一种同时检测32个单核苷酸多态性位点基因型的方法
阅读：631发布：2020-05-24
专利汇可以提供一种同时检测32个单核苷酸多态性位点基因型的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种同时检测32个标签单核苷酸多态性位点的方法。选择国际单倍型图工程 数据库 上公布的内收蛋白1，血小板内皮细胞黏附分子-1，C-反应蛋白，内皮固有型一 氧 化氮合酶，浆细胞膜糖蛋白1，L-选择素，G蛋白β3亚单位，血管紧张素I转换酶，血管紧张素II 1型受体，血管紧张素原，亚甲基四氢叶酸还原酶和肝脂肪酶基因中国汉族人群的32个标签单核苷酸多态性，每个单核苷酸多态性设计3条引物(2条PCR扩增引物和1条延伸引物)，通过PCR扩增、延伸及杂交，应用SNP Stream基因分型系统对单核苷酸多态性位点进行基因分型。本检测方法具有快速、准确、高通量、操作简单、微量化等优点。，下面是一种同时检测32个单核苷酸多态性位点基因型的方法专利的具体信息内容。
1.一种同时检测32个单核苷酸多态性位点的方法，这些基因及32个标签单核苷酸多态性位点是内收蛋白1基因：rs3775067、rs1263359，血小板内皮细胞黏附分子-1基因：
rs503550，C-反应蛋白基因：rs1205，内皮固有型一氧化氮合酶基因：rs7830、rs3918188，浆细胞膜糖蛋白1基因：rs12528076、rs858341、rs021966、rs858345、rs9308995，L-选择素基因：rs964555、rs2205848、rs4987318、rs2298900，G蛋白β3亚单位基因：rs5445，血管紧张素I转换酶基因：rs4333、rs4305、rs4353，血管紧张素II 1型受体基因：rs6801836、rs2675511、rs5182，血管紧张素原基因：rs1926722、rs7539020、rs3889728、rs493132、rs478523，亚甲基四氢叶酸还原酶基因：rs1801133、rs9651118、rs6541003和肝脂肪酶基因：rs12462668、rs10426971，其特征在于检测方法包括下述步骤：
(1)设计并合成用于扩增32个单核苷酸多态性位点的序列1至序列96引物，每个单核苷酸多态性设计3个引物，其中2个为PCR扩增引物，用于扩增出含有目的单核苷酸多态性位点的片断；1个为延伸引物，用于单核苷酸多态性位点的测序及与玻璃芯片上的寡核苷酸链杂交；
(2)稀释并混合PCR引物，对目标DNA进行PCR扩增；
(3)对扩增产物进行纯化；
(4)稀释并混合延伸引物，进行延伸反应；
(5)杂交；
(6)对杂交板进行荧光扫描，根据荧光信号判断单核苷酸多态性位点的基因型。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测32个单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于所述的步骤(2)中将PCR引物稀释并混合使其终浓度为2.5μM，构建PCR引物池，每96人份PCR反应体系为：
试剂成分 体积(μL)
引物池(2.5μL) 11.2
脱氧核苷酸(2.5mM) 20
10倍PCR缓冲液II 56.2
氯化镁(25mM) 112.6
金牌扩增酶(5U/μL) 11.2
双蒸水 126
3.根据权利要求1所述的一种同时检测32个单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于所述的步骤(2)中PCR循环条件为：
4.根据权利要求1所述的一种同时检测32个单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于所述的步骤(4)中将延伸引物稀释并混合使其终浓度为5μM，构建延伸引物池。每96人份PCR反应体系为：
一种同时检测32个单核苷酸多态性位点基因型的方法
技术领域
背景技术
[0002] 近年来，随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，冠心病已成为当今危害我国人民健康和生命的主要疾病，其患病率呈逐年上升趋势，死亡率已超过肿瘤而跃居第一。其发病是遗传因素和环境因素共同作用的结果。冠心病的发生主要是由于动脉粥样硬化斑块导致的。动脉粥样硬化的形成受多方面因素的影响。大量的临床实验证实，血脂水平在动脉粥样硬化的发生和发展方面起了重要作用。血脂紊乱成为冠心病和动脉粥样硬化的主要危险因素。此外，炎症反应也贯穿动脉粥样硬化的整个过程，炎症反应的激活可能是导致斑块不稳定从而导致急性冠状动脉综合征的主要因素。目前认为血管内(内皮功能受损、氧化应激等)和血管外(感染等)因素导致炎症反应的发生，炎症反应又引起细胞因子的产生，进一步诱导急性时相反应物及一些炎症应答相关的效应分子的表达。
[0003] 随着科学技术的发展，临床上对冠心病的诊断手段日趋完善。早期诊断或排除冠心病对其预后极其重要。心电图是心血管疾病诊断、治疗的常用手段，它具有简便、快速、价廉、无创和重复性好等优点，但其敏感性差、假阳性率高，易漏诊、误诊。二维超声心动图、放射性核素心肌灌注显像、电子束CT等对冠心病的诊断具有较高的敏感性和特异性，但仪器价格昂贵，而冠脉造影术虽然是冠心病诊断的金标准，因其技术复杂，且具有一定的创伤性，因而也较难普及。
[0004] 随着分子生物学理论和分子生物学技术的进展，冠心病的基因机制及基因检测在冠心病诊断中的应用研究日益受到重视。基因组水平上由单个核苷酸的变异可引起DNA序列的多态性，这是引起个体间遗传差异的主要原因。这种单核苷酸的多态性造成了人类在疾病易感性等方面的不同。如核苷酸的变异在种群中的频率大于1％则称为单核苷酸多态性。已知在人类基因组中大约存在1500万个单核苷酸多态性位点，即平均每300～600bp存在一个碱基突变。这些单核苷酸多态性位点可能正是生物多样性(包括群体水平与个体水平)的物质基础，也是多基因复杂疾病及个体间患病风险与药物不同反应的物质基础。单倍体型是位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的单核苷酸多态性位点。单核苷酸多态性的基因型频率、等位基因频率及单倍体型频率都可能与疾病相关。标签单核苷酸多态性是指能代表一个染色体区域其他众多位点信息的单核苷酸多态性位点。因此研究标签单核苷酸多态性，可以提供该区域内大多数的遗传多态模式，极大提供关联分析的有效性。
检测单核苷酸多态性进行疾病的相关性分析，可以从遗传的角度将疾病的基因诊断提高到单碱基水平。单核苷酸多态性作为一种最普遍的遗传变异类型，在遗传性疾病研究、群体遗传学、药物基因组学、法医学、药物开发及复杂疾病的研究中也越来越受到关注。
检测单核苷酸多态性进行疾病的相关性分析，可以从遗传的角度将疾病的基因诊断提高到单碱基水平。单核苷酸多态性作为一种最普遍的遗传变异类型，在遗传性疾病研究、群体遗传学、药物基因组学、法医学、药物开发及复杂疾病的研究中也越来越受到关注。
