特别是差异结合亲和力。例如，可以用核酸(例如，病毒、质粒、线性DNA、RNA等)转染患者的抗原呈递细胞或具有匹配的HLA类型的细胞，以使用如下更详细描述的构建体表达一种或多于一种新表位。经表达和抗原加工后，可以使用针对新表位的特异性结合物或者使用基于细胞的系统(例如，患者的PBMC)在细胞外侧的MHC复合体中鉴别新表位，在所述系统中可以在体外观察T细胞活化或细胞毒性NK细胞活性。然后将选择具有差异活性的新表位(与相应的野生型表位相比引发更强的信号或免疫应答)以用于疗法创建。
[0071] 在鉴别出期望的新表位后，可以使用新表位的序列信息制备一种或多于一种免疫治疗剂。在其他药剂中，特别优选的是，可以用如下进一步讨论的经核酸构建体遗传修饰的病毒来治疗患者，该核酸构建体导致所鉴别的新表位中的至少一种的表达以引发对肿瘤的免疫应答。例如，合适的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、α病毒、疱疹病毒、慢病毒等。然而，特别优选腺病毒。此外，进一步优选病毒是复制缺陷型和非免疫原性病毒，其通常通过所选病毒蛋白(例如E1、E3蛋白)的靶向缺失来实现。通过删除E2b基因功能可以进一步增强这种期望的性质，并且如最近所报道的，使用经遗传修饰的人293细胞可以实现高滴度的重组病毒(例如，J Virol.1998年2月；72(2)：926-933)。
[0072] 不管重组病毒的类型如何，考虑病毒可用于离体或体内感染患者(或非患者)细胞。例如，可以皮下或静脉内注射病毒，或者可以鼻内或通过吸入施用病毒以感染患者细胞，尤其是抗原呈递细胞。或者，可以在体外感染患者(或来自同种异体来源)的免疫潜能细胞(例如，NK细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)，然后将其输注给患者。或者，免疫治疗不需要依赖病毒，而可以使用RNA或DNA进行核酸转染或疫苗接种，或使用导致新表位在期望细胞、尤其是免疫潜能细胞中表达(例如，作为单肽、串联小基因等)的其他重组载体，从而实现免疫治疗。
[0073] 最典型地，期望的核酸序列(用以从病毒感染的细胞表达)处于本领域熟知的适当的调节元件的控制之下。例如，合适的启动子元件包括组成型强启动子(例如，SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK、CAGG启动子)，但诱导型启动子也被认为适用于本文，特别是在诱导条件是肿瘤微环境的典型诱导条件的情况下。例如，诱导型启动子包括对缺氧敏感的启动子和对TGF-β或IL-8敏感的启动子(例如，通过TRAF、JNK、Erk、或其他响应元件启动子)。在其他实例中，合适的诱导型启动子包括
四环素诱导型启动子、粘病毒抵抗基因1(Mx1)启动子等。
[0074] 在这种情况下，应当理解，发明人已经发现新表位排列的方式和合理设计的新表位运输可以对各种免疫治疗组合物的功效产生实质性影响。例如，单个新表位可以由作为单个质粒、病毒表达构建体等递送的对应重组构建体来单独表达。或者，多个新表位可以由形成单个mRNA，然后该mRNA单独翻译为对应的新表位的单独启动子分别表达，或者由包含每个新表位序列的单独翻译起始点的单个mRNA(例如，使用2A或IRES信号)分别表达。值得注意的是，虽然通常认为这种排列允许受控地递送适当的新表位肽，但是这种表达系统的功效并不理想(数据未显示)。
[0075] 相比之下，在由单个转录物表达多个新表位以由此形成单个转录物且随后该单个转录物被翻译成单个多表位(即具有一系列以多联体方式连接的新表位、任选地具有介入的接头序列的多肽)的情况下，表达、加工和抗原呈递被发现是有效的。值得注意的是，多表位的表达需要通过细胞内适当的蛋白酶(例如，蛋白酶体、内体蛋白酶、溶酶体蛋白酶)进行加工以产生新表位序列，并且与各个新表位的表达相比，多表位改善了针对大多数新表位的抗原加工和呈递，特别是在各个新表位的长度相对较短(例如，少于25个氨基酸；结果未显示)的情况下。此外，这种方法还允许在新表位肽序列之间合理设计蛋白酶敏感性序列基序，从而确保或避免被特定蛋白酶加工，因为蛋白酶体、内体蛋白酶和溶酶体蛋白酶具有不同的切割偏好。因此，可以将多表位设计为不仅包括在空间上分离新表位的接头序列，还包括优先被特定蛋白酶切割的序列部分(例如，3至15个氨基酸)。
[0076] 因此，发明人考虑了包含编码多表位的核酸区段的重组核酸和表达载体(例如，病毒表达载体)，其中多表位与期望的启动子元件可操作地偶联，并且其中各个新表位任选地由接头和/或蛋白酶切割或识别序列分开。例如，图1示例性地说明了用于由腺病毒表达系统表达的新表位的各种考虑的排列(这里所用的是缺失E1和E2b基因的AdV5)。在此处，构建体1示例性地示出了包含八个新表位(′小基因′)的新表位排列，其中在多联序列中具有15个氨基酸的总长度并且没有介入的接头序列，而构建体2显示出构建体1的排列，但每个新表位序列之间包含九个氨基酸的接头。当然，如上所述，应该认识到的是，新表位序列的确切长度不限于15个氨基酸，并且确切长度可以显著变化。然而，在大多数情况下，当8至12个氨基酸的新表位序列的侧翼为其他氨基酸时，总长度通常不超过25个氨基酸、或30个氨基酸、或50个氨基酸。同样，应注意，虽然图1指出了G-S接头，但各种其他接头序列也适用于本文。在期望通过MHC-I复合体进行新表位的呈递的情况下，这种相对短的新表位是特别有益的。
