油脱胶方法
阅读：476发布：2022-04-08
专利汇可以提供油脱胶方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在可选实施方案中，本 发明 提供磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶、编码它的核酸、与其特异性结合的 抗体 以及制备和使用它们的方法。还提供包括使用这些磷脂酶的工业方法和产品。在某些实施方案中，本文提供的是使脂质基质内的非 水 化磷脂(NHP)水合的方法。该方法能够使NHP迁移到油-水界面，从而允许NHP反应和/或从脂质除去。在某些实施方案中，提供的是从 植物 油 中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂以制造可用于食物生产和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品的方法。在某些实施方案中，本文提供的是使NHP水合、然后酶处理并除去各种磷脂和卵磷脂的方法。本文提供的方法可以针对粗制或水脱胶油实施。，下面是油脱胶方法专利的具体信息内容。
1.一种水合食用油中的非水化磷脂的方法，包括：
i-a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；和
i-b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中步骤i-a)和/或
i-b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述乳液包含至少约60、70、80、90、93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约20μm～约45μm的水相。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述液滴尺寸为约15、18、20、22、25、27、29、32、35或
40μm。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述乳液包含至少约90体积％的液滴尺寸为约
15-40μm的水相。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述食用油是粗制油或水脱胶油。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述食用油包括Neochloris oleoabundans油、
二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)油、眼虫藻(Euglena gracilis)油、三角褐指
藻(Phaeodactylum tricornutum)油、颗石藻(Pleurochrysis carterae)油、小定鞭
金藻(Prymnesium parvum)油、扁藻(Tetraselmis chui)油、四爿 藻(Tetraselmis
suecica)油、绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)油、微拟球藻(Nannochloropsis
salina)油、丛粒藻(Botryococcus braunii)油、杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)油、微球藻(Nannochloris)油、螺旋藻(Spirulina)油、绿藻(Chlorophycease)油、硅藻
(Bacilliarophy)油、巴西莓油、杏仁油、巴巴苏仁油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、芥花油、腰果油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻仁油、葡萄籽油、榛子油、其他坚果油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻籽油、夏威夷核果油、芒果仁油、绣线菊油、芥末油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、山核桃油、松仁油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、乳木果油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、tsubaki油、核桃油、经由遗传修饰的微生物(GMO)或传统的“育种”而具有改变的脂肪酸组成的“天然”油种类如高油酸、低亚麻酸或低饱和油(高油酸芥花油、低亚麻酸大豆油或高硬脂酸葵花籽油)或其共混物。
7.如权利要求1所述的方法，其中使用高剪切混合器进行步骤i-a)和/或i-b)中
的混合，所述高剪切混合器的尖端速度至少为约1400cm/s、1600cm/s、1800cm/s、2000cm/s、
2100cm/s、2300cm/s、2500cm/s、3000cm/s或3500cm/s。
8.如权利要求1所述的方法，其中使用尖端速度为约2300cm/s的高剪切混合器进行步
骤i-a)和/或i-b)中的混合。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述酸选自磷酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和其混合物。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述酸是柠檬酸。
11.如权利要求1所述的方法，其中步骤i-a)中的酸性混合物的pH为约1～约4。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述酸的混合持续约1分钟至约5小时。
13.如权利要求1所述的方法，其中步骤i-b)中的反应混合物的pH为约6～约9。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、硅酸钠、碳酸钠、碳酸钙和其组合。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述碱的混合持续约1分钟至约5小时。
16.如权利要求1所述的方法，还包括水或酶脱胶而得到脱胶油的步骤。
17.如权利要求1所述的方法，还包括酶脱胶的步骤。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述酶选自磷脂酶A、磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C或其组合。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述酶选自磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C
或其组合。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述酶选自磷脂酶C、包含SEQ IDNO：8的酶或其
组合。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述酶包含SEQ ID NO：8。
22.如权利要求16所述的方法，其中所述酶是具有SEQ ID NO：8的多肽。
23.如权利要求16所述的方法，其中所述脱胶油含有小于约30ppm的磷、小于约20ppm