[0005] 随着单核苷酸多态性研究的深入，国内外学者发现了多个与冠心病易感性密切相关的单核苷酸多态性位点。内收蛋白1是一种细胞膜骨架蛋白，内收蛋白1基因第10外显子存在G614T点突变，使氨基酸序列第460位的甘氨酸(Gly)被色氨酸(Trp)取代。研究发现内收蛋白1基因的Gly460Trp多态性不仅与冠心病密切相关(Alanna C.M，Molly S.B，Aaron R.F，et al.ADD1 460W allele associated with cardiovascular disease in hypertensive individuals.Hypertension，2002，39(6)：1053-1057)，而且还与冠心病的危险因子高血压及大动脉弹性密切相关，是高血压后冠心病发病率和死亡率的理想预警因子(Yan L，Lutgarde T，Tatiana K，et al.Cardiovascular risk inrelation to a-Adducin Gly460Trp polymorphism and systolic pressure.Hypertension，2005，46(3)：527-532)。
[0006] 血小板内皮细胞黏附分子-1是一种细胞黏附分子，在炎症过程中，血小板内皮细胞黏附分子-1可能诱导炎症起始期，它的表达会促进白细胞的迁移。血小板内皮细胞黏附分子-1基因有多个单核苷酸多态性，其中外显子2转录起始位点下游第373核苷酸由胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)所代替，导致编码产物第125位氨基酸由亮氨酸(Leu)变异为缬氨酸(Val)。国内的研究结果表明血小板内皮细胞黏附分子-1的G373C多态性与冠心病密切相关(常智堂，陈健，程龙献等，血小板内皮细胞黏附分子-1基因Leu 125 Val多态性与冠心病及危险因素的关系，中华老年心脑血管病杂志，2007，9(10)：664-667)。国外的研究结果也提示血小板内皮细胞黏附分子-1的G373C多态性与冠心病密切相关，而血小板内皮细胞黏附分子-1的G1688A多态性与冠心病无明显相关(Lu Fang，Heming Wei，Sanual H.C，et al.Association of Leu125Val polymorphism of platelet endothelial celladhesion molecule-1(PECAM-1)gene & soluble level of PECAM-1with coronary artery disease in Asian Indians.Indian J Med Res，2005，121(2)：92-99；Wei H，Fang L，Chowdhury SH，et al.Platelet-endothelial cell adhesionmolecule-1gene polymorphism and its soluble level are associated with severe coronary artery steecNOSisin Chinese Singaporean.Clin Biochem，2004，37(12)：1091-1097)。冠心病患者血清血小板内皮细胞黏附分子-1水平明显升高，并与G373C多态性的基因型相关；血清血小板内皮细胞黏附分子-1水平还与血清中血小板选择素浓度，外周血血小板数和白细胞数密切相关，提示冠心病患者炎症是血小板内皮细胞黏附分子-1水平升高的重要因素。
[0007] 血清C-反应蛋白是炎症反应的标志物。C-反应蛋白不仅可以预测冠心病发病和发生的风险，还可对冠心病的预后进行评估(Roy D，Quiles J，Avanzas P，et al.A comparative study of markersof inflammation for the assessment of cardiovascular risk in patients presenting to the emergency departmentwith acute chest pain suggestive of acute coronary syndrome.Int J Cardiol，2006，109(3)：317-321)。丁艳萍等对C-反应蛋白的1059G/C基因多态性进行了研究，发现GG基因型C-反应蛋白水平显著高于GC+CC基因型，未发现1059G/C基因多态性与冠心病发生和冠状动脉病变严重程度的相关性(丁艳萍，马周建，C反应蛋白及其基因多态性与冠心病发病的相关性研究，山东医药，2006，46(19)：36-37)。
[0008] 一氧化氮是一种重要的生物活性分子，参与调节体内血管扩张、血管通透性、血小板粘附和聚集、神经信号传递、宿主防御反应等一系列生理活动，是心血管系统中抗冠状动脉粥样硬化和血栓形成，维持正常血管舒缩反应必不可少的保护因子。内皮固有型一氧化氮合酶作为合成一氧化氮的关键酶，对一氧化氮具有重要的调控作用，其基因发生变异，可影响内皮固有型一氧化氮合酶蛋白的功能和活性。有文献报道内皮固有型一氧化氮合酶的多个单核苷酸多态性与冠心病的发病有关(Tangurek B，Ozer N，Sayar N，et al.The relationshipbetween endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism(T-786C)and coronary artery disease in theTurkish population.Heart Vessels，2006，21(5)：285-290；Lin NT，Lee MJ，Lee RP，et al.Analysis of endothelialnitric oxide synthase gene polymorphisms with cardiovascular diseases in eastern Taiwan.Chin J Physiol，2008，51(1)：42-47)。
[0009] 浆细胞膜糖蛋白1基因是胰岛素受体酪氨酸激酶活性的抑制物，可抑制胰岛素受体酪氨酸激酶活性，减弱胰岛素的生物学作用，因而是2型糖尿病的候选基因之一。糖尿病和胰岛素抵抗是冠心病的独立危险因素。研究发现，浆细胞膜糖蛋白1基因的K121Q多态性与糖尿病和冠心病的发生密切相关(Simonetta B，Ornella L，Sabrina P，et al.The K121Q polymorphism ofthe ENPP1/PC-1 gene is associated with insulin resistance/atherogenic phenotypes，including earlier onsetof type 2diabetes and myocardial infarction.Diabetes，2005，54(10)：3021-3025)。
[0010] G蛋白，又称鸟苷酸调节蛋白，是细胞膜受体与细胞内效应器之间的信号传递因子，介导G蛋白偶联受体激动后的细胞内信号传导，参与细胞的增殖与分化过程。G蛋白对维持血管壁的完整性及调节血管张力起极为重要的作用。G蛋白途径信号传导的激活可刺激血管平滑肌细胞的增殖。研究结果显示G蛋白β3亚单位C825T等位基因多态性不仅与原发性高血压相关，而且还与冠心病及冠脉的病变程度相关(Von B，Schusterschitz Y，Koch W，et al.G proteinbeta 3subunit 825T allele carriage and risk of coronary artery disease.Atherosclerosis，2003，167(1)：135-139)。
