发明背景

对动物体重且特别是身体脂肪的调节是一个与健康密切相关的复杂过 程且对人和其它动物都是如此。与偏瘦的身体质量相比体重过大和/或身体脂 肪过多与包括冠状动脉疾病、中风和糖尿病在内的各种健康问题相关。

据估计半数美国人超重。在美国约24％的男性和27％的女性被确定为 轻度至重度肥胖。将超过理想体重标准20％的个体看作是肥胖的。将肥胖分 类为轻度(超重20-40％)、中度(超重41-100％)和重度(＞100％)超重。 严重的肥胖相对罕见，他们影响0.5％以下的所有肥胖个体和约0.1％的总人 口。

肥胖不仅是对人的问题。许多动物也患有与肥胖相关的不良结果。例 如，据报导约10-40％接受兽医护理的猫超重。导致猫肥胖的因素包括久 卧生活型、被禁闭于室内和阉割。肥胖的猫存在某些疾病的较大危险，包括 骨关节炎、韧带损伤、会阴皮炎、糖尿病、心肌病和泌尿外科综合征。因此， 维持健康体重以便将疾病的危害减小到最低限度是关键。参见美国专利 US6,071,544。

通过从对重度肥胖实施外科手术(胃改造术)到对轻度至中度肥胖实施饮 食疗法、行为改变和药物疗法的各种方式来治疗人体肥胖。对中度和轻度肥 胖的控制一般由个体和提供行为改变程序且在某些情况中提供预包装的饮食 的商业团体来进行。医疗社区建议在医疗监督下给予饮食疗法。

肥胖疗法的范围反映出涉及体重调节过程的复杂性且目前缺乏对这些 过程的理解。近期的报导已经涉及了肥胖中作为可能致病因素的病毒(U.S. News and World Report，2000年8月7日)。还存在大量有关肥胖素质的可能 遗传碱基的报导。Moll等已经报导了在许多人群中，肥胖看起来受到几个遗 传基因位置的控制(Moll等[1991]Am.J.Hum.Gen.49：1243)。此外，人双胎 研究强烈提示了控制体重的主要遗传基础，其中估计遗传率占80-90％ (Simopoulos，A.P.和Childs，B.编辑，1989在“肥胖的遗传改变和营养”，World Review of Nutrition and Diabetes，63，S.Karger，Basel，Switzerland；Norjeson，M.， 1976，Acta.Paediatr.Scand.65：279-287)。

肥胖基因产物重组agouti蛋白刺激各种细胞中的Ca2+流入量。Agouti 也刺激脂肪重新生成中的关键酶脂肪酸合酶(FAS)的表达和活性并通过Ca2+依赖性机制抑制人和鼠脂肪细胞内的基础和兴奋剂刺激的脂解。可以在没有 agouti存在的情况下由受体或电压介导的Ca2+通道活化来模拟这些作用且它 们受到诸如硝苯地平这样的Ca2+通道拮抗剂抑制。

近期的数据表明1，25-二羟基维生素D(1，25-(OH)2-D)在初级培养的人脂 肪细胞中使胞内钙浓度([Ca2+]i)显著和持续增加并使脂解相应地受到抑制 (Zemel等[2000]FASEB J.，14：1132-1138)。增加膳食中的钙抑制了[Ca2+]i、抑 制了1，25-(OH)2-D且随后通过刺激脂解并抑制脂肪生成而抑制了肥胖。与这 些发现一致的是，将膳食中的钙从400mg/天增加到1000mg/天使人体脂肪在 一年中减少4.9kg(Zemel等[2000]FASEB J.，14：1132-1138)。膳食钙还可以缓 解饮食诱发的肥胖发展并促进确定肥胖中的减体重(Shi，H.和Zemel，M.B. [2000]FASEB J.555.3(摘要))。

发明概述

本发明提供了治疗或避免人和其它动物肥胖的物质和方法。有利的是可 以将本发明的物质和方法用于便利和有效地进行减体重和/或预防体重增 加。在一个优选的实施方案中，本发明控制肥胖的有益性通过提供高钙饮食 来实现。在本发明的一个方面中，对个体维持受限的热量饮食。

在本发明的一个特定实施方案中，提供的钙以乳制品形式出现。在本发 明的另一个方面中，提供的钙以诸如碳酸钙这样膳食添加剂或维生素补充剂 的形式出现。

本发明还提供了刺激脂解、抑制脂肪生成和增加白脂肪组织非偶联蛋白 2(UCP2)表达的方法。本发明还提供了增加个体体核温度的方法以及诊断、 治疗和/或监测肥胖的方法。本发明还提供了抑制个体内[Ca2+]i水平的方法。

本发明还提供了通过增加儿童消耗的膳食钙的量而缓解儿童体重增加 和肥胖并控制儿童体重增加的方法。

附图简述

附图1A-B表示1，25-(OH)2-D(左侧的组)和甲状旁腺激素(右侧的组)对 人脂肪细胞中胞内钙的作用。

附图2表示1，25-(OH)2-D对人脂肪细胞中毛喉素刺激的脂解的作用。毛 喉素疗法使甘油释放增加约2倍；对毛喉素治疗组所示的数据与100％校正。 (n＝6/组；P＜0.001)。

附图3表示钙和乳制品对在aP2启动子控制下表达脂肪组织内agouti的 转基因小鼠中6周重量增加的作用。

附图4表示钙和乳制品对在aP2启动子控制下表达脂肪组织内agouti的 转基因小鼠中体核温度的作用。

附图5A-C表示钙和乳制品对在aP2启动子控制下表达脂肪组织内 agouti的转基因小鼠中脂肪细胞脂肪酸合酶活性(上部的组)、表示为脂肪酸合 酶(FAS：肌动蛋白比)的脂肪酸合酶mRNA(中间的组)数据和脂解的作用。将 数据表示为平均值±标准偏差(n＝10/组)。在每组中均显示了统计学显著性。

