在植物细胞中产生长链多不饱和脂肪酸
阅读：254发布：2022-06-08
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1.一种提取的植物脂质，其包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；
ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％。
2.如权利要求1所述的脂质，其具有一个或多个或所有以下特征：
i)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的棕榈酸水平在约2％与18％之间，或在约2％与
16％之间，或在约2％与15％之间；
ii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的肉豆蔻酸(C14:0)水平小于6％，或小于3％或小于2％，或小于1％；
lxvii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在约1％与约30％之间、在约3％与约30％之间，或在约6％与约30％之间，或在1％与约20％之间，或在约30％与约60％之间，或约45％至约60％；或为约30％；
lxviii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在约4％与约35％之间，或在约4％与约20％之间，或在约4％与17％之间；
lxix)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在约4％与约40％之间、在约7％与约40％之间，或在约10％与约35％之间，或在约20％与约35％之间，或在约
4％与16％之间，或在约2％与16％之间；
lxx)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的γ-亚麻酸(GLA)水平小于4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、在0.05％与7％之间、在0.05％与4％之间，或在
0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
lxxi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的十八碳四烯酸(SDA)水平小于约7％、小于约6％、小于约4％、小于约3％、在约0.05％与约7％之间、在约0.05％与约6％之间、在约
0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
lxxii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳四烯酸(ETA)水平小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约1％、小于约0.5％、在约0.05％与约6％之间、在约0.05％与约
5％之间、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间，或在约0.05％与约2％之间；
lxxiii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于4％、小于约2％、小于约1％、在0.05％与4％之间、在0.05％与3％之间，或在0.05％与约2％之间，或在0.05％与约1％之间；
lxxiv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳五烯酸(EPA)水平小于4％、小于约
3％、小于约2％、在0.05％与10％之间、在0.05％与5％之间，或在0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
lxxv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十二碳五烯酸(DPA)水平小于4％、小于约
3％、小于约2％、在0.05％与8％之间、在0.05％与5％之间，或在0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
lxxvi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、在约8％与20％之间、在约
10％与20％之间、在约11％与20％之间、在约10％与约16％之间，或在约14％与20％之间；
Δ4,7,10,13,16
lxxvii)所述脂质在其脂肪酸含量中包含ω6-二十二碳五烯酸(22:5 )；
lxxviii)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含ω6-二十二碳五烯酸
Δ4,7,10,13,16
(22:5 )；
lxxix)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含SDA、EPA和ETA；
lxxx)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约25％之间，或在约4％与约20％之间、在约6％与约20％之间、在约4％与约60％之间、在约30％与约
60％，或在约45％与约60％之间；
lxxxi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约4％与约35％之间，或在约8％与约25％之间，或在8％与约22％之间；
lxxxii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约20％与约
75％之间，或在约50％与约75％之间，或在约60％与约75％之间；
lxxxiii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸水平在约35％与约50％之间、在约20％与约35％之间、在约6％与20％之间、小于20％、小于约16％、小于约10％、在约1％与约16％之间、在约2％与约10％之间，或在约4％与约10％之间；
lxxxiv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平小于约10％、小于约
8％、小于约6％、小于4％、在约1％与约20％之间、在约1％与约10％之间、在约0.5％与约
8％之间，或在约0.5％与4％之间；
lxxxv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在36％与约65％之间、在
40％与约60％之间、在约20％与约35％之间、在约10％与约20％之间、为约25％、约30％、约35％或约40％；
lxxxvi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在9％与约33％之间、在约10％与约20％之间、在约20％与约30％之间、在约12％与约25％之间、为约13％、约
15％、约17％或约20％；
lxxxvii)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约1.0与约3.0之间、在约0.1与约1之间、在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约1.0、约0.1或约0.2；
lxxxviii)所提取的脂质的脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约
1.0与约3.0之间、在约0.1与约1之间、在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约0.1、约0.2或约1.0；
lxxxix)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ12-去饱和酶油酸到LA的转化效率为至少约60％、至少约70％、至少约80％、在约60％与约98％之间、在约70％与约95％，或在约
75％与约90％之间；
xc)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ6-去饱和酶ALA到SDA的转化效率为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、在约30％与约70％之间、在约35％与约60％，或在约50％与约70％之间；
xci)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ6-延长酶SDA到ETA酸的转化效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、在约60％与约95％之间、在约70％与约88％之间，或在约75％与约85％之间；
xcii)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ5-去饱和酶ETA到EPA的转化效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、在约60％与约99％之间、在约70％与约99％之间，或在约75％与约98％之间；
xciii)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ5-延长酶EPA到DPA的转化效率为至少约80％、至少约85％、至少约90％、在约50％与约95％之间，或在约85％与约95％之间；
xciv)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ4-去饱和酶DPA到DHA的转化效率为至少约80％、至少约90％、至少约93％、在约50％与约95％之间、在约80％与约95％之间，或在约85％与约95％之间；
xcv)所述脂质的脂肪酸组成是基于油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约
15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约10％与约30％之间，或在约10％与约
25％之间；
xcvi)所述脂质的脂肪酸组成是基于LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约
20％、至少约22％、至少约25％、在约15％与约50％之间、在约20％与约40％之间，或在约
20％与约30％之间；
xcvii)所述脂质的脂肪酸组成是基于ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约
22％、至少约24％、在约17％与约55％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约
35％之间；
xcviii)所提取的脂质中的总脂肪酸具有小于1％的C20:1；
xcix)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％、在约70％与约99％之间，或在约90％与约99％之间；
c)所述脂质包含二酰基甘油(DAG)；
ci)所述脂质包含小于约10％、小于约5％、小于约1％，或在约0.001％与约5％之间的游离(未酯化)脂肪酸和/或磷脂，或基本上不含游离脂肪酸和/或磷脂；
cii)至少70％或至少80％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上；
ciii)所述脂质中最丰富的含DHA的TAG种类是DHA/18:3/18:3(TAG 58:12)；和civ)所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的脂质，其呈油形式，其中以重量计至少约90％或至少约95％、至少约98％，或在约95％与约98％之间的所述油是脂质。
4.如权利要求1至3中任一项所述的脂质，其还包含一种或多种甾醇。
5.如权利要求4所述的脂质，其呈油形式且其包含小于约10mg甾醇/g油、小于约7mg甾醇/g油、在约1.5mg与约10mg之间的甾醇/g油，或在约1.5mg与约7mg之间的甾醇/g油。
6.如权利要求4或权利要求5所述的脂质，其包含菜油甾醇/24-甲基胆甾醇、Δ5-豆甾醇、齿孔醇、β-谷甾醇/24-乙基胆甾醇、Δ5-燕麦甾醇/异岩藻甾醇、Δ7-豆甾醇/豆甾-7-烯-3β-醇和Δ7-燕麦甾醇中的一种或多种或全部。
7.如权利要求4至6中任一项所述的脂质，其包含小于约0.5mg胆甾醇/g油、小于约
0.25mg胆甾醇/g油、在约0mg与约0.5mg之间的胆甾醇/g油，或在约0mg与约0.25mg之间的胆甾醇/g油，或其基本上不含胆甾醇。
8.如权利要求1至7中任一项所述的脂质，其中所述脂质是油，优选为得自油料种子的油。
9.如权利要求8所述的脂质，其中所述脂质是芸苔属植物油、陆地棉油、亚麻油、向日葵属植物油、红花油、毛豆油、玉米油、拟南芥油、二色高粱油、甜高粱油、燕麦油、车轴草属植物油、油棕油、本氏烟油、大麦油、狭叶羽扇豆油、水稻油、光稃稻油、亚麻荠油、深海两节荠油、巨银草油或中国芒油。
10.一种用于产生提取的植物脂质的方法，其包括以下步骤：
i)获得包含脂质的植物部分，所述脂质包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)和γ-亚麻酸(GLA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)且任选地包括二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所述植物部分中的可提取脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％；和
ii)从所述植物部分提取脂质，
其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平是约7％至20％。
11.如权利要求10所述的方法，其中所提取的脂质具有权利要求2至9中所定义的特征中的一个或多个。
12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述植物部分是种子，优选为油料种子。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述种子是芸苔属种子、陆地棉种子、亚麻种子、向日葵属种子、红花种子、毛豆种子、玉米种子、拟南芥种子、二色高粱种子、甜高粱种子、燕麦种子、车轴草属种子、油棕种子、本氏烟种子、大麦种子、狭叶羽扇豆种子、水稻种子、光稃稻种子、亚麻荠种子或深海两节荠种子，优选为油菜种子、芥菜种子或亚麻荠种子。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述种子包含至少约18mg、至少约
22mg、至少约26mg、在约18mg与约100mg之间、在约22mg与约70mg之间或在约24mg与约
50mg之间的DHA/g种子。
15.如权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述植物部分包含编码以下酶集合之一的外源多核苷酸；
i)ω3-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
ii)Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
iii)Δ12-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
iv)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
v)ω3-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
vi)Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
vii)Δ12-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；或
viii)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
且其中各多核苷酸被可操作地连接于一个或多个能够指导所述多核苷酸在所述植物部分的细胞中表达的启动子。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述植物部分具有一个或多个或所有以下特征：
i)所述Δ12-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将油酸转化成亚油酸，效率为至少约60％、至少约70％、至少约80％、在约60％与约95％之间、在约70％与约90％之间，或在约75％与约85％之间；
ii)所述ω3-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将ω6脂肪酸转化成ω3脂肪酸，效率为至少约65％、至少约75％、至少约85％、在约65％与约95％之间、在约75％与约
91％之间，或在约80％与约91％之间；
iii)所述Δ6-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将ALA转化成SDA，效率为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、在约30％与约70％之间、在约35％与约60％之间，或在约50％与约70％之间；
iv)所述Δ6-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将亚油酸转化成γ-亚麻酸，效率小于约5％、小于约2.5％、小于约1％、在约0.1％与约5％之间、在约0.5％与约2.5％之间，或在约0.5％与约1％之间；
v)所述Δ6-延长酶在所述植物的一个或多个细胞中将SDA转化成ETA，效率为至少约
60％、至少约70％、至少约75％、在约60％与约95％之间、在约70％与约80％之间，或在约
75％与约80％之间；
vi)所述Δ5-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将ETA转化成EPA，效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、在约60％与约95％之间、在约70％与约95％之间，或在约75％与约95％之间；
vii)所述Δ5-延长酶在所述植物的一个或多个细胞中将EPA转化成DPA，效率为至少约80％、至少约85％、至少约90％、在约50％与约90％之间，或在约85％与约95％之间；
viii)所述Δ4-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将DPA转化成DHA，效率为至少约80％、至少约90％、至少约93％、在约50％与约95％之间、在约80％与约95％之间，或在约85％与约95％之间；
ix)在所述植物部分的一个或多个细胞中油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约10％与约30％之间，或在约10％与约
25％之间；
x)在所述植物部分的一个或多个细胞中LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约
20％、至少约22％、至少约25％、在约15％与约50％之间、在约20％与约40％之间，或在约
20％与约30％之间；
xi)在所述植物部分的一个或多个细胞中ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、在约17％与约55％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约
35％之间；
xii)所述植物部分的一个或多个细胞所包含的ω3脂肪酸比缺乏所述外源多核苷酸的相应细胞多出至少约15％、至少约20％、在约15％与约30％之间，或在约22.5％与约
27.5％之间；
xiii)相对于亚油酸(LA)，所述Δ6-去饱和酶优先将α-亚麻酸(ALA)去饱和化；
xiv)所述Δ6-延长酶还具有Δ9-延长酶活性；
xv)所述Δ12-去饱和酶还具有Δ15-去饱和酶活性；
xvi)所述Δ6-去饱和酶还具有Δ8-去饱和酶活性；
xvii)所述Δ8-去饱和酶还具有Δ6-去饱和酶活性或不具有Δ6-去饱和酶活性；
xviii)所述Δ15-去饱和酶还对GLA具有ω3-去饱和酶活性；
xix)所述ω3-去饱和酶还对LA具有Δ15-去饱和酶活性；
xx)所述ω3-去饱和酶对LA和/或GLA进行去饱和化；
xxi)相对于LA，所述ω3-去饱和酶优先对GLA进行去饱和化；
xxii)所述植物部分中的DHA水平是基于所述植物部分中油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约15％与约30％之间，或在约20％与约25％之间；
xxiii)所述植物部分中的DHA水平是基于所述植物部分中LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约20％、至少约22％、在约15％与约60％之间、在约20％与约40％之间，或在约22％与约30％之间；
xxiv)所述植物部分中的DHA水平是基于所述植物部分中ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、在约17％与约65％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约35％之间
xxx)所述去饱和酶中的一种或多种或全部对酰基-CoA底物的活性高于对相应的酰基PC底物的活性；
xxxi)所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA的Δ6-去饱和酶活性高于对LA的Δ6-去饱和酶活性；
xxxii)所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6-去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的Δ6-去饱和酶活性；
xxxiii)与LA相比，所述Δ6-去饱和酶对作为底物的ALA具有高至少约2倍Δ6-去饱和酶活性、至少3倍活性、至少4倍活性或至少5倍活性；
xxxiv)所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的活性；
xxxv)与作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA相比，所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA具有高至少约5倍Δ6-去饱和酶活性或至少10倍活性；
xxxvi)所述去饱和酶是前端去饱和酶；
xxxvii)所述Δ6-去饱和酶对ETA不具有可检测的Δ5-去饱和酶活性。
17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述植物部分具有一个或多个或所有以下特征：
i)所述Δ12-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:10中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:10具有至少50％同一性的氨基酸序列；
ii)所述ω3-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:12中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:12具有至少50％同一性的氨基酸序列；
iii)所述Δ6-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:16中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:16具有至少50％同一性的氨基酸序列；
iv)所述Δ6-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:25中所提供的序列、其生物学活性片段，诸如SEQ ID NO:26，或与SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:26具有至少50％同一性的氨基酸序列；
v)所述Δ5-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:30中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:30具有至少50％同一性的氨基酸序列；
vi)所述Δ5-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:37中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:37具有至少50％同一性的氨基酸序列；
vii)所述Δ4-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:41中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:41具有至少50％同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述植物部分还包含编码以下各项的外源多核苷酸：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)、甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(LPAAT)，优选为可使用C22多不饱和脂肪酰基-CoA底物的LPAAT；酰基-CoA:溶血磷脂胆碱酰基转移酶(LPCAT)；磷脂酶A2(PLA2)；磷脂酶C(PLC)；磷脂酶D(PLD)；CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)；磷脂胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)；磷脂酰胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(PDCT)；酰基-CoA合成酶(ACS)；或其中两种或更多种的组合。
19.如权利要求10至18中任一项所述的方法，其中所述植物部分还包含能下调所述植物部分的细胞中的内源酶的产生和/或活性的引入突变或外源多核苷酸，所述内源酶选自FAE1、DGAT、MGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、诸如FATB等硫酯酶或Δ12-去饱和酶或其中两种或更多种的组合。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中至少一个或所有的启动子是种子特异性启动子。
21.如权利要求20所述的方法，其中至少一个或所有的启动子是获自诸如油质蛋白等油生物合成或累积基因或获自诸如conlinin等种子存储蛋白基因。
22.如权利要求15至21中任一项所述的方法，其中指导编码Δ4-去饱和酶和Δ5-延长酶的外源多核苷酸表达的启动子在所述启动子指导编码Δ12-去饱和酶和ω3-去饱和酶的外源多核苷酸表达之前在所述植物部分的正在发育的种子中引发所述多核苷酸的表达或达到峰值表达。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述外源多核苷酸共价连接于被整合至植物部分的细胞的基因组中的DNA分子中，优选地T-DNA分子中，且优选地，其中所述被整合至植物部分的细胞的基因组中的DNA分子的数目为不超过1个、2个或3个，或为
2个或3个。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述植物包含至少两种不同的外源多核苷酸，各外源多核苷酸编码Δ6-去饱和酶，所述Δ6-去饱和酶具有相同或不同的氨基酸序列。
25.如权利要求15至24中任一项所述的方法，其中包含所述外源多核苷酸的植物部分的总油含量是缺乏所述外源多核苷酸的相应植物部分的总油含量的至少约40％，或至少约
50％，或至少约60％，或至少约70％，或在约50％与约80％之间。
26.如权利要求10至25中任一项所述的方法，其中所述脂质呈油形式，优选为得自油料种子的种子油，且其中以重量计至少约90％或至少约95％、至少约98％，或在约95％与约98％之间的所述脂质是三酰基甘油。
27.如权利要求10至26中任一项所述的方法，其还包括处理所述脂质以提高DHA水平，所述DHA水平呈占总脂肪酸含量的百分比形式。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述处理为酯基转移。
29.一种脂质或包含所述脂质的油，其是使用如权利要求10至28中任一项所述的方法产生。
30.一种嵌合基因构建体，其按顺序包含第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因和第六基因，所述基因全部共价连接于单个DNA分子上，
其中所述第一、第二和第三基因连接在一起作为第一基因簇，且所述第四、第五和第六基因连接在一起作为第二基因簇，
其中各基因包含启动子、编码区和转录终止子和/或聚腺苷酸化区，使得各启动子被可操作地连接于所述编码区和转录终止子和/或聚腺苷酸化区，
其中各启动子独立地与其它启动子同一或不同，使得所述DNA分子包含3、4、5或6个不同的启动子，
其中一个或多个或所有启动子相对于其可操作地连接的编码区而言是异源的，其中所述第一基因的转录方向远离所述第三基因且与所述第三基因的转录方向相对，其中所述第四基因的转录方向远离所述第六基因且与所述第六基因的转录方向相对，其中所述第二基因的转录方向与所述第一基因或所述第三基因相同，
其中所述第五基因的转录方向与所述第四基因或所述第六基因相同，
其中所述第二基因的转录终止子和/或聚腺苷酸化区通过在约0.2与约3.0千碱基之间的第一间隔区与所述第一或第三基因中更接近者的启动子间隔开，
其中所述第一基因簇通过在约1.0与约10.0千碱基之间的第二间隔区与所述第二基因簇间隔开，且
其中所述第五基因的转录终止子和/或聚腺苷酸化区通过在约0.2与约3.0千碱基之间的第三间隔区与所述第四或第六基因中更接近者的启动子间隔开。
31.如权利要求30所述的基因构建体，其中所述DNA分子包含第七基因，所述第七基因通过在约1.0与约10.0千碱基之间的间隔区与所述第一基因簇或所述第二基因簇中更接近者间隔开。
32.如权利要求30或权利要求31所述的基因构建体，其中所述DNA分子包含两个或更多个不同的转录终止子和/或聚腺苷酸化区。
33.如权利要求30至32中任一项所述的基因构建体，其中所述间隔区中至少一个包含基质连接区(MAR)。
34.如权利要求30至33中任一项所述的基因构建体，其中所述DNA分子包含侧接所述基因的右边界区和左边界区，并且是T-DNA分子。
35.如权利要求30至34中任一项所述的基因构建体，其是在农杆菌属细胞中或被整合至植物细胞的基因组中。
36.如权利要求30至35中任一项所述的基因构建体，其中至少一个所述基因编码脂肪酸去饱和酶或脂肪酸延长酶。
37.如权利要求36所述的基因构建体，其包含编码如权利要求15中所定义的酶集合的基因，和/或其中一个或多个所述基因编码如权利要求16或权利要求17中所定义的酶。
38.一种分离和/或外源多核苷酸，其包含：
i)选自SEQ ID NO:1至9、11、14、18、22、23、28、34、35、39或45中任一个的核苷酸序列；和/或
ii)与SEQ ID NO:1至9、11、14、18、22、23、28、34、35、39或45中所阐述的序列中的一个或多个具有至少95％同一性或99％同一性的核苷酸序列。
39.一种载体或基因构建体，其包含如权利要求38所述的多核苷酸和/或如权利要求
30至37中任一项所述的基因构建体。
40.如权利要求39所述的载体或基因构建体，其中选自SEQ ID NO:11、14、18、22、23、
28、34、35、39或45中任一个的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11、14、18、22、23、28、34、35、39或45中所阐述的序列中的一个或多个具有至少95％同一性或99％同一性的核苷酸序列被可操作地连接于启动子。
41.一种宿主细胞，其包含编码以下酶集合之一的外源多核苷酸；
i)ω3-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
ii)Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
iii)Δ12-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
iv)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
v)ω3-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
vi)Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
vii)Δ12-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；或
viii)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
且其中各多核苷酸被可操作地连接于一个或多个能够指导所述多核苷酸在所述细胞中表达的启动子。
42.如权利要求41所述的细胞，其包含如权利要求1至9中任一项所定义的脂质，或其中所述去饱和酶或延长酶中的一种或多种或全部具有一个或多个如权利要求16或权利要求17中所定义的特征。
43.一种宿主细胞，其包含
i)编码Δ12-去饱和酶的第一外源多核苷酸，其包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:10中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:10具有至少50％同一性的氨基酸序列；和
ii)编码ω3-去饱和酶的第二外源多核苷酸，其包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:12中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:12具有至少50％同一性的氨基酸序列，
其中各多核苷酸被可操作地连接于一个或多个能够指导所述多核苷酸在所述细胞中表达的启动子。
44.一种宿主细胞，其包含如权利要求38所述的多核苷酸、如权利要求30至37中任一项所述的基因构建体或如权利要求39或权利要求40所述的载体或基因构建体中的一者或多者。
45.如权利要求41至44中任一项所述的细胞，其是在植物中、在植物部分中和/或是成熟植物种子细胞。
46.如权利要求45所述的细胞，其中所述植物或植物种子分别是油料种子植物或油料种子。
47.一种转基因非人生物体，其包含如权利要求41至46中任一项所述的细胞。
48.如权利要求47所述的转基因非人生物体，其是转基因植物。
49.一种油料种子植物，其包含
a)其种子中的脂质，所述脂质包括呈酯化形式的脂肪酸；和
b)编码以下酶集合之一的外源多核苷酸；
i)Δ12-去饱和酶、真菌ω3-去饱和酶和/或真菌Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；或
ii)Δ12-去饱和酶、真菌ω3-去饱和酶和/或真菌Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶，
其中各多核苷酸被可操作地连接于一种或多种能够指导所述多核苷酸在所述植物的正在发育的种子中表达的种子特异性启动子，其中所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)和γ-亚麻酸(GLA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括二十碳五烯酸(EPA)和/或二十碳四烯酸(ETA)，且其中所述脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约
7％至20％。
50.如权利要求49所述的植物，其中所述植物是油菜、毛豆、亚麻荠或拟南芥植物。
51.如权利要求49或权利要求50所述的植物，其中所述去饱和酶中的一种或多种能够使用酰基-CoA底物。
52.如权利要求51所述的植物，其中Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶和Δ8-去饱和酶中的一个或多个在存在时能够使用酰基-CoA底物，优选为以下各项中的每一项：i)Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶和Δ4-去饱和酶；或ii)Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶和Δ8-去饱和酶能够使用酰基-CoA底物。
53.如权利要求49至52中任一项所述的植物，其中所述植物的成熟收获种子的DHA含量为至少约28mg/g种子，优选为至少约32mg/g种子、至少约36mg/g种子、至少约40mg/g种子，更优选为至少约44mg/g种子或至少约48mg/g种子。
54.一种油菜、芥菜或亚麻荠植物，其能够产生包含DHA的种子，其中所述植物的成熟收获种子的DHA含量为至少约28mg/g种子，优选为至少约32mg/g种子、至少约36mg/g种子、至少约40mg/g种子，更优选为至少约44mg/g种子或至少约48mg/g种子。
55.一种如权利要求49至54中任一项所述的植物的植物细胞，其包含所述外源多核苷酸。
56.一种植物部分，优选为种子，其具有以下特征中的一个或多个：
i)来自于如权利要求48至54中任一项所述的植物；
ii)包含如权利要求1至9中任一项所定义的脂质；
iii)可用于如权利要求10至28中任一项所述的方法中；
iv)包含如权利要求30至37中任一项所述的基因构建体；或
v)包含权利要求14、41或48至52中任一项所定义的外源多核苷酸的集合。
57.一种成熟收获油菜、芥菜或亚麻荠种子，其包含DHA和以重量计在约4％与约15％之间的水分含量，其中所述种子的DHA含量为至少约28mg/g种子，优选为至少约32mg/g种子、至少约36mg/g种子、至少约40mg/g种子，更优选为至少约44mg/g种子或至少约48mg/g种子。
58.如权利要求41至46或55中任一项所述的细胞，如权利要求47或权利要求48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分或如权利要求
57所述的种子，其可用于产生包含一个或多个如权利要求1至9中任一项中所定义的特征的提取脂质。
59.一种用于产生如权利要求41至45中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括a)将如权利要求30至37中任一项所述的基因构建体、如权利要求38所述的分离和/或外源多核苷酸、如权力要求39或权力要求40所述的载体或基因构建体、权利要求14、41至43或48至52中的任一项中所定义的外源多核苷酸的组合中的一种或多种引入所述细胞中，所述细胞优选地为不能够合成LC-PUFA的细胞；
b)任选地，在所述细胞中表达所述基因或多核苷酸；
c)任选地，分析所述细胞的脂肪酸组成；和
d)任选地，选择表达所述基因或多核苷酸的细胞。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞中的脂质具有权利要求1至9中所定义的特征中的一个或多个。
61.如权利要求59或权利要求60所述的方法，其中所述基因构建体、所述分离和/或外源多核苷酸、所述载体、所述基因构建体或外源多核苷酸组合被稳定地整合至所述细胞的基因组中。
62.如权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述细胞是植物细胞，且所述方法还包括由步骤a)的细胞再生转化植物的步骤。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述基因和/或外源多核苷酸被瞬时表达于所述细胞中。
64.一种细胞，其是使用如权利要求59至63中任一项所述的方法产生。
65.一种产生种子的方法，所述方法包括：
a)种植如权利要求48至54中任一项所述的植物或产生如权利要求10至28、56或57中任一项所定义的部分的植物，优选地种植在作为具有至少1000株这样的植物的群体的一部分的田地中或在以标准种植密度种植的至少1公顷面积中；
b)从所述植物收获种子；和
c)任选地，从所述种子提取脂质，优选地产生油，其中总DHA产量为至少60kg DHA/公顷。
66.如权利要求48至57中任一项所述的植物、植物细胞、植物部分或种子，其具有以下特征中的一个或多个：
i)如权利要求2或4至7中任一项所定义的油；
ii)所述植物部分或种子能够用于如权利要求14、16至19、21至28中任一项所述的方法中；
iii)所述外源多核苷酸被包含在如权利要求30至35中任一项所述的基因构建体中；
iv)所述外源多核苷酸包含如权利要求38所述的外源多核苷酸；
v)所述植物细胞是如权利要求43所述的细胞；且
vi)所述种子是根据如权利要求65所述的方法产生。
67.一种产生一种或多种脂肪酸去饱和酶和/或脂肪酸延长酶或一种或多种脂肪酸去饱和酶和一种或多种脂肪酸延长酶的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达如权利要求36或权利要求37所述的基因构建体、如权利要求38所述的分离和/或外源多核苷酸、如权利要求39或权利要求40所述的载体或基因构建体、如权利要求14、41至43或48至52中的任一项中所定义的外源多核苷酸组合中的一种或多种。
68.一种脂质或油，其是使用如权利要求10至28中任一项所述的方法、由如权利要求
41至46或55中任一项所述的细胞、如权利要求47或权利要求48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分、如权利要求57所述的种子或如权利要求66所述的植物、植物细胞、植物部分或种子产生或获得。
69.如权利要求29或权利要求68所述的脂质或油，其是通过从油料种子提取油而获得。
70.如权利要求29、68或69所述的脂质或油，其为芥花油(油菜、芜菁亚种)、芥子油(芥菜)、其它芸苔属植物油、葵花油(向日葵)、亚麻子油(亚麻)、大豆油(毛豆)、红花油(红花)、玉米油(玉米)、烟草油(普通烟草)、花生油(花生)、棕榈油、棉籽油(陆地棉)、椰子油(椰子)、鳄梨油(鳄梨)、橄榄油(橄榄)、腰果油(腰果)、夏威夷果油(夏威夷果)、杏仁油(巴旦杏)或拟南芥种子油(拟南芥)。
71.一种脂肪酸，其是使用如权利要求10至28中任一项所述的方法、由如权利要求41至46或55中任一项所述的细胞、如权利要求47或权利要求48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分、如权利要求57所述的种子或如权利要求66所述的植物、植物细胞、植物部分或种子产生或获得。
72.一种种子粕，其是由如权利要求56、57或66中任一项所述的种子获得。
73.一种组合物，其包含如权利要求29或59至51中任一项所述的脂质或油、如权利要求62所述的脂肪酸、如权利要求30至37中任一项所述的基因构建体、如权利要求38所述的分离和/或外源多核苷酸、如权利要求39或权利要求40所述的载体或基因构建体、如权利要求41至46或55中任一项所述的细胞、如权利要求47或权利要求48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分、如权利要求57所述的种子、如权利要求66所述的植物、植物细胞、植物部分或种子或如权利要求72所述的种子粕中的一种或多种。
74.一种饲料、化妆品或化学制品，其包含如权利要求1至9、29或59中任一项所述的脂质或油、如权利要求62所述的脂肪酸、如权利要求30至37中任一项所述的基因构建体、如权利要求38所述的分离和/或外源多核苷酸、如权利要求39或权利要求40所述的载体或基因构建体、如权利要求41至46或55中任一项所述的细胞、如权利要求47或权利要求
48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求
54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分、如权利要求57所述的种子、如权利要求66所述的植物、植物细胞、植物部分或种子、如权利要求72所述的种子粕或如权利要求73所述的组合物中的一种或多种。
75.一种生产饲料的方法，所述方法包括将如权利要求1至9、29或59中任一项所述的脂质或油、如权利要求62所述的脂肪酸、如权利要求30至37中任一项所述的基因构建体、如权利要求38所述的分离和/或外源多核苷酸、如权利要求39或权利要求40所述的载体或基因构建体、如权利要求41至46或55中任一项所述的细胞、如权利要求47或权利要求48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分、如权利要求57所述的种子、如权利要求66所述的植物、植物细胞、植物部分或种子、如权利要求72所述的种子粕或如权利要求73所述的组合物中的一种或多种与至少一种其它食物成分混合。
76.一种治疗或预防将受益于PUFA的病状的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1至9、29或59中任一项所述的脂质或油、如权利要求62所述的脂肪酸、如权利要求
30至37中任一项所述的基因构建体、如权利要求38所述的分离和/或外源多核苷酸、如权利要求39或权利要求40所述的载体或基因构建体、如权利要求41至46或55中任一项所述的细胞、如权利要求47或权利要求48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分、如权利要求57所述的种子、如权利要求66所述的植物、植物细胞、植物部分或种子、如权利要求72所述的种子粕、如权利要求73所述的组合物或如权利要求74所述的饲料中的一种或多种。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述病状是心律不齐、血管成形术、炎症、哮喘、牛皮癣、骨质疏松症、肾结石、AIDS、多发性硬化、类风湿性关节炎、克罗恩病、精神分裂症、癌症、胎儿酒精综合症、注意缺陷多动障碍、囊性纤维化、苯丙酮酸尿症、单相抑郁、攻击性敌对情绪、肾上腺脑白质营养不良、冠心病、高血压、糖尿病、肥胖、阿茲海默病、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、血管成形术后再狭窄、湿疹、高血压、血小板凝聚、胃肠出血、子宫内膜异位、经前期综合征、肌痛性脑脊髓炎、病毒感染后慢性疲劳或眼病。
78.一种如权利要求1至9、29或59中任一项所述的脂质或油、如权利要求62所述的脂肪酸、如权利要求30至37中任一项所述的基因构建体、如权利要求38所述的分离和/或外源多核苷酸、如权利要求39或权利要求40所述的载体或基因构建体、如权利要求41至
46或55中任一项所述的细胞、如权利要求47或权利要求48所述的转基因生物体、如权利要求49至53中任一项所述的油料种子植物、如权利要求54所述的油菜、芥菜或亚麻荠植物、如权利要求49或权利要求56所述的植物部分、如权利要求57所述的种子、如权利要求
66所述的植物、植物细胞、植物部分或种子、如权利要求72所述的种子粕、如权利要求73所述的组合物或如权利要求74所述的饲料的用途，其是用于制造用以治疗或预防将受益于PUFA的病状的药物。
79.一种交易种子的方法，其包括获得如如权利要求56、57或66中任一项所述的种子，和交易所获得的种子以获得金钱。
80.如权利要求79所述的方法，其中获得所述种子包括栽培如权利要求48至54或66中任一项所述的植物，和/或从所述植物收获所述种子。
81.如权利要求80所述的方法，其中获得所述种子还包括将所述种子放在容器中和/或存储所述种子。
82.如权利要求79至81中任一项所述的方法，其中获得所述种子还包括将所述种子运输到不同的地点。
83.如权利要求79至82中任一项所述的方法，其中所述交易是使用诸如计算机等电子手段进行。
84.一种制造种子箱的方法，其包括：
a)对包含如权利要求56、57或66中任一项所定义的种子的植物地上部分进行捆晒、割晒和/或收割；
b)对所述植物部分进行脱粒和/或簸选，以分离所述种子与所述植物部分的其余部分；和
c)对步骤b)中所分离的种子进行筛选和/或拣选，且将经过筛选和/或拣选的种子装入箱中，从而产生种子箱。
85.一种用于产生多不饱和脂肪酸乙酯的方法，所述方法包括对提取的植物脂质中的三酰基甘油进行酯基转移，其中所提取的植物脂质包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％，从而产生所述乙酯。
在植物细胞中产生长链多不饱和脂肪酸
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 现在广泛认为ω3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)是关乎人类和动物健康的重要化合物。可从饮食来源或通过转化亚油酸(LA，18:2ω6)或α-亚麻酸(ALA，18:3ω3)脂肪酸来获得这些脂肪酸，这两种脂肪酸都被认为是人类饮食中的必需脂肪酸。尽管人类和许多其它脊椎动物能够将植物来源的LA或ALA转化成C22，但他们进行这种转化的速率很慢。此外，大多数现代社会的饮食不平衡，其中至少90％的多不饱和脂肪酸(PUFA)属于ω6脂肪酸，而不是理想的4:1或更低的ω6:ω3脂肪酸比例(Trautwein,2001)。对于人类来说，诸如二十碳五烯酸(EPA，20:5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6ω3)等LC-PUFA的直接饮食来源主要是来自鱼类或鱼油。因此，健康专家推荐将含有高水平LC-PUFA的鱼类常规纳入人类饮食中。举例来说，来源于鱼类的LC-PUFA油正越不越多地被掺入食品和婴儿配方食品中。然而，由于全球和国家渔业的下滑，需要找到这些有益健康的油类的替代来源。
[0004] 与动物相反，开花植物缺乏合成链长度大于18个碳的多不饱和脂肪酸的能力。确切地说，农作物和园艺植物以及其它被子植物不具有合成诸如EPA、二十二碳五烯酸(DPA，22:5ω3)和DHA等衍生自ALA的较长链ω3脂肪酸所需的酶。因此，植物生物技术中的一个重要目标是对能产生大量LC-PUFA的农作物植物进行工程改造，由此提供这些化合物的替代来源。
[0005] LC-PUFA生物合成途径