[0011] L-选择素作为一种高度糖基化的膜蛋白，主要表达于中性粒细胞、单核细胞和某些淋巴细胞亚群表面，与表达于活化内皮细胞表面的E-选择素和表达于活化血小板、内皮细胞表面的P-选择素共同构成选择素家族。L-选择素参与了白细胞的活化、炎症和创伤等过程，使白细胞沿内皮细胞表面滚动、迁移和黏附，并通过与β2整合素的黏附加强作用，使白细胞活化、变形、穿越血管内皮细胞进人心内膜下，释放炎症介质介导炎症反应。同时L-选择素与P-选择素相互识别，可触发白细胞与血小板结合，血流动力学改变，血流瘀滞，容易形成血栓，加重心肌缺血。研究结果显示中国汉族人群L-选择素基因P213S多态性与冠心病相关。冠心病组血清L-选择素水平明显升高。提示L-选择素参与了冠心病发生、发展过程(夏尊恩，李艳，熊小泉等。老年冠心病患者L-选择素P213S基因多态性研究。中国老年学杂志，2006，26(5)：594-596)。
[0012] 肾素-血管紧张素系统在维持机体水盐平衡和调节心血管活动中起着十分重要的作用。血管紧张素I转换酶是肾素-血管紧张素系统的关键酶，可将非活性类型血管紧张素转变为活性类型并灭活激肽，在维持机体水盐代谢、内环境稳定和调节心血管功能方面起着重要的作用，其在高血压发病中的作用已得到了肯定。血管紧张素I转换酶基因位于17号染色体长臂2区3带，由26个外显子和25个内含子组成。研究发现，存在于血管紧张素I转换酶基因16内含子一个大小为287bp的插入/缺失(I/D)多态性与血浆血管紧张素I转换酶水平及冠心病的发病相关(Acarturk E，Attila G，Bozkurt A，et al.Insertion/deletion polymorphismof the angiotensin converting enzyme gene in coronary artery disease in southern Turkey.J Biochem MolBiol，2005，38(4)：486-490)。在肾素-血管紧张素系统中，血管紧张素II的作用最强。血管紧张素II具有血管收缩作用并负责调节水盐代谢、醛固酮生物合成。血管紧张素II还可刺激血管平滑肌细胞生长，心肌细胞和内膜增生，提高交感神经活性，增加冠状动脉阻力，甚至可能诱发心律失常。血管紧张素II主要通过与血管紧张素II 1型受体结合而发挥作用。血管紧张素II 1型受体激活后引起水钠潴留及血压升高，是肾素-血管紧张素系统作用于效应器的关键环节。国内学者对血管紧张素II 1型受体的多个单核苷酸多态性与冠心病的相关性进行了分析，但结果不尽相同。血管紧张素原为肾素的底物，在肾素及血管紧张素转化酶的作用下形成血管紧张素II。研究结果显示血管紧张素原基因的G-6A和M235T多态性与中国汉族人群的冠心病易感性密切相关(杨帆，赵洛沙，郑红等，血管紧张素原基因G-6A多态性与冠心病的相关性研究，山东医药，2008，48(1)：19-21；任洁，贾永平，吕吉元等，血管紧张素原基因M235T多态性与冠心病的相关性研究，山西医科大学学报，2005，36(4)：439-442)。
[0013] 同型半胱氨酸血症可能通过多种机制导致动脉粥样硬化，包括造成内皮损伤和功能异常、刺激血管平滑肌细胞增生、破坏机体凝血和纤溶系统、影响脂质代谢等，使机体处于血栓前状态，从而增加了心脑血管疾病发病的危险性。高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化和血栓形成等心脑血管疾病发病的独立危险因素。在体内，蛋氨酸经脱甲基等一系列反应生成同型半胱氨酸，生成的同型半胱氨酸约有50％在蛋氨酸合成酶的作用下，以维生素B12为辅助因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成蛋氨酸，这一反应中的甲基供体是由亚甲基四氢叶酸还原酶催化N5，N10-亚甲基四氢叶酸而产生。所以亚甲基四氢叶酸还原酶是蛋氨酸代谢中的一个关键酶。亚甲基四氢叶酸还原酶的基因突变，可导致酶活性降低，引起叶酸和维生素B12代谢障碍，进而影响同型半胱氨酸转化为蛋氨酸，使得体内同型半胱氨酸水平增高。研究结果显示亚甲基四氢叶酸还原酶基因的C677T多态性分布在冠心病组与对照组之间存在显著差异，并与冠心病的发病年龄密切相关(Mager A，Koren-Morag N，Shohat M，et al.Impact of ethnicity and MTHFR genotype on age at ohset of coronaryartery di sease in women in Israel.Isr Med Assoc J，
2008，10(7)：516-519)，但与冠心病的预后无关(JoséM.G P，Salvador E C，Manuel J N，et al.Influence of 677 C→T polymorphism of methylenetetrahydrofolatereductase on medium-term progecNOSis after acute coronary syndromes.Tex Heart Inst J，
2007，34(2)：142-147)。通过对其3种不同基因型个体血浆同型半胱氨酸水平进行检测，结果表明冠心病组的血浆同型半胱氨酸水平明显高于对照组，不论是在冠心病组还是在对照组中，TT基因型个体的同型半胱氨酸水平都高于TC基因型和CC基因型的个体，而这两组中TC基因型与CC基因型个体的同型半胱氨酸水平之间的差异没有显著性。在对亚甲基四氢叶酸还原酶基因另一多态性A1298C与冠心病的相关性研究中，针对不同的民族种群得到的结果却不尽相同。
2008，10(7)：516-519)，但与冠心病的预后无关(JoséM.G P，Salvador E C，Manuel J N，et al.Influence of 677 C→T polymorphism of methylenetetrahydrofolatereductase on medium-term progecNOSis after acute coronary syndromes.Tex Heart Inst J，
2007，34(2)：142-147)。通过对其3种不同基因型个体血浆同型半胱氨酸水平进行检测，结果表明冠心病组的血浆同型半胱氨酸水平明显高于对照组，不论是在冠心病组还是在对照组中，TT基因型个体的同型半胱氨酸水平都高于TC基因型和CC基因型的个体，而这两组中TC基因型与CC基因型个体的同型半胱氨酸水平之间的差异没有显著性。在对亚甲基四氢叶酸还原酶基因另一多态性A1298C与冠心病的相关性研究中，针对不同的民族种群得到的结果却不尽相同。
[0014] 肝脂酶是由肝实质细胞合成，是脂蛋白代谢中重要的关键酶之一，能水解各种脂蛋白内的甘油三酯和磷脂。肝脂肪酶活力异常可引起血浆脂蛋白代谢紊乱，与冠心病发生有一定的相关性。通过对肝脂肪酶基因启动子-250G/A、-514C/T、-710T/C和-763A/G 4个位点单核苷酸多态性的检测，发现肝脂肪酶基因的多态性与冠心病相关(施金俏，倪培华，郑寿贵等，肝脂酶基因启动子250G/A多态性与冠心病的关系，中华检验医学杂志，2006，29(6)：515-517；胡敏，邵建国，朱毅等，肝脂肪酶基因-514C/T多态性与冠心病相关性研究，中国药理学通报，2006，22(9)：1118-1121.)。
