海洋辽阔，微生物资源十分丰富，但由于海洋独特的环境，包括高盐、 高压、低营养、低温等，造就了海洋微生物有别于陆生微生物的许多特异 性如不易培养、形态多样且在保藏和移种过程中很容易死亡等，不利于海 洋微生物研究和开发的深入，因而迫切需要建立一些简单、方便、易于操 作并能在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到并能分离得到有用微 生物菌株，为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。目前，大分子rRNA 己成为一个分子指标，广泛地用于各种微生物的遗传和分子差异的研究， 加上大量已知微生物的DNA都已被测定并输入国际基因数据库，成为微生 物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的 测定和比较分析，达到以其进行快速、有效的鉴定分类的确定新的菌株的 目的。
近年来随着生物技术的发展，寻找具有全新性质的酶已成为国际酶制 剂研究的热点。海洋生物由于生长在海洋这一独特的环境中，特别是生活 在极端环境下的海洋微生物和微藻，能产生丰富的极端酶，造就了海洋微 生物有别于陆地微生物诸多特异性，与陆地微生物所产生的酶相比，海洋 酶具有更为独特的酶学性质，因此引起了国内外研究人员的极大关注。
目前，研究较为透彻的微生物源溶菌酶主要有来自Chalaropsis的ChL (Lyne J E 1990).Streptomyces globisporus产生的M1酶(Lichenstein H S 1990)、S.coelicolor产生的Cellosyl(Astid R 2001)等。在此溶菌体 系中，至少含有3种具有溶菌作用的水解酶。在水解细菌细胞壁时，这些 不同的溶菌酶分别作用于细胞壁肽聚糖的不同化学位点，共同完成“溶壁” 这一生物学过程。整个溶菌体系的协同作用理论上远大于几种纯酶作用的 加和，因为像酰胺酶等，其本身并不表现溶菌活性，但它的作用能够使肽 聚糖结构松散，很大程度上促进了胞壁质酶、内肽酶的分解功能。由于金 黄色葡萄球菌的细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸的6位羟基被乙酰化，根据 对金黄色葡萄球菌的高活性可推测海洋溶菌酶酶系至少含有N，O-二乙酰胞 壁质酶。溶解细胞壁的过程并非单一的酶类作用就可以达到，需要有作用 于不同位点的多种水解酶类共同作用。而单一溶菌酶尚未见报道。溶菌酶 作为一种蛋白质，其用量在化妆品中应用不受限制，能真正做到无毒、无 残留，是一种绿色防腐剂，但作为化妆品防腐剂国内外还没有报道过。

本发明的目的在于提供在中国东海海域的海泥中培养分离得到的一种 高产新型海洋微生物溶菌酶的芽孢杆菌S-12。
本发明的另一目的提供由上述芽孢杆菌S-12高产海洋微生物溶菌酶。
本发明提供的新型芽孢杆菌S-12是从东海海域的海泥中培养分离得到 高产新型海洋微生物溶菌酶的芽孢杆菌S-12，菌株S-12单独构成一个分支， 确定为一新型菌株。该芽孢杆菌S-12于2004年12月1日保藏于中国武 汉典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M204089。
本发明提供的芽孢杆菌S-12形态特征与生理生化特征：
形态特征
对菌株进行革兰氏染色，为革兰氏阳性菌。显微镜形态观察发现形态 特征随着生长时期的不同而变化，在延迟期，菌体呈细长的杆状；在对数 生长期，菌体呈短而粗的杆状；在静止期，菌体呈细长的杆状，偶尔能观 察到卵圆形的芽孢；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、边缘不平滑； 不透明、不产生色素，用1％H2SO4(pH6.8)对菌株进行复染，于HPCM120型透 射电镜下观察菌体形状和大小，为(0.6-1.0)um×(2.0-3.0)um(图1)。
生理生化反应特征
该菌生理生化特征如表1-2。菌株能很好地利用葡萄糖、蔗糖、麦芽 糖做碳源，为严格好氧菌。最适生长pH值为7.0-7.5，最适培养温度为 30℃，培养基中NaCl高于6％时生长受到抑制。
                       表1     特征     S     特征     S     乳糖     果糖     木糖     半乳糖     山梨醇     山梨糖     水杨苷     +     -     +     -     -     -     -     蔗糖     麦芽糖     阿拉伯糖     鼠季糖     糊精     海藻糖     酪氨酸水解     +     +     -     -     +     -     -