附图6A-B表示钙和乳制品对在aP2启动子控制下表达脂肪组织内 agouti的转基因小鼠中禁食血糖和胰岛素水平的作用。上面的组表示胰岛素 且下面的组表示葡萄糖。

附图7A-C表示基础低钙(0.4％)、高脂肪、高蔗糖饮食的6周消耗对 aP2-agouti转基因小鼠中体重(上组)、总脂垫(fat pad)质量(中间组)和基础脂肪 细胞[Ca2+]i(下组)的作用。将数据表示为平均值±SE(n＝8)。*与给药前相比 p＜0.001。

附图8A-C表示给予6周高钙饮食对能量受限的(70％不受限制)aP2- agouti转基因小鼠中体重(附图8A，上组)、总脂垫(fat pad)质量(附图8B，中 间组)和基础脂肪细胞[Ca2+]i(附图8C，下组)的作用。将数据表示为平均值 ±SE(n＝8)。

附图9A-C表示给予6周高钙饮食对能量受限的(70％不受限 制)aP2(ape)-agouti转基因小鼠中脂肪酸合酶活性(附图9A，上组)、脂肪酸合 酶mRNA(附图9B，中间组)和脂解(附图9C，下组)的作用。将甘油释放用 于测定脂解。将数据表示为平均值±SE(n＝8)。

附图10A-B表示给予6周高钙饮食对能量受限的(70％不受限 制)aP2-agouti转基因小鼠中腹部脂肪组织非偶联蛋白2(UCP2)表达的作用。 上组(附图10A)：来自8次平行测定的有代表性的RNA印迹；下组(附图10B)： 对UCP2/肌动蛋白mRNA密度单位的定量分析。将数据表示为平均值 ±SE(n＝8)。*与基础饮食相比p＜0.05。

附图11表示膳食钙对血浆胰岛素水平的作用。将数据表示为平均值 ±SE(n＝8)。*与基础饮食疗法前相比p＜0.001；+与不受限制的情况相比 p＜0.001。

本发明的详细说明

本发明提供了治疗或预防人体和其它动物肥胖的物质和方法。有利的是 可以将本发明的物质和方法用于便利和有效地进行减体重和/或预防体重增 加。在一个优选的实施方案中，本发明减肥的有益性通过提供高钙饮食来实 现。

本发明在一个优选的实施方案中提供了通过增加钙的摄取而诱导人或 其它动物脂肪组织消耗的方法。在本发明的一个方面中，提供了乳制品形式 的钙，诸如牛奶、酸牛奶或干酪。在本发明的另一个方面中，提供了膳食添 加剂形式的钙，诸如碳酸钙或维生素补充剂。在本发明的另一个方面中，对 个体维持受限的热量饮食。

本发明还提供了降低胞内钙浓度([Ca2+]i)、刺激脂解、抑制脂肪生成和 增加白脂肪组织非偶联蛋白2(UCP2)表达的方法。本发明还提供了增加个体 体核温度的方法(产热)。这些方法中的每一种均通过增加由个体摄取的钙量 和任选地限制个体热量摄取来实施。

本发明还提供了恢复妇女产后正常身体脂肪比例的新型和有利的方 法。在一种这类实施方案中，所述的方法通过鉴定近期生小孩的个体并增加 由该个体消耗的膳食钙的量来实施。

本发明还提供了预防或减轻膳食初期后消耗的体重重新恢复的方法。该 方法可以通过鉴定作为上述膳食结果的体重消耗的个体并增加由该个体消耗 的膳食钙量来实施。

本发明还提供了通过增加由个体消耗的膳食钙的量来降低calcitrophic 激素(1，25-(OH)2-D)水平的方法。

本发明还提供了通过增加由儿童消耗的钙量来减轻儿童肥胖危害的方 法。钙的摄取例如可以通过增加儿童对乳制品或其它含有高钙水平的产品的 摄取来实现。

本发明还提供了减轻、缓解或治疗肥胖的方法，该方法包括通过给予治 疗有效量的例如膳食钙这样的1，25-(OH)2-D拮抗剂而降低个体内calcitrophic 激素(1，25-(OH)2-D)水平。其它1，25-(OH)2-D拮抗剂包括1，25-(OH)2-D中和抗 体、可溶性1，25-(OH)2-D受体、含有1，25-(OH)2-D受体的融合蛋白(例如与Ig 重链或优选靶向脂肪细胞的部分融合的1，25-(OH)2-D受体的可溶形式)、化合 物和诸如碳酸钙这样含有钙的化合物。

本发明还提供了减轻、治疗或缓解个体肥胖的方法，该方法包括给予治 疗有效量的1，25-(OH)2-D受体拮抗剂的步骤。这类拮抗剂的实例包括阻断该 受体的配体结合位点的抗体、该受体的化合物拮抗剂、特异性结合1，25- (OH)2-D受体而拮抗该受体功能的1，25-(OH)2-D的类似物、同系物或异构体， 例如1-β，25-二羟基维生素D。

按照本发明对个体提供的钙可以采用例如乳制品(例如牛奶、不含脂肪的 乳粉、酸牛奶、干酪、酪农干酪、冰淇淋或冷冻酸牛奶)、营养补充剂(诸如 钙强化的维生素和补充了钙的液体)、补充了钙的食品或其它高钙食品(例如 鲑鱼、菜豆、豆腐、菠菜、芜菁绿、散叶甘蓝、嫩茎花椰菜、华夫饼干、薄 烤饼或皮杂饼)的形式。