的磷、小于约15ppm的磷、小于约10ppm的磷、小于约7ppm的磷、小于约5ppm的磷或小于约
3ppm的磷。
24.一种水合食用油中的非水化磷脂的方法，包括：
i-a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；和
i-b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中步骤i-a)和/或
i-b)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15-35μm的水相的乳液。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述平均液滴尺寸为约15、18、20、22、25、27、29或
35μm。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述平均液滴尺寸为约15、18、20、22或25μm。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述平均液滴尺寸为约20μm。
28.一种获得磷脂的方法，包括：
i-a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；
i-b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中步骤i-a)和/或
i-b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液；
i-c)混合磷脂酶；和
i-d)分离磷脂。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述磷脂酶是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述酶是具有SEQ ID NO：8的多肽。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述磷脂包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺
(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酸(LPA)、胆碱(C)、乙醇胺(E)、丝氨酸(S)，肌醇(I)或其组合。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述磷脂是磷脂酰肌醇。
33.一种获得磷脂的方法，包括：
i-a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；
i-b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中步骤i-a)和/或
i-b)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15-35μm的水相的乳液；
i-c)混合磷脂酶；和
i-d)分离磷脂。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述磷脂酶是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述酶是具有SEQ ID NO：8的多肽。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述磷脂包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺
(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酸(LPA)、胆碱(C)、乙醇胺(E)、丝氨酸(S)、肌醇(I)或其组合。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述磷脂是磷脂酰肌醇。
38.一种获得肌醇的方法，包括：
i-a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；
i-b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中步骤i-a)和/或
i-b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液；
i-c)混合磷脂酶；和
i-d)分离肌醇。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述磷脂酶是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述酶是具有SEQ ID NO：8的多肽。
41.如权利要求18、28、33或38中任一项所述的方法，其中所述磷脂酶由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下
的核酸序列组成：
(a)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，且
(i)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，且所有其他选项均设置为缺省；
(ii)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(iii)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(iv)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(v)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(b)(a)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(c)(a)或(b)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多肽；
(d)(c)的核酸，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(e)(a)～(d)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(f)(e)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序列、
或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(g)(d)、(e)或(f)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，所
述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内膜
系统的N-端和/或C-端延伸或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(h)(d)、(e)或(f)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动子、或
