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酵母中的油酸生产

阅读：962发布：2023-03-03

专利汇可以提供酵母中的油酸生产专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了转化的细胞，所述细胞包含影响所述细胞的脂质含量的一种或多种遗传修饰，这例如通过相对于同一类型的未修饰的细胞增加所述细胞中油酸的浓度来实现。还公开了用于改变细胞的脂质含量的方法，所述方法是通过提高所述细胞中一种或多种 蛋白质 的活性和/或通过降低所述相同细胞中一种或多种蛋白质的活性来实现的。，下面是酵母中的油酸生产专利的具体信息内容。

1.一种转化的细胞，所述细胞包含第一遗传修饰和第二遗传修饰，所述第一遗传修饰和所述第二遗传修饰选自由以下各项组成的组：
降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白、天然Δ9去饱和酶蛋白、或天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传修饰；以及
增加甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白、延长酶蛋白、或二酰基甘油酰基转移酶蛋白的表达的遗传修饰。
2.如权利要求1所述的细胞，其中所述第一遗传修饰或所述第二遗传修饰是用包含编码甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白、Δ9去饱和酶蛋白、延长酶蛋白、或二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因的核酸进行转化。
3.如权利要求2所述的细胞，其中所述核酸编码与以下各项中所示的序列具有至少
95％序列同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:
37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:147；SEQ ID NO:149；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；
SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:
95；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:127；SEQ ID NO:129；SEQ ID NO:131；SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:135；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:139；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:151；SEQ ID NO:
153；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:157；SEQ ID NO:159；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:115；或SEQ ID NO:117。
4.如权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中所述第一遗传修饰或所述第二遗传修饰(a)降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白、天然Δ9去饱和酶蛋白、或天然Δ12去饱和酶蛋白的活性，并且(b)所述修饰是敲除突变。
5.如权利要求1至4中任一项所述的细胞，所述细胞进一步包含第三遗传修饰，所述第三遗传修饰选自由以下各项组成的组：
提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、或磷脂:
二酰基甘油酰基转移酶；以及
降低以下各项的活性的遗传修饰：天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
6.如权利要求5所述的细胞，其中：
所述第三遗传修饰提高以下各项的活性：Δ9去饱和酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶；并且
所述第三遗传修饰是用包含编码以下各项的基因的核酸进行转化：Δ9去饱和酶蛋白、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白、溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白、磷脂酸磷酸酶蛋白、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白、或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白。
7.如权利要求6所述的细胞，其中所述核酸编码与以下各项中所示的序列具有至少
95％序列同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11；
SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:111；SEQ ID NO:113；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:
61；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:75；SEQ ID NO:77；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:119；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:123；SEQ ID NO:125；SEQ ID NO:105；或SEQ ID NO:109。
8.如权利要求5所述的细胞，其中所述第三遗传修饰是敲除突变。
9.如权利要求5或8所述的细胞，其中：
所述细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；
所述第三遗传修饰降低以下各项的活性：天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶；并且
所述天然三酰基甘油脂酶具有SEQ ID NO:91中所示的氨基酸序列；所述天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶具有SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列；所述天然溶血磷脂酸酰基转移酶具有SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列；所述天然磷脂酸磷酸酶具有SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列；并且所述天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶具有SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列。
10.如权利要求5或8所述的细胞，其中：
所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母(Arxula adeninivorans)；
所述第三遗传修饰降低以下各项的活性：天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶；并且
所述天然三酰基甘油脂酶具有SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、或SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列；所述天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶具有SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列；所述天然溶血磷脂酸酰基转移酶具有SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列；所述天然磷脂酸磷酸酶具有SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列；并且所述天然磷脂:
二酰基甘油酰基转移酶具有SEQ ID NO:105中所示的氨基酸序列。
11.如权利要求5或8所述的细胞，其中：
所述细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；
所述第三遗传修饰降低天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶的活性；并且并且所述天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶具有SEQ ID NO:119中所示的氨基酸序列。
12.如权利要求1至8中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：藻类、细菌、霉菌、真菌、植物、以及酵母。
13.如权利要求12所述的细胞，其中所述细胞是酵母、真菌、或酵母样藻类。
14.如权利要求13所述的细胞，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：阿克苏拉酵母属(Arxula)、曲霉属(Aspegillus)、破囊壶菌属(Aurantiochytrium)、假丝酵母属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉菌属(Cunninghamella)、地霉属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、柯达酵母属(Kodamaea)、白冬孢酵母属(Leucosporidiella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、欧加铁酵母属(Ogataea)、毕赤酵母属(Pichia)、原壁藻属(Prototheca)、根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、丝孢酵母属(Trichosporon)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、以及耶氏酵母属(Yarrowia)。
15.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus orzyae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、紫色麦角菌(Claviceps purpurea)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、拉氏隐球菌(Cryptococcus ramirezgomezianus)、地生隐球菌(Cryptococcus terreus)、威氏隐球菌(Cryptococcus wieringae)、刺孢小克银汉霉菌(Cunninghamella echinulata)、日本小克银汉霉菌(Cunninghamella japonica)、发酵地霉(Geotrichum fermentans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)、克里替弗拉白冬孢酵母(Leucosporidiella creatinivora)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)、黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、多形欧加铁酵母(Ogataea polymorpha)、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia  pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)、饶氏原壁藻(Prototheca zopfii)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、巴布维红冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、沼泽生红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、恩氏银耳(Tremella enchepala)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、发酵丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、西弗威克汉姆酵母(Wickerhamomyces ciferrii)、以及解脂耶氏酵母。
16.如权利要求15所述的细胞，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、酿酒酵母、以及解脂耶氏酵母。
17.如权利要求9或16所述的细胞，其中：
所述细胞是解脂耶氏酵母；
所述第一遗传修饰或所述第二遗传修饰降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白、天然Δ9去饱和酶蛋白、或天然Δ12去饱和酶蛋白的活性；并且
所述天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列；所述天然Δ9去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列；并且所述天然Δ12去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
18.如权利要求10或16所述的细胞，其中：
所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母；
所述第一遗传修饰或所述第二遗传修饰降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白、天然Δ9去饱和酶蛋白、或天然Δ12去饱和酶蛋白的活性；并且
所述天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列；所述天然Δ9去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列；并且所述天然Δ12去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列。
19.如权利要求1至18中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含至少50％的脂质，所述
50％的脂质是通过干细胞重量％所测量。
20.如权利要求1至19中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含浓度为至少70％的油酸，所述油酸的浓度为占所述细胞中总C16和C18脂肪酸的百分比。

说明书全文

酵母中的油酸生产

[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2014年12月10日提交的美国临时专利申请序列号62/090,169的优先权益。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式递交并且在此以引用的方式整体并入本文。所述在2015年12月8日创建的ASCII拷贝被命名为NGX-03725_SL.txt
并且具有523,236个字节的大小。

背景技术

[0005] 脂质是食品和化妆品行业中不可缺少的成分，并且它们是生物柴油和生物化学行业中重要的前体。包括被良好表征的酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在内的许
多含油微生物产生脂质。
[0006] 微生物合成具有不同的碳链长度和不饱和度的脂质。这些脂肪酸可以作为贮存脂质，例如作为三酰基甘油酯(TAG)被贮存在细胞器中，被称作脂质体或脂滴。细胞的脂质谱，即构成细胞中总脂质的脂肪酸物质的相对量，是通过合成脂肪酸的各种酶(脂肪酸合酶、延长酶、去饱和酶)、通过将脂肪酸并入到贮存脂质中来使它们稳定的各种酶(酰基转移酶)以及降解脂肪酸并且贮存脂质的各种酶(例如脂酶)的活性和底物特异性来确定的。
[0007] 在使脂质产品以特定的市场/应用为目标时，能够调控细胞的脂质谱以提高特定的脂肪酸的浓度的能力是所期望的。确切地说，提高含油酵母，如解脂耶氏酵母的油酸含量提高了生物体中产生的TAG的值。
[0008] 含油生物体的脂质收率可以通过牵涉到脂质途径中的基因的上调、下调、或缺失来增加。然而，成功调节酶最好也只不过是不可预测的。举例来说，在解脂耶氏酵母中使来自高山被孢霉(Mortierella alpine)的DGA1过表达对脂质含量没有显著的影响(美国专利
7,198,937；以引用的方式并入本文)；同样，使DGA2过表达在不存在其它遗传修饰的情况下对脂质含量没有显著的影响。
发明内容
[0009] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：藻类、细菌、霉菌、真菌、植物、以及酵母。所述细胞可以是酵母。举例来说，所述细胞可以是选自由以下各项组成的组的酵母：噬腺嘌呤阿克苏拉酵母(Arxula adeninivorans)、酿
酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、以及解脂耶氏酵母。
[0010] 在一些实施方案中，所述转化的细胞包含提高所述细胞中一种或多种蛋白质的活性的一种或多种遗传修饰。举例来说，所述转化的细胞可以包含提高以下各项的活性的一
种或多种遗传修饰：Δ9去饱和酶蛋白；延长酶蛋白；1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白；
sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白；溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白；磷脂酸磷酸酶蛋白；甘
油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白；和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白。
所述一种或多种遗传修饰可以是用编码以下各项的一种或多种核酸进行的转化：Δ9去饱
和酶蛋白；延长酶蛋白；1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白；sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白；溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白；磷脂酸磷酸酶蛋白；甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白；和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白。
[0011] 在一些实施方案中，所述转化的细胞包含降低所述细胞中天然蛋白质的活性的一种或多种遗传修饰。举例来说，所述转化的细胞可以包含降低以下各项的活性的一种或多
种遗传修饰：天然的Δ9去饱和酶蛋白；天然的Δ12去饱和酶蛋白；天然的二酰基甘油酰基转移酶蛋白；天然的三酰基甘油脂酶蛋白；天然的sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白；天然的溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白；天然的磷脂酸磷酸酶蛋白；天然的甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白；天然的甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白；和/或天然的磷脂:二酰基
甘油酰基转移酶蛋白。所述一种或多种遗传修饰可以是例如敲除突变。
[0012] 在一些方面，本发明涉及一种源自于本发明的转化的细胞的产品。在一些实施方案中，所述产品包含油、脂质、或三酰基甘油。所述产品可以包含硬脂酸、油酸、或亚油酸。举例来说，所述产品可以是油酸。
[0013] 在一些方面，本发明涉及改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括转化所述细胞。所述细胞可以选自由以下各项组成的组：藻类、细菌、霉菌、真菌、植物、以及酵母，例如，所述细胞可以是酵母。举例来说，所述细胞可以是选自由以下各项组成的组的酵母：噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、酿酒酵母、以及解脂耶氏酵母。
[0014] 在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中一种或多种蛋白质的活性的一种或多种核酸转化。举例来说，所述一种或多种核酸可以提高以下各项的活
性：Δ9去饱和酶蛋白；延长酶蛋白；1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白；甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白；sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白；溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白；磷脂酸磷酸酶蛋白；甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白；和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白。所述一种或多种核
酸可以编码Δ9去饱和酶基因、延长酶基因、1型二酰基甘油酰基转移酶基因、2型二酰基甘油酰基转移酶基因、3型二酰基甘油酰基转移酶基因、甘油-3-磷酸酰基转移酶基因、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶基因、溶血磷脂酸酰基转移酶基因、磷脂酸磷酸酶基因、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶基因、和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶基因。
[0015] 在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然蛋白质的活性的核酸转化。举例来说，所述核酸可以降低以下各项的活性：天然的Δ9去饱和酶蛋白；天然的Δ12去饱和酶蛋白；天然的二酰基甘油酰基转移酶蛋白；天然的三酰基甘油脂酶蛋白；