[0015] 目前单核苷酸多态性的检测方法主要有测序，高效液相色谱，限制性酶切，基因芯片和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)等。这些方法只能检测一个或少数几个单核苷酸多态性，不适合多个单核苷酸多态性，多种类型单核苷酸多态性和大批量标本的检测。因此选择国际单倍型图工程数据库上公布的内收蛋白1，血小板内皮细胞黏附分子-1，C-反应蛋白，内皮固有型一氧化氮合酶，浆细胞膜糖蛋白1，L-选择素，G蛋白β3亚单位，血管紧张素I转换酶，血管紧张素II 1型受体，血管紧张素原，亚甲基四氢叶酸还原酶和肝脂肪酶基因中国汉族人群的标签单核苷酸多态性，建立多个单核苷酸多态性的检测方法，通过对单核苷酸多态性进行基因分型，筛选与冠心病相关的单核苷酸多态性，从遗传学水平为心血管危险因素的预测和防治提供了一种新思路，使得人们可以通过对健康人群或早期出现心血管危险因素群体的基因多态性分型，及时预测和评价心血管疾病风险，为心血管疾病早期预防和及时治疗提供理论的指导。
发明内容
[0016] (一)要解决的技术问题
[0017] 本发明的目的是提供一种同时检测12个与冠心病相关基因的32个中国汉族人群标签单核苷酸多态性位点的方法。这些基因及32个标签单核苷酸多态性位点是内收蛋白1基因：rs3775067、rs1263359，血小板内皮细胞黏附分子-1基因：rs503550，C-反应蛋白基因：rs1205，内皮固有型一氧化氮合酶基因：rs7830、rs3918188，浆细胞膜糖蛋白1基因：rs12528076、rs858341、rs021966、rs858345、rs9308995，L-选择素基因：rs964555、rs2205848、rs4987318、rs2298900，G蛋白β3亚单位基因：rs5445，血管紧张素I转换酶基因：rs4333、rs4305、rs4353，血管紧张素II 1型受体基因：rs6801836、rs2675511、rs5182，血管紧张素原基因：rs1926722、rs7539020、rs3889728、rs493132、rs478523，亚甲基四氢叶酸还原酶基因：rs1801133、rs9651118、rs6541003和肝脂肪酶基因：rs12462668、rs10426971。
[0018] (二)技术方案
[0019] 本发明所述方法的基本原理为单碱基延伸和标签微阵列。单碱基延伸法又称微测序法，是在双脱氧测序法的基础上发展出来的单核苷酸多态性检测方法。首先用PCR的方法从基因组DNA中扩增出含有目的单核苷酸多态性位点的片段，用一条与单核苷酸多态性位点上游序列相匹配的引物进行“测序反应”，并在反应中加入荧光标记的双脱氧核苷酸，使得这个“测序反应”测出单核苷酸多态性位点是哪个碱基后便终止了。SNP Stream基因分型系统是一套高自动化，高通量的单核苷酸多态性分型系统，它将多重PCR技术与荧光标记单碱基延伸分型技术结合起来，同时将寡核苷酸微阵列技术应用于常规的384孔板内，并引入微阵列芯片杂交技术，结果可由成像仪上的双色荧光读出，该系统可同时对4种类型多至48个单核苷酸多态性位点进行大批量样本快速检测(Wang IJ，Chiang TH，Shih YF，etal.The association of single nucleotide polymorphisms in the MMP-9genes with susceptibi lity to acute primaryangle closure glaucoma in Taiwanese patients.Molecular Vision，2006，12：1223-1232；Pollin TI，Tanner K，Connell JR，et al.Linkage of plasma adiponectin levels to 3q27explained by association with variation inthe APM1gene.Diabetes，2005，54：268-274；Damcott CM，Ott SH，Pollin TI，et al.Genetic variation inadiponectin receptor 1and adiponectin receptor2is associated with type 2diabetes in the old order amish.Diabetes，2005，54：
2245-2250)。
2245-2250)。
[0020] 本发明所述的方法，它包括下述步骤：
[0021] (1)设计用于扩增含有目的单核苷酸多态性位点片段的32对引物及测序和杂交的32条延伸引物见表1。
[0022] 表1本发明所设计的32对引物及测序和杂交的32条延伸引物
[0023]
[0024]
[0025]
[0026] (2)稀释并混合PCR引物使其终浓度为2.5μM，构建PCR引物池并对目的片段进行扩增。每96人份PCR反应体系为：
[0027]
[0028] 试剂成分 体积(μL)
[0029]
[0030] 引物池(2.5μM) 11.2
[0031] 脱氧核苷酸(2.5mM) 20
[0032] 10倍PCR缓冲液II 56.2
[0033] 氯化镁(25mM) 112.6
[0034] 金牌扩增酶(5U/μL) 11.2
[0035] 双蒸水 126
[0036]
[0037] PCR循环条件为：
[0038]
[0039] (3)对扩增产物进行纯化。纯化液的配制：
[0040]
[0041] 试剂成分 体积(μL )
[0042]
[0043] 外切酶I(20U/μL) 11.2
[0044] 虾碱性磷酸酶(1U/μL) 112
[0045] 10倍虾碱性磷酸酶缓冲液 34
[0046] 双蒸水 180
[0047]
[0048] 纯化反应的条件为：
[0049]
[0050] (4)稀释并混合延伸引物使其终浓度为5μM，构建延伸引物池，进行延伸反应。每96人份PCR反应体系为：
[0051]
[0052] 试剂成分 体积(μL)
[0053]
[0054] 延伸稀释缓冲液 423
[0055] 延伸引物池 3.4
[0056] 20倍延伸双脱氧核苷酸(T/C和A/G) 各11.3
[0057] 双蒸水 334
[0058] DNA聚合酶 2.36
[0059]
[0060] 延伸反应的条件为：
[0061]
[0062] (5)杂交。在延伸产物中加入8μL杂交液(50μL杂交试剂加到850μL杂交缓冲液中)，混匀后取15μL加入杂交板反应孔中，42℃杂交2h。
[0064] 图1标本的单核苷酸多态性扫描结果经SNP Stream基因分型系统扫描，可以获得三种颜色的扫描结果，即纯合型的蓝色(XXL＝0.95，XXU＝1.0)或绿色(YYL＝0.02，YYU＝0.06)，杂合型的橙色(XYL＝0.38，XYU＝0.7)，基准线(baseline＝2.22)。
[0065] 本发明的有益效果
[0066] 本发明所述的方法运用单碱基延伸和标签微阵列原理，在同一体系中可同时检测32个单核苷酸多态性位点的基因型，具有快速、准确、高通量、操作简单、微量化等优点。
[0067] 本发明中实验所用脱氧核苷酸购自日本TaKaRa公司，PCR缓冲液II、氯化镁、金牌扩增酶购自瑞士Roche公司，外切酶I购自新英格兰BioLabs公司，虾硷性磷酸酶及其缓冲液、灭菌双蒸水购自美国Promega公司，其他试剂、溶液、杂交板等除已标明来源外均购自美国Beckman Coulter公司。
具体实施方式