在一个优选的实施方案中，对个体提供治疗有效量的膳食钙。治疗有效 量的膳食钙是足以诱导哺乳动物减体重、预防体重增加和/或增加脂肪组织代 谢性消耗的钙量。

按照本领域中所公知的方法来制备包括1，25-(OH)2-D受体的融合蛋白。 典型的融合蛋白包括按照Capan等的教导与Ig重链融合的1，25-(OH)2-D受体 的可溶形式(美国专利US5,565,375和5,336,603，将这些文献的全部内容引 入本文作为参考)。在其它实施方案中，例如使用酰化刺激蛋白(ASP)将至少 一种1，25-(OH)2-D受体(Nemere等[1998]J.Bone Miner.Res.13：1353-59；Fleet 等[1999]Nutr.Rev.57：60-64)导入优选靶向脂肪细胞的脂质体(Kalant等 [1995]Clin.Invest.Med.18(Supp.B：B10)；Maslowska等[1998]Int.J.Obesity 22： S108；Maslowska等[1999]“酰化刺激蛋白(ASP)：脂肪组织中的作用”- Progress in Obes的Research：8 Ed.B.Gut-Grand和G.Ailhaud，John Libbey & Co.)。在其它实施方案中，可以使1，25-(OH)2-D受体的可溶形式与诸如ASP 这样的脂肪细胞靶向剂偶联。1，25-(OH)2-D受体的可溶形式可以按照本领域 中所公知的方法由维生素D受体的结合膜形式生产。可以以重组方式或使用 诸如由Pierce(Rockford，IL)销售的化学交联化合物来完成一种或多种可溶性 1，25-(OH)2-D受体与一种或多种脂肪细胞靶向剂的偶联。

术语“个体”包括来源于鸟类、哺乳动物或爬行动物的动物。得益于本 公开方法的哺乳动物种类包括但不限于：猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；驯化 动物(宠物)，诸如狗、猫、豚鼠、仓鼠、Vietnamese大肚猪、家兔和白鼬； 驯化的农场动物，诸如母牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；一般 在动物园找到的外来动物，诸如熊、狮、虎、豹、大象、河马、犀牛、长颈 鹿、羚羊、懒猴、瞪羚、斑马、wildebeests、场拔鼠、袋熊、袋鼠、负鼠、 浣熊、小熊猫、大熊猫、袋狼、海豹、海狮和海象。爬行动物包括但不限于 短吻鳄、鳄鱼、海龟、龟、蛇、鬣蜥(iguanas)和/或其它蜥蜴。鸟类包括但不 限于鸡、火鸡、鸽子、鹌鹑、鹦鹉、金刚鹦鹉、鸽子、几内亚母鸡、小鹦鹉 类、长尾小鹦鹉、火烈鸟、鹰、隼、猎鹰、神鹰、鸵鸟、孔雀、鸭子和天鹅。

上述各方法可以进一步包括限制个体的热量摄取。另外，可以给所述个 体提供含高水平钙的膳食产品与膳食计划。可以以定期或预定计划为基础或 根据个体需要给个体提供所述的膳食产品。

本发明的方法可以进一步包括分析个体膳食摄取情况。这种分析可以通 过分析由个体完成的有关个体膳食摄取情况的调查表或膳食记录上记录的个 体消耗的食品来完成。记录和调查表可以是电子文本或纸件形式。

可以通过亲自询问个体问题或在国际互联网上调查来获得膳食摄取信 息。在本发明的该方面中，对个体提出有关膳食习惯和/或食品消耗方面的问 题。这些问题可以在国际互联网上传输。另一方面，可以在国际互联网上给 消费者传送表格或膳食记录表。在本发明的各方面中，可以通过国际互联网 使个体记录的信息返回到网址。可以通过经国际互联网接收来自个体的信息 的计算机来分析膳食摄取情况。

可以在输入涉及个体食品消耗情况的数据后由计算机来分析个体膳食 摄取情况。将个体消耗的食品和量与含有食品营养价值的数据库进行比较并 给个体提供饮食的营养组成。在分析由个体摄取的食品营养组成后，提供个 体消耗的钙量。可以从比较消耗钙量与发现使减体重最优化或诱导减体重的 钙量的数据库中提供有关个体消耗的钙量增加以及膳食钙来源的建议。

在某些情况中，可以不改变个体的热量摄取且热量摄取可以没有限制。 在其它情况中，需要减少个体的热量摄取作为膳食计划的部分。在一种实施 方案中，个体的热量摄取范围基于性别。热量摄取可以在约200-约2500kcal/ 天的范围。在一个优选的实施方案中，热量摄取范围约为300-2400kcal/ 天、优选500-2200kcal/天、更优选700-2000kcal/天、甚至更优选900- 1700kcal/天，且最优选1100-1500kcal/天。

可以通过获得以千克(kg)计的个体体重并将该值除以以米计的个体身高 来计算体重/身高比。另一方面，可以通过将以磅(lbs)计的个体体重乘以703 并将该值除以个体身高(以英寸计(in))的平方而获得个体的体重/身高比。一般 将这些比值称作BMI。因此，BMI＝kg/m2或BMI＝(lbs.×703)/(in)2。

如果将BMI用作肥胖的量度，那么当BMI值在25.0-29.9范围时，认 为个体超重。将肥胖定义为BMI值大于或等于30.0。世界卫生组织指定的 BMI值如下：25.0-29.9，I级肥胖(中度超重)；30.0-39.9，II级肥胖(严 重超重)；和40.0或40.0以上，III级肥胖(超大型/病态肥胖)。使用体重表将 肥胖分类为轻度(超重20-40％)、中度(超重41-100％)和重度(＞100％) 超重。超过理想体重标准20％的个体被认为是肥胖。将超过理想体重1- 19.9％的个体分类为超重。

可以以电子形式或打印形式提供涉及维持正常体重的益处或任选的正 常体重/身高比的信息、含有高水平钙的膳食计划和公开高钙饮食益处的印刷 品且可以将这些信息储存在数据库中。

本发明的另一个方面提供了通过提供含钙产品促进良好健康的方法，其 中对产品的规定附带有关于钙的消耗对控制肥胖的有益性的信息。所提供的 含钙产品可以是膳食产品，诸如；例如谷类食品、牛奶和其它乳制品、蔬菜 和其它属于天然高钙或用钙强化的食品。含钙的产品也可以是例如丸粒或液 体形式的膳食补充剂。

