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细胞法产生葡糖二酸

阅读：730发布：2023-03-01

专利汇可以提供细胞法产生葡糖二酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及通过重组表达肌醇-1- 磷酸合酶、肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶在细胞内产生葡糖醛酸和葡糖二酸。本发明还公开了对编码糖醛酸脱氢酶之基因的克隆和表征。，下面是细胞法产生葡糖二酸专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种细胞，其重组表达编码糖醛酸脱氢酶的基因并且重组表达编码肌醇加氧酶的基因。
2.权利要求1的细胞，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是细菌基因。
3.权利要求1或2的细胞，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)基因或者恶臭假单胞菌(Pseudomonas purida)基因。
4.权利要求1或2的细胞，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)基因。
5.权利要求1至4中任一项的细胞，其中所述编码肌醇加氧酶的基因是哺乳动物基因。
6.权利要求5的细胞，其中所述编码肌醇加氧酶的基因是小鼠基因。
7.权利要求1至6中任一项的细胞，其中所述细胞重组表达编码肌醇-1-磷酸合酶的基因。
8.权利要求7的细胞，其中所述编码肌醇-1-磷酸合酶的基因是酵母基因。
9.权利要求8的细胞，其中所述编码肌醇-1-磷酸合酶的基因是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因。
10.权利要求1至9中任一项的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
11.权利要求10的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
12.权利要求11的细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。
13.权利要求1至12中任一项的细胞，其中所述编码肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因已经密码子优化修饰，用于在细菌中表达。
14.权利要求1至9中任一项的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
15.权利要求14的细胞，其中所述细胞是真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或者哺乳动物细胞。
16.权利要求1至15中任一项的细胞，其中所述编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因由质粒表达。
17.权利要求1至15中任一项的细胞，其中所述编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因被整合到所述细胞的基因组中。
18.权利要求1至17中任一项的细胞，其中通过所述细胞内糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白质工程使葡糖二酸的产生增加。
19.权利要求1至18中任一项的细胞，其中通过使细胞内萄糖二酸代谢途径的组分突变而使葡糖二酸的产生增加。
20.一种产生葡糖二酸的方法，包括培养权利要求1至19中任一项的细胞以产生葡糖二酸。
21.权利要求20的方法，还包括从所述细胞回收葡糖二酸。
22.一种经遗传修饰的微生物，其包含编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶的一个或多个重组核酸分子。
23.一种产生葡糖二酸的方法，所述方法包括对细胞进行遗传修饰以使其重组表达糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶中的至少一种，培养所述细胞的群以及从已经遗传修饰以产生萄糖二酸的该细胞群中收集葡糖二酸。
24.权利要求23的方法，其中所述细胞重组表达编码糖醛酸脱氢酶的基因。
25.权利要求23或24的方法，其中所述细胞重组表达编码肌醇加氧酶的基因。
26.权利要求23至25中任一项的方法，其中所述细胞重组表达编码肌醇-1-磷酸合酶的基因。
27.权利要求23至26中任一项的方法，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是细菌基因。
28.权利要求23至26中任一项的方法，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是丁香假单胞菌基因或恶臭假单胞菌基因。
29.权利要求23至26中任一项的方法，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是根瘤农杆菌基因。
30.权利要求23至29中任一项的方法，其中所述编码肌醇加氧酶的基因是哺乳动物基因。
31.权利要求30的方法，其中所述编码肌醇加氧酶的基因是小鼠基因。
32.权利要求23至31中任一项的方法，其中所述编码肌醇-1-磷酸合酶的基因是酵母基因。
33.权利要求32的方法，其中所述编码肌醇-1-磷酸合酶的基因是酿酒酵母基因。
34.权利要求23至33中任一项的方法，其中所述细胞是原核细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
36.权利要求35的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
37.权利要求23至36中任一项的方法，其中所述编码肌醇加氧酶和/或编码肌醇-1-磷酸合酶的基因已经密码子优化修饰，用于在细菌中表达。
38.权利要求23至33中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述细胞是真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
40.权利要求23至39中任一项的方法，其中所述编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因由质粒表达。
41.权利要求23至37中任一项的方法，其中所述编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因被整合到所述细胞的基因组中。
42.权利要求23至41中任一项的方法，其中通过所述细胞内糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白质工程使葡糖二酸的产生增加。
43.权利要求23至42中任一项的细胞，其中通过使细胞内萄糖二酸代谢途径的组分突变而使葡糖二酸的产生增加。
44.由细胞培养物产生的葡糖二酸，其中所述细胞培养物中的所述细胞已经遗传修饰以使其重组表达糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶中的至少一种。
45.权利要求44的葡糖二酸，其中所述细胞重组表达编码糖醛酸脱氢酶的基因。
46.权利要求44或45的葡糖二酸，其中所述细胞重组表达编码肌醇加氧酶的基因。
47.权利要求44至46中任一项的葡糖二酸，其中所述细胞重组表达编码肌醇-1-磷酸合酶的基因。
48.权利要求44至47中任一项的葡糖二酸，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是细菌基因。
49.权利要求44至48中任一项的葡糖二酸，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是丁香假单胞菌基因或恶臭假单胞菌基因。
50.权利要求44至48中任一项的葡糖二酸，其中所述编码糖醛酸脱氢酶的基因是根瘤农杆菌基因。
51.权利要求44至50中任一项的葡糖二酸，其中所述编码肌醇加氧酶的基因是哺乳动物基因。
52.权利要求51的葡糖二酸，其中所述编码肌醇加氧酶的基因是小鼠基因。
53.权利要求44至52中任一项的葡糖二酸，其中所述编码肌醇-1-磷酸合酶的基因是酵母基因。
54.权利要求53的葡糖二酸，其中所述编码肌醇-1-磷酸合酶的基因是酿酒酵母基因。
55.权利要求44至54中任一项的葡糖二酸，其中所述细胞是原核细胞。
56.权利要求55的葡糖二酸，其中所述细胞是细菌细胞。
57.权利要求56的葡糖二酸，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
58.权利要求44至57中任一项的葡糖二酸，其中所述编码肌醇加氧酶和/或编码肌醇-1-磷酸合酶的基因已经密码子优化修饰，用于在细菌中表达。
59.权利要求44至54中任一项的葡糖二酸，其中所述细胞是真核细胞。
60.权利要求59的葡糖二酸，其中所述细胞是真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
61.权利要求44至60中任一项的葡糖二酸，其中所述编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因由质粒表达。
62.权利要求44至60中任一项的葡糖二酸，其中所述编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因被整合到所述细胞的基因组中。
63.权利要求44至62中任一项的葡糖二酸，其中通过所述细胞内糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白质工程使葡糖二酸的产生增加。
64.权利要求44至63中任一项的葡糖二酸，其中通过使细胞内萄糖二酸代谢途径的组分突变而使葡糖二酸的产生增加。
65.一种分离的核酸分子，其选自：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25的分离的核酸分子；
(b)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26序列之氨基酸序列的分离的核酸分子；
(c)与(a)或(b)的全长序列反向互补的分离的核酸分子；
(d)与(a)-(c)中任一项具有至少95％的核苷酸一致性的分离的核酸分子。
66.一种包含权利要求65中所述核酸分子的重组表达载体，其与转录调控元件可操作地连接。
67.一种分离的糖醛酸脱氢酶多肽，其由权利要求65的所述核酸分子编码。
68.一种分离的糖醛酸脱氢酶多肽，其与SEQ ID NO：2具有至少95％的氨基酸一致性。
69.一种细胞，其含有权利要求66的重组表达载体。
70.权利要求69的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞。
71.一种产生糖醛酸脱氢酶的方法，包括在允许多肽表达的条件下培养权利要求69或
70所述的细胞。
72.权利要求71的方法，还包括从培养基或所述细胞中回收多肽。
73.一种分离的抗体，其与权利要求67所述的多肽选择性结合。
74.一种分离的抗体，其与权利要求68所述的多肽选择性结合。
75.权利要求73或74的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其抗原结合片段。

说明书全文

细胞法产生葡糖二酸

[0001] 关联申请

[0002] 根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2008年4月4日提交的名称为“微生物法产生葡糖二酸”的美国临时申请NO.61/042,502的权益，其全文通过引用并入本文。

[0003] 政府利益

[0004] 本项工作得到海军研究局基金N000140510656的部分资助。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

[0005] 本发明涉及通过重组基因表达来产生葡糖醛酸和葡糖二酸。

背景技术

[0006] 包括应用重组DNA技术在内的代谢工程，已经显示出其为以下多种目的而优化细胞功能的潜力：重组蛋白的生产、提高生产力的途径工程以及新产品产生的新途径设计。新途径被定义为在宿主物种中不存在的一系列转化。已经设计了新途径并在大肠杆菌(E.coli)中构建，用于生产1，3-丙二醇(C.E.Nakamura和G.M.Whited(2003).Curr.Opin.Biotechnol.14：454-459)、青蒿酸(Nature Biotech，21，pp796-802)和1，2，4-丁三醇(JACS，125，pp12998-12999)。在这些方法中，每一个步骤均基于酶的可用性而设计，鉴定了来自不同生物体的所招募的酶的活性，并且通过组装这些酶促步骤而在大肠杆菌中构建新途径。这些实例中的基本思想是将包括酶在内的蛋白看作是可相互交换的部分，术语“合成生物学”已用于描述此概念(Nature 421，p118；Nature Chemical Biology，3，pp521-525)。

[0007] D-葡糖二酸可见于水果、蔬菜和哺乳动物中，并已经针对其降低胆固醇 (Z.Walaszek 等 (1996).Nutr.Res.16：673-681) 和癌症化疗 (J.Singh 和
K.P.Gupta(2003).Biomed Environ.Sci.16：9-16)进行了研究。在最近的一篇报道中
(T.Werpy 和 G.Petersen(2004).“Top Value Added Chemicals From Biomass，”Vol.I，PNNL and NREL)，D-葡糖二酸被确认为“来自生物质的高附加值化学品”以及用于产生新型尼龙和超支化聚酯的有希望的起始材料。D-葡糖二酸是含有4个手性碳的高度官能化化合物，目前通过利用硝酸作为氧化剂对D-葡萄糖进行化学氧化而产生，该过程是非选择性的并且昂贵(T.Werpy和G.Peterson(2004).“Top Value Added Chemicals From Biomass，”Vol.I，PNNL and NREL)。利用酶的新型催化过程可带来高产量和高选择性。可以通过模仿哺乳动物体内存在的D-葡糖二酸途径而获得产生葡糖二酸的生物学方法。但是，这种途径效率不高，其包含超过10个以D-葡萄糖为起始原料的转化步骤。

发明内容

[0008] 本文中描述了编码糖醛酸脱氢酶之第一个udh基因的克隆和表征。本文中进一步描述了通过将不同生物来源的“生物部分”相组合来建立细胞(例如大肠杆菌细胞)内产生D-葡糖醛酸或D-葡糖二酸的新途径。第一种酶即肌醇-1-磷酸合酶(Ino1/MIPS)，通过中间体葡萄糖-6-磷酸，由葡萄糖产生肌醇(Dean-Johnson和Henry，1989)。第二种酶即肌醇加氧酶(MIOX)，使肌醇转化成葡糖醛酸。这两种酶在细胞(例如大肠杆菌细胞)内的共表达使得可以由葡萄糖产生葡糖醛酸。糖醛酸脱氢酶可以使葡糖醛酸转化成葡糖二酸(Bateman和Kosuge等，1970；Wagner和Hollman，1976)。如本文所述，此第三种基因与INO1和MIOX同时表达使得可以由葡萄糖产生葡糖二酸。出乎意料的是，重组表达糖醛酸脱氢酶使该途径的流量显著增加，从而可以得到高产量的葡糖二酸。

[0009] 本发明提供了一种重组表达编码糖醛酸脱氢酶之基因并且重组表达编码肌醇加氧酶之基因的细胞。在一些实施方案中，编码糖醛酸脱氢酶的基因是细菌基因，例如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)基因或根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)基因。在一些实施方案中，编码肌醇加氧酶的基因是哺乳动物基因，例如小鼠基因。在一些实施方案中，所述细胞还重组表达编码肌醇-1-磷酸合酶的基因。在一些实施方案中，编码肌醇-1-磷酸合酶的基因可以是真菌基因或酵母基因，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因。

[0010] 重组表达上述酶的细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，编码肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因已经密码子优化修饰，用于在细菌中表达。在一些实施方案中，所述细胞是真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

[0011] 编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因可以由质粒表达或者被整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，通过细胞内糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白质工程或者通过使细胞内萄糖二酸代谢途径的组分突变，从而使葡糖二酸的产生增加。本发明的一些实施方案中包括经遗传修饰的微生物，其包含一种或多种编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶的重组核酸分子。

[0012] 本发明还提供了产生葡糖醛酸和葡糖二酸的方法，其包括培养与本发明相关的细胞以产生葡糖醛酸或葡糖二酸，以及从细胞中回收葡糖醛酸或葡糖二酸。在一些实施方案中，所述产生葡糖醛酸或葡糖二酸的方法包括对细胞进行遗传修饰以使其重组表达糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶中的至少一种，培养所述细胞的群，以及从已经遗传修饰以产生萄糖二酸的细胞的群中收集葡糖二酸。