注：+：阳性；-：阴性。
                  表2
                                菌种
特征                            S-12
葡萄糖产酸                      +
VP反应                          a
接触酶                          +
柠檬酸盐的利用                  +
丙二酸盐的利用                  -
反硝化                          +
明胶水解                        +
精氨酸双水解                    -
淀粉水解                        +
7％Nacl                         +
生长温度                        5-50℃
“+”：反应呈阳性或者可以生长、利用：“-”：反应呈阴性或者不可以生长、利用： a：V.P反应为弱阳性
菌株S-12 16SrDNA序列经测定，全长为1543bp。经酶切图谱分析， 发现在837-842处有一个Pstl酶切位点(图2)，表明经PStl酶切后可 得到大小分别为840bP和703bP的两个小片断，这与其重组克隆酶切产物 的电泳结果相吻合(图2的第1泳道)。将该16SrDNA序列递交GenBank 进行Blast同源序列检索，结果发现，在亲缘关系相近的前100个序列中， 前36个均为芽抱杆菌属的菌株，S-12与他们都具有98％以上的同源性， 但都低于99％，单独构成一个分支。菌株S-12发酵液中存在能够有效分解 细菌细胞壁的物质，将其命名为海洋微生物溶菌酶(称溶菌酶)。
(3)菌株S-12 16srRNA全序列
TTTTTGATCC TGGCTCAGGA TGAACGCTGG CGGCGTGCCT AATACATGCA AGTCGAGCGA
ATGGATTAAG AGCTTGCTCT TATGAAGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA
CCTGCCCATA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT AATACCGGAT AACATTTTGA
ACCGCATGGT TCGAAATTGA AAGGCGGCTT CGGCTGTCAC TTATGGATGG ACCCGCGTCG
CATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG
GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG
GAATCTTCCC AATGGACGAA AGTCTGACGG AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGCTTTC
GGGTCGTAAA ACTCTGTTGT TAGGGAAGAA CAAGTGCTAG TTGAATAAGC TGGCACCTTG
ACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG
TGGCAAGCGT TATCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGCGCGCG CAGGTGGTTT CTTAAGTCTG
ATGTGAAAGC CCACGGCTCA ACCGTGGAGG GTCATTGGAA ACTGGGAGAC TTGAGTGCAG
AAGAGGAAAG TGGAATTCCA TGTGTACGGG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGGAACACC
AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGAGCGC
AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG
TTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGTCGC
AAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA
TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCC TCTGACAATC CTAGAGATAG
GACAGAACCT TCGGGGGCAG AGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG
AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGT
TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC
ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGACAGAACA AAGGGCAGCG
AAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT CTGTTCTCAG TTCGGATCGC AGTCTGCAAC
TCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT
TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGT
GAGGTAACCT TTTAGGAGCC AGCCGCCGAA GGTGGGACAG ATGATTGGGG TGAAGTCGTA
ACAAGGGTAT ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGC
16SrRNA基因序列在某些位点会以不同的几率发生突变，在种、属等水 平上表现出结构和功能的保守性，有“细菌化石”之称，特别是其进化具 有良好的时钟性质，是生物进化史的计时器。应用16SrRNA作为分子指标， 可以实现快速、微量、准确、简便的对微生物进行分类鉴定。
发酵培养
本发明提供的芽孢杆菌S-12发酵培养优选采用经过芽孢杆菌S-12的 原生质体紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)复合诱变得到的芽孢杆菌S-12-86 突变株，该株比较稳定，酶活由原来的90u/ml达到270u/ml左右，诱变效 果显著。
(1)酶稳定性
在液体培养基(胰蛋白胨1％、牛肉浸出粉0.3％、NaCl 0.5％(wt)中 连续转种传代44代，结果表明，随着传代次数的增加酶活略有下降，但超 过10代以后酶活不再下降，结果见图3。
(2)产酶时间
随着培养时间的延长酶的活性逐渐升高，20-26h达到最高，之后开始 下降，从细菌生长曲线图4分析，酶的积累主要发生在对数生长后期，说 明对数后期菌体的能量不再用于大量繁殖，主要消耗在其代谢产物—溶菌 酶的合成上，因此酶的收获要控制在细菌生长的稳定期。
(3)培养温度
不同的温度对产酶量和活性影响很大，在25-30℃范围内菌体生长量随 温度的升高而增大，但酶的活性在28-32℃之间最高，结果见图5。也就是 说最适产酶温度和最适生长温度并不一致，综合考虑生物量、产酶活性、 比生产量，最优发酵温度选择28-30℃。
(4)种龄
图6可见，8-18h随种龄增大，菌体生长量增大，当种龄超过20h，菌 体生长缓慢。
(5)接种量
图7可见，接种量对菌体生长影响较大，接种量小时(0.5％-4％)，比 生长速率大，发酵培养基的pH为7左右。
(6)培养基pH
发酵培养基的pH值对微生物生长和酶的产生具有非常明显的影响，见 图8-图9。一般认为培养基中的H+和OH-是间接对微生物的代谢产生影响， 它首先作用于胞外的可解离的弱酸(或弱碱)，形成易透过细胞膜的游离 态进入胞内再作用于参与代谢的各种酶类，从而影响菌体的生长和产物的 合成。结果表明在pH 6.0-8.5时细菌的生长和酶的活性较好，而pH在 6.0-7.0之间酶的活性最高，这可能与该酶在较低pH下更稳定或微生物产 生的有害代谢产物比碱性条件下对生长和产酶的抑制作用弱有关，故选用 发酵培养基的pH为7左右。
(7)摇床转速
摇床转速越高溶解在培养基中的氧气越多，这对菌体生长和产酶影响 较大，S-12-86的培养是需氧发酵，因此在100-300r/min范围内转速的提 高带来菌体密度的提高，同时酶产量也越高，见图10。这表明氧气是合成 溶菌酶所必需的，并且溶解氧在该菌的生长和代谢中起着较为关键的作用， 但也不能认为发酵过程中溶解氧越高越好，因为溶解氧过大不仅造成浪费 而且还可能会改变代谢途径，应以达到该菌的临界氧浓度为宜，当摇床转 速在300r/min时，培养基的溶解氧处在其合适的范围内，图10同时表明 酶的合成比细菌生长对溶解氧的依赖性大，只有在细胞生长状态较好的前 提下才能将代谢的能量消耗在溶菌酶的合成上。