[0068] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0069] 实施例1用本发明所述的方法同时检测中国汉族人群32个单核苷酸多态性位点的基因型。
[0070] (1)设计用于扩增含有目的单核苷酸多态性位点片断的32对引物及测序和杂交的32条延伸引物，详见序列1至序列96。。
[0071] (2)稀释并混合PCR引物使其终浓度为2.5μM，构建PCR引物池并对目的片段进行扩增。每96人份PCR反应体系为：
[0072]
[0073] 试剂成分 体积(μL)
[0074]
[0075] 引物池(2.5μM) 11.2
[0076] 脱氧核苷酸(2.5mM) 20
[0077] 10倍PCR缓冲液II 56.2
[0078] 氯化镁(25mM) 112.6
[0079] 金牌扩增酶(5U/μL) 11.2
[0080] 双蒸水 126
[0081]
[0082] PCR循环条件为：
[0083]
[0084]
[0085] (3)对扩增产物进行纯化。纯化液的配制：
[0086]
[0087] 试剂成分 体积(μL)
[0088]
[0089] 外切酶I(20U/μL) 11.2
[0090] 虾碱性磷酸酶(1U/μL) 112
[0091] 10倍虾碱性磷酸酶缓冲液 34
[0092] 双蒸水 180
[0093]
[0094] 纯化反应的条件为：
[0095]
[0096] (4)稀释并混合延伸引物使其终浓度为5μM，构建延伸引物池，进行延伸反应。每96人份PCR反应体系为：
[0097]
[0098] 试剂成分 体积(μL)
[0099]
[0100] 延伸稀释缓冲液 423
[0101] 延伸引物池 3.4
[0102] 20倍延伸双脱氧核苷酸(T/C和A/G) 各11.3
[0103] 双蒸水 334
[0104] DNA聚合酶 2.36
[0105]
[0106] 延伸反应的条件为：
[0107]
[0108] (5)杂交。在延伸产物中加入8μL杂交液(50μL杂交试剂加到850μL杂交缓冲液中)，混匀后取15μL加入杂交板反应孔中，42℃杂交2h。1000转离心甩干。吸取20μL稀释后的冲洗缓冲液2(60倍冲洗缓冲液2)加入到杂交板上的每个孔中，离心甩干，一共清洗3次。
[0109] (6)扫描：在SNPstream V2.2软件(Beckman Coulter公司)中输入与杂交板每个反应孔对应的样品信息，导入引物位点文件，扫描杂交板后通过该软件分析扫描信号并导出结果。
[0111] <110>中国人民解放军总医院
[0112] <120>一种同时检测32个单核苷酸多态性位点基因型的方法
[0113] <160>96
[0114] <210>1
[0115] <211>20
[0116] <212>DNA
[0117] <213>人工序列
[0118] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6541003 SNP位点的上游引物：
[0119] <400>1
[0120] CACTGATCAT CCGAATCACC 20
[0121] <210>2
[0122] <211>22
[0123] <212>DNA
[0124] <213>人工序列
[0125] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6541003 SNP位点的下游引物：
[0126] <400>2
[0127] TTTTTCAAAA AGTGGATCTC CA 22
[0128] <210>3
[0129] <211>45
[0130] <212>DNA
[0131] <213>人工序列
[0132] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6541003 SNP位点的延伸引物：
[0133] <400>3
[0134] CTCACTATCT GACAAGCCAC GCTCAAGAAG TAAAACACAC ATTCC 45
[0135] <210>4
[0136] <211>18
[0137] <212>DNA
[0138] <213>人工序列
[0139] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7503550 SNP位点的上游引物：
[0140] <400>4
[0141] AAGGCTGAGG ACCTGGCC 18
[0142] <210>5
[0143] <211>25<212>DNA
[0144] <213>人工序列
[0145] <220>
[0146] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7503550 SNP位点的下游引物：
[0147] <400>5
[0148] ATTATGTGAT CTGTAGTTTG GAAGC 25
[0149] <210>6
[0150] <211>45
[0151] <212>DNA
[0152] <213>人工序列
[0153] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7503550 SNP位点的延伸引物：
[0154] <400>6
[0155] CTAACTAAGC TACGCCGACA TTCCTCCCGA TCCCCTCCAA ACCCA
[0156] <210>7
[0157] <211>27
[0158] <212>DNA
[0159] <213>人工序列
[0160] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3775067 SNP位点的上游引物：
[0161] <400>7
[0162] TAACCAATTC AAACTTATTT AATCAGC 27
[0163] <210>8
[0164] <211>23
[0165] <212>DNA
[0166] <213>人工序列
[0167] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3775067 SNP位点的下游引物：
[0168] <400>8
[0169] TGTGGTGGAG ATTAGTGCTA AGT 23
[0170] <210>9
[0171] <211>45
[0172] <212>DNA
[0173] <213>人工序列
[0174] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3775067 SNP位点的延伸引物：
[0175] <400>9
[0176] CACCGCTATC AACAGACTTG CCAATCACAG CTGTAACATT TTCAC 45
[0177] <210>10
[0178] <211>23
[0179] <212>DNA
[0180] <213>人工序列
[0181] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1926722 SNP位点的上游引物：
[0182] <400>10
[0183] TGTAGGTTTT GCTGAAATTT TCC
[0184] <210>11
[0185] <211>18
[0186] <212>DNA
[0187] <213>人工序列
[0188] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1926722 SNP位点的下游引物：