细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(i)(a)～(h)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(j)(a)～(h)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(k)与(a)～(j)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列。
42.如权利要求18、28、33或38中任一项所述的方法，其中所述磷脂酶
(a)包含氨基酸序列，所述氨基酸序列：
(i)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(ii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(b)(a)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(c)(a)或(b)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(d)(c)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(e)(d)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶
向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(f)(a)～(e)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(g)(a)～(f)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(h)(a)～(f)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(i)(a)～(h)中任一个的多肽，其中：(i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一
个糖基化位点，(ii)(i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；
(iii)(i)或(ii)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv)(iii)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(j)(a)～(i)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种磷脂
酶的组合物，或包含在所述组合物中；或
(k)(j)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ ID NO：2和/或SEQ ID
NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
43.一种水解、破裂或分裂含有磷脂的组合物的方法，包括：
(A)(a)提供磷脂酶多肽；
(b)提供含有磷脂的组合物；和
(c)在所述磷脂酶水解、破裂或分裂所述含有磷脂的组合物的条件下使步骤(a)的多
肽与步骤(b)的组合物接触；
(B)(A)的方法，其中所述组合物包括含有磷脂的脂质双层或膜；或
(C)(A)或(B)中任一个的方法，其中所述组合物包含植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，且
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸、或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中所述PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在所述组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
44.一种液化或除去含有磷脂的组合物的方法，包括：
(a)提供磷脂酶多肽；
(b)提供含有磷脂的组合物；和
(c)在所述磷脂酶除去或液化所述含有磷脂的组合物的条件下使步骤(a)的多肽与步
骤(b)的组合物接触，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，和
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中所述PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在所述组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ ID NO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
45.一种将非水化磷脂转化成水化形式的方法，包括：
(Aa)(Aaa)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
(Aab)提供含有非水化磷脂的组合物；和
(Aac)在所述多肽将所述非水化磷脂转化成水化形式的条件下使步骤(Aaa)的多肽与
步骤(Aab)的组合物接触，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，且
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤
设置被设定为blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺
省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中所述PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1,4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iV-1)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在所述组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
46.一种纯化植物甾醇或三萜烯的方法，包括：
AI)(AIa)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
(AIb)提供含有植物甾醇或三萜烯的组合物；和
(AIc)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(AIa)的多肽与
步骤(AIb)的组合物接触；
(BI)(AI)的方法，其中所述植物甾醇或三萜烯包括植物甾醇；
(CI)(BI)的方法，其中所述植物甾醇衍生于植物油；
(DI)(EI)的方法，其中所述植物油包括椰子油、芥花油、可可油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、衍生于米糠的油、红花油、芝麻油、大豆油或葵花籽油；
(EI)(AI)～(DI)中任一个的方法，还包括使用非极性溶剂定量提取游离植物甾醇和
植物甾醇基脂肪酸酯；或
(FI)(EI)的方法，其中所述植物甾醇或三萜烯包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾烷醇、谷甾烷醇、链甾醇、海绵甾醇、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇或菜籽甾醇，其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，且