[0077] 在该上下文中，应当理解的是，合适的接头序列将提供空间上的柔性和两个相邻新表位的分离。然而，必须当心的是不选择可能具有免疫原性/形成已经存在于患者体内的表位的接头氨基酸。因此，通常优选的是，针对可能见于患者中的表位存在(例如，作为正常序列的一部分或由于SNP或其他序列变异)来再次筛选多表位构建体。这种筛选将应用如上讨论过的相同的技术和标准。
[0078] 类似地，构建体3示例性地说明了在没有介入的接头序列的多联序列中包含八个新表位的新表位排列，且构建体4显示出构建体3的排列，其中每个新表位序列之间包含九个氨基酸的接头。如上所述，应该认识到的是，这种新表位序列的确切长度不限于25个氨基酸，并且确切长度可以显著变化。然而，在大多数情况下，当14至20个氨基酸的新表位序列的侧翼为其他氨基酸时，总长度通常不超过30个氨基酸、或45个氨基酸、或60个氨基酸。同样，应注意的是，虽然图1指出了用于这些构建体的G-S接头，但各种其他接头序列也适用于本文。在期望通过MHC-II复合体进行新表位呈递的情况下，这种相对长的新表位是特别有益的。
[0079] 在该实例中，应当理解，15-aa小基因是MHC I类靶向的肿瘤突变，该突变被选择在任一侧具有7个氨基酸的天然序列；并且25-aa小基因是MHC II类靶向的肿瘤突变，该突变被选择在任一侧具有12个氨基酸的天然序列。示例性的9个氨基酸的接头被视为具有足够的长度，使得在相邻的小基因之间不会形成“非天然的”MHC I类表位。相比单个新表位，多表位序列往往被更有效地被加工和呈递(数据未显示)，并且针对MHC-I呈递超过12个氨基酸的氨基酸添加和针对MHC-I呈递超过20个氨基酸的氨基酸添加似乎允许在一定程度上改善蛋白酶加工。
[0080] 为了使定制的蛋白质序列保留在细胞内以供HLA复合体加工和呈递的可能性最大化，可以以最大限度减少可以将运输引导至细胞膜或细胞外空间中的疏水序列的方式来排列新表位序列。最优选地，通过将序列与加权矩阵进行比较(参见例如，Nucleic Acids Res.1986年6月11日；14(11)：4683-4690)或通过使用神经网络训练含有信号序列的肽(参见例如，Journal of Molecular Biology 2004，第338卷，第5期，1027-1036)来进行疏水序列或信号肽检测。图2描绘了排列选择的示例性方案，其中分析了多个多表位序列。在此处，计算所有新表位的所有位置排列以产生排列集合。然后通过加权矩阵和/或神经网络预测处理该集合，以产生表示疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度的得分。然后根据得分对所有位置排列进行评级，并且使用得分低于疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度的预定阈值或最低得分的排列来构建定制的新表位表达组件。
[0081] 关于多表位中新表位序列的总数，通常优选的是，多表位包含至少两个、或至少三个、或至少五个、或至少八个、或至少十个的新表位序列。实际上，通常认为重组DNA的有效负载能力以及所筛选的适当的新表位的可用性是限制因素。因此，特别优选的是腺病毒表达载体，特别是Adv5，因为这样的载体可以容纳高达14kb的重组有效负载。
[0082] 在本发明主题的更进一步考虑的方面，应当注意，新表位/多表位可以被引导至特定的亚细胞区室(例如，细胞质、内体、溶酶体)，并且利用该特性被引导至特定的MHC呈递类型。这种定向表达、加工和呈递是特别有利的，因为可以制备使免疫应答导向CD8+类型应答(其中多表位被引导至细胞质空间)或导向CD4+类型应答(其中多表位被引导至内体/溶酶体区室)的所考虑组合物。此外，应该认识到，通常通过MHC-I途径呈递的多表位可以通过MHC-II途径呈递(从而模拟新表位的交叉呈递)。因此，应当理解，可以使用合适的序列元件设计新表位和多表位序列并将其引导至MHC呈递途径中的一种或两种。关于将如此表达的新表位引导至期望的MHC系统，应注意MHC-I呈递的肽通常经由蛋白酶体加工而由细胞质产生并通过内质网递送。因此，意图用于MHC-I呈递的表位的表达通常将被导向细胞质，如下更详细地进一步讨论。另一方面，MHC-II呈递的肽通常在递送至细胞膜之前通
过酸性蛋白酶(例如，天冬酰胺内肽酶(legumain)、组织蛋白酶L和组织蛋白酶S)的降解和加工从内体和溶酶体区室产生。
[0083] 此外，考虑还可以使用各种方法增强多表位的蛋白水解降解，并且特别考虑的方法包括向N末端添加可切割或不可切割的泛素部分，和/或在呈递导向MHC-I的多表位的N末端放置一个或多于一个去稳定化的氨基酸(例如，N、K、C、F、E、R、Q)。另一方面，在呈递导向MHC-II的情况下，可以将特定内体或溶酶体蛋白酶的切割位点设计到多表位中以帮助促进抗原加工。
[0084] 因此，在本发明主题考虑的方面，可以使用信号和/或前导肽将新表位和/或多表位运输至内体和溶酶体区室，或将其保留在细胞质空间中。例如，在将多表位输送至内体和溶酶体区室的情况下，可以使用前导肽如CD1b前导肽来保留来自细胞质的(新生)蛋白质。另外地或替代地，可以使用靶向前序列和/或靶向肽。靶向肽的前序列可添加至N末端和/或C末端并且通常包含6至136个碱性疏水氨基酸。在靶向过氧化物酶体的情况下，靶向序列可以在C末端。可以使用其他信号(例如，信号斑)，其包括在肽序列中分开的并且在适当的肽折叠后变得有功能的序列元件。此外，蛋白质修饰如糖基化可以诱导靶向。在其他合适的靶向信号中，发明人考虑了作为C末端三肽的氧化物酶体靶向信号1(PTS1)和作为位于N末端附近的九肽的过氧化物酶体靶向信号2(PTS2)。