[0189] <400>11
[0190] CCAGGCAGGC TTATGCTC 18
[0191] <210>12
[0192] <211>45
[0193] <212>DNA
[0194] <213>人工序列
[0195] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1926722 SNP位点的延伸引物：
[0196] <400>12
[0197] CACGACAAGA CAACAGATAC GGATGACTTA GTTGGGTGAT GGGGG 45
[0198] <210>13
[0199] <211>21
[0200] <212>DNA
[0201] <213>人工序列
[0202] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1205 SNP位点的上游引物：
[0203] <400>13
[0204] TCTGTTGTTT GTCAATCCCT T 21
[0205] <210>14
[0206] <211>21
[0207] <212>DNA
[0208] <213>人工序列
[0209] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1205 SNP位点的下游引物：
[0210] <400>14
[0211] ATCTTCTTGC TGCTGGATTT C 21
[0212] <210>15
[0213] <211>45
[0214] <212>DNA
[0215] <213>人工序列
[0216] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1205 SNP位点的延伸引物：
[0217] <400>15
[0218] ACGTAAGACC ACTCAAGACC ACTTCCAGTT TGGCTTCTGT CCTCA 45
[0219] <210>16
[0220] <211>18
[0221] <212>DNA
[0222] <213>人工序列
[0223] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7539020 SNP位点的上游引物：
[0224] <400>16
[0225] ACCAGGCCCC CTGACTCT 18
[0226] <210>17
[0227] <211>22
[0228] <212>DNA
[0229] <213>人工序列
[0230] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7539020 SNP位点的下游引物：
[0231] <400>17
[0232] GGGATAAGCT AAAAGGCAGA TT 22
[0233] <210>18
[0234] <211>45
[0235] <212>DNA
[0236] <213>人工序列
[0237] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7539020 SNP位点的上游引物：
[0238] <400>18
[0239] ACCGCACTAA GCAATGTATC ATCCACGAGC TGAAGCACCA ATCTA 45
[0240] <210>19
[0241] <211>28
[0242] <212>DNA
[0243] <213>人工序列
[0244] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs5445 SNP位点的上游引物：
[0245] <400>19
[0246] ATCTCATTCA GGTGTTCTCT TCTATATT 28
[0247] <210>20
[0248] <211>18
[0249] <212>DNA
[0250] <213>人工序列
[0251] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs5445 SNP位点的下游引物：
[0252] <400>20
[0253] TGTCCCTGAT GCTGCCTC 18
[0254] <210>21
[0255] <211>45
[0256] <212>DNA
[0257] <213>人工序列
[0258] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs5445 SNP位点的延伸引物：
[0259] <400>21
[0260] CACTAGTCAT AACGCAGCCT GGGTGCCATT CCCACTAAGC TTTCT 45
[0261] <210>22
[0262] <211>18
[0263] <212>DNA
[0264] <213>人工序列
[0265] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3889728 SNP位点的上游引物：
[0266] <400>22
[0267] GAGGGAAAAG GGGAGCTG 18
[0268] <210>23
[0269] <211>18
[0270] <212>DNA
[0271] <213>人工序列
[0272] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3889728 SNP位点的下游引物：
[0273] <400>23
[0274] TGAGGTTTCC CTGATGCA 18
[0275] <210>24
[0276] <211>45
[0277] <212>DNA
[0278] <213>人工序列
[0279] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3889728 SNP位点的延伸引物：
[0280] <400>24
[0281] CAGTCAACAA TCCAGATCAA GAGAGAGTTG AGAGTGCCCG GTGTG 45
[0282] <210>25
[0283] <211>22
[0284] <212>DNA
[0285] <213>人工序列
[0286] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2493132 SNP位点的上游引物：
[0287] <400>25
[0288] TAAACTAAAA AAGGGAAGCT GC 22
[0289] <210>26
[0290] <211>18
[0291] <212>DNA
[0292] <213>人工序列
[0293] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2493132 SNP位点的下游引物：
[0294] <400>26
[0295] TCGACAGATT TACCTAGCCT CC 22
[0296] <210>27
[0297] <211>45
[0298] <212>DNA
[0299] <213>人工序列
[0300] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2493132 SNP位点的延伸引物：