(8)装液量
培养过程中，该菌产酶的能力在装液量适当增加的情况会有显著提高。 如图11所示，当培养基装液量由10ml增加到40ml，产酶能力增加，但如 继续提高装液量则产酶能力迅速降低。这主要是因为S-12-86菌株为好氧 菌，当氧气供应太少时会严重影响菌体的生长，而最终影响酶的产生。考 察菌体生长量与装液量的关系可以发现：随着培养基装液量的增加，菌体 的生长量总是减少的。
(9)发酵培养基组成
培养基是实现高效产酶的关键，尤其碳的含量占微生物细胞干物质的 50％左右，是发酵培养基中的主要材料。培养基中各组分的浓度比例要适当， 如果碳氮比偏小，会导致菌体生长过盛，易造成菌体提前衰老自溶；碳氮 比过大，菌体繁殖数量少、发酵密度低，细菌代谢不平衡、不利于产物的 积累；碳氮比例合适，但碳源、氮源浓度过低，则会影响菌体的繁殖；当 碳源、氮源浓度过高，虽然发酵起始导致菌体的大量繁殖，但发酵后期菌 体生长缓慢，代谢废物过多而增加发酵液黏度，使溶解氧降低，引起菌体 代谢异常，最终也影响产物的合成。因此在进行S-12-86大规模工业化培 养时，需要根据菌体生长及代谢产物的特点，选择合理培养基。
氮源
在液体培养基中，氮源为有机氮源(棉籽饼粉、豆饼粉、胰蛋白胨、 酵母膏、牛肉膏、牛肉浸出粉)或无机氮源(尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4)， 浓度均为1％，结果见图12。结果表明菌株S-12-86利用无机氮源优于有机 氮源，最佳氮源为NH4Cl、(NH4)2SO4。
碳源
以NH4Cl为氮源，碳源选用葡萄糖、蔗糖、糊精、淀粉、米糠、玉米粉、 麸皮、花生粕，浓度均为1％，结果见图13。表明当碳源为糊精、花生粕、 蔗糖、淀粉时，酶活较高，但选用蔗糖时，酶活达到最高后下降的过快， 不利于工业上大规模发酵；选用淀粉时，发酵周期过长，同样不符合工业 生产上节约成本的要求。而以糊精、花生粕为碳源时，酶活较高、下降缓 慢、发酵周期短，二者都是较好的碳源，因此选择糊精、花生粕最为该菌 产酶的碳源。
碳氮比
通过单因子实验确定了糊精、花生粕为产酶最佳碳源，(NH4)2SO4、NH4Cl为最佳氮源，碳氮源最佳组合为糊精2％、花生粕2％、NH4Cl 1％、(NH4)2SO4 1％。
本发明提供的芽孢杆菌的发酵培养的优化是一个十分复杂的工作。贫瘠 和加富的培养基对细菌的生长和产酶都有相当的影响，营养不足会导致细菌 提前进入衰亡期，产量减少；营养过于丰富会导致细菌代谢途径发生一定的 变化，造成底物抑制，不仅细菌生物量减少，同时造成产酶量减少，对酶的 合成有明显的抑制作用。进一步证实了摇床转速、培养温度、培养基pH值 和培养时间等培养条件对产酶有显著性影响，对产酶影响显著性的顺序为培 养温度、种龄、培养时间、接种量、起始pH值。考虑到酶的总活性并结合 单因子实验结果，通过三角瓶培养S-12-86菌溶菌酶的优化发酵条件为：以 糊精2％、花生粕2％为碳源，以NH4Cl 1％、(NH4)2SO4 1％。为氮源，起始pH值 7，接种20h种龄的种子6％，25℃、250r/min的条件下在旋转摇床中培养 27h。
海洋独特的环境，造就了海洋微生物有别于陆地微生物的诸多特异性， 本发明提供的溶菌酶生产菌株中海洋芽孢杆菌S-12-86与其它产酶菌株相 比，对培养基成分和培养条件要求简单，更利于大规模工业化生产。对培 养基成分和培养条件优化后酶活有大幅度提高。
海洋微生物溶菌酶的纯化
新型海洋微生物溶菌酶的分离纯化将溶菌酶发酵液经过如下步骤：
粗酶的制备
将发酵液在4℃以下以4000r/min离心40min，获得含溶菌酶的上清液。
超滤浓缩：选取截留分子量为50kDa和10kDa的膜对溶菌酶进行初步 纯化。发酵液经超滤浓缩后，溶菌酶比活为286.9U/mg，纯化倍数为3.0。
阳离子交换层析：以CM Sepharose FF阳离子交换层析柱对超滤浓缩样 品进行层析，上样缓冲液为pH 3.8，10mmol/L柠檬酸-1mmol/L Na2HPO4 缓冲液，用含有NaCl缓冲液洗脱，NaCl浓度梯度为0～1.0mol/L，流速 1.0ml/min，收集活性组分并进行透析浓缩。经CM-Sepharose FF阳离子柱 层析纯化后，溶菌酶比活达到了2078.2U/mg，纯度提高了7.3倍，此步纯 化效果比较明显，去除了大部分杂蛋白。