[0085] 此外，蛋白质分选至内体和溶酶体也可以通过蛋白质的胞质结构域内的信号来介导，该信号通常包含短的线性序列。一些信号被称为基于酪氨酸的分选信号并且符合NPXY或 共用基序。被称为基于二亮氨酸的信号的其他信号符合[DE]XXXL[LI]或DXXLL共用基序。通过与细胞膜的胞质面外周相关的蛋白质
外壳的组分来识别所有这些信号。通过衔接蛋白(AP)复合体AP-1、AP-2、AP-3、和AP-4以特征性的良好特异性来识别 和
[DE]XXXL[LI]信号，而DXXLL信号被另一个称为GGA的衔接家族识别。还可以添加FYVE结构域，其与液泡蛋白分选和内体功能相关。在更进一步的方面，还可以使用人CD1尾序列靶向内体区室(参见例如，Immunology，122，522-531)。例如，可以使用LAMP1-TM(跨膜)序列实现溶酶体靶向，而可以通过CD1a尾靶向序列靶向再循环内体，并且可以通过CD1c尾靶向序列靶向分选内体，如下进一步更详细所示。
[0086] 在更进一步考虑的方面，多表位还可以设计为嵌合多表位，该嵌合多表位包括至少一部分的、更通常是整个的肿瘤相关抗原(例如，CEA、PSMA、PSA、MUC1、AFP、MAGE、HER2、HCC1、p62、p90等)。最值得注意的是，肿瘤相关抗原通常通过MHC-II途径加工和呈递。因此，代替使用区室特异性信号序列和/或前导序列，可以采用肿瘤相关抗原的加工机制进行MHC-II靶向。
[0087] 运输至细胞质区室或保留在细胞质区室中可能不一定需要一种或多于一种特定序列单元。然而，在至少一些方面，可以添加N末端或C末端细胞质保留信号，其包括膜锚定蛋白或膜锚定蛋白的膜锚定结构域，使得蛋白质面向细胞质保留在细胞中。例如，膜锚定蛋白包括SNAP-25、突触融合蛋白、小突触小泡蛋白、突触结合蛋白、囊泡相关膜蛋白(VAMP)、突触小泡糖蛋白(SV2)、高亲和力胆碱转运蛋白、神经连接蛋白(Neurexin)、
电压门控
钙通道、乙酰胆碱酯酶和NOTCH。
[0088] 在本发明主题的更进一步考虑的方面，多表位还可以包含一个或多于一个跨膜区段，该跨膜区段将加工后的新表位引导至细胞膜外侧，从而使其对免疫潜能细胞可见。本领域中已知许多跨膜结构域，并且认为所有这些跨膜结构域适用于本文，包括具有单个α螺旋、多个α螺旋、α/β折叠桶等的跨膜结构域。例如，考虑的跨膜结构域可以包括T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR或PAG/Cbp的α、β或ζ链的跨膜区。在需要融合蛋白的情况下，考虑重组嵌合基因具有编码跨膜区的第一部分，其中第一部分与编码抑制蛋白的第二部分框内克隆。应当注意，这样的呈递不会导致MHC复合体呈递，并且因此提供不依赖于MHC/T细胞受体相互作用的新表位呈递，这可以进一步打开用于免疫识别的其他途径并触发针对新表位的抗体产生。
[0089] 替代地或另外地，多表位还可以设计为包括信号序列，该信号序列用于一种或多于一种新表位的蛋白质输出，从而使被转染的细胞产生并分泌一种或多于一种新表位。例如，SPARC前导序列可以添加到新表位或多表位序列中，从而导致新表位或多表位序列在体内分泌到细胞外空间中。有利地，随后这种分泌的新表位或多表位被免疫潜能细胞摄入，尤其是被抗原呈递细胞和树突状细胞摄入，这些细胞转而通常经由MHC-II途径加工并展示新表位。
[0090] 替代地或另外地，新表位或多表位也可以作为肽来施用，任选地与载体蛋白结合，从而起到肽疫苗的作用。在其他合适的载体蛋白中，特别优选的是人
白蛋白或乳
铁蛋白。此类载体蛋白可以是天然构象的，或经预处理形成具有暴露的可以与新表位或多表位偶联的疏水结构域的纳米颗粒(参见例如，Adv Protein Chem Struct Biol.2015；98：121-43)。最典型地，新表位或多表位与载体蛋白的偶联将是非共价的。类似于所分泌的新表位或多表位，载体蛋白结合的新表位或多表位将被免疫潜能细胞摄入，尤其是被抗原呈递细胞和树突状细胞摄入，这些细胞转而通常经由MHC-II途径加工并展示新表位。
[0091] 因此，应当理解，可以制备能够将一种或多于一种新表位递送至各种亚细胞位置且同时利用其产生不同免疫应答的免疫治疗组合物。例如，现有技术图3示意性地说明了一个方案，其中多表位主要在细胞质的蛋白酶体中加工并通过MHC-I复合体呈递，该MHC-I复合体由CD8+T细胞的T细胞受体识别。因此，多表位加工靶向细胞质区室将会使免疫应答朝CD8+型应答偏倚。另一方面，现有技术图4示意性地示出了一个方案，其中多表位主要在内体区室中加工并通过MHC-II复合体呈递，该MHC-II复合体由CD4+T细胞的T细胞受体识别。因此，多表位加工靶向内体或溶酶体区室将会使免疫应答朝CD4+型应答偏倚。此外，应当理解，这种靶向方法允许将多表位肽或新表位肽特异性递送至与肽具有最高亲和力的MHC亚型，即使该肽原本不由该MHC亚型呈递。因此，如前所述，用于MHC-I呈递的肽通常将被设计为具有8至12个氨基酸(加上额外的氨基酸以在蛋白酶加工中提供灵活性)，而用于MHC-H呈递的肽将被设计为具有14至20个氨基酸(加上额外的氨基酸以在蛋白酶加工中提供灵活性)。在下面的实例中，添加额外的氨基酸以允许在细胞质、蛋白酶体或内体区室中提供加工灵活性。