[0013] 在一些实施方案中，所述细胞重组表达肌醇加氧酶并产生葡糖醛酸。在一些实施方案中，所述细胞重组表达肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶并产生葡糖醛酸。在一些实施方案中，所述细胞重组表达肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶并产生葡糖二酸。在一些实施方案中，所述细胞重组表达肌醇加氧酶、肌醇-1-磷酸合酶和糖醛酸脱氢酶并产生葡糖二酸。

[0014] 在一些实施方案中，编码糖醛酸脱氢酶的重组表达基因是细菌基因，例如丁香假单胞菌基因或者根瘤农杆菌基因。在一些实施方案中，编码肌醇加氧酶的重组表达基因是哺乳动物基因，例如小鼠基因。在一些实施方案中，编码肌醇-1-磷酸合酶的重组表达基因是真菌基因或酵母基因，例如酿酒酵母基因。在一些实施方案中，重组表达上述酶的细胞是原核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。编码肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因可以经密码子优化修饰，用于在细菌中表达。

[0015] 在一些实施方案中，重组表达上述酶的细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因可以由质粒表达或者被整合到所述细胞的基因组中。可以通过细胞内糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白质工程或者通过使细胞内萄糖二酸代谢途径的组分突变而使葡糖二酸的产生增加。

[0016] 本发明还提供了由上述细胞和方法产生的葡糖二酸。在一些实施方案中，葡糖二酸由细胞培养物产生，其中在所述细胞培养物中的细胞已经遗传修饰以使其重组表达糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和肌醇-1-磷酸合酶中的至少一种。在一些实施方案中，编码糖醛酸脱氢酶的基因是细菌基因，例如丁香假单胞菌基因或根瘤农杆菌基因。在一些实施方案中，编码肌醇加氧酶的基因是哺乳动物基因，例如小鼠基因。在一些实施方案中，编码肌醇-1-磷酸合酶的基因是真菌基因或酵母基因，例如酿酒酵母基因。

[0017] 在一些实施方案中，由原核细胞产生葡糖二酸。在一些实施方案中，所述原核细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，编码肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因经密码子优化修饰，用于在细菌中表达。葡糖二酸还可以由真核细胞产生。在某些实施方案中，所述细胞是真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

[0018] 为了产生葡糖二酸，编码糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的基因可以由质粒表达或者整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，通过细胞内糖醛酸脱氢酶、肌醇加氧酶和/或肌醇-1-磷酸合酶的蛋白质工程或者通过使细胞内萄糖二酸代谢途径的组分突变而使葡糖二酸的产生增加。

[0019] 本发明还包括分离的核酸分子，其包括：(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25的分离的核酸分子；(b)编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26序列之氨基酸序列的分离的核酸分子；(c)与(a)或(b)的全长序列反向互补的分离的核酸分子；以及(d)与(a)-(c)中任一项具有至少95％的核苷酸一致性的分离的核酸分子。本发明还包括包含上述核酸分子的重组表达载体，所述核酸分子与转录调控元件可操作地连接。本发明还包括分离的糖醛酸脱氢酶多肽，其由本文中所述核酸分子编码。在一些实施方案中，分离的糖醛酸脱氢酶多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26具有至少95％的氨基酸一致性。

[0020] 本发明包括含有本文中所述重组表达载体的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或者动物细胞。通过在允许多肽表达的条件下培养所述细胞以及从培养基或细胞中回收所述多肽，可将重组表达糖醛酸脱氢酶基因的细胞用于产生糖醛酸脱氢酶蛋白。

[0021] 本发明还包括分离的抗体，其与本文中所述的糖醛酸脱氢酶多肽选择性地结合。在一些实施方案中，所述抗体选择性地结合与SEQ ID NO：2具有至少95％的氨基酸一致性的多肽。在一些实施方案中，所述抗体与由与SEQ ID NO：1具有至少95％核苷酸一致性的核酸所编码的多肽相结合。所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者其抗原结合片段。
附图说明

[0022] 图1是表明所设计的在大肠杆菌中产生葡糖二酸的途径的图。PTS＝磷酸烯醇式丙酮酸依赖型磷酸转移酶系统；Inol(MIPS)＝来自酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合酶；磷酸酶＝SuhB，内源性大肠杆菌酶(Matsuhisa等.J.Bacteriol.(1995)177：200-205)；MIOX＝经密码子优化的小鼠肌醇加氧酶；Udh＝丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶；PEP＝磷酸烯醇式丙酮酸。

[0023] 图2是表明在BL21(DE3)(pRSFD-IN-MI)中产生葡糖醛酸的图。将培养物在添加了10g/L葡萄糖和0.1mM IPTG的LB培养基中于30℃一式三份培养。数据点是三次生物学重复的平均值和标准偏差。△＝葡糖醛酸(左轴)；□＝肌醇(左轴)；◇＝葡萄糖(右轴)。葡萄糖浓度以g/L计。

[0024] 图3是显示在BL21(DE3)中表达之重组Ino1、MIOX和Udh的体外活性的图，所述BL21(DE3)中带有这三种基因。将培养物在添加了10g/L葡萄糖的LB培养基中于30℃培养并用0.05mM IPTG诱导。MIOX活性表示为相对于背景计算的净活力。数据是三次生物学重复的平均值和标准偏差。△＝Ino1；□＝MIOX；◇＝Udh。

[0025] 图4是小鼠MIOX基因与其经密码子优化用于在大肠杆菌中表达的合成物之间的DNA序列比对。DNA序列比对利用Vector NTI 软件(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行。

[0026] 图5是表明细菌中葡糖醛酸和葡糖二酸的分解代谢的图。通过敲除uxaC基因阻止了葡糖醛酸的消耗。uxaC基因敲除的细胞中糖醛酸脱氢酶的存在使得大肠杆菌能够利用葡糖醛酸生长。

[0027] 图6是描述能够对来自丁香假单胞菌的假定Udh进行酶促动力学测定的图。含有+由PSPTO_1053ORF所表达之蛋白的大肠杆菌裂解物能够利用NAD 作为辅助因子使葡糖醛酸氧化。

[0028] 图7是显示来自大肠杆菌粗裂解物之不同来源的经表达udh基因的活性。pTATudh2＝根瘤农杆菌，pTPPudh＝恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，pTPSudh＝丁香假单胞菌。空心柱＝无IPTG，实心柱＝含0.1mM IPTG。

[0029] 图8描述了葡糖二酸的LC-MS色谱图。图8a显示从酶促反应混合物中分离的葡糖二酸。图8b显示葡糖二酸标准品。葡糖二酸用其质量(m/z＝209、210、419、420和441)表征，洗脱峰也与葡糖二酸标准品的质量相对应。

[0030] 图9描述了对经纯化之Udh的SDS-PAGE分析。经纯化的Udh在变性条件下进行12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳道1，分子量标记；泳道2和3，表达pETATu之大肠杆菌BL21(DE3)的粗提物和经纯化的根瘤农杆菌Udh；泳道4和5，表达pETPPu之大肠杆菌BL21(DE3)的粗提物和经纯化的恶臭假单胞菌Udh；泳道6和7，表达pETPSu之大肠杆菌BL21(DE3)的粗提物和经纯化的丁香假单胞菌Udh。经纯化的Udh以箭头符号表示。

[0031] 图10是描述pH值和温度对来源于根瘤农杆菌、恶臭假单胞菌和丁香假单胞菌之Udh活性的影响的图。图10a显示了作为pH之函数的相对活性。图10b显示了在所示温度下孵育30分钟后的相对活性。图10c显示了作为测试温度之函数的相对活性。方块+直线：根瘤农杆菌Udh。圆+虚线：恶臭假单胞菌Udh。三角形+点线：丁香假单胞菌Udh。

[0032] 图11提供了显示udh基因在染色体上的座位及其相邻基因的列表。图11a：丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株；图11b：恶臭假单胞菌KT2440；图11c：根瘤农杆菌C58菌株。图11d是显示其相邻基因名称的列表。这些座位和名称参考NC_004578(丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株)、NC_002947(恶臭假单胞菌KT2440)和NC_003063(根
瘤农杆菌C58菌株)的基因组序列。

[0033] 图12显示了序列比对和系统进化分析。图12a描述了来源于丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株、恶臭假单胞菌KT2440和根瘤农杆菌C58菌株之糖醛酸脱氢酶的序列比对。对于比对而言，一致的、保守的和相似的氨基酸序列分别以黑色、深灰色和浅灰色框来表示。一级序列基序以GxxGxxG和YxxxK表示。图12b描述了来源于不同原核和真核物种之糖醛酸脱氢酶同源物的系统进化分析。系统进化分析利用丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株之PSPTO_1053的同源物进行。糖醛酸脱氢酶以粗体表示。

[0034] 发明详述

[0035] 本发明的一些方面涉及通过细胞内重组基因表达来产生葡糖醛酸和葡糖二酸的方法及组合物。本文中描述了编码糖醛酸脱氢酶之基因的克隆，所述酶可以使葡糖醛酸转化成葡糖二酸。还描述了所设计并实施的新途径，其通过联合重组表达糖醛酸脱氢酶、肌醇-1-磷酸合酶和肌醇加氧酶，从而由葡萄糖产生葡糖醛酸和葡糖二酸。该新途径代表了一种产生葡糖二酸(从产生尼龙和聚酯到癌症治疗中均广泛应用的分子)的出乎意料高效的新系统。

[0036] 本文中描述的用于在细胞内产生葡糖醛酸和葡糖二酸的新途径涉及几种酶组分。第一种酶是肌醇-1-磷酸合酶(Ino1/MIPS)，其由酿酒酵母的INO1基因编码，通过中间产物葡萄糖-6-磷酸由葡萄糖产生肌醇(Dean-Johnson和Henry，1989)。例如酿酒酵母序列具有GenBank登录号NC_001142(GeneID：853288)。在酵母中，肌醇是膜磷脂组分，其衍生物对于细胞信号转导十分重要。MIPS的底物葡萄糖-6-磷酸，在大肠杆菌中由于PTS系统进行葡萄糖运输而存在(Postma，Lengeler等，1993)。第二种酶是肌醇加氧酶(MIOX)，其使肌醇转化成葡糖醛酸。该酶主要存在于哺乳动物中，代表肌醇代谢的第一步(Charalampous和Lyras，1957)。例如小鼠序列具有GenBank登录号NC_000081(GeneID：56727)。这两种酶在细胞(例如大肠杆菌细胞)内的共表达使得可以由葡萄糖产生葡糖醛酸。

[0037] 在产生葡糖二酸的新途径中，第三步是使葡糖醛酸转化成葡糖二酸，该步骤可以由糖醛酸脱氢酶完成(Bateman Kosuge等，1970；Wagner和Hollman，1976)。如实施例2中所述，对编码糖醛酸脱氢酶的基因进行克隆和表征，以构建该途径。如实施例2中所示，从丁香假单胞菌番茄致病变种DC300菌株、恶臭假单胞菌KT2440和根瘤农杆菌C58菌株中克隆了糖醛酸脱氢酶。丁香假单胞菌的udh基因序列储存于GenBank中，其登录号为
EU377538。丁香假单胞菌番茄致病变种DC300A udh的DNA和蛋白序列分别如SEQ ID NO：
1和2所示。根瘤农杆菌和恶臭假单胞菌之相应基因的登录号分别为BK006462(DNA：SEQ ID NO：23；蛋白：SEQ ID NO：24)和BK006380(DNA：SEQ ID NO：25；蛋白：SEQ ID NO：26)。
糖醛酸脱氢酶的克隆使得可以利用本领域已知的同源性检索标准方法(例如通过BLAST检索)对多个物种中的糖醛酸脱氢酶蛋白进行鉴定。

[0038] 如本文中所述，在细胞内共表达肌醇-1-磷酸合酶和肌酶加氧酶使得可以由葡萄糖产生葡糖醛酸。当表达这些酶的细胞进一步表达糖醛酸脱氢酶时，其导致以出乎意料之高效水平通过以下三步之途径由葡萄糖产生葡糖二酸：1)由葡萄糖产生肌醇；2)将肌醇转化成葡糖醛酸；和3)使葡糖醛酸转化成葡糖二酸。本发明还包括一个两步途径，其省略了上述第一步，由步骤2和3组成。在该特定的实施方案中，可以使用能够产生葡萄糖的细胞因而无需向细胞培养基中添加葡萄糖。在一些实施方案中，向该细胞中提供葡萄糖聚合物，例如玉米淀粉。

[0039] 本发明的一些方面涉及重组表达肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶中至少一种的细胞。本发明包括任何细胞类型，包括原核和真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在另一些实施方案中，所述细胞是真菌细胞或酵母细胞，例如酿酒酵母细胞。在另一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如小鼠细胞。应当理解，一些细胞可内源表达与本发明相关的至少一种酶。在一些实施方案中，所述细胞不内源表达任何一种酶，而是重组表达一种、两种或三种酶。在另一些实施方案中，所述细胞内源表达一种酶并且重组表达另外一种或两种酶。在另一些实施方案中，所述细胞内源表达两种酶并且重组表达另外一种或两种酶。在一些实施方案中，所述细胞内源表达一种或多种酶并且还重组表达相同的一种或多种酶。