天然的sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白；天然的溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白；天然的磷
脂酸磷酸酶蛋白；天然的甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白；天然的甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白；和/或天然的磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白。所述核酸可以通过
敲除编码天然蛋白质的基因来降低所述蛋白质的活性，例如，所述核酸可以与所述基因和/或所述基因的调节区中的核苷酸序列重组，从而破坏所述基因转录或翻译成与所述天然蛋
白质具有相同水平的活性的蛋白质。
[0016] 参考以下说明、附图、以及权利要求书，本发明的这些和其它特征、方面、以及优势将被更好地理解。

附图说明

[0017] 图1描绘了可以被操纵以改变细胞的脂质含量或脂质组成的各种生物合成途径。
[0018] 图2描绘了用于使二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因NG66在解脂耶氏酵母菌株NS18(从ARS培养物保藏中心(ARS Culture Collection)获得，NRRL号：YB 392)中过表达的
pNC243构建体的图谱。在转化之前通过PacI/NotI限制酶切消化将载体pNC243线性化。“2u ori”表示来自2μm环质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR”表示用作氨苄西林(ampicillin)选择标记的bla基因；“PR2”表示解脂耶氏酵母GPD1启动子-931至-1；“NG66”表示通过GenScript合成的天然圆红冬孢酵母
(Rhodosporidium toruloides)DGA1cDNA；“TER1”表示终止密码子之后300个碱基对的解脂耶氏酵母CYC1终止子；“PR22”表示酿酒酵母TEF1启动子-412至-1；“NG3”表示用作诺尔斯菌素(nourseothricin)选择标记的诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)Nat1基因；
“TER2”表示终止密码子之后275个碱基对的酿酒酵母CYC1终止子；并且“Sc URA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标记。
[0019] 图3描绘了在天然Δ12去饱和酶基因缺失之前(NS18)和之后(NS419)解脂耶氏酵母菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸酯、硬脂酸
酯、油酸酯、以及亚油酸酯。
[0020] 图4描绘了在用编码解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶基因的另外拷贝的核酸进行转化之前(NS18)和之后(NS441)解脂耶氏酵母菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂
肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯。
[0021] 图5(由图A-C组成)描绘了对包含提高或降低延长酶蛋白的活性的遗传修饰的解脂耶氏酵母细胞进行的实验。(A)在天然ELO1基因缺失之前(NS18)和之后(NS276)解脂耶氏
酵母菌株的脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是C16脂肪酸或C18脂肪酸。(B)在用编码解脂耶氏酵母ELO1基因的另外拷贝的核酸进行转化之前(NS452)和之后(NS477)解脂耶氏酵母菌株
的脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是C16脂肪酸或C18脂肪酸。(C)在用编码解脂耶氏酵母ELO1基因的另外拷贝的核酸进行转化之前(NS452)和之后(NS477)解脂耶氏酵母菌株的脂肪酸
的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯。菌株NS452包含编码DGA1蛋白的解脂耶氏酵母DGAT2基因的另外的拷贝和编码DGA2蛋白的紫色
麦角菌(Claviceps purpurea)DGAT1基因的拷贝、以及天然Δ12去饱和酶基因的缺失。
[0022] 图6描绘了在将解脂耶氏酵母菌株NS418用包含来自其它生物体的Δ9去饱和酶基因的核酸转化之后所述菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、
棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯，所述菌株包含天然Δ9去饱和酶基因的缺失。
[0023] 图7描绘了在天然甘油酰基转移酶基因(SCT1)缺失之前(NS18)和之后(NS563)解脂耶氏酵母菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯。
[0024] 图8描绘了在将解脂耶氏酵母菌株NS18用包含来自各种物种的DGAT2基因的核酸转化之后所述菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸
酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯。所述DGAT2基因编码DGA1蛋白。
[0025] 图9描绘了在将解脂耶氏酵母菌株NS281用包含来自各种物种的DGAT1基因的核酸转化之后所述菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸
酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯，所述菌株包含编码来自圆红冬孢酵母的DGA1蛋白的核酸。所述DGAT1基因编码DGA2蛋白。
[0026] 图10描绘了在将解脂耶氏酵母菌株NS564用包含来自各种物种的SCT1基因的核酸转化之后所述菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸
酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯，所述菌株包含天然Δ12去饱和酶基因和天然SCT1基因的缺失。
[0027] 图11描绘了在天然Δ12去饱和酶基因缺失之前(NS252)和之后(NS478)噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸酯、棕榈油酸
酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯。
[0028] 图12描绘了在将噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS252用包含来自各种物种的DGAT2基因的核酸转化之后所述菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是棕榈酸
酯、棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、以及亚油酸酯。所述DGAT2基因编码DGA1蛋白。
[0029] 图13描绘了用于将解脂耶氏酵母菌株NS551工程化的策略。
[0030] 图14描绘了包含Δ12去饱和酶敲除和各种延长酶基因的添加的噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是C16脂肪酸或C18脂肪酸。将
每一种延长酶基因添加到噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS554中，所述菌株包含Δ12去饱和
酶敲除并且被示为对照。
[0031] 图15描绘了包含各种延长酶基因的噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS554和解脂耶氏酵母菌株NS276的作为占总C16和C18脂肪酸的百分比的各种脂肪酸的百分比。噬腺嘌呤阿
克苏拉酵母菌株NS554包含Δ12去饱和酶敲除突变并且解脂耶氏酵母菌株NS276包含ELO1
敲除突变。
[0032] 图16描绘了包含ELO1敲除和各种延长酶基因的添加的解脂耶氏酵母菌株的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是C16脂肪酸或C18脂肪酸。将每一种延长酶基因添加到解脂耶氏酵母菌株NS276中，所述菌株包含ELO1去饱和酶敲除并且被示为对照。
[0033] 图17描绘了进一步包含来自解脂耶氏酵母的ELO1基因的噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS557的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比，所述脂肪酸是C16脂肪酸或C18脂肪酸。亲本菌株噬腺嘌呤阿克苏拉酵母NS557包含Δ12去饱和酶敲除突变并且表达解脂耶氏酵母
DGA1。将菌株NS557作为对照来分析，并且水平线标示该菌株的C18百分比。
[0034] 图18描绘了实施例14中所述的噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS776的包含各种链长度和饱和度水平的脂肪酸的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比。
[0035] 图19是示出了其中将各种遗传修饰引入到解脂耶氏酵母菌株NS18中，从而产生菌株NS987、NS988、NS991、NS992、NS993、以及NS994的顺序的流程图，所述菌株描述于实施例
15中。
[0036] 图20描绘了描述于实施例16中的各种解脂耶氏酵母菌株的包含各种链长度和饱和度水平的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比。
[0037] 图21描绘了描述于实施例16中的各种解脂耶氏酵母菌株的包含各种链长度和饱和度水平的C16脂肪酸和C18脂肪酸的百分比。此外，每一种菌株的总脂质含量被示为干细
胞重％(“总脂质”)。

具体实施方式

[0038] 定义
[0039] 冠词“一个(a/an)”和“一种”在本文中用于指代一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)语法对象。举例来说，“一个元件(an element)”意指一个元件或多于一个元件。
[0040] 术语“活性”指的是细胞执行功能的总能力。举例来说，降低细胞中酶的活性的遗传修饰可以减少细胞中所述酶的量或降低所述酶的效率。敲除减少了细胞中蛋白质的量。或者，基因突变可以降低它的蛋白质产物的效率而对细胞中所述蛋白质的量几乎没有影
响。降低酶的效率的突变可以例如通过改变一个或多个活性位点残基来影响活性位点；它
们可以例如通过在空间上阻挡底物或产物来损害酶的动力学；它们可以例如通过降低正确
折叠的酶的比例来影响蛋白质的折叠或动力学；它们可以例如通过防止蛋白质定位到脂质
颗粒来影响蛋白质定位；或它们可以例如通过添加一个或多个蛋白质切割位点或通过添加
靶向蛋白质进行蛋白水解的一个或多个残基或氨基酸序列来影响蛋白质降解。这些突变影
响编码区。降低蛋白质的活性的突变相反可能会影响基因的转录或翻译。举例来说，增强子或启动子的突变可以通过减少蛋白质的表达来降低它的活性。使基因的非编码部分，如它
的内含子突变或缺失也可以减少转录或翻译。此外，基因的上游调节子的突变可以影响它
的蛋白质产物的活性；例如，一个或多个阻遏子的过表达可以降低蛋白质的活性，并且一个或多个激活子的敲除或突变可以类似地降低蛋白质的活性。
[0041] 提高细胞中蛋白质的活性的遗传修饰可以增加所述细胞中所述蛋白质的量或提高所述蛋白质的效率(例如酶的效率)。举例来说，所述遗传修饰可以简单地将所述蛋白质
的另外的拷贝插入到所述细胞中以使得所述另外的拷贝被转录并且被翻译成另外的功能
蛋白。所添加的基因可以是宿主生物体天然的或来自不同的生物体。或者，使基因的非编码部分，如它的内含子突变或缺失也可以增加翻译。天然基因可以通过添加引起更多转录的
新启动子来改变。类似地，可以将增强子添加到基因中以增加转录，或可以使沉默子突变或从基因中缺失以增加转录。天然基因的编码区的突变也可能提高蛋白质的活性，例如通过
产生不与抑制性蛋白质或分子相互作用的蛋白质变体来实现。一个或多个激活子的过表达
可以通过增加蛋白质的表达来提高蛋白质的活性，并且一个或多个阻遏子的敲除或突变可
以类似地提高蛋白质的活性。
[0042] 术语“生物活性部分”指的是小于全长氨基酸序列，但是表现出全长序列的至少一种活性的氨基酸序列。举例来说，二酰基甘油酰基转移酶的生物活性部分可以指的是DGA1或DGA2的具有将酰基辅酶A和二酰基甘油转化成三酰基甘油的生物活性的一个或多个结构
域。蛋白质的生物活性部分包括这样的肽或多肽，其包含的氨基酸序列与所述蛋白质的氨
基酸序列足够相同或源自于所述蛋白质的氨基酸序列，例如以下各项中所示的氨基酸序
列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、
47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、
97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、
135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、或159，所述肽或多肽包括比全长蛋白质少的氨基酸，并且表现出所述蛋白质的至少一种活性。类似地，蛋白质的生物活性部分包括这样的肽或多肽，其包含的氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列足够相同或源自
于所述蛋白质的氨基酸序列，例如以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、
11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、
61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、
109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、
147、149、151、153、155、157、或159，所述肽或多肽包括比全长蛋白质少的氨基酸，并且表现出所述蛋白质的至少一种活性。蛋白质的生物活性部分可以包含例如100个、101个、102个、
103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、
128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、
153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、
178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、
203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、
228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、
253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、
278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、
303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、
328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、
353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、
378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、
403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、
428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、
453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个、469个、470个、471个、472个、473个、474个、475个、476个、477个、
478个、479个、480个、481个、482个、483个、484个、485个、486个、487个、488个、489个、490个、491个、492个、493个、494个、495个、496个、497个、498个、499个、500个、501个、502个、
503个、504个、505个、506个、507个、508个、509个、510个、511个、512个、513个、514个、515个、516个、517个、518个、519个、520个、521个、522个、523个、524个、525个、526个、527个、
528个、529个、530个、531个、532个、533个、534个、535个、536个、537个、538个、539个、540个、541个、542个、543个、544个、545个、546个、547个、548个、549个、550个、551个、552个、
553个、554个、555个、556个、557个、558个、559个、560个、561个、562个、563个、564个、565个、566个、567个、568个、569个、570个、571个、572个、573个、574个、575个、576个、577个、
578个、579个、580个、581个、582个、583个、584个、585个、586个、587个、588个、589个、590个、591个、592个、593个、594个、595个、596个、597个、598个、599个、600个、601个、602个、
603个、604个、605个、606个、607个、608个、609个、610个、611个、612个、613个、614个、615个、616个、617个、618个、619个、620个、621个、622个、623个、624个、625个、626个、627个、
628个、629个、630个、631个、632个、633个、634个、635个、636个、637个、638个、639个、640个、641个、642个、643个、644个、645个、646个、647个、648个、649个、650个、651个、652个、
653个、654个、655个、656个、657个、658个、659个、660个、661个、662个、663个、664个、665个、666个、667个、668个、669个、670个、671个、672个、673个、674个、675个、676个、677个、
678个、679个、680个、681个、682个、683个、684个、685个、686个、687个、688个、689个、690个、691个、692个、693个、694个、695个、696个、697个、698个、699个、700个或更多个氨基酸。
通常，生物活性部分包含具有催化活性，如用于产生硬脂酸、油酸、或亚油酸的催化活性的结构域或基序。蛋白质的生物活性部分包括蛋白质的与全长肽具有相同的活性的部分以及
具有比背景更高的活性的每一个部分。举例来说，相对于全长酶，酶的生物活性部分可以具有0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％、100.1％、
100.2％、100.3％、100.4％、100.5％、100.6％、100.7％、100.8％、100.9％、101％、105％、
110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、
190％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％、400％或更高的活性。蛋白质的生物活性部分可以包括蛋白质的缺少使蛋白质靶向细胞隔室的结构域的
部分。DGA1蛋白的生物活性部分可以是具有例如262个氨基酸的长度的多肽。
[0043] 术语“DGAT1”指的是编码1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因，如编码DGA2蛋白的基因。
[0044] 术语“DGAT2”指的是编码2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因，如编码DGA1蛋白的基因。
[0045] “二酰基甘油酯”、“二酰基甘油”、以及“甘油二酯”是包含甘油和两个脂肪酸的酯。
[0046] 术语“二酰基甘油酰基转移酶”和“DGA”指的是催化二酰基甘油形成三酰基甘油酯的任何蛋白质。二酰基甘油酰基转移酶包括1型二酰基甘油酰基转移酶(DGA2)、2型二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)、和3型二酰基甘油酰基转移酶(DGA3)以及催化上述反应的所有同
源物。
[0047] 术语“二酰基甘油酰基转移酶1型”和“1型二酰基甘油酰基转移酶”指的是DGA2和DGA2直系同源物。
[0048] 术语“二酰基甘油酰基转移酶2型”和“2型二酰基甘油酰基转移酶”指的是DGA1和DGA1直系同源物。
[0049] 术语“结构域”指的是蛋白质的氨基酸序列中能够独立于蛋白质的其余部分折叠成稳定的三维结构的部分。
[0050] 术语“药物”指的是抑制细胞生长或增殖，从而为含有赋予对药物的抗性的基因的细胞提供选择优势的任何分子。药物包括抗生素、抗微生物剂、毒素、以及农药。
[0051] “干重”和“干细胞重”意指在相对不存在水的情况下确定的重量。举例来说，在提到含油细胞包含以干重计指定百分比的特定组分时，意指该百分比是基于在基本上所有的水已经被去除之后细胞的重量来计算的。
[0052] 术语“编码”指的是包含编码区、编码区的一部分、或其互补序列的核酸。DNA和RNA这两者均可以编码基因。DNA和RNA这两者均可以编码蛋白质。
[0053] 如本文所用的术语“酶”指的是可以催化化学反应的蛋白质。
[0054] 术语“外源”指的是被引入到细胞中的任何物质。“外源核酸”是经由细胞膜进入细胞的核酸。外源核酸可以含有存在于细胞的天然基因组中的核苷酸序列和/或先前不存在于细胞的基因组中的核苷酸序列。外源核酸包括外源基因。“外源基因”是已经被引入到细胞中(例如通过转化/转染)的进行编码以表达RNA和/或蛋白质的核酸，并且也被称为“转基因”。包含外源基因的细胞可以被称为重组细胞，其中可以引入一个或多个另外的外源基
因。相对于所转化的细胞，外源基因可以来自相同的或不同的物种。因此，外源基因可以包括相对于基因的内源拷贝，在细胞的基因组中占据不同的位置或处在不同的控制下的天然
基因。外源基因在细胞中可以多于一个拷贝存在。外源基因可以作为基因组(核或质体)中