[0092] 在本发明主题的更进一步考虑的方面，应当注意，可以组合新表位或多表位的运输模式以适应一个或更多个特定目的。例如，顺序施用具有不同靶向的相同新表位或多表位可能对初次-加强方案特别有益，其中在第一次施用中向患者接种重组病毒以感染患者细胞，从而导致抗原表达、加工、和呈递(例如，主要是MHC-I呈递)，这将导致源自细胞内的第一免疫应答。然后可以采用与白蛋白结合的相同新表位的第二次施用作为加强，因为所递送的蛋白质被抗原呈递细胞摄入，从而在大多数情况下导致不同的抗原呈递(例如，主要是MHC-II呈递)。当相同的新表位或多表位被运输到细胞表面以供细胞表面结合的MHC非依赖性呈递时，可以促进ADCC应答或NK介导的细胞杀伤。在更进一步考虑的方面中，如以下实例中所示，可以通过交叉呈递或MHC-II定向呈递来增强新表位的免疫原性。值得注意的是，由于癌细胞新表位通常是内部产生和再循环的，并且优先通过MHC-I系统呈递，所以考虑的系统和方法目前允许通过MHC-II进行这种新表位的呈递，这些新表位可以更具免疫原性，如下更详细所示。另外，相同新表位或多表位的多次不同的运输可以有利地增加或补充由于细胞和体液免疫系统的各种不同组分的刺激引起的免疫应答。
[0093] 当然，应当理解，可以通过多种方式实现相同新表位或多表位的多次不同的运输。例如，可以使用相同的(例如，病毒表达载体)或不同的(例如，病毒表达载体和结合的白蛋白)方式分别施用按不同方式运输的新表位或多表位。类似地，特别是在治疗剂是表达系统(例如，病毒或细菌)的情况下，重组核酸可以包括对其进行编码的两个不同部分，即使在按不同方式运输的新表位或多表位(例如，第一部分被运输至第一位置(例如，细胞质或内体或溶酶体)，第二部分被运输至第二不同的位置(例如，细胞质或内体或溶酶体、分泌位置、膜结合位置))的情况下也是如此。同样地，第一次施用可以使用病毒来递送细胞质靶向的新表位或多表位，而第二次施用通常在第一次施用后至少一天、两天、四天、一周或两周进行并且可以使用病毒来递送内体或溶酶体靶向的新表位或多表位或分泌的新表位或多表位。
[0094] 另外，考虑表达构建体(例如，重组病毒表达载体或质粒)还可以编码至少一种、更通常至少两种、甚至更通常至少三种、最通常至少四种共刺激分子以增强被感染细胞(例如抗原呈递细胞)和T细胞之间的相互作用。例如，合适的共刺激分子包括CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL，而作用机制不太确定(或理解)的其他刺激分子包括GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1、LFA3和SLAM家族的成员。然而，用于与癌相关序列协同表达的特别优选的分子包括CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD54(ICAM-1)和CD11(LFA-1)。除共刺激分子外，发明人还考虑可以由重组核酸表达一种或多于一种细胞因子或细胞因子类似物，并且特别优选的细胞因子和细胞因子类似物包括IL-2、IL-15和IL-a5超级激动剂(ALT-803)。此外，应当理解，优选共刺激分子和/或细胞因子协同表达，使得新表位或多表位与一种或多于一种共刺激分子和/或细胞因子同时表达。因此，通常考虑由单个转录物(其可以包含或不包含编码多表位的序列部分)，例如使用内部核糖体进入位点或2A序列产生共刺激分子和/或细胞因子，或由多个转录物产生共刺激分子和/或细胞因子。
[0095] 同样地，考虑病毒载体还可以包括编码与检查点受体结合的一种多于一种肽配体的序列部分。最典型地，结合将抑制或至少减少经由受体的信号传导，并且特别考虑的受体+ +包括CTLA-4(特别是针对CD8细胞)、PD-1(特别是针对CD4细胞)、TIM1受体、2B4和CD160。例如，合适的肽结合物可以包括抗体片段且尤其是scFv，还包括特异性结合受体的小分子肽配体(例如，通过RNA展示或
噬菌体淘选而分离)。再次，应当理解的是，优选肽分子协同表达，使得新表位或多表位与一种或多于一种肽配体同时表达。因此，通常考虑由单个转录物(其可以包含或不包含编码多表位的序列部分)，例如使用内部核糖体进入位点或2A序列产生肽配体，或由多个转录物产生肽配体。
[0096] 应当理解，所有上述共刺激基因和编码干扰/下调检查点抑制的抑制蛋白的基因是本领域熟知的，并且可以从各种公共资源检索这些基因、亚型和变体的序列信息，该各种公共资包括可在NCBI、EMBL、GenBank、RefSeq等处获得的序列数据库。此外，尽管上述示例性刺激分子优选以全长形式在人类中表达，但是经修饰形式和非人类形式也被认为是合适的，只要这些形式有助于刺激或激活T细胞即可。因此，本文特别考虑了突变蛋白、截短形式和嵌合形式。
[0097] 因此，所考虑的表达构建体将优选地包括编码一个或多于一个多表位的序列部分，其中至少一个、更通常至少两个、或所有多表位将包含运输信号，该运输信号将使得优先将多表位运输至至少一个、更通常地至少两个不同的亚细胞位置。例如，可以将第一多表位引导至细胞质(并且第一多表位可以包含额外的可切割泛素或不可切割泛素)，而可以将第二多表位引导至内体或溶酶体区室。或者可以将第一多表位引导至内体或溶酶体区室，而可以将第二多表位引导至细胞膜或使其分泌。如前所述，被编码的多表位将包含至少两个新表位，任选地由接头分开。此外，此类考虑的表达构建体还将包括编码一种或多于一种共刺激分子和/或细胞因子的序列部分，并且还可包括干扰/下调检查点抑制的一种或多于一种抑制蛋白。最典型地，表达构建体还将包括与上述序列部分可操作地偶联以驱动多表位和共刺激分子、细胞因子、和/或抑制蛋白的同时表达的调节序列。合适的启动子元件是本领域已知的，特别优选的启动子包括上面讨论的组成型和诱导型启动子。