[0040] 在一些实施方案中，编码肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶的基因表达于重组表达载体中。本文中所用的“载体”可以是通过限制性酶切和连接使一种或多种期望序列能够插入其中的很多核酸中的任何核酸，用于在不同的遗传环境之间转运或者在宿主细胞中表达。载体通常由DNA组成，尽管也可使用RNA载体。载体包括但不限于质粒、fosmid、噬菌粒、病毒基因组以及人工染色体。

[0041] 克隆载体是能够自主复制或者被整合到宿主细胞基因组中的载体，其进一步通过一个或多个限制性内切酶位点来表征。在所述位点，可以将载体以确定的方式切开，并将靶序列插入其中，以使新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。对于质粒来说，随着宿主细菌内质粒拷贝数的增加，靶序列可发生多次复制，或者靶序列在宿主通过有丝分裂进行复制前在每个宿主中仅复制一次。对于噬菌体来说，复制可以在裂解期主动发生或者在溶源期被动发生。

[0042] 表达载体是可以通过限制性酶切和连接而将靶DNA序列插入其中的载体，其可与调控序列可操作性地连接并可表达为RNA转录物。载体还可以包含适于对已经或未经载体转化或转染的细胞进行鉴定的一个或多个标记序列。标记包括例如编码提高或降低对抗生素或其他化合物敏感性之蛋白的基因、编码其活性可以通过本领域已知的标准测定方法来检测之酶(例如β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因，以及视觉影响被转化或被转染细胞、宿主、菌落或者噬菌斑之表型(例如绿色荧光蛋白)的基因。优选的载体是能够自主复制并表达其所可操作连接的DNA片段中存在的结构基因产物的那些载体。

[0043] 当编码序列和调控序列通过共价连接而使得编码序列的表达或转录受调控序列的影响或控制时，其在本文中称为“可操作性地”连接。如果需要将编码序列翻译成功能性蛋白，则当5’调控序列中启动子的诱导编码序列转录并且当两个DNA序列间的连接并不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应RNA转录子翻译成蛋白质的能力时，那么这两个DNA序列称为可操作性地连接。因此，如果启动子区域能够实现DNA序列的转录并使得所产生的转录物可被翻译成靶蛋白或多肽，则启动子区域即与编码序列可操作性地连接。

[0044] 当编码本发明所要求保护的任何酶的核酸分子在细胞内表达时，可使用多种转录控制序列(例如启动子/增强子序列)来指导其表达。所述启动子可以是天然启动子，即内源表达基因的启动子，其可正常调节基因的表达。在一些实施方案中，所述启动子可以是组成型的，即启动子不受调控而允许其相关基因持续转录。也可以使用多种条件型启动子，例如受到分子之存在或缺失调控的启动子。

[0045] 基因表达所需调控序列的精确性质可因物种或细胞类型而不同，但一般来说将包括(如需要)分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。特别地，所述5’非转录调控序列包括启动子区域，其包含对所述可操作性连接基因进行转录控制的启动子序列。根据需要，调控序列还可包含增强子序列或上游活化序列。本发明的载体可任选地包含5’前导序列或信号序列。适宜载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断范围内。

[0046] 包含所有表达必需元件的表达载体是市售且本领域技术人员已知的。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通过将异源DNA(RNA)导入细胞中来对所述细胞进行遗传改造。该异源DNA(RNA)处于转录元件的可操作控制下，以允许其在宿主细胞中表达。实施例部分描述了利用大肠杆菌产生葡糖二酸之新途径的异源表达。葡糖二酸产生的新途径也可以表达于其他细菌细胞、古细菌细胞、真菌、哺乳动物细胞、植物细胞等中。

[0047] 在一些实施方案中，可将本发明的两种或更多种核酸克隆到同一表达载体或质粒中。如实施例部分所述，在一些实施方案中，将INO1基因和MIOX基因克隆到同一质粒(例如pRSFD质粒)中。

[0048] 可以利用本领域的标准方法和技术，将编码用于产生葡糖二酸之任何酶的一种或多种核酸分子引入细胞中。例如，可以通过标准方案例如转化(包括化学转化和电穿孔)、转导、粒子轰击等将核酸分子引入。还可以通过将核酸分子整合到基因组中而实现编码用于产生葡糖二酸之酶的基因表达。可以利用本领域众所周知的标准技术将核酸分子整合到细胞基因组DNA中。

[0049] 在一些实施方案中，与本发明相关的酶重组表达于细菌细胞中。可将本发明的细菌细胞在任何类型(丰富型或基础型)和组成的培养基中培养。实施例1提供了一种实施方案，其中发现添加了葡萄糖并经IPTG诱导的丰富培养基(LB培养基，BD Biosciences；San Jose，CA)是最佳的。本领域普通技术人员应当理解，通过常规优化允许使用其他类型的培养基(包括基础培养基，如M9基础培养基)。所选择的培养基可以添加多种附加组分。
类似地，还可以通过常规实验对培养基的其他方面和生长条件进行优化。例如，可优化之因素的非限定性实例有pH值和温度。根据本发明的一些方面，用于培养细胞的液体培养基可以放置于本领域已知并使用的任何培养容器中。

[0050] 本发明的一些方面包括对细胞内葡糖二酸的生产进行优化的策略。葡糖二酸的经优化生产是指采取优化策略与未采取所述策略相比产生更多量的葡糖二酸。一种策略是通过选择合适的启动子和核糖体结合位点来优化肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶和/或糖醛酸脱氢酸的表达水平。在一些实施方案中，其可以包括选择和使用高拷贝数的质粒、或者低拷贝数或中等拷贝数的质粒。还可以通过引入或消除某些结构(例如茎环结构)来靶向转录终止步骤，以调节基因表达。

[0051] 在一些实施方案中，利用之前为产生葡糖二酸已经过优化的细胞可以是有利的。例如，在产生葡糖二酸之前使细胞内葡糖二酸代谢途径中的一种或多种组分突变可以是最佳的，以使细胞不消耗所产生的产物。在一些实施方案中，可以通过随机突变筛选或者通过筛选已知的突变，对引起葡糖二酸产生增加的突变进行筛选。在一些实施方案中，可以通过对具有使葡糖二酸产生增加之片段的细胞或有机体进行筛选，对其基因组片段进行鸟枪法克隆，来鉴定引起葡糖二酸产生增加的基因组区域。在某些情况下，可在同一细胞或有机体中将一个或多个突变进行组合。

[0052] 在一些实施方案中，蛋白质表达的优化可能还需要在引入细胞前对编码与本发明相关之酶的基因进行修饰，例如通过密码子优化用于在细菌细胞中表达。可以在Codon Usage Database因特网站点获得多种有机体的密码子使用偏好。例如，本发明包括为在大肠杆菌中表达而经密码子优化后合成的小鼠MIOX基因。

[0053] 在一些实施方案中，可以利用蛋白质工程对与本发明相关之一种或多种酶的表达或活性进行优化。在某些实施方案中，蛋白质工程方法可以包括测定酶的三维(3D)结构，或者基于其相关蛋白的结构而构建出3D同源物模型。基于3D模型，可以构建酶中的突变并将其导入细胞或有机体中，随后可筛选葡糖二酸产生增加的细胞或有机体。在一些实施方案中，可以通过操作与本发明相关酶在相同途径中作用的酶来增加细胞内葡糖二酸的产生。例如，在一些实施方案中，增加作用于与本发明相关之酶上游的酶或其他因子的表达可以是有利的。这可以通过使用任何标准方法使上游因子过量表达而实现。

[0054] 因此，本发明的一个方面涉及糖醛酸脱氢酶多肽、编码这些多肽的基因、其功能性修饰和变体以及其相关用途。可以通过常规技术鉴定本发明之糖醛酸脱氢酶核酸的同源基因和等位基因。本发明还包括在严格条件下与本文中所述的糖醛酸脱氢酶核酸杂交的核酸。本文中所用的术语“严格条件”是指本领域所熟知的参数。核酸杂交参数可以从记载所述方法的参考文献中找到，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989或Current Protocols in Molecualr Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York。更具体地，本文中所用的严格条件是指例如在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中于65℃杂交。SSC是0.15M 氯化钠/0.015M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，在室温下用2×SSC随后在高达68℃下用0.1-0.5×SSC/0.1×SDS清洗转移有DNA的膜。

[0055] 还可以使用在严格程度方面类似的其他条件或试剂等。本领域技术人员熟悉这些条件，因此这里未将其列出。但是应当理解，本领域技术人员能够控制这些条件，以使得可以清楚鉴定本发明之糖醛酸脱氢酶核酸的同源基因和等位基因(例如，利用严格程度较低的条件)。本领域技术人员还熟悉筛选表达所述分子之细胞和文库以及随后将其常规分离，然后分离相关核酸分子并测序的方法。

[0056] 一般来说，同源基因和等位基因通常与糖醛酸脱氢酶的核酸和多肽序列分别具有至少75％的核苷酸一致性和/或至少90％的氨基酸一致性，在某些情形下，其具有至少90％的核苷酸一致性和/或至少95％的氨基酸一致性，在另一些情形下，其具有至少95％的核苷酸一致性和/或至少99％的氨基酸一致性。可以利用NCBI(Bethesda，Maryland)研发的多种公众可获得的软件工具计算同源性，所述工具可以在NCBI因特网站点上获得。示例性的工具包括BLAST软件，其也可在NCBI因特网站点(www.ncbi.hlm.nih.gov)上获得。
可以利用MacVector序列分析软件(Oxford Molecular Group)进行Pairewise和ClustalW比对(BLOSUM30 matrix setting)以及Kyte-Doolittle亲水性分析。本发明还包括上述核酸的Watson-Crick互补序列。

[0057] 在筛选糖醛酸脱氢酶基因时，可以应用本领域普通技术人员已知的技术，例如Southern印迹法、Northern印迹法以及扩增方案，例如利用与所述序列杂交的引物进行的聚合酶链式反应。

[0058] 本发明还包括简并核酸，其包含天然物质中所存在密码子的替代密码子。例如，丝氨酸残基由密码子TCA、AGT、TCC、TCG、TCT和AGC编码，这六个密码子中的每个在编码丝氨酸残基的目的上是等效的。因此本领域普通技术人员应当清楚，任何编码丝氨酸的三联核苷酸均可用于在体内或者体外指导蛋白质合成体系，以将丝氨酸残基加入至正在延伸的糖醛酸脱氢酶多肽中。类似地，编码其他氨基酸残基的三联核苷酸序列包括但不限于：CCA、CCC、CCG和CCT(脯氨酸密码子)；CGA、CGC、CGG、CGT、AGA和AGG(精氨酸密码子)；ACA、ACC、ACG和ACT(苏氨酸密码子)；AAC和AAT(天门冬酰胺密码子)；以及ATA、ATC和ATT(异亮氨酸密码子)。类似地，其他氨基酸残基也可以由多种核苷酸序列编码。因此，本发明包括由于遗传密码的简并性而使其密码子序列不同于生物学分离之核酸的简并核酸。本发明还包括对密码子进行优化以使其与宿主细胞最佳的密码子使用相适合。

[0059] 本发明还提供了经修饰的核酸分子，其包括一种或多种核苷酸的添加、替代和缺失。在一些优选的实施方案中，这些经修饰的核酸分子和/或其所编码的多肽保留了未经修饰之核酸分子和/或多肽的至少一种活性或功能，例如糖醛酸脱氢酶的酶活性。在某些实施方案中，所述经修饰的核酸分子编码经修饰的多肽，优选编码本文中另外描述的具有保守氨基酸替代的多肽。所述经修饰的核酸分子与未经修饰的核酸分子在结构上相关联，在一些优选的实施方案中，所述经修饰的核酸分子与未经修饰的核酸分子在结构上高度关联，使得经修饰的和未经修饰的核酸分子能够在本领域技术人员已知的严格条件下杂交。

[0060] 例如，可制备编码具有单个氨基酸变化之多肽的经修饰的核酸分子。除对应于本文中所述遗传密码简并性的核苷酸变化之外，每个这些核酸分子都可以具有1个、2个或3个核苷酸替代。同样地，可以制备编码具有2个氨基酸变化之多肽的经修饰的核酸分子，其具有例如2-6个核苷酸变化。本领域技术人员可以容易地预期大量类似这样的经修饰的核酸分子，包括例如编码氨基酸2和3、2和4、2和5、2和6等密码子中核苷酸的替代。在上述实施例中，每2个氨基酸的组合包含在一组经修饰的核酸分子中，编码氨基酸替代的所有核苷酸替代亦是如此。还可以制备编码具有附加替代(例如3个或更多)、添加或缺失(例如通过引入终止密码子或者剪切位点)之多肽的附加核酸分子，而且本领域普通技术人员可以容易地预期其也包括于本发明中。可以通过常规实验对上述任一核酸分子或多肽与本文中所公开之核酸和/或多肽的结构关系或活性之保留进行检测。

[0061] 本发明还提供了由上述糖醛酸脱氢酶核酸所编码的分离的多肽。所述多肽(例如单独或者作为融合蛋白)可用于在体内或者体外将葡糖醛酸转化成葡糖二酸。糖醛酸脱氢酶多肽可以自生物样品(包括组织或者细胞匀浆)分离，并且可以通过构建适于表达系统的表达载体、将所述表达载体引入表达系统以及分离重组表达的蛋白来重组表达于多种原核或真核表达系统中。还可以利用肽合成的公认方法化学合成多肽。