[0006] 诸如微藻类、苔藓和真菌等生物体中的LC-PUFA的生物合成通常是一系列氧依赖性去饱和反应和延长反应(图1)。这些生物体中产生EPA的最常见途径包括Δ6去饱和、Δ6延长和Δ5去饱和(称为Δ6去饱和途径)，而较不常见的途径则使用Δ9延长、Δ8去饱和与Δ5去饱和(称为Δ9去饱和途径)。这些连续的去饱和作用和延长反应可以如图1左上部分(ω6)示意性地显示从ω6脂肪酸底物LA开始，或如图1右下部分(ω3)所显示从ω3底物ALA开始，直到EPA。如果初始Δ6去饱和在ω6底物LA上进行，则该系列三种酶的LC-PUFA产物将是ω6脂肪酸ARA。合成LC-PUFA的生物体可以使用ω3-去饱和酶将ω6脂肪酸转化成ω3脂肪酸，如图1中所示的将花生四烯酸(ARA，20:4ω6)转化成EPA的Δ17-去饱和酶步骤。ω3-去饱和酶家族的一些成员可以作用于多种底物，从LA到ARA。
植物ω3-去饱和酶通常特异性催化由LA到ALA的Δ15去饱和，而真菌和酵母ω3-去饱和酶则可对由ARA到EPA的Δ17去饱和具有特异性(Pereira等,2004a；Zank等,2005)。
一些报告提出，可能存在可将多种ω6底物转化成其相应ω3产物的非特异性ω3-去饱和酶(Zhang等,2008)。
植物ω3-去饱和酶通常特异性催化由LA到ALA的Δ15去饱和，而真菌和酵母ω3-去饱和酶则可对由ARA到EPA的Δ17去饱和具有特异性(Pereira等,2004a；Zank等,2005)。
一些报告提出，可能存在可将多种ω6底物转化成其相应ω3产物的非特异性ω3-去饱和酶(Zhang等,2008)。
[0007] 在这些生物体中，通过EPA的Δ5延长产生DPA，随后通过Δ4去饱和产生DHA而将EPA转化成DHA(图1)。相反，哺乳动物则使用所谓的“Sprecher”途径，通过与Δ4-去饱和酶无关的3个独立的反应将DPA转化成DHA(Sprecher等,1995)。
[0008] 一般在植物、苔藓、微藻类和诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)等低等动物中发现的前端去饱和酶主要接受与磷脂酰胆碱(PC)底物的sn-2位置发生酯化的脂肪酸底物。这些去饱和酶因此称为酰基-PC脂质连接的前端去饱和酶(Domergue等,2003)。相反，高等动物前端去饱和酶一般接受酰基-CoA底物，其中所述脂肪酸底物连接于CoA而不是PC(Domergue等,2005)。已知一些微藻类去饱和酶和一种植物去饱和酶使用与CoA发生酯化的脂肪酸底物(表2)。
[0009] 各PUFA延长反应由多组分蛋白复合物催化的4个步骤组成：首先，缩合反应给脂肪酸添加来自丙二酰基-CoA的2C单元，导致形成β-酮酰基中间物。然后通过NADPH将这种中间物还原，随后脱水产生烯酰基中间物。最后第二次还原这种中间物，产生延长的脂肪酸。一般认为这4个反应的缩合步骤具有底物特异性，而其它步骤则不然。实际上，这意味着只要引入PUFA特异性缩合酶(典型地称为‘延长酶’)，天然植物延长机制就能够延长PUFA，但天然植物延长机制在延长非天然PUFA底物方面的效率可能较低。2007年公开了对酵母伸长循环脱水酶的鉴定并且表征(Denic和Weissman,2007)。
[0010] 在植物、苔藓和微藻类中，PUFA去饱和天然地发生在主要属于酰基-PC库的脂肪酸底物，而延长则发生在酰基-CoA库中的底物。脂肪酸从酰基-PC分子转移至CoA载体是通过磷脂酶(PLA)进行，而酰基-CoA脂肪酸转移至PC载体是通过溶血磷脂胆碱酰基转移酶(LPCAT)进行(图21)(Singh等,2005)。
[0011] 工程改造产生LC-PUFA
[0012] 大多数LC-PUFA代谢工程一直是使用需氧Δ6去饱和/延长途径来进行。1996年首次报告了使用得自蓝细菌集胞藻的Δ6-去饱和酶在烟草中生物合成γ-亚麻酸(GLA，18:3ω6)(Reddy和Thomas,1996)。最近，已经在诸如红花(种子油中含73％GLA；Knauf等,2006)和大豆(28％GLA；Sato等,2004)等农作物植物中产生了GLA。诸如EPA和DHA等LC-PUFA的产生由于涉及更多的去饱和与延长步骤数目而涉及更复杂的工程改造。Qi等(2004)首先报告了在陆生植物中产生EPA，其将编码来自于球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ9-延长酶、来自于小眼虫(Euglena gracilis)的Δ8-去饱和酶和来自于高山被孢霉(Mortierella alpina)的Δ5-去饱和酶的基因引入拟南芥中，产生多达3％的EPA。在这之后，Abbadi等(2004)报告了使用编码来自于小立碗藓(Physcomitrella patens)的Δ6-去饱和酶和Δ6-延长酶的基因和编码来自于三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的Δ5-去饱和酶的基因在亚麻种子中产生了多达0.8％的EPA。
[0013] WO 04/017467中首先报告了DHA产生，并且是迄今为止最高的VLC-PUFA产生水平，其中描述了通过引入编码异丝水霉(Saprolegnia diclina)Δ6-去饱和酶、高山被孢霉Δ6-去饱和酶、高山被孢霉Δ5-去饱和酶、异丝水霉Δ4-去饱和酶、异丝水霉Δ17-去饱和酶、高山被孢霉Δ6-延长酶和路氏巴夫藻(Pavlova lutheri)Δ5-延长酶的基因，在大豆胚而非种子中产生了3％的DHA。在也产生DHA的胚中，最高EPA水平是19.6％，表明EPA到DHA的转化效率低下(WO 2004/071467)。这一发现与Robert等(2005)发表的类似，后者的从EPA到DHA的流量低下，其使用斑马鱼Δ5/6-去饱和酶、秀丽隐杆线虫Δ6-延长酶和盐生巴夫藻(Pavlova salina)Δ5-延长酶和Δ4-去饱和酶在拟南芥中产生了3％EPA和0.5％DHA。同样在2005年，Wu等发表了使用畸雌腐霉(Pythium irregulare)Δ6-去饱和酶、破囊壶菌(Thraustochytrid)Δ5-去饱和酶、小立碗藓Δ6-延长酶、金盏花(Calendula officianalis)Δ12-去饱和酶、破囊壶菌Δ5-延长酶、致病疫霉(Phytophthora infestans)Δ17-去饱和酶、虹鳟鱼(Oncorhyncus mykiss)LC-PUFA延长酶、破囊壶菌Δ4-去饱和酶和破囊壶菌LPCAT在芥菜中产生了25％ARA、15％EPA和1.5％DHA(Wu等,2005)。Venegas-Caleron等(2010)和Ruiz-Lopez等(2012)中提供了对产生能合成ω3LC-PUFA的油料种子农作物的成果汇总。如Ruiz-Lopez等(2012)所指示，迄今为止针对在转基因植物中产生DHA所获得的结果远远不及鱼油中所见的水平。
[0014] 因此，仍需要在重组细胞中更有效地产生LC-PUFA，确切地说，在油料种子植物的种子中更有效地产生DHA。
[0015] 发明概述
[0017] 在第一方面，本发明提供了提取的植物脂质，其包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％。
[0018] 在一个实施方案中，所提取的脂质具有一个或多个或所有以下特征：
[0019] i)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的棕榈酸水平在约2％与18％之间、在约2％与16％之间，或在约2％与15％之间；
[0020] ii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的肉豆蔻酸(C14:0)水平小于约6％、小于约3％、小于约2％，或小于约1％；
[0021] iii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在约1％与约30％之间、在约3％与约30％之间、在约6％与约30％之间、在1％与约20％之间、在约30％与约60％之间、在约45％至约60％之间，或为约30％；
[0022] iv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在约4％与约35％之间、在约4％与约20％之间，或在约4％与17％之间；
[0023] v)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在约4％与约40％之间、在约7％与约40％之间、在约10％与约35％之间、在约20％与约35％之间、在约4％与约16％之间，或在约2％与约16％之间；
[0024] vi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的γ-亚麻酸(GLA)水平小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、在0.05％与约7％之间、在0.05％与约4％之间、在0.05％与约3％之间或在0.05％与约2％之间；
[0025] vii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的十八碳四烯酸(SDA)水平小于约7％、小于约6％、小于约4％、小于约3％、在约0.05％与约7％之间、在约0.05％与约6％之间、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间或在0.05％与约2％之间；
[0026] viii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳四烯酸(ETA)水平小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约1％、小于约0.5％、在约0.05％与约6％之间、在约0.05％与约5％之间、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间，或在约0.05％与约2％之间；
[0027] ix)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于约4％、小于约2％、小于约1％、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间、在约0.05％与约2％之间，或在约0.05％与约1％之间；
[0028] x)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳五烯酸(EPA)水平小于约4％、小于约3％、小于约2％、在约0.05％与约10％之间、在约0.05％与约5％之间、在约0.05％与约3％之间，或在约0.05％与约2％之间；
[0029] xi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十二碳五烯酸(DPA)水平小于约4％、小于约3％、小于约2％、在约0.05％与约8％之间、在约0.05％与约5％之间、在约0.05％与约3％之间，或在约0.05％与约2％之间；
[0030] xii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、在约8％与20％之间、在约10％与20％之间、在约11％与20％之间、在约10％与约16％之间，或在约14％与20％之间；
[0031] xiii)所述脂质在其脂肪酸含量中包含ω6-二十二碳五烯酸(22:5Δ4,7,10,13,16)；
[0032] xiv)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含ω6-二十二碳五烯酸Δ4,7,10,13,16
(22:5 )；
(22:5 )；
[0033] xv)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含SDA、EPA和ETA；
[0034] xvi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约25％之间、在约4％与约20％之间、在约6％与约20％之间、在约4％与约60％之间、在约30％与约60％之间，或在约45％与约60％之间；
[0035] xvii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约4％与约35％之间、在约8％与约25％之间或在8％与约22％之间；
[0036] xviii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约20％与约75％之间、在约50％与约75％之间，或在约60％与约75％之间；
[0037] xix)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸水平在约35％与约50％之间、在约20％与约35％之间、在约6％与20％之间、小于约20％、小于约16％、小于约10％、在约1％与约16％之间、在约2％与约10％之间，或在约4％与约10％之间；
[0038] xx)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平小于约10％、小于约8％、小于约6％、小于4％、在约1％与约20％之间、在约1％与约10％之间、在约0.5％与约
8％之间，或在约0.5％与4％之间；
8％之间，或在约0.5％与4％之间；
[0039] xxi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在36％与约65％之间、在约40％与约60％之间、在约20％与约35％之间、在约10％与约20％之间、为约25％、约30％、约35％或约40％；
[0040] xxii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在约9％与约33％之间、在约10％与约20％之间、在约20％与约30％之间、在约12％与约25％之间、为约13％、约15％、约17％或约20％；
[0041] xxiii)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约1.0与约3.0之间、在约0.1与约1之间、在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约1.0、约0.1或约0.2；
[0042] xxiv)所提取的脂质的脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约1.0与约3.0之间、在约0.1与约1之间、在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约0.1、约0.2或约1.0；
[0043] xxv)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ12-去饱和酶油酸到LA的转化效率为至少约60％、至少约70％、至少约80％、在约60％与约98％之间、在约70％与约95％之间，或在约75％与约90％之间；
[0044] xxvi)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ6-去饱和酶ALA到SDA的转化效率为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、在约30％与约70％之间、在约35％与约60％之间，或在约50％与约70％之间；
[0045] xxvii)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ6-延长酶SDA到ETA酸的转化效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、在约60％与约95％之间、在约70％与约88％之间，或在约75％与约85％之间；
[0046] xxviii)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ5-去饱和酶ETA到EPA的转化效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、在约60％与约99％之间、在约70％与约99％之间，或在约75％与约98％之间；
[0047] xxix)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ5-延长酶EPA到DPA的转化效率为至少约80％、至少约85％、至少约90％、在约50％与约95％之间，或在约85％与约95％之间；
[0048] xxx)所述脂质的脂肪酸组成是基于通过Δ4-去饱和酶DPA到DHA的转化效率为至少约80％、至少约90％、至少约93％、在约50％与约95％之间、在约80％与约95％之间，或在约85％与约95％之间；
[0049] xxxi)所述脂质的脂肪酸组成是基于油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约10％与约30％之间，或在约10％与约25％之间；
[0050] xxxii)所述脂质的脂肪酸组成是基于LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约20％、至少约22％、至少约25％、在约15％与约50％之间、在约20％与约40％之间，或在约20％与约30％之间；
[0051] xxxiii)所述脂质的脂肪酸组成是基于ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、在约17％与约55％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约35％之间；
[0052] xxxiv)所提取的脂质中的总脂肪酸具有小于1％的C20:1；
[0053] xxxv)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％、在约70％与约99％之间，或在约90％与约99％之间；
[0054] xxxvi)所述脂质包含二酰基甘油(DAG)；
[0055] xxxvii)所述脂质包含小于约10％、小于约5％、小于约1％，或在约0.001％与约5％之间的游离(未酯化)脂肪酸和/或磷脂，或基本上不含游离脂肪酸和/或磷脂；
[0056] xxxviii)至少70％或至少80％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上；
[0057] xxxix)所述脂质中最丰富的含DHA的TAG种类是DHA/18:3/18:3(TAG 58:12)；和[0058] xl)所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。
[0059] 在另一个实施方案中，所提取的脂质呈油形式，其中以重量计至少约90％或至少约95％、至少约98％或在约95％与约98％之间的油是所述脂质。
[0060] 在一个优选的实施方案中，所述脂质或油，优选为种子油，具有以下特征：在所述脂质或油的总脂肪酸含量中，DHA水平在约7％与20％之间；棕榈酸水平在约2％与约16％之间；肉豆蔻酸水平小于约6％；油酸水平在约1％与约30％之间；LA水平在约4％与约35％之间；ALA存在；GLA存在；SDA水平在约0.05％与约7％之间；ETA水平小于约4％；EPA水平在约0.05％与约10％之间；DPA水平在约0.05％与约8％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约25％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约4％与约35％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约20％与约75％之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.05与约3.0之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约0.03与约3.0之间，优选地小于约0.50；所述脂质的脂肪酸组成是基于：通过Δ12-去饱和酶油酸到LA的转化效率为至少约60％；通过Δ6-延长酶SDA到ETA酸的转化效率为至少约60％；通过Δ5-延长酶EPA到DPA的转化效率在约
50％与约95％之间；通过Δ4-去饱和酶DPA到DHA的转化效率在约50％与约95％之间；油酸到DHA的转化效率为至少约10％；且所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％；
且任选地所述脂质基本上不含胆甾醇和/或所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。
50％与约95％之间；通过Δ4-去饱和酶DPA到DHA的转化效率在约50％与约95％之间；油酸到DHA的转化效率为至少约10％；且所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％；
且任选地所述脂质基本上不含胆甾醇和/或所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。
[0061] 在一个更优选的实施方案中，所述脂质或油，优选为种子油，具有以下特征：在所述脂质的总脂肪酸含量中，DHA水平在约7％与20％之间；棕榈酸水平在约2％与约16％之间；肉豆蔻酸水平小于约2％；油酸水平在约1％与约30％之间；LA水平在约4％与约35％之间；ALA水平在约7％与约40％之间；GLA水平小于约4％；SDA水平在约0.05％与约7％之间；ETA水平小于约4％；ETrA水平在约0.05％与约4％之间；EPA水平在约0.05％与约10％之间；DPA水平在约0.05％与约8％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约25％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约4％与约35％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约
20％与约75％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平在约0.5％与约
10％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在36％与约75％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在约9％与约33％之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.05与约3.0之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约0.03与约3.0之间；
所述脂质的脂肪酸组成是基于：通过Δ12-去饱和酶油酸到LA的转化效率为至少约60％；
通过Δ6-延长酶SDA到ETA酸的转化效率为至少约60％；通过Δ5-去饱和酶ETA到EPA的转化效率为至少约60％；通过Δ5-延长酶EPA到DPA的转化效率在约50％与约95％之间；通过Δ4-去饱和酶DPA到DHA的转化效率在约50％与约95％之间；油酸到DHA的转化效率为至少约10％；LA到DHA的转化效率为至少约15％；ALA到DHA的转化效率为至少约17％；且所提取的脂质中的总脂肪酸含量具有小于1％的C20:1；所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％；所述脂质基本上不含胆甾醇且所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG
66:18)。优选地，所述脂质或油是芥花油和/或在其从植物或植物部分中提取之后未用酯基转移方法进行处理。在一个特定实施方案中，可以随后处理所述脂质或芥花油以便将所述油中的脂肪酸转化成烷基酯，诸如甲基或乙基酯。可以应用进一步处理以使所述脂质或油富含DHA。
20％与约75％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平在约0.5％与约
10％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在36％与约75％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在约9％与约33％之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.05与约3.0之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约0.03与约3.0之间；
所述脂质的脂肪酸组成是基于：通过Δ12-去饱和酶油酸到LA的转化效率为至少约60％；
通过Δ6-延长酶SDA到ETA酸的转化效率为至少约60％；通过Δ5-去饱和酶ETA到EPA的转化效率为至少约60％；通过Δ5-延长酶EPA到DPA的转化效率在约50％与约95％之间；通过Δ4-去饱和酶DPA到DHA的转化效率在约50％与约95％之间；油酸到DHA的转化效率为至少约10％；LA到DHA的转化效率为至少约15％；ALA到DHA的转化效率为至少约17％；且所提取的脂质中的总脂肪酸含量具有小于1％的C20:1；所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％；所述脂质基本上不含胆甾醇且所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG
66:18)。优选地，所述脂质或油是芥花油和/或在其从植物或植物部分中提取之后未用酯基转移方法进行处理。在一个特定实施方案中，可以随后处理所述脂质或芥花油以便将所述油中的脂肪酸转化成烷基酯，诸如甲基或乙基酯。可以应用进一步处理以使所述脂质或油富含DHA。
[0062] 在一个实施方案中，所述脂质或油，优选为种子油，具有以下特征：在所述脂质的总脂肪酸含量中，DHA水平在约7％与20％之间；棕榈酸水平在约2％与约16％之间；肉豆蔻酸水平小于约2％；油酸水平在约30％与约60％之间，优选地在约45％与约60％之间；LA水平在约4％与约20％之间；ALA水平在约2％与约16％之间；GLA水平小于约3％；SDA水平小于约3％；ETA水平小于约4％；ETrA水平小于约2％；EPA水平小于约4％；DPA水平小于约4％；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约25％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约30％与约60％之间，或在约40％与约60％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约
20％与约75％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平在约0.5％与约
10％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在约10％与约20％之间；
所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在约9％与约20％之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.05与约3.0之间，优选地小于约0.50；所提取的脂质的脂肪酸含量中新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约0.03与约3.0之间；所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％；所述脂质基本上不含胆甾醇；且所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG66:18)。优选地，所述脂质或油基本上不含SDA、EPA和ETA和/或在其从植物或植物部分中提取之后未用酯基转移方法进行处理。在一个特定实施方案中，可以随后处理所述脂质或芥花油以便将所述油中的脂肪酸转化成烷基酯，诸如甲基或乙基酯。可以应用进一步处理以使所述脂质或油富含DHA。
20％与约75％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平在约0.5％与约
10％之间；所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在约10％与约20％之间；
所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在约9％与约20％之间；所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.05与约3.0之间，优选地小于约0.50；所提取的脂质的脂肪酸含量中新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约0.03与约3.0之间；所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％；所述脂质基本上不含胆甾醇；且所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG66:18)。优选地，所述脂质或油基本上不含SDA、EPA和ETA和/或在其从植物或植物部分中提取之后未用酯基转移方法进行处理。在一个特定实施方案中，可以随后处理所述脂质或芥花油以便将所述油中的脂肪酸转化成烷基酯，诸如甲基或乙基酯。可以应用进一步处理以使所述脂质或油富含DHA。
[0063] 在另一个优选的实施方案中，所述脂质或油，优选为种子油，具有以下特征：在所述脂质或油的总脂肪酸含量中，DHA水平在约7％与20％之间；棕榈酸水平在约2％与约16％之间；肉豆蔻酸水平小于约6％；油酸水平在约1％与约30％之间；LA水平在约4％与约35％之间；ALA存在；GLA存在；SDA水平在约0.05％与约7％之间；ETA水平小于约6％；
EPA水平在约0.05％与约10％之间；DPA水平在约0.05％与约8％之间。
EPA水平在约0.05％与约10％之间；DPA水平在约0.05％与约8％之间。
[0064] 在另一个实施方案中，所提取的脂质还包含一种或多种甾醇，优选地为植物甾醇。
[0065] 在另一个实施方案中，所提取的脂质呈油形式且包含小于约10mg甾醇/g油、小于约7mg甾醇/g油、在约1.5mg与约10mg之间的甾醇/g油或在约1.5mg与约7mg之间的甾醇/g油。
[0066] 可在所提取的脂质中的甾醇的实例包括但未必限于菜油甾醇/24-甲基胆甾醇、Δ5-豆甾醇、齿孔醇、β-谷甾醇/24-乙基胆甾醇、Δ5-燕麦甾醇/异岩藻甾醇、Δ7-豆甾醇/豆甾-7-烯-3β-醇和Δ7-燕麦甾醇中的一种或多种或全部。
[0067] 在一个实施方案中，所述植物种类是表26中所列出的植物种类，诸如芥花，且甾醇水平与表26中针对该特定植物种类所列出的大约相同。
[0068] 在一个实施方案中，所提取的脂质包含小于约0.5mg胆甾醇/g油、小于约0.25mg胆甾醇/g油、在约0mg与约0.5mg之间的胆甾醇/g油，或在约0mg与约0.25mg之间的胆甾醇/g油，或其基本上不含胆甾醇。
[0069] 在另一个实施方案中，所述脂质是油，优选为得自于油料种子的油。所述油类的实例包括但不限于诸如芥花油等芸苔属植物油、陆地棉油、亚麻油、向日葵属植物油、红花油、毛豆油、玉米油、拟南芥油、二色高粱油、甜高粱油、燕麦油、车轴草属植物油、油棕油、本氏烟油、大麦油、狭叶羽扇豆油、水稻油、光稃稻油、亚麻荠油、深海两节荠油、巨银草油或中国芒油。
[0070] 还提供了提取的植物脂质，优选为提取的芥花籽油，其包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包含亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所述脂质在脂质的总脂肪酸含量方面具有以下特征：
[0071] i)DHA水平为约3％、约4％、约5％、约6％或约7％；
[0072] ii)棕榈酸水平在约2％与约16％之间；
[0073] iii)肉豆蔻酸水平小于约2％；
[0074] iv)油酸水平在约30％与约60％之间，优选地在约45％与约60％之间；
[0075] v)LA水平在约4％与约20％之间；
[0076] vi)ALA水平在约2％与约16％之间；
[0077] vii)GLA水平小于约4％；
[0078] viii)SDA水平小于约6％或小于约4％；
[0079] ix)ETA水平小于约6％或小于约4％；
[0080] x)ETrA水平小于约1％；
[0081] xi)EPA水平小于约10％和/或EPA水平是DHA水平的0.5-2.0倍；
[0082] xii)DPA水平小于约4％；
[0083] xiii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约25％之间；
[0084] xiv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约30％与约70％之间；
[0085] xv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约15％与约75％之间，优选地在约15％与约30％之间；
[0086] xvi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平在约0.5％与约10％之间；
[0087] xvii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在约10％与约20％之间；
[0088] xviii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在约3％与约20％之间；
[0089] xix)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.05与约3.0之间，优选小于约0.50；
[0090] xx)所提取的脂质的脂肪酸含量中新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约0.03与约3.0之间；
[0091] xxi)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％，且
[0092] xxii)所述脂质基本上不含胆甾醇。在一个实施方案中，所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。更优选地，所述脂质基本上不含SDA和ETA，和/或在其从植物或植物部分中提取之后未用酯基转移方法进行处理。
[0093] 在另一个方面，提供了一种提取的植物脂质，其包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包含亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，和十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中(i)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平在7％与20％之间；(ii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的棕榈酸水平在2％与16％之间；(iii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的肉豆蔻酸(C14:0)水平小于约
6％；(iv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在1％与30％之间或在30％与60％之间；(v)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在4％与35％之间；(vi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在4％与40％之间；(vii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于约4％；(viii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在4％与25％之间；(ix)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在1.0与3.0之间或在0.1与1之间；(x)所述脂质
的三酰基甘油(TAG)含量为至少70％；且(xi)至少70％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上。在一个实施方案中，一个或多个或所有以下特征：
6％；(iv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在1％与30％之间或在30％与60％之间；(v)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在4％与35％之间；(vi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在4％与40％之间；(vii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于约4％；(viii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在4％与25％之间；(ix)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在1.0与3.0之间或在0.1与1之间；(x)所述脂质
的三酰基甘油(TAG)含量为至少70％；且(xi)至少70％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上。在一个实施方案中，一个或多个或所有以下特征：
[0094] i)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的棕榈酸水平在2％与15％之间；
[0095] ii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的肉豆蔻酸(C14:0)水平小于1％；
[0096] iii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在约3％与约30％之间、在约6％与约30％之间、在1％与约20％之间、在约45％与约60％之间或为约30％；
[0097] iv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在约4％与约20％之间，或在约4％与17％之间；
[0098] v)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在约7％与约40％之间、在约10％与约35％之间、在约20％与约35％之间或在约4％与16％之间；
[0099] vi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的γ-亚麻酸(GLA)水平小于4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、在0.05％与7％之间、在0.05％与4％之间或在
0.05％与约3％之间或在0.05％与约2％之间；
0.05％与约3％之间或在0.05％与约2％之间；
[0100] vii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的十八碳四烯酸(SDA)水平小于约4％、小于约3％、在约0.05％与约7％之间、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
[0101] viii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳四烯酸(ETA)水平小于约4％、小于约1％、小于约0.5％、在约0.05％与约5％之间、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间，或在约0.05％与约2％之间；
[0102] ix)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于约2％、小于约1％、在0.05％与4％之间、在0.05％与3％之间，或在0.05％与约2％之间，或在0.05％与约1％之间；
[0103] x)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳五烯酸(EPA)水平小于4％、小于约3％、小于约2％、在0.05％与10％之间、在0.05％与5％之间，或在0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
[0104] xi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十二碳五烯酸(DPA)水平小于4％、小于约3％、小于约2％、在0.05％与8％之间、在0.05％与5％之间，或在0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
[0105] xii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、在约8％与20％之间、在约10％与20％之间、在约11％与20％之间、在约10％与约16％之间，或在约14％与20％之间；
[0106] xiii)所述脂质在其脂肪酸含量中包含ω6-二十二碳五烯酸(22:5Δ4,7,10,13,16)；
[0107] xiv)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含ω6-二十二碳五烯酸Δ4,7,10,13,16
(22:5 )；
(22:5 )；
[0108] xv)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含SDA、EPA和ETA；
[0109] xvi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约20％之间，或在约6％与约20％之间；
[0110] xvii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约4％与约35％之间、在约8％与约25％之间，或在8％与约22％之间；
[0111] xviii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约20％与约75％之间、在约50％与约75％之间，或在约60％与约75％之间；
[0112] xix)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸水平在约35％与约50％之间、在约20％与约35％之间、在约6％与20％之间、小于20％、小于约16％、小于约10％、在约1％与约16％之间、在约2％与约10％之间，或在约4％与约10％之间；
[0113] xx)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平小于约10％、小于约8％、小于约6％、小于4％、在约1％与约20％之间、在约1％与约10％之间、在约0.5％与约
8％之间，或在约0.5％与4％之间；
8％之间，或在约0.5％与4％之间；
[0114] xxi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在36％与约65％之间、在40％与约60％之间、在约20％与约35％之间、在约10％与约20％之间、为约25％、约30％、约35％或约40％；
[0115] xxii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在9％与约33％之间、在约10％与约20％之间、在约20％与约30％之间、在约12％与约25％之间、为约13％、约15％、约17％或约20％；
[0116] xxiii)所提取的脂质的脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约
1.0、约0.1或约0.2；
1.0、约0.1或约0.2；
[0117] xxiv)所提取的脂质的脂肪酸含量中新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约1.0与约3.0之间、在约0.1与约1之间、在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约0.1、约0.2或约1.0；
[0118] xxv)所述脂质的脂肪酸组成是基于油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约10％与约30％之间，或在约10％与约25％之间；
[0119] xxvi)所述脂质的脂肪酸组成是基于LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约20％、至少约22％、至少约25％、在约15％与约50％之间、在约20％与约40％之间，或在约
20％与约30％之间；
20％与约30％之间；
[0120] xxvii)所述脂质的脂肪酸组成是基于ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、在约17％与约55％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约35％之间；
[0121] xxviii)所提取的脂质中的总脂肪酸具有小于1％的C20:1；
[0122] xxix)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约80％、至少约90％、至少95％、在约70％与约99％之间，或在约90％与约99％之间；
[0123] xxx)所述脂质包含二酰基甘油(DAG)；
[0124] xxxi)所述脂质包含小于约10％、小于约5％、小于约1％，或在约0.001％与约5％之间的游离(未酯化)脂肪酸和/或磷脂，或基本上不含游离脂肪酸和/或磷脂；
[0125] xxxii)至少80％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上；
[0126] xxxiii)所述脂质中最丰富的含DHA的TAG种类是DHA/18:3/18:3(TAG 58:12)；和
[0127] xxxiv)所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。
[0128] 关于以上方面，在一个实施方案中，
[0129] i)所述脂质呈油形式，其中所述油包含一种或多种甾醇，诸如菜油甾醇、Δ5-豆甾醇、齿孔醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麦甾醇、Δ7-豆甾醇和Δ7-燕麦甾醇中的一种或多种或全部，且任选地，所述油包含小于10mg甾醇/g油和/或所述油基本上不含胆甾醇；和/或[0130] ii)所述脂质呈得自于油料种子的油形式，诸如油料种子是芸苔属植物油料种子或芥花种子。
[0131] 在另一个方面，本发明提供了一种用于产生提取的植物脂质的方法，其包含以下步骤：
[0132] i)获得包含脂质的植物部分，所述脂质包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括二十碳五烯酸(EPA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所述植物部分中的可提取脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％；和
[0133] ii)从所述植物部分提取脂质，
[0134] 其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％。
[0135] 在一个优选的实施方案中，所提取的脂质具有以上定义的特征中的一个或多个。
[0136] 在一个实施方案中，其中所述植物部分是种子，优选为油料种子。
[0137] 所述种子的实例包括但不限于芸苔属种子、陆地棉种子、亚麻种子、向日葵属种子、红花种子、毛豆种子、玉米种子、拟南芥种子、二色高粱种子、甜高粱种子、燕麦种子、车轴草属种子、油棕种子、本氏烟种子、大麦种子、狭叶羽扇豆种子、水稻种子、光稃稻种子、亚麻荠种子或深海两节荠种子，优选为油菜种子、芥菜种子或亚麻荠种子。
[0138] 在另一个实施方案中，所述种子包含至少约18mg、至少约22mg、至少约26mg、在约18mg与约100mg之间、在约22mg与约70mg之间，或在约24mg与约50mg之间的DHA/g种子。
[0139] 在另一个实施方案中，所述植物部分包含编码以下酶集合之一的外源多核苷酸：
[0140] i)ω3-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0141] ii)Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0142] iii)Δ12-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0143] iv)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0144] v)ω3-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
[0145] vi)Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
[0146] vii)Δ12-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；或
[0147] viii)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
[0148] 且其中各多核苷酸可操作地连接于一个或多个能够指导所述多核苷酸在所述植物部分的细胞中表达的启动子。
[0149] 在另一个实施方案中，所述植物部分具有一个或多个或所有以下特征：
[0150] i)所述Δ12-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将油酸转化成亚油酸，其效率为至少约60％、至少约70％、至少约80％、在约60％与约98％之间、在约70％与约95％之间，或在约75％与约90％之间；
[0151] ii)所述ω3-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将ω6脂肪酸转化成ω3脂肪酸，其效率为至少约65％、至少约75％、至少约85％、在约65％与约95％之间、在约75％与约95％之间，或在约80％与约95％之间；
[0152] iii)所述Δ6-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将ALA转化成SDA，其效率为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、在约30％与约70％之间、在约35％与约60％之间，或在约50％与约70％之间；