凝胶层析：将CM-Sepharose FF阳离子交换柱层析纯化所得浓缩样品用 Sephadex G-100凝胶层析柱进行层析，用pH为6.5的5mmol/L  NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱，流速0.1ml/min，收集活性组分并进行透析浓缩。经 Sephadex G-100凝胶层析纯化后溶菌酶比活达到3279.5U/mg，纯度提高了 1.6倍。
海洋溶菌酶酶学性质
①溶菌酶分子量为39KD
②溶菌酶的分子由354个氨基酸组成
③等电点为pI＞9
④酶的最适pH和最适作用温度
以溶壁微球菌为底物测定纯酶在不同pH缓冲液和不同温度下的相对酶 活，结果见图14，该溶菌酶最适：pH 8，最适作用温度35℃，在5℃仍保 持酶活力的25％，具有低温酶的典型特征。
④金属离子对酶活力的影响
将酶液与各种金属离子(浓度1×10-2mol/L)混合后置20℃，保温30 min，同时以不加金属离子的酶液为对照，结果见图15。表明，大部分金属 离子对酶活没有影响，Co2+、Cu2+、Ag+对酶活略有激活作用，Mg2+、Zn2+、 Ca2+有抑制作用。
⑤酶的pH稳定性和热稳定性
将酶液分别置于一系列不同的pH缓冲液中，20℃保温30min，然后于20℃、pH 6.0 测定酶活力(图16-17)，结果表明酶在pH 4.0-10.0之间稳定性好。将酶液在20、25、 35、40、45℃下保温不同时间，测定酶活力(图17)，结果表明酶在小于45℃时有较 好的稳定性。
⑥海洋溶菌酶抑菌谱
以革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌共18株菌株作为检测指示 菌，采用MIC法测定溶菌酶对这些菌株的抑菌作用。结果表明(表3)该溶 菌酶有较宽的抑菌谱，对18株菌种都有不同程度的抑制作用，其中以对革 兰氏阴性菌的抑菌效果最为明显。
                       表3溶菌酶的抑菌谱 菌株     MIC(％) 菌株   MIC(％) 金黄色葡萄球菌JCM-2413 短小芽孢杆菌AS 1.594 白色葡萄球CCGMC 1.0184 枯草芽孢杆菌CCGMC 1.0107 溶壁微球菌ATCC49861 蜡状芽孢杆菌ASI.126 铜绿假单胞菌IFO-3446 黑曲霉 *表葡萄球菌     0.35     0.35     0.175     0.175     0.35     0.088     0.175     0.35     0.175 变形链球菌JCM-5175 藤黄微球菌CCGMC 1.0258 大肠杆菌ATCC 44104 *化脓性链球菌 *肺炎链球菌 *肺炎克雷伯氏菌 *白色念珠球菌 *生孢梭菌 鼠伤寒沙门氏CCGMC 1.1190   0.088   0.35   0.175   0.175   0.044   0.088   0.35   0.35   0.35
*青岛大学医学院提供的临床分离菌
海洋溶菌酶是一种应用前景很好的生物酶制剂。对进行溶菌特异性试 验的大部分菌株，它均有溶解能力，这一点是卵清溶菌酶无法比拟的。海 洋溶菌酶能分解卵清溶菌酶不能分解的金黄色葡萄球菌，可能是一种内 -N，O-二乙酰胞壁质酶。
⑦海洋溶菌酶与其他微生物溶菌酶抑菌谱
          表4不同来源微生物溶菌酶对细胞壁的作用 微生物溶菌酶 被分解的微生物   不能被分解的微生物 嗜水气单胞菌产生的 酶 金黄色葡萄球菌   化脓链球菌、粪链球菌、藤黄八   叠球菌、枯草芽孢杆菌、革兰氏   阴性菌 表皮葡萄球菌ALE 菌株产生的酶 金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌   大肠杆菌、化脓链球菌 SA肽链内切酶 金黄色葡萄球菌、 化脓链球菌、粪链球菌、   溶壁微球菌、藤黄八叠球菌、 灰色链霉菌产生的F2 酶 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌   溶壁微球菌、大肠杆菌 金黄色葡萄球菌M-18 菌株产生的酶 溶壁微球菌、金黄色葡萄 球菌藤黄八叠球菌、表皮 葡萄球菌   大肠杆菌、化脓链球菌 拟内串生孢霉产生的 溶菌酶CH 金黄色葡萄球菌、粪链球 菌、藤黄八叠球菌、溶壁 微球菌   大肠杆菌、化脓链球菌 溶葡萄菌素 溶壁微球菌   金黄色葡萄球菌 海洋溶菌酶 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓链球菌、粪链球菌 大肠杆菌、藤黄八叠球菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌
已有的微生物溶菌酶都是以HEWL不能分解的底物(如：金黄色葡萄球 菌)为底物筛选出来的，一般不能分解革兰氏阴性菌，芽孢杆菌S-12-86 产生的海洋溶菌酶为一种新型溶菌酶，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都 有强烈的抑菌作用。古伊森等人认为细菌细胞壁外膜上的脂多糖对HEWL有 很强的亲和性，从而阻止酶的渗透，使HEWL不能分解革兰氏阴性菌。海洋 溶菌酶可能与革兰氏阴性菌外层成分的脂多糖无亲和性，所以能很好的分 解革兰氏阴性菌。
⑧海洋溶菌酶与其他微生物来源溶菌酶性质的比较
                  表5几种微生物溶菌酶的性质比较 酶来源   分子量KD     等电点   最适pH     稳定pH     稳定温度 白色链霉素菌G(酶32)     --     10.3   4.4-4.8(SA，CW)*     --     -- 球孢链霉素1892(Mu I)     20     10   5.5(SM，CW)     --     60℃×10min 灰色链霉素(S-35F)     --     10   7-8(SA，CW)     5-10     45℃×30min Chalaropsis溶菌酶Ch     22.4     7.53   5.6(SA，CW)     --     -- 溶葡萄球菌素     30     ＞9   7-7.5(MI，CW)     --     -- 枯草杆菌(K-77)     93     9.8   6.5(MI，CW)     酸性     60℃×10min 鸡卵溶菌酶     14.2     11.2   5-9(MI，CW)     酸性     96℃×15min 海洋溶菌酶     16.0     9.28   6.5(SA，PA)     4-10     60℃×50min
*SA：金黄色葡萄球菌；CW：细胞壁；MI：溶壁小球菌；PA：绿脓杆菌；
⑨海洋溶菌酶与护肤化妆品重要原料的配伍性评价
将护扶化妆品常用原料按所示浓度加到含海洋溶菌酶的缓冲液中，测 定酶活力，结果见表6。表明橄榄油、貂油、凡士林对溶菌酶酶活略有抑制 作用，山梨醇对酶活有明显激活作用，其它原料对酶活基本没有影响，由 此可认为实际防腐过程中各种护肤化妆品常用原料与酶有良好的配伍性。 同时本文考察了海洋溶菌酶在护肤化妆品原料中的稳定性，研究表明该酶 在原料溶液中作用1-30天，其酶活没有明显下降，说明该酶在化妆品防腐 过程中不会失活。
表6护肤化妆品中主要原料对酶活性影响 添加剂  质量％               酶残余活力     1天     2天     15天     30天 橄榄油 玉米油 葵花籽油 貂油 卵磷脂 羊毛脂 蜂蜡 鲸蜡 凡士林 硅油 硬脂酸 大豆甾醇 肉豆蔻酸异丙脂 硬脂酸单甘油脂 鲸醇 甘油 丙二醇 聚乙烯醇 三乙醇胺(80％) 石蜡 山梨醇(70％)  5.0  5.0  5.0  5.0  4.0  3.0  11.0  5.0  8.0  5.0  1.5  3.0  5.0  6.0  5.0  5.0  5.0  5.0  0.5  8.0  5.0     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     100     108     100     100     100     99     100     100     100     100     98     100     100     100     100     100     99     100     100     100     99     100     105     98     100     100     98     100     100     99     100     98     100     99     100     100     100     99     99     100     100     99     100     105     97     100     100     98     100     99     99     99     97     100     99     100     99     99     98     99     98     100     99     100     105