[0062] 本发明包括上述糖醛酸脱氢酶的变体。本文中所用糖醛酸脱氢酶的“变体”是包含糖醛酸脱氢酶多肽之一级氨基酸序列的一个或多个修饰的多肽。可以对糖醛酸脱氢酶多肽进行产生糖醛酸脱氢酶变体的修饰，以便1)降低或消除糖醛酸脱氢酶多肽的活性；2)增强糖醛酸脱氢酶多肽的特性，例如将葡糖醛酸转化成葡糖二酸的能力或表达系统中蛋白质的稳定性或蛋白质-蛋白质结合的稳定性；3)为糖醛酸脱氢酶多肽提供新的活性或特性，例如添加抗原表位或者添加可检测的部分；或者4)使糖醛酸脱氢酶分子与另一分子(例如酶促底物)同等地或更好地结合。通常，对糖醛酸脱氢酶多肽的修饰通过针对修饰编码糖醛酸脱氢酶多肽的核酸进行，其可以包括缺失、点突变、截短、氨基酸替代以及氨基酸或非氨基酸部分的添加。或者，可以直接对多肽进行修饰，例如通过剪切、添加连接物分子、添加可检测部分(例如生物素)、添加脂肪酸等。修饰还包括包含所有或部分糖醛酸脱氢酶氨基酸序列的融合蛋白。本领域技术人员熟悉用于预计蛋白质序列变化对蛋白质构象之影响的方法，因此可根据已知方法“设计”糖醛酸脱氢酶多肽变体。所述方法的一个实例由Dahiyat和Mayo描述于Science 278：82-87，1997，通过该方法可以重新设计蛋白质。该方法可以应用于已知蛋白质，用于改变多肽序列的仅一部分。通过应用Dahiyat和Mayo的计算方法，可以提出糖醛酸脱氢酶多肽的特定变体并对其进行测试，以确定该变体是否保留所期望的构象。

[0063] 一般来说，变体包括经特异性修饰的糖醛酸脱氢酶多肽，以改变与所述多肽的期望生理活性无关的性质。例如，半胱氨酸残基可被替代或缺失，以防止不期望的二硫键。类似地，可以使某些氨基酸改变，从而通过消除表达系统中蛋白酶(例如存在KEX2蛋白酶活性之酵母表达系统中的双碱性氨基酸残基)的蛋白水解作用来增强糖醛酸脱氢酶多肽的表达。

[0064] 编码糖醛酸脱氢酶多肽之核酸的突变优选保留编码序列的氨基酸读码框，并且优选在核酸中不产生可能杂交形成二级结构(例如发卡或环，其可对变体多肽的表达有不利影响)的区域。

[0065] 可以通过选择氨基酸替代或者使编码多肽之核酸的选定位点随机突变来进行突变。随后表达多肽变体并检测其一种或多种活性，以确定哪个突变使多肽变体具有所期望的特性。可以对变体(或非变体糖醛酸脱氢酶多肽)进行进一步突变，所述突变对多肽的氨基酸序列是沉默的，但是提供用于在特定宿主中进行翻译的优选密码子。本领域普通技术人员熟知使核酸在例如大肠杆菌中翻译的优选密码子。还可以对糖醛酸脱氢酶基因或cDNA克隆进行其他突变，用于增强多肽的表达。如本文中所述，可以通过如下步骤对糖醛酸脱氢酶多肽变体的活性进行检测：将编码糖醛酸脱氢酶多肽变体的基因克隆到细菌或哺乳动物表达载体中，将所述载体导入合适的宿主细胞中，表达所述变体糖醛酸脱氢酶多肽，以及检测所述糖醛酸脱氢酶多肽的功能。

[0066] 本领域技术人员还应当认识到，可以对糖醛酸脱氢酶多肽进行保守性氨基酸替代，以提供上述多肽的功能等效变体，例如所述变体保留糖醛酸脱氢酶多肽的功能。本文中所用的“保守性氨基酸替代”指不会使发生氨基酸替代之蛋白的相对电荷或大小特性发生改变的氨基酸替代。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法制备变体，例如可以从记载所述方法的参考文献中找到，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989 或 Current Protocols in Molecualr Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley&Sons，Inc.，New York。糖醛酸脱氢酶多肽的示例性功能等效变体包括本文中所公开蛋白质之氨基酸序列中的保守氨基酸替代。氨基酸的保守替代包括发生在下列组内氨基酸之间的替代：(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。

[0067] 一般来说，制备变体多肽时优选并非所有的氨基酸都发生变化。如果已知特定的氨基酸具有某功能，则不将此氨基酸替代，或者，进行保守性氨基酸替代。制备变体多肽时，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个残基可发生变化。通常优选发生最少数量的替代。因此，产生变体多肽的一种方法是将所有其余的氨基酸替代为特定的单个氨基酸，随后测定该变体的活性，然后对具有最佳活性的所述多肽中的一种或多种重复上述步骤。

[0068] 通常，通过改变编码糖醛酸脱氢酶多肽的核酸来使糖醛酸脱氢酶多肽的氨基酸序列发生保守性氨基酸替代，以产生糖醛酸脱氢酶多肽的功能等效变体。可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法来进行所述替代。例如，可以依照Kunkel的方法(Kuntel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82：488-492，1985)通过PCR介导性突变、定点突变或通过化学合成编码糖醛酸脱氢酶多肽的基因来进行氨基酸替代。

[0069] 本文中所述的发明具有多种用途，其中一些在本文中另有描述。首先，本发明使得可以分离糖醛酸脱氢酶蛋白分子。可以利用本领域技术人员众所周知的多种方法获得分离的糖醛酸脱氢酶分子。可以通过色谱法或免疫识别法从天然产生多肽的细胞中纯化该多肽。或者，可以将表达载体引入细胞以产生多肽。在另一种方法中，可以将mRNA转录子微注射或通过其他方法引入细胞中，以产生所编码多肽。还可以使用mRNA在无细胞的提取物(例如网状细胞裂解物系统)中翻译以产生多肽。本领域技术人员还可以容易地依照已知方法分离糖醛酸脱氢酶多肽。所述方法包括但不限于免疫层析、HPLC、体积排阻色谱、离子交换色谱和免疫吸附色谱。

[0070] 可以利用本领域普通技术人员已知的常规方法测定本发明之分子的表达。这些方法包括但不限于：直接的RNA扩增、RNA反转录为cDNA、实时RT-PCR、cDNA扩增、杂交，以及基于免疫学的测定方法，其包括但不限于免疫组化、抗体夹心捕获法、ELISA和酶联免疫斑点测定(EliSpot测定)。例如，可以通过任何标准核酸检测方法测定本发明之核酸分子在个体或组织中的存在水平，所述方法包括聚合酶链式反应或者利用标记杂交探针进行测定。所述杂交方法包括但不限于微阵列技术。

[0071] 本发明还提供了糖醛酸脱氢酶(Udh)的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与和SEQ ID NO：2具有至少95％氨基酸一致性的多肽相结合。在一些实施方案中，所述抗体与由与SEQ ID NO：1具有至少95％核苷酸一致性的核酸分子所编码的多肽相结合。在一些实施方案中，所述抗体与和SEQ ID NO：24具有至少95％氨基酸一致性的多肽相结合。在一些实施方案中，所述抗体与由与SEQ ID NO：23具有至少95％核苷酸一致性的核酸分子所编码的多肽相结合。在一些实施方案中，所述抗体与和SEQ

[0072] ID NO：26具有至少95％氨基酸一致性的多肽相结合。在一些实施方案中，所述抗体与由与SEQ ID NO：25具有至少95％核苷酸一致性的核酸分子所编码的多肽相结合。

[0073] 本发明的抗体可以通过多种方法来制备，包括将蛋白质、蛋白质片段、表达蛋白质或其片段等的细胞施用给动物体以产生多克隆抗体。本发明还提供了产生Udh单克隆抗体的方法。单克隆抗体的产生依照本领域中众所周知的技术进行。本领域中众所周知，仅抗体分子的一小部分(即互补位(paratope))参与了抗体与其抗原表位的结合(一般参见Clark，W.R.，1986，The Experimental Foundations of Modern Immunology，Wiley & Sons，Inc.，New York，；Roitt，I.，1991，Essential Immunology，7th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。例如pFc’和Fc区域是补体级联反应中的效应器，但并不参与抗原结合。已通过酶切去掉pFc’区域的抗体或者无pFc’区域的抗体被称为F(ab’)2片段，其保留了完整抗体的全部2个抗原结合位点。类似地，已通过酶切去掉Fc区域的抗体或者无Fc区域的抗体被称为Fab片段，其保留了完整抗体的抗原结合位点之一。
Fab片段由共价结合的抗体轻链和被称为Fd的抗体重链之一部分组成。所述Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单一的Fd片段可以与10个不同的轻链相关联而不改变其抗体特异性)而且Fd片段在分离时保留抗原表位结合能力。

[0074] 本领域众所周知，抗体的抗原结合部分中存在直接与抗原表位相结合的补体决定区(CDRs)和保留了互补位三级结构的骨架区(FR)(一般参见Clark，1986；Roitt，1991)。IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中均存在4个骨架区(FR1至FR4)，其分别被3个补
体决定区(CDR1至CDR3)所分隔开。CDR，特别是CDR3区，更特别地是重链CDR3，主要负责抗体特异性。

[0075] 本领域众所周知，哺乳动物抗体的非CDR区可被非特异性或异种特异性抗体的相似区域取代，同时保留原始抗体的抗原表位特异性。这最明显地表现在“人源化”抗体的开发与利用中，所述抗体中非人CDR共价结合于人FR和/或Fc/pFc’区域，以产生功能性抗体。例如参见美国专利4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,762和5,859,205。还可以通过对经人免疫球蛋白重链和轻链位点转基因的小鼠进行免疫来制备完全人单克隆抗体。在将这些小鼠(例如XenoMouse(Abgenix)、HuMab小鼠(Medarex/GenPharm))免疫后，可以根据标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体具有人免疫球蛋白的氨基酸序列，并因此在施用给人时不会激发人抗鼠的抗体(HAMA)应答。因此，本领域普通技术人员清楚，本发明还提供了F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗体，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域被同源的人或非人序列所取代；嵌合F(ab’)2片段抗体，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域被同源的人或非人
序列所取代；嵌合Fab片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域被
同源的人或非人序列所取代；以及嵌合Fd片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2区域
被同源的人或非人序列所取代。本发明还包括所谓的单链抗体、结构域抗体和重链抗体。

[0076] 应当理解，编码糖醛酸脱氢酶、肌醇-1-磷酸合酶和肌醇加氧酶的基因可以从多种来源获得。在本文所述实施例部分所描述的实施方案中，肌醇-1-磷酸合酶由酿酒酵母基因(INO1)编码，肌醇加氧酶由小鼠基因(MIOX)编码，糖醛酸脱氢酶由丁香假单胞菌、恶臭假单胞菌或根瘤农杆菌基因(udh)编码。本领域技术人员应当了解，可以通过同源检索鉴定出这些酶在许多物种中的同源基因，例如通过NCBI因特网站点(www.ncbi.nlm.nih.gov)的蛋白质BLAST检索。本领域普通技术人员应当理解，编码这些酶的基因可以从含有所述给定酶之任何来源的DNA中PCR扩增得到，例如利用退火引物。在某些实施方案中，所述编码给定酶的基因可以是合成的。获得编码本文中所述酶之基因的任何方法均适于构建本发明的途径。实施例

[0077] 实施例1：葡糖二酸的产生：重组大肠杆菌中的生物合成途径

[0078] 已经在大肠杆菌中构建了由葡萄糖产生葡糖醛酸和葡糖二酸的合成途径(图1)。编码酿酒酵母肌醇-1-磷酸合酶(Ino1)和小鼠肌醇加氧酶(MIOX)之基因的共表达使得通过中间体肌醇而产生葡糖醛酸。在培养液中测定高达0.3g/L的葡糖醛酸浓度。MIOX的活性是限速步骤，其导致肌醇和葡糖醛酸均作为终产物积累，其浓度大致相同。第三种酶即丁香假单胞菌糖醛酸脱氢酶(Udh)的加入促使葡糖醛酸转化成葡糖二酸。该重组酶的活性比Ino1和MIOX的高出超过2个数量级并且增加了通过所述途径的整体流量，使得观察到葡糖二酸的浓度超过了1g/L。这代表了一种用于由生物质生物产生葡糖二酸(一种“高附加值化学品”)的新型微生物系统。

[0079] 材料与方法

[0080] 菌株、培养基和质粒

[0081] 大肠杆菌菌株DH10B[F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 RrecA1 endA1 araΔ139 Δ(ara，leu)7697 galU galKλ-rpsL(Str)nupG] 用于所
TM - - -
有的分子生物学操作。将DH10B和BL21 Star (DE3)[FompT hsdSB(rBmB)gal dcm
rne131(DE3)]用作宿主用于产生有机酸。这两种菌株的感受态细胞购自Invitrogen
Corporation(Carlsbad，CA)。培养物在LB或M9培养基中繁殖。LB(Miller)培养基依照生产商(BD Biosciences，San Jose，CA)的说明由脱水粉末制备。M9如前所述(32)制备，其由
1×M9盐(12.8g/L Na2HPO4·7H2O，3g/L KH2PO4，0.5/L NaCl，1g/L NH4Cl)、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2和10g/L(1％)葡萄糖组成。向DH10B中加入终浓度为105μg/mL的亮氨酸。当需
要为质粒保持提供选择压力时，加入终浓度为20μg/mL的卡那霉素和终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。