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸，其还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸、或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中所述PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在所述组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ ID NO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
47.一种精制油或脂肪的方法，包括：
(A1)(A1a)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
(A1b)提供包含含有磷脂的油或脂肪的组合物；和
(A1c)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(A1a)的多肽与
步骤(A1b)的组合物接触；
(B1)(A1)的方法，其中所述多肽处于被加到所述组合物中的水溶液中；
(C1)(B1)的方法，其中水量为约0.5～5％；
(D1)(A1)～(C1)中任一个的方法，其中处理时间小于约2小时；
(E1)(A1)～(C1)中任一个的方法，其中处理时间小于约60分钟；
(F1)(A1)～(C1)中任一个的方法，其中处理时间小于约30分钟、小于约15分钟或小
于约5分钟；
(G1)(A1)～(F1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括约25℃～70℃的温度；
(H1)(A1)～(G1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括使用碱；
(I1)(A1)～(H1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括约pH 3～pH 10的pH；
(J1)(A1)～(I1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括加入乳化剂和/或在步骤
(A1)(A1c)的接触之后的混合；
(K1)(A1)～(J1)中任一个的方法，包括加入破乳剂和/或加热或冷却，以促进水相分
离；
(L1)(A1)～(K1)中任一个的方法，包括在接触步骤之前脱胶以通过离心收集卵磷脂，
然后加入PLC、PLC和/或PLA以除去非水化磷脂；
(M1)(A1)～(L1)中任一个的方法，包括对于食用油的粗制油水脱胶至小于10ppm的
磷，然后对于生物柴油物理精制到小于约50ppm的磷；或
(N1)(A1)～(M1)中任一个的方法，包括加入酸以促进非水化磷脂的水合，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，且
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列、或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中所述PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在所述组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
48.一种使油或脂肪脱胶的方法，包括：
(a1)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
(b1)提供含有包含磷脂的脂肪或油的组合物；和
(c1)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(a1)的多肽与步
骤(b1)的组合物接触，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，和
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：1-磷脂
酰-1D-myo-肌醇4，5-二磷酸(也称作PIP2，磷脂酰肌醇二磷酸)+ 肌
醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在该组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
49.一种处理油或脂肪的方法，包括：
(a1)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
(b1)提供含有油或脂肪的组合物；和
(c1)在所述多肽能够催化所述油或脂肪中的磷脂水解的条件下使步骤(a1)的多肽与
步骤(b1)的组合物接触，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，和
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10，或由其组成的核酸；或(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物或包含在该组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ ID NO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
50.一种物理精制含有磷脂的组合物的方法，包括：
(A-1)(A-1a)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
(A-1b)提供含有磷脂的组合物；和
(A-1c)在物理精制之前、期间或之后使步骤(A-1a)的多肽与步骤(A-1b)的组合物接
触；
(B-1)(A-1)的方法，其中所述多肽在物理精制之前加入，所述含有磷脂的组合物包含
植物，并且所述多肽在所述植物中被转基因表达，所述多肽在种子或其他植物部分的破碎过程中加入，或者，所述多肽在破碎之后或在精制之前加入；
(C-1)(A-1)的方法，其中所述多肽在物理精制期间加入；
(D-1)(A-1)的方法，其中所述多肽在物理精制之后加入：在分离之前在剧烈混合器或
保持混合器中；在加热步骤之后；在离心机中；在皂料中；在洗涤水中；或在漂白或除臭步骤期间；或
(E-1)(A-1)～(D-1)中任一个的方法，还包括加入磷脂酶A(PLA)、磷脂酶B(PLB)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、或磷酸酶，或其任意组合，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，和
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在该组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
51.一种对含有磷脂的组合物进行碱精制的方法，包括：
(A1)(A1a)提供含有具有磷脂酶活性的多肽的组合物；
(A1b)提供含有磷脂的组合物；和
(A1c)在碱精制之前、期间或之后使步骤(A1a)的多肽与步骤(A1b)的组合物接触；
(B1)(A1)的方法，其中所述多肽在加入酸或碱之前加入；