的插入序列或作为游离型分子保持于细胞中。
[0055] 术语“表达”指的是细胞中核酸序列或氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白质)的量。基因表达增加指的是该基因的转录增加。氨基酸序列、肽、多肽、或蛋白质的表达增加指的是编码所述氨基酸序列、肽、多肽、或蛋白质的核酸的翻译增加。
[0056] 如本文所用的术语“基因”可以涵盖含有外显子的基因组序列，特别是编码涉及特定活性的多肽序列的多核苷酸序列。所述术语进一步涵盖了并非源自于基因组序列的合成核酸。在某些实施方案中，所述基因缺少内含子，这是因为它们是基于cDNA和蛋白质序列的已知DNA序列来合成的。在其它实施方案中，所述基因是合成的非天然的cDNA，其中密码子已经基于密码子使用被优化以在解脂耶氏酵母中表达。所述术语可以进一步包括包含上
游、下游、和/或内含子核苷酸序列的核酸分子。
[0057] 术语“遗传修饰”指的是转化的结果。根据定义，每一种转化均会引起遗传修饰。
[0058] 如本文所用的术语“同源物”指的是(a)肽、低聚肽、多肽、蛋白质、以及酶，它们相对于所考虑的未修饰的蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与作为它们的来源的未修饰的蛋白质具有相似的生物活性和功能活性；以及(b)编码具有(a)中所述的相同特征
的肽、低聚肽、多肽、蛋白质、以及酶的核酸。
[0059] “诱导型启动子”是响应于特定的刺激而介导可操作连接的基因转录的启动子。
[0060] 术语“整合”指的是作为细胞基因组中的插入序列，如染色体中的插入序列，包括质体基因组中的插入序列被保持在细胞中的核酸。
[0061] “可操作连接”指的是两个核酸序列，如控制序列(通常是启动子)与所连接的序列(通常是编码蛋白质的序列，也被称为编码序列)之间的功能性连接。如果启动子可以介导基因的转录，那么所述启动子与所述基因是可操作连接的。
[0062] 术语“敲除突变”或“敲除”指的是防止天然基因被转录并且被翻译成功能蛋白的遗传修饰。
[0063] 术语“天然”指的是在转化事件之前细胞或亲本细胞的组成。“天然基因”指的是编码并非通过转化事件引入到细胞中的蛋白质的核苷酸序列。“天然蛋白质”指的是由天然基因编码的氨基酸序列。
[0064] 术语“核酸”指的是具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合形式、或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析所限定的多个
基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的具有任何序列的DNA、分离的具有任何序列的RNA、核酸探针、以及引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。多核苷酸可以被进一步修饰，如通过与标记组分缀合。在本文提供的所有核酸序列中，U核苷酸是可与T核苷酸互换的。
[0065] 首字母缩写“ORF”代表开放阅读框。
[0066] 术语“亲本细胞”指的是作为细胞的亲代的每一种细胞。细胞的基因组包含亲本细胞的基因组和对亲本细胞的基因组的任何后续的遗传修饰。
[0067] 如本文所用的术语“质粒”指的是与生物体的基因组DNA物理分离的环状DNA分子。质粒在被引入到宿主细胞中之前可以被线性化(在本文被称作线性化质粒)。线性化质粒可
能不是自我复制的，但是可以整合到生物体的基因组DNA中并且与之一起复制。
[0068] 术语“部分”指的是肽、低聚肽、多肽、蛋白质结构域、以及蛋白质。编码“蛋白质的部分”的核苷酸序列包括可以被转录和/或翻译的核苷酸序列和必须经历一个或多个重组事件以被转录和/或翻译的核苷酸序列这两者。举例来说，核酸可以包含编码选择性标记蛋白的一个或多个氨基酸的核苷酸序列。该核酸可以被工程化以与编码所述蛋白质的其余部
分的一个或多个不同的核苷酸序列重组。这样的核酸可用于产生敲除突变，这是因为只有
与靶序列重组才有可能重构全长选择性标记基因，而随机整合事件不可能产生可以产生功
能性标记蛋白的核苷酸序列。
[0069] “启动子”是引导核酸转录的核酸控制序列。如本文所用，启动子包括靠近转录起始位点的必要核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。
[0070] 术语“蛋白质”指的是包含氨基酸序列的分子，其中所述氨基酸是由肽键连接的。
[0071] “重组”指的是细胞、核酸、蛋白质、或载体，它已经由于外源核酸的引入或天然核酸的改变而被修饰。因此，例如，重组细胞可以表达细胞的天然(非重组)形式内不存在的基因或表达天然基因而不同于那些基因由非重组细胞表达。重组细胞可以包括但不限于编码基因产物或降低细胞中活性基因产物的水平的抑制元件，如突变、敲除、反义RNA、干扰RNA(RNAi)、或dsRNA的重组核酸。“重组核酸”是一般通过操纵核酸，例如使用聚合酶、连接酶、核酸外切酶、以及核酸内切酶而最初在体外形成的核酸，或以其它方式呈自然界中通常不
存在的形式。可以产生重组核酸，例如以使两个或更多个核酸处于可操作连接。因此，为了实现本发明的目的，通过连接在自然界中通常不会连接的DNA分子而在体外形成的分离的
核酸或表达载体这两者均被认为是重组的。一旦重组核酸被制备并且引入到宿主细胞或生
物体中，它就可以使用宿主细胞的体内细胞机制进行复制；然而，这样的核酸一旦重组产
生，尽管随后在细胞内进行复制，但为了实现本发明的目的而仍然被认为是重组的。类似
地，“重组蛋白”是使用重组技术，即经由使重组核酸表达而制备的蛋白质。
[0072] 术语“调节区”指的是影响基因的转录或翻译，但是不编码氨基酸序列的核苷酸序列。调节区包括启动子、操纵子、增强子、以及沉默子。
[0073] 术语“基本上相同”指的是编码蛋白质的生物活性部分的核苷酸序列或氨基酸序列，所述序列与参考序列具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、
99.8％、99.9％或更大的序列同一性。对于酶，基本上相同的序列通常保留参考序列的酶活性。举例来说，如果序列编码具有参考酶的酶活性的10％至1,000％的酶，那么所述序列与参考序列基本上相同。
[0074] “转化”指的是将核酸转移到宿主生物体或宿主生物体的基因组中，从而引起遗传稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“重组”、“转基因”或“转化”生物体。因此，本发明的分离的多核苷酸可以被并入重组构建体中，所述构建体通常是DNA构建体，能够引入到宿主细胞中并且在宿主细胞中复制。这样的构建体可以是载体，所述载体包括
复制系统和能够使多肽编码序列在给定的宿主细胞中转录和翻译的序列。通常，表达载体
包括例如处在5'端和3'端调节序列的转录控制下的一个或多个克隆基因和选择性标记。这
样的载体还可以含有启动子调节区(例如控制诱导型或组成型、环境调节或发育调节的、或位置特异性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点、和/或多聚腺苷酸化信号。
[0075] 术语“转化的细胞”指的是已经经历转化的细胞。因此，转化的细胞包含亲本的基因组和可遗传的遗传修饰。
[0076] 术语“三酰基甘油酯”、“三酰基甘油”、“甘油三酯”以及“TAG”是包含甘油和三个脂肪酸的酯。
[0077] 术语“三酰基甘油脂酶”指的是可以催化脂肪酸链从三酰基甘油中去除的任何蛋白质。三酰基甘油脂酶包括TGL3、TGL4、以及TGL3/4。
[0078] 术语“载体”指的是用于使核酸可以在生物体、细胞、或细胞组分之间传播和/或转移的工具。载体包括质粒、线性DNA片段、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、以及人工染色体等，它们可能能够或可能不能自主复制或整合到宿主细胞的染色体中。
[0079] 微生物工程化
[0080] A.概述
[0081] 在本发明的某些实施方案中，微生物被遗传修饰以改变它的脂质组成，例如增加它的油酸含量(图1)。
[0082] 基因和基因产物可以被引入微生物宿主细胞中。用于表达基因和核酸分子的合适的宿主细胞是可以在真菌科或细菌科内广泛发现的微生物宿主。合适的宿主菌株的实例包
括但不限于真菌或酵母物种，如阿克苏拉酵母属(Arxula)、曲霉属(Aspegillus)、破囊壶菌属(Aurantiochytrium)、假丝酵母属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属
(Cryptococcus)、小克银汉霉菌属(Cunninghamella)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、白冬孢酵母属(Leucosporidiella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、欧加铁酵母属(Ogataea)、毕赤酵母属(Pichia)、原壁藻属
(Prototheca)、根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属
(Rhodotorula)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、丝孢酵母属(Trichosporon)、耶氏酵母属(Yarrowia)；或细菌物种，如变形菌门(proteobacteria)和放线菌类的成员，以及以下属：不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属
(Bacillus)、梭菌纲(Clostridia)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、以及棒状杆菌属
(Cornyebacterium)。解脂耶氏酵母和噬腺嘌呤阿克苏拉酵母适用作宿主微生物，这是因为它们可以三酰基甘油的形式积聚它们重量的较大百分比。
[0083] 含有引导外来蛋白质的高水平表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员已知的。这些中的任一种可以用于构建嵌合基因以产生具有本发明的序列
的基因产物中的任一种。然后可以经由转化技术将这些嵌合基因引入到适当的微生物中以
提供酶的高水平表达。
[0084] 举例来说，可以将编码酶的基因在合适的质粒中克隆，并且可以将作为宿主的上述起始亲本菌株用所得的质粒转化。这种方法可以增加编码酶的基因中的每一种的拷贝数
并且因此，可以提高酶的活性。所述质粒不受特别限制，只要它使得所期望的遗传修饰可遗传到微生物的后代即可。
[0085] 可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域公知的。通常，所述载体或盒含有引导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记、以及允许自主复制或染色体整合的序列。
合适的载体包含携带转录起始控制的基因的5'端区域和控制转录终止的DNA片段的3'端区
域。在某些实施方案中，这两个控制区源自于与转化的宿主细胞同源的基因，尽管应当了解的是，这样的控制区不需要源自于被选择作为产生宿主的特定物种天然的基因。
[0086] 启动子、cDNA和3'UTR以及载体的其它元件可以经由克隆技术，使用从天然来源分离的片段来产生(Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual《( 分子克
隆：实验室手册》),(第4版,2012)；美国专利号4,683,202(以引用的方式并入本文))。或者，可以使用已知的方法合成产生元件(Gene 164:49-53(1995))。
[0087] B.同源重组
[0088] 同源重组是互补DNA序列对齐和交换同源区的能力。将含有与所靶向的基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA(“供体”)引入到生物体中，然后在相应的同源基因组序列的位点处重组到基因组中。
[0089] 能够在宿主生物体中进行同源重组的能力对于在分子遗传学水平上可以进行的操作具有许多实际意义并且可用于产生可以产生所期望的产物的微生物。根据同源重组的
性质，它是精确的基因靶向事件，并且因此，用相同的靶向序列产生的大多数转基因株系在表型方面将是基本上相同的，从而需要筛选少得多的转化事件。同源重组还将基因插入事
件定向到宿主染色体中，从而潜在地产生优良的遗传稳定性，即使是在不存在遗传选择的
情况下。由于不同的染色体基因座可能会影响基因表达，甚至是由外源启动子/UTR所引起
的基因表达，因此同源重组可以是在不熟悉的基因组环境中查询基因座以及评估这些环境
对基因表达的影响的方法。
[0090] 使用同源重组的特别有用的遗传工程化方法是选出特异性宿主调节元件，如启动子/UTR，而以高度特异性方式驱动异源性基因表达。
[0091] 由于同源重组是精确的基因靶向事件，因此它可以用于对所关注的基因或区域内的任何一个或多个核苷酸进行精确修饰，只要已经鉴定出足够的侧接区域即可。因此，同源重组可以用作对影响RNA和/或蛋白质的基因表达的调节序列进行修饰的手段。它还可以用
于修饰蛋白质编码区以试图改变酶活性，如底物特异性、亲和力以及Km，从而影响宿主细胞代谢的所期望的变化。同源重组提供了操纵宿主基因组，从而引起基因靶向、基因转换、基因缺失、基因复制、基因倒置以及交换基因表达调节元件，如启动子、增强子以及3'UTR的强有力的手段。
[0092] 可以通过使用含有内源性序列片段的靶向构建体来“靶向”内源性宿主细胞基因组内所关注的基因或区域来实现同源重组。这样的靶向序列可以位于所关注的基因或区域
的5'端处、所关注的基因/区域的3'端处或甚至侧接所关注的基因/区域。这样的靶向构建
体可以作为具有另外的载体骨架的超螺旋质粒DNA、没有载体骨架的PCR产物或线性化分子
被转化到宿主细胞中。在一些情况下，可能有利的是，首先通过用限制性内切酶切割转基因DNA来暴露转基因DNA(供体DNA)内的同源序列。这个步骤可以提高重组效率并且减少不期
望的事件的发生。提高重组效率的其它方法包括使用PCR产生转化转基因DNA，所述DNA含有与所靶向的基因组序列同源的线性末端。
[0093] C.载体和载体组分
[0094] 鉴于本文的公开内容，可以通过为本领域技术人员所熟悉的已知技术来制备用于转化根据本发明的微生物的载体。载体通常含有一个或多个基因，其中每一个基因进行编
码以使所期望的产物(基因产物)表达，并且与调节基因表达或使基因产物靶向重组细胞中
的特定位置的一个或多个控制序列可操作地连接。
[0095] 1.控制序列
[0096] 控制序列是调节编码序列的表达或将基因产物引导到细胞中或细胞外的特定位置的核酸。调节表达的控制序列包括例如调节编码序列转录的启动子和使编码序列的转录
终止的终止子。另一个控制序列是位于编码序列的末端处的编码多聚腺苷酸化信号的3'非
翻译序列。将基因产物引导到特定位置的控制序列包括编码信号肽的序列，所述信号肽将
与它们连接的蛋白质引导到细胞内或细胞外的特定位置。
[0097] 因此，用于使基因在微生物中表达的示例性载体设计含有所期望的基因产物(例如选择性标记或酶)的编码序列，所述编码序列与在酵母中具有活性的启动子可操作地连
接。或者，如果载体不含与所关注的编码序列可操作地连接的启动子，那么可以将所述编码序列转化到细胞中，以使它在载体整合时与内源性启动子可操作地连接。
[0098] 用于表达基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或不同的启动子。
[0099] 启动子一般可以被表征为组成型或诱导型。组成型启动子一般在所有时间(或在细胞生命周期中的某些时间)具有相同水平的驱动表达的活性或功能。相反，诱导型启动子仅响应于刺激而具有活性(或致使其无活性)或显著上调或下调。这两种类型的启动子均可
以应用于本发明的方法中。可用于本发明中的诱导型启动子包括响应于刺激而介导可操作
连接的基因转录的那些启动子，所述刺激诸如外源性提供的小分子、温度(热或冷)、培养基中缺少氮等。合适的启动子可以激活基本上沉默的基因转录或上调，例如显著上调以低水
平转录的可操作连接的基因的转录。
[0100] 终止区控制序列的包括是任选的，并且如果使用的话，则选择主要是方便的序列，这是因为终止区是相对可互换的。终止区可以是转录起始区(启动子)天然的、可以是所关注的DNA序列天然的、或可以是可从另外的来源获得的(参见例如Chen和Orozco,Nucleic 
Acids Research 16:8411(1988))。
[0101] 2.基因和密码子优化
[0102] 通常，基因包括启动子、编码序列以及终止控制序列。当通过重组DNA技术进行组装时，基因可以被称为表达盒，并且可以由限制性位点侧接以便于插入到用于将重组基因
引入宿主细胞中的载体中。表达盒可以由来自基因组或其它核酸靶标的DNA序列侧接以有
助于表达盒通过同源重组稳定整合到基因组中。或者，载体和它的表达盒可以保持未整合
(例如游离体)，在这种情况下，载体通常包括能够提供载体DNA的复制的复制起点。
[0103] 载体上存在的常见基因是编码蛋白质的基因，所述基因的表达允许含有所述蛋白质的重组细胞与不表达所述蛋白质的细胞相区别。这样的基因和它相应的基因产物被称作
选择性标记或选择标记。多种选择性标记中的任一种可以应用于可用于转化本发明的生物
体的转基因构建体中。
[0104] 为了使重组蛋白最佳地表达，有益的是，使用产生具有由待转化的宿主细胞最佳使用的密码子的mRNA的编码序列。因此，转基因的适当表达可能需要转基因的密码子使用
与其中所述转基因正被表达的生物体的特异性密码子偏倚性相匹配。这种效应潜在的精确
机制有许多，但是包括可用的氨基酰化tRNA池与细胞中正合成的蛋白质的适当平衡，联同
当这一需要被满足时转基因信使RNA(mRNA)的更高效的翻译。当转基因中的密码子使用没
有经过优化时，可用的tRNA池不足以允许转基因mRNA的高效翻译，从而导致核糖体失速和
终止以及转基因mRNA可能的不稳定性。
[0105] C.转化
[0106] 可以通过任何合适的技术转化细胞，所述技术包括例如生物射弹法、电穿孔法、玻璃珠转化法以及碳化硅晶须转化法。在本发明中可以使用用于将转基因引入到微生物中的任何方便的技术。转化可以通过例如以下方法来实现：D.M.Morrison(Methods in 
Enzymology 68:326(1979))的方法；通过用氯化钙提高接受体细胞对DNA的通透性而实现
的方法(Mandel和Higa,J.Molecular Biology,53:159(1970))等。
[0107] 转基因在含油酵母(例如解脂耶氏酵母)中表达的实例可以见于文献(Bordes等,J.Microbiological Methods,70:493(2007)；Chen等,Applied Microbiology&
Biotechnology 48:232(1997))中。外源基因在诸如大肠杆菌的细菌中表达的实例是公知
的(Green和Sambrook,MolecularCloning:A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手
册》),(第4版,2012))。
[0108] 用于转化根据本发明的微生物的载体可以通过为本领域技术人员所熟悉的已知技术来制备。在一个实施方案中，用于使基因在微生物中表达的示例性载体设计含有编码
酶的基因，所述基因与在微生物中具有活性的启动子可操作地连接。或者，如果载体不含与所关注的基因可操作连接的启动子，那么可以将所述基因转化到细胞中以使它在载体整合
时与天然启动子可操作地连接。所述载体还可以含有编码蛋白质的第二基因。任选地，一个或这两个基因后面是含有多聚腺苷酸化信号的3'非翻译序列。编码这两个基因的表达盒可
以物理方式连接于载体中或单独的载体上。还可以使用微生物的共同转化，其中同时使用
不同的载体分子来转化细胞(Protist155:381-93(2004))。转化的细胞可以任选地基于在
抗生素存在下生长的能力或其它选择性标记在其中缺少抗性盒的细胞不会生长的条件下
来选择。
[0109] 示例性细胞、核酸、以及方法
[0110] A.转化的细胞
[0111] 在一些实施方案中，转化的细胞是原核细胞，如细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞，如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、天然生物细胞、藻类细胞、禽类细胞、植物细胞、或昆虫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是酵母。本领域技术人员将认识到的是，丝状真菌的许多形式产生酵母样生长，并且本文中酵母的定义涵盖了这样的细胞。
[0112] 所述细胞可以选自由以下各项组成的组：阿克苏拉酵母属、曲霉属、破囊壶菌属、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉菌属、地霉属(Geotrichum)、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、柯达酵母属(Kodamaea)、白冬孢酵母属、油脂酵母属、被孢霉属、欧加铁酵母属、毕赤酵母属、原壁藻属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、以及耶氏酵母属。
[0113] 在一些实施方案中，所述细胞选自由以下各项组成的组：噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus orzyae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、紫色麦角菌、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、拉氏隐球菌(Cryptococcus ramirezgomezianus)、地生隐球菌(Cryptococcus terreus)、
威氏隐球菌(Cryptococcus wieringae)、刺孢小克银汉霉菌(Cunninghamella 
echinulata)、日本小克银汉霉菌(Cunninghamella japonica)、发酵地霉(Geotrichum 
fermentans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces 
lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、奥默柯达酵母(Kodamaea 
ohmeri)、克里替弗拉白冬孢酵母(Leucosporidiella creatinivora)、产油油脂酵母
(Lipomyces lipofer)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、子囊菌油脂酵母
(Lipomyces tetrasporus)、黄褐色被孢霉(Mortierella isabellina)、高山被孢霉、多形欧加铁酵母(Ogataea polymorpha)、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、季也蒙毕赤酵母
(Pichia guilliermondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia 