[0153] iv)所述Δ6-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将亚油酸转化成γ-亚麻酸，其效率小于约5％、小于约2.5％、小于约1％、在约0.1％与约5％之间、在约0.5％与约2.5％之间，或在约0.5％与约1％之间；
[0154] v)所述Δ6-延长酶在所述植物的一个或多个细胞中将SDA转化成ETA，其效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、在约60％与约95％之间、在约70％与约88％之间，或在约75％与约85％之间；
[0155] vi)所述Δ5-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将ETA转化成EPA，其效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、在约60％与约99％之间、在约70％与约99％之间，或在约75％与约98％之间；
[0156] vii)所述Δ5-延长酶在所述植物的一个或多个细胞中将EPA转化成DPA，其效率为至少约80％、至少约85％、至少约90％、在约50％与约95％之间，或在约85％与约95％之间；
[0157] viii)所述Δ4-去饱和酶在所述植物的一个或多个细胞中将DPA转化成DHA，其效率为至少约80％、至少约90％、至少约93％、在约50％与约95％之间、在约80％与约95％之间，或在约85％与约95％之间；
[0158] ix)在所述植物部分的一个或多个细胞中，油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约10％与约30％之间，或在约10％与约25％之间；
[0159] x)在所述植物部分的一个或多个细胞中，LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约20％、至少约22％、至少约25％、在约15％与约50％之间、在约20％与约40％之间，或在约20％与约30％之间；
[0160] xi)在所述植物部分的一个或多个细胞中，ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、在约17％与约55％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约35％之间；
[0161] xii)所述植物部分的一个或多个细胞所包含的ω3脂肪酸比缺乏外源多核苷酸的相应细胞多出至少约15％、至少约20％、在约15％与约30％之间，或在约22.5％与约27.5％之间；
[0162] xiii)相对于亚油酸(LA)，所述Δ6-去饱和酶优先对α-亚麻酸(ALA)进行去饱和化；
[0163] xiv)所述Δ6-延长酶还具有Δ9-延长酶活性；
[0164] xv)所述Δ12-去饱和酶还具有Δ15-去饱和酶活性；
[0165] xvi)所述Δ6-去饱和酶还具有Δ8-去饱和酶活性；
[0166] xvii)所述Δ8-去饱和酶还具有Δ6-去饱和酶活性或不具有Δ6-去饱和酶活性；
[0167] xviii)所述Δ15-去饱和酶还对GLA具有ω3-去饱和酶活性；
[0168] xix)所述ω3-去饱和酶还对LA具有Δ15-去饱和酶活性；
[0169] xx)所述ω3-去饱和酶能对LA和/或GLA进行去饱和化；
[0170] xxi)相对于LA，所述ω3-去饱和酶优先对GLA进行去饱和化；
[0171] xxii)所述植物部分中的DHA水平是基于所述植物部分中油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约15％与约30％之间，或在约20％与约25％之间；
[0172] xxiii)所述植物部分中的DHA水平是基于所述植物部分中LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约20％、至少约22％、在约15％与约60％之间、在约20％与约40％之间，或在约22％与约30％之间；
[0173] xxiv)所述植物部分中的DHA水平是基于所述植物部分中ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、在约17％与约65％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约35％之间
[0174] xxx)所述去饱和酶中的一种或多种或全部对酰基-CoA底物的活性高于对相应的酰基PC底物的活性；
[0175] xxxi)所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA的Δ6-去饱和酶活性高于对LA的Δ6-去饱和酶活性；
[0176] xxxii)所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6-去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的Δ6-去饱和酶活性；
[0177] xxxiii)与LA相比，所述Δ6-去饱和酶对作为底物的ALA具有高至少约2倍Δ6-去饱和酶活性、至少3倍活性、至少4倍活性或至少5倍活性；
[0178] xxxiv)所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的活性大于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的活性；
[0179] xxxv)与作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA相比，所述Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA具有高至少约5倍Δ6-去饱和酶活性或至少10倍活性；
[0180] xxxvi)所述去饱和酶是前端去饱和酶；
[0181] xxxvii)所述Δ6-去饱和酶对ETA不具有可检测的Δ5-去饱和酶活性。
[0182] 在另一个实施方案中，所述植物部分具有一个或多个或所有以下特征：
[0184] ii)所述ω3-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:12中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:12具有至少50％同一性的氨基酸序列；
[0185] iii)所述Δ6-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:16中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:16具有至少50％同一性的氨基酸序列；
[0186] iv)所述Δ6-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:25中所提供的序列、其生物学活性片段(诸如SEQ ID NO:26)或与SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:26具有至少50％同一性的氨基酸序列；
[0187] v)所述Δ5-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:30中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:30具有至少50％同一性的氨基酸序列；
[0188] vi)所述Δ5-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:37中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:37具有至少50％同一性的氨基酸序列；
[0189] vii)所述Δ4-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:41中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:41具有至少50％同一性的氨基酸序列。
[0190] 在一个实施方案中，所述植物部分还包含编码以下各项的外源多核苷酸：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)；单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)；甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAT)；1-酰基-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(LPAAT)，优选为可使用C22多不饱和脂肪酰基-CoA底物的LPAAT；酰基-CoA:溶血磷脂胆碱酰基转移酶(LPCAT)；磷脂酶A2(PLA2)；磷脂酶C(PLC)；磷脂酶D(PLD)；CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)；磷脂胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)；磷脂酰胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(PDCT)；酰基-CoA合成酶(ACS)；或其中两种或更多种的组合。
[0191] 在另一个实施方案中，所述植物部分还包含下调所述植物部分的细胞中的内源酶的产生和/或活性的引入突变或外源多核苷酸，所述内源酶选自FAE1、DGAT、MGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、诸如FATB等硫酯酶或Δ12去饱和酶或其中两种或更多种的组合。
[0192] 在另一个实施方案中，至少一个或所有的启动子是种子特异性启动子。在一个实施方案中，至少一个或所有的启动子是获自诸如油质蛋白等油生物合成或累积基因或获自诸如conlinin等种子存储蛋白基因。
[0193] 在另一个实施方案中，指导编码Δ4-去饱和酶和Δ5-延长酶的外源多核苷酸表达的启动子在所述启动子指导编码Δ12-去饱和酶和ω3-去饱和酶的外源多核苷酸表达之前在所述植物部分的正在发育的种子中引发所述多核苷酸表达或达到峰值表达。
[0194] 在另一个实施方案中，所述外源多核苷酸共价连接于被整合至所述植物部分的细胞的基因组中的DNA分子中，优选地T-DNA分子中，且优选地，其中所述被整合至所述植物部分的细胞的基因组中的DNA分子的数目为不超过1个、2个或3个，或为2个或3个。
[0195] 在另一个实施方案中，所述植物包含至少两种不同的外源多核苷酸，各外源多核苷酸编码Δ6-去饱和酶，所述Δ6-去饱和酶具有相同或不同的氨基酸序列。
[0196] 在另一个实施方案中，包含所述外源多核苷酸的植物部分的总油含量为缺乏所述外源多核苷酸的相应植物部分的总油含量的至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或在约50％与约80％之间。在这些实施方案中，最大油含量可为相应野生型植物部分的油含量的约100％。
[0197] 在另一个实施方案中，所述脂质呈油形式，优选为得自于油料种子的种子油，且其中以重量计至少约90％或至少约95％、至少约98％，或在约95％与约98％之间的所述脂质是三酰基甘油。
[0198] 在另一个实施方案中，所述方法还包括处理所述脂质以提高DHA水平，所述DHA水平呈占总脂肪酸含量的百分比形式。举例来说，所述处理是酯基转移。举例来说，可对诸如芥花油等脂质进行处理以便将所述油中的脂肪酸转化成烷基酯，诸如甲基或乙基酯，然后可以进行分级以使所述脂质或油富含DHA。
[0199] 此外，提供了一种用于产生提取的植物脂质的方法，其包括以下步骤：
[0200] i)获得包含脂质的植物部分，优选芥花种子，所述脂质包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括二十碳五烯酸(EPA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所述植物部分中的可提取脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约3％、约4％、约5％、约6％或约7％；和[0201] ii)从所述植物部分提取脂质，
[0202] 其中所提取的脂质在所述脂质的总脂肪酸含量方面具有以下特征：
[0203] i)DHA水平为约3％、约4％、约5％、约6％或约7％；
[0204] ii)棕榈酸水平在约2％与约16％之间；
[0205] iii)肉豆蔻酸水平小于约2％；
[0206] iv)油酸水平在约30％与约60％之间，优选在约45％与约60％之间；
[0207] v)LA水平在约4％与约20％之间；
[0208] vi)ALA水平在约2％与约16％之间；
[0209] vii)GLA水平小于约4％；
[0210] viii)SDA水平小于约6％或小于约4％；
[0211] ix)ETA水平小于约6％或小于约4％；
[0212] x)ETrA水平小于约1％；
[0213] xi)EPA水平小于约10％和/或EPA水平是DHA水平的0.5-2.0倍；
[0214] xii)DPA水平小于约4％；
[0215] xiii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约25％之间；
[0216] xiv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约30％与约70％之间；
[0217] xv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约15％与约75％之间，优选在约15％与约30％之间；
[0218] xvi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平在约0.5％与约10％之间；
[0219] xvii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在约10％与约20％之间；
[0220] xviii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在约3％与约20％之间；
[0221] xix)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.05与约3.0之间，优选小于约0.50；
[0222] xx)所提取的脂质的脂肪酸含量中新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约0.03与约3.0之间；
[0223] xxi)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约70％；且
[0224] xxii)所述脂质基本上不含胆甾醇。在一个实施方案中，所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。更优选地，所述脂质基本上不含SDA和ETA，和/或在其从所述植物或植物部分中提取之后未用酯基转移方法进行处理。
[0225] 还提供了一种用于产生提取的植物脂质的方法，其包括以下步骤i)获得包含脂质的植物部分，所述脂质包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，和十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中(i)其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平在7％与20％之间；(ii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的棕榈酸水平在2％与16％之间；(iii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的肉豆蔻酸(C14:0)水平小于约6％；(iv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在1％与30％之间或在30％与60％之间；(v)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在4％与35％之间；(vi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在4％与40％之间；(vii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于约4％；(viii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在4％与25％之间；(ix)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在1.0与3.0之间或在0.1与1之间；(x)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少70％；且(xi)至少70％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上。
[0226] ％，和
[0227] ii)从所述植物部分提取脂质，
[0228] 其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％。
[0229] 还提供了使用本发明方法产生的脂质或包含所述脂质的油。
[0230] 在另一个方面，本发明提供了一种用于产生多不饱和脂肪酸乙酯的方法，所述方法包括对提取的植物脂质中的三酰基甘油进行酯基转移，其中所提取的植物脂质包含呈酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％，从而产生所述乙酯。
[0231] 在一个优选的实施方案中，所提取的脂质具有以上所定义的特征中的一个或多个。
[0232] 在另一个方面，本发明提供了一种用于产生多不饱和脂肪酸乙酯的方法，所述方法包括对提取的植物脂质中的三酰基甘油进行酯基转移，其中所提取的植物脂质包含呈三酰基甘油形式的酯化脂肪酸，所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)和二十二碳六烯酸(DHA)，和十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种，其中(i)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约3％、约4％、约5％、约6％或在7％与20％之间；(ii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的棕榈酸水平在2％与16％之间；(iii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的肉豆蔻酸(C14:0)水平小于约6％；(iv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在1％与30％之间或在30％与60％之间；(v)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在4％与35％之间；(vi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在4％与40％之间；(vii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于约4％；(viii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在4％与25％之间；(ix)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在1.0与3.0之间或在0.1与1之间；(x)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少70％；且(xi)至少70％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上，从而产生所述乙酯。在一个实施方案中，所提取的植物脂质具有一个或多个或所有以下特征：
[0233] i)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的棕榈酸水平在2％与15％之间；
[0234] ii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的肉豆蔻酸(C14:0)水平小于1％；
[0235] xxxv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的油酸水平在约3％与约30％之间、在约6％与约30％之间、在1％与约20％之间、在约45％与约60％之间或为约30％；
[0236] xxxvi)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA)水平在约4％与约20％之间，或在约4％与17％之间；
[0237] xxxvii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的α-亚麻酸(ALA)水平在约7％与约40％之间、在约10％与约35％之间、在约20％与约35％之间，或在约4％与16％之间；
[0238] xxxviii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的γ-亚麻酸(GLA)水平小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、在0.05％与7％之间、在0.05％与4％之间，或在0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
[0239] xxxix)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的十八碳四烯酸(SDA)水平小于约4％、小于约3％、在约0.05％与约7％之间、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
[0240] xl)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳四烯酸(ETA)水平小于约4％、小于约1％、小于约0.5％、在约0.05％与约5％之间、在约0.05％与约4％之间、在约0.05％与约3％之间，或在约0.05％与约2％之间；
[0241] xli)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳三烯酸(ETrA)水平小于约2％、小于约1％、在0.05％与4％之间、在0.05％与3％之间，或在0.05％与约2％之间，或在0.05％与约1％之间；
[0242] xlii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十碳五烯酸(EPA)水平小于约4％、小于约3％、小于约2％、在0.05％与10％之间、在0.05％与5％之间，或在0.05％与约3％之间，或在0.05％与约2％之间；
[0243] xliii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的二十二碳五烯酸(DPA)水平小于约4％、小于约3％、小于约2％、在0.05％与8％之间、在0.05％与5％之间，或在0.05％与约
3％之间，或在0.05％与约2％之间；
3％之间，或在0.05％与约2％之间；
[0244] xliv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、在约8％与20％之间、在约10％与20％之间、在约11％与20％之间、在约10％与约16％之间，或在约14％与20％之间；
[0245] xlv)所述脂质在其脂肪酸含量中包含ω6-二十二碳五烯酸(22:5Δ4,7,10,13,16)；
[0246] xlvi)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含ω6-二十二碳五烯酸Δ4,7,10,13,16
(22:5 )；
(22:5 )；
[0247] xlvii)所述脂质在其脂肪酸含量中基本上不含SDA、EPA和ETA；
[0248] xlviii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总饱和脂肪酸水平在约4％与约20％之间，或在约6％与约20％之间；
[0249] xlix)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总单不饱和脂肪酸水平在约4％与约35％之间、在约8％与约25％之间，或在8％与约22％之间；
[0250] l)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总多不饱和脂肪酸水平在约20％与约75％之间、在约50％与约75％之间，或在约60％与约75％之间；
[0251] li)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω6脂肪酸水平在约35％与约50％之间、在约20％与约35％之间、在约6％与20％之间、小于20％、小于约16％、小于约10％、在约1％与约16％之间、在约2％与约10％之间，或在约4％与约10％之间；
[0252] lii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸水平小于约10％、小于约8％、小于约6％、小于4％、在约1％与约20％之间、在约1％与约10％之间、在约0.5％与约
8％之间，或在约0.5％与4％之间；
8％之间，或在约0.5％与4％之间；
[0253] liii)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的总ω3脂肪酸水平在36％与约65％之间、在40％与约60％之间、在约20％与约35％之间、在约10％与约20％之间、为约25％、约30％、约35％或约40％；
[0254] liv)所提取的脂质的总脂肪酸含量中的新ω3脂肪酸水平在9％与约33％之间、在约10％与约20％之间、在约20％与约30％之间、在约12％与约25％之间、为约13％、约15％、约17％或约20％；
[0255] lv)所提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约1.0、约0.1或约0.2；
[0256] lvi)所提取的脂质的脂肪酸含量中的新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率在约1.0与约3.0之间、在约0.1与约1之间、在约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、为约0.1、约0.2或约1.0；
[0257] lvii)所述脂质的脂肪酸组成是基于油酸到DHA的转化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、在约10％与约50％之间、在约10％与约30％之间，或在约10％与约25％之间；
[0258] lviii)所述脂质的脂肪酸组成是基于LA到DHA的转化效率为至少约15％、至少约20％、至少约22％、至少约25％、在约15％与约50％之间、在约20％与约40％之间，或在约20％与约30％之间；
[0259] lix)所述脂质的脂肪酸组成是基于ALA到DHA的转化效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、在约17％与约55％之间、在约22％与约35％之间，或在约24％与约35％之间；
[0260] lx)所提取的脂质中的总脂肪酸具有小于1％的C20:1；
[0261] lxi)所述脂质的三酰基甘油(TAG)含量为至少约80％、至少约90％、至少95％、在约70％与约99％之间，或在约90％与约99％之间；
[0262] lxii)所述脂质包含二酰基甘油(DAG)；
[0263] lxiii)所述脂质包含小于约10％、小于约5％、小于约1％，或在约0.001％与约5％之间的游离(未酯化)脂肪酸和/或磷脂，或基本上不含游离脂肪酸和/或磷脂；
[0264] lxiv)至少80％呈TAG形式的酯化DHA是在TAG的sn-1或sn-3位置上；
[0265] lxv)所述脂质中最丰富的含DHA的TAG种类是DHA/18:3/18:3(TAG 58:12)；和[0266] lxvi)所述脂质包含tri-DHA TAG(TAG 66:18)。
[0267] 关于上述方面，在一个实施方案中，以下各项中一项或多项或全部适用：
[0268] i)所述脂质呈油形式，其中所述油包含一种或多种甾醇，诸如菜油甾醇、Δ5-豆甾醇、齿孔醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麦甾醇、Δ7-豆甾醇和Δ7-燕麦甾醇中的一种或多种，且任选地，所述油包含小于10mg甾醇/g油和/或所述油基本上不含胆甾醇；
[0269] ii)所述脂质呈得自于油料种子的油形式，诸如油料种子是芸苔属植物油料种子或芥花种子；
[0270] iii)所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约3％、约4％、约5％、约6％或在7％与20％之间。
[0271] 在另一个方面，本发明提供了一种嵌合基因构建体，其按顺序包含第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因和第六基因，所述基因全部共价连接于单个DNA分子上，
[0272] 其中所述第一、第二和第三基因连接在一起作为第一基因簇，且所述第四、第五和第六基因连接在一起作为第二基因簇，
[0274] 其中各启动子独立地与其它启动子同一或不同，使得所述DNA分子包含3、4、5或6个不同的启动子，
[0275] 其中一个或多个或所有启动子相对于其可操作地连接的编码区而言是异源的，[0276] 其中所述第一基因的转录方向远离所述第三基因且与所述第三基因的转录方向相对，
[0277] 其中所述第四基因的转录方向远离所述第六基因且与所述第六基因的转录方向相对，
[0278] 其中所述第二基因的转录方向与所述第一基因或所述第三基因相同，
[0279] 其中所述第五基因的转录方向与所述第四基因或所述第六基因相同，
[0280] 其中所述第二基因的转录终止子和/或聚腺苷酸化区通过在约0.2与约3.0千碱基之间的第一间隔区与所述第一或第三基因中更接近者的启动子间隔开，
[0281] 其中所述第一基因簇通过在约1.0与约10.0千碱基之间的第二间隔区与所述第二基因簇间隔开，且
[0282] 其中所述第五基因的转录终止子和/或聚腺苷酸化区通过在约0.2与约3.0千碱基之间的第三间隔区与所述第四或第六基因中更接近者的启动子间隔开。
[0283] 在一个实施方案中，所述DNA分子包含第七基因，所述第七基因通过在约1.0与约10.0千碱基之间的间隔区与所述第一基因簇或所述第二基因簇中更接近者间隔开。
[0284] 在另一个实施方案中，所述DNA分子包含两个或更多个不同的转录终止子和/或聚腺苷酸化区。
[0285] 在另一个实施方案中，所述间隔区中至少一个包含基质连接区(MAR)。
[0286] 在另一个实施方案中，所述DNA分子包含侧接所述基因的右边界区和左边界区，并且是T-DNA分子。
[0287] 在另一个实施方案中，所述基因构建体是在农杆菌属细胞中或被整合至植物细胞的基因组中。
[0288] 在一个优选的实施方案中，所述基因中至少一个编码脂肪酸去饱和酶或脂肪酸延长酶。
[0289] 在另一个实施方案中，所述基因构建体包含编码如本文中所定义的酶集合的基因，和/或其中所述基因中的一个或多个编码如本文中所定义的酶。
[0290] 在另一个方面，本发明提供了一种分离和/或外源多核苷酸，其包含：
[0291] i)选自SEQ ID NO:1至9、11、14、18、22、23、28、34、35、39或45中任一者的核苷酸序列，和/或
[0292] ii)与SEQ ID NO:1至9、11、14、18、22、23、28、34、35、39或45中所述的序列中的一个或多个具有至少95％同一性或99％同一性的核苷酸序列。
[0293] 在一个特别优选的实施方案中，所述分离和/或外源多核苷酸包含：
[0294] i)SEQ ID NO:2的核苷酸序列；和/或
[0295] ii)与SEQ ID NO:2中所阐述的序列具有至少95％同一性或99％同一性的核苷酸序列。
[0296] 在另一个方面，本发明提供了一种载体或基因构建体，其包含本发明的多核苷酸和/或本发明的基因构建体。
[0297] 在一个实施方案中，选自SEQ ID NO:11、14、18、22、23、28、34、35、39或45中的任一个的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:11、14、18、22、23、28、34、35、39或45中所阐述的序列中的一个或多个具有至少95％同一性或99％同一性的核苷酸序列可操作地连接于启动子。
[0298] 在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含编码以下酶集合之一的外源多核苷酸：
[0299] i)ω3-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0300] ii)Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0301] iii)Δ12-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0302] iv)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；
[0303] v)ω3-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
[0304] vi)Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
[0305] vii)Δ12-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；或
[0306] viii)Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶或Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶；
[0307] 且其中各多核苷酸被可操作地连接于一个或多个能够指导所述多核苷酸在所述细胞中表达的启动子。
[0308] 在一个实施方案中，所述细胞包含如上文所定义的脂质，或其中所述去饱和酶或延长酶中的一种或多种或全部具有一个或多个如上文所定义的特征。
[0309] 在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含：
[0310] i)编码Δ12-去饱和酶的第一外源多核苷酸，其包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:10中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:10具有至少50％同一性的氨基酸序列；和
[0311] ii)编码ω3-去饱和酶的第二外源多核苷酸，其包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:12中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:12具有至少50％同一性的氨基酸序列，
[0312] 且其中各多核苷酸被可操作地连接于一个或多个能够指导所述多核苷酸在所述细胞中表达的启动子。
[0313] 在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸、本发明的基因构建体或本发明的载体或基因构建体中的一种或多种。
[0314] 在一个实施方案中，所述细胞是在植物中、在植物部分中和/或是成熟的植物种子细胞。
[0315] 在一个实施方案中，所述植物或植物种子分别是油料种子植物或油料种子。
[0316] 还提供了一种包含本发明的细胞的转基因非人生物体。优选地，所述转基因非人生物体是转基因植物，优选为油料种子植物或拟南芥。在一个实施方案中，所述植物是芸苔属植物，优选为油菜或芥菜或除拟南芥以外的植物。
[0317] 在另一个方面，本发明提供了一种油料种子植物，其包含：
[0318] a)其种子中的脂质，所述脂质包括呈酯化形式的脂肪酸；和
[0319] b)编码以下酶集合之一的外源多核苷酸：
[0320] i)Δ12-去饱和酶、真菌ω3-去饱和酶和/或真菌Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延长酶和Δ5-延长酶；或
[0321] ii)Δ12-去饱和酶、真菌ω3-去饱和酶和/或真菌Δ15-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶和Δ5-延长酶，
[0322] 其中各多核苷酸被可操作地连接于一种或多种能够指导所述多核苷酸在所述植物的正在发育的种子中表达的种子特异性启动子，其中所述脂肪酸包括油酸；棕榈酸；ω6脂肪酸，其包括亚油酸(LA)和γ-亚麻酸(GLA)；ω3脂肪酸，其包括α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，且任选地包括二十碳五烯酸(EPA)和/或二十碳四烯酸(ETA)，且其中所述脂质的总脂肪酸含量中的DHA水平为约7％至20％。
[0323] 油料种子植物的实例包括但不限于芸苔属植物、陆地棉、亚麻、向日葵属植物、红花、毛豆、玉米、拟南芥、二色高粱、甜高粱、燕麦、车轴草属植物、油棕、本氏烟、大麦、狭叶羽扇豆、水稻、光稃稻、亚麻荠或深海两节荠。在一个实施方案中，所述油料种子植物是芥花、毛豆、亚麻荠或拟南芥植物。在一个替代实施方案中，所述油料种子植物不是拟南芥。
[0324] 在一个实施方案中，所述去饱和酶中的一种或多种能够使用酰基-CoA底物。在一个优选实施方案中，Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶和Δ8-去饱和酶中的一种或多种在存在时能够使用酰基-CoA底物，优选为以下各项中的每一项：i)Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶和Δ4-去饱和酶；或ii)Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶和Δ8-去饱和酶能够使用酰基-CoA底物。在一个实施方案中，Δ12-去饱和酶和/或ω3-去饱和酶能够使用酰基-CoA底物。酰基-CoA底物优选为ALA-CoA、ETA-CoA、DPA-CoA、ETrA-CoA、LA-CoA、GLA-CoA或ARA-CoA。
[0325] 在一个实施方案中，所述植物的成熟收获种子的DHA含量为至少约28mg/g种子，优选为至少约32mg/g种子、至少约36mg/g种子、至少约40mg/g种子，更优选为至少约44mg/g种子或至少约48mg/g种子。最大DHA含量可为约80至约100mg/g种子或约80mg或约100mg/g种子。
[0326] 在另一个方面，本发明提供了一种油菜、芥菜或亚麻荠植物，其能够产生包含DHA的种子，其中所述植物的成熟收获种子的DHA含量为至少约28mg/g种子，优选为至少约32mg/g种子、至少约36mg/g种子、至少约40mg/g种子，更优选为至少约44mg/g种子或至少约48mg/g种子。最大DHA含量可为约80至约100mg/g种子或约80mg或约100mg/g种子。
[0327] 在另一个方面，本发明提供了包含所述外源多核苷酸的本发明植物的植物细胞。
[0328] 还提供了一种植物部分，优选为种子，其具有一个或多个以下特征：
[0329] i)来自于本发明的植物；
[0330] ii)包含如本文中所定义的脂质；
[0331] iii)可用于本发明方法中；
[0332] iv)包含本发明的基因构建体；或
[0333] v)包含如本文中所定义的外源多核苷酸集合。
[0334] 在另一个方面，本发明提供了成熟收获油菜、芥菜或亚麻荠种子，其包含DHA和以重量计在约4％与约15％之间的水分含量，其中所述种子的DHA含量为至少约28mg/g种子，优选为至少约32mg/g种子、至少约36mg/g种子、至少约40mg/g种子，更优选为至少约44mg/g种子或至少约48mg/g种子。最大DHA含量可为约80至约100mg/g种子或约80mg或约100mg/g种子。
[0335] 在一个实施方案中，本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分或本发明的种子可用于产生包含一个或多个或所有如本文中所定义的特征的提取脂质。
[0336] 在另一个方面，本发明提供了一种产生本发明的细胞的方法，所述方法包括：
[0337] a)将本发明的基因构建体、本发明的分离和/或外源多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、一个或多个本文中所定义的外源多核苷酸组合引入细胞中，优选地引入不能够合成LC-PUFA的细胞中；
[0338] b)任选地，在所述细胞中表达所述基因或多核苷酸；
[0339] c)任选地，分析所述细胞的脂肪酸组成；和
[0340] d)任选地，选择表达所述基因或多核苷酸的细胞。
[0341] 在一个实施方案中，所述细胞中的脂质具有一个或多个本文中所定义的特征。
[0342] 在另一个实施方案中，所述基因构建体、所述分离和/或外源多核苷酸、所述载体、所述基因构建体或外源多核苷酸组合被稳定地整合至所述细胞的基因组中。
[0343] 在另一个实施方案中，所述细胞是植物细胞，且所述方法还包括由步骤a)的细胞再生出转化植物的步骤。
[0344] 在另一个实施方案中，所述基因和/或外源多核苷酸被瞬时表达于所述细胞中。
[0345] 还提供了一种使用本发明方法产生的细胞。
[0346] 在另一个方面，本发明提供了一种产生种子的方法，所述方法包括：
[0347] a)种植本发明的植物或产生如本文中所定义的部分的植物，优选地种植在作为具有至少1000株这样的植物的群体的一部分的田地中或在以标准种植密度种植的至少1公顷面积中；
[0348] b)从所述植物收获种子；和
[0349] c)任选地，从所述种子提取脂质，优选地产生油，其中总DHA产量为至少60kg DHA/公顷。
[0350] 在一个实施方案中，本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子具有一个或多个以下特征：
[0351] i)所述油如本文中所定义；
[0352] ii)所述植物部分或种子能够用于本发明方法中；
[0353] iii)所述外源多核苷酸被包含在本发明的基因构建体中；
[0354] iv)所述外源多核苷酸包含本发明的外源多核苷酸；
[0355] v)所述植物细胞是本发明的细胞；且
[0356] vi)所述种子是根据本发明方法产生。
[0357] 在另一个方面，本发明提供了一种产生一种或多种脂肪酸去饱和酶和/或脂肪酸延长酶或一种或多种脂肪酸去饱和酶和一种或多种脂肪酸延长酶的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达本发明的基因构建体、本发明的分离和/或外源多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本文中所定义的一种或多种外源多核苷酸组合，优选在田地中的油料种子植物中的正在发育的油料种子中。
[0358] 在另一个方面，本发明提供了使用本发明的方法、由本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分、本发明的种子或本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子产生或获得的脂质或油。
[0359] 在一个实施方案中，所述脂质或油是通过从油料种子提取油而获得。得自于油料种子的油的实例包括但不限于芥花油(油菜、芜菁亚种)、芥子油(芥菜)、其它芸苔属植物油、葵花油(向日葵)、亚麻子油(亚麻)、大豆油(毛豆)、红花油(红花)、玉米油(玉米)、烟草油(普通烟草)、花生油(花生)、棕榈油、棉籽油(陆地棉)、椰子油(椰子)、鳄梨油(鳄梨)、橄榄油(橄榄)、腰果油(腰果)、夏威夷果油(夏威夷果)、杏仁油(巴旦杏)或拟南芥种子油(拟南芥)。
[0360] 在另一个方面，本发明提供了使用本发明的方法、由本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分、本发明的种子或本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子产生或获得的脂肪酸。优选地，所述脂肪酸是DHA。所述脂肪酸可呈具有如本文中所描述的脂肪酸组成的脂肪酸混合物形式。在一个实施方案中，所述脂肪酸未酯化。
[0361] 还提供了由本发明的种子获得的种子粕。优选的种子粕包括但未必限于油菜、芥菜、亚麻荠或毛豆种子粕。在一个实施方案中，所述种子粕包含如本文中所定义的外源多核苷酸和/或基因构建体。
[0362] 在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的脂质或油、本发明的脂肪酸、本发明的基因构建体、本发明的分离和/或外源多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子，或本发明的种子粕中的一种或多种。在实施方案中，所述组合物包含适用于药物、食物或农业用途的载剂、种子处理化合物、肥料、另一种食物或饲料成分，或添加的蛋白质或维生素。
[0363] 还提供了饲料、化妆品或化学品，其包含本发明的脂质或油、本发明的脂肪酸、本发明的基因构建体、本发明的分离和/或外源多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子、本发明的种子粕或本发明的组合物中的一种或多种。
[0364] 在另一个方面，本发明提供了一种生产饲料的方法，所述方法包括将本发明的脂质或油、本发明的脂肪酸、本发明的基因构建体、本发明的分离和/或外源多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子、本发明的种子粕或本发明的组合物中的一种或多种与至少一种其它食物成分混合。
[0365] 在另一个方面，本发明提供了一种治疗或预防将受益于PUFA的病状的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的脂质或油、本发明的脂肪酸、本发明的基因构建体、本发明的分离和/或外源多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子、本发明的种子粕、本发明的组合物或本发明的饲料中的一种或多种。
[0366] 将受益于PUFA的病状的实例包括但不限于心律不齐、血管成形术、炎症、哮喘、牛皮癣、骨质疏松症、肾结石、AIDS、多发性硬化、类风湿性关节炎、克罗恩病、精神分裂症、癌症、胎儿酒精综合症、注意缺陷多动障碍、囊性纤维化、苯丙酮酸尿症、单相抑郁、攻击性敌对情绪、肾上腺脑白质营养不良、冠心病、高血压、糖尿病、肥胖、阿茲海默病、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、血管成形术后再狭窄、湿疹、高血压、血小板凝聚、胃肠出血、子宫内膜异位、经前期综合征、肌痛性脑脊髓炎、病毒感染后慢性疲劳或眼病。
[0367] 还提供了本发明的脂质或油、本发明的脂肪酸、本发明的基因构建体、本发明的分离和/或外源多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的细胞、本发明的转基因生物体、本发明的油料种子植物、本发明的油菜、芥菜或亚麻荠植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的植物、植物细胞、植物部分或种子、本发明的种子粕、本发明的组合物或本发明的饲料中的一种或多种的用途，其用于制造用来治疗或预防将受益于PUFA的病状的药物。所述药物的制造可包括将本发明的油与药学上可接受的载剂混合，以用于治疗如本文中所描述的病状。所述方法可包括首先对所述油进行纯化和/或酯基转移，和/或对所述油进行分级以增加DHA水平。在一个特定实施方案中，所述方法包括处理所述脂质或油，诸如芥花油，以便将所述油中的脂肪酸转化成烷基酯，诸如甲基或乙基酯。可以应用诸如分级或蒸馏等进一步处理以使所述脂质或油富含DHA。在一个优选实施方案中，所述药物包含DHA乙酯。在一个甚至更优选的实施方案中，所述药物中的DHA乙酯水平在30％与50％之间。所述药物还可以包含EPA乙酯，诸如在所述药物的总脂肪酸含量的30％与50％之间。所述药物适合施用于人类或动物受试者，以便治疗如本文中所描述的医学病状。
[0368] 在另一个方面，本发明提供了一种交易种子的方法，其包括获得本发明的种子，和交易所获得的种子以获得金钱。
[0369] 在一个实施方案中，获得所述种子包括栽培本发明的植物和/或从所述植物收获所述种子。
[0370] 在另一个实施方案中，获得所述种子还包括将所述种子放在容器中和/或存储所述种子。
[0371] 在另一个实施方案中，获得所述种子还包括将所述种子运输到不同的地点。
[0372] 在另一个实施方案中，所述方法还包括在交易所述种子之后将所述种子运输到不同的地点。
[0373] 在另一个实施方案中，所述交易是使用诸如计算机等电子手段进行。
[0374] 在另一个方面，本发明提供了一种生产种子箱的方法，其包括：
[0375] a)对包含本发明的种子的植物地上部分进行捆晒、割晒和/或收割；
[0376] b)对所述植物部分进行脱粒和/或簸选，以分离所述种子与所述植物部分的其余部分；和
[0377] c)对步骤b)中所分离的种子进行筛选和/或拣选，且将经过筛选和/或拣选的种子装入箱中，从而产生种子箱。
[0378] 在一个相关实施方案中，所述脂质或油，优选为本发明的或可用于本发明的种子油，具有大约如实例部分的表中所提供的脂肪水平，诸如表16的种子14。
[0379] 除非另外具体说明，否则本文中的任何实施方案将在采取必要的变更后应用于任何其它实施方案。
[0380] 本发明在范围上不受本文中所描述的具体实施方案限制，所述实施方案意在仅用于例证目的。如本文中所描述的功能等效产物、组合物和方法显然在本发明范围内。
[0383] 附图简述
[0384] 图1.需氧型DHA生物合成途径。