(C1)(A1)～(B1)中任一个的方法，其中所述多肽在碱精制期间加入，并且取决于磷水
平和游离脂肪酸水平加入不同水平的酸和碱；或
(D1)(A1)～(B1)中任一个的方法，其中所述多肽在碱精制之后加入：在分离之前在剧
烈混合器或保持混合器中；在加热步骤之后；在离心机中；在皂料中；在洗涤水中；或在漂白或除臭步骤期间；
(E1)(A1)～(D1)中任一个的方法，其中碱精制条件通过加入浓碱溶液产生，或其中碱
精制条件包括使用比11％的工业标准更浓的浓碱溶液，或其中碱精制条件包括使用浓缩了约12％～50％的浓碱溶液；
(F1)(A1)～(E1)中任一个的方法，其中所述含有磷脂的组合物包括植物；
(G1)(A1)～(F1)中任一个的方法，其中所述多肽在所述植物中被转基因地表达；
(H1)(A1)～(G1)中任一个的方法，其中所述多肽种子或其他植物部分的破碎期间加
入，或者，所述多肽在破碎之后或在精制之前加入；或
(I1)(A1)～(H1)中任一个的方法，包括如图10所示的方法；或如图10所示的方法，
其中加入足量酸以促进钙和镁金属含量的降低，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，和
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在该组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
52.一种从脂质A使2’或3’脂肪酸链脱去酰基的方法，包括：
使脂质A与磷脂酶多肽接触，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，和
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在该组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
53.一种通过减少的油截留来减少胶质并提高中性油(甘油三酯)量的方法，包括：
(A1)(A1a)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
(A1b)提供含有具有磷脂的脂肪或油的组合物；和
(A1c)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(A1a)的多肽与
步骤(A1b)的组合物接触足以减少胶质并提高中性油的时间；
(B1)(A1)的蛋白制剂，其中所述蛋白制剂包括含有非水液体组合物的制剂、流延固体、粉末、冻干粉末、颗粒形式、微粒形式、压片、小球、丸剂、凝胶形式、水凝胶、糊剂、气雾剂、喷雾剂、洗液、浆剂、水/油乳剂、乳膏、胶囊、囊泡或胶束的悬液；或，
(C1)(A1)或(B1)的方法，包括对所述组合物使用高剪切混合，然后与本发明的具有
磷脂酶活性的至少一种多肽无剪切混合或低剪切混合，从而允许磷脂底物与磷脂酶充分接触，
其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)编码，所述核酸(多
核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，和
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：
10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在该组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
54.一种通过权利要求47、48、49或53中任一项所述的方法生产的油或脂肪。
55.一种制造生物柴油的方法，包括：
(A)(a)提供磷脂酶多肽，其中所述磷脂酶多肽由分离的、合成的或重组的核酸(多核
苷酸)编码，所述核酸(多核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成：
(I)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，且
(ia)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性，
以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
(ib)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
(ic)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、
表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC
中洗涤约15分钟；
(id)包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成的核酸；或
(ie)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(II)(I)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸
序列的多肽；
(III)(I)或(II)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多
肽；
(IV)(III)的核酸序列，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
(V)(I)～(IV)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异
源核苷酸序列；
(VI)(V)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序
列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
(VII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，
所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内
膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成，或所述异源序列编码限制位点；
(VIII)(IV)、(V)或(VI)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动
子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；
(IX)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(X)(I)～(VIII)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(XI)与(I)～(X)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列，
或所述磷脂酶多肽包含氨基酸序列：
(Ia)(Iai)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性；
(Iaii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性；
(Ib)(Ia)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