有关消耗钙对控制肥胖的有益性的信息例如包括书面或口述的有关消 耗钙与减体重和/或预防体重增加的解释。该信息以这样一种方式出现，使得 含钙产品的潜在消费者和/或用户会理解消耗含钙产品可以使体重减轻或减 少体重增加且因使用所述产品导致的减体重或体重增加减少直接的原因，至 少部分原因是存在于所述产品中的钙导致的。

按照本发明，有关含钙产品控制肥胖的有益性的信息可以直接伴随该产 品。因此，例如可以将所述信息打印在谷类食品盒、牛奶容器、干酪包装或 冰淇淋纸版盒上。还可以通过较广泛的通讯通道发布该信息，包括例如报纸、 杂志、直接邮寄、广播、电视、国际互联网和广告牌。其它发布通道包括语 言通讯、分发小册子、印刷载体、录音磁带、磁性载体、数字载体、视听载 体、发布广告、电子邮件、盲文、电子载体、旗帜广告(包括国际互联网旗帜 广告和飞机牵引的旗帜)、光导纤维和激光展示。在一个优选的实施方案中， 由此发布的有关钙对减体重的有益性的信息会鉴别为了接受钙控制肥胖益处 而摄取的含钙的特定产品。例如，可以通过商品名来鉴别该特定产品。

在一个优选的实施方案中，由含钙的特定产品的提供者来传达控制肥胖 的益处。例如，所述的提供者可以是产品商品名的拥有者。有关钙的控制肥 胖益处的信息还可以描述含钙的一般类产品的有益性。因此，例如，该信息 可以描述含钙的乳制品的控制肥胖益处。该信息例如可以通过商业协会来发 布。类似地，该信息可以描述含钙的膳食补充剂的控制肥胖益处。

本发明提供的控制肥胖信息可以带有或不带有涉及其它健康益处的信 息，这些益处可能是钙或可能是含钙产品中的其它成分所产生的。因此，控 制肥胖信息可以附带有涉及钙对骨质疏松症的有益性的信息。

在一个特定的实施方案中，有关钙控制肥胖的有益性的信息可以通过在 销售含钙产品或一类含钙产品中有金融股份的商业实体来发布。例如，一般 可以是给特定患者提供有关高钙饮食的医疗建议的医生，但不能涉及产品的 特定商品名。一般还包括描述评价钙的控制肥胖益处的研究的科学文章。

本发明还提供了用于刺激脂肪组织代谢性消耗的制品。这类制品一般包 括食品和公开高钙饮食控制肥胖益处的印刷材料。在本发明的一个方面中， 所述的印刷材料可以是小册子、包装说明书的形式或作为包装部分。在本发 明的另一个方面中，所述的信息可以压印或印刷在食品上。由此提供的信息 可以包括食品中包含的钙的量、以代谢方式辅助脂肪组织消耗所必不可少的 推荐的钙摄取水平、推荐的BMI值或推荐的个体身高和体重。所述的食品可 以是固体或液体。在本发明的一个方面中，将含有增加水平钙的液体制成治 疗肥胖或刺激脂肪组织代谢性消耗的膳食补充剂。在本发明的该方面中，可 以给所述的液体以颜色代码以标注其中含有的钙量。通过实例将食品的着色 添加剂导入液体以指示其中含有的钙量。绿色液体可以含有100mg钙/份食 品，黄色液体可以含有200mg钙/份食品，而品红色液体可以含有500mg钙/ 份食品。 实施例1-膳食钙对肥胖的调节

           材料和方法 人脂肪细胞的分离和培养

从患有未知代谢性疾病病史的进行腹部整形手术的患者体内获得人皮 下脂肪组织。通过洗涤、切碎、胶原酶消化和如上所述的过滤来分离脂肪细 胞并将其在补充了1％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和庆 大霉素(50μg/ml)的Dulbecco改进的Eagle培养基中培养。将细胞培养成混悬 液并保持在培养基上部的薄层中，每天改变培养基。在分离后约72小时研究 细胞并在研究前进行血清饥饿。 动物和饮食

为了评价膳食钙在调节体内肥胖中的作用，研究在aP2启动子控制下脂 肪细胞中特异性表达agouti的转基因小鼠。这些动物表现出正常的勒帕茄碱 表达模式和类似于在人体中发现的活力且表现出agouti表达的人体模式(脂 肪细胞特异性)。这些小鼠用于饮食诱导的肥胖模型，即它们在使用标准 AIN-93G饮食时并不是肥胖型的，但可以转变成作为对因给予胰岛素或高蔗 糖饮食诱发的血胰岛素过多症的反应的肥胖。对来自该群集的雄性aP2-agouti 转基因动物在6周龄时给予含有亚最适量钙(0.4％)、作为单一碳水化合物来 源的蔗糖和能量增加至25％的含猪脂的脂肪的改进的AIN-93G饮食。如下 将它们随机分成4组。对基础组持续给予不加改进的这种饮食；高钙组接受 补充了CaCO3的基础饮食以使膳食钙增加3倍而达到1.2％；中钙乳制品饮 食，其中25％的蛋白质被不含脂肪的乳粉所取代且膳食钙增加至1.2％；和 50％蛋白质被不含脂肪的乳粉取代的高钙乳制品组，钙增加至2.4％。每天 测定食品摄取和溢出物的量且每周给动物称重。在6周饲喂期结束时，在异 氟烷麻醉条件下通过放血处死动物并通过心脏穿刺采集血液用于葡萄糖和胰 岛素测定。解剖脂垫(fat pad)(附睾、肾囊、腹部和肩胛下)、立即称重、将其 冷冻在液氮中并储存在-80℃下。测定腹部脂肪中脂肪酸合酶的活性和mRNA 水平。 体核温度