[0098] 在表达构建体是病毒表达构建体(例如，腺病毒、特别是缺失E1和E2b的AdV)的情况下，考虑然后可以将重组病毒单独地或组合地用作药物组合物中的治疗性疫苗，通常配制成无菌的可注射组合物，其病毒滴度为每剂量单位106至1013个病毒颗粒、更通常为109至1012个病毒颗粒。或者，可以使用病毒来离体感染患者(或其他HLA匹配的)细胞，然后将如此感染的细胞输注给患者。在进一步的实例中，用病毒治疗患者可伴随同种异体移植的或自体的自然杀伤细胞或裸露形式的T细胞或携带嵌合抗原受体的T细胞，该嵌合抗原受体表达靶向新表位、靶向肿瘤相关抗原或靶向与病毒相同的负载的抗体。包括衍生于患者的NK-92细胞系的天然杀伤细胞也可以表达CD16并且可以与抗体偶联。
[0099] 需要时，可以使用可基于新表位的(例如，如WO 2016/172722中所述的针对新表位的合成抗体)其他治疗方式，其单独使用或与自体NK细胞或同种异体NK细胞、尤其是haNK细胞或taNK细胞(例如，均可从NantKwest商购获得，9920 Jefferson Blvd.Culver City，CA 90232)组合使用。在使用haNK或taNK细胞的情况下，特别优选的是haNK细胞在CD16变体上携带重组抗体，该重组抗体与被治疗患者的新表位结合，并且在使用taNK细胞的情况下，优选taNK细胞的嵌合抗原受体与被治疗患者的新表位结合。其他治疗方式也可以不依赖于新表位，并且特别优选的方式包括基于细胞的疗法例如活化的NK细胞(例如，aNK细胞，其可从NantKwest商购获得，9920 Jefferson Blvd.Culver City，CA 90232)、和不基于细胞的疗法例如
化学治疗和/或
放射治疗。在更进一步考虑的方面，可以单独施用免疫刺激细胞因子，特别是IL-2、IL15、和IL-21，或将其与一种或多于一种检查点抑制剂(例如，易普利姆玛(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)等)组合施用。类似地，还进一步考虑，额外的药物干预可包括施用一种或多于一种抑制免疫抑制细胞、特别是MDSC、Treg和M2巨噬细胞的药物。
因此，合适的药物包括IL-8或干扰素-γ抑制剂、或结合IL-8或干扰素-γ的抗体、以及使MDSC失活的药物(例如，NO抑制剂、精氨酸酶抑制剂、ROS抑制剂)，该使MDSC失活的药物阻断细胞向MDSC发育或分化(例如，IL-12、VEGF-抑制剂、双膦酸盐)或对MDSC具有毒性的
试剂(例如，吉西他滨、
顺铂、5-FU)。同样地，可以使用如环磷酰胺、达利珠单抗(daclizumab)、和抗GITR或抗OX40抗体的药物来抑制诱导Treg。
[0100] 为了触发应激信号的过表达或转录，还考虑可以使用低剂量方案进行患者的化学治疗和/或放射治疗，优选以
节拍方式进行。例如，通常优选，这种治疗将使用有效影响蛋白质表达、细胞分裂和细胞周期中的至少一种的剂量，优选使用有效诱导细胞凋亡或者至少诱导或增加应激相关基因(特别是NKG2D配体)的表达的剂量。因此，在进一步考虑的方面，此类治疗将包括使用一种或多于一种化学治疗剂的低剂量治疗。最典型地，低剂量治疗将是暴露于等于或小于70％、等于或小于50％、等于或小于40％、等于或小于30％、等于或小于20％、等于或小于10％、或等于或小于5％的化学治疗剂LD50或IC50的治疗。另外，在有利的情况下，这种低剂量方案可以以节拍方式进行，例如在US 7758891、US 7771751、US 7780984、US 7981445和US 8034375中所述。
[0101] 关于在这种低剂量方案中使用的特定药物，考虑认为所有化学治疗剂都是合适的。在其他合适的药物中，激酶抑制剂、受体激动剂和拮抗剂、抗代谢药物、细胞抑制药物和细胞毒性药物都在本文中考虑。然而，特别优选的药剂包括被鉴别为干扰或抑制驱动肿瘤生长或发展的途径组分的那些药剂。可以使用对例如WO2011/139345和WO2013/062505中描述的组学数据的途径分析来鉴别合适的药物。最值得注意的是，如此实现的肿瘤细胞中应激相关基因的表达将导致NKG2D、NKP30、NKP44和/或NKP46配体的表面呈递，该表面呈递转而激活NK细胞以特异性地破坏肿瘤细胞。因此，应当理解的是，可以使用低剂量化疗作为肿瘤细胞中的触发因素以表达并展示应激相关蛋白，该应激相关蛋白转而将触发NK细胞活化和/或NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤。另外，NK细胞介导的杀伤将与细胞内肿瘤特异性抗原的释放相关，这被认为进一步增强了免疫应答。