stipites)、饶氏原壁藻(Prototheca zopfii)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、巴布维红冬孢酵母(Rhodosporidium  babjevae)、圆红冬孢酵母、沼泽生红冬孢酵母
(Rhodosporidium paludigenum)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红酵母
(Rhodotorula mucilaginosa)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、恩氏银耳(Tremella enchepala)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、发酵丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、西弗威克汉姆酵母(Wickerhamomyces ciferrii)、以及解脂耶氏酵母。
[0114] 在某些实施方案中，所述细胞是酿酒酵母、解脂耶氏酵母、或噬腺嘌呤阿克苏拉酵母。
[0115] 在一些实施方案中，所述细胞是酵母、真菌、或酵母样藻类。所述细胞可以选自破囊壶菌(破囊壶菌属)和无叶绿素单细胞藻类(原壁藻属)。
[0116] 在某些实施方案中，转化的细胞包含至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、或更多的脂质，所述脂质是通过干细胞重量％所测量。在一些实施方案中，转化的细胞包含作为占细胞中总C16和C18脂肪酸的百分比的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高的浓度的C18脂肪酸。在一些实施方案中，转化的细胞包含作为占细胞中总C16和C18脂肪酸的百分比的至少50％、51％、
52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或更高的浓度的油酸。
[0117] B.用于提高蛋白质活性的核酸和方法
[0118] 本发明的基因可以包含保守取代、缺失、和/或插入，而仍编码具有活性的蛋白质。举例来说，密码子可以针对特定的宿主细胞经过优化；不同的密码子可以被取代以为了方
便起见，以引入限制性位点或形成最佳的PCR引物；或密码子可以被取代以实现另外的目
的。类似地，核苷酸序列可以被改变以形成保守氨基酸取代、缺失、和/或插入。
[0119] 蛋白质可以包含保守取代、缺失、和/或插入，而仍维持活性。保守取代表是本领域公知的(Creighton,Proteins(《蛋白质》)(第2版,1992))。
[0120] 氨基酸取代、缺失和/或插入可以容易地使用重组DNA操纵技术来产生。用于操纵DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域公知的。这些方法包括M13
诱变、T7-Gen体外诱变(俄亥俄州克利夫兰的USB公司(USB,Cleveland,OH))、Quick Change定点诱变(加利福尼亚州圣地亚哥的Stratagene公司(Stratagene,San Diego,CA))、PCR介
导的定点诱变、以及其它定点诱变方案。
[0121] 为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，可以将所述序列比对以实现最佳比较的目的(例如，可以将空位引入到第一氨基酸序列或核酸序列和第二氨基
酸序列或核酸序列中的一个或这两者中以进行最佳比对并且为了比较目的，不相同的序列
可以被忽略)。为了比较目的所比对的参考序列的长度可以是参考序列的长度的至少95％。
然后可以比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位
置与第二序列中的相应位置由相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置处
是相同的(如本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的数目的函数，将需要被引入以将这两个
序列进行最佳比对的空位数目和每一个空位的长度考虑在内。
[0122] 比较序列以及确定两个序列之间的同一性百分比可以使用数学算法来实现。在一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经被并入到GCG软件包(可
在http://www.gcg.com获取)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Molecular Biology 
48:444-453(1970))算法，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵、以及16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定。在又另一个实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com获取)中的GAP程序，使用
NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70、或80的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用已
经被并入到ALIGN程序(2.0版或2.0U版)中的E.Meyers和W.Miller的算法(Computer 
Applications in the Biosciences 4:11-17(1988))，使用PAM120权重残基表、12的空位
长度罚分以及4的空位罚分来确定。
[0123] 可以用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序的套件，例如BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX、以及BLASTP；以及Clustal程序的套件，例如ClustalW、ClustalX、以及Clustal Omega。
[0124] 当相对于基因库DNA序列和其它公共数据库中的核酸序列来评价给定的核酸序列时，通常使用BLASTN程序来进行序列搜索。BLASTX程序有效用于针对基因库蛋白质序列和
其它公共数据库中的氨基酸序列搜索已经在所有阅读框中被翻译的核酸序列。
[0125] 比对所选择的序列以确定两个或更多个序列之间的“同一性％”是使用例如CLUSTAL-W程序进行的。
[0126] “编码序列”或“编码区”指的是具有在表达序列时产生蛋白质产物，如氨基酸或多肽所必需的序列信息的核酸分子。编码序列可以包含翻译区内的非翻译序列(包括内含子或5'或3'非翻译区)和/或由所述非翻译序列组成，或可以缺少这样的居间非翻译序列(例
如，如cDNA中那样)。
[0127] 在整个说明书中用于指代包含核苷酸序列和/或由核苷酸序列组成的核酸的缩写是常规的单字母缩写。因此，当被包括在核酸中时，天然存在的编码核苷酸缩写如下：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)以及尿嘧啶(U)。此外，除非另外说明，否则本文所呈现的核酸序列是按5'→3'方向。
[0128] 如本文所用的术语“互补”和其衍生词用于指核酸根据A与T或U配对以及C与G配对的公知规则进行配对。互补可以是“部分的”或“完全的”。在部分互补中，只有一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配；而在完全或全部互补中，所有碱基根据配对规则均匹配。核酸链之间的互补程度可以对核酸链之间杂交的效率和强度有显著的影响，如本领域公知的那样。
所述杂交的效率和强度取决于检测方法。
[0129] 氨基酸序列和核苷酸序列可以源自于具有高的天然水平的脂质积聚的含油生物体。(Bioresource Technology 144:360-69(2013)；Progress Lipid Research 52:395-
408(2013)；Applied Microbiology&Biotechnology90:1219-27(2011)；European Journal Lipid Science&Technology113:1031-51(2011)；Food Technology&Biotechnology 47:
215-20(2009)；Advances Applied Microbiology 51:1-51(2002)；Lipids 11:837-44
(1976))。具有所报道的约50％和更高的脂质含量的生物体列表示于表1中。圆红冬孢酵母
和斯达氏油脂酵母具有最高的脂质含量。
[0130] 表1
[0131] 具有所报道的约50％和高于50％的脂质含量的含油真菌的列表
[0132]
[0133]
[0134] 蛋白质的活性可以通过使所述蛋白质过表达来提高。可以使用多种遗传修饰使蛋白质在细胞中过表达。在一些实施方案中，所述遗传修饰增加天然蛋白质的表达。可以通过修饰编码蛋白质的基因的上游转录调节子，例如通过增加转录激活子的表达或减少转录阻
遏子的表达来使天然蛋白质过表达。或者，可以通过与外源核酸重组将天然基因的启动子
用组成型活性或诱导型启动子取代。
[0135] 在一些实施方案中，提高蛋白质的活性的遗传修饰包括用包含编码蛋白质的基因的核酸转化。所述基因可以是细胞天然的或来自不同的物种。在某些实施方案中，所述基因是可遗传到转化细胞的后代的。在一些实施方案中，所述基因是可遗传的，这是因为它存在于质粒上。在某些实施方案中，所述基因是可遗传的，这是因为它整合到转化的细胞的基因组中。
[0136] 1.提高Δ9去饱和酶的活性
[0137] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰提高所述细胞中Δ9去饱和酶蛋白的活性。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中Δ9去饱和酶蛋白的活性的核酸转化。
[0138] 所述核酸可以编码Δ9去饱和酶基因。在一些实施方案中，所述基因是Δ9。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)、花药黑粉菌(Microbotryum violaceum)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)、圆红冬孢酵母、粘红酵母、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、或解脂耶氏酵母。所述基因可以来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母或禾柄锈菌。
[0139] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:112；或SEQ ID NO:114。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:
14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:112；或SEQ ID NO:114。在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14中所示的序列具有至少70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、
99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14中所示的核苷酸序列。
[0140] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:111；或SEQ ID NO:113、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:111；或SEQ ID NO:113。在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、
99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:
13、或其生物活性部分。所述核酸可以编码SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列。
[0141] 包含编码Δ9去饱和酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:
16；SEQ ID NO:112；或SEQ ID NO:114。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:
16；SEQ ID NO:112；或SEQ ID NO:114，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的Δ9去饱和酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:111；或SEQ ID NO:113。
[0142] Δ9去饱和酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:111；或SEQ ID NO:113。在其它实施方案中，Δ9去饱和酶蛋白与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:3；
SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:111；
或SEQ ID NO:113，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:
11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:111；或SEQ ID NO:113。
[0143] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低
以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)由用编码外源Δ9去饱和酶蛋白的核酸转化组成的遗传修饰；以及(2)天然Δ9去饱
和酶基因中的敲除突变。
[0144] 2.提高延长酶的活性
[0145] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰提高所述细胞中延长酶蛋白的活性。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述
细胞中延长酶蛋白的活性的核酸转化。
[0146] 所述核酸可以编码延长酶基因。在一些实施方案中，所述基因是ELO1或ELO2。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、褐家鼠(Rattus norvegicus)、酿酒酵母或解脂耶氏酵母。
[0147] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:156；SEQ ID NO:158；或SEQ ID NO:160。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:156；SEQ ID NO:158；或SEQ ID NO:160。
[0148] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:157；或SEQ ID NO:159、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:157；
或SEQ ID NO:159。
[0149] 包含编码延长酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:156；SEQ ID NO:158；或SEQ ID NO:160。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:156；
SEQ ID NO:158；或SEQ ID NO:160，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白
质的延长酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不
同：SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:157；或SEQ ID NO:159。
[0150] 延长酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:157；或SEQ ID NO:159。在其它实施方案中，延长酶蛋白与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:157；或SEQ ID NO:159，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:157；或SEQ ID NO:159。
[0151] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)提高延长酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)降低天然Δ12去饱和酶基因的活
性的遗传修饰。类似地，所述转化的细胞可以包含(1)提高延长酶蛋白的活性的遗传修饰；
以及(2)提高二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性的遗传修饰。
[0152] 3.提高酰基转移酶的活性
[0153] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰提高所述细胞中酰基转移酶蛋白的活性。
[0154] a.提高1型二酰基甘油酰基转移酶的活性
[0155] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的
方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性
的核酸转化。
[0156] 所述核酸可以编码1型二酰基甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是DGAT1。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、解脂耶氏酵母、圆红冬孢酵母、斯达氏油脂酵母、土曲霉、紫色麦角菌、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、季也蒙毕赤
酵母、禾本红酵母、圆红冬孢酵母、绿木霉(Trichoderma virens)、以及球毛壳霉
(Chaetomium globosum)。举例来说，所述基因可以来自紫色麦角菌。
[0157] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:104；SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:148；或SEQ ID NO:150。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:104；SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:
146；SEQ ID NO:148；或SEQ ID NO:150。在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:38中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、
99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以包含SEQ ID NO:38中所示的核苷酸序列。
[0158] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:101；
SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:147；或SEQ ID NO:149、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:147；或SEQ ID NO:
149。在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:37或其生物活性部分中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、
99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以编码SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。
[0159] 包含编码1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:
40；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:104；SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:148；或SEQ ID NO:150。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:104；SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:
146；SEQ ID NO:148；或SEQ ID NO:150，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的二酰基甘油酰基转移酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位
基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:143；
SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:147；或SEQ ID NO:149。
[0160] 1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:147；
或SEQ ID NO:149。在其它实施方案中，1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白与以下各项基本上
相同：SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:145；
SEQ ID NO:147；或SEQ ID NO:149，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:147；或SEQ ID NO:149。
[0161] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含提高DGA1蛋白的活性的遗传修饰和提高DGA2蛋白的活性的遗传修饰。在一些实施方案中，所述