[0385] 图2.在pJP3416-GA7的左边界与右边界之间的T-DNA插入区的图。RB表示右边界；LB，左边界；TER，转录终止子/聚腺苷酸化区；PRO，启动子；编码区指示在箭头上方，启动子和终止子在箭头下方。Micpu-Δ6D，细小微胞藻(Micromonas pusilla)Δ6-去饱和酶；Pyrco-Δ6E，Pyramimonas cordataΔ6-延长酶；Pavsa-Δ5D，盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶；Picpa-ω3D，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)ω3-去饱和酶；Pavsa-Δ4D，盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶；Lackl-Δ12D，克鲁维郎香酵母(Lachancea kluyveri)Δ12-去饱和酶；Pyrco-Δ5E，Pyramimonas cordataΔ5-延长酶。NOS表示根癌农杆菌胭脂碱合成酶转录终止子/聚腺苷酸化区；FP1，油菜截短napin启动子；FAE1，拟南芥FAE1启动子；凝集素，毛豆凝集素转录终止子/聚腺苷酸化区；Cnl1和Cnl2表示亚麻conlinin1或conlinin2启动子或终止子。MAR表示来自于普通烟草的Rb7基质连接区。
[0386] 图3.在pJP3404的左边界与右边界之间的T-DNA插入区的图。标注如图2中。
[0387] 图4.在pJP3367的左边界与右边界之间的插入区的图。标注如图2中。
[0388] 图5.DHA水平，呈占得自于T2和T3两代中多个独立的转基因拟南芥种子的种子脂质中的总脂肪酸的百分比形式。加括号的T2事件被带到T3。示出了来自于Columbia和fad2突变拟南芥背景的事件。
[0389] 图6.得自于转基因拟南芥种子的脂质的油含量(w/w)对比DHA含量，呈占总脂肪酸含量的百分比形式。
[0390] 图7.代表性RT-PCR凝胶，其显示Δ6-去饱和酶基因相对于使用pJP3416-GA7转化的油菜胚的T-DNA中的其它转基因的低表达。各泳道从左侧起显示RT-PCR产物：1，DNA大小标记物；第2泳道，Δ12去饱和酶；第3泳道，ω3-去饱和酶；第4泳道，Δ6-去饱和酶(低表达)；第5泳道，Δ6-延长酶；第6泳道，Δ5-去饱和酶；第7泳道，Δ5-延长酶；第8泳道，Δ4-去饱和酶。
[0391] 图8.ALA百分比相对于油酸百分比的曲线图，各百分比为占获自转基因35S:LEC2油菜体细胞胚的脂质中的总脂肪酸的百分比。
[0392] 图9.通过NMR对A)金枪鱼油和B)转基因DHA拟南芥种子油的位置分布分析。标注‘DHA-α’的峰表示TAG的sn-1和sn-3位置上存在的DHA的量(在无位置偏好的情况下，这将等于总DHA的66％)，而标注‘DHA-β’的峰表示TAG的sn-2位置上存在的DHA的量(在无偏好的情况下，这将等于总DHA的33％)。
[0393] 图10.对转基因拟南芥的发育种子(灰色)和成熟种子(黑色)中的主要含DHA三酰基甘油种类的LC-MS分析。DHA之后的数字表示其它两种脂肪酸中的总碳原子数和总双键数。因此，DHA/34:1也可以指定为TAG 56:7等等。
[0394] 图11.在pORE04+11ABGBEC_豇豆_EPA_插入序列的左边界与右边界之间的T-DNA插入区的图。标注如图2中；SSU，拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚单位启动子。
[0395] 图12.二元载体pJP3364的图，其显示了候选Δ12-去饱和酶被克隆到其中的NotI限制位点。
[0396] 图13.使用SigmaPlot产生的箱线图，其显示脂肪酸20:4ω6(ARA)在用pFN045-pFN050转化的拟南芥T2种子群体的种子脂质中的百分比。各箱中距零最近的边界指示25百分位，各箱内的线标记中位数；而各箱中距零最远的边界指示75百分位。各箱上下所显示的误差线指示90百分位和10百分位。
[0397] 图14.平均ARA水平，呈占用pFN045-pFN050转化的拟南芥T2种子的种子脂质中的总脂肪酸含量的百分比形式。
[0398] 图15.箱线图，其显示脂肪酸20:2ω6(EDA)在用pFN045-pFN050转化的拟南芥T2种子群体的种子脂质中的百分比。该箱线图表示如图13中所描述的值。
[0399] 图16.箱线图，其显示ARA在用pFN045-pFN050转化的拟南芥T4种子群体的种子脂质中的百分比。该箱线图表示如图13中所描述的值。
[0400] 图17.平均ARA水平，呈占用pFN045-pFN050转化的拟南芥T4种子群体的种子脂质中的总脂肪酸含量的百分比形式。
[0401] 图18.箱线图，其显示EDA在用pFN045-pFN050转化的拟南芥T4种子群体的种子脂质中的百分比。该箱线图表示如图13中所描述的值。
[0402] 图19.(A)具有环和侧链编号的基本植物甾醇结构。(B)一些植物甾醇的化学结构。
[0403] 图20.已知LPAAT的系统树。
[0404] 图21.在PC、CoA库和TAG库之间转移脂肪酸的各种酰基交换酶。由Singh等(2005)改编而来。
[0406] SEQ ID NO:1-pJP3416-GA7核苷酸序列。
[0407] SEQ ID NO:2-pGA7-mod_B核苷酸序列。
[0408] SEQ ID NO:3-pGA7-mod_C核苷酸序列。
[0409] SEQ ID NO:4-pGA7-mod_D核苷酸序列。
[0410] SEQ ID NO:5-pGA7-mod_E核苷酸序列。
[0411] SEQ ID NO:6-pGA7-mod_F核苷酸序列。
[0412] SEQ ID NO:7-pGA7-mod_G核苷酸序列。
[0413] SEQ ID NO:8-pORE04+11ABGBEC_豇豆_EPA_插入核苷酸序列。
[0414] SEQ ID NO:9–用于在植物中表达克鲁维郎香酵母Δ12去饱和酶的密码子经优化开放阅读框。
[0415] SEQ ID NO:10-克鲁维郎香酵母Δ12-去饱和酶。
[0416] SEQ ID NO:11-用于在植物中表达巴斯德毕赤酵母ω3去饱和酶的密码子经优化开放阅读框。
[0417] SEQ ID NO:12-巴斯德毕赤酵母ω3去饱和酶。
[0418] SEQ ID NO:13-编码细小微胞藻Δ6-去饱和酶的开放阅读框。
[0419] SEQ ID NO:14-用于在植物中表达细小微胞藻Δ6-去饱和酶的密码子经优化开放阅读框(版本1)。
[0420] SEQ ID NO:15-用于在植物中表达细小微胞藻Δ6-去饱和酶的密码子经优化开放阅读框(版本2)。
[0421] SEQ ID NO:16-细小微胞藻Δ6-去饱和酶。
[0422] SEQ ID NO:17-编码绿色鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus)Δ6-去饱和酶的开放阅读框。
[0423] SEQ ID NO:18-用于在植物中表达绿色鞭毛藻Δ6-去饱和酶的密码子经优化开放阅读框。
[0424] SEQ ID NO:19-绿色鞭毛藻Δ6-去饱和酶
[0425] SEQ ID NO:20–青绿藻(Ostreococcus tauri)Δ6-去饱和酶。
[0426] SEQ ID NO:21-编码Pyramimonas cordataΔ6-延长酶的开放阅读框。
[0427] SEQ ID NO:22-用于在植物中表达Pyramimonas cordataΔ6-延长酶的密码子经优化开放阅读框。(在3'端截短且编码功能延长酶)(版本1)。
[0428] SEQ ID NO:23-用于在植物中表达Pyramimonas cordataΔ6-延长酶的密码子经优化开放阅读框。(在3'端截短且编码功能延长酶)(版本2)。
[0429] SEQ ID NO:24-用于在植物中表达Pyramimonas cordataΔ6-延长酶的密码子经优化开放阅读框。(在3'端截短且编码功能延长酶)(版本3)。
[0430] SEQ ID NO:25-Pyramimonas cordataΔ6-延长酶。
[0431] SEQ ID NO:26-截短Pyramimonas cordataΔ6-延长酶。
[0432] SEQ ID NO:27-编码盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶的开放阅读框。
[0433] SEQ ID NO:28-用于在植物中表达盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶的密码子经优化开放阅读框(版本1)。
[0434] SEQ ID NO:29-用于在植物中表达盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶的密码子经优化开放阅读框(版本2)。
[0435] SEQ ID NO:30-盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶。
[0436] SEQ ID NO:31–编码Pyramimonas cordataΔ5-去饱和酶的开放阅读框。
[0437] SEQ ID NO:32-Pyramimonas cordataΔ5-去饱和酶。
[0438] SEQ ID NO:33–编码Pyramimonas cordataΔ5-延长酶的开放阅读框。
[0439] SEQ ID NO:34-用于在植物中表达Pyramimonas cordataΔ5-延长酶的密码子经优化开放阅读框(版本1)。
[0440] SEQ ID NO:35-用于在植物中表达Pyramimonas cordataΔ5-延长酶的密码子经优化开放阅读框(版本2)。
[0441] SEQ ID NO:36-用于在植物中表达Pyramimonas cordataΔ5-延长酶的密码子经优化开放阅读框(版本3)。
[0442] SEQ ID NO:37-Pyramimonas cordataΔ5-延长酶。
[0443] SEQ ID NO:38-编码盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶的开放阅读框。
[0444] SEQ ID NO:39-用于在植物中表达盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶的密码子经优化开放阅读框(版本1)。
[0445] SEQ ID NO:40-用于在植物中表达盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶的密码子经优化开放阅读框(版本2)。
[0446] SEQ ID NO:41-盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶。
[0447] SEQ ID NO:42-编码球等鞭金藻Δ9-延长酶的开放阅读框。
[0448] SEQ ID NO:43-球等鞭金藻Δ9-延长酶。
[0449] SEQ ID NO:44-编码赫氏圆石藻(Emiliania huxleyi)CCMP1516Δ9-延长酶的开放阅读框。
[0450] SEQ ID NO:45-用于在植物中表达赫氏圆石藻Δ9-延长酶的密码子经优化开放阅读框。
[0451] SEQ ID NO 46-赫氏圆石藻CCMP1516Δ9-延长酶。
[0452] SEQ ID NO 47-编码Pavlova pinguisΔ9-延长酶的开放阅读框。
[0453] SEQ ID NO 48-Pavlova pinguisΔ9-延长酶。
[0454] SEQ ID NO 49-编码盐生巴夫藻Δ9-延长酶的开放阅读框。
[0455] SEQ ID NO 50-盐生巴夫藻Δ9-延长酶。
[0456] SEQ ID NO 51-编码盐生巴夫藻Δ8-去饱和酶的开放阅读框。
[0457] SEQ ID NO 52-盐生巴夫藻Δ8-去饱和酶。
[0458] SEQ ID NO 53-P19病毒抑制剂。
[0459] SEQ ID NO 54-V2病毒抑制剂。
[0460] SEQ ID NO 55-P38病毒抑制剂。
[0461] SEQ ID NO 56-Pe-P0病毒抑制剂。
[0462] SEQ ID NO 57-RPV-P0病毒抑制剂。
[0463] SEQ ID NO 58–编码P19病毒抑制剂的开放阅读框。
[0464] SEQ ID NO 59-编码V2病毒抑制剂的开放阅读框。
[0465] SEQ ID NO 60-编码P38病毒抑制剂的开放阅读框。
[0466] SEQ ID NO 61-编码Pe-P0病毒抑制剂的开放阅读框。
[0467] SEQ ID NO 62-编码RPV-P0病毒抑制剂的开放阅读框。
[0468] SEQ ID NO 63–拟南芥LPAAT2。
[0469] SEQ ID NO 64–白池花(Limnanthes alba)LPAAT。
[0470] SEQ ID NO 65-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LPAAT。
[0471] SEQ ID NO 66-细小微胞藻LPAAT。
[0472] SEQ ID NO 67-高山被孢霉LPAAT。
[0473] SEQ ID NO 68-油菜LPAAT。
[0474] SEQ ID NO 69–油菜LPAAT。
[0475] SEQ ID NO 70-致病疫霉ω3去饱和酶。
[0476] SEQ ID NO 71-假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)ω3去饱和酶。
[0477] SEQ ID NO 72-畸雌腐霉ω3去饱和酶。
[0478] 发明详述
[0479] 一般技术和定义
[0480] 除非另外具体说明，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都应该被视为具有与本领域(例如细胞培养、分子遗传学、脂肪酸合成、转基因植物、蛋白质化学和生物化学领域)技术人员通常所理解的含义相同的含义。
[0481] 除非另外指示，否则本发明中所利用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术都是本领域技术人员众所周知的标准程序。这样的技术在文献中有充分描述和解释，诸如以下来源：J.Perbal,A Practical Gu ide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)；J.Sambroo k 等 ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbou r Laboratory Press(1989)；T.A.Brown( 编 ),Essential Molecular Bi ology:A Practical Approach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编 ),DNA Cloning:A Practical Approach, 第1-4 卷,IRL Press(1995 和1996)；F.M.Ausubel 等 ( 编 ),Current P rotocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-I nterscience(1988，包括迄今的所有更新)；Ed Harlow和 David Lane( 编 ),Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labor atory,(1988)；和 J.E.Coligan 等 ( 编 ),Current Protocols in Immunolo gy,John Wiley&Sons(包括迄今的所有更新)。
[0482] 术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意味着“X和Y”或“X或Y”，并且将被视为明确支持两种含义或任一种含义。
[0483] 除非有相反说明，否则如本文中所使用，术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-1％。
[0484] 纵观本说明书，词语“包含”或变化形式应理解为暗示包括所述元件、整数或步骤或元件、整数或步骤的族群，而不排除任何其它元件、整数或步骤或元件、整数或步骤的族群。
[0486] 如本文中所使用，术语“提取的植物脂质”和“分离的植物脂质”是指例如通过粉碎从植物或其部分(诸如种子)中提取的脂质组合物。提取的脂质可以是通过例如粉碎植物种子而获得的相对粗制的组合物，或其中来源于所述植物材料的水、核酸、蛋白质和糖类中的一种或多种或每一种的大部分(如果不是全部)已经被去除的更纯组合物。以下描述了纯化方法的实例。在一个实施方案中，所提取或分离的植物脂质包含以组合物的重量计至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％(w/w)脂质。所述脂质在室温下可以是固体或液体，当为液体时，其被视为油。在一个实施方案中，本发明的提取脂质未掺有不是由另一种来源产生的诸如DHA(例如得自于鱼油的DHA)等另一种脂质。在一个实施方案中，在提取之后，油酸:DHA、棕榈酸:DHA、亚油酸:DHA和总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸中一项或多项或全部的比率当与完整种子或细胞中的比率相比时没有显著变化(例如，不大于10％或5％的变化)。在另一个实施方案中，所提取的植物脂质未暴露于诸如氢化或分级等程序，当与完整种子或细胞中的比率相比时，所述程序可能改变油酸:DHA、棕榈酸:DHA、亚油酸:DHA和总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸中一项或多项或全部的比率。当本发明的提取植物脂质包含在油中时，所述油还可能包含非脂肪酸分子，诸如甾醇。
[0487] 如本文中所使用，术语“提取的植物油”和“分离的植物油”是指包含提取的植物脂质或分离的植物脂质且在在室温下为液体的物质或组合物。所述油是获自植物或其部分，诸如种子。提取的或分离的油可以是通过例如粉碎植物种子而获得的相对粗制的组合物，或其中来源于所述植物材料的水、核酸、蛋白质和糖类中的一种或多种或每一种的大部分(如果不是全部)已经被去除的更纯组合物。所述组合物可以包含其它组分，所述其它组分可以是脂质或非脂质。在一个实施方案中，油组合物包含至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％(w/w)提取的植物脂质。在一个实施方案中，本发明的提取油未掺有不是由另一种来源产生的诸如DHA(例如得自于鱼油的DHA)等另一种油。在一个实施方案中，在提取之后，油酸:DHA、棕榈酸:DHA、亚油酸:DHA和总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸中一项或多项或全部的比率当与完整种子或细胞中的比率相比时没有显著变化(例如，不大于10％或5％的变化)。在另一个实施方案中，所提取的植物油未暴露于诸如氢化或分级等程序，当与完整种子或细胞中的比率相比时，所述程序可能改变油酸:DHA、棕榈酸:DHA、亚油酸:DHA和总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸中一项或多项或全部的比率。本发明的提取植物油可以包含非脂肪酸分子，诸如甾醇。
[0488] 如本文中所使用，“油”是主要包含脂质且在室温下为液体的组合物。举例来说，本发明的油优选包含以重量计至少75％、至少80％、至少85％或至少90％脂质。典型地，经纯化的油包含以所述油中的脂质的重量计为至少90％的三酰基甘油(TAG)。如本文中所描述，可能存在诸如二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、磷脂和甾醇等油的微量组分。
[0489] 如本文中所使用，术语“脂肪酸”是指通常具有长脂肪族尾部的饱和或不饱和羧酸(或有机酸)。典型地，脂肪酸具有碳-碳键合链，其长度为至少8个碳原子，更优选地长度为至少12个碳。大部分天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子，因为其生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以呈游离状态(非酯化)或呈酯化形式，诸如作为甘油三酯、二酰基甘油、单酰基甘油的部分、酰基-CoA(硫酯)结合形式或其它结合形式。所述脂肪酸可酯化为磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油形式。
[0490] “饱和脂肪酸”沿着链不含任何双键或其它官能团。术语“饱和”是指氢，其中所有的碳(除羧酸[-COOH]基以外)都含有尽可能多的氢。换句话说，ω端含有3个氢(CH3-)，而链内的各个碳含有2个氢(-CH2-)。
[0491] “不饱和脂肪酸”与饱和脂肪酸具有类似形式，但沿着链存在一个或多个烯烃官能团，各烯烃将链中的单键连接的“-CH2-CH2-”部分置换为双键连接的“-CH＝CH-”部分(即，一个碳与另一个碳双键连接)。链中结合于双键任一侧的下两个碳原子可以顺式或反式构型存在。
[0492] 如本文中所使用，术语“单不饱和脂肪酸”是指在其碳链中包含至少12个碳原子且在链中仅有一个烯烃基(碳-碳双键)的脂肪酸。如本文中所使用，术语“多不饱和脂肪酸”或“PUFA”是指在其碳链中包含至少12个碳原子和至少两个烯烃基(碳-碳双键)的脂肪酸。
[0493] 如本文中所使用，术语“长链多不饱和脂肪酸”和“LC-PUFA”是指在其碳链中包含至少20个碳原子和至少两个碳-碳双键的脂肪酸，且因此包括VLC-PUFA。如本文中所使用，术语“极长链多不饱和脂肪酸”和“VLC-PUFA”是指在其碳链中包含至少22个碳原子和至少三个碳-碳双键的脂肪酸。通常，脂肪酸碳链中的碳原子数是指非分支碳链。如果碳链是分支的，则碳原子数不包括侧基中的碳原子。在一个实施方案中，所述长链多不饱和脂肪酸是ω3脂肪酸，即从所述脂肪酸的甲基端开始在第三个碳-碳键中发生去饱和(碳-碳双键)。在另一个实施方案中，所述长链多不饱和脂肪酸是ω6脂肪酸，即从所述脂肪酸的甲基端开始在第六个碳-碳键中发生去饱和(碳-碳双键)。在另一个实施方案中，所述长链多不饱和脂肪酸是选自：花生四烯酸(ARA，20:4Δ5,8,11,14；ω6)、二十碳四烯酸(ETA，20:4Δ8,11,14,17；ω3)、二十碳五烯酸(EPA，20:5Δ5,8,11,14,17；ω3)、二十二碳五烯酸(DPA，22:5Δ7,10,13,16,19；ω3)或二十二碳六烯酸(DHA，22:6Δ4,7,10,13,16,19；
ω3)。LC-PUFA也可以是二高-γ-亚油酸(DGLA)或二十碳三烯酸(ETrA，20:3Δ11,14,17；
ω3)。显而易见，根据本发明产生的LC-PUFA可以是任何或所有上述各项的混合物，并且可包括其它LC-PUFA或这些LC-PUFA中任一种的衍生物。在一个优选实施方案中，所述ω3脂肪酸是至少DHA，优选地DPA和DHA，或EPA、DPA和DHA。
ω3)。LC-PUFA也可以是二高-γ-亚油酸(DGLA)或二十碳三烯酸(ETrA，20:3Δ11,14,17；
ω3)。显而易见，根据本发明产生的LC-PUFA可以是任何或所有上述各项的混合物，并且可包括其它LC-PUFA或这些LC-PUFA中任一种的衍生物。在一个优选实施方案中，所述ω3脂肪酸是至少DHA，优选地DPA和DHA，或EPA、DPA和DHA。
[0494] 此外，如本文中所使用，术语“长链多不饱和脂肪酸”和“极长链多不饱和脂肪酸”是指呈游离状态(非酯化)或呈酯化形式的脂肪酸，诸如作为甘油三酯、二酰基甘油、单酰基甘油的部分、酰基-CoA结合形式或其它结合形式。所述脂肪酸可酯化为磷脂，诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油形式。因而，LC-PUFA可以混合物形式存在于细胞脂质或从细胞、组织或生物体提取的经纯化油或脂质中。在优选实施方案中，本发明所提供的油包含至少75％或至少85％三酰基甘油，其余部分作为其它形式的脂质存在，诸如所提到的那些，其中至少包含LC-PUFA的所述三酰基甘油。所述油随后可被进一步纯化或处理，例如通过用强碱水解以释放游离脂肪酸，或通过蒸馏等等。
[0495] 如本文中所使用，“总ω6脂肪酸”或“总ω6脂肪酸含量”等等是指所提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子中所有ω6脂肪酸(酯化和非酯化)的总和，如上下文所测定，表达为占总脂肪酸含量的百分比。这些ω6脂肪酸包括(如果存在)LA、GLA、DGLA、ARA、EDA和ω6-DPA，且不包括任何ω3脂肪酸和单不饱和脂肪酸。
[0496] 如本文中所使用，“新ω6脂肪酸”或“新ω6脂肪酸含量”等等是指所提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子中除LA以外的所有ω6脂肪酸(酯化和非酯化)的总和，如上下文所测定，表达为占总脂肪酸含量的百分比。这些新ω6脂肪酸是通过表达引入细胞中的基因构建体(外源多核苷酸)而在本发明的细胞、植物、植物部分和种子中产生的脂肪酸，且包括(如果存在)GLA、DGLA、ARA、EDA和ω6-DPA，但不包括LA和任何ω3脂肪酸和单不饱和脂肪酸。示例性总ω6脂肪酸含量和新ω6脂肪酸含量是通过如实施例1中所描述将样品中的脂肪酸转化成FAME且利用GC进行分析来确定。
[0497] 如本文中所使用，“总ω3脂肪酸”或“总ω3脂肪酸含量”等等是指所提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子中所有ω3脂肪酸(酯化和非酯化)的总和，如上下文所测定，表达为占总脂肪酸含量的百分比。这些ω3脂肪酸包括(如果存在)ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA，且不包括任何ω6脂肪酸和单不饱和脂肪酸。
[0498] 如本文中所使用，“新ω3脂肪酸”或“新ω3脂肪酸含量”等等是指所提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子中除ALA以外的所有ω3脂肪酸(酯化和非酯化)的总和，如上下文所测定，表达为占总脂肪酸含量的百分比。这些新ω3脂肪酸是通过表达引入细胞中的基因构建体(外源多核苷酸)而在本发明的细胞、植物、植物部分和种子中产生的脂肪酸，且包括(如果存在)SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA，但不包括ALA和任何ω6脂肪酸和单不饱和脂肪酸。示例性总ω3脂肪酸含量和新ω3脂肪酸含量是通过如实施例1中所描述将样品中的脂肪酸转化成FAME且利用GC进行分析来确定。
[0499] 可用于本发明的去饱和酶、延长酶和酰基转移酶蛋白质和其编码基因是本领域中已知的任一种或其同系物或衍生物。表1中列出了这样的基因的实例和所编码蛋白质的大小。据显示参与LC-PUFA生物合成的去饱和酶都属于所谓的“前端”去饱和酶族群。
[0500] 如本文中所使用，术语“前端去饱和酶”是指能在脂质的酰基链的羧基与预先存在的不饱和部分之间引入双键的一类酶的成员，其结构特征为存在N末端细胞色素b5结构域以及典型脂肪酸去饱和酶结构域，所述典型脂肪酸去饱和酶结构域包括三个高度保守的组氨酸盒(Napier等,1997)。
[0501] 可通过以下方式测试用于本发明的延长酶或去饱和酶中任一种的活性：在诸如酵母细胞、植物细胞等细胞中或优选在体细胞胚或转基因植物中表达编码所述酶的基因，和确定所述细胞、胚或植物产生LC-PUFA的能力与不表达所述酶的相应细胞、胚或植物相比是否有所增加。
[0502] 在一个实施方案中，用于本发明的去饱和酶和/或延长酶中的一种或多种可由微藻类中提纯而来，即，在氨基酸序列上与可从微藻类中提纯而来的多肽同一。
[0503] 尽管本文中将某些酶具体描述为“双功能的”，但不存在该术语未必暗示特定酶不具有除具体定义的活性以外的活性。
[0504] 去饱和酶
[0505] 如本文中所使用，术语“去饱和酶”是指能够将碳-碳双键酶引入脂肪酸底物的酰基中的酶，所述脂肪酸底物典型地呈酯化形式，诸如酰基-CoA酯。酰基可酯化成磷脂，诸如磷脂酰胆碱(PC)或酰基载体蛋白(ACP)或在一个优选实施方案中酯化成CoA。相应地，去饱和酶一般可以分类为三组。在一个实施方案中，所述去饱和酶是前端去饱和酶。
[0506] 如本文中所使用，“Δ4-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的羧基端起第4个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。“Δ4-去饱和酶”至少能够将DPA转化成DHA。在除哺乳动物以外的生物体中，由DPA产生DHA的去饱和步骤是由Δ4-去饱和酶催化，并且已经从淡水原生生物小眼虫和海洋物种破囊壶菌属中分离出编码这种酶的基因(Qiu等,2001；Meyer等,2003)。在一个实施方案中，所述Δ4-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:41中所提供的序列或破囊壶菌属Δ4-去饱和酶、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:41具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0507] 表1.参与LC-PUFA生物合成的克隆的基因
[0508]
[0509]
[0510]
[0511] *http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ **功能未证实/未确定
[0512] 如本文中所使用，“Δ5-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的羧基端起第5个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。Ruiz-Lopez等(2012)和Petrie等(2010a)和本文中的表1中列出了Δ5-去饱和酶的实例。在一个实施方案中，Δ5-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:30中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:30具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，Δ5-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:32中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:32具有至少53％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述Δ5-去饱和酶是得自于破囊壶菌或赫氏圆石藻。
[0513] 如本文中所使用，“Δ6-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的羧基端起第6个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。Ruiz-Lopez等(2012)和Petrie等(2010a)和本文中的表1中列出了Δ6-去饱和酶的实例。优选的Δ6-去饱和酶是得自于细小微胞藻、畸雌腐霉或青绿藻。
[0514] 在一个实施方案中，Δ6-去饱和酶的另一特征在于具有以下各种中的至少两项，优选具有所有三项且优选在植物细胞中：i)对作为脂肪酸底物的α-亚麻酸(ALA，18:3Δ9,12,15，ω3)的Δ6-去饱和酶活性大于对亚油酸(LA，18:2Δ9,12，ω6)的Δ6-去饱和酶活性；ii)对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6-去饱和酶活性大于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的Δ6-去饱和酶活性；iii)对ETrA具有Δ8-去饱和酶活性。表2中提供了这样的Δ6-去饱和酶的实例。
[0515] 在一个实施方案中，Δ6-去饱和酶对ω3底物的活性大于对对应ω6底物的活性，且对ALA具有活性，以便产生十八碳四烯酸(硬脂四烯酸，SDA，18:4Δ6,9,12,15，ω3)，当由外源多核苷酸表达于诸如植物细胞等重组细胞中时，效率为至少30％，更优选为至少40％，或最优选为至少50％；或当表达于酵母细胞中时，效率为至少35％。在一个实施方案中，Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA的活性高于对LA的活性，例如高至少约2倍Δ6-去饱和酶活性。在另一个实施方案中，Δ6-去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的活性，例如高至少约5倍的Δ6-去饱和酶活性或高至少10倍的活性。在另一个实施方案中，Δ6-去饱和酶对两种脂肪酸底物ALA-CoA和连接于PC的sn-2位置的ALA都具有活性。
[0516] 表2.经证实对酰基-CoA底物具有活性的去饱和酶
[0517]
[0518] 在一个实施方案中，Δ6-去饱和酶对ETA不具有可检测的Δ5-去饱和酶活性。在另一个实施方案中，Δ6-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有至少77％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，Δ6-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有至少67％同一性的氨基酸序列。Δ6-去饱和酶也可能具有Δ8-去饱和酶活性。
[0519] 如本文中所使用，“Δ8-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的羧基端起第8个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。Δ8-去饱和酶至少能够将ETrA转化成ETA。表1中列出了Δ8-去饱和酶的实例。在一个实施方案中，Δ8-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:52中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:52具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0520] 如本文中所使用，“ω3-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的甲基端起第3个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。ω3-去饱和酶因此可以将LA转化成ALA并且将GLA转化成S DA(所有C18脂肪酸)或将DGLA转化成ETA和/或将ARA转化成E PA(C20脂肪酸)。一些ω3-去饱和酶(第I组)仅对C18底物具有活性，诸如植物和蓝藻ω3-去饱和酶。这样的ω3-去饱和酶也是Δ15-去饱和酶。其它ω3-去饱和酶对C20底物具有活性，对C18底物不具有活性(第II组)或具有一定活性(第III组)。
这样的ω3-去饱和酶也是Δ17-去饱和酶。优选的ω3-去饱和酶是第III组类型，其将LA转化成AL A、将GLA转化成SDA、将DGLA转化成ETA且将ARA转化成E PA，诸如巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶(SEQ ID NO:12)。ω3-去饱和酶的实例包括以下各项：Pereira等(2004a)(异丝水霉ω3-去饱和酶，第II组)、Horiguchi等(1998)、Berberich等(1998)和Spychalla等(1997)(秀丽隐杆线虫ω3-去饱和酶，第III组)。在一个优选实施方案中，ω3-去饱和酶是真菌ω3-去饱和酶。如本文中所使用，“真菌ω3-去饱和酶”是指来自于真菌来源(包括卵菌)来源的ω3-去饱和酶，或氨基酸序列与其具有至少95％同一性的其变体。已经从真菌来源分离出编码许多ω3-去饱和酶的基因，诸如致病疫霉(登录号CAJ30870，WO2005083053；SEQ ID NO:70)、异丝水霉(登录号AAR20444，Pereira等,2004a和美国专利7211656)、畸雌腐霉(WO2008022963，第II组；S EQ ID NO:72)、高山被孢霉(Sakuradani等,2005；登录号BAD91495；WO2006019192)、假微型海链藻(Armbrust等,2004；登录号XP_002291057；WO2005012316，SEQ ID NO:71)、克鲁维郎香酵母(也称为克鲁维糖酵母(Saccharomyces kluyveri)；Oura等,2004；登录号AB 118663)。Xue等(2012)描述了得自于卵菌瓜果腐霉菌、大豆疫霉菌和栎树猝死病菌的ω3-去饱和酶，其能够有效地将ω6脂肪酸底物转化成相应ω3脂肪酸，偏好C20底物，即，其Δ17-去饱和酶活性强于Δ15-去饱和酶活性。这些酶缺乏Δ12-去饱和酶活性，但可使用酰基-CoA和磷脂级分中的脂肪酸作为底物。
这样的ω3-去饱和酶也是Δ17-去饱和酶。优选的ω3-去饱和酶是第III组类型，其将LA转化成AL A、将GLA转化成SDA、将DGLA转化成ETA且将ARA转化成E PA，诸如巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶(SEQ ID NO:12)。ω3-去饱和酶的实例包括以下各项：Pereira等(2004a)(异丝水霉ω3-去饱和酶，第II组)、Horiguchi等(1998)、Berberich等(1998)和Spychalla等(1997)(秀丽隐杆线虫ω3-去饱和酶，第III组)。在一个优选实施方案中，ω3-去饱和酶是真菌ω3-去饱和酶。如本文中所使用，“真菌ω3-去饱和酶”是指来自于真菌来源(包括卵菌)来源的ω3-去饱和酶，或氨基酸序列与其具有至少95％同一性的其变体。已经从真菌来源分离出编码许多ω3-去饱和酶的基因，诸如致病疫霉(登录号CAJ30870，WO2005083053；SEQ ID NO:70)、异丝水霉(登录号AAR20444，Pereira等,2004a和美国专利7211656)、畸雌腐霉(WO2008022963，第II组；S EQ ID NO:72)、高山被孢霉(Sakuradani等,2005；登录号BAD91495；WO2006019192)、假微型海链藻(Armbrust等,2004；登录号XP_002291057；WO2005012316，SEQ ID NO:71)、克鲁维郎香酵母(也称为克鲁维糖酵母(Saccharomyces kluyveri)；Oura等,2004；登录号AB 118663)。Xue等(2012)描述了得自于卵菌瓜果腐霉菌、大豆疫霉菌和栎树猝死病菌的ω3-去饱和酶，其能够有效地将ω6脂肪酸底物转化成相应ω3脂肪酸，偏好C20底物，即，其Δ17-去饱和酶活性强于Δ15-去饱和酶活性。这些酶缺乏Δ12-去饱和酶活性，但可使用酰基-CoA和磷脂级分中的脂肪酸作为底物。
[0521] 在一个更优选实施方案中，真菌ω3-去饱和酶是巴斯德毕赤酵母(也称为巴斯德驹形氏酵母)ω3-去饱和酶/Δ15-去饱和酶(Zhang等,2008；登录号EF116884；SEQ ID NO:12)或与其具有至少95％同一性的多肽。
[0522] 在一个实施方案中，ω3-去饱和酶至少能够实现将ARA转化成EPA、将DGLA转化成ETA、将GLA转化成SDA之一、将ARA转化成EPA且将DGLA转化成ETA、将ARA转化成EPA且将GLA转化成SDA或所有这三种转化。
[0523] 在一个实施方案中，ω3-去饱和酶对具有至少三个碳-碳双键、优选为ARA的C20脂肪酸具有Δ17-去饱和酶活性。在另一个实施方案中，ω3-去饱和酶对具有三个碳-碳双键、优选为GLA的C18脂肪酸具有Δ15-去饱和酶活性。优选地，两种活性都存在。
[0524] 如本文中所使用，“Δ12-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的羧基端起第12个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。Δ12-去饱和酶典型地将油酰基磷脂酰胆碱或油酰基-CoA分别转化成亚麻酰基磷脂酰胆碱(18:1-PC)或亚麻酰基-CoA(18:1-CoA)。使用PC连接的底物的子类称为磷脂依赖性Δ12-去饱和酶，后一个子类称为酰基-CoA依赖性Δ12-去饱和酶。植物和真菌Δ12-去饱和酶一般属于前一种子类，而动物Δ12-去饱和酶属于后一种子类，例如由Zhou等(2008)从昆虫克隆的基因所编码的Δ12-去饱和酶。可通过检索序列数据库容易地鉴别许多其它Δ12-去饱和酶序列。
[0525] 如本文中所使用，“Δ15-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的羧基端起第15个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。已经从植物和真菌物种中克隆了许多编码Δ15-去饱和酶的基因。举例来说，US5952544描述了编码植物Δ15-去饱和酶(FAD3)的核酸。这些酶包含植物Δ15-去饱和酶所特有的氨基酸基序。WO200114538描述了一种编码大豆FAD3的基因。可通过检索序列数据库容易地鉴别许多其它Δ15-去饱和酶序列。
[0526] 如本文中所使用，“Δ17-去饱和酶”是指能进行去饱和酶反应从而在从脂肪酸底物的羧基端起第17个碳-碳键处引入碳-碳双键的蛋白质。如果Δ17-去饱和酶作用于C20底物从而在ω3键处引入去饱和，则其也被视为ω3-去饱和酶。
[0527] 在一个优选实施方案中，Δ12-去饱和酶和/或Δ15-去饱和酶是真菌Δ12-去饱和酶或真菌Δ15-去饱和酶。如本文中所使用，“真菌Δ12-去饱和酶”或“真菌Δ15-去饱和酶”是指来自于真菌来源(包括卵菌来源)的Δ12-去饱和酶或
Δ15-去饱和酶或氨基酸序列与其具有至少95％同一性的变体。已经从真菌来源分离了编码许多去饱和酶的基因。US7211656描述了得自于异丝水霉的Δ12去饱和酶。
WO2009016202描述了得自于泽蛭(Helobdella robusta)、二色蜡蘑(Laccaria bicolor)、霸王莲花青螺(Lottia gigantea)、微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、领鞭毛虫(Monosiga brevicollis)、香蕉黑条叶斑病菌(Mycosphaerella fijiensis)、禾生球腔菌(Mycospaerella graminicola)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruben)、红球丛赤壳(Nectria haematococca)、海葵(Nematostella vectensis)、布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)、里氏木霉(Trichoderma resii)、小立碗藓、褐腐菌(Postia placenta)、穗状地衣(Selaginella moellendorffii)和雪霉微座孢(Microdochium nivale)的真菌去饱和酶。WO2005/012316描述了得自于假微型海链藻和其它真菌的Δ12-去饱和酶。
WO2003/099216描述了编码从粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和高山被孢霉分离的真菌Δ12-去饱和酶和Δ15-去饱和酶的基因。WO2007133425描述了从以下各物分离的真菌Δ15去饱和酶：克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、高山被孢霉、构巢曲霉、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)。优选Δ12去饱和酶来自于大豆疫霉菌(Ruiz-Lopez等,2012)。
Δ15-去饱和酶或氨基酸序列与其具有至少95％同一性的变体。已经从真菌来源分离了编码许多去饱和酶的基因。US7211656描述了得自于异丝水霉的Δ12去饱和酶。
WO2009016202描述了得自于泽蛭(Helobdella robusta)、二色蜡蘑(Laccaria bicolor)、霸王莲花青螺(Lottia gigantea)、微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、领鞭毛虫(Monosiga brevicollis)、香蕉黑条叶斑病菌(Mycosphaerella fijiensis)、禾生球腔菌(Mycospaerella graminicola)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruben)、红球丛赤壳(Nectria haematococca)、海葵(Nematostella vectensis)、布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)、里氏木霉(Trichoderma resii)、小立碗藓、褐腐菌(Postia placenta)、穗状地衣(Selaginella moellendorffii)和雪霉微座孢(Microdochium nivale)的真菌去饱和酶。WO2005/012316描述了得自于假微型海链藻和其它真菌的Δ12-去饱和酶。
WO2003/099216描述了编码从粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和高山被孢霉分离的真菌Δ12-去饱和酶和Δ15-去饱和酶的基因。WO2007133425描述了从以下各物分离的真菌Δ15去饱和酶：克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、高山被孢霉、构巢曲霉、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)。优选Δ12去饱和酶来自于大豆疫霉菌(Ruiz-Lopez等,2012)。
[0528] 真菌Δ12-去饱和酶和真菌Δ15-去饱和酶的一个独特子类是双功能真菌Δ12/Δ15-去饱和酶。已经从以下各物中克隆了编码这些酶的基因：串珠镰孢菌(登录号DQ272516，Damude等,2006)、卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)(登录号EF017656，Sayanova等,2006)、海生鞭孢簇虫(Perkinsus marinus)(WO2007042510)、麦角菌(Claviceps purpurea)(登录号EF536898，Meesapyodsuk等,2007)和灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)(登录号AF269266，Zhang等,2007)。
[0529] 在另一个实施方案中，与相应酰基-PC底物的活性相比，ω3-去饱和酶对酰基-CoA底物具有至少一些活性，优选地具有更大活性。如本文中所使用，“相应酰基-PC底物”是指在磷脂酰胆碱(PC)的sn-2位置上酯化的脂肪酸，其中所述脂肪酸是与酰基-CoA底物中相同的脂肪酸。举例来说，酰基-CoA底物可以是ARA-CoA，且相应酰基-PC底物是sn-2ARA-PC。在一个实施方案中，所述活性高至少两倍。优选地，所述ω3-去饱和酶对酰基-CoA底物及其相应酰基-PC底物具有至少一些活性且对C18和C20底物都具有活性。这样的ω3-去饱和酶的实例是已知的，尤其是上文所列出的克隆真菌去饱和酶。
[0530] 在另一个实施方案中，所述ω3-去饱和酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:12中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:12具有至少60％同一性、优选与SEQ ID NO:12具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0531] 在另一个实施方案中，用于本发明的去饱和酶对酰基-CoA底物的活性高于对相应酰基-PC底物的活性。在另一个实施方案中，用于本发明的去饱和酶对酰基-PC底物的活性高于对相应酰基-CoA底物的活性，但对两种底物都具有一定的活性。如上文中所述，“相应酰基-PC底物”是指在磷脂酰胆碱(PC)的sn-2位置上酯化的脂肪酸，其中所述脂肪酸是与酰基-CoA底物中相同的脂肪酸。在一个实施方案中，所述更高活性是高至少两倍。在一个实施方案中，所述去饱和酶是Δ5或Δ6-去饱和酶，或ω3-去饱和酶，所提供的其实例为但不限于表2中所列出的那些。为了测试去饱和酶作用于哪种底物，即酰基-CoA或酰基-PC底物，可如Domergue等(2003)和(2005)中所描述在酵母细胞中进行测定。当延长酶在与去饱和酶一起表达时在植物细胞中具有至少约90％的酶转化效率时，也可以推断去饱和酶能够作用于酰基-CoA底物，其中所述延长酶催化去饱和酶产物延长。基于此，由GA7构建体(实施例2和3)及其变体(实施例5)表达的Δ5-去饱和酶和Δ4-去饱和酶
能够将其相应酰基-CoA底物、ETA-CoA和DPA-CoA去饱和化。
能够将其相应酰基-CoA底物、ETA-CoA和DPA-CoA去饱和化。
[0532] 延长酶
[0533] 生物化学证据表明脂肪酸延长由4个步骤组成：缩合、还原、脱水和第二次还原。在本发明上下文中，“延长酶”是指在合适的生理学条件下，在存在延长复合物的其它成员的情况下能催化缩合步骤的多肽。已经证明，相应酰基链的延长仅需要在细胞中异源或同源表达延长蛋白复合物的缩合组分(“延长酶”)。因而，所引入的延长酶能够成功募集转基因宿主的还原和脱水活性，以进行成功的酰基延长。就脂肪酸底物的链长和去饱和度而言，认为延长反应的特异性在于所述缩合组分。该组分也被认为在延长反应中具有速率限制性。
[0534] 如本文中所使用，“Δ5-延长酶”至少能够将EPA转化成DPA。Δ5-延长酶的实例包括WO2005/103253中所公开的那些。在一个实施方案中，所述Δ5-延长酶对EPA具有活性，从而以至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％或最优选地至少80％或90％的效率产生DPA。在另一个实施方案中，所述Δ5-延长酶包含如SEQ ID NO:37中所提供的氨基酸序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:37具有至少47％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述Δ6-延长酶来自于青绿藻或绿色鞭毛藻(US2010/088776)。