[0102] 因此，发明人考虑了患者中治疗癌症的各种方法，其中向患者施用重组核酸(优选以体内病毒转染的形式)，其中重组核酸包含编码一种或多于一种多表位的序列部分。最优选地，至少一种、更通常至少两种、或所有多表位包含导致多表位优选运输(例如，在靶向的亚细胞区室中发现至少70％、更通常至少80％、最通常至少90％的所有已表达的多表位)至至少一个或至少两个不同的亚细胞位置的运输信号。例如，可以将第一多表位引导至细胞质(并且第一多表位可以包括额外的可切割泛素或不可切割泛素)，而可以将第二多表位引导至内体或溶酶体区室。或者可以将第一多表位引导至内体或溶酶体区室，而可以将第二多表位引导至细胞膜或使其分泌。如上所述，被编码的多表位将包含至少两个新表位，任选地由接头分开。
[0103] 在至少一些考虑的方法中，考虑的表达构建体还将包括编码一种或多于一种共刺激分子和/或细胞因子的序列部分，并且还可包括一种或多于一种干扰/下调检查点抑制的抑制蛋白。因此，多表位的表达可伴随共刺激分子、细胞因子、和/或抑制蛋白的表达。因此，表达构建体将包括与上述序列部分可操作地偶联的调节序列，以驱动多表位和共刺激分子、细胞因子、和/或抑制蛋白的同时表达。
[0104] 如将容易理解的，在考虑的方法中，可以例如使用同时施用或短暂间隔施用的不同表达构建体，在同一时间或以随后施用的方式将相同(或不同)的多表位靶向不同的亚细胞区室。因此，由于靶向不同区室(甚至细胞外空间)的可能性，考虑的组合物和方法也可用于引发CD8+偏倚免疫应答(刺激细胞毒性T细胞)、引发CD4+偏倚免疫应答(产生Th1和/或Th2细胞因子以刺激B细胞、抗体产生和记忆细胞)、引发抗体偏倚的免疫应答、和/或引发受激免疫应答(至少部分逆转检查点抑制和/或加强NK和T细胞细胞毒性激活)。因此，从不同的角度来看，当患者对抗肿瘤的NK和T细胞细胞毒性的活性不足时，可以使用考虑的组合物和方法通过将多表位靶向细胞质抗原呈递途径来支持或增加这种活性，从而增加MHC-I呈递并增强CD8+偏倚免疫应答。另一方面，当患者的CD4+型免疫应答不足时，可以使用考虑的组合物和方法通过将多表位靶向内体和/或溶酶体抗原呈递途径来支持或增加这种活性，从而增加MHC-II呈递并同时增强CD4+偏倚免疫应答。
[0105] 如本文所用，术语“施用”药物组合物或药物是指药物组合物或药物的直接和间接施用，其中药物组合物或药物的直接施用通常由医疗保健专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向医疗保健专业人员提供药物组合物或药物或者使其可获得药物组合物或药物以用于直接施用(例如，通过注射、输注、经口递送、局部递送等)的步骤。最优选地，通过皮下或真皮下注射施用重组病毒。然而，在其他考虑的方面，施用也可以是静脉内注射。替代地或另外地，可以从患者的细胞中分离抗原呈递细胞或使其生长，在体外感染，然后输注给患者。因此，应当理解，考虑的系统和方法可以被认为是用于高度个性化癌症治疗的完整药物发现系统(例如，药物发现、
治疗方案、验证等)。
[0107] 示例性序列排列
[0108] 通过肿瘤和正常样品的位置导向的同步比对经由计算机模拟来确定新表位序列，例如在使用BAM文件和BAM服务器的US2012/0059670和US2012/0066001中所公开的。具体地，肿瘤的DNA分析来自B16-F10小鼠黑素瘤系并且匹配正常组织是来自C57bl/6亲本小鼠的血液DNA。通过该肿瘤细胞系的RNA测序筛选表达结果。进一步分析所发现的已表达的新表位对鼠MHC-I(此处：Kb)和MHC-II(此处：I-Ab)的结合亲和力。在使用所有新表位的位置排列进行dbSNP筛选，然后通过加权矩阵和神经网络预测处理以产生表示疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度的分数的进一步步骤之后，进一步分析所选择的结合物(具有等于或小于200nM的亲和力)。多表位(未显示)的最佳评分排列(疏水序列或信号肽的最低可能性)用于进一步的实验。通过RNAseq或其他定量系统中的检测对新表位进行优先性排序，该定量系统产生携带新表位突变的特定基因的表达强度。
[0109] 表1显示了通过RNAseq确定其表达的示例性新表位，并显示了基因名称和突变的氨基酸以及突变氨基酸的位置。以*列出的新表位在dbSNP筛选后舍弃，因为该新表位在28％的群体中作为变体Rs71257443出现。
[0110] 表1
[0111]基因 位置 新表位-a 新表位-b
VIPR2 V73M GETVTMPCP
LILRB3 T187N VGPVNPSHR*
FCRL1 R286C GLGAQCSEA
FAT4 S1613L RKLTTELTI PERRKLTTE
PIEZO2 T2356M MDWVWMDTT VWMDTTLSL
SIGLEC14 A292T GKTLNPSQT REGKTLNPS
SIGLEC1 D1143N VRNATSYRC NVTVRNATS
SLC4A11 Q678P FAMAQIPSL AQIPSLSLR
[0112] 表2显示了新表位的其他实例，其中改变了突变氨基酸的位置，并且显示了MHC-I呈递(9-mer)和MHC-II呈递(15-mer)的其他替代序列。将MHC-II呈递的新表位序列反向翻译成相应的核酸序列，其也显示在表2中。
[0113] 表2
[0114]
[0115] 序列运输
[0116] 癌症模型：使用鼠B16-F10黑素瘤(衍生于C57/B16小鼠)。以如上所述的肿瘤与正常组织的方式筛选肿瘤，并且在B16F10黑素瘤细胞系中鉴别表达的突变表位。如上所述使用测序数据分析和针对鼠MHC I(H2-Kb、H2-Dd)和MHC II(I-Ab)的结合分析来进一步筛选候选新表位。然后制备九种不同的多表位构建体以供测试各种运输方案，并且将每种构建体制备为在CMV启动子控制下的相应重组核酸。将每种构建体克隆到缺失E1和E2b基因的AdV5表达载体中，然后将所得的重组病毒用于小鼠转染，如下面进一步讨论。