将体核温度用作测定良好能量转化成体重功效方面上的任何降低是否 附带有产热增加的间接代谢指标。通过温差电偶(Columbus Instruments， Columbus，OH)测定温度。将恒定距离(1.8cm)的探针插入每只小鼠的直肠，在稳 定后(10s)，每隔5s记录一次温度，持续30s。在上午8:00-9:00进行 所有的温度测定。 胞内钙(人脂肪细胞)

如上所述以荧光测定法测定胞内Ca2+。在37℃下和黑暗中用加载有 fura-2-乙酰氧基甲基酯(10μM)的HEPES缓冲盐溶液将细胞洗涤45分钟，同 时持续进行振摇。然后将细胞冲洗3次、重新悬浮并使用双激发(340和 380nm)/单发射(510nm)荧光测定法测定胞内Ca2+。在建立稳定的基线后，测 定对1，25-(OH)2-D或甲状旁腺激素(10pM-100nM)或其相应载体的响应。将毛 地黄皂苷(25c)和Tris/EGTA(100mM，pH8.7)用于计算最终胞内Ca2+的校 准。 脂解

在有或没有毛喉素(1μM)存在的情况下将脂肪细胞培养4小时并测定释 放入培养基中的甘油以评价脂解情况。将甘油释放数据对细胞蛋白进行校 准。 脂肪酸合酶活性和mRNA水平

在动物死亡后立即将脂肪组织分离并通过测定NADPH的氧化率来测定 胞质提取物中的脂肪酸合酶活性。使用考马斯蓝染料对酶活性进行蛋白质校 正。

通过氯化铯密度梯度提取总RNA、对其进行电泳、进行RNA印迹分析 并使用标准方法使其与脂肪酸合酶的放射性大鼠cDNA探针进行杂交。以光 密度测定法对放射自显影图进行定量并剥离所有的印迹且用作为荷载对照的 β-肌动蛋白重新进行探测。 统计学分析(体外和动物数据)

将全部数据表示为平均值±SD。通过一种单向方差分析(ANOVA)或t检 验对数据评价统计学显著性，这取决于进行比较的数量。通过ANOVA对带 有多重比较的所有数据组进行分析，随后使用SPSS-PC的最小显著性差异检 验分离出明显不同组的平均值(v.8.0)。 NHANES III分析

为了测定动物观察结果是否与确定膳食钙在调节总体水平的身体组成 上的作用相关，对国家健康和营养检验调查(NHANES III)数据组进行分析。 对1988-1994年间进行的这种大规模典型调查产生了用于代表完整的美国 2个月年龄以上非制度化公众人口的复杂四步概率取样图。在这种数据分析 中包括仅完成本研究的所有3个阶段的成年人(面谈、身体检查和实验室检 查)：如果应答者不能提供完整而有用的身体组成/人体测量数据(例如被截肢 者和带管型的个体)、使用胰岛素或属于怀孕或近期怀孕或目前正在进行母乳 喂养，那么从这种分析中排除他们。使用在身体检查过程中采集的人体测量 和生物电阻抗数据评价身体组成，其中使用来自Segal的回归方程计算身体 脂肪百分比。

通过多重逻辑回归分析与使用SUDAAN的Roust变量估计法(Shah等， SUDAAN User’s Mannual，Release 7.0(1996))估计身体脂肪百分比的奇数比与 相应的5％置信区间。对所有参数的点估计值加权以反映出每一数值的人口 分布；使用SUDAAN计算变量以考虑到复杂的取样设计。对男性和女性分 别进行分析并通过包括作为连续变量的模型中的年龄对年龄调整所有的奇数 比。模型中包括的群体互变量是热量摄取值、种族/人种(ethnicity)和活性水 平。研究样品的特征如表1和2中所示。

          表1.NHANES III研究样品的特征a

                        女性                    男性

                      (n＝380)                (n＝7114)

年龄(岁数)            28.7±0.4               43.5±0.44 身体质量指标(kg/m2)      25.7±0.4               26.6±0.11

身体脂肪(％)          32.7±0.6               25±0.2   钙摄取量(mg/天)         720±52                 965±15 乳制品消耗量(每月频率)    54.7±3                 51.4±1   能量摄取(kcal/天)       1896±68                2656±28

膳食脂肪(g/天)        74±4                   102±2 a将所有数据均表示为平均值±SEM。 表2.NHANES III研究中女性与男性的身体脂肪的四分位数a

                          身体脂肪％ 四分位数             女性                  男性

1             22.82±0.45           15.47±0.14

2             30.54±0.17           22.83±0.06

3             34.85±0.18           27.55±0.06

4             42.49±0.44           34.08±0.11

a人群(平均值±SEM)。

                           结果

附图1表明1，25-(OH)2-D和甲状旁腺激素(PTH)在人脂肪细胞初级培养 物中刺激显著而持久的胞内Ca2+增加(P＜0.001：就1，25-(OH)2-D而言， EC50～50pM；而就PTH而言，EC50～10nM)。1，25-(OH)2-D疗法还导致 毛喉素刺激的人脂肪细胞中的脂解得到显著(83％)抑制(附图2)。尽管PTH 疗法刺激胞内Ca2+反应，但它对脂解几乎没有发挥作用(数据未显示)，其最 大的可能是腺苷酸环化酶的附带活化的结果。

使用高脂肪/高蔗糖基础饮食治疗aP2-转基因agouti小鼠导致体重增加 24％，高钙与中钙乳制品饮食使体重分别下降了26％和29％(P＜0.04)，且 使用高钙乳制品饮食进一步使体重下降了39％(P＜0.04；附图3)。尽管在食 品摄取方面没有任何差异，但是这些差异确实发生。对间接代谢指标，体核 温度的测定反映出了这些观察结果，其中对所有三种高钙饮食而言体核温度 均增加了～0.5℃(P＜0.03；附图4)。这种增加与食品摄取方面缺乏差异联系 起来表明能量代谢效率从能量储存向产热方向移动。