[0535] 如本文中所使用，“Δ6-延长酶”至少能够将SDA转化成ETA。Δ6-延长酶的实例包括表1中所列出的那些。在一个实施方案中，所述延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:25中所提供的序列、其生物学活性片段(诸如SEQ ID NO:26所提供的片段)或与SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26之一或两者具有至少55％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，Δ6-延长酶来自于小立碗藓(Zank等,2002；登录号AF428243)或假微型海链藻(Ruiz-Lopez等,2012)。
[0536] 如本文中所使用，“Δ9-延长酶”至少能够将ALA转化成ETrA。Δ9-延长酶的实例包括表1中所列出的那些。在一个实施方案中，所述Δ9-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:43中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:43具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述Δ9-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:46中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:46具有至少81％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述Δ9-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:48中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:48具有至少50％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述Δ9-延长酶包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:50中所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:50具有至少50％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述Δ9-延长酶对ω6底物的活性高于对相应ω3底物的活性，或相反。
[0537] 如本文中所使用，术语“对ω6底物的活性高于对相应ω3底物的活性”是指不同在于ω3去饱和酶的作用的所述酶对底物的相对活性。优选地，ω6底物是LA且ω3底物是ALA。
[0538] 具有Δ6-延长酶和Δ9-延长酶活性的延长酶至少能够(i)将SDA转化成ETA和(ii)将ALA转化成ETrA，且Δ6-延长酶活性高于Δ9-延长酶活性。在一个实施方案中，所述延长酶转化SDA以产生ETA的效率是至少50％，更优选地至少60％，和/或转化ALA以产生ETrA的效率是至少6％或更优选地至少9％。在另一个实施方案中，所述延长酶的Δ6-延长酶活性比Δ9-延长酶活性高至少约6.5倍。在另一个实施方案中，所述延长酶不具有可检测的Δ5-延长酶活性。
[0539] 其它酶
[0540] 如本文中所使用，术语“1-酰基-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶”(LPAAT)，也称为溶血磷脂酸-酰基转移酶或酰基CoA-溶血磷脂酸酯-酰基转移酶，是指能使sn-2位置上的sn-1-酰基-甘油-3-磷酸酯(sn-1G-3-P)酰化以形成磷脂酸(PA)的蛋白质。因而，术语“1-酰基-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶活性”是指(sn-1G-3-P)在sn-2位置上酰化产生PA(EC 2.3.1.51)。优选的LPAAT是可使用多不饱和C22酰基-CoA作为底物以便将多不饱和C22酰基转移至LPA的sn-2位置，从而形成PA的那些。这样的LPAAT例示于实施例13中且可如其中所描述进行测试。在一个实施方案中，可用于本发明的LPAAT包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:63至69中的任一个所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:63至69中的一个或多个具有至少40％同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，可用于本发明的LPAAT包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO:64、65和67中的任一个所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO:64、65和67中的一个或多个具有至少40％同一性的氨基酸序列。
[0541] 如本文中所使用，术语“二酰基甘油酰基转移酶”(EC 2.3.1.20；D GAT)是指能将脂肪酰基从酰基-CoA转移至二酰基甘油底物以产生三酰基甘油的蛋白质。因而，术语“二酰基甘油酰基转移酶活性”是指将酰基-CoA转移至二酰基甘油以产生三酰基甘油。有三种已知类型的DGAT，分别称为DGAT1、DGAT2和DGAT3。DGAT1多肽典型地具有10个跨膜结构域，DGAT2多肽典型地具有2个跨膜结构域，而DGAT3典型地是可溶的。DGAT1多肽的实例包括由来自于以下物种的DGAT1基因编码的多肽：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(登录号X P_755172)、拟南芥(CAB44774)、蓖麻(Ricinus communis)(AAR11479)、油桐(Vernicia fordii)(ABC94472)、咸 虾 花(Vernonia galamensis)(ABV21945,ABV21946)、鬼 箭 羽(Euonymus alatus)(AAV31083)、秀丽隐杆线虫(AAF82410)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(NP_445889)、智人(NP_036211)以及其变体和/或突变体。DGAT2多肽的实例包括由来自于以下物种的DGAT2基因编码的多肽：拟南芥(登录号NP_566952)、蓖麻(AAY16324)、油桐(ABC94474)、拉曼孢霉(Mortierella ra manniana)(AAK84179)、智人(Q96PD7，Q58HT5)、普通牛(Bos taur us)(Q70VD8)、小家鼠(Mus musculus)(AAK84175)、微胞藻CCMP1545以及其变体和/或突变体。DGAT3多肽的实例包括由来自于以下物种的DGAT3基因编码的多肽：花生(落花生(Arachis hypogaea)，S aha等,2006)以及其变体和/或突变体。
[0542] 多肽/肽
[0543] 术语“重组”在多肽的上下文中是指当所述多肽由细胞或在无细胞表达系统中产生时与其在天然情况下产生时的天然状态相比在量和速率方面有所改变。在一个实施方案中，所述细胞是在天然情况下不产生所述多肽的细胞。然而，所述细胞可以是包含能改变所产生的多肽的量非内源基因的细胞。本发明的重组多肽包括能产生所述多肽的细胞、组织、器官或生物体或无细胞表达系统中的多肽，即，未经过纯化或未与产生所述多肽的转基因(重组)细胞的其它组分分离的多肽，和在这样的细胞或无细胞系统中产生且随后与至少一些其它组分纯化分离的多肽。
[0544] 术语“多肽”和“蛋白质”一般可互换使用。
[0545] 一种多肽或一类多肽可以通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性程度(％同一性)，或通过其与一个参考氨基酸序列的％同一性高于与另一个参考氨基酸序列的％同一性来定义。多肽与参考氨基酸序列的％同一性典型地通过GAP分析(Needleman和Wunsch,1970；GCG程序)来确定，所用参数为：间隙创建罚分＝5和间隙延伸罚分＝0.3。查询序列的长度为至少15个氨基酸，且GAP分析在具有至少15个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度为至少50个氨基酸，且GAP分析在具有至少50个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度为至少100个氨基酸，且GAP分析在具有至少100个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度为至少250个氨基酸，且GAP分析在具有至少250个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析比对两个序列的整个长度。所述多肽或所述类别的多肽可与参考多肽具有相同的酶活性或不同的活性，或缺乏所述活性。优选地，所述多肽的酶活性是参考多肽的活性的至少10％、至少50％、至少75％或至少90％。
[0546] 如本文中所使用，“生物学活性”片段是本文中所定义的多肽的一部分，其保持全长参考多肽的所定义的活性，例如具有去饱和酶和/或延长酶活性或其它酶活性。如本文中所使用的生物学活性片段不包括全长多肽。生物学活性片段可以是任何尺寸的部分，条件是其保持所定义的活性。优选地，生物学活性片段保持全长蛋白质活性的至少10％、至少50％、至少75％或至少90％。
[0547] 就所定义的多肽或酶而言，应了解，高于本文中所提供的那些数值的％同一性数值将涵盖优选的实施方案。因而，在适当的情况下，与最低％同一性数值相比，优选所述多肽/酶所包含的氨基酸序列与相关指定SEQ ID NO具有至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少76％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、更优选地至少93％、更优选地至少94％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、更优选地至少99.1％、更优选地至少99.2％、更优选地至少99.3％、更优选地至少99.4％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少
99.7％、更优选地至少99.8％且甚至更优选地至少99.9％的同一性。
99.7％、更优选地至少99.8％且甚至更优选地至少99.9％的同一性。
[0548] 本文中所定义的多肽的氨基酸序列变体/突变体可以通过在本文中所定义的核酸内引入适当的核苷酸变化或通过体外合成所需多肽来制备。这样的变体/突变体包括例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。可进行缺失、插入和取代的组合来获得最终构建体，条件是最终肽产物具有所需的酶活性。
[0549] 可通过使用本领域中已知的任何技术来制备突变的(改变的)肽。举例来说，可如Harayama(1998)广泛描述对本文中所定义的多核苷酸进行体外突变诱发或DNA改组技术。可以使用本文中所描述的技术容易地筛选源自于突变的/改变的DNA的产物以确定其是否具有例如去饱和酶或延长酶活性。
[0550] 在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于欲修饰的特征。可个别地或连续地修饰突变位点，例如通过(1)首先选择保守性氨基酸进行取代，然后取决于所实现的结果进行较激进的选择；(2)缺失靶残基；或(3)在与所定位的位点相邻处插入其它残基。
[0551] 氨基酸序列缺失一般在约1至15个残基范围内，更优选地在约1至10个残基范围内且典型地在约1至5个连续残基范围内。
[0552] 取代突变体去除多肽分子中的至少一个氨基酸残基且在该处插入一个不同的残基。取代型突变诱发的最感兴趣的位点包括在天然存在的去饱和酶或延长酶中不保守的位点。这些位点优选地以相对保守的方式经取代，以便保持酶活性。表3中在“示例性取代”栏目下示出了这样的保守取代。
[0553] 在一个优选的实施方案中，当与天然存在的多肽相比时，突变体/变体多肽仅具有或具有不多于1个或2个或3个或4个保守氨基酸变化。表3中提供了保守氨基酸变化的详情。如本领域技术人员应知晓，可以合理地预测当在重组细胞中表达时，这样的少数变化不会改变多肽的活性。
[0554] 可以用多种方式产生多肽，包括根据本领域中已知的方法产生和回收天然多肽或重组多肽。在一个实施方案中，通过在能有效产生多肽的条件下培养能够表达所述多肽的细胞(诸如本文中所定义的宿主细胞)来产生重组多肽。更优选的用于产生多肽的细胞是植物细胞，尤其是植物种子中的细胞。
[0555] 多核苷酸
[0556] 本发明还提供和/或使用了多核苷酸，其可以是例如基因、分离的多核苷酸、诸如T-DNA分子等嵌合基因构建体或嵌合DNA。其可以是基因组和合成来源的的DNA或RNA，可以是双链或单链的，并且与碳水化合物、脂质、蛋白质或其它材料组合以履行本文中所定义的活性。术语“多核苷酸”在本文中与术语“核酸分子”可互换使用。“分离的多核苷酸”意味着如果是从天然来源获得则已经与在其天然状态下与其结合或连接的多核苷酸序列分离的多核苷酸，或非天然存在的多核苷酸。优选地，分离的多核苷酸至少60％、更优选地至少75％且更优选地至少90％不含与其天然结合的其它组分。
[0557] 表3.示例性取代
[0558]原残基 示例性取代
Ala(A) val；leu；ile；gly
Arg(R) lys
Asn(N) gln；his
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gin(Q) asn；his
Gln(E) asp
Gly(G) pro，ala
His(H) asn；gln
lle(I) leu；val；ala
Leu(L) ile；val；met；ala；phe
Lys(K) arg
Met(M) leu；phe
Phe(F) leu；val；ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp；phe
Val(V) ile；leu；met；phe，ala
Ala(A) val；leu；ile；gly
Arg(R) lys
Asn(N) gln；his
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gin(Q) asn；his
Gln(E) asp
Gly(G) pro，ala
His(H) asn；gln
lle(I) leu；val；ala
Leu(L) ile；val；met；ala；phe
Lys(K) arg
Met(M) leu；phe
Phe(F) leu；val；ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp；phe
Val(V) ile；leu；met；phe，ala
[0559] 在一个实施方案中，本发明的多核苷酸是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸的实例包括但不限于已经突变的那些(诸如通过使用本文中所描述的方法)和编码蛋白质的开放阅读框可操作地连接于在天然情况下不与其结合的启动子(诸如在本文中所描述的构建体中)的多核苷酸。
[0560] 如本文中所使用，术语“基因”取其最广泛含义且包括脱氧核糖核苷酸序列，所述序列包含转录区和(如果经过翻译的话)结构基因的蛋白质编码区，并且包括位于与5'和3'端上的所述编码区相邻处与任一端相距至少约2kb距离且参与所述基因的表达的序列。
就此而言，所述基因包括天然情况下与给定基因结合的诸如启动子、增强子、终止和/或多腺苷酸化信号等控制信号，或异源控制信号，在该情况下所述基因称为“嵌合基因”。位于蛋白质编码区5'端且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于蛋白质编码区3'端或下游且存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有可能间杂有被称为“内含子”或“干扰区”或“干扰序列”的非编码序列的编码区。内含子是被转录至核RNA(hnRNA)中的基因区段。内含子可含有诸如增强子等调控元件。内含子将从核转录产物或初级转录产物中去除或“剪切出”，因此信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA的功能是在翻译过程中确定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。术语“基因”包括编码全部或部分本文中所描述的本发明蛋白质的合成或融合分子以及上述任一者的互补核苷酸序列。
就此而言，所述基因包括天然情况下与给定基因结合的诸如启动子、增强子、终止和/或多腺苷酸化信号等控制信号，或异源控制信号，在该情况下所述基因称为“嵌合基因”。位于蛋白质编码区5'端且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于蛋白质编码区3'端或下游且存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有可能间杂有被称为“内含子”或“干扰区”或“干扰序列”的非编码序列的编码区。内含子是被转录至核RNA(hnRNA)中的基因区段。内含子可含有诸如增强子等调控元件。内含子将从核转录产物或初级转录产物中去除或“剪切出”，因此信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA的功能是在翻译过程中确定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。术语“基因”包括编码全部或部分本文中所描述的本发明蛋白质的合成或融合分子以及上述任一者的互补核苷酸序列。
[0561] 如本文中所使用，术语“嵌合DNA”或“嵌合基因构建体”是指不是处于其非天然位置上的天然DNA分子的任何DNA分子，在本文中也称为“DNA构建体”。典型地，嵌合DNA或嵌合基因包含在自然界中未发现可操作地连接在一起，即相对于彼此为异源的调控序列和转录序列或蛋白质编码序列。因此，嵌合DNA或嵌合基因可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源但以不同于自然界中所发现的方式排列的调控序列和编码序列。
[0562] 术语“内源性”在本文中用于指例如未修饰植物与所研究的植物中在同一发育阶段中正常存在或产生的物质。“内源性基因”是指生物体基因组中的天然位置上的天然基因。如本文中所使用，“重组核酸分子”、“重组多核苷酸”或其变体是指通过重组DNA技术构建或修饰的核酸分子。术语“外来多核苷酸”或“外源性多核苷酸”或“异源多核苷酸”等等是指通过实验操作引入细胞的基因组中的任何核酸。外来或外源基因可以是插入非天然生物体内的基因、引入天然宿主细胞内的新位置上的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化程序引入基因组中的基因。术语“基因修饰”、“转基因”及其变化形式包括通过转化或转导将基因引入细胞中，从而使细胞内的基因突变并且改变或调节已经进行了这些行为的细胞或生物体或其子代的基因调控。如本文中所使用的“基因组区”是指已经将一个转基因或一组转基因(在本文中也称为簇)插入细胞或其祖先内的基因组内位置。这样的区域仅包含已经通过人为干预(诸如通过本文中所描述的方法)并入的核苷酸。
[0563] 术语“外源性”在多核苷酸上下文中是指当存在于细胞中时与其天然状态相比存在量有所改变的多核苷酸。在一个实施方案中，所述细胞是在天然条件下不包含所述多核苷酸的细胞。然而，所述细胞可能是包含导致所编码的多肽的产量发生变化的非内源性多核苷酸的细胞。本发明的外源性多核苷酸包括尚未与它们存在于其中的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统的其它组分分离的多核苷酸，和这样的细胞或无细胞表达系统中产生且随后与至少一些其它组分纯化分开的多核苷酸。外源性多核苷酸(核酸)可以是天然存在的一段连续核苷酸，或包含来自于不同来源(天然存在的和/或合成的)并且经连接以形成单一多核苷酸的两个或更多个连续核苷酸段。典型地，这样的嵌合多核苷酸至少包含编码本发明多肽的开放阅读框，所述开放阅读框可操作地连接于适合在感兴趣的细胞中驱动所述开放阅读框转录的启动子。
[0564] 如本文中所使用，术语“不同的外源性多核苷酸”或其变化形式意味着各多核苷酸的核苷酸序列中有至少一个、优选地有多个核苷酸不同。所核苷酸所编码的RNA可能在细胞内翻译成蛋白质或未翻译。在一个实例中，优选各多核苷酸编码具有不同活性的蛋白质。在另一个实例中，各外源性多核苷酸与其他外源多核苷酸具有小于约95％、小于90％或小于80％同一性。优选地，外源性多核苷酸编码功能蛋白/酶。此外，优选不同的外源性多核苷酸是非重叠的，即各多核苷酸是例如染色体外转移核酸的独特区域，其与另一个外源性多核苷酸不重叠。至少，各外源性多核苷酸具有转录起始和终止位点以及指定启动子。个别外源性多核苷酸可以包含或不包含内含子。
[0565] 就所定义的多核苷酸而言，应了解，高于上文所提供的那些的％同一性数值将涵盖优选实施方案。因而，在适当的情况下，就最小同一性数值而言，优选多核苷酸所包含的多核苷酸序列与相关指定SEQ ID NO具有至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、更优选地至少93％、更优选地至少94％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、更优选地至少99.1％、更优选地至少99.2％、更优选地至少99.3％、更优选地至少99.4％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少99.8％且甚至更优选地至少99.9％的同一性。
[0566] 本发明的多核苷酸可在严格条件下与编码本发明多肽的多核苷酸选择性地杂交。如本文中所使用，严格条件是(1)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如含0.1％(w/v)牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮的50％(v/v)甲酰胺，含750mM NaCl、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，42℃；或(2)采用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x邓哈特溶液、经过超声处理的鲑鱼精DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，在0.2x SSC和0.1％SDS中；和/或(3)采用低离子强度和高洗涤温度，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃。
[0567] 当与天然存在的分子相比时，本发明的多核苷酸可具有一个或多个突变，所述突变可以是核苷酸残基的缺失、插入或取代。相对于参考序列具有突变的多核苷酸可以是天然存在的(也就是说，从天然来源分离的)或合成的(例如，通过在上述核酸上进行定点突变诱发或DNA改组)。因而，显而易见本发明的多核苷酸可以来自于天然存在的来源或是重组的。优选的多核苷酸是如本领域中已知的具有密码子经优化以便在植物细胞中翻译的编码区的那些。
[0568] 重组载体
[0569] 本发明的一个实施方案包括重组载体，其包含至少一种本文中所定义的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子插入能够将所述多核苷酸分子递送至宿主细胞中的任何载体。重组载体包括表达载体。重组载体含有异源多核苷酸序列，即被发现在天然情况下不与本文中所定义的多核苷酸分子相邻且优选地来源于除所述多核苷酸分子的来源物种以外的物种的多核苷酸序列。所述载体可以是RNA或DNA，且典型地是质粒。质粒载体典型地包括额外的核酸序列以便在原核生物细胞中容易地选择、扩增和转化表达盒，例如pUC衍生载体、pSK衍生载体、pGEM衍生载体、pSP衍生载体、pBS衍生载体，或优选地含有一个或多个T-DNA区域的二元载体。额外的核酸序列包括用于载体自主复制的复制起点、优选地编码抗生素抗性或除草剂抗性的选择标记基因、用于提供多个位点以便将所编码的核酸序列或基因插入核酸构建体中的多个独特克隆位点，和能增强原核生物和真核生物(尤其是植物)细胞的转化的序列。重组载体可包含多于一种本文中所定义的多核苷酸，例如3、4、5或6种本文中所定义的多核苷酸的组合，优选地本发明的嵌合基因构建体，各多核苷酸可操作地连接于相关细胞中可操作的表达控制序列。多于一种本文中所定义的多核苷酸，例如3、4、5或6种多核苷酸优选地在单一重组载体中，优选地在单一T-DNA分子中共价连接在一起，然后可作为单一分子引入细胞中以形成根据本发明的重组细胞，且优选地整合至该重组细胞的基因组中，例如转基因植物中的重组细胞。由此，这样连接的多核苷酸将作为单一基因座一起被重组细胞或植物的子代继承。重组载体或植物可包含两种或更多种这样的重组载体，各载体含有多种多核苷酸，例如其中各重组载体包含3、4、5或6种多核苷酸。
[0570] 如本文中所定义的“可操作地连接”是指两个或更多个核酸(例如DNA)区段之间的功能关系。典型地，其是指转录调控元件(启动子)与所转录的序列之间的功能关系。举例来说，启动子可操作地连接于编码序列，诸如本文中所定义的多核苷酸，条件是其在适当的细胞中刺激或调节编码序列的转录。总体来说，可操作地连接于所转录的序列的启动子转录调控元件与所转录的序列在物理上是连续的，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调控元件，诸如增强子，不需要与转录被它们增强的编码序列在物理上连续或位于与之紧密相邻处。
[0571] 当存在多个启动子时，各启动子可独立地相同或不同。
[0572] 诸如嵌合DNA等重组分子或基因构建体还可以含有(a)一种或多种编码信号肽序列的分泌信号，以使得所表达的本文中所定义的多肽能够从产生所述多肽的细胞中分泌或为所表达的多肽提供定位，例如使所述多肽保留在所述细胞中的内质网(ER)中或转移至质体内；和/或(b)含有融合序列，由此导致核酸分子表达为融合蛋白。合适的信号区段的实例包括能够指导本文中所定义的多肽分泌或定位的任何信号区段。重组分子还可以包括在本文中所定义的核酸分子的核酸序列周围和/或内部的间插和/或未翻译序列。
[0573] 为了促进转化体的鉴别，核酸构建体理想地包含选择或筛选标记基因作为外来或外源多核苷酸，或包含选择或筛选标记基因以及外来或外源多核苷酸。“标记基因”意味着赋予表达所述标记基因的细胞以独特表型且因而允许区分这样的经转化细胞与不具有该标记物的细胞的基因。选择标记物基因赋予可基于对选择剂(例如除草剂、抗生素、辐射、热或对未经转化的细胞具有破坏性的其它处理)的抗性进行“选择”的性状。筛选标记基因(或报告基因)赋予可通过观察或测试，例如通过“筛选”(例如β-葡糖醛酸酶、荧光素酶、GFP或未转化细胞中不存在的其它酶活性)加以鉴别的性状。标记基因和相关核苷酸序列不必连接。标记物的实际选择不重要，只要其与所选择的细胞(诸如植物细胞)联合具有功能(即，选择性)即可。
[0574] 细菌选择标记物的实例是赋予抗生素抗性的标记物，诸如氨苄西林、红霉素、氯霉素或四环素抗性，优选地卡那霉素抗性。用于选择植物转化体的示例性选择标记物包括但不限于hyg基因，其编码潮霉素B抗性；新霉素磷酸转移酶(nptII)基因，其赋予对卡那霉素、巴龙霉素、G418的抗性；得自于大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因，其赋予对谷胱甘肽衍生的除草剂的抗性，例如，如EP 256223中所描述；谷氨酰胺合成酶基因，其在过度表达后赋予对诸如草胺膦等谷氨酰胺合成酶抑制剂的抗性，例如，如WO 87/05327中所描述；得自于产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰基转移酶基因，其赋予对选择剂草胺膦的抗性，例如，如EP 275957中所描述；编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸酯合成酶(EPSPS)的基因，其赋予对N-膦酰基甲基甘氨酸的耐受性，例如，如Hinchee等(1988)所描述；bar基因，其赋予对双丙氨磷的抗性，例如，如WO91/02071中所描述；腈水解酶基因，诸如得自于臭鼻克雷伯菌(Klebsiella ozaenae)的bxn，其赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等,1988)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Thillet等,1988)；突变乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化合物的抗性(EP154,204)；突变的邻氨基苯甲酸合成酶基因，其赋予对5-甲基色氨酸的抗性；或茅草枯脱卤素酶基因，其赋予对除草剂的抗性。
[0575] 优选的筛选标记物包括但不限于uidA基因，其编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，该酶的各种显色底物是已知的；绿色荧光蛋白基因(Niedz等,1995)或其衍生物；荧光素酶(luc)基因(Ow等,1986)，其允许进行生物发光检测；和本领域中已知的其它酶。如本说明书所使用的“报告分子”意味着由其化学性质提供有助于通过参考蛋白质产物确定启动子活性的可分析鉴别信号的分子。
[0576] 优选地，核酸构建体被稳定并入诸如植物细胞等细胞的基因组中。相应地，所述核酸可包含适当的元件，从而允许分子被并入基因组中，优选地将T-DNA分子或构建体的右边界和左边界序列放在可并入细胞的染色体中的适当载体中。
[0577] 表达
[0578] 如本文中所使用，表达载体是能够转化宿主细胞且实现一种或多种指定多核苷酸分子的表达的DNA载体。本发明的优选表达载体可指导酵母和/或植物细胞中的基因表达。可用于本发明的表达载体含有调控序列，诸如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点和与重组细胞相容并且控制本发明多核苷酸分子的表达的其它调控序列。确切地说，可用于本发明的多核苷酸或载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录起始、延长和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，诸如启动子和增强子序列。合适的转录控制序列包括可在至少一种本发明重组细胞中起作用的任何转录控制序列。所使用的调控序列的选择取决于靶生物体，诸如相关植物和/或靶器官或组织。这样的调控序列可获自任何真核生物体，诸如植物或植物病毒，或可以化学合成。多种这样的转录控制序列对于本领域技术人员是已知的。特别优选的转录控制序列是在植物中具有指导转录活性的启动子，取决于所使用的植物或其部分，可以是组成性的或阶段和/或组织特异性的。
[0579] 适用于稳定转染植物细胞或建立转基因植物的许多载体已描述于例如以下文献中：Pouwels等,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,增刊1987；Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989；和 Gelvin等,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990。典型地，植物表达载体包括例如在5'和3'调控序列的转录控制下的一种或多种克隆植物基因和显性选择标记物。这样的植物表达载体还可以含有启动子调控区(例如，控制诱导型或组成型表达、环境调控型表达或发育调控型表达、或细胞特异性表达或组织特异性表达的调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
[0580] 已经描述了在植物细胞中具有活性的许多组成型启动子。用于在植物中进行组成型表达的合适的启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S、甘蔗杆状病毒启动子、鸭拓草黄色斑点病毒启动子、来自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚单位的光诱导型启动子、稻细胞质磷酸丙糖异构酶启动子、拟南芥腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1基因启动子、甘露氨酸合成酶和章鱼碱合成酶启动子、Adh启动子、蔗糖合成酶启动子、R基因复合体启动子和叶绿素α/β结合蛋白基因启动子。
[0581] 为了在诸如叶、种子、根或茎等植物源组织中表达，优选本发明所利用的启动子在这些特定组织中具有相对较高的表达。为此，可针对基因选择许多具有组织或细胞特异性或增强型表达的启动子。文献中报告的这样的启动子的实例包括豌豆叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、小麦叶绿体果糖-1,6-二磷酸酶启动子、马铃薯核光合ST-LS1启动子、拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡糖淀粉酶(CHS)启动子。也被报告在光合活性组织中具有活性的是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶启动子和Cab启动子。
[0582] 响应于环境、激素、化学品和/或发育信号而被调控的多种植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达基因，包括由以下各项调控的启动子：(1)热；(2)光(例如豌豆RbcS-3A启动子、玉米RbcS启动子)；(3)激素，诸如脱落酸；(4)创伤(例如WunI)；或(5)化学品，诸如茉莉酮酸甲酯、水杨酸、类甾醇激素、醇、安全剂(WO97/06269)；或采用(6)器官特异性启动子也是有利的。
[0583] 如本文中所使用，术语“植物种子特异性启动子”或其变化形式是指与其它植物组织相比优先在植物的发育种子中指导基因转录的启动子。在一个实施方案中，种子特异性启动子在植物的发育种子中的表达相对于在植物的叶和/或茎中的表达强至少5倍，且优选地，在发育种子的胚中的表达与其它植物组织相比更强。优选地，所述启动子仅在发育种子中指导相关基因表达，和/或植物的其它部分(诸如叶)中的相关基因表达无法通过Northern印迹分析和/或RT-PCR检测。典型地，所述启动子在种子生长和发育过程中，确切地说，在种子中合成和累积贮藏化合物的阶段中驱动基因表达。这样的启动子可在整个植物贮藏器官中或仅在其部分中，诸如双子叶植物种子的种皮或子叶中，优选地在胚中，或在单子叶植物种子的胚乳或糊粉层中驱动基因表达。
[0584] 种子特异性表达的优选启动子包括i)来自于编码诸如去饱和酶和延长酶等参与种子中的脂肪酸生物合成和累积的酶的基因的启动子；ii)来自于编码种子贮藏蛋白的基因的启动子；和iii)来自于编码参与种子中碳水化合物生物合成和累积的酶的基因的启动子。合适的种子特异性启动子是油料种子油菜napin基因启动子(US5,608,152)、蚕豆USP启动子(Baumlein等,1991)、拟南芥油质蛋白启动子(W098/45461)、菜豆的菜豆球蛋白启动子(US5,504,200)、芸苔属Bce4启动子(WO91/13980)或蚕豆的豆球蛋白LeB4启动子(Baumlein等,1992)，和在诸如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等单子叶植物中引起种子特异性表达的启动子。合适的著名启动子是大麦lpt2或lpt1基因启动子(W095/15389和WO95/23230)或WO99/16890中所描述的启动子(来自于大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的米谷蛋白基因、稻的醇溶谷蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因、黑麦的黑麦碱基因的启动子)。其它启动子包括Broun等(1998)、Potenza等(2004)、US20070192902和US20030159173所描述的那些。在一个实施方案中，所述种子特异性启动子优先表达于种子的规定部分中，诸如胚、子叶或胚乳。这样的特异性启动子的实例包括但不限于FP1启动子(Ellerstrom等,1996)、豌豆豆球蛋白启动子(Perrin等,2000)、豆植物凝血素启动子(Perrin等,2000)、编码亚麻2S贮藏蛋白的基因的conlinin 1和conlinin 2启动子(Cheng等,2010)、拟南芥FAE1基因的启动子、油菜类球蛋白蛋白基因的BnGLP启动子、亚麻peroxiredoxin基因LPXR启动子。
[0585] 5'非翻译前导序列可来源于用于表达本发明多核苷酸的异源基因序列的启动子，或优选地，相对于欲产生的酶的编码区是异源的，且需要时可进行特异性修饰以增加mRNA的翻译。关于优化转基因的综述，参见Koziel等(1996)。5'非翻译区还可以获自植物病毒RNA(烟草花叶病毒、烟草蚀刻病毒、玉米矮花叶病病毒、苜蓿花叶病毒等等)、合适的真核生物基因、植物基因(小麦和玉米叶绿素a/b结合蛋白基因前导序列)或合成基因序列。本发明不限于其中所述非翻译区源自于伴随启动子序列的5'非翻译序列的构建体。前导序列也可以源自于无关的启动子或编码序列。可用于本发明上下文中的前导序列包括玉米Hsp70前导序列(US5,362,865和US5,859,347)和TMVω元件。
[0586] 转录终止是通过可操作地连接于嵌合载体中的相关多核苷酸的3'非翻译DNA序列实现。重组DNA分子的3'非翻译区含有在植物中用于将腺嘌呤核苷酸添加至RNA的3'端的多腺苷酸化信号。3'非翻译区可获自表达于植物细胞中的各种基因。就这种能力而言，常用的是胭脂碱合成酶3'未翻译区、来自于豌豆小亚单位核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因的3'未翻译区、来自于大豆7S种子贮藏蛋白基因或亚麻conlinin基因的3'未翻译区。含有农杆菌肿瘤诱导型(Ti)质粒基因的多腺苷酸化信号的3'转录非翻译区也是合适的。
[0587] 可使用重组DNA技术来提高转化多核苷酸分子的表达，例如通过操纵宿主细胞内的多核苷酸分子的拷贝数、多核苷酸分子的转录效率、所得转录物的翻译效率和翻译后修饰的效率。可用于增加本文中所定义的多核苷酸分子的表达的重组技术包括但不限于将多核苷酸分子整合至一个或多个宿主细胞染色体中、向mRNA添加稳定性序列、取代或修饰转录控制信号(例如启动子、操纵子、增强子)、取代或修饰翻译控制信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)、修饰多核苷酸分子以对应宿主细胞的密码子使用情况和缺失会使转录物不稳定的序列。
[0588] 重组细胞
[0589] 本发明还提供了一种重组细胞，优选地重组植物细胞，其是以一种或多种诸如本文中所定义的多核苷酸、嵌合基因或重组载体等重组分子转化的宿主细胞。重组细胞可包含其任何组合，诸如两种或三种重组载体，或一种重组载体与以后总或多种额外的多核苷酸或嵌合DNA。合适的本发明细胞包括可用本发明的多核苷酸、嵌合DNA或重组载体转化的任何细胞，例如编码本文中所描述的多肽或酶的分子。所述细胞优选地为由此能够用于产生LC-PUFA的细胞。重组细胞可以是培养的细胞、体外或生物体中的细胞，例如植物或诸如种子或叶等器官中的细胞。优选地，所述细胞处于植物或植物部分中，更优选地，处于植物种子中。
[0590] 引入多核苷酸的宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转化的细胞。这样的核酸分子可能与LC-PUFA合成有关或无关。本发明的宿主细胞可以内源性地(即，天然地)能够产生本文中所定义的蛋白质，在这种情况下，由其产生的重组细胞产生多肽的能力得以增强，或仅在用至少一种本发明多核苷酸转化之后能够产生这样的蛋白质。在一个实施方案中，本发明的重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸的能力有所增强。如本文中所使用，术语“合成长链多不饱和脂肪酸的能力有所增强的细胞”是一个将本发明的重组细胞与缺乏本发明多核苷酸的宿主细胞相比较的相对术语，其中与天然细胞相比，所述重组细胞产生更多长链多不饱和脂肪酸或更高浓度的LC-PUFA，诸如DHA(相对于其它脂肪酸)。合成另一种产物(例如另一种脂肪酸、脂质、诸如淀粉等碳水化合物、RNA分子、多肽、药物或其它产物)的能力有所增强的细胞具有相应的含义。
[0591] 本发明的宿主细胞可以是能够产生至少一种本文中所描述的蛋白质的任何细胞，且包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞。所述细胞可以是原核生物的或真核生物的。优选的宿主细胞是酵母和植物细胞。在一个优选实施方案中，所述植物细胞是种子细胞，确切地说是种子子叶或胚乳中的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是动物细胞或海藻细胞。动物细胞可以属于任何类型的动物，诸如非人类动物细胞、非人类脊椎动物细胞、非人类哺乳动物细胞或诸如鱼类等水生动物或甲壳类动物、无脊椎动物、昆虫等的细胞。所述细胞可属于适用于发酵方法的生物体。如本文中所使用，术语“发酵方法”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵微生物的实例包括真菌生物体，诸如酵母。如本文中所使用，“酵母”包括酵母属、酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomyces carlbergensis)、假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula spp.)、木霉属、斯氏油脂酵母(Lipomyces starkey)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。优选的酵母包括酵母属菌株，且确切地说是酿酒酵母。
[0592] 转基因植物
[0593] 本发明还提供了一种包含本发明细胞的植物，诸如包含一种或多种本发明多核苷酸的转基因植物。术语“植物”在本文中作为名词使用时是指整个植物，但在作为形容词使用时是指植物中所存在的、获自植物的、来源于植物的或与植物有关的任何物质，例如植物器官(例如叶、茎、根、花)、单个细胞(例如花粉)、种子、植物细胞等等。术语“植物部分”是指所有包括植物DNA的植物部分，包括诸如叶或茎、根、开花器官或结构、花粉、种子、种子部分(诸如胚、胚乳、盾片或种皮)、植物组织(诸如维管组织)、其细胞和子代等营养结构，只要所述植物部分能合成根据本发明的脂质即可。
[0594] “转基因植物”、“经过基因修饰的植物”或其变化形式是指含有在属于同一物种、品种或栽培变种的野生型植物中未发现的基因构建体(“转基因”)的植物。如本发明上下文中所定义的转基因植物包括使用重组技术进行基因修饰以便在所需植物或植物器官中产生本文中所定义的脂质或至少一种多肽的植物及其后代。转基因植物细胞和转基因植物部分具有相应的含义。如本文中所提到的“转基因”具有生物技术领域中的正常含义且包括通过重组DNA或RNA技术产生或改变并且引入本发明细胞、优选地植物细胞中的基因序列。转基因所包括的基因序列可来源于与引入所述转基因的植物细胞属于同一物种、品种或栽培变种的植物细胞，或来源于不同物种、品种或栽培变种的植物细胞，或来源于除植物细胞以外的细胞。典型地，转基因已经通过人为操作(诸如通过转化)而引入细胞(诸如植物)中，但可以使用本领域技术人员认可的任何方法。
[0595] 术语“种子”和“籽粒”在本文中可互换使用。“籽粒”是指成熟籽粒，诸如收获的籽粒或虽然仍在植物上但已适合收获的籽粒，但是根据上下文，也可能指吸胀或萌芽后的籽粒。成熟籽粒或种子的水分含量通常低于约18％至20％。如本文中所使用的“发育中的种子”是指成熟前的种子，典型地见于授粉或开花期后的植物繁殖结构中，但也可指从植物分离的成熟前种子。
[0596] 如本文中所使用，术语“获得植物部分”或“获得种子”分别是指获得植物部分或种子的任何手段，包括从田地或诸如温室或生长室等容器中的植物收获植物部分或种子，或通过从供应商购买或收到植物部分或种子。所述种子可适合于种植，即，能够萌芽和产生后代植物，或者已经用使其不再能够萌芽的方式进行处理，例如可用于食物或饲料应用或用于提取本发明脂质的经过破碎、抛光或碾磨的种子。
[0597] 如本文中所使用，术语“植物贮藏器官”是指专门用于以例如蛋白质、碳水化合物、脂肪酸和/或油的形式贮藏能量的植物部分。植物贮藏器官的实例是种子、果实、块状根和块茎。本发明优选的植物贮藏器官是种子。
[0598] 如本文中所使用，术语“具有正常表型”是指本发明的经过基因修饰的植物或植物器官，特别是贮藏器官，诸如种子、块茎或果实，与未经改造的植物或植物器官相比，其生长和繁殖能力未显著降低。在一个实施方案中，具有正常表型的经过基因修饰的植物或植物器官包含可操作地连接于植物贮藏器官特异性启动子的编码沉默阻抑因子的外源多核苷酸，且与不包含所述多核苷酸的同基因植物或器官具有基本上相同的生长或繁殖能力。优选地，当在相同条件下生长时，所产生的生物量、生长率、萌芽率、贮藏器官大小、种子大小和/或活种子数目与缺乏所述外源多核苷酸的植物相比不低于后者的90％。该术语不涵盖可能不同于野生型植物但不影响植物用于商业目的的适用性的植物特征，诸如幼苗叶子的芭蕾舞裙样表型。
[0599] 本发明所提供的或预期用于实施本发明的植物包括单子叶植物和双子叶植物。在优选的实施方案中，本发明的植物是农作物植物(例如谷类和豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯、稻、高粱、粟、木薯、大麦或豌豆)或其它豆科植物。可以种植所述植物以产生可食用的根、块茎、叶、茎、花或果实。所述植物可以是蔬菜或观赏植物。本发明的植物可以是：玉米(玉米)、芸苔(油菜、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.))、芥菜(芥菜)、亚麻(亚麻)、紫花苜蓿(紫苜蓿)、稻(水稻)、黑麦(黑麦(Secale cerale))、高粱(二色高粱、甜高粱)、向日葵(向日葵(Helianthus annus))、小麦(小麦(Tritium aestivum))、大豆(大豆)、烟草(普通烟草)、马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))、花生(落花生)、棉花(陆地棉)、甜薯(甜薯(Lopmoea batatus))、木薯(木薯(Manihot esculenta))、咖啡(咖啡(Cofea spp.))、椰子(椰子(Cocos nucifera))、凤梨(菠萝)、柑桔(柑橘(Citrus spp.))、可可(可可(Theobroma cacao))、茶(茶(Camellia senensis))、香蕉(香蕉(Musa spp.))、鳄梨(鳄梨)、无花果(无花果(Ficus casica))、番石榴(番石榴(Psidium guajava))、芒果(芒果(Mangifer indica))、橄榄(橄榄)、番木瓜(番木瓜)、腰果(腰果(Anacardium occidentale))、夏威夷果(夏威夷果(Macadamia intergrifolia))、杏仁(巴旦杏)、甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、燕麦或大麦。
[0600] 在一个优选的实施方案中，所述植物是被子植物。
[0601] 在一个实施方案中，所述植物是油料种子植物，优选地油料种子农作物植物。如本文中所使用，“油料种子植物”是用于由植物的种子商品化生产油的植物物种。油料种子植物可以是油料种子油菜(诸如芸苔)、玉米、向日葵、大豆、高粱、亚麻(亚麻子)或甜菜。此外，油料种子植物可以是其它芸苔属、棉花、花生、罂粟、芥菜、蓖麻子、芝麻、红花或产生坚果的植物。植物在其果实中可产生高水平的油，诸如橄榄、油棕或椰子。本发明可应用的园艺植物是莴苣、菊苣或芸苔属蔬菜，包括甘蓝、椰菜或花椰菜。本发明可应用于烟草、葫芦、胡萝卜、草莓、番茄或胡椒。
[0602] 在另一个优选的实施方案中，用于产生本发明的转基因植物的非转基因植物(尤其是在种子中)所产生的油具有i)少于20％、少于10％或少于5％的18:2脂肪酸和/或ii)少于10％或少于5％的18:3脂肪酸。
[0603] 在一个优选的实施方案中，转基因植物对于已经引入的各个和每个基因(转基因)都是纯合的，所以其后代的所需表型不会分离。转基因植物对于所引入的转基因也可能是杂合的，优选地对于所述转基因一律是杂合的，诸如由杂交种子生长而来的F1子代。这样的植物可以提供诸如本领域中众所周知的杂种优势等优势。
[0604] 在相关的情况下，转基因植物还可以包含编码参与产生LC-PUFA的酶的额外的转基因，诸如但不限于Δ6-去饱和酶、Δ9-延长酶、Δ8-去饱和酶、Δ6-延长酶、Δ5-去饱和酶、ω3-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ5-延长酶、二酰基甘油酰基转移酶、LPAAT、Δ17-去饱和酶、Δ15-去饱和酶和/或Δ12去饱和酶。具有一种或多种这些活性的这样的酶的实例在本领域中是已知的且包括本文中所描述的那些。在具体实例中，转基因植物至少包含编码以下各项的外源多核苷酸：
[0605] a)Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-延长酶和Δ6-延长酶；
[0606] b)Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-延长酶和Δ9-延长酶；
[0607] c)Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-延长酶、Δ6-延长酶和Δ15-去饱和酶；
[0608] d)Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-延长酶、Δ9-延长酶和Δ15-去饱和酶；
[0609] e)Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-延长酶、Δ6-延长酶和Δ17-去饱和酶；或
[0610] f)Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-延长酶、Δ9-延长酶和Δ17-去饱和酶。
[0611] 在一个实施方案中，外源多核苷酸编码多肽集合，所述多肽集合是畸雌腐霉Δ6-去饱和酶、破囊壶菌Δ5-去饱和酶或球石藻(Emiliana huxleyi)Δ5-去饱和酶、小立碗藻Δ6-延长酶、破囊壶菌Δ5-延长酶或青绿藻Δ5-延长酶、致病疫霉ω3-去饱和酶或畸雌腐霉ω3-去饱和酶和破囊壶菌Δ4-去饱和酶。