[0082] 所有的分子生物学操作均依照标准做法(32)进行。编码肌醇-1-磷酸合酶(Ino1，也称为MIPS)的INO1基因利用下述引物从酿酒酵母的基因组DNA制备物中经PCR 扩增得到：正向-5’-GAATTCATGACAGAAGATAATATTGCTC-3’(SEQ ID NO：3)；反向-5’-AAGCTTCTACAACAATCTCTCTTCG-3’(SEQ ID NO：4)。引物5’端的EcoRI和HindIII限制性位点以下划线标出。编码肌醇加氧酶的小鼠MIOX基因是合成的，其在GeneBank登录号为AF197127的基础上由DNA 2.0(Menlo Park，CA)进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达。858个核苷酸(286个密码子)序列的优化由厂商进行，其结果归纳如下：19.2％的核苷酸发生了变化，对286个密码子中的153个(53.5％)有影响。在经优化的密码子中，144个(94.1％)仅在第
3个核苷酸的位置发生了变化。在密码子中有3个密码子的所有3个核苷酸均发生了变化。
经合成的基因以质粒pJ2-MIOX接收。基因的5’端和3’端分别含有EcoRI和HindIII限制性位点。图4显示了小鼠MIOX基因与其经密码子优化以在大肠杆菌中表达的合成物之间的序列比对。两个基因均亚克隆到IPTG诱导的质粒pMMB206(25)和pTrc99A(2)中，以证实其所表达之酶的活性。所得到的质粒命名为pMMB-INNO1、pTrc-INO1、pMMB-MIOX和pTrc-MIOX。
为了共表达这两个基因，使用包含两个T7启动子的pRSFDuet-1载体(来自Novagen)
(Gibbstown，NJ)。INOS1基因通过EcoRI和HindIII位点亚克隆到第一位置，产生质粒
pRSFD-IN。为了将MIOX基因引入到第二位置，在用EcoRI消化前利用Klenow酶将pJ2-MIOX的HindIII位点进行末端补平。在与MIOX基因片段连接前，首先将pRSFD-IN用XhoI消化并末端补平，随后用与EcoRI相容的MfeI消化。所得到的质粒命名为pRSFD-IN-MI。实施例2中描述了编码丁香假单胞菌糖醛酸脱氢酶之udh基因(GenBank登录号EU377538)的
分离。将丁香假单胞菌udh基因亚克隆到pTrc99A中，以产生所述的pT1053(40)(下文中称为pTrc-udh)。

[0083] MIPS(INO1)、MIOS和UDH活性的酶活测定

[0084] INO1、MIOX和udh基因的功能性表达通过体外酶活测定进行证实。首先用100-200μL含有1mg/mL溶菌酶的10mM Tris-Cl(pH 8.0)将1-2mL培养物的细胞沉淀重
悬，以制备粗裂解物。通过交替利用液氮冷冻和30-40℃水浴融化的5个循环将细胞溶液裂解。所得到的溶液以14,000rpm于4℃离心15分钟，以去除不溶物。裂解物的全蛋白浓度用Bradford法(11)测定。

[0085] 如前所述(1，6)测定了肌醇-1-磷酸合酶的活性。简而言之，将葡萄糖-6-磷酸+底物在由50mM Tris-乙酸(pH 7.5)、0.8mM NAD、14mM NH4Cl、5mM疏基乙醇和5mM葡萄糖-6-磷酸组成的反应缓冲液中转化成肌醇-1-磷酸。加入裂解物后开始反应，并于37℃孵育1小时。加入0.4倍体积的20％三氯乙酸使反应终止。为了对产物进行定量，通过
用等体积的0.2M NaIO4进行氧化来除去肌醇-1-磷酸中的无机磷酸盐。加入等体积的1M Na2SO3以去除多余的高碘酸盐。设立没有葡萄糖-6-磷酸和未加入高碘酸盐的对照反应。

[0086] 如前所述(4，30，31)测定了肌醇加氧酶的活性。反应缓冲液由50mM Tris-Cl(pH8.0)、2mM L-半胱氨酸、1mM Fe(NH4)2(SO4)2和60mM肌醇组成。将样品在无底物的情况下于30℃预孵育10分钟，以活化MIOX酶。反应于30℃预孵育1小时，随后加入1/10体积的
30％三氯乙酸使反应终止。所产生的葡糖二酸用苔黑酚试剂进行定量(13)。该试剂由在
10mL浓HCl(含有5.4mg FeCl3)中的40mg苔黑酚组成。将1体积的样品与2体积的苔黑
酚试剂混合并在沸水浴中孵育30分钟。冷却至室温后，测量670nm下的吸光度以测定葡糖二酸的浓度。设立无肌醇的对照反应以表示背景。

[0087] 如前所述(35，40)，通过在340nm下监测NADH辅助因子的产生，对糖醛酸脱氢酶的活性进行测定。反应混合物含有100mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)、2.5mM葡糖醛酸、0.9mM +NAD 和如上所述制备的细菌裂解液。

[0088] 产酸的生长条件

[0089] 如“结果”部分所述，培养物在添加了10g/L葡萄糖并经IPTG诱导的LB培养基中生长。在LB培养基中制备接种物，并将1％或2％(v/v)接种于含有50或100mL培养基的250-mL带挡板的烧瓶中。将培养物在30℃下以250rpm孵育，定期取样，以测定培养基中的细胞密度和产物浓度。

[0090] 有机酸的检测和定量

[0091] 代谢物(包括葡糖醛酸和葡糖二酸)通过高效液相色谱法(HPLC)进行定量。对于葡糖二酸的测定而言，如前所述(28，40)将样品预处理，以使葡糖二酸与其他代谢物(包括葡糖醛酸)分离。简而言之，将对葡糖二酸中存在的共面相邻顺式羟基基团具有亲和力的硼酸亲和凝胶(Affi-gel boronate gel，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)(28)与样品混合，并用80mM磷酸钾-20mM硼酸缓冲液(pH 7.0)清洗。用0.1M盐酸洗脱葡糖二酸。加入10M NaOH中和洗脱液，随后通过HPLC分析。利用配有Aminex HPX-87H柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)以及折光系数和二极管阵列检测仪的Agilent 1100系列设备在如下条件下进行HPLC分析：流动相，水中的5mM硫酸；流速，0.5mL/分钟；注入体积，50μL；温度，55℃；UV 波长，210nm。

[0092] 结果

[0093] 重组Ino1和MIOX活性的验证

[0094] 之前已报道利用酿酒酵母肌醇-1-磷酸合酶(Ino1)通过大肠杆菌发酵产生高浓度的肌醇(15)。在高细胞密度下补料分批发酵54小时获得了效价高达21g/L的产物。为了确定摇瓶中Ino1的情况，将相应基因扩增，插入相容性载体中，随后亚克隆到高拷贝数和中拷贝数质粒中，用于在普通实验室菌株DH10B中表达。质粒pTrc-INO1含有经修饰的ColE1复制子，使其具有数百个拷贝数，而基于RSF1010复制子的pMMB-INO1具有数十个拷贝数。对这两个质粒在单个菌株中利用相容性载体共表达INO1和MIOX基因的潜力进行了评估。分别含有pTrc-INO1和pMMB-INO1且于30℃孵育的培养物可测出344nmol/hr/mg和128nmol/hr/mg的体外活性，表明酶成功表达(表1)。但是，仅在高拷贝数质粒中的表达使培养基中积累了可检测量的0.37g/L肌醇。活性还受到温度的强烈影响，培养物在37℃生长时检测不到。还检测了M9基础培养基中的肌醇产量。假定在基础培养基中培养且以葡萄糖作为唯一碳源可以使葡萄糖流量增加并进而提高肌醇产量。但是，仅产生了一半数量的肌醇，表明虽然葡萄糖流量实际上可确实更高，但是这种条件下表达的Ino1酶不能有效地与糖酵解作用竞争底物。随后的实验在添加了葡萄糖的LB培养基中进行。

[0095] MIOX是主要来源于真核生物的蛋白质，已对其在人、小鼠、大鼠和猪中的同源物进行了充分表征(3，4，30，31)。肌醇加氧酶(MIOX)已在大肠杆菌中进行了功能性表达并纯化，用于对该酶的特性进行表征；但是，据我们所知，还未将哺乳动物MIOX用于完整的细胞重组系统以产生葡糖醛酸。已发现小鼠肌醇加氧酶具有在大肠杆菌中表达的最有利特性(3)并选择其进行研究。该基因的合成物购自DNA 2.0，其经密码子优化以在大肠杆菌中表达。该基因还被亚克隆到用于评估DH10B中Ino1活性的高拷贝数载体和低拷贝数载体中。由于MIOX来源于哺乳动物，因此最初于37℃评估MIOX的活性。

[0096] 已知MIOX酶需要Fe2+和半胱氨酸进行体外活化(4)。如体外试验所测，向培养基中加入这些化合物并不能促进pTrc-MIOX中该酶的表达，反而使其活性降低(表2)。还测定了培养基中的葡糖醛酸，尽管其浓度较低。所观察到的酶活性下降与细胞密度的显著降2+
低相符合，表明这些化合物对宿主具有毒性。之前曾报道(30，31)，高浓度的Fe 和半胱氨酸会抑制MIOX的活性。虽然其胞外浓度设定于在体外试验中活化该酶的水平上，但是其相应的胞内浓度是未知的。之前还曾报道，培养基中含有肌醇可以促进大肠杆菌中MIOX的可溶性表达(3)。本文中也观察到了这种现象，发现当不添加肌醇时该酶的活性明显降低(表
2)。重组MIOX的一个突出特性是其明显具有不稳定性(3)。指数期(接种后6小时)所
取样品中观察到了高活性，但是在静止期(接种后24小时)显著下降(表2)。如在含有
空pTrc99A质粒的对照样品中所测，试验背景活性一般随时间而增加。注意到该试验的背景高是由苔黑酚试剂的非特异性造成的，已知所述苔黑酚试剂与其他生物化合物反应，虽然反应程度较低。因此，该试验对于酶活性的精确定量并不可靠。但是，在有和没有肌醇的样品之间所观察到的差别以及早期和晚期时间点加入肌醇的样品之间的差别足够大，可以认为其趋势是明显的。

[0097] 在含有较低拷贝数pMMB-MIOX构建体的培养基中未观察到体外酶活性或体内葡糖醛酸的产生，表明需要高表达水平以使MIOX的活性可检测。由于INO1仅在30℃活跃表达，因此还评估了在该温度下高拷贝数质粒中体内MIOX的情况。培养24小时后产生了可比较量的0.4g/L的葡糖醛酸，48小时后效价加倍至0.78g/L。

[0098] 葡糖醛酸的产生

[0099] 由葡萄糖产生葡糖醛酸需要使INO1和MIOX在同一菌株中共表达。对相容性质粒pTrc99A和pMMB206均进行了研究，预计可使用含有pTrc-INO1和MMB-MIOX或者含有
pMMB-INO1和pTrc-MIOX的双重转化菌株用于生产。但是，我们的结果表明，只有利用高拷贝数的质粒表达两个基因时才能达到适当的体外活性(通过培养基中每个目的产物的积累情况而测定)。为了解决此问题，我们将两种酶均引入了高拷贝数pRSFDuet载体中，其包含一对多克隆位点，每个位点均位于T7启动子之后。如前所述测定酶活性并通过SDS-PAGE验证其表达(数据未显示)。在该方法中，测定0.1mM浓度的IPTG是优选的。宿主菌株也由DH10B变为BL21(DE3)，以使得能够利用T7启动子表达。之前我们发现DH10B不能利用葡糖醛酸来生长(数据未显示)。BL21(DE)3可以代谢葡糖醛酸，但是其消耗似乎受到分解代谢物的抑制(数据未显示)。因此，在过量的葡萄糖中培养菌株可阻止目的产物的消耗。

[0100] 含有pRSFD-IN-MI的BL21(DE3)菌株能够由葡萄糖产生葡糖醛酸，尽管其水平仅为约270m g/L(图2)。培养图显示，葡糖醛酸24小时后出现而且未检测到中间产物，其浓度在4天内增加了50％。但是48小时后，培养基中出现了大量的肌醇。肌醇在培养基中持续积累，在实验末期其浓度比目的终产物葡糖醛酸稍高。葡糖醛酸的终浓度为0.27g/L，比在上述DH10B(pTrc-MIOx)系统中使肌醇直接转化时所测浓度(0.78g/L)要低。肌醇的积累表明MIOX的活性是产生高浓度葡糖醛酸的限速因素。体外试验证实，在整个实验过程中Ino1的活性显著高于仅载体的对照，3天后仅有少许背景活性(数据未显示)。相反，1天后MIOX的活性仅比背景稍高且随后与背景难以区分。这与之前所归纳的显示MIOX活性在24小时后急剧下降的结果相一致。此外，该系统中MIOX的活性可能受到由Ino1产生之肌醇浓度的限制。虽然细胞外添加60mM(10.8g/L)肌醇并不意味着其胞内浓度也如此高，但是可以合理预期由Ino1活性而产生的肌醇胞内浓度很可能达不到相同的浓度。