(Ic)(Ia)或(Ib)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
(Id)(Ic)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标
签、可检测标记或表位，或由其组成；
(Ie)(Id)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者
靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成；
(If)(Ia)～(Ie)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括：
1-磷 脂 酰-1D-myo- 肌 醇4，5-二 磷 酸 (也 称 作PIP2，磷 脂 酰 肌 醇 二 磷
酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
(Ig)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的；
(Ih)(Ia)～(If)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的；
(Ii)(Ia)～(Ih)中任一个的多肽，其中：(i-i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii-i)(i-i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化；(iii-i)(i-i)或(ii-i)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv-i)(iii-i)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
(Ij)(Ia)～(Ii)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种
磷脂酶的组合物，或包含在该组合物中；或
(Ik)(Ij)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ IDNO：2和/或SEQ
ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
(b)提供含有脂质或烷基酯的组合物；
(c)使(a)的磷脂酶多肽与(b)的组合物接触；
(B)(A)的方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是油和/或脂肪，或包含油和/或
脂肪；或
(C)(A)或(B)的方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含藻类、植物油、直链植物油、原始植物油、废植物油、动物脂肪、油脂、牛油、猪油或黄油脂。
56.一种通过如权利要求55所述的方法制备的生物柴油。
油脱胶方法
[0001] 相关申请
[0004] 本申请经由MPEP§1730 II.B.2.(a)(A)授权并列出的USPTO EFS-WEB服务器电子提交，该电子申请包括电子提交的序列(SEQ ID)表；该序列表在此全文引入作为参考。
该序列表以下面的电子提交的.txt文件识别：
该序列表以下面的电子提交的.txt文件识别：
[0005]发明领域
[0006] 本发明总体上涉及磷脂酶、编码它的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。在可选实施方案中，本发明提供磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶、编码它的核酸、与其特异性结合的抗体以及制备和使用它们的方法。提供了使用这些磷脂酶的工
业方法和产品。本文还提供的是使脂质基质内的非水化磷脂(NHP)水合的方法。这些方法
能够使NHP迁移到油-水界面，从而允许NHP反应和/或从脂质除去。在某些实施方案中，
提供的是从植物油中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂(统称为“胶”)以制造可用于食物生产
和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品的方法。在某些实施方案中，本文提供的是使NHP
水合、然后酶处理并除去各种磷脂和卵磷脂的方法。本文提供的方法可以针对粗制或水脱
胶油实施。在某些实施方案中，本文提供的是从食用油获得磷脂的方法。
业方法和产品。本文还提供的是使脂质基质内的非水化磷脂(NHP)水合的方法。这些方法
能够使NHP迁移到油-水界面，从而允许NHP反应和/或从脂质除去。在某些实施方案中，
提供的是从植物油中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂(统称为“胶”)以制造可用于食物生产
和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品的方法。在某些实施方案中，本文提供的是使NHP
水合、然后酶处理并除去各种磷脂和卵磷脂的方法。本文提供的方法可以针对粗制或水脱
胶油实施。在某些实施方案中，本文提供的是从食用油获得磷脂的方法。
[0007] 背景
[0008] 通过压制或溶剂提取方法获得的粗制植物油是一种甘油三酯、磷脂、甾醇、生育酚、游离脂肪酸、痕量金属和其他微量化合物的复杂混合物。希望除去磷脂、游离脂肪酸和痕量金属，从而生产出口味淡、色泽浅和保质期长的色拉油或者适于转换成原料的油，这种原料容易化学或酶转化成生物燃料(甲基-或乙基-酯类)、生物塑料(环氧化油)和其他
传统石油系材料。
传统石油系材料。
[0009] 除去磷脂导致几乎所有与植物油精制相关的损失。大部分磷脂分子同时具有亲水性官能团和亲脂性脂肪酸链，它们倾向于是优异的天然乳化剂。磷脂中的官能团可以是各
种已知类型中的任意一种，下面的方案1示出了其中的几个。
种已知类型中的任意一种，下面的方案1示出了其中的几个。
[0010] 方案1：磷脂中的官能团
[0011]
[0012] -丝氨酸
[0013] 官能团
[0014] 含有官能团-胆碱、-肌醇和-乙醇胺的磷脂对水具有最大的亲和性，而酸、酸式盐(钙(Ca)、镁(Mg)和铁(Fe))和-乙醇胺盐(Ca，Mg，和Fe)对水具有较低的亲和
性。磷脂酸和磷脂酸的盐通常被称为“非水化磷脂”或NHP。表1包含由Sen Gupta，
A.K.，Fette Seifen Anstrichmittel 88，第79-86页(1986)报道的以及后来由Segers，
J.C.等人，“Degumming-Theory and Practice”，American Oil Chemists’s Society出版，“Edible fats and Oils Processing：basic principals and modern practices：World conference proceedings”/David Erickson编，(1990)，第88-93页报道的不同磷脂的相
对水合速率。
性。磷脂酸和磷脂酸的盐通常被称为“非水化磷脂”或NHP。表1包含由Sen Gupta，
A.K.，Fette Seifen Anstrichmittel 88，第79-86页(1986)报道的以及后来由Segers，