[0301] <400>27
[0302] CAGAACATCC TCAGAAGCAA CCGTCTTCCC TCTGCTCGTC TGACA 45
[0303] <210>28
[0304] <211>20
[0305] <212>DNA
[0306] <213>人工序列
[0307] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7830 SNP位点的上游引物：
[0308] <400>28
[0309] CCTCTGTCCC TAGATTGTGT 20
[0310] <210>29
[0311] <211>18
[0312] <212>DNA
[0313] <213>人工序列
[0314] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7830 SNP位点的下游引物：
[0315] <400>29
[0316] ATTCTGGCAG GAGCGGCT 18
[0317] <210>30
[0318] <211>45
[0319] <212>DNA
[0320] <213>人工序列
[0321] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs7830 SNP位点的延伸引物：
[0322] <400>30
[0323] GCAAGCCATC AGCTAATACA ACTCCCTTCA GGCAGTCCTT TAGTC 45
[0324] <210>31
[0325] <211>20
[0326] <212>DNA
[0327] <213>人工序列
[0328] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3918188 SNP位点的上游引物：
[0329] <400>31
[0330] CCCAGCTGAA GCATTTAAAA 20
[0331] <210>32
[0332] <211>18
[0333] <212>DNA
[0334] <213>人工序列
[0335] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3918188 SNP位点的下游引物：
[0336] <400>32
[0337] TGAAGGGCAG CTCGGTGG 18
[0338] <210>33
[0339] <211>45
[0340] <212>DNA
[0341] <213>人工序列
[0342] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3918188 SNP位点的延伸引物：
[0343] <400>33
[0344] CGCAGAAGCA ACTCACTTCT TGGGAGCAAG GCACACGTAC AAGGG 45
[0345] <210>34
[0346] <211>18
[0347] <212>DNA
[0348] <213>人工序列
[0349] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4353 SNP位点的上游引物：
[0350] <400>34
[0351] ATGAGATGCA GAATCGCC 18
[0352] <210>35
[0353] <211>18
[0354] <212>DNA
[0355] <213>人工序列
[0356] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4353 SNP位点的下游引物：
[0357] <400>35
[0358] ATTGTGTACT TTCTAGAGAA TGTGTGG 27
[0359] <210>36
[0360] <211>45
[0361] <212>DNA
[0362] <213>人工序列
[0363] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4353 SNP位点的延伸引物：
[0364] <400>36
[0365] AGACCGACAA GCAATCTACA TGTACACATG CTTTATCTCC CAAGA 45
[0366] <210>37
[0367] <211>19
[0368] <212>DNA
[0369] <213>人工序列
[0370] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1801133 SNP位点的上游引物：
[0371] <400>37
[0372] AGCTTTGAGG CTGACCTGA 19
[0373] <210>38
[0374] <211>18
[0375] <212>DNA
[0376] <213>人工序列
[0377] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1801133 SNP位点的下游引物：
[0378] <400>38
[0379] ATGTCGGTGC ATGCCTTC 18
[0380] <210>39
[0381] <211>45
[0382] <212>DNA
[0383] <213>人工序列
[0384] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1801133 SNP位点的延伸引物：
[0385] <400>39
[0386] CCATAACAAC TTACCAGCCA TTGAAGGAGA AGGTGTCTGC GGGAG 45
[0387] <210>40
[0388] <211>19
[0389] <212>DNA
[0390] <213>人工序列
[0391] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12528076 SNP位点的上游引物：
[0392] <400>40
[0393] AACGCAAGAA AGTAGGGCT 19
[0394] <210>41
[0395] <211>24
[0396] <212>DNA
[0397] <213>人工序列
[0398] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12528076 SNP位点的下游引物：
[0399] <400>41
[0400] TCTAGAGGGT CTCCCACTAG TTTA 24
[0401] <210>42
[0402] <211>45
[0403] <212>DNA
[0404] <213>人工序列
[0405] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12528076 SNP位点的延伸引物：
[0406] <400>42
[0407] AGTAGCCTAA CAGCACTCGA GCTGCAATGC TCAGTGGATG TGATG 45
[0408] <210>43
[0409] <211>18
[0410] <212>DNA
[0411] <213>人工序列
[0412] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4305 SNP位点的上游引物：
[0413] <400>43