[0612] 在一个实施方案中，本发明的植物被种植在田地中，优选地作为至少1,000或1,000,000株基本上相同的植物的群体，或种植在至少1公顷的面积中。种植密度根据植物物种、植物品种、气候、土壤条件、施肥速率和如本领域中已知的其它因素而不同。举例来说，典型地以120至150万株植物/公顷的种植密度种植芸苔。如本领域中已知来收获植物，这可以包括捆晒、割晒和/或收割植物，随后脱粒和/或簸选植物材料以分离种子与植物部分的其余部分(通常呈谷壳形式)。或者，可以用单一方法，例如联合收割机从田地中的植物收获种子。
[0613] 植物的转化
[0614] 可使用本领域中已知的技术来产生转基因植物，诸如以下文献中大体描述的 那 些 技 术：A.Slater 等 ,Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)；和P.Christou和H.Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley and Sons(2004)。
[0615] 如本文中所使用，术语“稳定转化”和其变化形式是指将外源核酸分子整合至细胞的基因组中，由此在细胞分裂过程中将其转移至后代细胞而无需对其存在进行阳性选择。可通过本领域中已知的任何手段选择稳定转化体或其子代，诸如染色体DNA上的Southern印迹或基因组DNA的原位杂交。
[0616] 农杆菌介导的转移是用于将基因引入植物细胞中的广泛适用系统，这是因为DNA可以引入整个植物组织或植物器官或组织培养的外植体的细胞中，以便瞬时表达或将DNA稳定整合在植物细胞基因组中。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞中在本领域中是众所周知的(参见例如US5177010、US5104310、US5004863或US5159135)，包括使用农杆菌或其它可将DNA转移至植物细胞中的细菌的花序浸染法。欲转移的DNA区由边界序列限定，且间插DNA(T-DNA)通常被插入植物基因组中。此外，T-DNA的整合是相对精确的过程，其极少产生重排。由于基因转移的简便和确定性，其在有效发生农杆菌介导的转化的那些植物品种中成为首选的方法。优选的农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌中复制，从而允许便利的操作，如Klee等,Plant DNA Infectious Agents,Hohn和Schell编,Springer-Verlag,New York,pp.179-203(1985)所描述。
[0617] 可使用的加速方法包括例如微粒轰击等等。将转化核酸分子递送至植物细胞的方法的一个实例是微粒轰击。该方法的综述见Yang等,Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,Oxford Press,Oxford,England(1994)。非生物学粒子(微粒)可涂有核酸且被推进力递送至细胞中。示例性粒子包括由钨、金、铂等等构成的那些。微粒轰击除了是一种可再现地转化单子叶植物的有效手段以外，其特别优势还在于既不需要分离原生质体，又不需要对农杆菌感染的易感性。
[0618] 在另一个替代实施方案中，可稳定地转化质体。已公开的用于在高等植物中进行质体转化的方法包括粒子枪递送含有选择标记物的DNA和通过同源重组使DNA靶向质体基因组(US5,451,513、US5,545,818、US5,877,402、US5,932479和WO99/05265)。
[0619] 还可以使用其它细胞转化方法，且包括但不限于通过直接将DNA转移至花粉中、通过直接将DNA注入植物的繁殖器官中或通过将DNA直接注入未成熟胚的细胞中随后对脱水的胚进行复水而将DNA引入植物中。
[0620] 从单个植物原生质体转化体或从各种转化外植体再生、发育和载培植物在本领域中是众所周知的(Weissbach等,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,Calif.,(1988)。这种再生和生长方法典型地包括以下步骤：选择经转化的细胞，培养那些个体化细胞经过胚发育至生根幼苗阶段的通常阶段。转基因胚和种子的再生方式类似。此后将所得转基因生根苗栽植在适当的植物生长培养基(诸如土壤)中。
[0621] 含有外来的外源基因的植物的发育或再生在本领域中是众所周知的。优选地，再生的植物经自花授粉以产生纯合转基因植物。或者，将获自再生的植物的花粉与具有重要农艺价值的株系的种子长成的植物进行杂交。反之，将得自于这些重要株系的植物的花粉用于对再生的植物授粉。通过使用本领域技术人员所熟知的方法栽培含有所要外源核酸的本发明转基因植物。
[0622] 为了证实转基因细胞和植物中存在转基因，可使用本领域技术人员已知的方法来进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。取决于产物的性质，可用多种方式中的任一种来检测转基因表达产物，且包括Western印迹和酶测定。在获得转基因植物后，可使其生长以产生具有所要表型的植物组织或部分。可收获植物组织或植物部分，和/或收集种子。种子可充当用于生长出含具有所要特征的组织或部分的其它植物的来源。
[0623] 使用农杆菌或其它转化方法形成的转基因植物典型地含有位于一个染色体上的单个基因座。这样的转基因植物可称为对于所添加的基因是半合的。更优选的转基因植物对于所添加的基因是纯合的，即，转基因植物含有两个添加的基因，一对染色体的各染色体上在同一基因座上具有一个基因。可通过半合转基因植物自花授粉，从而使所产生的一些种子萌芽并分析所得植物中的相关基因来获得纯合转基因植物。
[0624] 还应理解，还可以使含有两种独立地分离外源基因或基因座的两种不同的转基因植物杂交(交配)，以产生含有两组基因或基因座的后代。适当的F1子代的自花授粉可产生对于两种外源基因或基因座都是纯合的植物。还预期与亲本植物回交和与非转基因植物异系杂交，以及营养体繁殖。通常用于不同性状和农作物的其它育种方法的描述可见于Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.编,American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987)。
[0625] 提高的外源RNA水平和稳定的表达
[0626] 沉默阻抑物
[0627] 在一个实施方案中，本发明的细胞、植物或植物部分包含编码沉默阻抑蛋白的外源多核苷酸。
[0628] 转录后基因沉默(PTGS)是核苷酸序列特异性防卫机制，其可靶向细胞和病毒mRNA以便降解。PTGS存在于经外来(异源)或内源DNA稳定或瞬时转化的植物或真菌中，且导致与所引入的核酸具有序列相似性的RNA分子的累积减少。
[0629] 广泛认为沉默阻抑物与相关转基因的共表达将提高由转基因转录而来的细胞中所存在的RNA的水平。尽管这在体外被证明是正确的，但在许多整株植物共表达研究中已经观察到显著副作用。更具体地说，如Mallory等(2002)、Chapman等(2004)、Chen等(2004)、Dunoyer等(2004)、Zhang等(2006)、Lewsey等(2007)和Meng等(2008)中所描述，表达沉默阻抑物(一般在组成型启动子的控制之下)的植物的表型异常程度往往导致其无法用于商业生成。
[0630] 最近，已发现可通过将沉默阻抑物表达局限于植物种子或其部分来提高RNA分子水平和/或使RNA分子水平稳定许多世代(WO2010/057246)。如本文中所使用，“沉默阻抑蛋白”或SSP是可表达于植物细胞中，从而提高来自于植物细胞中的不同转基因的表达产物的水平(特别是经过从最初转化植物反复传代后)的任何多肽。在一个实施方案中，所述SSP是病毒沉默阻抑物或其突变体。许多病毒沉默阻抑物在本领域中是已知的，且包括但不限于P19、V2、P38、Pe-Po和RPV-P0。在一个实施方案中，病毒沉默阻抑物包含如下氨基酸，所述氨基酸具有如SEQ ID NO 53至57中任一个所提供的序列、其生物学活性片段或与SEQ ID NO 53至57中的任何一个或多个具有至少50％同一性的氨基酸序列，并且具有沉默阻抑物的活性。
[0631] 如本文中所使用，术语“使表达稳定”、“稳定地表达”、“稳定的表达”及其变化形式是指经反复传代(例如至少3代、至少5代或至少10代)后子代植物中的RNA分子水平与缺乏编码所述沉默阻抑物的外源多核苷酸的同基因植物相比基本上相同或较高。然而，该术语不排除经反复传代后RNA分子水平与前一代相比存在一定损失，例如每代损失不少于10％的可能性。
[0632] 阻抑物可选自任何来源，例如植物、病毒、哺乳动物等。参见WO2010/057246中可获得阻抑物的病毒的列表，和来自于各特定病毒的阻抑物的蛋白质(例如B2、P14等)或编码区名称。可以使用阻抑物的多个拷贝。不同的阻抑物可以一起使用(例如以串联方式)。
[0633] RNA分子
[0634] 基本上任何需要表达于植物种子中的RNA分子都可以与沉默阻抑物一起共表达。所编码的多肽可参与油、淀粉、碳水化合物、营养物等的代谢，或可以负责合成蛋白质、肽、脂肪酸、脂质、蜡、油、淀粉、糖、碳水化合物、香味、气味、毒素、类胡萝卜素、激素、聚合物、类黄酮、贮藏蛋白、酚酸、生物碱、木质素、丹宁酸、维生素、糖蛋白、糖脂等，优选地负责TAG的生物合成或组装。
[0635] 在一个特定的实例中，植物所产生的用于在植物(诸如芸苔属植物，例如芸苔或向日葵、红花、亚麻、棉花、大豆、亚麻荠或玉米)中产生油的酶的水平有所增加。
[0636] 所产生的LC-PUFA的水平
[0637] 重组细胞或诸如种子等植物部分中所产生的LC-PUFA或LC-PUFA组合的水平十分重要。所述水平可以表示为特定LC-PUFA或一组相关LC-PUFA(例如ω3LC-PUFA或ω6LC-PUFA)或VLC-PUFA或其它占总脂肪酸组成(以百分比表示)，这可以通过本领域中已知的方法来确定。所述水平还可以表示为LC-PUFA含量，例如LC-PUFA占包含所述重组细胞的材料的干重的百分比，例如LC-PUFA占种子干重的百分比。应了解，就LC-PUFA含量而言，油料种子中所产生的LC-PUFA可显著高于不是为了产油而种植的蔬菜或籽粒，但两者可具有相似的LC-PUFA组成，且两者都可以用作人类或动物摄入LC-PUFA的来源。
[0638] 可通过本领域中已知的任何方法测定LC-PUFA的水平。在一种优选的方法中，从细胞、组织或生物体提取总脂质，并且将脂肪酸转化成甲酯，随后通过气相色谱法(GC)进行分析。实施例1中描述了这样的技术。色谱中的峰位置可用于鉴别各特定脂肪酸，且积分得到的各峰下的面积用于确定量。如本文中所使用，除非另有说明，否则样品中特定脂肪酸的百分比是根据该脂肪酸的峰下面积占色谱中的脂肪酸总面积的百分比来确定。这基本上对应于重量百分比(w/w)。脂肪酸的鉴别可以通过GC-MS来证实。总脂质可以通过本领域中已知的用于纯化级分(诸如TAG级分)的技术进行分离。举例来说，可以进行分析规模的薄层色谱法(TLC)以分离TAG与其它脂质级分，诸如DAG、酰基-CoA或磷脂，以便确定TAG的具体脂肪酸组成。
[0639] 在一个实施方案中，所提取的脂质中的脂肪酸中ARA、EPA、DPA和DHA的总和在细胞中的总脂肪酸的约7％与约25％之间。在另一个实施方案中，细胞中的总脂肪酸具有少于1％的C20:1。在优选的实施方案中，细胞中的可提取TAG包含本文中所提到的水平的脂肪酸。还涵盖了界定如本文中所描述的脂质的特征的各可能组合。
[0640] 重组细胞、植物或植物部分(诸如种子)中的LC-PUFA产生水平还可以表示为特定底物脂肪酸转化成一种或多种产物脂肪酸的转化百分比，这在本文中也称为“转化效率”或“酶效率”。这个参数是基于从细胞、植物、植物部分或种子中提取的脂质中的脂肪酸组成，即，所形成的LC-PUFA(包括由其衍生的其它LC-PUFA)的量占一种或多种脂肪酸(包括由其衍生的所有其它脂肪酸)的百分比。转化百分比的通式是：100×(产物LC-PUFA和由其衍生的所有产物的百分比的总和)/(底物脂肪酸和由其衍生的所有产物的百分比总和)。举例来说，就DHA而言，这可以表示为DHA水平(呈占脂质中总脂肪酸含量的百分比形式)与底物脂肪酸(例如OA、LA、ALA、SDA、ETA或EPA)和来源于所述底物的除DHA以外的所有产物的水平的比率。可以表示途径中的单个酶促步骤或途径的部分或整体的转化百分比或转化效率。
[0641] 本文中根据以下各式计算特定转化效率：
[0642] 1.OA到DHA＝100x(％DHA)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0643] 2.LA到DHA＝100x(％DHA)/(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0644] 3.ALA到DHA＝100x(％DHA)/(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0645] 4.EPA到DHA＝100x(％DHA)/(EPA、DPA和DHA的总％)。
[0646] 5.DPA到DHA(Δ4-去饱和酶效率)＝100x(％DHA)/(DPA和DHA的总％)。
[0647] 6.Δ12-去饱和酶效率＝100x(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0648] 7.ω3-去饱和酶效率＝100x(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)/(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0649] 8.OA到ALA＝100x(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0650] 9.Δ6-去饱和酶效率(对ω3底物ALA)＝100×(SDA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)/(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0651] 10.Δ6-延长酶效率(对ω3底物SDA)＝100×(ETA、EPA、DPA和DHA的总％)/(SDA、ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0652] 11.Δ5-去饱和酶效率(对ω3底物ETA)＝100×(EPA、DPA和DHA的总％)/(ETA、EPA、DPA和DHA的总％)。
[0653] 12.Δ5-延长酶效率(对ω3底物EPA)＝100×(DPA和DHA的总％)/(EPA、DPA和DHA的总％)。
[0654] 对于总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸或新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸，本发明脂质(优选地种子油)的脂肪酸组成的特征还在于总脂肪酸含量中的ω6脂肪酸:ω3脂肪酸的比率。术语总ω6脂肪酸、总ω3脂肪酸、新ω6脂肪酸和新ω3脂肪酸具有如本文中所定义的含义。所述比率是用如本文中所例示的方式根据从细胞、植物、植物部分或种子中提取的脂质中的脂肪酸组成进行计算。需要脂质中的ω3脂肪酸水平大于ω6脂肪酸水平，且因此ω6:ω3比率小于1.0是优选的。比率0.0指示完全不存在所定义的ω6脂肪酸；比率0.03是如实施例6中所描述来实现。这样的低比率可以通过组合使用偏好ω3底物的Δ6-去饱和酶与ω3-去饱和酶，特别是真菌ω3-去饱和酶，诸如本文中所例示的巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶来实现。
[0655] 每单位重量种子的LC-PUFA产率也可以基于种子中的总油含量和油中的DHA％进行计算。举例来说，如果芸苔种子的油含量为约40％(w/w)且油的总脂肪酸含量的约12％是DHA，则种子的DHA含量为约4.8％或约48mg/g种子。如实施例2中所描述，油含量低于芸苔且具有约9％DHA的拟南芥种子的DHA含量为约25mg/g种子。在DHA含量为约7％时，芸苔种子或亚麻荠种子的DHA含量为约28mg/g种子。因此，本发明提供了油菜、芥菜和亚麻荠植物和由其获得的种子，其包含至少约28mg DHA/g种子。所述种子的水分含量对于干透之后的所收获成熟种子是标准的(4％至15％水分)。本发明还提供了一种用于获得油的方法，包括获得种子和从所述种子提取油；以及油的用途和获得种子的方法，包括从根据本发明的植物收获种子。
[0656] 如果每公顷的种子产量是已知的或可估计的，则也可以计算每公顷产生的DHA的量。举例来说，在澳大利亚，每公顷芸苔典型地产生约2.5吨种子，这在40％油含量下产生约1000kg油。在总油中存在12％DHA时，这提供约120kg DHA/公顷。如果油含量减少50％，则这仍能提供约60kg DHA/ha。
[0657] 迄今为止，证据表明一些异源表达于酵母或植物中的去饱和酶在一些延长酶组合时具有相对较低的活性。这可以通过在LC-PUFA合成中提供能够使用脂肪酸的酰基-CoA作为底物的去饱和酶来缓和，且这在重组细胞中，特别是在植物细胞中被认为是有利的。用于有效DHA合成的特别有利的组合是真菌ω3-去饱和酶，例如巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶(SEQ IDNO:12)，其中Δ6-去饱和酶偏好ω3酰基底物，诸如细小微胞藻Δ6-去饱和酶(SEQ ID NO:13)，或其具有至少95％氨基酸序列同一性的变体。
[0658] 如本文中所使用，术语“基本上不含”意味着组合物(例如脂质或油)包含极少(例如少于约0.5％、少于约0.25％、少于约0.1％或少于约0.01％)或不含所定义的组分。在一个实施方案中，“基本上不含”意味着使用常规分析技术无法检测出所述组分，例如，如实施例1中所述，使用气相色谱法无法检测到特定脂肪酸(诸如ω6-二十二碳五烯酸)。
[0659] 油的产生
[0660] 可以使用本领域中常规实行的技术来提取、处理和分析由本发明的细胞、植物、种子等产生的油。典型地，植物种子经熟化、压榨和提取以产生粗油，然后进行脱胶、精制、脱色和除臭。总体来说，用于压碎种子的技术在本领域中是已知的。举例来说，可以通过给油料种子喷水使其软化，使水分含量提高至例如8.5％，并且使用间隙设置为0.23至0.27mm的平滑辊筒将其制成薄片。取决于种子类型，在压碎之前可以不加水。施加热使酶失活，促进进一步破坏细胞，使油滴凝结，且使蛋白质粒子凝聚，所有这些都有助于提取加工。
[0661] 在一个实施方案中，通过螺旋压榨机来释放大多数种子油。然后使用热追踪柱对螺旋压榨机排出的料饼进行溶剂提取，例如用己烷。或者，可以使压榨操作所产生的粗油通过沉降槽，其具有狭缝状线路引流顶部以去除压榨操作过程中与油一起挤出的固体。可以使经过净化的油通过板框式压滤机以去除任何剩余的精细固体粒子。如果需要，可将由提取方法回收的油与经过净化的油组合以产生掺合的粗油。
[0662] 在从粗油中汽提溶剂后，将压榨的和提取的部分组合并对其进行正常的油加工程序。如本文中所使用，术语“纯化”在结合本发明的脂质或油使用时典型地意味着已经对提取的脂质或油进行了一个或多个提高脂质/油组分纯度的加工步骤。举例来说，纯化步骤可以包括对所提取的油进行由以下各项组成的群组中的一项或多项或全部：脱胶、脱臭、脱色、干燥和/或分级。然而，如本文中所使用，术语“纯化”不包括酯基转移方法或能改变本发明脂质或油的脂肪酸组成以增加DHA含量(呈占总脂肪酸含量的百分比形式)的其它方法。换句话表达，纯化脂质或油的脂肪酸组成基本上与未纯化脂质或油的相同。
[0663] 脱胶
[0664] 脱胶是油类精制中的早期步骤，且其主要目的是从油中去除大部分磷脂，其存在量可占总提取脂质的约1％至2％。向粗油中添加约2％水(典型地含有磷酸，70℃至80℃)，从而分离大部分磷脂，伴随痕量金属和颜料。所去除的不溶性材料主要是磷脂与三酰基甘油的混合物，并且也称为卵磷脂。脱胶可通过向粗种子油中添加浓磷酸以便将不可水合之磷脂转化成可水合形式并且使所存在的微量金属螯合来进行。通过离心从种子油中分离胶。
[0665] 碱精制
[0666] 碱精制是用于处理粗油的精制方法之一，有时也称为中和。其通常在脱胶之后且在脱色之前进行。在脱胶之后，可以通过添加足以滴定所有脂肪酸和磷酸的量的碱溶液且去除由此形成的肥皂对种子油进行处理。合适的碱性材料包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化锂、氢氧化钙、碳酸钙和氢氧化铵。这个方法典型地在室温下进行且去除游离脂肪酸级分。通过离心或通过萃取至针对肥皂溶剂中来去除肥皂，且用水洗涤经过中和的油。如果需要，则油中的任何过量碱都可以用诸如盐酸或硫酸等合适的酸中和。
[0667] 脱色
[0668] 脱色是一项精制方法，其在90℃至120℃下在存在漂白土(0.2％至2.0％)和不存在氧气(通过用氮气或蒸汽操作)的情况下或在真空中将油加热10至30分钟。这个步骤在油加工中旨在去除不需要的颜料(类胡萝卜素、叶绿素、棉籽酚等)，并且该方法还去除氧化产物、痕量金属、含硫化合物和痕量肥皂。
[0669] 脱臭
[0670] 除臭是在高温(200℃至260℃)和低压(0.1至1mm Hg)下对油类和脂肪进行的一项处理。这典型地通过以约0.1ml/min/100ml种子油的速率向种子油中引入蒸汽来实现。在喷射约30分钟之后，允许种子油在真空下冷却。典型地将种子油转移至玻璃容器且用氩气冲洗，随后在冷冻下存储。这项处理改良种子的颜色并且去除大多数挥发性物质或臭味化合物，包括任何剩余游离脂肪酸、单酰基甘油和氧化产物。
[0671] 冻凝
[0672] 冻凝是油类商业生产中有时会用到的一项方法，其通过在低于环境的温度下进行结晶将油类和脂肪分成固体(硬脂)和液体(油精)级分。其最初被应用于棉籽油以产生无固体产物。其典型地用于降低油的饱和脂肪酸含量。
[0673] 酯基转移
[0674] 酯基转移是一种在TAG内和TAG之间交换脂肪酸或将脂肪酸转移至另一种醇以形成酯的方法，其是以从TAG释放呈游离脂肪酸或脂肪酸酯(通常为脂肪酸甲酯或乙酯)形式的脂肪酸为起点。当与分级方法组合时，酯基转移可用于修饰脂质的脂肪酸组成(Marangoni等,1995)。酯基转移可使用化学(例如强酸或碱催化)或酶促手段，后者使用脂肪酶，所述脂肪酶可能对TAG上的脂肪酸具有位置特异性(sn-1/3或sn-2特异性)，或偏好一些脂肪酸(Speranza等,2012)。可以通过本领域中已知的任何方法实现脂肪酸分级以提高油中的LC-PUFA浓度，诸如冷冻结晶、使用尿素的复合物形成、分子蒸馏、超临界流体萃取和银离子错合。利用尿素的复合物形成因其简单性和在降低油中的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸水平方面的效率而成为优选的方法(Gamez等,2003)。起初，通过在酸或碱催化的反应条件下进行水解，借此使1mol TAG与至少3mol醇(例如用于乙酯的乙醇或用于甲酯的甲醇)在过量醇(用于使得能够分离所形成的烷基酯与同时形成的甘油)下反应或通过脂肪酶使油中的TAG分裂成其组成脂肪酸，通常呈脂肪酸酯形式。然后可将脂肪酸组成中通常不会被处理改变的这些游离脂肪酸或脂肪酸酯与尿素的乙醇溶液混合以进行复合物形成。饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸容易地与尿素复合且在冷却时结晶析出，且随后可利用过滤将其去除。从而使未与尿素复合的级分富含LC-PUFA。
[0675] 饲料
[0676] 本发明包括可用作饲料的组合物。出于本发明的目的，“饲料”包括供人类或动物摄入的任何食物或制品，当进入身体后，(a)用于营养或强化组织或供应能量；和/或(b)保持、恢复或支持足够的营养状况或代谢功能。本发明的饲料包括用于婴儿和/或幼儿的营养组合物，诸如本发明的婴儿配方食品和种子粕。
[0677] 本发明的饲料包含例如本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明的方法的产物、本发明的发酵方法的产物或组合物以及合适的载体。术语“载体”在其最广泛意义上用于涵盖可能具有或不具有营养价值的任何组分。本领域技术人员应了解，载剂必须适用于饲料中(或以足够低的浓度使用)，以便其不会对摄入饲料的生物体产生有害作用。
[0678] 本发明的饲料包含使用本文中公开的方法、细胞或植物直接或间接产生的油、脂肪酸酯或脂肪酸。组合物可呈固体或液体形式。另外，组合物可包括特定用途所需的量的可食用的常量营养物、蛋白质、碳水化合物、维生素和/或矿物。这些成分的量将取决于组合物打算用于正常个体还是用于具有特殊需要的个体(诸如患有代谢病症的个体等)而变化。
[0679] 具有营养价值的合适载剂的实例包括但不限于常量营养物，诸如可食用的脂肪、碳水化合物和蛋白质。这样的可食用脂肪的实例包括但不限于椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑加仑油、大豆油和甘油单酯和甘油二酯。这样的碳水化合物的实例包括(但不限于)：葡萄糖、可食用乳糖和水解淀粉。另外，本发明的营养组合物中可利用的蛋白质的实例包括(但不限于)大豆蛋白、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳汁乳清或这些蛋白质的水解产物。
[0681] 本发明的饲料组合物中所利用的组分可以是半纯化或纯化来源的。半纯化或纯化意味着通过纯化天然材料或通过从头合成而制备的材料。
[0682] 本发明的饲料组合物也可以添加至食物中，即使当不需要对饮食进行补充时。举例来说，组合物可以添加至任何类型的食物中，包括(但不限于)：人造黄油、改性黄油、奶酪、乳汁、酸奶、巧克力、糖果、点心、色拉油、烹饪用油、肉、鱼和饮料。
[0683] 酵母属用于酿造啤酒和葡萄酒以及作为烘焙用剂，特别是面包。其它酵母，诸如产油酵母，包括例如耶氏酵母，也可用于LC-PUFA产生。酵母可以用作动物饲料中的添加剂，诸如用于水产养殖。显而易见，可提供适于合成如本文中所描述的LC-PUFA的经基因工程改造的酵母菌株。这些酵母菌株或其中所产生的LC-PUFA随后可用于食品以及酒和啤酒酿造，以便提供脂肪酸含量有所提高的产物。
[0684] 另外，根据本发明产生的脂肪酸或经转化而含有并表达受试者基因的宿主细胞也可以用作动物食物补充剂以改变动物的组织、卵或乳汁的脂肪酸组成，使其更合乎人类或动物摄入的需要。这样的动物的实例包括羊、牛、马、家禽(诸如鸡)等。
[0685] 此外，本发明的饲料可用于水产养殖以提高供人类或动物摄入的鱼类或甲壳动物(诸如对虾)中的脂肪酸水平。优选的鱼类是鲑鱼。
[0686] 本发明的优选饲料是植物、种子和其它植物部分，诸如叶和茎，其可以直接用作人类或其它动物的食物或饲料。举例来说，动物可以直接生长在生长这样的植物的田间放牧，或以更加定量的控制饲养方式喂食。本发明包括使用这样的植物和植物部分作为饲料以增加人类和其它动物的LC-PUFA水平。
[0687] 组合物
[0688] 本发明还涵盖组合物，特别是药物组合物，所述组合物包含一种或多种使用本发明方法产生的脂肪酸和/或所得油。
[0689] 药物组合物可包含一种或多种脂肪酸和/或油连同众所周知的标准无毒药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂，诸如磷酸盐缓冲生理盐水、水、乙醇、多元醇、植物油、润湿剂或乳液，诸如水/油乳液。组合物可呈液体或固体形式。举例来说，组合物可以呈片剂、胶囊、可摄取液体或粉剂、可注射剂或局部用软膏或乳膏剂。可通过例如在分散液情况下保持所需粒度和通过使用表面活性剂来保持适当流动性。还可能需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等等。除了这样的惰性稀释剂以外，所述服组合物还可以包括佐剂，诸如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
[0691] 可使用本领域中众所周知的技术来制备固体剂型，诸如片剂和胶囊剂。举例来说，根据本发明产生的脂肪酸可与诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉等常规片剂基质连同诸如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶等粘合剂、诸如马铃薯淀粉或海藻酸等崩解剂和诸如硬脂酸或硬脂酸镁等润滑剂一起进行制片。可通过将这些赋形剂与抗氧化剂和相关脂肪酸一起并入明胶胶囊中来制备胶囊剂。
[0692] 对于静脉内施用，可将根据本发明产生的脂肪酸或其衍生物并入商业制品中。
[0693] 特定脂肪酸的典型剂量是0.1mg至20g，每天摄取1至5次(多达每天100g)，且优选地在每天约10mg至约1、2、5或10g范围内(摄取一个或多个剂量)。如本领域中已知，每天需要最少约300mg脂肪酸，尤其是LC-PUFA。然而，应了解，任何量的脂肪酸都将有益于受试者。
[0694] 本发明的药物组合物的可能施用途径包括例如肠内(例如口服和直肠)和肠胃外。举例来说，可口服或经直肠施用液体制剂。另外，可将均质混合物完全分散在水中，在无菌条件下与生理学上可接受的稀释剂、防腐剂、缓冲剂或推进剂混合以形成喷雾或吸入剂。
[0695] 待施用于患者的所述组合物的剂量可以由本领域技术人员确定，且取决于各种因素，诸如患者的体重、患者的年龄、患者的总体健康状况、患者的既往病史、患者的免疫状态等。
[0696] 另外，本发明的组合物可用于化妆品目的。其可添加至预先存在的化妆品组合物中以便形成混合物，或可将根据发明产生的脂肪酸用作化妆品组合物中的唯一“活性”成分。实施例
[0697] 实施例1.材料和方法
[0698] 以瞬时表达系统在植物细胞中表达基因
[0699] 基本上如Voinnet等(2003)和Wood等(2009)所描述用瞬时表达系统在植物细胞中表达外源基因构建体。将含有欲由诸如CaMV 35S启动子等强组成型启动子表达的编码区的质粒引入根癌农杆菌菌株AGL1中。如WO 2010/057246中所描述将用于表达p19病毒沉默阻抑物的嵌合基因35S:p19单独地引入AGL1中。使重组农杆菌细胞在补充有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的28℃LB培养液中生长到静止期。然后通过在室温下在5000g下离心15min使细菌形成球粒，随后再悬浮于含有10mM MES pH 5.7、10mM MgCl2和100μΜ乙酰丁香酮的浸润缓冲液中，达到OD600＝1.0。然后在28℃下将细胞振荡孵育3小时，随后将相等体积的含35S:p19和相关测试嵌合构建体的农杆菌培养物混合，随后浸润至叶组织中。在浸润之后，典型地使植物再生长5天，随后获取叶盘并冻干以便对脂肪酸进行GC分析。
[0700] 通过在80℃下在甲醇/HCl/二氯甲烷(10/1/1v/v)溶液中将样品与已知量的作为内标物的十六酸一起孵育2小时来产生冻干样品中的总叶脂质的脂肪酸甲酯(FAME)。在己烷/DCM中提取FAME，在己烷中浓缩至较小体积且注入GC。脂质级分中所存在的个别脂肪酸和总脂肪酸的量是基于已知量的内标物进行定量。
[0701] 脂肪酸的气相色谱(GC)分析
[0702] 通过气相色谱分析FAME，使用Agilent Technologies 7890A GC(Palo Alto，California，USA)，其配备有30m SGE-BPX70柱(70％氰基丙基聚硅亚苯基硅氧烷，0.25mm内径，0.25mm膜厚度)、FID、分流/不分流注射器和Agilent Technologies 7693系列自动采样器和注射器。使用氦气作为载气。在150℃炉温下以分流模式(50:1比率)注入样品。注入后，将炉温保持在150℃下持续1min，然后以3℃/min升至210℃，再以50℃/min升至240℃，且最终在240℃下保持1.4min。用Agilent Technologies ChemStation软件(Rev B.04.03(16)，Palo Alto，California，USA)，基于已知量的外标物GLC-411(Nucheck)和C17:0-ME内标物的反应对峰进行定量。
[0703] 脂质的液相色谱质谱(LC-MS)分析
[0704] 从冻干的开花后12天(daf)的发育种子和添加已知量的tri-C17:0-TAG作为内部定量标准物之后的成熟种子提取总脂质。将所提取的脂质每5mg干材料溶解于1mL含10mM丁基化羟基甲苯的丁醇:甲醇(1:1v/v)中，且使用Agilent 1200系列LC和6410b电喷雾电离三级四极LC-MS进行分析。使用在二元梯度下以0.2mL/min的流速操作的Ascentis Express RP-Amide柱(50mm×2.1mm，2.7μm，Supelco)对脂质进行色谱分离。移动相是：A.10mM H2O中的甲酸铵:甲醇:四氢呋喃(50:20:30v/v/v)；B.10mM H2O中的甲酸铵:甲醇:四氢呋喃(5:20:75，v/v/v)。多重反应监测(MRM)列表是基于以下主要脂肪酸：16:0、18:0、18:1、18:2、18:3、18:4、20:1、20:2、20:3、20:4、20:5、22:4、22:5、22:6，使用碰撞能30V和破碎电压60V。个别MRM TAG是基于氨合前驱离子和产物离子由22:6的中和损失而鉴别。TAG是使用10μΜ三硬脂酸甘油酯外标物进行定量。
[0705] 测定种子脂肪酸分布和油含量
[0706] 在欲测定种子油含量的情况下，在干燥器中将种子干燥24h，并且将大约4mg种子转移至含有聚四氟乙烯内衬螺帽的2ml玻璃瓶中。将溶解于0.1ml甲苯中的0.05mg甘油三十七烷酸酯添加至该小瓶中作为内标物。
[0707] 藉由向含有种子材料的小瓶中添加0.7ml 1N甲醇盐酸溶液(Supelco)，简单涡旋且在80℃下孵育2h来制备种子FAME。冷却至室温后，向小瓶中添加0.3ml 0.9％NaCl(w/v)和0.1ml己烷且在Heidolph Vibramax 110中充分混合10分钟。将FAME收集至0.3ml玻璃衬管中且如先前所述利用火焰电离检测器(FID)通过GC进行分析。
[0708] 首先基于市售标准物GLC-411(NU-CHEK PREP,INC.，USA)中所存在的已知量的相同FAME的峰面积反应来修正个别FAME的峰面积。GLC-411含有相等量的31种脂肪酸(wt％)，在C8:0至C22:6范围内。在标准物中不存在的脂肪酸的情况下，诸位发明人取最相似的FAME的峰面积反应。举例来说，将16:1d9的FAME峰面积反应用于16:1d7且将C22:6的FAME反应用于C22:5。通过与内标物质量相比较，经过修正的面积用于计算样品中各FAME的质量。油主要以TAG形式存储且其重量是基于FAME重量进行计算。甘油的总摩尔数是通过计算各FAME的摩尔数且将FAME的总摩尔数除以三来确定。TAG计算为甘油和脂肪酰基部分的总和，使用以下关系：油重量％＝100×((41×FAME总mol数/3)+(FAME的总g数-(15×FAME总mol数)))/g种子，其中41和15分别是甘油部分和甲基的分子量。
[0709] 分析油样品的甾醇含量
[0710] 通过使用4mL含5％KOH的80％MeOH和在80℃下在聚四氟乙烯内衬旋盖玻璃管中加热2h将大约10mg油与作为内标物的添加C24:0monol等分试样的一起皂化。在反应混合物冷却后，添加2mL Milli-Q水且通过振荡和涡旋将甾醇提取至2mL己烷:二氯甲烷(4:1v/v)中。对混合物进行离心且取出甾醇提取物，并且用2mL Milli-Q水洗涤。然后在振荡和离心之后去除甾醇提取物。使用氮气蒸汽蒸发提取物，并且通过使用200mL BSTFA和在80℃下加热2h对甾醇进行硅烷基化。
[0711] 对于甾醇的GC/GC-MS分析，在氮气物流下在40℃热块上干燥甾醇-OTMSi衍生物，然后再溶解于三氯甲烷或己烷中，随后立即进行GC/GC-MS分析。使用配有TM
Supelco Equity -1熔融石英毛细管柱(15m×0.1mm i.d.，0.1μm膜厚度)、FID、分流/无分流注射器和Agilent Technologies 7683B系列自动采样器和注射器的Agilent Technologies6890A GC(Palo Alto，California，USA)通过气相色谱法(GC)分析甾醇-OTMS衍生物。氦气是载气。以无分流模式注入样品，炉温为120℃。注入后，以10℃/min使炉温升至270℃，且最后以5℃/min达到300℃。利用Agilent Technologies ChemStation软件(Palo Alto，California，USA)对峰进行定量。GC结果中个别组分面积的误差为±5％。
Supelco Equity -1熔融石英毛细管柱(15m×0.1mm i.d.，0.1μm膜厚度)、FID、分流/无分流注射器和Agilent Technologies 7683B系列自动采样器和注射器的Agilent Technologies6890A GC(Palo Alto，California，USA)通过气相色谱法(GC)分析甾醇-OTMS衍生物。氦气是载气。以无分流模式注入样品，炉温为120℃。注入后，以10℃/min使炉温升至270℃，且最后以5℃/min达到300℃。利用Agilent Technologies ChemStation软件(Palo Alto，California，USA)对峰进行定量。GC结果中个别组分面积的误差为±5％。
[0712] 在Finnigan Thermoquest GCQ GC-MS和Finnigan Thermo Electron Corporation GC-MS上进行GC-质谱(GC-MS)分析；两种系统都配有柱内注射器和ThermoquestXcalibur软件(Austin，Texas，USA)。各GC都配有与上述毛细管柱具有类似极性的毛细管柱。通过使用质谱数据且通过将保留时间数据与针对权威实验室标准物所获得的数据进行比较来鉴别个别组分。与样品批次同时进行完全程序空白分析。
[0713] RT-PCR条件
[0714] 典型地，通过使用Superscript III One-Step RT-PCR系统(Invitrogen)，使用10pmol正向引物和30pmol反向引物、MgSO4最终浓度2.5mM、400ng总RNA与缓冲液和核苷酸组分，根据制造商说明书以25μl体积进行反转录-PCR(RT-PCR)扩增。典型温度方案为：1个循环的45℃、30分钟用于反转录；然后1个循环的94℃、2分钟，随后40个循环的
94℃、30秒，52℃、30秒，70℃、1分钟；然后1个循环的72℃、2分钟，随后将反应混合物冷却至5℃。
94℃、30秒，52℃、30秒，70℃、1分钟；然后1个循环的72℃、2分钟，随后将反应混合物冷却至5℃。
[0715] 通过用35S-LEC2诱导产生油菜体细胞胚
[0716] 如(Attila Kereszt等,2007)所描述，使用氯气对油菜(栽培品种Oscar)种子进行杀菌。使经过灭菌的种子在含0.8％琼脂且调节至pH5.8的1/2强度MS培养2
基(Murashige和Skoog,1962)上萌芽，并且在24℃下、在荧光照明(50μE/ms)下以
18/6h(光/暗)光照期生长6至7天。从这些幼苗上无菌分离2至4mm杆长度的子叶叶柄且用作外植体。从来自于新鲜培养板的单一集落接种经过转化的根癌农杆菌菌株AGL1的培养物(一种带有种子特异性二元载体，且第二种带有35S-LEC2构建体)，且使其在10mL含适当抗生素的LB培养基中生长并且在28℃下、在以150rpm搅拌下生长过夜。通过在
4000rpm下离心5分钟来收集细菌细胞，用含有2％蔗糖的MS培养基洗涤，且再悬浮于10mL相同培养基中，并且在添加乙酰丁香酮达到100μΜ之后，在视情况选择的抗生素存在下生长4小时。在添加至植物组织之前两小时，添加亚精胺达到1.5mM最终浓度，且用新鲜培养基将细菌的最终密度调节至OD 600nm＝0.4。将两种细菌培养物(一种携带种子特异性构建体，且另一种携带35S-AtLEC2)以1:1至1:1.5的比率混合。
基(Murashige和Skoog,1962)上萌芽，并且在24℃下、在荧光照明(50μE/ms)下以
18/6h(光/暗)光照期生长6至7天。从这些幼苗上无菌分离2至4mm杆长度的子叶叶柄且用作外植体。从来自于新鲜培养板的单一集落接种经过转化的根癌农杆菌菌株AGL1的培养物(一种带有种子特异性二元载体，且第二种带有35S-LEC2构建体)，且使其在10mL含适当抗生素的LB培养基中生长并且在28℃下、在以150rpm搅拌下生长过夜。通过在
4000rpm下离心5分钟来收集细菌细胞，用含有2％蔗糖的MS培养基洗涤，且再悬浮于10mL相同培养基中，并且在添加乙酰丁香酮达到100μΜ之后，在视情况选择的抗生素存在下生长4小时。在添加至植物组织之前两小时，添加亚精胺达到1.5mM最终浓度，且用新鲜培养基将细菌的最终密度调节至OD 600nm＝0.4。将两种细菌培养物(一种携带种子特异性构建体，且另一种携带35S-AtLEC2)以1:1至1:1.5的比率混合。
[0717] 用20mL根癌农杆菌培养物将新分离的油菜子叶叶柄感染6分钟。在无菌滤纸上揩吸子叶叶柄以去除过量根癌农杆菌，然后转移至共培育培养基(MS培养基，具有1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、100μΜ乙酰丁香酮，补充有L-半胱氨酸(50mg/L)、抗坏血酸(15mg/L)和MES(250mg/l))。用微孔胶带密封培养板且在24℃下在暗处孵育48h。将共培育的外植体转移至预选培养基(MS，含有1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、3mg/L AgNO3、250mg/L氨噻肟头孢菌素和50mg/L特美汀)，且在24℃以16h/8h光照期培养4至5天。然后根据种子特异性载体上的选择标记基因将外植体转移至选择培养基(MS，含有1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、3mg/L AgNO3、250mg/L氨噻肟头孢菌素和50mg/L特美汀)，且在24℃下以16h/8h光照期培养2至3周。将具有绿色胚性愈伤组织的外植体转移至无激素MS培养基(MS，具有3mg/L AgNO3、
250mg/L氨噻肟头孢菌素、50mg/L特美汀和选择剂)且再培养2至3周。使用GC分析从存活外植体分离的鱼雷形或子叶阶段胚的总脂质中的脂肪酸组成。
250mg/L氨噻肟头孢菌素、50mg/L特美汀和选择剂)且再培养2至3周。使用GC分析从存活外植体分离的鱼雷形或子叶阶段胚的总脂质中的脂肪酸组成。
[0718] 实施例2.拟南芥种子中的转基因DHA途径的稳定表达
[0719] 二元载体构建
[0720] 二元载体pJP3416-GA7和pJP3404各自含有编码5种去饱和酶和2种延长酶的7个异源脂肪酸生物合成基因和处于各载体中所存在的T-DNA的左边界重复序列与右边界重复序列之间的植物选择标记物(图2和3)。SEQ ID NO:1提供了pJP3416-GA7的T-DNA区从右边界序列到左边界序列的核苷酸序列。两种基因构建体都含有编码克鲁维郎香酵母Δ12-去饱和酶(包含SEQ ID NO:1的核苷酸14143-16648)、巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶(包含SEQ ID NO:1的核苷酸7654-10156)、细小微胞藻Δ6-去饱和酶(包含SEQ ID NO:1的核苷酸226-2309)、盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶和Δ4-去饱和酶(分别包含SEQ ID NO:1的核苷酸4524-6485和10157-14142)和Pyramimonas cordataΔ6-延长酶和Δ5-延长酶(分别包含SEQ ID NO:1的核苷酸2310-4523和17825-19967)的植物密码子经优化基因。就SEQ ID NO:1而言，二元载体pJP3416-GA7的T-DNA(取向：右边界序列至左边界序列)区的特定区域如下：
[0721] 核苷酸1-163：右边界；480-226，根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子(TER_NOS)；1883-489，细小微胞藻Δ6-去饱和酶；2309-1952，油菜截短napin启动子(PRO_FP1)；
2310-3243，拟南芥FAE1启动子(PRO_FAE1)；3312-4181，Pyramimonas cordataΔ6-延长酶；4190-4523，毛豆凝集素终止子(TER_凝集素)；4524-4881，PRO_FP1；4950-6230：盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶；6231-6485：TER_NOS；7653-6486，普通烟草Rb7基质连接区(MAR)；
8387-7654，亚麻conlinin1终止子(TER_Cnl1)；9638-8388，巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶；10156-9707，亚麻conlinin1启动子(PRO_Cnl1)；10157-12189，亚麻conlinin1启动子；12258-13604，盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶；13605-14142，亚麻conlinin2终止子；
14143-14592，PRO_Cnl1；14661-15914，克鲁维郎香酵母Δ12-去饱和酶；15915-16648，TER_Cnl1；17816-16649，MAR；17825-18758，PRO_FAE1；18827-19633，Pyramimonas cordataΔ5-延长酶；19634-19967，TER_凝集素；19990-20527，具有重复增强子区的花椰菜花叶病毒35S启动子；20537-21088，产绿色链霉菌基因草胺膦-N-乙酰基转移酶；
21097-21349，TER_NOS；21367-21527，左边界。
2310-3243，拟南芥FAE1启动子(PRO_FAE1)；3312-4181，Pyramimonas cordataΔ6-延长酶；4190-4523，毛豆凝集素终止子(TER_凝集素)；4524-4881，PRO_FP1；4950-6230：盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶；6231-6485：TER_NOS；7653-6486，普通烟草Rb7基质连接区(MAR)；
8387-7654，亚麻conlinin1终止子(TER_Cnl1)；9638-8388，巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶；10156-9707，亚麻conlinin1启动子(PRO_Cnl1)；10157-12189，亚麻conlinin1启动子；12258-13604，盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶；13605-14142，亚麻conlinin2终止子；
14143-14592，PRO_Cnl1；14661-15914，克鲁维郎香酵母Δ12-去饱和酶；15915-16648，TER_Cnl1；17816-16649，MAR；17825-18758，PRO_FAE1；18827-19633，Pyramimonas cordataΔ5-延长酶；19634-19967，TER_凝集素；19990-20527，具有重复增强子区的花椰菜花叶病毒35S启动子；20537-21088，产绿色链霉菌基因草胺膦-N-乙酰基转移酶；
21097-21349，TER_NOS；21367-21527，左边界。
[0722] 所述构建体中的7个编码区各自受种子特异性启动子控制，使用3种不同的启动子，即，截短油菜截短napin启动子(pBnFP1)、拟南芥FAE1启动子(pAtFAE1)和亚麻Δ9conlinin1启动子(pLuCnl1)。该7个脂肪酸生物合成基因一起编码旨在将18:1 (油酸)Δ4,7,10,13,16,19
转化成22:6 (DHA)的整个DHA合成途径。两种二元载体都含有可操作地连接于
具有重复增强子区的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和根癌农杆菌nos3’聚腺苷酸化区转录终止子的BAR植物选择标记物编码区。植物选择标记物位于与T-DNA区的左边界相邻处，因此相对于T-DNA的取向位于T-DNA远端上转移至植物细胞中。这增加了不会选择将有可能不包括选择标记基因的部分转移T-DNA的可能性。pJP3416-GA7和pJP3404各自含有来自于发根农杆菌的RiA4复制起点(Hamilton,1997)。
转化成22:6 (DHA)的整个DHA合成途径。两种二元载体都含有可操作地连接于
具有重复增强子区的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和根癌农杆菌nos3’聚腺苷酸化区转录终止子的BAR植物选择标记物编码区。植物选择标记物位于与T-DNA区的左边界相邻处，因此相对于T-DNA的取向位于T-DNA远端上转移至植物细胞中。这增加了不会选择将有可能不包括选择标记基因的部分转移T-DNA的可能性。pJP3416-GA7和pJP3404各自含有来自于发根农杆菌的RiA4复制起点(Hamilton,1997)。
[0723] 通过合成对应于SEQ ID NO:1的核苷酸226-19975的DNA区(GA7区)且将该区插入受体二元载体pJP3416中的PspOMI位点上来产生pJP3416-GA7。GA7上的各脂肪酸生物合成基因包括烟草花叶病毒5’未翻译区(5’UTR)序列，该序列可操作地连接于处于启动子与翻译起始ATG之间的各编码区，以便使由该基因产生的mRNA的翻译效率最大化。如Hall等(1991)所描述，GA7构建体还包括两个普通烟草Rb7基质连接区(MAR)序列。已知MAR序列，有时称为核连接区，在体外特异性结合核基质且在体内可介导染色质与核基质结合。认为MAR的功能是减少转基因沉默。在pJP3416-GA7中，也插入了MAR且其位于T-DNA区内以便充当DNA间隔物以隔离转基因表达盒。pJP3416载体在GA7区插入之前仅含有处于边界之间的植物选择标记物盒。
[0724] 利用基于序列限制酶的插入物来制造基因构建体pJP3404，其中将基因盒添加至包含用于在种子中产生SDA的基因的二元载体pJP3367。该构建体含有编码克鲁维郎香酵母Δ12-去饱和酶和巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶的基因(两种酶均由油菜截短napin启动子(FP1)表达)和由拟南芥FAE1启动子表达的细小微胞藻Δ6-去饱和酶(图4)。首先，将拟南芥FAD2内含子侧接EcoRI位点且克隆至pJP3367MfeI位点中以产生pJP3395。将含有分别由FAE1和FP1启动子驱动的P.cordataΔ6-延长酶和Δ5-延长酶盒的片段克隆至pJP3395的KasI位点以产生pJP3398。然后通过用RiA4复制起点替换pJP3398中的RK2复制起点来产生pJP3399。通过将含有分别由FP1和FAE1启动子驱动的盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶盒和Δ4-去饱和酶盒的SbfI侧接片段克隆至pJP3399的SbfI位点中来产生最终的二元载体pJP3404。
[0725] 拟南芥转化和脂肪酸组成分析
[0726] 将嵌合载体引入根癌农杆菌菌株AGL1以及使用用于转化的花序浸染法来自于用于处理拟南芥(生态型Columbia和fad2突变型)植物的经转化农杆菌培养物的细胞中(Clough和Bent,1998)。在成熟后，从经过处理的植物收获T1种子且接种至含有PPT的MS培养板上以便选择含有BAR选择标记基因的植物。将存活的健康T1幼苗转移至土壤。在植物生长至成熟且允许自花授粉后，从这些植物收获T2种子且如实施例1中所描述通过GC分析来分析其种子脂质的脂肪酸组成。