[0117] 更具体地，三种多表位构建体包括用于MHC-I呈递的MHC I结合新表位，并因此被靶向至细胞质区室。一种构建体具有未修饰的N末端，另一种构建体具有N末端不可切割泛素，而又一种构建体具有N末端可切割泛素。使用泛素化来靶向细胞溶胶中的蛋白酶体。其他三种多表位构建体包括用于MHC-II呈递的MHC I结合新表位，并因此被靶向至溶酶体/内体区室。一种构建体具有溶酶体靶向序列，另一种构建体具有再循环内体靶向序列，而又一种构建体具有分选内体靶向序列。另外三种多表位构建体包括用于MHC-II呈递的MHC II结合新表位，并且也被靶向至溶酶体/内体区室。再次，一种构建体具有溶酶体靶向序列，另一种构建体具有再循环内体靶向序列，而又一种构建体具有分选内体靶向序列。这九种构建体具有如下序列排列。
[0118] 在以下示例性序列中，对于MHC-I呈递，使用泛素(可切割和不可切割)进行蛋白酶体靶向，而对于所有MHC-II导向序列，使用CD1b前导肽作为输出前导肽用以将多肽从细胞溶胶中运出。使用LAMP1-TM/细胞质尾作为溶酶体靶向序列，而使用LAMP1-TM/CD1a尾作为再循环内体靶向序列，以及使用LAMP1-TM/CD1c尾作为分选内体靶向结构域。
[0119] 还应注意的是，在上述多肽中还使用各种内部对照来解释表达和呈递。更具体地，使用SIINFEKL肽作为MHC I限制性(Kb)肽表位的内部对照，而使用Esat6肽作为用于MHC II呈递的分泌蛋白的内部对照。使用FLAG标签作为用于检测表达的内部对照表位，使用cMYC作为用于简单蛋白质检测的内部对照标签。
[0120] 导向MHC-I呈递的MHC-I表位的示例性构建体(通过蛋白酶体运输，细胞质靶向)：
[0121] 仅多表位：12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFEKL-AAAA-Esat6-cMYC。图5A示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中SIINFEKL基序用下划线标出，Esat6基序是斜体，且cMY基序是粗体字体。图5A的核苷酸序列是SEQ ID NO：9，图5A的多肽序列是SEQ ID NO：12。
[0122] 多表位和可切割泛素GGR N末端：泛素-GGR-12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFEKL-AAAA-Esat6-c MYC。图5B示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中可切割泛素部分是斜体并用下划线标出，SIINFEKL基序用下划线标出，Esat6基序是斜体，且cMY基序是粗体字体。图5B的核苷酸序列是SEQ ID NO：10，图5B的多肽序列是SEQ ID NO：13。
[0123] 多表位和不可切割泛素G N末端：泛素-G-12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFEKL-AAAA-Esat6-c MYC。图5C示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中可切割泛素部分是斜体并用下划线标出，SIINFEKL基序用下划线标出，Esat6基序是斜体，且cMY基序是粗体字体。图5C的核苷酸序列是SEQ ID NO：11，图5C的多肽序列是SEQ ID NO：14。
[0124] 导向MHC-II呈递的MHC-I表位的示例性构建体(从细胞质输出，通过内体/溶酶体运输)：
[0125] Kb表位肽的溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/细胞质尾。图6A示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分是粗体，Esat6基序用下划线标出，Flag-tag基序是斜体，且LAMP1TM/细胞质尾是粗体/下划线字体。图6A的核苷酸序列是SEQ ID NO：15，图6A的多肽序列是SEQ ID NO：18。
[0126] Kb表位肽的再循环溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1a尾。图6B示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分是粗体，Esat6基序用下划线标出，Flag-tag基序是斜体，并且LAMP1TM基序是粗体/下划线字体，CD1a靶向基序是下划线/斜体。图6B的核苷酸序列是SEQ ID NO：16，图6B的多肽序列是SEQ ID NO：19。
[0127] Kb表位肽的分选内体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1c尾。图6C示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分是粗体，Esat6基序用下划线标出，Flag-tag基序是斜体，并且LAMP1TM基序是粗体/下划线字体，CD1c靶向基序是下划线/斜体。图6C的核苷酸序列是SEQ ID NO：17，图6C的多肽序列是SEQ ID NO：20。