转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例
来说，所述转化的细胞可以包含(1)由用编码外源DGA2蛋白的核酸转化组成的遗传修饰；以及(2)天然DGAT1基因中的敲除突变。类似地，所述转化的细胞可以包含(1)由用编码外源
DGA2蛋白的核酸转化组成的遗传修饰；以及(2)降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传
修饰。
[0162] b.提高2型二酰基甘油酰基转移酶的活性
[0163] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的
方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性
的核酸转化。
[0164] 所述核酸可以编码2型二酰基甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是DGAT2。在一些实施方案中，所述基因来自土曲霉、裂殖壶菌、噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、紫色麦角菌、密粘褶菌、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、禾柄锈菌、双倒卵形红冬孢酵母(Rhodosporidium diobovatum)、圆红冬孢酵母、禾本红酵母、或解脂耶氏酵母。所述基因可以来自解脂耶氏酵母。
[0165] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:96；SEQ ID NO:100；SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:134；SEQ ID NO:136；SEQ ID NO:138；SEQ ID NO:
140；或SEQ ID NO:142。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:20；
SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:
52；SEQ ID NO:96；SEQ ID NO:100；SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:134；SEQ ID NO:136；SEQ ID NO:138；SEQ ID NO:140；或SEQ ID NO:142。在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:20中所示的序列具有
至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以包含SEQ ID NO:20中所示的核苷酸序列。
[0166] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:127；SEQ ID NO:129；SEQ ID NO:131；SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:
135；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:139；或SEQ ID NO:141、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:127；SEQ ID NO:129；SEQ ID NO:131；SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:135；SEQ ID NO:137；
SEQ ID NO:139；或SEQ ID NO:141。在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:19或其生物活性部分中所示的序列具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以编码SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。
[0167] 包含编码2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:
28；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:96；SEQ ID NO:100；SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:134；SEQ ID NO:136；SEQ ID NO:138；SEQ ID NO:140；
或SEQ ID NO:142。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:20；
SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:
52；SEQ ID NO:96；SEQ ID NO:100；SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:134；SEQ ID NO:136；SEQ ID NO:138；SEQ ID NO:140；或SEQ ID NO:142，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的2型二酰基甘油酰基转移酶活性的蛋白
质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:127；SEQ ID NO:129；SEQ ID NO:131；SEQ ID NO:
133；SEQ ID NO:135；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:139；或SEQ ID NO:141。
[0168] 2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:127；SEQ ID NO:129；SEQ ID NO:131；SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:135；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:139；或SEQ ID NO:141。在其它实施方案中，2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:127；SEQ ID NO:129；SEQ ID NO:131；SEQ ID NO:133；
SEQ ID NO:135；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:139；或SEQ ID NO:141，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:127；SEQ ID NO:129；SEQ ID NO:131；
SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:135；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:139；或SEQ ID NO:141。
[0169] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含提高DGA1蛋白的活性的遗传修饰和提高DGA2蛋白的活性的遗传修饰。在一些实施方案中，所述
转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例
来说，所述转化的细胞可以包含(1)由用编码外源DGA1蛋白的核酸转化组成的遗传修饰；以及(2)天然DGAT2基因中的敲除突变。类似地，所述转化的细胞可以包含(1)由用编码外源
DGA1蛋白的核酸转化组成的遗传修饰；以及(2)降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传
修饰。
[0170] c.提高3型二酰基甘油酰基转移酶的活性
[0171] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的
方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性
的核酸转化。
[0172] 所述核酸可以编码3型二酰基甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是DGAT3。在一些实施方案中，所述基因来自蓖麻(Ricinus communis)或花生(Arachis 
hypogaea)。
[0173] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:152或SEQ ID NO:154中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、
99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以包含SEQ ID NO:152或SEQ ID NO:154中所示的核苷酸序列。
[0174] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:151；或SEQ ID NO:153、或其生物活性部分。所述核酸可以编码SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:153中所示的氨基酸序
列。
[0175] 包含编码3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含SEQ ID NO:152或SEQ ID NO:154中所示的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8；SEQ ID SEQ ID NO:152；或SEQ ID NO:154，并且所述核苷酸序列编码保留由SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:153编码的蛋白质的3型二酰基甘油酰基转
移酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同。
[0176] 3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白可以具有SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:153中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，3型二酰基甘油酰基转移酶蛋白与SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:153基本上相同，并且保留SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:153的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同。
[0177] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0178] d.提高甘油-3-磷酸酰基转移酶的活性
[0179] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方
法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的活性的核
酸转化。
[0180] 所述核酸可以编码甘油-3-磷酸酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是SCT1。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、三角褐指藻、圆红冬孢酵母、粘红酵母、禾本红酵母、酿酒酵母、或解脂耶氏酵母。所述基因可以来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母或酿酒酵母。
[0181] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:116；或SEQ ID NO:118。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:116；或SEQ ID NO:118。在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、
99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以包含SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44中所示的核苷酸序列。
[0182] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:115；或SEQ ID NO:117、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:115；或SEQ ID NO:117。在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、
99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:41；或SEQ ID NO:43、或其生物活性部分。所述核酸可以编码SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
[0183] 包含编码甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:48；
SEQ ID NO:116；或SEQ ID NO:118。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：
SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:
116；或SEQ ID NO:118，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变
而不同：SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:115；或SEQ ID NO:117。
[0184] 甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:115；或SEQ ID NO:117。在其它实施方案中，甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:115；或SEQ ID NO:117，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:115；或SEQ ID NO:117。
[0185] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或磷脂:
二酰基甘油酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的
活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)由用编码外源甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的核酸转化组成的遗传修饰；以及(2)天然SCT1基因
中的敲除突变。类似地，所述转化的细胞可以包含(1)增加甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的
表达的遗传修饰；以及(2)降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传修饰。
[0186] e.提高磷脂:二酰基甘油酰基转移酶的活性
[0187] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量
的方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白的
活性的核酸转化。
[0188] 所述核酸可以编码磷脂:二酰基甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是LRO1。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母或解脂耶氏酵母。
[0189] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:110中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、
99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性。所述核酸可以包含SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:110中所示的核苷酸序列。
[0190] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:105；或SEQ ID NO:109、或其生物活性部分。所述核酸可以编码SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序
列。
[0191] 包含编码磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:110中所示的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述基因与SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:110基本上相同，并且所述核苷酸序列编码保留由SEQ ID NO:105或SEQ ID 
NO:109编码的蛋白质的磷脂:二酰基甘油酰基转移酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同。
[0192] 磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白可以具有SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白与SEQ ID NO:105
或SEQ ID NO:109基本上相同，并且保留SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:109的蛋白质的功能
活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同。
[0193] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-
3-磷酸酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性
的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0194] f.提高甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶的活性
[0195] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中甘油-3-磷酸/二羟丙酮
磷酸sn-1酰基转移酶蛋白的活性的核酸转化。
[0196] 所述核酸可以编码甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是GPT2。在一些实施方案中，所述基因来自酿酒酵母、达氏诺莫维酵母
(Naumovozyma dairenensis)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)或卡氏诺莫
维酵母(Naumovozyma castellii)。
[0197] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:120；SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:124；或SEQ ID NO:126。
所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:120；SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:124；或SEQ ID NO:126。
[0198] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:119；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:123；或SEQ ID NO:125、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:119；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:123；或SEQ ID NO:125。
[0199] 包含编码甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:120；SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:124；或SEQ ID NO:126。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:120；SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:124；或SEQ ID NO:126，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列
上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:119；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:123；或SEQ ID NO:125。
[0200] 甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:119；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:123；或SEQ ID NO:125。在其它实施方案中，甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:119；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:123；或SEQ ID NO:125，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:
119；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:123；或SEQ ID NO:125。
[0201] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:
二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)由用编码外源甘油-3-磷
酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白的核酸转化组成的遗传修饰；以及(2)天然GPT2基因
中的敲除突变。
[0202] g.提高sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶的活性
[0203] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含
量的方法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白
的活性的核酸转化。
[0204] 所述核酸可以编码sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是SLC1或SLC4。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、酿酒酵母、三角褐指藻、圆红冬孢酵母、小红酵母(Rhodotorula minuta)、禾本红酵母、或解脂耶氏酵母。
[0205] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:76；或SEQ ID NO:78。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:
64；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:76；或SEQ ID NO:78。
[0206] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:75；或SEQ ID NO:77、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:75；或SEQ ID NO:77。
[0207] 包含编码sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:76；或SEQ ID NO:78。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:76；或SEQ ID NO:78，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异
或诱变而不同：SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:
67；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:75；或SEQ ID NO:77。
[0208] sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:75；或SEQ ID NO:77。在其它实施方案中，sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:
63；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:75；或SEQ ID NO:77，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:75；或SEQ ID NO:77。
[0209] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的
遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0210] h.提高溶血磷脂酸酰基转移酶的活性
[0211] 在一些实施方案中，所述酰基转移酶蛋白是溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方
法，所述方法包括将所述细胞用提高所述细胞中溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白的活性的核酸
转化。
[0212] 所述核酸可以编码溶血磷脂酸酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述基因是LOA1。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、酿酒酵母、或解脂耶氏酵母。
[0213] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:82；或SEQ ID NO:84。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:82；或SEQ ID NO:84。
[0214] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；或SEQ ID NO:83、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；或SEQ ID NO:83。
[0215] 包含编码溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:82；或SEQ ID NO:84。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:82；或SEQ ID NO:84，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，但是在核
苷酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；或SEQ ID NO:83。
[0216] 溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；或SEQ ID NO:83。在其它实施方案中，溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；或SEQ ID NO:83，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；或SEQ ID NO:83。
[0217] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0218] 4.提高磷脂酸磷酸酶的活性
[0219] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰提高所述细胞中磷脂酸磷酸酶蛋白的活性。所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用提
高所述细胞中磷脂酸磷酸酶蛋白的活性的核酸转化。
[0220] 所述核酸可以编码磷脂酸磷酸酶基因。在一些实施方案中，所述基因是PAH1。在一些实施方案中，所述基因来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母、酿酒酵母、或解脂耶氏酵母。
[0221] 在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与以下各项中所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:56；或SEQ ID NO:58。所述核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:56；或SEQ ID NO:58。
[0222] 在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与以下各项中所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更大的序列同源性：SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；或SEQ ID NO:57、或其生物活性部分。所述核酸可以编码以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；或SEQ ID NO:57。
[0223] 包含编码磷脂酸磷酸酶蛋白的基因的核酸可以包含以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:56；或SEQ ID NO:58。在其它实施方案中，所述基因与以下各项基本上相同：SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:56；或SEQ ID NO:58，并且所述核苷酸序列编码保留由以下各项编码的蛋白质的磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质，但是在核苷酸序列上，例如
由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；或SEQ ID NO:57。
[0224] 磷脂酸磷酸酶蛋白可以具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；或SEQ ID NO:57。在其它实施方案中，磷脂酸磷酸酶蛋白与以下各项基本上相
同：SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；或SEQ ID NO:57，并且保留以下各项的蛋白质的功能活性，但是在氨基酸序列上，例如由于天然等位基因变异或诱变而不同：SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；或SEQ ID NO:57。
[0225] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-
1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0226] C.用于降低天然蛋白质的活性的核酸和方法
[0227] 在一些实施方案中，所述转化的含油细胞包含降低天然蛋白质的活性的遗传修饰。这样的遗传修饰可以影响调节天然蛋白质转录的蛋白质，包括减少转录激活子的表达
和/或增加转录阻遏子的表达的修饰。影响调节蛋白的修饰可以减少天然蛋白质的表达并
且改变使细胞平衡朝向油酸积聚增加偏移的其它基因表达谱。或者，所述遗传修饰可以是
引入干扰核酸，如小干扰RNA、或编码干扰核酸的核酸。在其它实施方案中，所述遗传修饰由核酸和编码天然蛋白质的基因的调节区的同源重组组成。基因的调节区可以包括操纵子、
启动子、启动子上游的序列、增强子、和/或基因下游的序列。
[0228] 在一些实施方案中，所述转化的含油细胞包含由同源重组事件组成的遗传修饰。在某些实施方案中，所述转化的细胞包含由天然基因与核酸之间的同源重组事件组成的遗
传修饰。因此，所述遗传修饰使天然基因缺失、防止它转录、或防止可以被翻译成完全活性蛋白质的基因转录。同源重组事件可以使天然基因的一部分突变或缺失。举例来说，同源重组事件可以使天然酶的活性位点中的一个或多个残基突变，从而降低酶的效率或使它变得
无活性。或者，同源重组事件可以影响翻译后修饰、折叠、稳定性、或细胞内的定位。在一些实施方案中，同源重组事件将启动子置换为驱动更少的转录的启动子。在其它实施方案中，同源重组事件使启动子突变以损害它驱动转录的能力。在某些实施方案中，所述遗传修饰
是敲除突变。
[0229] 敲除突变可以使一个或多个基因缺失。此外，敲除突变可以将天然基因用编码不同蛋白质的外源基因取代。所述外源基因可以与外源启动子可操作地连接。在某些实施方
案中，所述基因不与外源启动子连接，并且相反，所述基因被配置成与天然基因重组以使得天然基因的启动子驱动所述外源基因的转录。因此，如果所述基因随机整合到细胞的基因
组中，那么它不太可能被表达。用于形成敲除的方法是本领域公知的(参见例如Fickers等,J.Microbiological Methods 55:727(2003))。
[0230] 在某些实施方案中，所述遗传修饰包含两个同源重组事件。在第一个事件中，编码基因的一部分的核酸与天然基因重组，并且在第二个事件中，编码所述基因的其余部分的核酸与天然基因重组。所述基因的这两个部分被设计成使得除非这两个部分彼此重组，否
则它们都不是功能性的。这两个事件进一步降低了在随机整合事件后所述基因可能被表达
的可能性。
[0231] 在某些实施方案中，所述基因编码标记蛋白，如显性选择性标记。因此，可以通过针对所述标记进行筛选来选择敲除细胞。在一些实施方案中，所述显性选择性标记是药物抗性标记。药物抗性标记是在由细胞表达时，允许细胞在原本通常将抑制细胞生长和/或存活的药物存在下生长和/或存活的显性选择性标记。可以通过在所述药物存在下培养细胞
来选择表达药物抗性标记的细胞。在一些实施方案中，所述药物抗性标记是抗生素抗性标
记。在一些实施方案中，所述药物抗性标记赋予对药物的抗性，所述药物选自由以下各项组成的组：两性霉素B(Amphotericin B)、杀假丝菌素(Candicidin)、菲律宾菌素(Filipin)、哈霉素(Hamycin)、纳他霉素(Natamycin)、制霉菌素(Nystatin)、龟裂杀菌素(Rimocidin)、联苯苄唑(Bifonazole)、布康唑(Butoconazole)、克霉唑(Clotrimazole)、益康唑
(Econazole)、芬替康唑(Fenticonazole)、异康唑(Isoconazole)、酮康唑(Ketoconazole)、卢立康唑(Luliconazole)、咪康唑(Miconazole)、奥莫康唑(Omoconazole)、奥昔康唑
(Oxiconazole)、舍他康唑(Sertaconazole)、硫康唑(Sulconazole)、噻康唑
(Tioconazole)、阿巴康唑(Albaconazole)、氟康唑(Fluconazole)、艾沙康唑
(Isavuconazole)、伊曲康唑(Itraconazole)、泊沙康唑(Posaconazole)、雷夫康唑
(Ravuconazole)、特康唑(Terconazole)、伏立康唑(Voriconazole)、阿巴芬净
(Abafungin)、阿莫罗芬(Amorolfin)、布替萘芬(Butenafine)、萘替芬(Naftifine)、特比萘芬(Terbinafine)、阿尼芬净(Anidulafungin)、卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净
(Micafungin)、苯甲酸、环吡酮(Ciclopirox)、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素
(Griseofulvin)、卤普罗近(Haloprogin)、水蓼二醛(Polygodial)、托萘酯(Tolnaftate)、结晶紫、阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、新霉素
(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、妥布霉素(Tobramycin)、巴龙霉素(Paromomycin)、大观霉素(Spectinomycin)、格尔德霉素(Geldanamycin)、除莠霉素(Herbimycin)、利福昔明(Rifaximin)、链霉素(Streptomycin)、氯碳头孢(Loracarbef)、厄他培南(Ertapenem)、多利培南(Doripenem)、亚胺培南(Imipenem)、美罗培南(Meropenem)、头孢羟氨苄
(Cefadroxil)、头孢唑啉(Cefazolin)、头孢噻吩(Cefalotin)、头孢氨苄(Cefalexin)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢孟多(Cefamandole)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢丙烯(Cefprozil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢克肟(Cefixime)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢妥仑
(Cefditoren)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢泊肟
(Cefpodoxime)、头孢他啶(Ceftazidime)、头孢布烯(Ceftibuten)、头孢唑肟
(Ceftizoxime)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、头孢比普(Ceftobiprole)、替考拉宁(Teicoplanin)、万古霉素(Vancomycin)、特拉万星(Telavancin)、克林霉素(Clindamycin)、林可霉素(Lincomycin)、达托霉素
(Daptomycin)、阿奇霉素(Azithromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、地红霉素
(Dirithromycin)、红霉素(Erythromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、醋竹桃霉素
(Troleandomycin)、泰利霉素(Telithromycin)、螺旋霉素(Spiramycin)、氨曲南
(Aztreonam)、呋喃唑酮(Furazolidone)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)、利奈唑胺
(Linezolid)、泊西唑来(Posizolid)、雷得唑来(Radezolid)、泰地唑来(Torezolid)、阿莫西林(Amoxicillin)、氨苄西林、阿洛西林(Azlocillin)、羧苄西林(Carbenicillin)、氯唑西林(Cloxacillin)、双氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、美洛西林
(Mezlocillin)、甲氧西林(Methicillin)、萘夫西林(Nafcillin)、苯唑西林(Oxacillin)、青霉素G、青霉素V、哌拉西林(Piperacillin)、青霉素G、替莫西林(Temocillin)、替卡西林(Ticarcillin)、克拉维酸(clavulanate)、舒巴坦(sulbactam)、他唑巴坦(tazobactam)、克拉维酸、杆菌肽(Bacitracin)、粘菌素(Colistin)、多粘菌素B(Polymyxin B)、环丙沙星
(Ciprofloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、左氧氟沙星
(Levofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、萘啶酸(Nalidixic acid)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、曲伐沙星(Trovafloxacin)、格帕沙星(Grepafloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、替马沙星(Temafloxacin)、磺胺米隆
(Mafenide)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺嘧啶银(Silver sulfadiazine)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine)、磺胺甲二唑(Sulfamethizole)、磺胺甲 唑(Sulfamethoxazole)、对氨基苯磺酰胺(Sulfanilimide)、柳氮磺胺吡啶
(Sulfasalazine)、磺胺异 唑(Sulfisoxazole)、甲氧苄啶-磺胺甲 唑(Trimethoprim-
Sulfamethoxazole)、复方新诺明(Co-trimoxazole)、亚磺酰胺基二氨基偶氮苯
(Sulfonamidochrysoidine)、地美环素(Demeclocycline)、强力霉素(Doxycycline)、米诺环素(Minocycline)、土霉素(Oxytetracycline)、四环素(Tetracycline)、氯法齐明
(Clofazimine)、氨苯砜(Dapsone)、卷曲霉素(Capreomycin)、环丝氨酸(Cycloserine)、乙胺丁醇(Ethambutol)、乙硫异烟胺(Ethionamide)、异烟肼(Isoniazid)、吡嗪酰胺
(Pyrazinamide)、利福平(Rifampicin)、利福布丁(Rifabutin)、利福喷丁(Rifapentine)、链霉素、胂凡纳明(Arsphenamine)、氯霉素(Chloramphenicol)、磷霉素(Fosfomycin)、夫西地酸(Fusidic acid)、甲硝唑(Metronidazole)、莫匹罗星(Mupirocin)、平板霉素
(Platensimycin)、奎奴普丁(Quinupristin)、达福普汀(Dalfopristin)、甲砜霉素
(Thiamphenicol)、替加环素(Tigecycline)、替硝唑(Tinidazole)、甲氧苄啶
(Trimethoprim)、遗传霉素(Geneticin)、诺尔丝菌素、潮霉素(Hygromycin)、博来霉素
(Bleomycin)、以及嘌呤霉素(Puromycin)。
[0232] 在一些实施方案中，所述显性选择性标记是营养标记。营养标记是当由细胞表达时使细胞能够使用一种或多种特定的营养源生长或存活的显性选择性标记。可以通过在限
制营养条件下培养细胞来选择表达营养标记的细胞，其中表达营养标记的细胞可以存活
和/或生长，但是缺少营养标记的细胞则不能。在一些实施方案中，营养标记选自由以下各项组成的组：乳清酸核苷5-磷酸脱羧酶、亚磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、碱性磷酸酶、氰胺水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、缩二脲水解酶、尿素酰胺水解酶、氰尿酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水解酶、亚磷酸脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳族脱亚磺酸酶、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶、以及支链淀粉酶
(Pullulonase)。