在对由营养物和激素调节高度敏感的脂肪重新生成中的关键酶脂肪酸 合酶的研究过程中，这种能量代谢上的移动是明显的。基础饮食使脂肪酸合 酶活性增加2.6倍且这种作用被所有三种高钙饮食明显弱化(P＜0.002；附图 5A)。这种饮食使脂肪细胞脂肪酸合酶mRNA相应减少，其中使用高钙饮食 下降27％，而使用中等钙和高钙乳制品饮食下降51％(P＜0.01；附图5B)。 脂肪细胞以对脂肪酸合酶反应相反的方式对膳食调控起反应。基础饮食导致 脂解受到显著(67％)抑制(P＜0.0001)；然而，高钙饮食对脂解的刺激提高了3 -5.2倍(P＜0.015；附图5C)，其中高钙乳制品饮食高于高钙饮食。对6周膳 食疗法后脂垫质量的评价进一步提供了对这些发现的支持。表3表明所有三 种高钙饮食均使附睾、肾周、腹部和肩胛下脂肪组织层的质量下降了36％ (P＜0.001)。所有三种饮食均使附睾和肩胛下脂垫质量减少了～50％，而腹部 脂垫显示出在使用中钙乳制品和高钙乳制品饮食时的质量减少高于使用高钙 饮食时的质量减少(P＜0.001；表3)。 表3.钙和乳制品对在aP2启动子控制下表达脂肪组织中Agouti的转基因

               小鼠 脂垫质量的作用a

           基础           高钙          中钙乳制品          高钙乳制品 腹部(g)    2.239±0.109   1.807±0.082*   1.661±0.127**    1.680±0.113** 肾周(g)    1.675±0.124   1.271±0.098*   1.172±0.128*     1.052±0.094* 附睾(g)    0.198±0.036   0.110±0.017*   0.110±0.014*     0.097±0.015* 肩胛下(g)  1.592±0.318   0.680±0.069*   0.663±0.068*     0.639±0.087* 总计b(g)  5.703±0.548   3.649±0.238*   3.705±0.276*     3.787±0.251*

a数据表示为平均值±偏差。

b腹部、肾周、附睾和肩胛下脂垫的总和。

*与基础饮食比较P＜0.001。

**与高钙饮食比较P＜0.001。

对血糖与胰岛素的连续测定证明了基础高脂肪/高蔗糖/低钙饮食的致糖 尿病作用，其中禁食血糖从98±10mg/dl增加至130±11mg/dl(P＜0.02)和相应 的代偿性血胰岛素过多症的程度。这些增加被高钙和中钙乳制品饮食所弱化 且由高钙乳制品预防(附图6)。

表4中概括了NHANES III的数据分析。在控制能量摄取、活性水平、 年龄、种族和人种(ethnicity)后，成年女性中身体脂肪的最高四分位数的奇数 比从钙摄取的第一个四分位数1.00分别明显下降至第二、第三和第四个四分 位数的0.75、0.40和0.16(多R2＝0.20；P＝0.0009)。类似地，男性的回归模型 显示了钙和乳制品摄取与身体脂肪之间的相反关系(多R2＝0.40；P＝0.0006)， 不过，从该模型中没有明显观察到钙摄取的四分位数的相对危害(奇数比)上 可比较的剂量反应性下降。

表4.膳食钙和乳制品摄取对女性身体脂肪最高四分位数的危害作用a 钙和乳制品消  钙摄取量(mg/    每日消耗量(一份食   最高身体脂肪四 耗的四分位数  天：平均值±SEM)物，月：平均值±SEM)分位数的奇数比

1            255±20          14.4±1.9       1.00

2            484±13          38±1.3         0.75(0.13，4.22)b

3            773±28          57.2±1.0       0.40(0.01，3.90)b

4            1346±113        1346±113       0.16(0.03，0.88)b

a对模型控制种族/人种和活性水平，其中年龄和热量摄取为连续的互变 量。b圆括号内的为95％置信区间。 实施例2-膳食钙对脂肪细胞胞内钙、脂质代谢和体重与脂肪减少的作用

                        材料和方法 动物和饮食

将aP2-agouti转基因(aP2-a)小鼠用作本研究中的动物模型。这些动物的 特征如上所述(Mynatt等，1997)。这些转基因小鼠在aP2启动子控制下特异 性表达脂肪组织中的正常agouti蛋白(Mynatt等，1997)，类似于脂肪细胞特 异性的人agouti表达模式。这些小鼠用作研究膳食诱发的肥胖研究的动物模 型，此时，它们在使用标准AIN 93-G饮食时并不肥胖，而在对因给予外源 性胰岛素(Mynatt等，1997)或高蔗糖饮食(Zemel等，1999)诱发的血胰岛素 过多症的反应是转变成肥胖。

将本研究分成两个6周阶段。在第一个阶段中，对60只6周龄雄性aP2 小鼠使用补充了亚最适量钙(0.4％)、作为唯一碳水化合物来源的蔗糖和加入 以将脂肪25％能量增加的猪脂的改变AIN 93-G饮食。为了评价这种低钙/ 高脂肪/高蔗糖饮食在这些动物中诱发的肥胖，我们每隔5天监测一次体重并 对8只有代表性的小鼠实施安乐死以便在第一个6周基础饮食喂养结束时测 定脂垫质量和脂肪细胞[Ca2+]i。在第二个6周阶段中，将表现出饮食诱发的 肥胖的剩余小鼠随机分成5组。对一组随意使用未加改变的相同低钙(0.4％) 饮食，而对其它4组如下维持能量限制(70％没有限制)。对基础限制组的小 鼠使用具有Kcal限制的基础低钙(0.4％)饮食。高钙能量限制组接受补充了增 加至1.2％钙的基础饮食。给称作中钙乳制品和高钙乳制品的另外2组饲喂 改变的基础饮食，其中25％或50％的蛋白质被不含脂肪的乳粉取代，其中 总膳食钙分别增加至1.2％或2.4％。每天给予饮食且每隔5天监测一次体 重。在第二阶段结束时，使用beuthanasia(含有苯妥英的浓戊巴比妥)对所有 小鼠实施安乐死并通过心脏穿刺获得血液以用于胰岛素和葡萄糖测定。解剖 脂垫(附睾、肾周、腹部和肩胛下)、立即称重、将其冷冻在液氮中并储存在- 80℃下。测定腹部脂肪中脂肪酸合酶的活性和mRNA水平。 体核温度