[0727] 对于使用pJP3416-GA7转化至Columbia基因背景中的13种转化体和对于使用fad2突变体的6种转化体，种子脂质中的DHA水平的数据示于图5中(标记为T2的泳道)。pJP3416-GA7构建体产生的DHA水平(呈占总脂肪酸含量的百分比形式)平均稍高于pJP3404构建体。表4显示具有最高DHA水平的T2株系的总种子脂质的脂肪酸组成。相同种子中由油酸产生DHA中的各酶促步骤的计算转化效率示于表5中。转化效率计算为(％产物×100)/(％剩余底物+％产物)，从而表示为百分比。
[0728] pJP3416-GA7T2转化株系中所产生的DHA的最高观察水平是6.2％，另外有0.5％EPA和0.2％DPA(#14株系)。这些T2种子对于转基因而言仍是分离的，即，尚不是均匀纯合的。将来自于独立转基因种子的总种子脂质分布(表4)的汇总数据示于表6中。由于这些种子中的转基因产生的ω3脂肪酸水平(总新ω3脂肪酸，不包括Columbia背景中内Δ9,12源性产生的ALA的水平)是10.7％，而ω6脂肪酸(总新ω6脂肪酸，但不包括18:2 )的水平是1.5％。这代表新ω3脂肪酸:新ω6脂肪酸的非常有利的配比，即7.3:1。
[0729] 将经pJP3416-GA7转化的选定株系，即，Columbia背景中指定为7、10、14、22和34的株系和fad2突变体背景中指定为18、21和25的株系的T2种子接种于含有PPT的MS培养基上，以便体外选择转基因幼苗。对于各株系，将20株抗PPT幼苗转移至土壤且在自花授粉后生长至成熟。这些植物对于选择标记基因而言且因此对于植物基因组中的至少一个T-DNA插入物而言非常可能是纯合的。从这些植物收获T3种子且通过GC分析其种子油中的脂肪酸组成。数据示于表7中。该分析显示，纯合植物的T3种子中的pJP3416-GA7构建体产生的ω3LC-PUFA DHA水平高于分离T2种子。Columbia背景中指定为22.2的T3pJP3416-GA7转化株系中观察到多达约13.9％DHA，在半合T2种子中增加约5.5％，新ω3脂肪酸的总水平为约24.3％(呈占种子脂质含量中的总脂肪酸的百分比形式)。新ω6脂肪酸的水平是总脂肪酸的1.1％，代表着非常有利的新ω3脂肪酸:新ω6脂肪酸比率，即约22:1。类似地，fad2突变体背景中的转化体产生总计20.6％新ω3脂肪酸，包括11.5％DHA(呈占种子脂质含量中的总脂肪酸的百分比形式)。
[0730] 表4.得自于DHA水平处于观察范围中较高的一端的独立转基因T2拟南芥种子的总种子脂质的脂肪酸组成。‘Col’是指Columbia生态型且‘FAD2’是指fad2突变生态型。‘GA7’是指用pJP3416-GA7载体的T-DNA转化，pJP3404是指用pJP3404载体的T-DNA转化。GC分析中未解析出20:1n-9和20:1n-11脂肪酸。“其它微量”脂肪酸包括14:0、16:1n7、16:1n9、16:1n13t、16:2n6、16:3n3、i18:0、18:1n5、20:1n5、22:0、22:1n7、22:1n11/n13、24:0、24:1n9。
[0731]
[0732] 表5.在来自于如表4独立转基因种子的总种子脂质中观察到的由油酸产生DHA的个别酶促步骤的转换效率。
[0733]
[0734] 表6.得自于表2中所示的独立转基因种子的总种子脂质分布的汇总数据。计算不包括表4中的‘微量脂肪酸’。
[0735]
[0736] 表7.得自于获自如表3中的植物株系的独立转基因T3和T4拟南芥子代种子的总种子脂质的脂肪酸组成。T4世代中所显示的误差表示n＝10的SD。
[0737]
[0738] 对于具有较高DHA水平的T3种子，由油酸产生DHA的途径中各酶步骤的酶转化效率示于表8中。株系22.2的种子中的Δ12-去饱和酶转化效率是81.6％且ω3-去饱和酶效率是89.1％，两者都显著较高且表明这些真菌(酵母)酶能够在发育种子中充分发挥功能。DHA途径中的其它外源酶对ω3底物的活性类似地较高，其中Δ6-去饱和酶的作用效率是42.2％，Δ6-延长酶的效率是76.8％，Δ5-去饱和酶的效率是95.0％，Δ5-延长酶的效率是88.7％且Δ4-去饱和酶的效率是93.3％。对ω6底物LA的Δ6-去饱和酶活性低得多，其中Δ6-去饱和酶作用于LA的转化效率仅为0.7％。GLA的存在水平仅为0.4％，且在具有最高DHA含量的T3种子中仅检测到除20:2ω6以外的新ω6产物。来自于独立转基因种子的总种子脂质分布(表7)的汇总数据示于表9中。具有最高DHA水平的株系的该数据所包括的总ω6FA(包括LA):总ω3FA(包括ALA)比率为0.10。该株系的脂质中的新ω6FA(不包括LA):新ω3FA(不包括ALA)比率是0.05。在这些株系中，总多不饱和脂肪酸水平大于50％，且在至少4个株系中大于60％。总体转化效率计算为：OA到EPA＝21.8％，OA到DHA＝18.0％，LA到EPA＝26.9％，LA到DHA＝22.2％，ALA到EPA＝30.1％，ALA到DHA＝24.9％。
[0739] 表8.在来自于如表7中的转基因T3拟南芥种子的总种子脂质中观察到的由油酸产生DHA的个别酶促步骤的转化效率。
[0740]
[0741] 表9.得自于表5中所示的独立转基因种子的总种子脂质分布的汇总数据。计算不包括表7中的‘微量脂肪酸’。
[0742]
[0743] Columbia背景中得自于pJP3416-GA7株系22.2的T3种子是T2株系22的子代，将其直接播种到土壤中，且通过GC分析所得T3植物的成熟种子的脂肪酸组成。这些种子的平均DHA水平(呈占种子脂质中的总脂肪酸的百分比形式)是13.3±1.6％(n＝10)。如表6中(右边列)所示，具有最高DHA水平的株系在种子脂质的总脂肪酸中含有15.1％DHA。由油酸产生DHA中各步骤的酶转化效率示于表8中。
[0744] 具有最高DHA水平的株系中的总ω6FA(包括LA):ω3FA(包括ALA)比率是0.102。具有最高DHA水平的株系中的新ω6FA(不包括LA):新ω3FA(不包括ALA)比率是0.053。
总饱和脂肪酸的水平为约17.8％且单不饱和脂肪酸的水平为约18.1％。总ω6脂肪酸的水平为约5.7％且ω3-脂肪酸的水平为约55.9％。总体转化效率计算为：OA到EPA＝24.5％，OA到DHA＝20.1％，LA到EPA＝29.9％，LA到DHA＝24.5％，ALA到EPA＝32.9％，ALA到DHA＝27.0％。发现总ω3脂肪酸累积达总脂肪酸的55.9％，而ω6脂肪酸是总分布的
5.7％。
总饱和脂肪酸的水平为约17.8％且单不饱和脂肪酸的水平为约18.1％。总ω6脂肪酸的水平为约5.7％且ω3-脂肪酸的水平为约55.9％。总体转化效率计算为：OA到EPA＝24.5％，OA到DHA＝20.1％，LA到EPA＝29.9％，LA到DHA＝24.5％，ALA到EPA＝32.9％，ALA到DHA＝27.0％。发现总ω3脂肪酸累积达总脂肪酸的55.9％，而ω6脂肪酸是总分布的
5.7％。
[0745] 进行Southern印迹杂交分析。结果显示，高累积DHA株系是来自于pJP3416-GA7构建体的T-DNA的单拷贝或双拷贝，但转基因株系Columbia#22除外，其在拟南芥植物的基因组中具有三个T-DNA插入物。还分析了T5世代种子，且发现其总种子脂质中具有多达13.6％DHA。发现就DHA产生能力而言，GA7构建体在多次传代后是稳定的。
[0746] 测定转基因拟南芥DHA株系中的油含量
[0747] 如实施例1中所描述通过GC测定具有各种DHA水平的转基因拟南芥种子的油含量。数据示于图6中，将油含量(％油，以种子重量计)相对于DHA含量(呈占总脂肪酸的百分比形式)作图。观察到多达26.5mg DHA/g种子(表10)。发现转基因拟南芥种子的油含量与DHA含量负相关。相对于具有约14％DHA的种子，具有DHA水平约9％的转化种子中的DHA的量/种子重量较高。这对于除拟南芥以外的种子是否成立尚未确定。
[0748] 表10.GA7-转化拟南芥种子中的DHA比例和量
[0749]
[0750] 实施例3.亚麻荠种子中的转基因DHA途径的稳定表达
[0751] 将如上文所述的二元载体pJP3416-GA7引入根癌农杆菌菌株AGL1以及使用用于的转化花序浸染法来自于用于处理亚麻荠开花植物的经转化农杆菌培养物的细胞中(Lu和Kang,2008)。在植物生长和成熟后，从经过处理的植物收获T1种子，播种至土壤上，且通过用除草剂BASTA喷雾来处理所得植物，以选择对于pJP3416-GA7的T-DNA上所存在的bar选择标记基因为转基因且表达该bar选择标记基因的植物。在允许耐受该除草剂的存活的T1植物自花授粉后使其生长至成熟，且收获所得T2种子。获得5种转基因植物，其中仅3种含有整个T-DNA。
[0752] 从具有来自于这三种含有整个T-DNA的植物的每一种的大约20种种子的库提取脂质。汇集的样品中两种含有非常低、仅可检测水平的DHA，但第三个库含有约4.7％DHA(表12)。因此，从得自于该植物的10个个别T2种子提取脂质且通过GC分析脂肪酸组成。该转化株系的个别种子的脂肪酸组成数据也示于表11中。来自于总种子脂质分布(表11)的汇总数据示于表12中。
[0753] 表11.经来自于pJP3416-GA7的T-DNA转化的转基因T2亚麻荠种子的总种子脂质的脂肪酸组成。所显示的脂肪酸组成是针对汇集种子批(FD5.46)和从最高到最低DHA分级的10个单一种子(从左到右)。
[0754]
[0755] 表12.得自于表11中所示的转基因种子的总种子脂质分布的汇总数据。计算不包括表11中的‘微量脂肪酸’。
[0756]
[0757] 这10种个别种子中有6种存在DHA。其它4种种子不具有DHA，且基于亲本株系中的T-DNA插入物的半合子状态，假定是不具有T-DNA的无效分离子。从具有最高DHA水平的单一种子提取的脂质具有9.0％DHA，而EPA、DPA和DHA的总百分比是11.4％。该种子中由于转化而产生的新ω3脂肪酸的总百分比(SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA、DHA)是19.3％，而新ω6脂肪酸的相应总和(GLA、EDA、DGLA、ARA和任何ω6延长产物)是2.2％，作为新ω6脂肪酸，仅检测到GLA和EDA。发现总ω6FA(包括LA):ω3FA(包括ALA)比率是0.44。具有最高DHA水平的种子中的新ω6FA(不包括LA):新ω3FA(不包括ALA)比率是0.12。
总饱和脂肪酸的水平为约17.8％且单不饱和脂肪酸的水平为约15.5％。总ω6脂肪酸的水平为约20.4％且ω3脂肪酸的水平为约46％。总体转化效率计算为：OA到EPA＝15.6％，OA到DHA＝12.3％，LA到EPA＝17.2％，LA到DHA＝13.6％，ALA到EPA＝24.8％，ALA到DHA＝19.6％。
总饱和脂肪酸的水平为约17.8％且单不饱和脂肪酸的水平为约15.5％。总ω6脂肪酸的水平为约20.4％且ω3脂肪酸的水平为约46％。总体转化效率计算为：OA到EPA＝15.6％，OA到DHA＝12.3％，LA到EPA＝17.2％，LA到DHA＝13.6％，ALA到EPA＝24.8％，ALA到DHA＝19.6％。
[0758] 来自于该株系的纯合种子是在T4代中获得。在事件FD5-46-18-110中产生多达10.3％DHA，而在整个T4代中观察到平均7.3％DHA。
[0759] 将纯合种子移植到若干个温室中以产生总共超过600株个别植物。使用多种方法(包括索氏抽提法、丙酮提取和己烷提取)从种子中提取油。
[0760] 因为如上所述获得的亚麻荠的独立转化的株系数较低，故进行进一步实验以便用pJP3416-GA7转化亚麻荠。发明人预计在经过进一步转化的株系中，将实现DHA水平(呈占种子油中的总脂肪酸百分比形式)大于10％，且对于T-DNA而言为纯合的植物达20％DHA。产生20个亚麻荠GA7_modH事件且分析种子的DHA含量。产生3个GA7_modB事件且对来自于事件CMD17.1的T1种子的分析显示汇集种子DHA含量为9.8％。发现最高的单一种子DHA值是13.5％。
[0761] 实施例4.油菜种子中的转基因DHA途径的稳定表达
[0762] 使用单一载体的油菜转化和脂肪酸组成分析
[0763] 使用二元载体pJP3416-GA7产生经过转化的油菜植物和得自于所述植物的种子。经由标准电穿孔程序将如上所述的载体pJP3416-GA7引入根癌农杆菌菌株AGL1中。在
28℃下在LB培养基中使转基因农杆菌属细胞的培养物生长过夜，同时以150rpm搅拌。通过在4000rpm下离心5分钟收集细菌细胞，用Winans AB培养基(Winans，1988)洗涤且再悬浮于10mL Winans AB培养基(pH 5.2)中，并且在卡那霉素(50mg/L)、利福平(25mg/L)和100μΜ乙酰丁香酮存在下继续生长过夜。在感染芸苔属细胞之前2小时，添加亚精胺(120mg/L)且用新鲜AB培养基将细菌的最终密度调节至OD 600nm＝0.3-0.4。将从在
1/2MS上生长的8天龄油菜幼苗新分离的子叶叶柄(Murashige和Skoog,1962)或在MS培养基上用1mg/L噻苯隆(TDZ)和0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)预处理3至4天的胚轴区段用
10mL农杆菌属培养物感染5分钟。在无菌滤纸上揩吸经农杆菌感染的外植体以去除过量农杆菌，并且转移至补充有或无不同抗氧化剂(L-半胱氨酸50mg/L和抗坏血酸15mg/L)的共培育培养基(MS培养基，具有1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、100μΜ乙酰丁香酮)。用石蜡膜密封所有培养板且在23℃至24℃下在暗处孵育48h。
28℃下在LB培养基中使转基因农杆菌属细胞的培养物生长过夜，同时以150rpm搅拌。通过在4000rpm下离心5分钟收集细菌细胞，用Winans AB培养基(Winans，1988)洗涤且再悬浮于10mL Winans AB培养基(pH 5.2)中，并且在卡那霉素(50mg/L)、利福平(25mg/L)和100μΜ乙酰丁香酮存在下继续生长过夜。在感染芸苔属细胞之前2小时，添加亚精胺(120mg/L)且用新鲜AB培养基将细菌的最终密度调节至OD 600nm＝0.3-0.4。将从在
1/2MS上生长的8天龄油菜幼苗新分离的子叶叶柄(Murashige和Skoog,1962)或在MS培养基上用1mg/L噻苯隆(TDZ)和0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)预处理3至4天的胚轴区段用
10mL农杆菌属培养物感染5分钟。在无菌滤纸上揩吸经农杆菌感染的外植体以去除过量农杆菌，并且转移至补充有或无不同抗氧化剂(L-半胱氨酸50mg/L和抗坏血酸15mg/L)的共培育培养基(MS培养基，具有1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、100μΜ乙酰丁香酮)。用石蜡膜密封所有培养板且在23℃至24℃下在暗处孵育48h。
[0764] 然后用含有500mg/L氨噻肟头孢菌素和50mg/L特美汀的无菌蒸馏水将经过处理的外植体洗涤10分钟，在无菌蒸馏水中冲洗10分钟，在无菌滤纸上揩干，转移至预选培养基(MS，含有1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、20mg/L硫酸腺嘌呤(ADS)、1.5mg/L AgNO3、250mg/L氨噻肟头孢菌素和50mg/L特美汀)，且在24℃以16h/8h光照期培养5天。然后将其转移至选择培养基(MS，含有1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、20mg/L ADS、1.5mg/L AgNO3、250mg/L氨噻肟头孢菌素和50mg/L特美汀)，以1.5mg/L草铵膦作为转化细胞的选择剂，且在24℃下以16h/8h光照期培养4周，每两周将传代培养物取到相同培养基上。将具有绿色愈伤组织的外植体转移至芽引发培养基(MS，含有1mg/L激动素、20mg/L ADS、1.5mg/L AgNO3、250mg/L氨噻肟头孢菌素、50mg/L特美汀和1.5mg/L草铵膦)且再培养2至3周。将从抗性外植体萌发的芽转移至芽延长培养基(MS培养基，具有0.1mg/L激勃酸、20mg/L ADS、1.5mg/L AgNO3、250mg/L氨噻肟头孢菌素和1.5mg/L草铵膦)且再培养2周。选择2至3cm的健康芽且转移至生根培养基(1/2MS，含有1mg/L NAA、20mg/L ADS、1.5mg/L AgNO3和250mg/L氨噻肟头孢菌素)且培养2至3周。将生长良好的生根芽转移至含有育苗混合物的器皿中且在生长室中生长2周，且随后转移至温室。利用该方法获得了大约40株经GA7构建体转化的植物(T0)。
[0765] 在允许自花授粉之后使植物生长至成熟。如实施例1中所描述分析获自转化植物的种子的种子油中的脂肪酸组成。具有最高DHA水平的转化株系的数据示于表13中。经来自于pJP3416-GA7的T-DNA转化的油菜种子的种子油中的平均DHA水平显著低于经相同构建体转化的拟南芥种子(实施例2)或亚麻荠种子(实施例3)。发现大约40株的最高DHA水平是1.52％，其中大多数转基因株系具有可检测的DHA。注意，这些种子中累积了大量ALA(占总脂肪酸的约35％)未有效转化成SDA或该途径中的下游产物。
[0766] 对来自于T1事件CT125-2的单一油菜种子进行脂肪酸分布分析，以更好地确定转基因种子中所产生的DHA的量。发现种子含有0％(无效种子)与8.5％之间的DHA(表13)。
[0767] 播种一些来自于植物株系CT116以及其它显示DHA产生的转基因株系的种子以产生子代植物。对从这些植物的发育胚分离的总RNA进行RT-PCR，以便确定为何在DHA产生方面GA7构建体相对于具有相同构建体的转基因拟南芥和亚麻荠表现不良和相对于pJP3115和pJP3116上的基因组合表现不良(下文)。使用单步RT-PCR试剂盒(Invitrogen)和靶向各转基因的基因特异性引物对总RNA进行RT-PCR。这证实了GA7构建体中的各基因在油菜转化体中都得以良好表达，除了Δ6-去饱和酶在大多数转化种子中表达不良。来自于该构建体的其它基因在油菜和拟南芥种子中充分作用，例如，Δ12-去饱和酶和Δ15-去饱和酶用于提高种子中产生的LA和ALA的水平，同时降低油酸水平。代表性RT-PCR凝胶示于图7中，该图清楚地示出了Δ6-去饱和酶相对于来自于pJP3416-GA7的其它转基因的低表达。
[0768] 转基因植物和种子是纯合的，因为所述转基因是通过种植来自于具有最高DHA的株系的子代而产生。
[0769] 表13.经pJP3416-GA7转化的独立T1油菜种子株系CT116-11和CT-125-2与野生型(未转化)对照相比的脂肪酸组成(呈占种子油中的总脂肪酸的百分比形式)。22:6ω3是DHA。得自于单一CT125-2油菜种子的数据由‘SS’表示。
[0770]
[0771] 使用两种载体的油菜转化和脂肪酸组成分析
[0772] 在油菜中进行且作为引入转基因的替代型式的另一个实验中，将如WO2010/057246中所描述的二元载体pJP3115和pJP3116用于单独地产生经过转化的油菜植物，且从所述植物获得经过转化的种子。pJP3115上的T-DNA包含编码还阳参(Crepis palestina)Δ12-去饱和酶、细小微胞藻Δ6-去饱和酶、Pyramimonas cordataΔ6-延长酶和盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶的嵌合基因，且pJP3116上的T-DNA含有编码白苏子Δ15-去饱和酶、Pyramimonas cordataΔ5-延长酶和盐生巴夫藻Δ4-去饱和酶的嵌合基因。两种T-DNA在共同存在且表达于发育种子中时形成七基因途径以便由内源性产生的油酸产生DHA。经由标准电穿孔程序将这些载体引入根癌农杆菌菌株AGL1中且使用如上所述的方法将经过转化的细胞独立地用于转化油菜，以产生经过稳定转化的T0植物。获得了29种pJP3115转化体和19种pJP3116转化体，且使这些植物生长至成熟并且分析在自花授粉之后获得的种子的种子油中的脂肪酸组成。预期用来自于pJP3115的T-DNA进行转化导致由内源性产生的ALA产生EPA，而预期用来自于pJP3116的T-DNA进行转化导致由LA产生的ALA增加。鉴别了若干种呈现这些表型的植物。大多数事件由于在低水平EPA产生下的Δ12去饱和而呈现OA减少/LA增加的表型。在pJP31115转基因汇集种子中观察到多达
2.6％EPA。类似地，发现大多数pJP3116事件由于Δ15-去饱和酶活性而具有升高的ALA表型。在用来自于pJP3116的T-DNA转化的汇集种子中发现多达18.5％ALA。
2.6％EPA。类似地，发现大多数pJP3116事件由于Δ15-去饱和酶活性而具有升高的ALA表型。在用来自于pJP3116的T-DNA转化的汇集种子中发现多达18.5％ALA。
[0773] 对得自于具有最高EPA和ALA水平的株系的T1植物进行杂交，且分析得自于24个回收事件的子代种子(F1)的DHA含量。在这些事件中的17个事件中发现了DHA，其中在从这些事件汇集的种子中发现了多达1.9％DHA。进行单一种子分析以确定DHA产量范围，数据示于表14中。在杂交子代中观察到了较大范围的DHA水平，这或许是由于亲本株系中的T-DNA的半合性，使得一些种子不接受这两种T-DNA。在总种子脂质中观察到多达6.7％DHA。
[0774] 表14.得自于pJP3115的T-DNA转基因植物与pJP3116的T-DNA转基因植物杂交的油菜F1单一种子的种子油中的脂肪酸组成(呈占总脂肪酸的百分比形式)。B1、B2和B4表示事件。0.0＝GC方法未检出。
[0775]
[0776] 表15.得自于表14中所示的转基因种子的总种子脂质分布的汇总数据。计算不包括表14中的‘微量脂肪酸’。
[0777]
[0778] 来自于总种子脂质分布(表14)的汇总数据示于表15中。从表15中的数据可见，具有最高DHA水平的种子中的总ω6FA(包括LA):ω3FA(包括ALA)比率是3.34。新ω6FA(不包括LA):新ω3FA(不包括ALA)比率是1.39。总饱和脂肪酸的水平为约13.7％且单不饱和脂肪酸的水平为约21.8％。总ω6脂肪酸的水平为约46.4％且ω3脂肪酸的水平为约14.8％。总体转化效率计算为：OA到EPA＝12.8％，OA到DHA＝8.5％，LA到EPA＝15.7％，LA到DHA＝10.4％，ALA到EPA＝72.1％，ALA到DHA＝47.9％。在该利用pJP3115与pJP3116的组合的实验中观察到ω6脂肪酸到ω3脂肪酸转化效率降低被认为是由于当与用于将ALA转化成DHA的基因组合时植物Δ15-去饱和酶与真菌Δ15/ω3去饱和酶(实施例2和3)相比效率较低。
[0779] 产生得自于对所有引入的转基因都是纯合的含DHA株系的子代以便进行分析。
[0780] 实施例5.对植物种子中编码DHA途径的T-DNA的修饰
[0781] 为了提高油菜中的DHA产生水平超过实施例4中所描述的水平，如下构建二元载 体 pJP3416-GA7-modA、pJP3416-GA7-modB、p JP3416-GA7-modC、pJP3416-GA7-modD、pJP3416-GA7-modE和pJ P3416-GA7-modF。这些二元载体是实施例2中所描述的pJP3416-GA7构建体的变体，且旨在进一步增加植物种子中的DHA合成，特别是通过改良Δ6-去饱和酶和Δ6-延长酶功能。已经观察到SDA在一些经GA7构建体转化的种子中由于与Δ5-延长酶相比延长效率相对较低而累积，因此在其它修改方案中，将T-DNA中的该两个延长酶基因位置切换。
[0782] 通过首先将新P.cordataΔ6-延长酶盒克隆在pJP3416-GA7的S bfI位点之间以置换P.cordataΔ5-延长酶盒将pJP3416-GA7中的两个延长酶编码序列切换到T-DNA上的位置以产生pJP3416-GA7-modA。通过交换驱动细小微胞藻Δ6-去饱和酶的FP1启动子与conlinin Cnl2启动子(pLuCnl2)进一步修饰该构建体，以产生pJP3416-GA7-modB。进行该修饰以试图增加Δ6-去饱和酶表达且从而提高酶效率。认为C nl2启动子与截短napin启动子相比可以在油菜中产生较高转基因表达。通过添加具有稍微不同的密码子用法(SEQ ID NO:15)且由FP1启动子驱动的第二细小微胞藻Δ6-去饱和酶盒来产生pJP3416-GA7-m odC，该FP1启动子插入在正好在pJP3416-GA7-modB的右边界内的PmeI位点上。将第二Δ6-去饱和酶盒添加到pJP3416-GA7-modB和p JP3416-GA7-modF，以便增加Δ6-去饱和酶表达水平和延长种子发育的时间段以便使用多个启动子表达Δ6-去饱和酶。将不同的密码子用法用于该两个核苷酸序列中以便在无同一T-DNA内的类似编码区所致的共阻抑风险的情况下翻译同一蛋白质序列。pJP3416-GA7-modD和pJP3416-GA7-modE是类似的变体，其中对应于SEQ ID NO:1的核苷酸16649-17816的第三MAR序列分别添加至pJP3416-GA7和p JP3416-GA7-modB的PmeI位点上。通过添加含有天然Δ6-去
饱和酶核苷酸序列且由pJP3416-GA7-modB右边界上的PmeI位点上的FP1启动子驱动的第二个细小微胞藻Δ6-去饱和酶盒来产生pJP3416-GA7-modF。通过首先用Cnl2:P.cordataΔ5-延长酶盒置换细小微胞藻Δ6-去饱和酶盒，通过限制AscI-PacI位点上的克隆来制造pJP3416-GA7-modG。通过首先用FAE1:细小微胞藻Δ6-去饱和酶盒置换原始FAE1:P.cordataΔ5-延长酶盒，通过限制SbfI位点上的克隆来制造pJP3416-GA7-modG。
这些基因构建体各自的T-DNA的核苷酸序列显示为：pJP3416-GA7-modB(SEQ ID NO:2)、pJP3416-GA7-modC(SEQ ID NO:3)、pJP3416-GA7-modD(SEQ ID NO:4)、pJP3416-GA7-modE(S EQ ID NO:5)、pJP3416-GA7-modF(SEQ ID NO:6)和pJP3416-GA7-modG(SEQ ID NO:7)。
饱和酶核苷酸序列且由pJP3416-GA7-modB右边界上的PmeI位点上的FP1启动子驱动的第二个细小微胞藻Δ6-去饱和酶盒来产生pJP3416-GA7-modF。通过首先用Cnl2:P.cordataΔ5-延长酶盒置换细小微胞藻Δ6-去饱和酶盒，通过限制AscI-PacI位点上的克隆来制造pJP3416-GA7-modG。通过首先用FAE1:细小微胞藻Δ6-去饱和酶盒置换原始FAE1:P.cordataΔ5-延长酶盒，通过限制SbfI位点上的克隆来制造pJP3416-GA7-modG。
这些基因构建体各自的T-DNA的核苷酸序列显示为：pJP3416-GA7-modB(SEQ ID NO:2)、pJP3416-GA7-modC(SEQ ID NO:3)、pJP3416-GA7-modD(SEQ ID NO:4)、pJP3416-GA7-modE(S EQ ID NO:5)、pJP3416-GA7-modF(SEQ ID NO:6)和pJP3416-GA7-modG(SEQ ID NO:7)。
[0783] 使 用 二 元 载 体 pJP3416-GA7-modB、pJP3416-GA7-modC、pJP3416-GA7-modD、pJP3416-GA7-modE、pJP3416-GA7-modF和pJP3416-GA7-modG来产生经过转化的芸苔体细胞胚和油菜、亚麻荠和拟南芥植物和子代种子。pJP3416-GA7-modB的数据示于下一个实施例中。
[0784] 产 生 了8 个 转 基 因 pJP3416-GA7-modB拟 南 芥 事 件 和15 个 转 基 因pJP3416-GA7-modG拟南芥事件。观察到所汇集的pJP3416-GA7-modB种子中的DHA在3.4％与7.2％之间且观察到所汇集的T2pJP3416-GA7-modG种子中的DHA在0.6％与4.1％之间。将若干个最高p JP3416-GA7-modB事件播种在选择培养基上且存活的幼苗产生下一代。分析种子的DHA含量。因为所汇集的T1种子代表分离转基因的群体且包括任何无效分离子，所以预期得自于子代植物的纯合种子将具有增加的DHA水平，多达种子油中的总脂肪酸含量的20％。使用其它经修饰构建体转化拟南芥。尽管仅获得少量转化株系，但所产生的DHA水平都不高于modB构建体。
[0785] 还使用pJP3416-GA7-modB构建体来产生载培品种Oscar的经转化油菜植物且育种株系表示为NX005。对于Oscar转化，迄今获得了10个独立的经转化植物(T0)，且对于NX005，获得了20个独立的株系。从这些转基因株系收获种子(T1种子)。测试种子库的种子油中的DHA水平，且选择显示最高水平的两个株系，这些株系表示为株系CT132.5(载培品种Oscar)和CT133.15(NX005)。使20种得自于CT132.5的种子和11种得自于CT133.15的种子吸胀，且在两天之后，从各个别种子的半子叶中提取油。保持另一半子叶与胚轴且在培养基上培养以保持特定子代株系。测定油中的脂肪酸组成；CT132.5的数据示于表16中。如通过GC分析所测定，所分析的20种种子中有10种的DHA水平在总脂肪酸含量的7％至
20％范围内。其它种子的DHA少于7％，且可能具有来自于pJP3416-GA7-modB的T-DNA的部分(不完全)拷贝。转基因株系似乎含有基因未连接的多个转基因插入物。转基因株系CT133.15的种子所展现的DHA水平在0％至5％范围内。不含DHA的种子可能是无效的分离子。这些数据证实modB构建体在芸苔种子中在DHA产生方面表现良好。
20％范围内。其它种子的DHA少于7％，且可能具有来自于pJP3416-GA7-modB的T-DNA的部分(不完全)拷贝。转基因株系似乎含有基因未连接的多个转基因插入物。转基因株系CT133.15的种子所展现的DHA水平在0％至5％范围内。不含DHA的种子可能是无效的分离子。这些数据证实modB构建体在芸苔种子中在DHA产生方面表现良好。
[0786] 还使用pJP3416-GA7-modB和pJP3416-GA7-modF构建体来产生经转化的亚麻荠植物。获得了至少24个独立的经转化植物(T0)且通过子代分析更详细地检查。从这些转基因株系收获种子(T1种子)。测试种子库的种子油中的DHA水平，且选择显示最高DHA水平(在6％与9％之间)的6个株系。分析来自各株系的20种T1种子的DHA水平，如通过GC分析所测定，大部分种子所展现的DHA水平在总脂肪酸含量的6％至14％范围内。测定油中的脂肪酸组成；若干种转基因种子的数据示于表17中。这些数据证实modB和modF构建体在亚麻荠种子中在DHA产生方面都表现良好。
[0787] 表16.含有modB构建体的萌芽T1转基因油菜种子的半子叶的脂肪酸分布。在含有高于10％DHA的许多样品中观察到多达18.1％DHA。
[0788]
[0789] 表17.含有modB或modF构建体的T1转基因亚麻荠种子的脂肪酸分布
[0790]
[0791] 诸位发明人认为总体来说，与单拷贝T-DNA转化体相比，在多拷贝T-DNA转化体中，限速酶活性在DHA途径中的效率较高，或可通过插入编码在该途径中可能具有限制性的酶的T-DNA多基因来提高。多拷贝转化体可能具有重要性的证据见经GA7构建体转化的拟南芥种子(实施例2)，其中最高产生DHA事件在宿主基因组中插入3个T-DNA。多个基因可能是同一的，或优选地是编码相同多肽的不同变体，或受具有重叠表达模式的不同启动子控制。举例来说，增加表达可通过表达多个Δ6-去饱和酶编码区来实现，即使在产生相同蛋白质的情况下。举例来说，在pJP3416-GA7-modF和pJP3416-GA7-modC中，存在两种细小微胞藻Δ6-去饱和酶版本且是由不同的启动子表达。编码序列具有不同的密码子用法，且因此具有不同的核苷酸序列，以减轻潜在沉默或共阻抑作用，但产生相同蛋白质。
[0792] 实施例6.种子特异性构建体在体细胞胚中的活性
[0793] 为了建立预测基因构建体在种子特异性启动子控制下在种子中的表达的快速测定系统，建立油菜的体细胞胚系统。这使用了用于表达参与起始体细胞胚发生的LEC2转录因子的载体。作为说明，经由标准电穿孔将二元载体35S:LEC2和pJP107(Petrie等,2010a和b)引入根癌农杆菌菌株AGL1中且通过共培育将农杆菌转化体用于共转化油菜。pJP107的T-DNA区含有编码球等鞭金藻Δ9-延长酶、盐生巴夫藻Δ8-去饱和酶和盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶的基因，其中各基因由种子特异性启动子表达。对照转化仅使用35S:LEC2载体。35S:LEC2表达导致在组织培养物中由经转化的油菜愈伤组织直接产生体细胞胚，如实施例1中所描述。
[0794] 脂肪酸分析显示构建体pJP107的T-DNA上的种子特异性基因在共转化的LEC2基因存在下被表达于转基因体细胞胚中且用于由LA产生ARA(20:4Δ5,8,11,14)和由ALA产生EPA(20:5Δ5,8,11,14,17)。将3种共转化体细胞胚的数据示于表18中，且将各自的脂肪酸组成与油菜种子的种子油的脂肪酸组成相比较，所述油菜种子对于pJP107的T-DNA是转基因的且表达pJP107的T-DNA(Petrie等,2010a和b)。当与稳定转化的种子分布相比时，在体细胞胚组织中观察到ARA和中间物脂肪酸EDA(20:2ω6)和DGLA(20:3ω6)的类似总百分比以及转化效率。在稳定T2转基因种子和体细胞胚的脂肪酸组成方面观察到类似的结果：ω6脂肪酸的水平分别是26.6％和25.6％(平均)，而发现ARA水平分别是9.7％和10.6％(平均)。
[0795] 当单独引入35S:LEC2且在时程中分析体细胞胚时，发现脂肪酸分布变成更像胚Δ9,12,15 Δ9的分布，其中18:3 减少而18:1 增加，呈逆相关方式(图8)。这些结果表明，体细胞胚在特征方面实际上变得像种子且表达来自于pJP107的T-DNA上的基因。这显示体细胞胚系统允许快速表征油菜中的转基因种子特异性构建体而不需要产生转基因植物和由该植物产生成熟种子的全过程。
[0796] 表18.通过共转化pJP107与35S:LEC2产生的获自油菜体细胞胚的脂质的脂肪酸组成与未转化对照(WT)和经pJP107转化的T2种子相比较。个别酶转化效率示于相关酶促步骤之后的括号中。D9-Elo是Δ9-延长酶，D8-Des是Δ8-去饱和酶，且D5-Des是Δ5-去饱和酶。
[0797]WT T2pJP107转基因种子 LEC2：#45 LEC2：#57 LEC2：#58
18∶1Δ9 57.2 45.7 3.8 2.5 1.9
18∶2Δ9，12 19.1 8.7 10 10.6 10
18∶3Δ9，12，15 10.2 4.1 22.5 27.5 24.2
20∶2Δ11，14 7.1±1.9(67％D9-elo) 5.2(61.8％D9-elo) 3.7(56.7％D9-elo) 4.6(61.8％D9-elo)
20∶3Δ8，11，14 1.1±0.2(60％D8-des) 0.4(67％D8-des) 0.2(73％D8-des) 0.4(73％D8-des)
20∶4Δ5，8，11，14 9.7±0.9(90％D5-des) 10.6(98％D5-des) 10(96％D5-des) 11.2(97％D5-des)
20∶3Δ11，14，17 4.0±0.8 9.9 5.5 7.3
20∶4Δ8，11，14，17 0.3±0.1 0.4 0.3 0.4
20∶5Δ5，8，11，14，17 2.4±0.2 7.6 6.4 7.9
总新 24.6 34.1 26.1 31.8
18∶1Δ9 57.2 45.7 3.8 2.5 1.9
18∶2Δ9，12 19.1 8.7 10 10.6 10
18∶3Δ9，12，15 10.2 4.1 22.5 27.5 24.2
20∶2Δ11，14 7.1±1.9(67％D9-elo) 5.2(61.8％D9-elo) 3.7(56.7％D9-elo) 4.6(61.8％D9-elo)
20∶3Δ8，11，14 1.1±0.2(60％D8-des) 0.4(67％D8-des) 0.2(73％D8-des) 0.4(73％D8-des)
20∶4Δ5，8，11，14 9.7±0.9(90％D5-des) 10.6(98％D5-des) 10(96％D5-des) 11.2(97％D5-des)
20∶3Δ11，14，17 4.0±0.8 9.9 5.5 7.3
20∶4Δ8，11，14，17 0.3±0.1 0.4 0.3 0.4
20∶5Δ5，8，11，14，17 2.4±0.2 7.6 6.4 7.9
总新 24.6 34.1 26.1 31.8
[0798] 通过使用同一系统来产生体细胞胚，用pJP3416-GA7-modB和pJP3416-GA7-modD单独地转化油菜细胞。获得了42个胚，18个针对modB且24个针对modD。从胚提取总脂质且分析脂肪酸组成。所述胚含有在0％与多达16.9％之间的DHA(表19)。在0％DHA下的结果被假定是由于仅整合部分T-DNA或插入基因组的转录沉默区。发现总ω3FA(包括ALA):总ω6FA(包括LA)比率对于#270胚是2.3且对于#284胚是11.96。总ω6FA(包括LA):总ω3FA(包括ALA)比率对于#284胚是0.08。新ω6FA(不包括LA):新ω3FA(不包括ALA)比率对于#284胚是0.03。总体转化效率计算为：(对于#270、#284胚)OA到EPA＝14.0％、29.8％；OA到DHA＝9.7％、24.2％；LA到EPA＝15.4％、30.7％；LA到DHA＝10.7％、25.0％；ALA到EPA＝22.1％、33.3％；ALA到DHA＝15.3％、27.0％。相对于在T3pJP3416-GA7拟南芥株系所观察的结果，这些效率类似，或比#284的情形更大，这表明pJP3416-GA7-modB载体能够在油菜细胞中良好地发挥作用。SDA水平低于3.0％，表明Δ6-延长酶比GA7构建体表现得甚至更好。在#284中所实现的个别酶效率是：Δ12-去饱和酶，97.4％；ω3-去饱和酶，92.3％；Δ6-去饱和酶，38.2％；Δ6-延长酶，88.2％；Δ5-去饱和酶，98.8％；Δ5-延长酶，94.1％；和Δ4-去饱和酶，86.3％。总饱和脂肪酸是21.2％，总单不饱和脂肪酸是10.2％，总多不饱和脂肪酸是68.6％。
[0799] 诸位发明人相信这是迄今为止在油菜细胞中实现的最高DHA水平，但进一步数据如下所述。这也证明，pJP3416-GA7-modB中相对于pJP3416-GA7的修饰在提高Δ6-去饱和酶基因的表达水平方面是有效的。将如上所述的二元载体pJP3416-GA7、pJP3416-GA7-modA、pJP3416-GA7-modC、pJP3416-GA7-modD、pJP3416-GA7-modE 和pJP3416-GA7-modF与35S:LEC2共转化以产生经转化的油菜体细胞胚。在modD胚中观察到多达7.0％DHA，modE胚中为9.9％，modF胚中为8.3％，且在少数modG胚中为3.6％。
[0800] 表19.通过共转化种子特异性DHA酸构建体pJP3416-GA7-mod B与35S:LEC2而产生的油菜体细胞胚#270和#284以及#286和#289(pJP3416-GA7-modD)的油的脂肪酸组成。
[0801]#270 #284 #286 #289
14∶0 0.3 0.2 0.2 0.2
16∶0 14.0 15.7 17.2 16.6
16∶1d9 0.7 0.4 0.8 0.8
16∶3 0.5 0.6 1.1 1.3
18∶0 2.6 2.4 2.5 2.5
18∶1d9 6.6 1.8 1.5 1.1
18∶1d116.3 6.8 6.5 6.7
18∶2 18.9 4.5 10.0 9.8
18∶3ω60.7 0.8 0.3 0.3
18∶3ω333.0 37.2 42.0 41.5
20∶0 0.9 0.9 0.8 0.8
18∶4ω31.9 2.8 3.6 4.5
20∶1d110.2 0.1 0.1 0.1
20∶2ω60.1 0.1 0.1 0.2
20∶3ω30.5 0.0 0.5 0.6
22∶0 0.8 1.5 0.6 0.7
20∶4ω30.2 0.9 0.7 0.7
20∶5ω30.7 0.2 0.3 0.3
22∶2ω60.0 1.2 0.0 0.0
22∶3ω30.0 0.1 0.0 0.1
24∶0 0.8 1.0 1.0 1.0
24∶1 0.8 1.0 0.7 0.9
22∶5ω32.4 2.7 3.2 3.0
22∶6ω37.0 16.9 6.1 6.4
14∶0 0.3 0.2 0.2 0.2
16∶0 14.0 15.7 17.2 16.6
16∶1d9 0.7 0.4 0.8 0.8
16∶3 0.5 0.6 1.1 1.3
18∶0 2.6 2.4 2.5 2.5
18∶1d9 6.6 1.8 1.5 1.1
18∶1d116.3 6.8 6.5 6.7
18∶2 18.9 4.5 10.0 9.8
18∶3ω60.7 0.8 0.3 0.3
18∶3ω333.0 37.2 42.0 41.5
20∶0 0.9 0.9 0.8 0.8
18∶4ω31.9 2.8 3.6 4.5
20∶1d110.2 0.1 0.1 0.1
20∶2ω60.1 0.1 0.1 0.2
20∶3ω30.5 0.0 0.5 0.6
22∶0 0.8 1.5 0.6 0.7
20∶4ω30.2 0.9 0.7 0.7
20∶5ω30.7 0.2 0.3 0.3
22∶2ω60.0 1.2 0.0 0.0
22∶3ω30.0 0.1 0.0 0.1
24∶0 0.8 1.0 1.0 1.0
24∶1 0.8 1.0 0.7 0.9
22∶5ω32.4 2.7 3.2 3.0
22∶6ω37.0 16.9 6.1 6.4
[0802] 实施例7.分析来自于产生DNA的转基因拟南芥种子的TAG
[0803] 来自于经转化拟南芥种子的TAG上的DHA的位置分布是通过NMR来确定。通过首先在己烷下压碎种子，随后将压碎的种子转移至含有10mL己烷的玻璃管而从大约200mg种子中提取总脂质。在水浴中在大约55℃下使管子升温，然后涡旋并离心。去除己烷溶液且再用4×10mL重复该程序。合并提取物，通过旋转蒸发进行浓缩，且通过使用20mL 7％己烷中的乙醚通过短石英柱对提取的脂质中的TAG进行纯化脱除极性脂质。如先前所描述(Petrie等,2010a和b)定量测定经纯化TAG上的酰基位置分布。
[0804] 分析显示总种子油中的大多数DHA位于TAG的sn-1/3位置上，而极少见于sn-2位Δ5,8,11,14置上(图9)。与该结果相反的是，来自于产生ARA的种子的TAG显示50％ARA(20:4 )位于转基因芥花油的sn-2位置上，而预期仅33％呈随机分布(Petrie等,2012)。
[0805] 通过基本上相同的方法测定来自于经pJP3416-GA7或pJP3115与pJP3116的组合转化的油菜种子的TAG中的DHA的位置分布。
[0806] 还通过三级四极LC-MS分析来自于转基因拟南芥种子的总脂质，以确定含DHA的主要三酰基甘油(TAG)种类(图10)。发现DHA含量最丰富的TAG种类是DHA-18:3-18:3(TAG58:12；命名法未描述位置分布)，而第二最丰富的是DHA-18:3-18:2(TAG 58:11)。在总种子油中观察到Tri-DHA TAG(TAG 66:18)，虽然含量很低但处于可检测的水平。其它含DHA的主要TAG种类包括DHA-34:3(TAG56:9)、DHA-36:3(TAG 58:9)、DHA-36:4(TAG 58:10)、DHA-36:7(TAG58:13)和DHA-38:4(TAG 60:10)。通过Q-TOF MS/MS进一步证实两种含DHA的主要TAG的同一性。
[0807] 实施例8.预测油菜种子中的DHA产量
[0808] 实施例2中显示使用GA7基因构建体在拟南芥种子中有效产生DHA，水平为15％。在许多(而不是所有)转化体中，相同构建体在油菜种子中仅产生约1.5％DHA，主要是由于GA7的Δ6-去饱和酶基因在这个物种中的不良表达(实施例4)。基于认识到对GA7构建体的修饰将克服Δ6-去饱和酶基因表达问题(参见实施例5，如实施例6中所显示)，进行计算以确定表达来自于pJP3416-GA7变体的基因的油菜转基因种子的可能脂肪酸分布，其中各转基因编码的酶的性能与在具有GA7构建体的拟南芥中所观察到的一样有效。三个计算(#1、#2、#3)的预测脂肪酸组成示于表20中。这是基于野生型(非转化)油菜的脂肪酸组成，其包括59％油酸、20％LA和8％ALA。该表下半部中所示的三种预测部分脂肪酸分布是基于该表上半部中所示的各酶促步骤的转化效率。在#2预测中，75％效率下的Δ12-去饱和、75％下的Δ15-去饱和、35％下的Δ6-去饱和、80％下的Δ6-延长、90％下的Δ5-去饱和、90％下的Δ5-延长和90％下的Δ4-去饱和的组合将在典型芸苔转基因种子中产生大约10％DHA。这些效率全部低于或约等于拟南芥所见的个别效率，所以#2预测代表了保守估计值。#3中所列出的转化效率是基于经pJP3416-GA7转化的拟南芥中所见的有效转化的近似值。预计所产生的DHA占油菜种子所产生的种子油中的总脂肪酸含量的约15％，该结果反映拟南芥中所观察到的最有效产生水平。预期插入多个呈纯合状态的T-DNA能将油菜中的DHA水平提高到20％。
[0809] 表20.基于转基因拟南芥中的观察酶促效率的选定脂肪酸的预测脂肪酸组成，呈占来自于经DHA途径构建体转化的油菜的种子油中的总脂肪酸含量的百分比形式。酶是按照在由油酸产生DHA的途径中的顺序列出，des＝去饱和酶，elo＝延长酶。预测脂肪酸组成#1、#2和#3是基于该表上半部中的效率。
[0810]
[0811] 实施例9.植物叶子中的转基因EPA途径的稳定表达
[0812] 二元载体构建
[0813] 设计二元载体pORE04+11ABGBEC_豇豆_EPA_插入序列(SEQ ID NO:8)用于将T-DNA引入植物中，以便在叶组织中合成EPA。其含有编码以下酶的嵌合基因：细小微胞藻Δ6-去饱和酶(SEQ ID NO:16)、P.cordataΔ6-延长酶(SEQ IDNO:25)和盐生巴夫藻Δ5-去饱和酶(SEQ ID NO:30)，各酶受CaMV35S和拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位(SSU)启动子控制(图9)。该二元载体是通过合成SEQ ID 2的区域199-10878且将其克隆至受体二元载体pORE04中的BsiWI和KasI位点上(Coutu等,1997)来构建。3Δ9,12,15 Δ5,8,11,14,17个脂肪酸生物合成基因密码将ALA 18:3 转化成EPA 20:5 所需的酶。
[0814] 在本氏烟叶细胞中瞬时表达EPA构建体
[0815] 为了测试所述构建体是正确的且将在叶组织中有效地表达所述基因，将嵌合载体pORE04+11ABGBEC_豇豆_EPA_插入序列引入至根癌农杆菌菌株AGL1中。还如实施例1中所描述将嵌合载体35S:p19引入根癌农杆菌菌株AGL1中。在24℃生长室中使得自于这些的培养物的细胞浸润至本氏烟植物的叶组织中。对若干个直接比较样进行浸润，其中所比较的样品位于同一个叶子的两侧。以一式三份进行实验。在浸润后，使植物再生长5天，随后取叶盘以便如实施例1中所描述通过GC进行脂肪酸分布分析。GC分析显示EPA载体的功能是在本氏烟叶子中产生EPA(表21)，其中所发现的最高EPA水平是总叶脂质的10.7％。
[0816] 普通烟草稳定转化
[0817] 使用嵌合载体pORE04+11ABGBEC_豇豆_EPA_插入序列稳定地转化普通烟草。经由标准电穿孔程序将所述载体引入根癌农杆菌菌株AGL1中。使经过转化的细胞在补充有卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的固体LB培养基上生长且在28℃下孵育2天。使用单一集落引发新鲜培养物。在48h有力培养之后，通过在2,000×g下离心收集细胞且去除上清液。将细胞以OD600＝0.5的密度再悬浮于含有50％LB和50％MS培养基的新鲜溶液中。
[0818] 表21.得自于各实验中具有最高EPA水平的转基因本氏烟(瞬时)和普通烟草(稳定初代转化体)事件的总叶脂质的脂肪酸组成。
[0819]
[0820] 切下体外生长的普通烟草载培品种W38的叶样品并且用锋利的解剖刀切出约0.52
至1cm大小的方形横断面，同时浸入根癌农杆菌溶液中。允许浸入根癌农杆菌中的受伤的普通烟草叶片在室温下静置10分钟，随后在无菌滤纸上揩干并转移至无补充剂的MS培养板上。在24℃下经过2天的共培育周期之后，用无菌液体MS培养基将外植体洗涤3次，然后用无菌滤纸揩干并且放在补充有1.0mg/L苯甲基氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/L吲哚乙酸(IAA)、50mg/L卡那霉素和250mg/L氨噻肟头孢菌素的选择MS琼脂上。在24℃下将培养板孵育2周以允许由经过转化的普通烟草叶片发芽。
至1cm大小的方形横断面，同时浸入根癌农杆菌溶液中。允许浸入根癌农杆菌中的受伤的普通烟草叶片在室温下静置10分钟，随后在无菌滤纸上揩干并转移至无补充剂的MS培养板上。在24℃下经过2天的共培育周期之后，用无菌液体MS培养基将外植体洗涤3次，然后用无菌滤纸揩干并且放在补充有1.0mg/L苯甲基氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/L吲哚乙酸(IAA)、50mg/L卡那霉素和250mg/L氨噻肟头孢菌素的选择MS琼脂上。在24℃下将培养板孵育2周以允许由经过转化的普通烟草叶片发芽。
[0821] 为了在体外建立生根的转基因植物，切掉健康绿色芽且转移至含有MS琼脂培养基的200mL组织培养皿中，所述MS琼脂培养基补充有25μg/L IAA、50mg/L卡那霉素和250mg/L氨噻肟头孢菌素。在生根后将转基因芽转移至土壤且在温室中生长至成熟。从21株成熟转基因植物获取足够大的叶盘且如实施例1中所描述分析脂肪酸分布。发现所有转基因样品都含有EPA(表21)，其中发现半合初代转化体中的最高EPA水平是总叶脂质的
12.1％，该叶样品的脂质中还含有少量(<0.5％)DPA，这是由以Δ6-延长酶的低Δ5-延长活性水平延长EPA而产生。发现总ω3FA(包括ALA):ω6FA(包括LA)比率是2.7。总体转化效率计算为：OA到EPA＝18.4％，LA到EPA＝18.9％，ALA到EPA＝25.9％。产生
12.1％EPA是值得注意的，尤其是因为所述事件是半合初代转化体。确切地说，ALA到EPA效率接近于在稳定种子转化体中所观察到的效率。值得注意的是，所述构建体不含Δ12或Δ15-去饱和酶用于提高OA和LA到ALA的转化。在添加这些活性的情况下将预期能提高效率。
12.1％，该叶样品的脂质中还含有少量(<0.5％)DPA，这是由以Δ6-延长酶的低Δ5-延长活性水平延长EPA而产生。发现总ω3FA(包括ALA):ω6FA(包括LA)比率是2.7。总体转化效率计算为：OA到EPA＝18.4％，LA到EPA＝18.9％，ALA到EPA＝25.9％。产生
12.1％EPA是值得注意的，尤其是因为所述事件是半合初代转化体。确切地说，ALA到EPA效率接近于在稳定种子转化体中所观察到的效率。值得注意的是，所述构建体不含Δ12或Δ15-去饱和酶用于提高OA和LA到ALA的转化。在添加这些活性的情况下将预期能提高效率。