[0233] 可以使用不同的方法来敲除酵母细胞中的基因(参见例如Dulermo等,Biochimica Biophysica Acta 1831:1486(2013))。可以使用本文所公开的方法和本领域已知的其它方
法来敲除其它物种，如噬腺嘌呤阿克苏拉酵母中的不同基因。
[0234] 在一些实施方案中，遗传修饰使天然基因的表达减少了0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％。
[0235] 在一些实施方案中，遗传修饰使天然蛋白质的效率降低了0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％。
[0236] 在一些实施方案中，遗传修饰使天然蛋白质的活性降低了0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％。
[0237] 1.降低天然Δ12去饱和酶的活性
[0238] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0239] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然Δ12去饱和酶蛋白的
活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然Δ12去饱和酶基因和/或天然Δ12去饱和酶基
因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然Δ12去饱和酶蛋白是由Δ12基
因编码的。
[0240] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然Δ12去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母，并且天然Δ12去饱和酶蛋白是由SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列编码的。
[0241] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然Δ12去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克
苏拉酵母，并且天然Δ12去饱和酶蛋白是由SEQ ID NO:50中所示的核苷酸序列编码的。
[0242] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含
(1)降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)提高Δ9去饱和酶蛋白的活性
的遗传修饰。类似地，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)提高二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性的遗传修饰。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0243] 2.降低天然Δ9去饱和酶的活性
[0244] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然Δ9去饱和酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0245] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然Δ9去饱和酶蛋白的
活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然Δ9去饱和酶基因和/或天然Δ9去饱和酶基因
的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然Δ9去饱和酶蛋白是由Δ9、OLE1、或FAD1基因编码的。
[0246] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然Δ9去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母，并且天然Δ9去饱和酶蛋白是由SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列编码的。
[0247] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然Δ9去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母，并且天然Δ9去饱和酶蛋白是由SEQ ID NO:8中所示的核苷酸序列编码的。
[0248] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶(例如外源Δ9去饱和酶)、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然Δ9去饱和酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)由用编码
Δ9去饱和酶蛋白，例如来自不同物种的Δ9去饱和酶蛋白的核酸转化组成的遗传修饰。在
一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ12
去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0249] 3.降低天然二酰基甘油酰基转移酶的活性
[0250] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0251] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然二酰基甘油酰基转移
酶蛋白的活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然二酰基甘油酰基转移酶基因和/或天
然二酰基甘油酰基转移酶基因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然二
酰基甘油酰基转移酶蛋白是由DGAT1或DGAT2基因编码的。
[0252] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞
是解脂耶氏酵母，并且天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:94
中所示的核苷酸序列编码的。
[0253] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母，并且天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:
52或SEQ ID NO:104中所示的核苷酸序列编码的。
[0254] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶(例如外源二酰基甘油酰基转移酶)、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性的遗传修
饰；以及(2)由用编码二酰基甘油酰基转移酶蛋白，例如来自不同物种的二酰基甘油酰基转移酶蛋白的核酸的转化组成的遗传修饰。类似地，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)提高Δ9去饱和酶蛋白的活性的遗传
修饰。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶(例如不同的二酰基甘油
酰基转移酶)、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然DGA1蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)降低天然DGA2蛋白的活性的
遗传修饰。类似地，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传修饰。
[0255] 4.降低天然三酰基甘油脂酶的活性
[0256] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然三酰基甘油脂酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0257] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然三酰基甘油脂酶蛋白
的活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然三酰基甘油脂酶基因和/或天然三酰基甘油
脂酶基因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然三酰基甘油脂酶是由
TGL3、TGL3/4、或TGL4基因编码的。
[0258] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然三酰基甘油脂酶蛋白具有SEQ ID NO:91中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母，并且天然三酰基甘油脂酶蛋白是由SEQ ID NO:92中所示的核苷酸序列编码的。
[0259] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然三酰基甘油脂酶蛋白具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；或SEQ ID NO:89。
在一些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母，并且天然三酰基甘油脂酶蛋白是
由以下各项中所示的核苷酸序列编码的：SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:88；或SEQ ID NO:90。
[0260] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含
(1)降低天然三酰基甘油脂酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)提高二酰基甘油酰基转移酶
蛋白的活性的遗传修饰。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的
活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘
油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:
二酰基甘油酰基转移酶。
[0261] 三酰基甘油脂酶通过去除一个或多个脂肪酸链来消耗细胞的三酰基甘油。因此，降低细胞的净三酰基甘油脂酶活性可以增加细胞的油酸。这一降低可以通过降低酶的效
率，例如通过使它的活性位点中的氨基酸突变、或通过减少酶的表达来实现。举例来说，
TGL3敲除突变将降低三酰基甘油脂酶的活性，这是因为它阻止细胞转录TGL3。三酰基甘油
脂酶敲除描述于WO 2015/168531和USSN 61/987,098中(这两者均以引用的方式并入本
文)。
[0262] 在一些实施方案中，三酰基甘油脂酶是TGL3。在其它实施方案中，三酰基甘油脂酶是TGL3/4或TGL4。
[0263] 解脂耶氏酵母中的TGL3基因编码三酰基甘油脂酶蛋白TGL3(SEQ ID NO:91)。SEQ ID NO:92含有TGL3核苷酸序列、100个上游核苷酸以及100个下游核苷酸。因此，可以使用
SEQ ID NO:92核苷酸序列来设计能够与天然解脂耶氏酵母三酰基甘油脂酶基因中的核酸
序列重组的核酸。
[0264] 敲除盒SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:168能够与解脂耶氏酵母中的天然TGL3基因重组。因此，在一些实施方案中，可以使用由SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:168编码的核酸来在解脂耶氏酵母中产生三酰基甘油脂酶敲除突变。SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:168各自含
有潮霉素抗性基因hph的部分。这两个分离的序列都不编码功能性蛋白，但是这两个序列能够在成功重组时编码赋予潮霉素抗性的功能性激酶。此外，SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:
168都不含启动子或终止子，并且因此，它们依靠与解脂耶氏酵母TGL3基因同源重组来使
hph基因转录和翻译。以这种方式，可以通过在含有潮霉素的培养基上培养细胞来选择成功转化的含油细胞。
[0265] 敲除盒SEQ ID NO:167可以通过用引物NP1798(SEQ ID NO:165)和引物NP656(SEQ ID NO:164)扩增潮霉素抗性基因hph(SEQ ID NO:162)来制备。敲除盒SEQ ID NO:50可以通
过用引物NP655(SEQ ID NO:163)和引物NP1799(SEQ ID NO:166)扩增潮霉素抗性基因hph
(SEQ ID NO:162)来制备。
[0266] 可以使用不同的方法来设计降低解脂耶氏酵母中TGL3的活性的核酸(Biochimica Biophysica Acta 1831:1486-95(2013))。可以使用本文所公开的方法和本领域已知的其
它方法来降低其它物种中三酰基甘油脂酶的活性。举例来说，可以使用这些方法来降低噬
腺嘌呤阿克苏拉酵母的TGL3基因(SEQ ID NO:86)、噬腺嘌呤阿克苏拉酵母的TGL3/4基因
(SEQ ID NO:88)、或噬腺嘌呤阿克苏拉酵母的TGL4基因(SEQ ID NO:90)的活性。类似地，这些方法一般适用于降低酵母和其它生物体中蛋白质的活性。
[0267] 5.降低天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶的活性
[0268] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0269] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然sn-2酰基甘油脂肪酰
基转移酶蛋白的活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶
基因和/或天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶基因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些
实施方案中，天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白是由SLC1或SLC4基因编码的。
[0270] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所
述细胞是解脂耶氏酵母，并且天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:60或
SEQ ID NO:66中所示的核苷酸序列编码的。
[0271] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列。在一些实施方
案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母，并且天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶蛋白是
由SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:64中所示的核苷酸序列编码的。
[0272] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶(例如外源sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶)、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移
酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0273] 6.降低天然溶血磷脂酸酰基转移酶的活性
[0274] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0275] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然溶血磷脂酸酰基转移
酶蛋白的活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然溶血磷脂酸酰基转移酶基因和/或天
然溶血磷脂酸酰基转移酶基因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然溶
血磷脂酸酰基转移酶蛋白是由LOA1基因编码的。
[0276] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母，并且天然溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:84中所示的核苷酸序列编码的。
[0277] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是噬腺
嘌呤阿克苏拉酵母，并且天然溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:82中所示的核苷
酸序列编码的。
[0278] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶(例如外源溶血磷脂酸酰基转移酶)、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0279] 7.降低天然磷脂酸磷酸酶的活性
[0280] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然磷脂酸磷酸酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0281] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然磷脂酸磷酸酶蛋白的
活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然磷脂酸磷酸酶基因和/或天然磷脂酸磷酸酶基
因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然磷脂酸磷酸酶蛋白是由PAH1基
因编码的。
[0282] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然磷脂酸磷酸酶蛋白具有SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母，并且天然磷脂酸磷酸酶蛋白是由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码的。
[0283] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然磷脂酸磷酸酶蛋白具有SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克
苏拉酵母，并且天然磷脂酸磷酸酶蛋白是由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的。
[0284] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶(例如外源磷脂酸磷酸酶)、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶。在一些实施
方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸酰基转移酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。
[0285] 8.降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶的活性
[0286] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0287] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然甘油-3-磷酸酰基转
移酶蛋白的活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然甘油-3-磷酸酰基转移酶基因和/或
天然甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然甘油-3-磷酸酰基转移酶是由SCT1基因编码的。
[0288] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵
母，并且天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:18中所示的核苷酸序列编码的。
[0289] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是噬
腺嘌呤阿克苏拉酵母，并且天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:44中所示的
核苷酸序列编码的。
[0290] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移酶(例如外源甘油-3-磷酸酰基转移酶)。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的活性的遗传
修饰；以及(2)由用编码外源甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的核酸转化组成的遗传修饰。在
一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白的活性的遗传修饰；以
及(2)降低天然Δ12去饱和酶蛋白的活性的遗传修饰。
[0291] 9.降低天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶的活性
[0292] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0293] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然磷脂:二酰基甘油酰
基转移酶蛋白的活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶
基因和/或天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶基因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实