J.C.等人，“Degumming-Theory and Practice”，American Oil Chemists’s Society出版，“Edible fats and Oils Processing：basic principals and modern practices：World conference proceedings”/David Erickson编，(1990)，第88-93页报道的不同磷脂的相
对水合速率。
[0015] 表1：相对水合速率
[0016]磷脂 相对水合速率
磷脂酰胆碱(PC) 100
磷脂酰肌醇(PI) 44
磷脂酰肌醇的钙盐 24
磷脂酰乙醇胺(PE) 16
磷脂酸(PA) 8.5
磷脂酰乙醇胺的钙盐 0.9
磷脂酸的钙盐 0.6
磷脂酰胆碱(PC) 100
磷脂酰肌醇(PI) 44
磷脂酰肌醇的钙盐 24
磷脂酰乙醇胺(PE) 16
磷脂酸(PA) 8.5
磷脂酰乙醇胺的钙盐 0.9
磷脂酸的钙盐 0.6
[0017] 通过油籽中存在的酶(即，磷脂酶D(PLD))来形成磷脂的钙、镁和铁盐。酶在成熟种子中保持休眠，直到种子的保护包衣在保存期间损坏或者在除去油之前的种子“准备”。
种子内的PLD的反应将从磷酸酯基团裂解-胆碱、-肌醇、-丝氨酸或-乙醇胺，从而产生
磷脂酸(PA)。此外，由于在富足的二价金属(Ca、Mg和Fe)存在下发生裂解，所以形成NHP。
磷脂酸钙离子复合物如下所示：
种子内的PLD的反应将从磷酸酯基团裂解-胆碱、-肌醇、-丝氨酸或-乙醇胺，从而产生
磷脂酸(PA)。此外，由于在富足的二价金属(Ca、Mg和Fe)存在下发生裂解，所以形成NHP。
磷脂酸钙离子复合物如下所示：
[0018]
[0019] 磷脂酸的钙盐
[0020] 磷脂通常以百万分之几(ppm)的“磷含量”在油中测量到。表2列出在主要的油籽作物中存在的典型磷脂量，以及各种官能团在油中存在的磷脂中的百分比分布。
[0021] 表2：常见油籽的典型水平和磷脂分布
[0022]
[0023] 下表3提供大豆胶的典型磷脂量和分布。在表3中，“原样”是指典型的磷脂组合物，其与截留的油(2分子磷脂和1分子油)一起从植物油中除去，产生的丙酮溶物含量为
67％。“标准化”是指不存在任何油的磷脂组合物，产生的丙酮溶物含量为100％。
67％。“标准化”是指不存在任何油的磷脂组合物，产生的丙酮溶物含量为100％。
[0024] 表3：大豆胶的典型磷脂量和分布
[0025]“原样”百分比 “标准化”百分比
磷脂酰胆碱(PC) 33.9 47.2
磷脂酰乙醇胺(PE) 14.3 19.9
磷脂酰丝氨酸(PS) 0.4 0.6
磷脂酸(PA) 6.4 8.9
磷脂酰肌醇(PI) 16.8 23.4
总计 71.8 100.0
磷脂酰胆碱(PC) 33.9 47.2
磷脂酰乙醇胺(PE) 14.3 19.9
磷脂酰丝氨酸(PS) 0.4 0.6
磷脂酸(PA) 6.4 8.9
磷脂酰肌醇(PI) 16.8 23.4
总计 71.8 100.0
[0026]
[0027] 在现代工业精制操作中，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸转化成它们的溶血或磷酸化形式极大地改变了脱胶的经济性。对于含有1000ppm磷的经水脱胶的粗制油，所有磷脂转化成它们的溶血形式避免了中性油损失，代表油产率
增加1.4％，而所有磷脂转化成它们的磷酸化形式代表油产率增加3.0％。
增加1.4％，而所有磷脂转化成它们的磷酸化形式代表油产率增加3.0％。
[0028] 磷脂可以通过多种不同的已知手段从植物油中部分或完全除去。工业中最常用的方法是水脱胶、酸脱胶、碱精制和酶脱胶。例示性方法记载在美国专利No.4,049,686；
4,698,185；5,239,096；5,264,367；5,286,886；5,532,163；6,001,640；6,103,505；
U.S.6,127,137；6,143,545；6,172,248；6,548,633；7,494,676；和7,226,771，和美国公开No.2007/0134777、2005/0059130、2008/0182322和2009/0069587中。
4,698,185；5,239,096；5,264,367；5,286,886；5,532,163；6,001,640；6,103,505；
U.S.6,127,137；6,143,545；6,172,248；6,548,633；7,494,676；和7,226,771，和美国公开No.2007/0134777、2005/0059130、2008/0182322和2009/0069587中。
[0029] 现有方法不足以使油中存在的非水化磷脂除去或反应，因为NHP不能被水合或反应而除去。
[0030] 需要从植物油中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂(统称为“胶”)以制造可用于食物生产和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品的有成本效益和有效率的方法。
[0031] 磷脂酶是水解磷脂的酯键的酶。对应于它们在磷脂代谢中的重要性，这些酶在原核生物和真核生物中普遍存在。磷脂酶影响新陈代谢、生物膜的构建和重组，并涉及信号级联。几种类型的磷脂酶是已知的，根据磷脂分子攻击的键位置而特异性不同。
[0032] 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶是真核细胞内酶的家族，在信号转导过程中发挥重要作用。PI-PLC催化的反应是：
[0033] 1-磷脂酰-1D-myo-肌醇4，5-二磷酸(也称作PIP2，磷脂酰肌醇二磷酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油
[0034] 磷脂酶C(PLC)酶的家族已经在细菌和锥虫中被鉴定。PLC酶属于水解酶和磷酸二酯酶家族。PLC以钙依赖性方式参与磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)代谢和脂质信号通路。
PLC亚型可以在它们的激活方式、表达水平、催化调控、细胞定位、膜结合亲和力和组织分布方面不同。所有的都能够催化PIP2的水解成为两个重要的第二信使分子，从而改变细胞响
应，如增殖、分化、凋亡、细胞骨架重构、膜泡运输、离子通道电导、内分泌功能和神经传导。
PLC被描述于例如Carmen，G.，J.Biol.Chem.270(1995)18711-18714，Jianag，Y.，J.Biol.Chem，271(1996)29528-29532，Waggoner，D.，J.Biol.Chem.270(1995)19422-19429，
Molecular Probes Product Sheet 2001，和Sano等人，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.
Physiol.281：844-851，2001。
PLC亚型可以在它们的激活方式、表达水平、催化调控、细胞定位、膜结合亲和力和组织分布方面不同。所有的都能够催化PIP2的水解成为两个重要的第二信使分子，从而改变细胞响
应，如增殖、分化、凋亡、细胞骨架重构、膜泡运输、离子通道电导、内分泌功能和神经传导。
PLC被描述于例如Carmen，G.，J.Biol.Chem.270(1995)18711-18714，Jianag，Y.，J.Biol.Chem，271(1996)29528-29532，Waggoner，D.，J.Biol.Chem.270(1995)19422-19429，
Molecular Probes Product Sheet 2001，和Sano等人，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.