将体核温度用作测定膳食钙是否调节与能量消耗的重要提供者即产热 增加相关的能量代谢的间接代谢指标。每周通过温差电偶(Columbus Instruments，Columbus，OH)测定温度(Kim等，1996)。将恒定距离(1.8cm)的探 针插入每只小鼠的直肠。在稳定后(10秒)，每隔5秒记录一次温度，持续30 秒。在上午8:00-9:00进行所有的体核温度测定。 小鼠脂肪细胞胞内Ca2+ ([Ca2+ ]i )的测定

如上所述并稍加改变由小鼠腹部贮存脂肪制备分离的小鼠脂肪细胞(Shi 等，1999)。简单地说，首先用Hank平衡盐溶液将脂肪组织洗涤几次、切成 小片并在37℃下的振摇水浴中用0.8mg/ml I型胶原酶消化30分钟。然后使 脂肪细胞通过无菌500μm尼龙筛网过滤并在补充了1％胎牛血清(FBS)的 Dulbecco改变的Eagle培养基(DMEM)中培养。将细胞在混悬液中培养并维 持在培养基上部的薄层中2小时用于细胞回收。

使用fura-2双波长荧光成象系统测定分离小鼠脂肪细胞中的[Ca2+]i。在 进行[Ca2+]i测定前，将脂肪细胞在不含血清的培养基中预保温2小时并用含 有下列成分(按mmol/L计)的Hepes平衡盐溶液冲洗：NaCl 138、CaCl2 1.8、 MgSO4 0.8、NaH2PO4 0.9、NaHCO3 4、葡萄糖5、谷氨酰胺6、Gepes 20 和牛血清清蛋白1％。在37℃下的含5％CO2的黑暗培养箱中在相同缓冲 液溶液中给脂肪细胞加载fura-2乙酰氧基甲基酯(AM)(10μmol/L)1小时。为了 除去胞外染料，用HBSS将脂肪细胞冲洗3次且然后在室温下再预保温30 分钟以使胞质fura-2 AM完全水解。将薄层脂肪细胞置于带有玻璃盖的35mm 平皿(P35G-0-14-C，MatTek Corporation)中。在使用Cohu 4915 CCD照相机的 Nikon TMS-F荧光倒置显微镜的载物台上固定含有加载染料的细胞的平皿。 任选地在340和380nm激发波长与520nm发射波长下捕捉荧光影象。使用如 上所述的公式计算[Ca2+]i(Grynkiewicz等，1985)。 脂肪酸合酶(FAS)活性测定

如上所述以分光光度法在小鼠脂肪组织的粗胞质提取物中测定FAS活 性(Jones等，1997)。在含有1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1mmol/L二硫 苏糖醇(DTT)和100μmol/L苯甲基磺酰氯(PMSF)(pH7.4)的250mmol/L蔗糖溶 液中匀化小鼠腹部脂垫。以18,500Xg将匀化物离心1小时并将infranatant 用于测定NADPH的氧化率。 脂解测定

在将小鼠处死后，立即解剖小鼠肾周脂肪组织并保温4小时。如上所述 使用一步酶荧光测定法测定释放入培养基的甘油作为脂解的指示剂(Boobis 等，1983)。 RNA印迹分析

如上所述进行RNA印迹分析(Shi等，1999)。使用CsCl2密度离心法提 取来自小鼠腹部脂肪组织的总RNA、在1％琼脂糖凝胶中进行并转至尼龙 膜上(New England Nuclear，Boston，MA)。使该膜与未偶联蛋白2(UCP2)或使 用随机引物法放射性标记的FAS cDNA探针进行杂交。在室温下通过用2X SSC/0.1％SDS将所述膜冲洗30分钟并在55℃下用0.1X SSC/0.1％SDS冲 洗45分钟来除去未结合的探针。最后在-80℃下使该膜暴露在X光片上(New EnglandNuclear，Boston，MA)。剥离所有膜并用作为加载对照的β-肌动蛋白重 新探测。 统计学分析

将所有数据表示为平均值±SE并通过使用SPSS(SPSS Inc，Chicago，IL) 的一种单向方差分析(ANOVA)评价统计学显著性。将p值＜0.05看作具有显 著性。

                              结果

为了建立aP2-agouti转基因(aP2-a)小鼠中饮食诱发的肥胖的动物模型， 对小鼠使用低钙(0.4％)/高脂肪/高蔗糖饮食6周。对aP2-a小鼠给予这种饮食 使脂肪细胞[Ca2+]i增加2倍(128±18与267±15nM，p＜0.001，下组，附图7)， 其中相应的体重增加27％(p＜0.001，上组，附图7)且最终脂垫质量增加2 倍(p＜0.001，中间组，附图7)，这一结果表明饮食诱发的脂肪细胞调节异常 与aP2-a小鼠肥胖增加相关。

评价有利于热量受限肥胖aP2-a小鼠减体重的膳食钙的作用。对这些肥 胖型aP2-a小鼠维持随意的低钙基础饮食或Kcal受限(70％没有限制)的补充 或未补充乳制品或CaCO3作为钙补充来源的饮食。附图8说明包括高钙饮食 (来源于CaCO3的1.2％Ca2+)、中钙乳制品饮食(来源于取代了25％蛋白质的 不含脂肪乳粉的1.2％Ca2+)和高钙乳制品饮食(来源于取代了50％蛋白质的 不含脂肪乳粉的2.4％Ca2+)在内的全部3种钙饮食使脂肪细胞[Ca2+]i减少50 ％(p＜0.001，附图8)，而来自维持Kcal受限的基础低钙饮食的小鼠的脂肪细 胞中的[Ca2+]i保持与没有限制的动物相同的升高水平。