⑩海洋溶菌酶与表面活性剂的配伍性
护肤用化妆品直接涂敷在皮肤表面，具有清洁皮肤、保持皮肤湿润、 促进皮肤新陈代谢和维护皮肤健康等功能。因此，它的各种组份配制应尽 量和皮脂相近，使其既能起到抵御外界的物理、化学刺激，又不防碍皮肤 的正常生理功能。尤其重要的是它必须能防止因干性和脂性所引起的各种 皮肤疾病，而且还能调节皮肤生理机能和美化肌肤。护肤化妆品中的表面 活性剂与制品的功能无直接关系，作为乳化剂使用的表面活性剂以安全性 较高的E0型非离子表面活性剂为主。将非离子表面活性剂月桂醇聚氧乙烯 醚、硬脂醇聚氧乙烯醚、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯羊毛脂脂肪酸酯、 聚氧乙烯脂肪酰胺(图中对应A、B、C、D、E)分别与海洋溶菌酶作用60min， 按1.2.1方法所示测定酶剩余活力。结果表明(图18)，非离子表面活性剂 仅在高浓度时对酶活有抑制作用。
附图说明
图1对数生长期菌体形态(10000×)
图2 16SrDNA的PCR扩增及Pst I酶切鉴定
图3不同传代次数对酶活的影响
图4培养时间对细胞生长、产酶的影响
图5培养温度对细胞生长、产酶的影响
图6接种龄对酶活的影响
图7接种量对产酶的影响
图8起始pH值对最终pH值的影响
图9培养基起始pH对细胞生长、产酶的影响
图10摇床转速对酶活的影响
图11装液量对S-12-86菌株产酶能力及细胞生长量的影响
图12氮源对溶菌酶活性的影响
图13碳源对溶菌酶活性的影响
图14温度和pH对酶活的影响
图15金属离子对酶活性的影响
图16酶的pH稳定性(20℃)
图17酶的热稳定性(pH 6.0)
图18非离子表面活性剂对酶活的影响
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不 限于下列实施例：
实施例1
初筛：将适当稀释的东海海域海泥悬液涂布在含金黄色葡萄球菌的平 板，30℃恒温培养2天，将透明圈较大的菌株接种液体发酵培养基进行复 筛，挑选发酵液溶菌活力较强的菌株牛奶管保存，记为S-12，其中液体发酵 培养基％(wt)：牛肉浸出粉0.3，蛋白胨0.5，NaCl0.5，自来水配制。
将菌S-12首先原生质体化并调整细胞浓度，先用亚硝酸基胍20h，然 后用此外线照射1分钟，涂再生平板培养筛选，最终得菌株S-12-86突变 株。
粗酶液制备：
取斜面保存的S-12-86突变株菌株一环接种于种子培养基，30℃， 150r/min培养24h.发酵液4000r/min离心20min，所得上清液即为溶菌酶 粗酶液。种子培养基为(％wt)牛肉浸出粉1，蛋白胨1，NaCl 0.5，琼脂2， pH 7.5。
超滤浓缩
将含溶菌酶的上清液用SCM杯式超滤系统进行分级，膜截留分子量为 50kDa，压力0.1MPa，再以截留分子量为10kDa的膜进行浓缩，浓缩倍数为 5倍，溶菌酶比活为86.9u/mg。
阳离子交换柱层析
以CM-Sepharose FF阳离子交换层析柱(2.5cm×10cm)对溶菌酶进行层 析，分部收集洗脱液，并测定溶菌酶比活。上样缓冲液pH 3.8，10mmol/L柠 檬酸-1mmol/L Na2HPO4缓冲液，用含有NaCl缓冲液洗脱，NaCl浓度梯度 为0～1.0mol/L，流速1.0ml/min，经CM-Sepharose FF阳离子柱层析纯化后， 溶菌酶比活达到了2078.2U/mg，纯度提高了7.3倍，去除了大部分杂蛋白。
凝胶层析
以Sephadex G-100凝胶层析柱(1.6cm×60cm)对溶菌酶进行层析，分部 收集洗脱液，并测定溶菌酶比活3279.5U/mg，纯度提高了1.6倍。其中用 pH为6.5的5mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱，流速0.1ml/min。
溶菌酶分子量测定
采用SDS-PAGE方法测定，为39KD。
溶菌酶活性的测定
用60mmol/L、pH6.2的磷酸缓冲液配制一定浊度(A450＝0.6-0.7)的溶壁微 球菌为底物，取0.5ml酶液加入2.5ml底物(20℃)中，迅速混合，在波长450nm 处读取反应体系5min内每隔15s的吸光度。以ΔA450/min变化0.001个吸光 度值为一个活性单位。
实施例2
实施例2的方法步骤相同于实施例1，所不同是通过三角瓶发酵培养条 件为以糊精2％、花生粕2％为碳源，以NH4CL 1％、(NH4)2SO4 1％。为氮源，起始 pH值7，接种20h种龄的种子6％，25℃、250r/min的条件下在旋转摇床中培 养27h。