施方案中，天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白是由LRO1基因编码的。
[0294] 在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母并且天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母，并且天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:110中所示的核苷酸序
列编码的。
[0295] 在某些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母并且天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:105中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是噬腺嘌呤阿克苏拉酵母，并且天然磷脂:二酰基甘油酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:106
中所示的核苷酸序列编码的。
[0296] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(例如外源磷脂:二酰基甘油酰基转移酶)、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或甘油-3-磷酸酰基转移
酶。在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然甘
油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、和/或天然甘油-3-磷酸酰基转移酶。
[0297] 10.降低天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶的活性
[0298] 在一些方面，本发明涉及一种转化的细胞，所述细胞包含遗传修饰，其中所述遗传修饰降低天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白的活性。在一些实施方案中，所述遗传修饰是敲除突变。
[0299] 所述遗传修饰可以是用核酸转化。在某些实施方案中，本发明涉及一种改变细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将所述细胞用降低所述细胞中天然甘油-3-磷酸/二羟丙
酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白的活性的核酸转化。所述核酸可能能够与天然甘油-3-磷酸/二
羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶基因和/或天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶基
因的调节区中的核苷酸序列重组。在一些实施方案中，天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-
1酰基转移酶蛋白是由GPT2基因编码的。
[0300] 在某些实施方案中，所述细胞是酿酒酵母并且天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白具有SEQ ID NO:119中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是酿酒酵母，并且天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白是由SEQ ID NO:
120中所示的核苷酸序列编码的。
[0301] 在一些实施方案中，所述转化的细胞进一步包含提高以下各项的活性的遗传修饰：Δ9去饱和酶、延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶(例如外源甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶)、和/或甘油-3-
磷酸酰基转移酶。举例来说，所述转化的细胞可以包含(1)降低天然甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白的活性的遗传修饰；以及(2)由用编码外源甘油-3-磷酸/二羟丙
酮磷酸sn-1酰基转移酶蛋白的核酸转化组成的遗传修饰。在一些实施方案中，所述转化的
细胞进一步包含降低以下各项的活性的遗传修饰：天然Δ9去饱和酶、天然Δ12去饱和酶、天然二酰基甘油酰基转移酶、天然三酰基甘油脂酶、天然sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶、天然溶血磷脂酸酰基转移酶、天然磷脂酸磷酸酶、天然磷脂酸磷酸酶、和/或天然甘油-3-磷酸酰基转移酶。
[0302] D.产品
[0303] 在某些实施方案中，在外源脂肪酸、葡萄糖、乙醇、木糖、蔗糖、淀粉、淀粉糊精、甘油、纤维素和/或乙酸存在下培养所述转化的细胞。可以在培养期间添加这些底物以增加脂质产生。外源脂肪酸可以包括硬脂酸酯、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸、和/或二十碳三烯酸。
[0304] 在某些实施方案中，本发明涉及一种产品，所述产品是由本文所述的修饰的宿主细胞产生的。在某些实施方案中，所述产品是油、脂质、或三酰基甘油。在一些实施方案中，所述产品是棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、或亚油酸。在某些实施方案中，所述产品是饱和脂肪酸。因此，所述产品可以是辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸、或蜡酸。在一些实施方案中，所述产品是不饱和脂肪酸。因此，所述产品可以是肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、顺式-6-十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、或二十二碳六烯酸。
[0305] 在一些实施方案中，所述产品包含18-碳脂肪酸。在一些实施方案中，所述产品包含油酸、硬脂酸、或亚油酸。举例来说，所述产品可以是油酸。
[0306] 本领域技术人员将容易了解的是，本发明很好地适用于实现所述目标并且获得所提到的目的和优势以及其中固有的那些。本文所述的实施方案不旨在作为对本发明的范围
的限制。
[0307] 实施例
[0308] 通过以下实施例进一步说明本说明，所述实施例不应当以任何方式被视为构成限制。所有所引用的参考文献(包括如整个本申请中所引用的文献参考文献、授权专利、公开的专利申请、以及基因库登录号)的内容在此明确地以引用的方式并入本文。当以引用的方式并入本文的文件中术语的定义与本文所用的那些相矛盾时，以本文所用的定义为准。
[0309] 实施例1：提高DGA1蛋白的活性的方法(DGAT2基因)。
[0310] 用于过表达DGA1的示例性核酸构建体描述于USSN 61/943,664(在此以引用的方式并入本文)中。图2示出了用于使圆红冬孢酵母DGA1基因NG66(SEQ ID NO:22)在解脂耶氏
酵母中过表达的表达构建体pNC243。在转化之前，通过PacI/NotI限制酶切消化将DGA1表达构建体线性化。线性表达构建体各自包括用于DGAT2基因和用于Nat1基因的表达盒，所述
Nat1基因用作诺尔丝菌素(NAT)选择标记。
[0311] 使用如Chen(Applied Microbiology&Biotechnology 48:232-35(1997))中所述的转化方案，使DGA1表达构建体随机整合到解脂耶氏酵母菌株NS18(从ARS培养物保藏中心
获得，NRRL号：YB 392)的基因组中。在具有500μg/mL的NAT的YPD板上选择转化体。
[0312] 对于大多数的构建体，转化体之间存在显著的菌落变异，这可能是因为在仅获得功能性Nat1盒的细胞中缺少功能性DGA1表达盒或是因为DGA1整合位点对DGA1表达的负面
影响。所有的转化体均有脂质含量的显著增加。
[0313] 在某些实验中，天然圆红冬孢酵母DGA1过表达对解脂耶氏酵母中的脂质产生的作用不如不含内含子的圆红冬孢酵母DGAT2基因的合成型式的作用那么高。这一结果可以表
明在解脂耶氏酵母中圆红冬孢酵母DGAT2基因的基因剪接不是非常高效的。在某些实验中，针对在解脂耶氏酵母中的表达对圆红冬孢酵母DGA1基因进行的密码子优化对脂质产生没
有积极的影响。
[0314] 本领域技术人员将认识到的是，可以使用类似的方法来提高多种生物体中其它蛋白质的活性。
[0315] 实施例2：降低天然三酰基甘油脂酶蛋白的活性的方法。
[0316] 用于敲除解脂耶氏酵母TGL3基因，同时过表达DGAT2基因的示例性核酸构建体描述于WO 2015/168531和USSN 61/987,098(这两者均以引用的方式并入本文)中。将TGL3基
因从解脂耶氏酵母野生型菌株NS18(从NRLL号YB-392获得)和它的DGA1过表达衍生物NS281
中敲除。NS281过表达来自圆红冬孢酵母的DGA1基因，如上文所述。如下使解脂耶氏酵母
TGL3基因(YALI0D17534g，SEQ ID NO:92)缺失：通过使用引物对NP1798-NP656和NP655-
NP1799(SEQ ID NO:163-166)由含有潮霉素抗性基因(“hph”，SEQ ID NO:162)的质粒进行PCR来扩增两片段缺失盒。根据WO 2014/182657和USSN 61/819,746(这两者均以引用的方
式并入本文)中开发的方案，将所得的PCR片段(SEQ ID NO:167和168)共同转化到NS18和
NS281中。在hph盒中省去启动子和终止子以及将hph编码序列分成两个PCR片段降低了这些
片段的随机整合将赋予潮霉素抗性的概率。hph基因应当只在它通过同源重组在TGL3基因
座处整合以使得TGL3启动子和终止子可以引导它的转录的情况下才被表达。通过PCR以确
认不存在TGL3和存在tgl3::hyg特异性产物来筛选潮霉素抗性菌落。
[0317] 本领域技术人员将认识到的是，可以使用类似的方法来降低多种生物体中其它蛋白质的活性。
[0318] 实施例3：降低解脂耶氏酵母中的Δ12去饱和酶活性。
[0319] Δ12去饱和酶经由将油酸去饱和，从而使C18:1脂肪酸转化成C18:2来引起亚油酸的产生。在解脂耶氏酵母菌株NS18中使Δ12基因(SEQ ID NO:2)缺失来产生菌株NS419。在
NS419中诱导脂质积聚并且分析脂质组成。Δ12基因的缺失引起亚油酸产生的完全消除以
及伴随的油酸增加(图3)。
[0320] 实施例4：提高解脂耶氏酵母中的Δ9去饱和酶活性。
[0321] Δ9去饱和酶经由将硬脂酸去饱和，从而使C18:0脂肪酸转化成C18:1来引起油酸的产生。使Δ9基因(SEQ ID NO:4)在解脂耶氏酵母菌株NS18中过表达以产生菌株NS441。诱导脂质积聚并且分析脂质组成。Δ9基因的过表达引起油酸(和棕榈油酸)增加(图4)。
[0322] 实施例5：提高解脂耶氏酵母中的延长酶活性。
[0323] 延长酶使脂肪酸的碳链延长到超过由脂肪酸合酶产生的长度。YALI0F06754(SEQ ID NO:6)被鉴定为与酿酒酵母延长酶具有有限的同源性的解脂耶氏酵母基因。尽管这一基
因没有被注释为延长酶，但是在解脂耶氏酵母中评估了它的功能，并且发现YALI0F06754在C16脂肪酸延长到C18脂肪酸中起作用。YALI0F06754因此被称作ELO1。
[0324] 解脂耶氏酵母菌株NS18中ELO1的缺失引起C18水平的降低(图5A)。解脂耶氏酵母菌株NS18中ELO1的敲除被命名为NS276。相反，ELO1的过表达引起C18水平增加(图5B)，并且确切地说，ELO1的过表达增加了油酸水平(图5C)。在菌株NS452中进行ELO1过表达，所述菌株NS452过表达解脂耶氏酵母DGA1和紫色麦角菌DGA2并且含有Δ12去饱和酶缺失，从而产
生菌株NS477。
[0325] 实施例6：转换解脂耶氏酵母中的Δ9去饱和酶特异性。
[0326] 解脂耶氏酵母的天然Δ9去饱和酶使用C16饱和脂肪酸和C18饱和脂肪酸这两者作为底物。通过引入基因(SEQ ID NO:8、10、12、14、以及16)作为解脂耶氏酵母中唯一的Δ9活性来针对更高的C18特异性筛选外源Δ9酶。这是通过首先使NS18中的解脂耶氏酵母Δ9缺
失以产生菌株NS418来实现的。NS418由于不存在Δ9活性而需要补充不饱和脂肪酸，如油酸和/或Tween-80以生长。然后经由靶向整合将外源Δ9基因插入天然基因座中并且针对在没
有补充的情况下生长的能力进行选择。来自在此所示的来源生物体的Δ9酶的表达在不存
在天然酶的情况下使得底物特异性压倒性地转向C18:0底物，从而将C16:1含量减少到最低
水平。来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母(SEQ ID NO:8)和禾柄锈菌(SEQ ID NO:14)的Δ9酶产生
最高的油酸水平(图6)。
[0327] 实施例7：降低解脂耶氏酵母中的酰基转移酶活性。
[0328] 当天然酰基转移酶活性表现出对脂肪酸的底物偏好时，所述基因的缺失可能影响脂肪酸组成。在NS18中使甘油酰基转移酶SCT1(SEQ ID NO:18)缺失以产生菌株NS563。诱导脂质积聚并且分析脂质组成。SCT1的缺失引起油酸脂质分数的增加(图7)。
[0329] 实施例8：提高解脂耶氏酵母中的酰基转移酶活性。
[0330] 酰基转移酶的过表达可以提高总脂质水平以实现高脂质收率。重要的是，过表达的酰基转移酶具有所期望的底物特异性以维持或增加细胞的油酸含量。过表达可以是在野
生型酰基转移酶背景下或在包含天然酰基转移酶的缺失的菌株中。使来自各种物种的2型
二酰基甘油酰基转移酶(SEQ ID NO:20、22、24、26、28、以及30)在NS18中表达。来自解脂耶氏酵母的编码DGA1蛋白的DGAT2基因产生最高的油酸水平(图8)。类似地，使来自不同物种
的1型二酰基甘油酰基转移酶(SEQ ID NO:32、34、36、38、以及40)在NS281(通过使圆红冬孢酵母DGA1在NS18中过表达所产生)中表达。来自紫色麦角菌的DGA2基因产生最高的油酸水
平(图9)。此外，使来自不同物种的甘油-3-磷酸酰基转移酶(SEQ ID NO:18、42、44、46、以及
48)在携带天然SCT1和Δ12基因缺失的菌株(NS564)中表达。来自酿酒酵母和噬腺嘌呤阿克
苏拉酵母的SCT1基因产生最高的油酸水平(图10)。
[0331] 实施例9：降低噬腺嘌呤阿克苏拉酵母中的Δ12去饱和酶活性。
[0332] 使Δ12基因(SEQ ID NO:50)从噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS252(ATCC 76597)中缺失以产生菌株NS478。诱导脂质积聚并且分析脂质组成。Δ12的缺失引起亚油酸产生的完全消除以及伴随的油酸增加(图11)。
[0333] 实施例10：提高噬腺嘌呤阿克苏拉酵母中的酰基转移酶活性。
[0334] 如在解脂耶氏酵母中那样，噬腺嘌呤阿克苏拉酵母中酰基转移酶的过表达可以提高总脂质水平以实现高脂质收率。重要的是，过表达的酰基转移酶具有所期望的底物特异
性以维持或增加细胞的油酸含量。过表达可以是在野生型酰基转移酶背景下或在天然酰基
转移酶缺失的菌株中。使来自不同物种的2型二酰基甘油酰基转移酶(SEQ ID NO:20、22、以及52)在噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS252中表达。来自解脂耶氏酵母的DGA1基因(SEQ ID 
NO:20)产生最高的油酸水平(图12)。
[0335] 实施例11：提高解脂耶氏酵母中的Δ9去饱和酶活性。
[0336] 使解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶基因在实施例5中所述的菌株NS477中过表达，从而产生菌株NS551。菌株NS551表达解脂耶氏酵母DGA1、紫色麦角菌DGA2、解脂耶氏酵母ELO1、解脂耶氏酵母Δ9，并且包含Δ12敲除。以占总C16和C18脂肪酸的百分比计，该菌株含有约
87％的油酸。图13提供了菌株NS551的生物工程化的概述。
[0337] 实施例12：提高噬腺嘌呤阿克苏拉酵母中的延长酶活性。
[0338] 经由线性表达盒的随机基因组整合使来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母(AaELO1，SEQ ID NO:108；AaELO2，SEQ ID NO:160)、解脂耶氏酵母(YlELO1，SEQ ID NO:6)、酿酒酵母
(ScELO1，SEQ ID NO:158)、以及褐家鼠(rELO2，SEQ ID NO:156)的延长酶基因在噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS554中表达。NS554携带野生型噬腺嘌呤阿克苏拉酵母中的Δ12去饱和
酶基因(SEQ ID NO:50)的缺失。AaELO1、YlELO1、以及rELO2的表达都增加了细胞的C18脂肪酸含量，这表明C16脂肪酸的延长增加(图14)。NS554中AaELO1、YlELO1、以及rELO2的表达还增加了油酸含量(图15)。
[0339] 实施例13：转换解脂耶氏酵母中的延长酶特异性。
[0340] 经由线性表达盒的随机基因组整合使来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母(AaELO1，SEQ ID NO:108；AaELO2，SEQ ID NO:160)、解脂耶氏酵母(YlELO1，SEQ ID NO:6)、酿酒酵母
(ScELO1，SEQ ID NO:158)、以及褐家鼠(rELO2，SEQ ID NO:156)的延长酶基因在解脂耶氏酵母菌株NS276中表达。NS276携带野生型解脂耶氏酵母中的ELO1基因(SEQ ID NO:6)的缺
失。rELO2的表达增加了细胞的C18脂肪酸含量，这表明C16脂肪酸的延长增加(图16)。此外，NS276中rELO2的表达还增加了油酸含量(图15)。
[0341] 实施例14：提高噬腺嘌呤阿克苏拉酵母中的延长酶活性。
[0342] 经由线性表达盒的随机基因组整合使来自解脂耶氏酵母(Yl ELO1，SEQ ID NO:6)的延长酶1基因在噬腺嘌呤阿克苏拉酵母菌株NS557中表达。NS557携带野生型噬腺嘌呤阿
克苏拉酵母中的Δ12去饱和酶基因(SEQ ID NO:50)的缺失和DGA1的解脂耶氏酵母基因
(SEQ ID NO:20)。大多数的转化体产生增加的C18脂肪酸，这表明C16脂肪酸由延长酶延长
(图17)。筛选了总共95个分离株，并且图17描绘了代表性结果。表现最好的分离株被命名为NS776，并且进一步分析它的脂质组成。菌株NS776中C16脂肪酸和C18脂肪酸的约87％是油
酸(图18)。
[0343] 实施例15：解脂耶氏酵母中遗传修饰的组合。
[0344] 将遗传修饰的各种组合引入到解脂耶氏酵母中。用于引入一些修饰的策略示于图19中。使用野生型解脂耶氏酵母菌株NS18作为亲本菌株(从ARS培养物保藏中心获得，NRRL
号YB 392)。通过首先使SCT1基因(SEQ ID NO:18)缺失，然后添加来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母的SCT1基因(SEQ ID NO:44)由菌株NS18制备菌株NS804。通过首先使Δ9去饱和酶基因
(SEQ ID NO:4)缺失，然后添加来自禾柄锈菌的Δ9去饱和酶基因(SEQ ID NO:14)由菌株
NS804制备菌株NS809。通过首先使Δ9去饱和酶基因(SEQ ID NO:4)缺失，然后添加来自噬
腺嘌呤阿克苏拉酵母的Δ9去饱和酶基因(SEQ ID NO:8)由菌株NS804制备菌株NS810。
[0345] 通过使Δ12去饱和酶基因(SEQ ID NO:2)缺失，使来自解脂耶氏酵母的DGA1基因(SEQ ID NO:20)过表达，添加来自紫色麦角菌的DGA2基因(SEQ ID NO:38)，并且添加来自
褐家鼠的ELO2基因(SEQ ID NO:156)由菌株NS18制备菌株NS813。
[0346] 通过使Δ12去饱和酶基因(SEQ ID NO:2)缺失，使Δ9去饱和酶基因(SEQ ID NO:4)缺失，添加来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母的Δ9去饱和酶基因(SEQ ID NO:8)，使SCT1基因
(SEQ ID NO:18)缺失，添加来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母的SCT1基因(SEQ ID NO:44)，并且
添加来自褐家鼠的ELO2基因(SEQ ID NO:156)由菌株NS18制备菌株NS814。
[0347] 菌株NS18、NS804、NS809、NS810、NS813、以及NS814的脂肪酸谱示于图20中。每一种修饰的菌株均比野生型菌株产生更多的油酸(C18:1)。
[0348] 通过使Δ12基因(SEQ ID NO:2)缺失由菌株NS809制备菌株NS968。通过添加来自褐家鼠的ELO2基因(SEQ ID NO:156)并且添加来自圆红冬孢酵母的DGA1基因(SEQ ID NO:
22)由菌株NS968制备菌株NS975。菌株NS992、NS993、以及NS994是通过添加来自禾柄锈菌的Δ9去饱和酶基因(SEQ ID NO:14)，添加来自圆红冬孢酵母的DGA1基因(SEQ ID NO:22)的
另外的拷贝，并且添加来自紫色麦角菌的DGA2基因(SEQ ID NO:38)由菌株NS975制备的三
种分离株。
[0349] 通过使Δ12基因(SEQ ID NO:2)缺失由菌株NS810制备菌株NS812。通过添加来自禾柄锈菌的Δ9去饱和酶基因(SEQ ID NO:14)，添加来自圆红冬孢酵母的DGA1基因(SEQ ID NO:22)，添加来自褐家鼠的ELO2基因(SEQ ID NO:156)，并且添加来自紫色麦角菌的DGA2基因(SEQ ID NO:38)由菌株NS812制备菌株NS969。
[0350] 通过使Δ12基因(SEQ ID NO:2)缺失，使SCT1基因(SEQ ID NO:18)缺失，并且添加来自噬腺嘌呤阿克苏拉酵母的SCT1基因(SEQ ID NO:44)由菌株NS18制备菌株NS662。
[0351] 菌株NS18、NS804、NS809、NS968、NS975、NS992、NS993、NS994、NS810、NS812、NS969、NS987、NS988、NS551(描述于实施例11中)、以及NS622的脂肪酸谱示于图21中。每一种修饰的菌株均比野生型菌株产生更多的油酸(C18:1)。此外，用来自紫色麦角菌的DGA2基因(SEQ ID NO:38)修饰的每一种菌株均比野生型NS18菌株包含更多的脂质。
[0352] 以引用的方式并入
[0353] 在本文所引用的专利、公开的专利申请、以及非专利参考文献中的每一篇在此以引用的方式整体并入本文。
[0354] 等同方案
[0355] 本领域技术人员仅使用常规的实验就将认识到或能够确定在本文所描述的本发明的具体实施方案的多个等同方案。这些等同方案意在由以下权利要求书所涵盖。
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