[0128] 导向MHC-II呈递的MHC-II表位的示例性构建体(从细胞质输出，通过内体/溶酶体运输)：
[0129] IAb表位肽的溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-mGPGPG-(20aa-X-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/细胞质尾。图7A示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分是粗体，SIINFEKL和Esat6基序用下划线标出，Flag-tag基序是斜体，且LAMP1TM/细胞质尾是粗体/下划线字体。图7A的核苷酸序列是SEQ ID NO：21，图7A的多肽序列是SEQ ID NO：24。
[0130] IAb表位肽的再循环溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1a尾。图7B示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分是粗体，SIINFEKL和Esat6基序用下划线标出，Flag-tag基序是斜体，其中LAMP1TM基序是粗体/下划线字体，并且其中CD1a尾是粗体/斜体。图7B的核苷酸序列是SEQ ID NO：22，图7B的多肽序列是SEQ ID NO：25。
[0131] IAb表位肽的分选内体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1c尾。图7C示例性地描述了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分是粗体，SIINFEKL和Esat6基序用下划线标出，Flag-tag基序是斜体，其中LAMP1TM基序是粗体/下划线字体，并且其中CD1c尾是粗体/斜体。图7C的核苷酸序列是SEQ ID NO：23，图7C的多肽序列是SEQ ID NO：26。
[0132] 体内疫苗接种
[0133] 图8描绘了示例性体内疫苗接种实验，其中用九种不同的重组Ad5病毒免疫接种九组C57bl/6小鼠，该重组Ad5病毒包含基本上如上所述的序列排列。对不同组的动物使用不同的途径(皮下和静脉内)按照两周一次的施用方案进行免疫接种，如图8所示。在第42天用B16-F10黑素瘤细胞进行肿瘤攻击，然后施用M2巨噬细胞抑制药物(RP182)和IL-15超级激动剂(Alt-803)。图9A至图9C描绘了皮下施用的示例性结果，而图10A至图10C描绘了静脉内施用的示例性结果。
[0134] 值得注意的是，无论是否存在泛素化，皮下注射编码导向细胞质和MHC-I呈递的I类多表位的腺病毒不提供显著的免疫保护，如图9A所示。另一方面，在将I类多表位引导至内体和溶酶体区室以供加工和通过MHC-II呈递的情况下，对于引导至再循环内体区室和溶酶体区室观察到一些保护性免疫，如图9B所示。当将II类多表位引导至内体和溶酶体区室以供加工和通过MHC-II呈递时，甚至观察到更强的免疫保护。在此处，对于引导至溶酶体和分选内体区室观察到最强保护，如图9C所示。
[0135] 当用相同的病毒构建体进行免疫时，尽管通过静脉内注射，对于引导至细胞质的I类新表位，在多表位包括可切割泛素的情况下仍观察到新表位疫苗接种的保护作用，并且在多表位包括不可切割泛素的情况下观察到一些保护作用，如图10A所示。值得注意的是，在将I类多表位引导至内体和溶酶体区室时，在所有疫苗接种中观察到更强的保护作用，如图10B所示。此外，当将II类多表位引导至内体和溶酶体区室以供加工和通过MHC-II呈递时，观察到显著的保护作用。在此处，对于引导至再循环和分选内体区室观察到最强保护，如图10C的图表所示。
[0136] 本文中对数值范围的引用仅旨在用作单独提到落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值并入本
说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。关于本文的某些实施方案提供的任何和所有实施例或示例性表述(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围造成限制。说明书中的任何表述都不应解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
[0137] 对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多
修改是可能的。因此，除了所附
权利要求的范围之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的最广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他的方式引用元素、组件或步骤，表示所引用的元素、组件或步骤可以存在，或者被利用或与未明确引用的其他元素、组件或步骤组合。当说明书和权利要求涉及选自A、B、C……和N中的至少一种时，文本应解释为只需要其中的一个元素，而不是A加N、或B加N等。