[0101] 葡糖二酸的产生

[0102] 实施例2表明了编码丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000之糖醛酸脱氢酶的基因的克隆和表征(40)。发现udh基因能够在大肠杆菌中充分表达，导致高的酶活性。为了产生葡糖二酸，我们利用了之前所构建的pTrc99A中含有udh基因的载体(其与pRSFD-IN-MI相容)。将两个载体引入BL21(DE3)中以构建带有INO1、MIOX和udh的大肠杆菌菌株。在几种不同诱导条件下测量该菌株的生产力(表3)。出乎意料的是，尽管之前在含有前两个基因的系统中仅观察到0.27g/L的葡糖醛酸，却产生了高达1g/L的葡糖二酸。在与之前用于产生葡糖醛酸的相同条件下(表3，条件A)产生了0.72g/L的葡糖二酸。为了进一步表征该系统，每天培养后测定粗裂解物中的酶活性(图3)。Udh活性是最高的，比Ino1活性高出超过2个数量级，比MIOX活性高出3个数量级。因此，Udh的高活性似乎提高了通过葡糖二酸途径的葡萄糖流量，使得葡糖二酸的效价相对较高。在这些样品中，MIOX活性似乎并不像之前观察到的那样随时间而降低；但是其活性幅度依然相当低。此外，此处第一个数据点是1天后，之前显示此时MIOX活性与指数生长期观察到的活性相比已明显降低(表2)。培养3天后当肌醇积累时未检测到葡糖醛酸，证实了MIOX催化的步骤是限速步骤。

[0103] 测试的3种诱导条件产生了浓度为0.72至1.13g/L的葡糖二酸。一般来说，诱导水平越高(即IPTG浓度越高)，导致由葡萄糖到葡糖二酸的产率就越高，但产物浓度就越低(比较例如表3中的条件A和B)。较高的诱导水平还导致葡萄糖消耗较少和细胞密度较低，表明存在与这3种酶的较高表达量相关的代谢负担。但是，在葡萄糖消耗率较低的情况下，相对于生物质而言，有更多部分的葡萄糖流向生成葡糖二酸的方向。我们还观察到较低的通气量(其由250-mL振荡培养瓶中培养物总体积由50mL增至100mL引起)导致葡糖二酸效价降低一半而生长未受影响(数据未显示)。此效价降低很可能是由于MIOX这一限速步骤酶利用分子氧作为共底物所致(12，38)。最后，检测了M9基础培养基中葡糖二酸的产量；但是，所产生的葡糖二酸量几乎可以忽略。

[0104] 讨论

[0105] 本文中描述了产生葡糖二酸之生物合成途径的构建，其中利用了3种不同来源的酶：酿酒酵母Ino1、小鼠MIOX和丁香假单胞菌Udh。一种内源性磷酸酶也参与了该途径。已经表明大肠杆菌的suhB基因产物在体外具有肌醇单磷酸酶活性，因而成为该内源活性的合适候选物(23)。从热力学角度来说，该途径是具有吸引力的，因为根据基团贡献理论(21，24)评估并将分子氧看作最终氧化剂，所有3个步骤的标准自由能变化(ΔG)都是负值：葡萄糖到肌醇的步骤是-14.3Kcal/mol；肌醇到葡糖醛酸的步骤是-86.8Kcal/mol；葡糖醛酸到葡糖二酸的步骤是-55.9Kcal/mol。但是，如Khosla和Keasling所指出的(18)，代谢工程不仅仅是单纯地招募不同的酶。当发生干扰(例如向宿主机体中引入新途径)时，其还涉及对代谢流量的整体优化。在这种情况下，与质粒保持和质粒所编码基因之表达相关的代谢负担问题也是特别令人感兴趣的(9，10，17)。在我们的系统中，仅利用高拷贝数质粒在体内产生了可检测量的葡糖醛酸。第一个底物葡萄糖-6-磷酸不应是中心代谢的限速步骤，因为使用了添加有过量葡萄糖的LB培养基用于生长。因此，似乎需要高表达水平的重组基因，以与快速而强烈的糖酵解途径竞争并将葡萄糖转化成葡糖醛酸。M9基础培养基中仅产生了少量的肌醇和未检出量的有机酸，此结果表明当葡萄糖是唯一的碳源和能量来源时，几乎所有的底物均进入了内源细胞代谢作用。该竞争作用还可以解释为什么在该过程的前两天，当培养基中的葡萄糖浓度较高时，由葡萄糖到葡糖二酸的产率通常要高于后期浓度较低时的(数据未显示)。高MIOX活性需要肌醇，表明Ino1酶的生产力低可最终限制M9培养基中有机酸的生成。或者，MIOX可在基础培养基中表达量很少。应当指出，之前利用Ino1进行研究使得替代性化学限定培养基中肌醇产量很高，并且也使用了高拷贝数质粒进行基因表达，但是这些实验是在数天大规模补料分批发酵中进行的(15)。在开始葡萄糖补料之前的初始批期间(约10小时)，肌醇浓度小于1g/L。因此，有必要研究在分批补料条件下进行培养对我们的系统生产力的提高程度。

[0106] 质粒拷贝数并不是与影响我们的合成系统性能之表达水平相关的唯一因素。如表3所示，提高诱导物浓度以增加表达量导致产物浓度较低。IPTG浓度在0.05mM以下不能促进葡糖二酸的产生，即使葡萄糖消耗率和生长速率由于代谢负担降低而增强了(数据未显示)。大肠杆菌在37℃比在30℃生长得好，并且限速酶MIOX的活性应该在37℃时更高。但是，发酵于30℃进行，因为Ino1在此较低温度下仅功能性表达。考虑到曾报道Udh具有异常的热力学不稳定性(7，35)，因此低于30℃的温度可能对其活性更有利。但是，我们观察到Udh的活性在30℃下比Ino1或MIOX的活性高得多(图3)，并且选择30℃作为培养温度
以使Ino1的功能性表达最强。

[0107] 考虑该系统生产力的所有限制因素，应当检查该途径中中间产物的潜在抑制作用。已报道猪肾MIOX在体外被D-葡糖二酸抑制但并不被D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸内酯抑制(30，31)。考虑到静止期时MIOX的活性甚至在不存在葡糖二酸的情况下急剧降低(表
2)，因此MIOX活性低很可能是由于其自身不稳定性而非中间产物的抑制作用(3)。还应当指出，我们并没有过量表达suhB基因或同源磷酸酶。然而，培养产物中未检测到肌醇-1-磷酸，而肌醇却的确积聚了。因此，我们推断磷酸酶活性并不限制通过该途径的流量。大肠杆菌还包含D-葡糖醛酸分解代谢途径(16)。的确，已经利用大肠杆菌以D-葡糖醛酸作为唯一碳源用于生长的能力进行了筛选，以鉴定糖醛酸脱氢酶的活性(40)。BL21(DE3)也可以代谢D-葡糖醛酸。但是，两种有机酸的消耗似乎均受到分解代谢的抑制，这阻止了在葡萄糖存在下不期望的产物流失(数据未显示)。因此，D-葡糖二酸效价的理论限制值似乎由酸的毒性和每个步骤的动力学所决定。加入浓度高达10g/L的葡糖二酸钾和葡糖醛酸钠并不会影响大肠杆菌的生长和葡萄糖的消耗(数据未显示)，因此，通过致力于提高限速步骤的动力学来提高效价是有空间的。进一步优化以提高该合成途径的葡萄糖流量需要招募不同来源的更好的酶，对这些酶进行改造并下调所述竞争性途径。

[0108] 表1.大肠杆菌中由高拷贝数质粒(pTrc)和中拷贝数质粒(pMMB)表达之重组INO1的活性。培养物在添加了10g/L葡萄糖和0.1mM(用于pTrc-INO1)或1.0mM(用于
pMMB-INO1)IPTG的LB培养基中于30℃生长。从指数期中期所取产品的粗裂解物中测定其体外活性，而将48小时后培养基中肌醇的浓度作为其体内活性。所示数据表示来自单次试验。N/D＝未检出。

[0109]

[0110] 表2.不同培养条件下大肠杆菌中高拷贝数pTrc-MIOX表达之重组MIOX的活性。培养物在LB培养基中于37℃生长并用1.0mM的IPTG诱导。24小时后对葡糖醛酸进行测
定。添加物：MI＝肌醇(60mM，10.8g/L)，Fe＝Fe(NH4)2(SO4)2(1mM)，Cys＝L-半胱氨酸(2mM)。N/D＝未检出。N/A＝未检测。

[0111]

[0112] 表3.培养3天后BL21(DE3)(pRSFD-IN-MI()pTrc-udh)中葡糖二酸的产生。培养物在添加了10g/L葡萄糖并用0.1mM IPTG诱导的LB培养基中于30℃培养。数据是3次独立试验的平均值和标准偏差。OD600＝600nm下的光密度，Glc＝葡萄糖，MI＝肌醇，Curo＝葡糖醛酸，Car＝葡糖二酸，产率(％)＝100×所产生的葡糖二酸/所消耗的葡萄糖(mol/mol)。条件A＝0.1mM IPTG，于0小时；条件B＝0.05mM IPTG，于0小时；条件C＝0.05mM IPTG，于0小时和0.1mM IPTG，于17.5小时。N/D＝未检出。

[0113]

[0114] 实施例1的参考文献

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[0155] 实施例2：丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株和根瘤农杆菌C58菌株糖醛酸脱氢酶的克隆和表征

[0156] 已经从丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株、恶臭假单胞菌KT2440和根瘤农杆菌C58菌株中克隆得到糖醛酸脱氢酶。利用一种新型互补测定法对这些基因进行了鉴定，其中使用不能以葡糖醛酸作为唯一碳源但能够利用葡糖二酸生长的大肠杆菌突变株。通过在含有葡糖醛酸的基础培养基中培养经转化的细胞，在大肠杆菌突变株中对丁香假单胞菌的鸟枪文库进行了筛选。对存活菌落中的糖醛酸脱氢酶(其能够将葡糖醛酸转化成葡糖二酸)进行了评估。用此方法，鉴定出0.8kb的开放读码框并随后证实其为udh。基于经测序基因组的相似性检索，还鉴定出了丁香假单胞菌和根瘤农杆菌的同源酶。对在大肠杆菌中表达的这3种有机体中每一种的重组蛋白进行了纯化和表征。对于所有这3种酶来说，以葡糖醛酸作为底物的转换数kcat比以半乳糖醛酸作为底物的要高。但是半乳糖醛酸的米氏常数Km较低。发现根瘤农杆菌中的酶具有最高的速率常数(对葡糖醛酸的kcat＝
2 -1
1.9×10s )，其比两种假单胞菌中的酶高出超过2倍。

[0157] 简介

[0158] 据报道细菌中己糖醛酸代谢涉及两条不同的途径，一条起始于异构化步骤而另一条起始于氧化步骤。在所述异构化途径中，己糖醛酸(葡糖醛酸，半乳糖醛酸)被糖醛酸异构酶异构化为己糖酮酸(ketohexuronate)，并最终降解成为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。之前已报道该异构化途径存在于细菌(包括大肠杆菌(7)、软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)(18)和菊欧文氏菌(Erwinia hrysanthemi)(15)、产气气杆菌(Areobacter aerogenes)(9，23)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcesces)(28))中。在所述氧化途径中，己糖醛酸被糖醛酸脱氢酶氧化为己醛糖二酸(aldohexarate)并进一步分解代谢为丙酮酸(2，5，7，9，18，19，24)。糖醛酸脱氢酶(Udh)是该途径的关键酶，其已在两种植物细菌即丁香假单胞菌和根瘤农杆菌中进行了研究。至今，文献中仅报道了关于Udh性质的有限研究(3，6，38，43)，并且还未有序列被鉴定出。Udh属于NAD-连接的氧化还原酶(EC1.1.1.203)，分子量大约为60,000。它是一种同源二聚体，由分子量分别为约30,000的两个亚基组成(38)。Udh是一种热力学不稳定的可逆酶，其最适pH值为约8.0(3，6，38)。

[0159] 在大肠杆菌MG1655己糖醛酸分解代谢的异构化途径中，葡糖醛酸由exuT所编码的己糖醛酸转运蛋白转运并由uxaC所编码的糖醛酸异构酶转化为果糖醛酸
(fructuronate)(22，30)。果糖醛酸被转运至恩特纳-杜德洛夫途径(Entner-Doudoroff pathway)中并通过2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸用作能量来源(7，27，31，32)。因此uxaC缺失的大肠杆菌MG1655不能利用葡糖醛酸作为碳源。在该菌株中，葡糖二酸由gudD所编码的D-葡糖二酸脱水酶转化成5-酮-4-脱氧-D-葡糖二酸，随后通过丙酮酸或2-磷
酸甘油酸转运至糖酵解(27，33)。最近公开了多种细菌基因组序列，包括丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株和根瘤农杆菌C58菌株的Udh序列(4，10)。构建了丁香假单胞菌的鸟枪文库，以鉴定编码Udh的基因。Udh的筛选在大肠杆菌MG1655ΔuxaC中进行。由于糖醛酸脱氢酶将葡糖醛酸转化成葡糖二酸(图5)，因此含有丁香假单胞菌鸟枪文库并能够在以葡糖醛酸作为唯一碳源的基础培养基中生长的大肠杆菌MG1655ΔuxaC菌株可能载有编码Udh的基因。一旦最初从丁香假单胞菌中鉴定出Udh，进行BLAST同源性检索就可以鉴定出其他细菌的Udh。