就膳食钙诱发的脂肪细胞[Ca2+]i下降是否有利于减体重和脂垫质量降低 而言进行检验。正如附图8中所示，与没有限制的组相比，能量限制导致体 重下降11％(p＜0.001，附图8)。然而，在高钙、中等钙和高钙乳制品组中分 别观察到了19％、25％、29％的更为明显的体重下降(与基础能量受限组 相比p＜0.01，附图8)。与该结果一致的是，与没有限制的基础饮食组相比， 能量限制导致脂垫质量仅下降8％，而高钙饮食导致脂垫质量下降42％ (p＜0.001，附图8)，中等钙和高钙乳制品饮食分别进一步使脂垫质量减少了 60％和69％(与基础能量受限组相比p＜0.01，附图8)。

附图9表明高钙饮食使脂肪酸合酶(FAS)活性降低35％(与基础能量受限 组相比p＜0.05)，中等钙和高钙乳制品饮食分别进一步使之降低了63％和62 ％(p＜0.05)。类似地，三种高钙饮食均导致脂肪细胞FAS mRNA相应降低， 使用高钙、中钙乳制品和高钙乳制品饮食分别使脂肪细胞FAS mRNA减少了 61％、72％和81％(与基础能量受限组相比p＜0.05，附图9)。膳食钙增加 导致脂解相应增加。尽管基础能量受限饮食不会影响脂肪细胞脂解，但是高 钙饮食使脂解受到77％的刺激(p＜0.05，附图9)，中钙乳制品和高钙乳制品 饮食组使脂解一步增加了2倍(与基础能量受限组相比p＜0.05，附图9)。与 脂肪生成减少联系在一起的脂解增加可以代表一种代谢状态，其中能量代谢 效率从能量储存向能量消耗移动。

这种能量代谢上的移动进一步通过膳食钙诱发的体核温度升高来证 实。全部三种高钙饮食均对体核温度具有刺激作用，其中高钙、中钙乳制品 和高钙乳制品饮食分别使体核温度增加了0.48℃、0.57℃和0.67℃ (p＜0.05)，而基础能量受限饮食不会影响体核温度。体核温度升高的可能生理 学基础在于涉及产热的非偶联蛋白2(UCP2)的表达(fleury等，1997；Gimeno 等，1997)在白脂肪组织中受到增量调节，其中使用所有3种高钙饮食均增 加80％(p＜0.05，附图10)。这一结果证明膳食钙还可以调节与产热相关的能 量代谢。因此，在使用高钙饮食时，与产热增加联系在一起的对脂解的增量 调节和对脂肪生成的减量调节组合可以用于使能量代谢从能量储存向能量消 耗移动。

基础低钙饮食产生了血胰岛素过多症作用，其中血浆胰岛素水平增加了 2倍(p＜0.001，附图11)。维持随意这种基础饮食的小鼠表现出持续的血胰岛 素过多症水平，而能量限制本身将血浆胰岛素减少了约50％。高钙饮食不会 进一步明显影响胰岛素水平，不过，存在趋向于进一步降低的非显著性倾向 (附图11)。 实施例3-给予高钙饮食的方法

本发明提供了用于诊断、治疗和/或监测肥胖的方法。本发明中的一种方 法包括下列步骤：

a.测个体体重并任选地测个体的身高；

b.将个体的体重或任选地个体体重/身高比与建立的基准进行比较；

c.任选地对个体肥胖进行分类；

d.任选地给所述个体提供与有益于维持正常体重或正常体重/身高比相 关的信息；和

e.为所述个体提供膳食计划，该计划包含高水平的钙和任选的公开有高 钙饮食对控制肥胖有益的印刷品。

本发明还提供了计算机执行的诊断、治疗和/或监测肥胖的方法。本发明 该实施方案的方法可以包括下列步骤：

a.测个体体重并任选地测个体的身高且将这些数据输入计算机系统；

b.任选地计算所述个体的体重/身高比；

c.将个体的体重或任选地个体体重/身高比与建立的包含在计算机采用 的体重和/或体重/身高比数据库中的基准进行比较；

d.任选地对个体肥胖进行分类；

e.任选地给所述个体提供与有益于维持正常体重或任选的正常体重/身 高比相关的信息；和

f.为所述个体提供膳食计划，该计划包含高水平的钙和任选的公开有高 钙饮食对控制肥胖有益的印刷品；

g.任选地监测所述个体的进展情况。

本发明还提供了计算机执行的在通讯网络上诊断、治疗和/或监测肥胖的 方法，本发明该实施方案的方法可以包括下列步骤：

a.根据网页上输入的数据从个体中获得体重和任选的身高数据；

b.任选地在与通讯国际互联网连接的计算机中计算所述个体的体重/身 高比；

c.将个体的体重或任选地个体体重/身高比与建立的包含在所述计算机 采用的体重和/或体重/身高比数据库中的基准进行比较；

d.任选地对个体肥胖进行分类；

e.任选地给所述个体提供与有益于维持正常体重或任选的正常体重/身 高比相关的信息；和

f.为所述个体提供膳食计划，该计划包含高水平的钙和任选的有关高钙 饮食对控制肥胖有益的信息。

该方法可以进一步提供所述个体输入的体重和身高数值是正确的所需 验证方法。该方法还可以提供肥胖的分类、涉及维持正常体重或任选的正常 体重/身高比的有益的信息，从而仅在所述个体需要时为其提供包含高水平钙 的膳食计划和/或有关高钙饮食有益的信息。所述的通讯网络可以是国际互联 网、局域网、LAN、WAN、实际的个人网络或电连接的两台或多台计算机。

应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于解释本发明的目的且可以 提示本领域技术人员根据这些内容进行各种修改或改变且这些修改或改变均 包括在本说明书和待批权利要求的精神和范围内。