[0414] AAACAAGCAC TGTGGCCC 18
[0415] <210>44
[0416] <211>18
[0417] <212>DNA
[0418] <213>人工序列
[0419] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4305 SNP位点的下游引物：
[0420] <400>44
[0421] ATGTCCTGGG GCTGCAAG 18
[0422] <210>45
[0423] <211>45
[0424] <212>DNA
[0425] <213>人工序列
[0426] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4305 SNP位点的延伸引物：
[0427] <400>45
[0428] GCAACATAAG ACCGCTCAAC ATGCTGCCAC TGTCATTTCT GGCTG 45
[0429] <210>46
[0430] <211>20
[0431] <212>DNA
[0432] <213>人工序列
[0433] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs10426971 SNP位点的上游引物：
[0434] <400>46
[0435] TGCTGAGACC AAAGGTAAAT 20
[0436] <210>47
[0437] <211>26
[0438] <212>DNA
[0439] <213>人工序列
[0440] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs10426971 SNP位点的下游引物：
[0441] <400>47
[0442] TTCTTCTGAA AAGTAATCAC TTGGTA 26
[0443] <210>48
[0444] <211>45
[0445] <212>DNA
[0446] <213>人工序列
[0447] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs10426971 SNP位点的延伸引物：
[0448] <400>48
[0449] GATCCATCAA CAGACATCAC CACTGCAGCA GAGCACTGCA GTCCT 45
[0450] <210>49
[0451] <211>20
[0452] <212>DNA
[0453] <213>人工序列
[0454] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6801836 SNP位点的上游引物：
[0455] <400>46
[0456] AAATTCTTCT CCCTTTTTCC TC 22
[0457] <210>50
[0458] <211>26
[0459] <212>DNA
[0460] <213>人工序列
[0461] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6801836 SNP位点的下游引物：
[0462] <400>50
[0463] CCAATTAGAA GAACATTTTA CATAAATG 28
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[0641] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs9651118 SNP位点的延伸引物：
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[0685] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2205848 SNP位点的延伸引物：
[0686] <400>81
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[0714] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2298900 SNP位点的上游引物：
[0715] <400>85
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[0721] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2298900 SNP位点的下游引物：
[0722] <400>86
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[0742] <220>
[0743] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs858345 SNP位点的下游引物：
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[0763] <213>人工序列
[0764] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2478523 SNP位点的下游引物：
[0765] <400>92
[0766] TTGAAAGACA GACACTAACT GGAG 24
[0767] <210>93
[0768] <211>45
[0769] <212>DNA
[0770] <213>人工序列
[0771] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2478523 SNP位点的延伸引物：
[0772] <400>93
[0773] CTCAGACTAC GAATCCACGT CCTGTGTGTC TGTCTACCAG TCCTC 45
[0774] <210>94
[0775] <211>18
[0776] <212>DNA
[0777] <213>人工序列
[0778] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4333 SNP位点的上游引物：
[0779] <400>94
[0780] TGAGAGCTCA TGTGCAGG 18
[0781] <210>95
[0782] <211>21
[0783] <212>DNA
[0784] <213>人工序列
[0785] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4333 SNP位点的下游引物：
[0786] <400>95
[0787] AAAACAAGAA AGGGCATTTC C 21
[0788] <210>96
[0789] <211>45
[0790] <212>DNA
[0791] <213>人工序列
[0792] <223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4333 SNP位点的延伸引物：
[0793] <400>96
[0794] TACAAGCACG CACTAGACAT TGCTGGGTGA GAGCACAGAG TTGGG 45
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