[0160] 材料与方法

[0161] 细菌菌株、质粒和生长条件

[0162] 本研究中所使用的菌株、质粒和引物序列列于表4中。培养基和化学试剂购自Sigma(St.Louis，MO，USA) 或BD Biosciences(San Jose，CA，USA)。丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株用作基因组文库的来源，由Massachusetts General
Hospital的Dr.Frederick Ausubel馈赠。丁香假单胞菌在添加了50μg/mL利福平的
LB(Luria-Bertani)培养基中于30℃生长。恶臭假单胞菌KT2440(ATCC 47054)购自美国典型培养物中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassa，VA，USA)并在LB培养基中于30℃生长。大肠杆菌菌株在2YT培养基(每升中有16g胰蛋白胨，10g酵母提
取物和10g氯化钠)中于37℃生长。如果需要，向培养基中分别加入100μg/mL的氨苄青霉素和25μg/mL的卡那霉素。大肠杆菌DH10B(F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
ZΔM15ΔlacX74

[0163] recA1endA1araD139Δ(ara，leu)7697galU galKλ-rpsL nupG)用作基因组文库的宿主菌株，并用于筛选基因的亚克隆(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，USA)。大肠杆菌MG1655ΔuxaC由Wisconsin-Madison大学大肠杆菌基因组项目(E.coli Genome Project)的Dr.F. R.Blattner提供。对于M9中的基础糖分，用22mM的葡萄糖、葡糖醛酸或者葡糖二酸作为碳源。质粒载体pTrc99A和Trc99SE分别用于构建基因组文库和用作候选基因的表达载体(表4)。质粒pTrc99SE由韩国Gyeongsang国立大学的Seon-Won Kim教授馈赠。用pBluescrip(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)作为常规克隆载体。

[0164] 基因组DNA的制备，丁香假单胞菌基因组文库的构建和筛选

[0165] 基因组DNA的制备和常规克隆步骤依照Sambrook等的描述进行(35)。根瘤农杆菌C58菌株的基因组DNA购自ATCC(ATCC号为33970D)。限制性酶和T4连接酶购自NewEngland Biolab(Beverly，MA，USA)。丁香假单胞菌基因组DNA用BfuCI进行部分消化，并随后点样于0.8％的琼脂糖凝胶上。从凝胶中纯化出26Kb的片段，随后连接至具有去磷酸化的BamHI末端的pTrc99A中。4℃连接2天后，用反应混合物转化大肠杆菌DH10B。从琼脂平板上将成功转化的克隆收集并合并，随后贮存于-80℃。用从菌落库分离的质粒库转化大肠杆菌MG1655ΔuxaC，用于Udh活性的筛选。经转化的菌株在添加了22mM葡糖醛酸的M9基础琼脂平板上于30℃培养4天。对平板上的存活克隆进行纯化和质粒测序，以进行筛选。将测序结果与丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株的基因组序列(GenBank登录号NC_004578，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行对比。

[0166] 含有Udh基因之表达质粒载体的构建

[0167] 利用Pfu Turbo AD依照厂商(Stratagene，La Jolla，CA，USA)的说明进行PCR扩增。利用表4中列出的引物从基因组DNA中分别扩增3个候选基因iolE、iolB和
PSPTO_1053。PCR产物以平末端连接至经EcoRV消化的pBluescriptII中，得到pBiolE、pBiolB、pBiolEB和pB1053，这些质粒分别经测序以确定其身份。iolE、iolB和iolEB分别用EcoRI和SalI消化剪切，随后连接至经相同酶消化的pTrc99A中，以分别构建pTiolE、pTiolB和pTiolEB。通过用NcoI和SacI消化从pB1053中切下PSPTO_1053，随后连接至经相同酶消化的pTrc99A中，得到pT1053。

[0168] 分别利用引物对ATudh2-F/ATudh-R、PPudh-F/PPudh-R和PSudh-F/1053-R从根瘤农杆菌、恶臭假单胞菌和丁香假单胞菌的基因组DNA中扩增假定的udh基因(表4)。PCR产物以平末端连接至经EcoRV消化的pBluescriptII中，得到质粒pBATudh2、pBPPudh和pBPSudh。为了构建质粒pTATudh2、pTPPudh和pTPSudh，用EcoRI和SacI分别从pBATudh2、pBPPudh和pBPSudh中切下相应基因，并插入到pTrc99Ser的相同位点中。

[0169] 蛋白纯化和动力学参数的测定

[0170] 利用表4中所列引物ATuEQ-F/R、PPuEQ-FR和PSuEQ-FR从根瘤农杆菌、恶臭假单胞菌和丁香假单胞菌的基因组DNA中扩增udh基因。PCR产物用SacI和HindIII消化并插入到含有6×His标签之pET21b的相同位点中，以分别构建pETATu、pETPPu和pETPSu(表
4)。用这些质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，以用于蛋白表达。重组的大肠杆菌BL21菌株经TM
IPTG诱导后在250rpm下于30℃培养6小时。利用ProBond Purification System根据厂
商(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，USA)的说明进行蛋白纯化。依照Sambrook等的描述进行SDA-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)(35)。通过在340nm下和室温中
监测初始NADH的产生来测定经纯化的蛋白对底物的酶活性。利用0至10mM葡糖醛酸或半+
乳糖醛酸以及100mM Tris-HCl(pH 8.0)中的1.2mM NAD 对葡糖醛酸和半乳糖醛酸进行动+ +
力学分析。利用0至2mM NAD 以及100mM Tris-HCl(pH 8.0)中的10mM葡糖醛酸进行NAD
的动力学分析。进行一系列酶促试验，以估计作为初始底物浓度之函数的初始活性。通过非线性最小二乘法回归对这些数据进行Michaelis-Menten动力学模型参数kcat和Km的拟合。
非线性最小二乘法回归分析通过利用Matlab 的自身函数nlinfit实施Gauss-Newton方
法进行。

[0171] 用于测定由葡糖醛酸通过Udh产生的葡糖二酸的LC-MS和CD分析

[0172] 用于由葡糖醛酸通过Udh产生葡糖二酸的反应混合物由20mM葡糖醛酸、21.6mM +NAD、40mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)以及如上所述的细菌裂解物组成。通过向反应混合
物中加入粗裂解物或经纯化蛋白并于室温孵育60分钟来进行酶促反应，随后通过加入
1M氢氧化钠使反应终止。利用填充有硼酸亲和凝胶(Affi-gel boronate gel，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)的柱从反应混合物中分离葡糖二酸，所述凝胶能够结合葡糖二酸的共面相邻顺式羟基基团(29)。葡糖醛酸由于其反式二醇基团而不能与凝胶结合。将反应混合物上样至亲和凝胶柱后，柱用80mM磷酸钾-20mM硼酸缓冲液(pH 7.0)清洗，随后加入0.1M HCl洗脱葡糖二酸。加入5M NaOH中和洗脱液，随后利用装配有Aminex HPX-87H柱(300×7.8nm，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)以及电喷雾电离检测器的Agilent 1100系列LC/MSD(Agilent Technologies，US)通过LC-MS进行分析。在阳离子和阴离子检测模式中均获得了质谱。图8中所示质谱图来源于阴离子检测模式。在室温下用pH 2.0的三氟乙酸(0.1％，v/v)作为流动相，流速为0.5mL/分钟。

[0173] 由葡糖醛酸形成的葡糖二酸的立体化学通过将其圆二色谱(circulardichroism，CD)与可靠的葡糖二酸标准品相比较而证实。在Aviv Model202CD
Spectrometer(Aviv Biomedical，Lakewood，NJ)上进行CD。反应混合物含有20mM葡糖醛+
酸、7mM NAD、100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)以及如上述方法制备的经纯化之酶。利用如上所述的硼酸亲和凝胶将葡糖二酸与葡糖醛酸分离。

[0174] 计算机分析，包括序列鉴定和比对分析

[0175] 利用BiocycTM(http://biocyc.org/)鉴定相关的代谢途径和代谢产物。丁香假单胞菌、恶臭假单胞菌和根瘤农杆菌的DNA序列从NCBI(National Center for
Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得，其登录号分别为NC_004578、NC_002947和NC_003063。利用NCBI的BLAST 算法进行同源性和保守结构域检索。利用Vector NTI软件(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行序列处理和比对。利用Vector NTI的AlignX模块进行比对和系统进化分析。

[0176] udh序列的GenBank登录号

[0177] 丁香假单胞菌的udh基因序列已储存于GenBank中，其登录号为EU377538(核酸序列是SEQ ID NO：1；氨基酸序列是SEQ ID NO：2)。根瘤农杆菌和恶臭假单胞菌的相应基因分别以登录号BK006462(DNA：SEQ ID NO：23；蛋白质：SEQ ID NO：24)和BK006380(DNA：SEQ ID NO：25；蛋白质：SEQ ID NO：26)储存。

[0178] Udh活性的酶促分析

[0179] 通过冻融法制备用于酶促分析的细菌裂解物。使含有udh基因的大肠杆菌菌株在含有0.1mM IPTG(异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)的LB培养基上生长过夜。沉淀重悬于1mg/mL溶菌酶溶液中，并于冰上孵育30分钟。在液氮中冷冻悬液，随后在37℃水浴中融化。重复该步骤5次。将细胞裂解液在4℃以14,000rpm离心15分钟，上清液用于酶促分析。通过在340nm下监测NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原态)的产生来测定Udh对
+
葡糖醛酸的活性(38)。反应混合物由2.5mM葡糖醛酸、0.9mM NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和100mM磷酸钠缓冲液组成。在室温下向反应混合物中加入裂解物，使反应开始并进行监测。为了确定Udh活性的最佳pH值，通过加入HCl或NaOH溶液来调整反应混合物至
pH为6.5至9.9。利用Bradford法(Bradford(1976)Anal Biochem72：248-54)测定总蛋
白浓度。比活性以每毫克总蛋白中的单位数来表示(1U＝产生1μmol NADH/分钟)。化学药品购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。

[0180] 结果

[0181] 从丁香假单胞菌中克隆udh基因

[0182] 利用大肠杆菌MG1655突变株进行筛选，用于鉴定丁香假单胞菌中对应于Udh活性的基因。uxaC基因的缺失使其不能利用葡糖醛酸生长，但保持以葡糖二酸作为唯一碳源而生长的能力。由于Udh催化葡糖醛酸转化成葡糖二酸(3，38)，因此含有丁香假单胞菌基因组文库之udh基因的大肠杆菌MG 1655ΔuxaC克隆应当以葡糖醛酸作为唯一碳源而生长。分别用大肠杆菌DH10B和pTrc99A作为宿主菌株和质粒载体，用于启动构建丁香假单胞菌基因组文库。从大肠杆菌DH10B克隆库中制备文库质粒库，并随后用其转化ΔuxaC菌株。
经转化的ΔuxaC克隆在含有葡糖醛酸的M9基础琼脂上于30℃孵育4天。

[0183] 从10个琼脂板上选择了28个克隆进行进一步筛选，其中每个克隆含有2-5kb的插入片段。从这些克隆中，对8个具有不同大小之插入片段的克隆进行测序，并与丁香假单胞菌基因组序列(GenBank登录号NC_004578)相比较。这些克隆中有6个含有iolE、iolB或者二者都有，1个克隆含有未指定的PSPTO_1053开放读码框。最后的克隆含有iolEB和PSPTO_1053区域的嵌合体。文库片段中的开放读码框经PCR扩增后插入到表达载体
pTrc99A中，得到质粒pTiolE、pTiolB、pTiolEB和pT1053。用含有这些载体的克隆确定哪个基因对应于糖醛酸脱氢酶活性。将大肠杆菌MG1655、其ΔuxaC衍生物以及经候选基因转化的4个ΔuxaC克隆在含有葡糖醛酸作为唯一碳源的M9基础培养基上孵育。野生型、ΔuxaC(pTiolB)、ΔuxaC(pTiolEB)和ΔuxaC(pT1053)能在M9-葡糖醛酸琼脂上生长，而ΔuxaC(pTrc99A)和ΔuxaC(pTiolE)则不能。因此，iolB和PSPTO_1053负责以葡糖醛酸作为唯一碳源而生长，其被鉴定为候选udh基因。

[0184] 为了进一步区分这两个候选基因，用质粒pTiolB和pT1053转化大肠杆菌DH10B，以表达重组基因。所得到的克隆在含有0.1mM IPTG的LB培养基中生长。对这两个克隆的粗裂解物中Udh活性的分析表明，含有pT1053的菌株表现出Udh活性，但是含有pTiolB的则不能(图6)。该试验以葡糖醛酸作为底物，并在340nm下监测NADH的产生。因此，推断828bp的PSPTO_1053编码糖醛酸脱氢酶。下文中将该基因称为udh，其在GenBank登记的登录号为EU377538(核酸序列是SEQ ID NO：1；氨基酸序列是SEQ ID NO：2)。