[0822] 从半合转化体收获种子且播种以产生纯合植物。
[0823] 顶部EPA株系中的种子集合似乎正常，且得自于#10和#17株系的种子萌芽情况良好，从而建立T2代。EPA到空白(无EPA)株系的比率表明#28事件是单基因座，且因此还建立了该株系的T3代。T3群体的脂肪酸分布分析表明转基因是纯合的，未发现空白事件且具有稳定的EPA的量。发现整个T3群体中的总叶脂质中的EPA的平均量是9.4％±0.3(表22)。
[0824] 表22.得自于野生型(WT)和独立的转基因或瞬时转化株系(EPA)的总叶脂质的代表性脂肪酸分布。物种是本氏烟(瞬时转化)、普通烟草(稳定转化的T3群体)、龙爪豆(稳定转化的T1事件)。误差表示多个样品的标准偏差。底部显示的表观转化效率描述ω3途径且计算为产物FA的总和/底物+产物FA的总和。
[0825]
[0826] 对纯合T3普通烟草植物的叶样品进行进一步生化分析。从冻干叶材料中提取总脂质且通过薄层色谱法(TLC)进行分级。发现EPA在普通烟草TAG中的存在量多达30.1％以及在极性类脂中为6.3％(表23)。令人感兴趣的是注意到所评估的所有脂质级分(包括TAG、MGDG、DGDG、SQDG、PG、PC、PE、PI和PS)中都存在由转基因途径产生的EPA。所有脂质库都含有低水平的新颖中间物或ω6LC-PUFA脂肪酸，其中新颖ω3:ω6脂肪酸的TAG比率是10:1。
[0827] 豇豆的稳定转化
[0828] 如下将嵌合载体pORE04+11ABGBEC-豇豆-EPA-插入序列转化至豇豆(龙爪豆)中。成熟干种子是优选的起始材料，但也可以使用从未成熟豆荚中收获的种子，即最大鲜重种子。对干种子进行手工脱粒以避免种皮破裂且因而减少微生物污染。
[0829] 将干种子或未成熟豆荚浸在70％乙醇中2min，然后在20％市售漂白剂(8.4g/L次氯酸钠最终浓度)中处理30min。然后用无菌水将种子洗涤若干次。以无菌方式从豆荚中取出未成熟种子，同时使成熟种子吸胀过夜。可以使用两种不同的外植体进行多次生芽，即，胚轴和子叶本身，优选与二等分胚轴连接的子叶。从轴上去除芽尖和根尖，随后在子叶节，即轴与子叶的连接点上制造创口。根据对19种载培品种和植株的初步比较，现已清楚大部分豇豆株系可以转化，唯一的警告是需要针对各株系对不同的组织培养条件进行优化。
[0830] 表23.分析得自于转基因普通烟草叶子样品的未成熟和成熟(未成熟|成熟)叶脂质级分三酰基甘油(TAG)、总极性脂质(PL)、单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)、二半乳糖基二酰基甘油(DGDG)、磺基奎诺糖基二酰基甘油(SQDG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)。误差表示多个样品的标准偏差。在叶TAG中观察到多达30％EPA，其中EPA还在所有极性脂质中都有分布。对于若干种脂肪酸，还观察到了未成熟与成熟叶分布之间的差异。
[0831]
[0832] 选择标记基因bar或NptII可用于转化。根癌农杆菌菌株AGL1是用于豇豆转化的优选菌株。在28℃下，在振荡器上以180rpm将含有pORE04+11ABGBEC-豇豆-EPA-插入序列载体的农杆菌培养过夜，且在8000g下将悬浮液离心10min并且再悬浮于培养基1(MS基础培养基，以1:10稀释且含有30g/l蔗糖、20mM 2-MES，在高压釜处理之前调节至pH5.6，补充有过滤器灭菌MS-维生素、100mg/l肌醇、1.7mg/l BAP、0.25mg/l GA3、0.2mM乙酰丁香酮、250mg/l硫代硫酸钠、150mg/l二硫苏糖醇和0.4g/l L-半胱氨酸)中。在无振荡的情况下将外植体浸入细菌悬浮液中1小时，随后用解剖刀在分生组织区中制造创口。然后在无菌滤纸上揩吸经过处理的外植体且转移至固化培养基2(含有0.8％琼脂的培养基1)，用滤纸覆盖。共培育4天后，将外植体转移至培养基3(全强度MS培养基，补充有100mg/l肌醇、150mg/l特美汀、30g/L蔗糖、3mM MES、1.7mg/L BAP、5mg/L PPT或25-50mg/L遗传霉素或150mg/L卡那霉素、0.8g/L琼脂，且调节至pH 5.6)以便进行芽诱导和选择经过转化的芽。两周后可见第一批芽。从子叶节区域去除子叶且将培养物转移至新鲜培养基3。每两周将培养物转移至新鲜培养基3，随后去除死的和垂死的组织。对前4次传代培养物进行卡那霉素选择，随后用遗传霉素和卡那霉素交替进行。在6次传代培养之后，将存活的绿色芽转移至培养基4(无BAP但补充有0.5mg/l GA3、50mg/l天冬酰胺、0.1mg/l 3-吲哚乙酸(IAA)、150mg/l特美汀和PPT(10mg/l)、遗传霉素(50mg/L)或卡那霉素(150mg/L))的培养基3以便进行芽延长。每两周对所述芽进行传代培养，直到单个芽的长度大于1cm。将这些较大的芽从皮氏培养皿转移至培养罐(80mm高度)中以便在选择下进一步生长。
[0833] 大多数再生的芽可在体外生根，且将生根植物转移至土壤并且允许在高湿度室中巩固14至21天，随后转移至环境温室条件。
[0834] 为了增强对豇豆的基因转移，共培养培养基补充有硫醇化合物。添加L-半胱氨酸、二硫苏糖醇和硫代硫酸钠会减轻受伤组织褐变。
[0835] 可用简化方案处理大量豇豆外植体。简言之，所述方案由以下步骤组成：灭菌成熟种子在水中吸胀过夜，通过对由此获得的种子进行纵向二等分得到外植体，分开的胚轴(去除芽和根端)仍连接于子叶，通过分生组织区中的局部创伤用农杆菌菌株AGL1感染，在25℃下在光照下在含有硫醇化合物的培养基上共培养4天，在含有选择剂的培养基上进行芽诱导和延长，在体外使芽生根并且转移至温室条件以便开花和结籽，对推定转基因植物进行PCR或酶分析，和通过PCR或酶活性筛选下一代子代。
[0836] 转基因T0植物的子代在表型方面是正常的。转基因被遗传到子代，且通过筛选其T3子代的酶活性或通过PCR鉴别纯合T2植物。
[0838] 使用该转化系统将pORE04+11ABGBEC-豇豆-EPA-插入序列二元载体引入再生的转化豇豆植物中。
[0839] 对pORE04+11ABGBEC-豇豆-EPA-插入序列二元载体进行修饰，其中添加编码Δ5-延长酶和Δ4-去饱和酶的基因，以提供能赋予将所产生的EPA进一步转化成DHA的能力的基因构建体。将该构建体转化至植物中以便在营养组织中产生DHA。
[0840] 发现EPA存在于经受住化学选择的少数事件中。最高株系的总叶脂质中含有7.1％±0.2EPA。转化率低于对豇豆的平常经验，其中仅6个株系被证实是转基因的。至今未知是什么导致了这个效果，但令人感兴趣的是注意到大于平常比例的转基因事件含有不完全T-DNA区。有可能较大构建体尺寸造成降低效率。还计算了3种转基因酶各自的表观转化效率(表22)。所有3个种类的结果大致类似，其中在天然ALA的初步Δ6-去饱和之后良好转化成EPA。注意到尽管不存在特异性Δ5-延长酶，但一些EPA到DPA的Δ5-延Δ9,12,15
长。P.cordataΔ6-延长酶先前已显示具有低水平的Δ9-延长酶活性(即18:3 转
Δ11,14,17
化成20:3 )，但在酵母测定中未检测到Δ5-延长酶活性。
长。P.cordataΔ6-延长酶先前已显示具有低水平的Δ9-延长酶活性(即18:3 转
Δ11,14,17
化成20:3 )，但在酵母测定中未检测到Δ5-延长酶活性。
[0841] 实施例10.测试Δ12-去饱和酶基因的变异
[0842] 二元载体构建
[0843] 为了测试和比较一系列嵌合Δ12-去饱和酶基因，制造了若干种二元载体用于转化拟南芥和油菜。二元载体pJP3365、pJP3366、pJP3367、pJP3368和pJP3369各自含有编码巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶(SEQ ID NO:12)和细小微胞藻Δ6-去饱和酶(SEQ ID NO:16)酶和一系列Δ12-去饱和酶之一的基因。Δ12-去饱和酶来自于新型隐球菌(登录号XP_570226，在pJP3365中)、含有L151M突变以增加基因活性的新型隐球菌Δ12-去饱和酶版本(在pJP3366中)、克鲁维郎香酵母(SEQ IDNO:10，在pJP3367中)、集胞藻PCC6803(登录号BAA18169，在pJP3368中)和还阳参(登录号CAA76157，Lee等,1998，在pJP3369中)。还阳参去饱和酶在该系列中是唯一的植物去饱和酶；其它是真菌酶。除了野生型还阳参Δ12-去饱和酶，对于各Δ12-去饱和酶通过将植物密码子经优化蛋白质编码区呈可操作地连接于FP1启动子的取向插入载体pJP3364的NotI位点(参见图12)以提供各去饱和酶的种子特异性表达来制造载体。载体pJP3364已含有编码巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶和细小微胞藻Δ6-去饱和酶的嵌合基因，各自受种子特异性启动子控制(图12)。设计3种脂肪酸生物合成酶，即Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶和Δ6-去饱和酶的Δ9 Δ6,9,12,15
组合以组装用于将油酸(18:1 )转化成SDA(18:4 )的途径。因此进行测定以测量
经转化种子中的SDA产生水平。
组合以组装用于将油酸(18:1 )转化成SDA(18:4 )的途径。因此进行测定以测量
经转化种子中的SDA产生水平。
[0844] 拟南芥和油菜转化和分析
[0845] 将嵌合二元载体引入根癌农杆菌菌株AGL1，以及使用用于转化的花序浸染法来自于用于转化fad2突变型拟南芥植物的经转化农杆菌的培养物的细胞中(Clough和Bent,1998)。在成熟后，从经过处理的植物收获T1种子且接种在含有卡那霉素的MS培养板上以便选择具有各嵌合载体的T-DNA上所存在的NptII选择标记基因的幼苗。将存活T1幼苗转移至土壤。在允许植物自花授粉且使其生长至成熟后，从这些植物收获T2种子且通过GC分析种子脂质的脂肪酸组成。
[0846] 嵌合载体pJP3367还通过实施例4中所描述的方法用于转化油菜，以产生12个转基因事件。发现汇集的植物种子中的SDA在0.6％至2.2％范围内，且分析得自于具有最高SDA的转基因植物的9个个别种子的脂肪酸组成。得自于所述分析的脂肪酸组成数据示于表24中。
[0847] 数据显示各T-DNA在拟南芥和油菜中表达的Δ12-去饱和酶活性出乎意料地低，酶转化效率为约20％而不是同一表达盒在GA7构建体(实施例2和3)中所见的70％至80％。来自于这些载体的Δ12-去饱和酶基因的这种相对不良表达的原因还不清楚，但总体上可能与基因在构建体中的位置有关。
[0848] 相比之下，RT-PCR表达分析显示T-DNA上的巴斯德毕赤酵母ω3-去饱和酶和细小微胞藻Δ6-去饱和酶基因在转化种子中的表达相对良好。表24包括在转化种子中的Δ6-去饱和酶转化效率，其在一个油菜转化株系中在约11％至约25％范围内。这显著高于经GA7构建体转化的油菜种子(实施例4)中所见的约7％的Δ6-去饱和酶转化效率。
[0849] 表24.经来自于pJP3367的T-DNA转化的T1油菜植物的单一种子的脂肪酸组成(占种子油中的总脂肪酸的百分比)。SDA(18:4ω3)以粗体显示。
[0850]
[0851] 因此，为了利用来自于pJP3367的T-DNA赋予较高Δ6-去饱和酶转化效率的优势，使经该T-DNA转化的油菜植物与经来自于pJP3416-GA7的T-DNA转化的植物(实施例4)杂交以产生携带两种T-DNA的子代植物和种子。通过GC分析从F1种子提取的油的脂肪酸组成的DHA含量和其它脂肪酸含量。由于Δ6-去饱和酶的表达增加，观察到DHA水平增加。产生了对于两种T-DNA是纯合的植物并且将产生较高的DHA水平。
[0852] 实施例11.通过使用沉默阻抑蛋白增加脂肪酸的累积
[0853] 二元载体构建
[0854] WO 2010/057246描述了使用沉默阻抑蛋白(SSP)来增加植物种子中的转基因表达。为了证明使用这样的蛋白质可以使油料种子中的LC-PUFA产生提高和稳定若干代，选择若干种SSP进行测试，即V2(登录号GU178820.1)、p19(登录号AJ288943.1)、p38(登录PE号DQ286869.1)和P0 (登录号L04573.1)。p19是来自于番茄丛矮病毒(TBS V)的阻抑蛋白质，其结合21个核苷酸长的siRNA，随后它们指导同源RNA的Argonaute指导型裂解(Voinnet等,2003)。V2是来自于番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的阻抑蛋白，其结合植物蛋白SGS3(Glick等,2008)、认为由ssRNA底物产生双链RNA中间物所需要的蛋白(B eclin等,2002)或结合具有5'悬垂物的dsRNA结构(Fukunaga等,2009)。p38是来自于芜菁皱缩病毒(TCV)的阻抑蛋白，其通过结合Dicer和Argonaute蛋白而干扰植物沉默机制PE
(Azevedo等,2010)。P0蛋白，诸如P0 和RPV-P0，来自于马铃薯卷叶病毒，其靶向Argonaut蛋白从而增强降解(Baumberger等,2007；Bortolamiol等,2007；Fusaro等,2012)。因此制备基因构建体用于如下在植物种子中表达这些SS P与一组脂肪酸生物合成基因的组合Δ9,12 Δ5,8,11,14
以便由LA(18:1 )产生ARA(20:4 )。
(Azevedo等,2010)。P0蛋白，诸如P0 和RPV-P0，来自于马铃薯卷叶病毒，其靶向Argonaut蛋白从而增强降解(Baumberger等,2007；Bortolamiol等,2007；Fusaro等,2012)。因此制备基因构建体用于如下在植物种子中表达这些SS P与一组脂肪酸生物合成基因的组合Δ9,12 Δ5,8,11,14
以便由LA(18:1 )产生ARA(20:4 )。
[0855] 通过用PmeI和AvrII进行消化，产生9560bp片段而在来自于pJP3010的单一DNA片段上获得了编码球等鞭金藻Δ9-延长酶和盐生巴夫藻Δ8-去饱和酶和Δ5-去饱和酶的脂肪酸生物合成基因和细菌选择标记物。该片段上的Δ9-延长酶编码区连接于拟南芥FAE1启动子(pAtFAE1)和conlinin转录终止/聚腺苷酸化区(LuCnl2-3')。去饱和酶编码区各自连接于截短napin FP1启动子(pBnFP1)和nos3’转录终止/聚腺苷酸化区。对该片段上的3个脂肪酸生物合成基因进行定向且用与pJP107中相同的方式(Petrie等,2012)间隔且编码与pJP107相同的蛋白质。该DNA片段还包含来自于pCW141的pFP1:GFiP:nos3'基因(参见WO2010/057246)，该基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。使用该筛选标记基因作为可见种子特异性标记物，从而允许简单且非破坏性地鉴别且从而选择包含和表达所述基因的转基因种子。
[0856] 将PmeI-AvrII片段插入一系列5种载体各自的PmeI-AvrII位点上，各载体含有不同的SSP基因(WO2010/057246)，从而产生命名为pFN045、pFN046、pFN047、pFN048和PEpFN049的基因构建体。这些包含分别编码SSP、P0 、p38、p19、35S:V2和V2的基因。各SSP基因受FP1启动子和ocs3'转录终止/聚腺苷酸化区控制，除了在构建体pFN048中，其中V2编码区受组成型CaMV 35S启动子控制。SSP基因在各情况下处于构建体的T-DNA区内，与T-DNA的右边界(RB)相邻。通过用AhdI和NheI消化pFN045，随后用DNA连接酶再环化PE
以缺失FP1:P0 基因来制造第六构建体，即缺乏任何SSP编码序列的pFN050。6种构建体各自包含处于T-DNA内且与T-DNA的左边界相邻的NptII选择标记基因。所有构建体都具有RK2复制起点以保持农杆菌中的质粒。
以缺失FP1:P0 基因来制造第六构建体，即缺乏任何SSP编码序列的pFN050。6种构建体各自包含处于T-DNA内且与T-DNA的左边界相邻的NptII选择标记基因。所有构建体都具有RK2复制起点以保持农杆菌中的质粒。
[0857] 用ARA表达载体与SSP组合转化拟南芥
[0858] 为了转化在种子脂质中具有高亚油酸水平的fad2/fae1双重突变型拟南芥的基因型MC49，用经6种构建体pFN045-pFN050中的每一种单独转化的根癌农杆菌菌株GV3101通过花序浸染法(Clough和Bent,1998)处理植物。使经过处理的植物生长至成熟，并且将从它们收获的T1种子接种于含有卡那霉素的MS培养基上以选择经过转化的T1植物。还使用了筛选种子中的GFP表达作为经过转化的T1种子的可见标记物。将MS/Kan培养板上存活的或获自GFP阳性种子的幼苗转移至土壤且使其生长至成熟以获得T2种子。对于用pFN045、pFN046、pFN047、pFN048、pFN049和pFN050转化，所获得的转化植物数目分别是5、14、32、8、23和24。在该阶段发现编码pFN046中的p38的基因不具功能性，且因此经载体pFN046转化的植物被视为附加对照，即，基本上与pFN050相同。
[0859] 从各转化植物获取约100个汇集T2种子以便通过FAME制备和GC分析确定种子脂质的脂肪酸组成。还使来自于各转基因株系的6个T2幼苗生长以产生T3种子。
[0860] 使用GC测定从T2种子中提取的总脂质中的脂肪酸组成。分析显示了T2群体中的ARA和中间物EDA(20:2ω6)和DGLA(20:3ω6)的水平范围。ARA的数据示于图13和14中。
[0861] 图13显示对T2种子群体的脂质中的ARA水平的箱线图分析。显然，含有FP1:p19和35S:V2基因以及ARA生物合成基因的种子群体中的ARA中位数(50％)水平显著高于含有缺陷FP1:p38基因或来自于pFP050的不含SSP基因的对照T-DNA的种子。经编码p19和V2的基因转化的种子的平均ARA水平高于经p38基因转化的种子或无SSP的那些种子(图14)。一个FP1:p19株系和两个FP1:V2株系分别展现约19％、20％和23％ARA。这些PE是界外值且因此不包括在箱线图分析的计算中。与其它构建体相比，经包含基因FP1:P0和35S:V2的T-DNA转化的植物的存活数较少；认为这些基因在MC49背景下可能不利于植物健康。
[0862] 不仅构建体之间的ARA水平显著不同，而且观察到从LA到ARA途径的第一中间物即EDA(20:2ω6)在种子脂质中的水平在表达V2或p19的株系中低于缺乏SSP或含有p38构建体的种子(图15)。在T3种子中，一个含有表达p19的构建体的群体展现ARA占种子脂质中的总脂肪酸的百分比为38％。
[0863] 转基因T3株系的范围进入T4代。表达V2的T4种子中的ARA水平与上一代相比相同或实际上展现与其T3亲本相比有所增加的水平(图16)。表达p19的株系显示变化更大的ARA水平。与T3亲本相比，ARA水平在一些株系中降低，而在其它株系中相同或有所增加。相比之下，含有缺陷p38基因或缺乏SSP的株系总体上显示ARA水平下降且中间物水平增加(图18)。在这些株系中的一些中，ARA降至约1％且EDA水平增至约20％。对于表达p19和V2的株系，与表达p38或缺乏SSP的株系相比，T4种子中的平均ARA水平较高(图17)。
[0864] 本实验显示，转基因植物的种子中的SSP以及LC-PUFA生物合成途径的其它基因的表达不仅增加第一代子代中的所要脂肪酸的产生水平，而且使后几代的脂肪酸产生水平稳定，诸如第三或第四代子代。脂肪酸产生增加伴随着生物合成途径中的中间物脂肪酸水平降低。由种子特异性启动子表达SSP的p19和V2是优选的。旨在表达p38SSP的构建体具有缺陷且利用该构建体未获得可用数据。V2SSP及其来自于其它病毒的同源物被认为是特别优选的，这是因为它们允许最大限度地表达生物合成途径基因且同时允许发育种子的相同细胞中的其它基因沉默。
[0865] 实施例12.测定油中的甾醇含量和组成
[0866] 如实施例1中所描述通过GC和GC-MS分析将得自于购自澳大利亚商业来源的12种植物油样品的植物甾醇表征为O-三甲基硅烷基醚(OTMSi-醚)衍生物。通过滞留数据、质谱解译和与文献和实验室标准质谱数据相比较来鉴别甾醇。通过使用5β(Η)-胆烷-24-醇内标物来定量甾醇。所鉴别的一些甾醇的基本植物甾醇结构和化学结构示于图19和表25中。
[0867] 所分析的植物油来自于：芝麻(芝麻)、橄榄(橄榄)、向日葵(向日葵)、蓖麻(蓖麻)、芸苔(油菜)、红花(红花)、花生(落花生)、亚麻(亚麻)和大豆(大豆)。在所有油样品中，按照相对丰度降低的顺序，主要的植物甾醇是：β-谷甾醇(在总甾醇含量的28％至55％范围内)、Δ5-燕麦甾醇(异岩藻甾醇)(3％至24％)、菜油甾醇(2％至33％)、Δ5-豆甾醇(0.7％至18％)、Δ7-豆甾醇(1％至18％)和Δ7-燕麦甾醇(0.1％至5％)。鉴别了若干种其它微量甾醇，这些是：胆甾醇、菜子甾醇、海绵甾醇、菜油甾烷醇和齿孔醇。
还检测到4种C29:2和2种C30:2甾醇，但进一步研究需要完全鉴别这些微量组分。另外，一些油中存在若干种其它未鉴别甾醇，但由于其丰度极低，故色谱强度不足以鉴别其结构。
还检测到4种C29:2和2种C30:2甾醇，但进一步研究需要完全鉴别这些微量组分。另外，一些油中存在若干种其它未鉴别甾醇，但由于其丰度极低，故色谱强度不足以鉴别其结构。
[0868] 甾醇含量表示为mg/g油，按照量降低的顺序为：芥花油(6.8mg/g)、芝麻油(5.8mg/g)、亚麻油(4.8-5.2mg/g)、葵花油(3.7-4.1mg/g)、花生油(3.2mg/g)、红花油(3.0mg/g)、大豆油(3.0mg/g)、橄榄油(2.4mg/g)、蓖麻油(1.9mg/g)。甾醇组成％和总甾醇含量呈现于表26中。
[0869] 表25.所鉴别的甾醇的IUPAC/系统名称。
[0870]甾醇编号 常用名称 IUPAC/系统名称
1 胆甾醇 胆甾-5-烯-3β-醇
2 菜子甾醇 24-甲基胆甾-5,22E-二烯-3β-醇
3 海绵甾醇/24-亚甲基胆甾醇 24-甲基胆甾-5,24(28)E-二烯-3β-醇
4 菜油甾醇/24-甲基胆甾醇 24-甲基胆甾-5-烯-3β-醇
5 菜油甾烷醇/24-甲基胆甾烷醇 24-甲基胆甾烷-3β-醇
7 Δ5-豆甾醇 24-乙基胆甾-5,22E-二烯-3β-醇
9 麦角甾-7-烯-3β-醇 24-甲基胆甾-7-烯-3β-醇
11 齿孔醇 4,4,14-三甲基麦角甾-8,24(28)-二烯-3β-醇
12 β-谷甾醇/24-乙基胆甾醇 24-乙基胆甾-5-烯-3β-醇
13 D5-燕麦甾醇/异岩藻甾醇 24-乙基胆甾-5,24(28)Z-二烯-3β-醇
19 D7-豆甾醇/豆甾-7-烯-3b-醇 24-乙基胆甾-7-烯-3β-醇
20 D7-燕麦甾醇 24-乙基胆甾7,24(28)-二烯-3β-醇
1 胆甾醇 胆甾-5-烯-3β-醇
2 菜子甾醇 24-甲基胆甾-5,22E-二烯-3β-醇
3 海绵甾醇/24-亚甲基胆甾醇 24-甲基胆甾-5,24(28)E-二烯-3β-醇
4 菜油甾醇/24-甲基胆甾醇 24-甲基胆甾-5-烯-3β-醇
5 菜油甾烷醇/24-甲基胆甾烷醇 24-甲基胆甾烷-3β-醇
7 Δ5-豆甾醇 24-乙基胆甾-5,22E-二烯-3β-醇
9 麦角甾-7-烯-3β-醇 24-甲基胆甾-7-烯-3β-醇
11 齿孔醇 4,4,14-三甲基麦角甾-8,24(28)-二烯-3β-醇
12 β-谷甾醇/24-乙基胆甾醇 24-乙基胆甾-5-烯-3β-醇
13 D5-燕麦甾醇/异岩藻甾醇 24-乙基胆甾-5,24(28)Z-二烯-3β-醇
19 D7-豆甾醇/豆甾-7-烯-3b-醇 24-乙基胆甾-7-烯-3β-醇
20 D7-燕麦甾醇 24-乙基胆甾7,24(28)-二烯-3β-醇
[0871] 在所有种子油样品中，主要植物甾醇一般是β-谷甾醇(在总甾醇含量的30％至57％范围内)。所述油中其它主要甾醇的比例范围较宽：菜油甾醇(2％至17％)、Δ5-豆甾醇(0.7％至18％)、Δ5-燕麦甾醇(4％至23％)、Δ7-豆甾醇(1％至18％)。来自于不同物种的油具有不同的甾醇分布，其中一些具有相当独特的分布。在芥花油的情况下，菜油甾醇具有最高比例(33.6％)，而其它物种样品一般具有较低水平，例如在花生油中多达
17％。红花油具有相对较高比例的Δ7-豆甾醇(18％)，而该甾醇在其它物种油中通常较低，在葵花油中多达9％。因为它们对于各物种是独特的，因此甾醇分布可用于辅助鉴别特定蔬菜或植物油和检查其纯粹性或是否掺杂其它油。
17％。红花油具有相对较高比例的Δ7-豆甾醇(18％)，而该甾醇在其它物种油中通常较低，在葵花油中多达9％。因为它们对于各物种是独特的，因此甾醇分布可用于辅助鉴别特定蔬菜或植物油和检查其纯粹性或是否掺杂其它油。
[0872] 表26.所测定的植物油的甾醇含量和组成。
[0873]
[0874]
[0875] C29:2*和C30:2*分别表示具有2个双键的C29甾醇和具有2个双键的C30甾醇[0876] 比较向日葵和红花的各2个样品，在各情况下，一种是通过冷压种子产生且未经精制，而另一种不是冷压且经过精制。尽管观察到一些差异，但油的两个来源具有类似的甾醇组成和总甾醇含量，表明加工和精制对这两个参数具有极小影响。甾醇含量在样品之间变化三倍且在1.9mg/g至6.8mg/g范围内。芥花油具有最高的甾醇含量且蓖麻油具有最低的甾醇含量。
[0877] 实施例13.增加DHA在sn-2TAG位置上的累积
[0878] 诸位发明人认为TAG中sn-2位置上的DHA累积可以通过共表达1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)与诸如GA7构建体或其变体赋予的DHA生物合成途径来增加。优选的LPAAT是可作用于多不饱和C22脂肪酰基-CoA底物，从而使多不饱和C22链在LPA的sn-2位置上插入(以形成PA相对于LPAAT)有所增加的那些。细胞质LPAAT酶经常显示变化的底物偏好，特别是在物种的TAG中合成并累积罕见脂肪酸的情况下。来自于荷包蛋花(Limnanthes douglasii)的LPAAT2显示使用瓢儿菜基-CoA(C22:1-CoA)作为PA合成底物，相比之下，来自于相同物种的LPAAT1不能利用C22底物(Brown等,2002)。
[0879] 考虑了已知的LPAAT且选择一定数目进行测试，包括一些预期不能增加DHA并入sn-2位置的作为对照。已知的LPAAT包括：拟南芥LPAAT2：(SEQ ID NO:63，登录号ABG48392，Kim等,2005)、白池花LPAAT(SEQ ID NO:64，登录号AAC49185，Lassner等,1995)、酿酒酵母S1c1p(SEQ ID NO:65，登录号NP_010231，Zou等,1997)、高山被孢霉LPAAT1(SEQ ID NO:67，登录号AED33305；美国专利号7879591)和油菜LPAAT(SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69，登录号分别是ADC97479和ADC97478)。选择这些以涵盖三组L PAAT酶：1)典型地对罕见长链多不饱和脂肪酸具有低活性的对照植物种子LPAAT(包括拟南芥和芸苔LPAAT)；2.先前已显示通过使用C22酰基-CoA作为底物而作用于C22脂肪酸的LPAAT，在该情况下芥子酸C22:1(包括白池花和酵母LPAAT)；3.诸位发明人认为可能能够利用诸如EPA和DHA等长链多不饱和脂肪酸作为底物的LPAA T(包括被孢霉LPAAT)。
[0880] 拟南芥LPAAT2(也表示为LPAT2)是局限于内质网的酶，已证明其对C16和C18底物具有活性，然而并未测试对C20或C22底物的活性(Kim等,2005)。白池花LPAAT2显示将C22:1酰基链插入PA的sn-2位置，但并未测试使用DHA作为底物的能力(Lassner等,1995)。已证明选定的酿酒酵母LPAAT S1c1p具有使用22:1-CoA以及18:1-CoA作为底物的活性，表明与链长度相关的广泛底物特异性(Zou等,1997)。也未测试DHA-CoA和其它LC-PUFA作为底物。被孢霉LPAAT先前已被证明在转基因解脂耶氏酵母中对EPA和DHA脂肪酸底物具有活性(US 7879591)。
[0881] 诸位发明人鉴别了其它LPAAT。细小微胞藻是产生和在其油中累积DHA的微藻，但在该物种中，DHA在TAG上的位置分布尚未得到证实。通过使用拟南芥LPAAT2作为BLAST查询序列检索细小微胞藻基因组序列鉴别了细小微胞藻LPAAT(SEQ ID NO:66，登录号XP_002501997)。出现了若干个候选序列且人工合成序列XP_002501997以便测试作为LPAAT酶对C22LC-PUFA具有活性的可能性。蓖麻LPAAT注释为蓖麻基因组序列中的推定LPAAT(Chan等,2010)。人工合成来自于蓖麻基因组的4种候选LPAAT且在浸润的本氏烟叶组织的粗制叶溶解物中进行测试。此处描述的候选序列显示LPAAT活性。
[0882] 将许多候选LPAAT与系统树上的已知LPAAT进行比对(图20)。注意，推定微单胞菌LPAAT不与推定C22LPAAT形成簇，而是发散序列。
[0883] 作为各种LPAAT使用DHA-CoA作为底物的能力的初步测试，如下制造各自受35S启动子控制的嵌合基因构建体以便在本氏烟叶中组成性表达外源LPAAT：35S：
Arath-LPAAT2( 拟 南 芥 ER LPAAT)；35S:Ricco-LPAAT2；35S:Limal-LPAAT( 白 池 花LPAAT)；35S:Sacce-S1c1p(酿酒酵母LPAAT)；35S:Micpu-LPAAT(细小微胞藻LPAAT)；
35S:Moral-LPAAT1(高山被孢霉LPAAT)。实验中使用缺乏外源LPA AT的35S:p19构建体作为对照。如实施例1中所描述将这些构建体各自经由农杆菌引入本氏烟叶子中，且在浸润后5天，将经过处理的叶子区切除并研磨以制造叶子溶解物。各溶解物包括外源LPAAT
14
以及用于合成LPA的内源酶。通过以一式三份向溶解物中单独添加经 C标记的-OA、-LA或-ALA(C18底物)、-ARA(C20底物)和-DHA(C22)建立体外反应。在25℃下孵育反应物
14
且通过TLC测定经 C标记的脂肪酸并入PA中的水平。计算各LPAAT使用DHA相对于AR A和C18脂肪酸的能力。发现白芒花、被孢霉和酵母LPAAT对DH A底物具有活性，其中经放射性标记的PA似乎针对这些而不是其它LPAAT。通过类似的油酸饲料证实所有LPAAT都具有活性。
Arath-LPAAT2( 拟 南 芥 ER LPAAT)；35S:Ricco-LPAAT2；35S:Limal-LPAAT( 白 池 花LPAAT)；35S:Sacce-S1c1p(酿酒酵母LPAAT)；35S:Micpu-LPAAT(细小微胞藻LPAAT)；
35S:Moral-LPAAT1(高山被孢霉LPAAT)。实验中使用缺乏外源LPA AT的35S:p19构建体作为对照。如实施例1中所描述将这些构建体各自经由农杆菌引入本氏烟叶子中，且在浸润后5天，将经过处理的叶子区切除并研磨以制造叶子溶解物。各溶解物包括外源LPAAT
14
以及用于合成LPA的内源酶。通过以一式三份向溶解物中单独添加经 C标记的-OA、-LA或-ALA(C18底物)、-ARA(C20底物)和-DHA(C22)建立体外反应。在25℃下孵育反应物
14
且通过TLC测定经 C标记的脂肪酸并入PA中的水平。计算各LPAAT使用DHA相对于AR A和C18脂肪酸的能力。发现白芒花、被孢霉和酵母LPAAT对DH A底物具有活性，其中经放射性标记的PA似乎针对这些而不是其它LPAAT。通过类似的油酸饲料证实所有LPAAT都具有活性。
[0884] 为了测试种子中的LPAAT活性，将若干个蛋白质编码序列或LP AAT插入受conlinin(pLuCnl1)启动子控制的二元载体中。然后使用分别含有嵌合基
因 Cnl1:Arath-LPAAT( 阴 性 对 照 )、Cnl1:Limal-LPAA T、Cnl:Sacce-S1c1p 和Cnl1:Moral-LPAAT的所得基因构建体转化油菜和拟南芥植物，以产生以种子特异性方式表达LPAAT的稳定转化体。使具有Cnl1:LPAAT构建体的经转化植物与表达GA7构建体或其变体且在种子中产生DHA的植物杂交(实施例5)，从而增加DHA在TAG的sn-2位置上的并入。所述构建体还用于转化已经含有GA7构建体和其变体的油菜、亚麻荠和拟南芥植物(实施例2至5)，以产生携带亲本和LPAAT基因构建体的子代。预期DHA在TAG的sn-2位置上的并入相对于在缺乏LPAAT编码转基因的植物中的并入有所增加。还提高了种子中的油含量，特别是对于产生较高DHA水平的种子，从而抵消如实施例2中所描述的拟南芥种子中所见的倾向。
因 Cnl1:Arath-LPAAT( 阴 性 对 照 )、Cnl1:Limal-LPAA T、Cnl:Sacce-S1c1p 和Cnl1:Moral-LPAAT的所得基因构建体转化油菜和拟南芥植物，以产生以种子特异性方式表达LPAAT的稳定转化体。使具有Cnl1:LPAAT构建体的经转化植物与表达GA7构建体或其变体且在种子中产生DHA的植物杂交(实施例5)，从而增加DHA在TAG的sn-2位置上的并入。所述构建体还用于转化已经含有GA7构建体和其变体的油菜、亚麻荠和拟南芥植物(实施例2至5)，以产生携带亲本和LPAAT基因构建体的子代。预期DHA在TAG的sn-2位置上的并入相对于在缺乏LPAAT编码转基因的植物中的并入有所增加。还提高了种子中的油含量，特别是对于产生较高DHA水平的种子，从而抵消如实施例2中所描述的拟南芥种子中所见的倾向。
[0885] 本领域技术人员应了解，可如具体实施方案中所示对本发明进行多种变化和/或修改而不脱离如宽泛描述的本发明的精神或范围。因此，本发明的实施方案被认为在所有方面都是说明性的，而不是限制性的。
[0886] 本申请要求2012年6月15日提交的US 61/660,392、2012年6月22日提交的US 61/663,344、2012年9月6日提交的US 61/697,676和2013年3月14日提交的US61/782,680的优先权，各文献的全部内容以引用的方式并入本文中。
[0887] 本文中所论述和/或参考的所有出版物都全文并入本文中。
[0888] 本申请将2012年6月15日提交的US 61/660,392、2012年6月22日提交的US61/663,344和2012年9月6日提交的US 61/697,676以引用的方式并入本文中。
[0889] 本说明书中所包括的对文献、法案、材料、装置、物品等等的任何论述仅用于提供本发明的背景。不能因为其在本申请的各项权利要求的优先权日之前已经存在就理解为承认任何或所有这些文件形成现有技术基础的一部分或者是本发明相关领域的公共常识。
[0890] 参考文献
[0891] Abbadi et al.(2004)Plant Cell 16:2734-2748.
[0892] Abbott et al.(1998)Science 282:2012-2018.
[0893] Abdullah et al.(1986)Biotech.4:1087.
[0894] Agaba et al.(2004)Marine Biotechnol.(NY)6:251-261.
[0895] Alvarez et al.(2000)Theor Appl Genet 100:319-327.
[0896] Armbrust et al.(2004)Science 306:79-86.
[0897] Attila Kereszt et al.(2007)Nature Protocols 2:948-952.
[0898] Baumberger et al.(2007)Curr.Biol.17:1609-1614.
[0899] Baumlein et al.(1991)Mol.Gen.Genet.225:459-467.
[0900] Baumlein et al.(1992)Plant J.2:233-239.
[0901] Beaudoin et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6421-6426.
[0902] Beclin et al.(2002)Curr.Biol.12:684-688.
[0903] Berberich.et al.(1998)Plant Mol.Biol.36:297-306.
[0904] Bortolamiol et al.(2007)Curr.Biol.17:1615-1621.
[0905] Broun et al.(1998)Plant J.13:201-210.
[0906] Brown et al.(2002)Biochem J.364:795-805.
[0907] Chapman et al.(2004)Gen.Dev.18:1179-1186.
[0908] Chen et al.(2004)The Plant Cell 16:1302-1313.
[0909] Cheng et al.(1996)Plant Cell Rep.15:653-657.
[0910] Cheng et al.(2010)Transgenic Res 19:221-229.
[0911] Chikwamba et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:11127-11132.[0912] Cho et al.(1999a)J.Biol.Chem.274:471-477.
[0913] Cho et al.(1999b)J.Biol.Chem.274:37335-37339.
[0914] Clough and Bent(1998)Plant J.16:735-43.
[0915] Coutu et al.(2007)Transgenic Res.16:771-781.
[0916] Damude et al.(2006).Proc Natl Acad Sci USA 103:9446-9451.
[0917] Denic and Weissman(2007)Cell 130:663-677.
[0918] Domergue et al (2002)Eur.J.Biochem.269:4105-4113.
[0919] Domergue et al.(2002)Eur.J.Biochem.269:4105-4113.
[0920] Domergue et al.(2003)J.Biol.Chem.278:35115-35126.
[0921] Domergue et al.(2005)Biochem.J.1389:483-490.
[0922] Dunoyer et al.(2004)The Plant Cell 16:1235-1250.
[0923] Ellerstrom et al.(1996)Plant Mol.Biol.32:1019-1027.
[0924] Fujimura et al.(1985)Plant Tissue Culture Lett.2:74.
[0925] Fukunaga(2009)EMBO J.28:545-55.
[0926] Gamez et al.(2003)Food Res International 36:721-727.
[0927] Garcia-Maroto et al.(2002)Lipids 37:417-426.
[0928] Girke et al.(1998)Plant J.15:39-48.
[0929] Glick et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.105-157-161.
[0930] Grant et al.(1995)Plant Cell Rep.15:254-258.
[0931] Hall et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9320-9324
[0932] Hamilton and Baulcombe(1999)Science 286:950-952.
[0933] Hamilton et al.(1997)Gene 200:107-16.
[0934] Harayama(1998).Trends Biotechnol.16:76-82.
[0935] Hastings et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14304-14309.
[0936] Hinchee et al.(1988)Biotechnology 6:915-922.
[0937] Hoffmann et al.(2008)J Biol.Chem.283:22352-22362.
[0938] Hong et al.(2002a)Lipids 37:863-868.
[0939] Horiguchi et al.(1998)Plant Cell Physiol.39:540-544.
[0940] Horvath et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:1914-1919.
[0941] Huang et al.(1999)Lipids 34:649-659.
[0942] Inagaki et al.(2002)Biosci.Biotechnol.Biochem.66:613-621.
[0943] Johansen and Carrington(2001)Plant Physiol.126-930-938.
[0944] Kajikawa et al.(2004)Plant Mol.Biol.54:335-52.
[0945] Kajikawa et al.(2006)FEBS Lett 580:149-154.
[0946] Kim et al.(2005)Plant Cell.2005 1073-89.
[0947] Knutzon et al.(1998)J.Biol Chem.273:29360-6.
[0948] Koziel et al.(1996)Plant Mol.Biol.32:393-405.
[0949] Lassner(1995)Plant Physiol.109:1389-94.
[0950] Leonard et al.(2000)Biochem.J.347:719-724.
[0951] Leonard et al.(2000b)Biochem.J.350:765-770.
[0952] Leonard et al.(2002)Lipids 37:733-740.
[0953] Lewsey et al.(2007)Plant J.50:240-252.
[0954] Lo et al.(2003)Genome Res.13:455-466.
[0955] Lu and Kang(2008)Plant Cell Rep.27:273-8.
[0956] Mallory et al.(2002)Nat.Biotech.20:622-625.
[0957] Marangoni et al.(1995)Trends in Food Sci.Technol.6:329-335.
[0958] Meesapyodsuk et al.(2007)J Biol Chem 282:20191-20199.
[0959] Meng et al.(2008)J.Gen.Virol.89:2349-2358.
[0960] Meyer et al.(2003)Biochem.42:9779-9788.
[0961] Meyer et al.(.2004)Lipid Res 45:1899-1909.
[0962] Michaelson et al.(1998a)J.Biol.Chem.273:19055-19059.
[0963] Michaelson et al.(1998b)FEBS Lett.439:215-218.
[0964] Murashige and Skoog(1962)Physiologia Plantarum 15:473-497.
[0965] Napier et al.(1998)Biochem.J.330:611-614.
[0966] Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453.
[0967] Niedz et al.(1995) PlantCell Reports 14:403.
[0968] Ow et al.(1986)Science 234:856-859.
[0969] Parker-Barnes et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:8284-8289.
[0970] Pereira et al.(2004a)Biochem.J.378:665-671.
[0971] Pereira et al.(2004b)Biochem.J.384:357-366.
[0972] Perrin et al.(2000)Mol Breed 6:345-352.
[0973] Petrie et al.(2010a)Metab.Eng.12:233-240.
[0974] Petrie et al.(2010b)Plant Methods 11:6:8.
[0975] Petrie et al.(2012)Transgenic Res.21:139-147.
[0976] Potenza et al.(2004)In Vitro Cell Der Biol-Plant 40:1-22.
[0977] Prasher et al(1985)Biochem.Biophys.Res.Commun.127:31-36.
[0978] Qi et al.(2002)FEBS Lett.510:159-165.
[0979] Qi et al.(2004)Nat.Biotech.22:739-745.
[0980] Qiu et al.(2001)J.Biol.Chem.276:31561-31566.
[0981] Reddy and Thomas(1996)Nat.Biotech.14:639-642.
[0982] Reddy et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:293-300.
[0983] Robert et al.(2005)Func.Plant Biol.32:473-479.
[0984] Robert et al.(2009)Marine Biotech 11:410-418.
[0985] Ruiz-Lopez et al.(2012)Transgenic Res.21:139-147.
[0986] Saha et al.(2006)Plant Physiol.141:1533-1543.
[0987] Saito et al.(2000)Eur.J.Biochem.267:1813-1818.
[0988] Sakuradani et al.(1999)Gene 238:445-453.
[0989] Sato et al.(2004)Crop Sci.44:646-652.
[0990] Sakuradani et al.(2005)Appl.Microbiol.Biotechnol.66:648-654.
[0991] Sayanova et al.(2006)J Biol Chem 281:36533-36541.
[0992] Sayanova et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4211-4216.
[0993] Sayanova et al.(2003)FEBS Lett.542:100-104.
[0994] Sayanova et al.(2006)Planta 224:1269-1277.
[0995] Sayanova et al.(2007)Plant Physiol 144:455-467.
[0996] Singh et al.(2005)Curr. Opin.in Plant Biol.8:197-203.
[0997] Speranza et al.(2012)Process Biochemistry(In Press).
[0998] Sperling et al.(2000)Eur.J.Biochem.267:3801-3811.
[0999] Sperling et al.(2001)Arch.Biochm.Biophys.388:293-8.
[1000] Sprecher et al.(1995)J.Lipid Res.36:2471-2477.
[1001] Spychalla et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:1142-1147.
[1002] Stalker et al.(1998)J.Biol.Chem.263:6310-6314.
[1003] Thillet et al.(1988)J.Biol.Chem 263:12500-12508.
[1004] Tonon et al.(2003)FEBS Lett.553:440-444.
[1005] Toriyama et al.(1986)Theor.Appl.Genet.205:34.
[1006] Trautwein(2001)European J.Lipid Sci.and Tech.103:45-55.
[1007] Tvrdik(2000)J.Cell Biol.149:707-718.
[1008] Venegas-Caleron et al.(2010)Prog.Lipid Res.49:108-119.
[1009] Voinnet et al.(2003)Plant J.33:949-956.
[1010] Wallis and Browse(1999)Arch.Biochem.Biophys.365:307-316.
[1011] Watts and Browse(1999b)Arch.Biochem.Biophys.362:175-182.
[1012] Weiss et al.(2003)Int.J.Med.Microbiol.293:95:106.
[1013] Whitney et al.(2003)Planta 217:983-992.
[1014] Winans(1988)J.Bacteriol.170:4047-54.
[1015] Wood(2009)Plant Biotechnol J.7:914-24.
[1016] Wu et al.(2005)Nat.Biotech.23:1013-1017.
[1017] Yang et al.(2003)Planta 216:597-603.
[1018] Zank et al.(2002)Plant J.31:255-268.
[1019] Zank et al.(2005)WO 2005/012316
[1020] Zhang et al.(2004)FEBS Lett.556:81-85.
[1021] Zhang et al.(2006)20:3255-3268.
[1022] Zhang et al.(2007a)FEBS Letters 581:315-319.
[1023] Zhang et al.(2008) Yeast 25:21-27.
[1024] Zhou et al.(2007)Phytochem.68:785-796.
[1025] Zhou et al.(2008)Insect Mol Biol 17:667-676.
[1026] Zou et al.(1997)Plant Cell.9:909-23.
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