[0185] 恶臭假单胞菌和根瘤农杆菌udh基因的克隆和鉴定

[0186] 利用NCBI的BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对丁香假单胞菌udh的经翻译之蛋白序列进行分析，以鉴定假定的同源物。之前曾经研究过根瘤农杆菌的Udh活性(5，6，43)。根瘤农杆菌开放读码框Atu3143的翻译产物具有47.8％的最高序列一致性，并被认为是同源Udh的候选物。还发现另一个候选的开放读码框，即恶臭假单胞菌KT2440的PP1171也与丁香假单胞菌Udh具有高的相似性，其序列一致性为75.6％。
Atu3143和PP1171从其各自基因组中经PCR扩增，连同丁香假单胞菌udh，分别被整合到质粒载体pTrc99SE中，以分别产生质粒pTATudh2、pTPPudh和pTPSudh，用于比较所表达之重组蛋白的相对活性。经转化的DH10B克隆在有或无0.1mM IPTG的LB中培养，随后制备粗裂解物以进行酶促分析(图7)。这些试验证实，在葡糖醛酸作为底物存在时，根瘤农杆菌和+
恶臭假单胞菌的重组蛋白具有消耗NAD 的活性，该活性与之前用丁香假单胞菌所得到的活性相似。来源于根瘤农杆菌和恶臭假单胞菌的两个udh基因也储存于Genbank中，其登录号分别为BK006462(DNA：SEQ ID NO：23；蛋白质：SEQ ID NO：24)和BK006380(DNA：SEQ ID NO：25；蛋白质：SEQ ID NO：26)。

[0187] 重组Udh的纯化和表征，以及反应产物的分析

[0188] 用含有丁香假单胞菌udh基因的大肠杆菌粗裂解物进行酶促反应，证实了存在利用葡糖醛酸作为底物的活性，而且对于低底物负荷而言，反应速率与葡糖醛酸的浓度是成+ +比例的(数据未显示)。该活性还利用NAD 而不是NADP 作为辅助因子(数据未显示)。这些结果表明底物被氧化。对葡糖醛酸结构的检查显示有两个可能的氧化点：醇向酮的转化或者醛向羧酸的转化，后者的反应产生葡糖二酸。这两种产物的差异应该在质谱中很明显，因为前者将导致相对于底物的质量差异为-2，而后者将产生+16的质量差异。为了证实酶促反应的产物是葡糖二酸，利用LC-MS对样品进行分析。从酶促反应中分离之洗脱液的质谱和葡糖二酸标准品的质谱是一致的，表明葡糖二酸是Udh反应的产物(图8)。

[0189] 3个udh基因均表达于带有6×His标签的大肠杆菌中并纯化，以测定相应酶的动力学参数。经纯化的酶利用SDS-PAGE进行分析，用于证实单体的分子量并评估纯度(图9)。丁香假单胞菌和恶臭假单胞菌之Udh的分子量均大约为30KDa，这与克隆基因的翻译产物以及之前的报道(38)一致。根瘤农杆菌Udh稍大些，为32KDa。

[0190] 用经纯化的制备品测定每种酶的动力学参数kcat和Km。葡糖醛酸和半乳糖醛酸均+用作底物，而且还通过改变NAD 辅助因子的浓度来测定相应的Km(表5)。通过改变辅助因子浓度而测得的kcat在利用葡糖醛酸作为底物测得之数值的20％以内(数据未显示)。在所有情况下，葡糖醛酸的kcat均比半乳糖醛酸的高。发现根瘤农杆菌酶利用葡糖醛酸作为底
2 -1
物时具有最高的速率常数(kcat＝1.9×10s )，其比假单胞菌酶的速率高出2倍多。但是，在所有情况下，半乳糖醛酸的Michaelis(亲和力)常数均较低，其中最低的Km值0.04mM出现于丁香假单胞菌酶利用半乳糖醛酸作为底物时。以半乳糖醛酸作为底物时一级速率常数kcat/Km最高，其中丁香假单胞菌中葡糖醛酸和半乳糖醛酸之间的差异最大。

[0191] 还研究了酶活性对pH和温度变化的响应(图10)。对于根瘤农杆菌和丁香假单胞菌的酶而言，观察到其最佳pH值均为8.0，尽管丁香假单胞菌Udh的活性在pH～7和pH～8之间相对不变(图10a)。丁香假单胞菌Udh的这种pH表现与之前的报道(3)一致。恶
臭假单胞菌酶在pH～7.0时表现出最高活性。一般来说，酶活性在pH～5和pH～8之间
变化大约10％，并且当pH值大于8时所有3种酶的活性均显著下降。

[0192] 利用两种方法评估了温度的影响。首先，通过将酶制备品暴露于不同温度下30分钟并随后在标准条件下进行酶活试验来检验其热稳定性。发现根瘤农杆菌Udh表现出比两种假单胞菌酶明显要高的热稳定性(图10b)。根瘤农杆菌制备品暴露于37℃后，其活性保持在最大值的将近80％，而另外两种酶的相应活性则低于最大值的20％。两种假单胞菌酶的稳定性图谱彼此相似。最后在递增的温度下进行试验，评估酶活性。这些活性遵循在4至42℃之间随温度增加活性也增加的一般趋势，这与催化速率常数对温度的Arrhenius型依赖性相一致(图10c)。

[0193] 为了对这些反应的产物做最后表征，利用硼酸亲和凝胶分离由所有3种酶在体外反应中利用经纯化蛋白产生的假定的葡糖二酸。3种产物的样品随后进行圆二色谱(CD)分析，用于检测这些化合物的立体化学。所有这3种色谱图均与葡糖二酸标准品的一致，证实了产物是葡糖二酸以及这3种基因是编码糖醛酸脱氢酶的基因(数据未显示)。

[0194] 讨论

[0195] 糖醛酸脱氢酶(Udh)催化细菌中己糖醛酸代谢之氧化途径的第一步。在细菌中，仅报道了针对丁香假单胞菌和根瘤农杆菌Udh的有限研究。而且对真核细胞Udh的研究甚至更少。报道了酿酒葡萄欧亚种(Vitis vinifera)的Udh序列，其被鉴定为半乳糖醛酸还原酶(EC 1.1.1.203；BRENDA登录号A1Y2Z0，GenBank登录号DQ843600)。我们合成了该基因，其经密码子优化以在大肠杆菌(DNA 2.0，Menlo Park，CA)中表达，并表达了该重组蛋+ +白。但是，当利用NAD 或者NADP 作为辅助因子时，未观察到与Udh相关的活性(数据未显示)。该序列与本研究中所鉴定的丁香假单胞菌Udh的比对显示二者仅有10％的一致性。
我们不能排除酿酒葡萄欧亚种的酶不能在大肠杆菌中功能性表达的可能性。但是，在比对的基础上，我们得出结论，酿酒葡萄欧亚种的已报道序列不是糖醛酸脱氢酶，或者其是该酶的高度异化形式。

[0196] 将丁香假单胞菌的鸟枪文库引入大肠杆菌ΔuxaC株中，用于筛选编码糖醛酸脱氢酶的udh基因，鉴定得到PSPTO_1053和iolB基因，并将其作为可能的Udh候选物进行筛选。通过酶促分析，最终鉴定出PSPTO_1053是编码糖醛酸脱氢酶的udh基因。在葡糖醛酸代谢停止的大肠杆菌uxaC缺失突变株中，葡糖醛酸被糖醛酸脱氢酶转化成葡糖二酸，随后被降解成可用作能量来源的丙酮酸或2-磷酸丙酮酸(27，33)。在大肠杆菌ΔuxaC株中，引入iolB基因使其可以在含有葡糖醛酸作为唯一碳源的M9琼脂上生长，但是该基因不具有Udh活性。之前已报道在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中，IolB是与肌醇代谢相关的蛋白(41，42)。在枯草芽孢杆菌中，IolB属于用于在枯草芽孢杆菌中使肌醇降解并将5-脱氧葡糖醛酸转化成2-脱氧-5-酮-D-葡糖醛酸的iol操纵子(42)。丁香假单胞菌IolB与枯草芽孢杆菌IolB具有约48％的同源性。在我们的筛选中，含有IolB的细胞中葡糖醛酸消耗的精确机制还不清楚。可能该蛋白能够将葡糖醛酸转化成与大肠杆菌代谢相容的类似化合物。

[0197] 丁香假单胞菌、恶臭假单胞菌和根瘤农杆菌基因组中的udh基因座位如图11所示。丁香假单胞菌和恶臭假单胞菌的udh座位分别在约1150和1346kbp，而根瘤农杆菌的udh座位在约150kbp。在根瘤农杆菌中，与udh相邻的基因Atu3140、3141、3142和3145分别是kdgD、kduD、kduI和kdgF，并且与果胶降解有关。果胶是一种杂多糖，由α-1，4连接的D-半乳糖醛酸残基组成，其来源于植物细胞壁。Hugouvieux-Cotte-Pattat等已经对植物致病性果胶杆菌(Pectobacterium)(包括菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora))中的果胶降解和摄入进行了详细地研究(12-14)。在菊欧文氏菌中，果胶由kdu和kdg操纵子基因降解并且用作能量来源。在丁香假单胞菌和恶臭假单胞菌中，与udh相邻的基因被鉴定为TRAP(三联ATP依赖性胞浆，Tripartite ATP-independent periplasmic)二羧酸转运体和孔蛋白。在这些基因中，已知孔蛋白
(PSPTO_1054，PP_1173)与来源于果胶降解之寡聚半乳糖醛酸的摄入有关(34)。因此植物致病性细菌中的糖醛酸脱氢酶可能在来源于宿主植物细胞壁果胶之己糖醛酸的利用中发挥功能，其随后被转化成己糖二酸(hexarate)。

[0198] 进行了来源于丁香假单胞菌、恶臭假单胞菌和根瘤农杆菌之3种糖醛酸脱氢酶的比对和其同源物的系统进化分析(图12)。酶序列显示出2个一级序列基序，YxxxK和GxxGxxG，其与保守结构域相关(图12a)。YxxxK基序定位于丁香假单胞菌Udh的Tyr145和Lys149之间，并且是3-α/β羟基类固醇脱氢酶结构域的一级基序(11，37)。定位于丁香+
假单胞菌Udh的Gly18-24的GxxGxxG基序与已经在NAD 结合结构域中发现的Rossman折叠GxxxG或Gx1-2GxxG相似(20)。在系统进化分析中，糖醛酸脱氢酶在古细菌和细菌(包括变形菌、蓝细菌、绿色非硫细菌和革兰氏阴性菌)中显示出与NAD依赖性差向异构酶/脱水酶、核苷酸糖差向异构酶、3-β羟基类固醇脱氢酶/异构酶以及短链脱氢酶/还原酶的同源性，并在几种真核细胞(包括真菌、植物和人)中显示出与核苷酸糖差向异构酶的同源性(图12b)。本研究中所筛选的3种糖醛酸脱氢酶存在于α和γ-变形菌中，并且其同源性与古细菌极端嗜盐古菌(Halorubrum lacusprofundi)和法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonas pharaonis)以及真菌黑曲霉(Aspergillus niger)相对接近。

[0199] 我们已经对来源于根瘤农杆菌、恶臭假单胞菌和丁香假单胞菌的3种糖醛酸脱氢酶进行了筛选并测序，所述酶可高效地将葡糖醛酸转化成葡糖二酸。该酶在几种细菌类型中对于糖醛酸代谢是重要的，其还可用于开发产生醛糖二酸(例如葡糖二酸)的生物合成途径。葡糖二酸是核苷酸糖代谢的终产物，其在哺乳动物和植物中天然存在(21，39)。葡糖二酸及其衍生物(例如葡糖二酸-1，4-内酯)之前已经作为解毒和天然抗癌化合物(8，21，36，39)以及聚合物合成的构建模块(16)而进行过研究。它还被称为待由生物质产生的潜在“高附加值”化合物(40)。目前，葡糖二酸通过利用强氧化剂(如硝酸或一氧化氮)进行化学氧化由葡萄糖合成(25)。我们利用本研究中鉴定的丁香假单胞菌udh成功地在大肠杆菌中由合成途径产生出了葡糖二酸(26)。

[0200] 实施例2的参考文献

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[0244] 表4.本研究使用的菌株、质粒和引物

[0245]

[0246]

[0247]

[0248] a引物结合位点、限制性位点、起始和终止密码子分别以粗体字母、双和单下划线表示。

[0249] 表5.来自根瘤农杆菌、恶臭假单胞菌和丁香假单胞菌的醛糖脱氢酶的转换数(Kcat)和Michaelis常数(Km)

[0250]

[0251]

[0252] 本领域技术人员公认或者能够确定，仅使用常规实验就可确定本文中所述的本发明的具体实施方案的很多等同方案。这些等同方案旨在包含在以下权利要求中。

[0253] 本文中所公开的全部参考文献均通过引用全文并入本文。

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