Physiol.281：844-851，2001。
[0035] 磷脂酶A1(PLA1)酶除去1-位脂肪酸产生游离脂肪酸和1-溶血-2-酰基磷脂。磷脂酶A2(PLA2)酶除去2-位脂肪酸产生游离脂肪酸和1-酰基-2-溶血磷脂。PLA1和PLA2
酶可以是细胞内或细胞外的，膜结合的或可溶的。细胞内PLA2被发现在几乎每一种哺乳动
物细胞中。磷脂酶C(PLC)酶除去磷酸酯部产生1，2-二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)
酶产生1，2-二酰基甘油磷酸酯和碱基团。
酶可以是细胞内或细胞外的，膜结合的或可溶的。细胞内PLA2被发现在几乎每一种哺乳动
物细胞中。磷脂酶C(PLC)酶除去磷酸酯部产生1，2-二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)
酶产生1，2-二酰基甘油磷酸酯和碱基团。
发明内容
[0036] 本文提供的是具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或等效酶活性和/或另一种磷脂酶活性的多肽和编码多肽的多核苷酸，包括磷脂酶A、B、C、D、patatin、磷脂酸磷酸酶(PAP)和/或脂酰水解酶(LAH)或等效酶活性，以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的
方法。在一个方面，本文提供的是多肽，例如，具有磷脂酶活性的酶，例如，磷脂酶A、B、D或C活性，例如磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)活性。本文提供的多肽和肽的酶活性包括
(包含或由其组成)磷脂酶活性、磷脂酶C活性或磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)活
性，包括脂质水解、酸水解反应(例如，将酯化脂肪酸替换为游离脂肪酸)、转酯化反应(例如，在甘油三酯之间进行脂肪酸交换)、酯合成、酯交换反应和脂酰水解酶(LAH)活性。在另一个方面，本文提供的多肽被用于合成对映体纯的手性产品。本文提供的多肽可被用于医
药、农业和工业的各种不同情况，包括化妆品和保健品生产。此外，本文提供的多肽可被用于食品加工、酿造、沐浴液添加剂、醇生产、肽合成、对映体选择、皮革工业的皮革制备、废料管理和动物废物降解、摄影工业中银的回收、医疗、丝绸脱胶、生物膜降解、生物质转化为乙醇、生物防卫、抗菌剂和消毒剂、个人护理和化妆品、生物技术试剂、增加玉米湿磨的淀粉产量、以及作为药品(例如，消化助剂和抗炎(消炎)剂)。
方法。在一个方面，本文提供的是多肽，例如，具有磷脂酶活性的酶，例如，磷脂酶A、B、D或C活性，例如磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)活性。本文提供的多肽和肽的酶活性包括
(包含或由其组成)磷脂酶活性、磷脂酶C活性或磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)活
性，包括脂质水解、酸水解反应(例如，将酯化脂肪酸替换为游离脂肪酸)、转酯化反应(例如，在甘油三酯之间进行脂肪酸交换)、酯合成、酯交换反应和脂酰水解酶(LAH)活性。在另一个方面，本文提供的多肽被用于合成对映体纯的手性产品。本文提供的多肽可被用于医
药、农业和工业的各种不同情况，包括化妆品和保健品生产。此外，本文提供的多肽可被用于食品加工、酿造、沐浴液添加剂、醇生产、肽合成、对映体选择、皮革工业的皮革制备、废料管理和动物废物降解、摄影工业中银的回收、医疗、丝绸脱胶、生物膜降解、生物质转化为乙醇、生物防卫、抗菌剂和消毒剂、个人护理和化妆品、生物技术试剂、增加玉米湿磨的淀粉产量、以及作为药品(例如，消化助剂和抗炎(消炎)剂)。
[0037] 在某些实施方案中，本文提供的是组合物(例如，磷脂酶、磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC))和生产磷脂油的方法，例如，具有更低的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和/或磷脂酸含量的油。任何油，例如植物油，例如，芥花油、大豆油，或动物油或脂肪，例如，牛油，都能够使用本文提供的组合物或方法进行处理。任何食品、食用物品、或烘烤、油炸或烹饪产品(例如，酱、卤汁、调味品、喷雾油、人造黄油、烘焙油、蛋黄酱、烹饪油、色拉油、可匙取和可倾倒的调料，等等，以及由此制成的产品)都可以含有使用本文提供的组合物或方法进行处理的植物油或动物脂肪。被修饰为低磷脂油的植
物油可被用于任何食品、食用物品、或烘烤、油炸或烹饪产品(例如，酱、卤汁、调味品、喷雾油、人造黄油、烘焙油、蛋黄酱、烹饪油、色拉油、可匙取和可倾倒的调料)等。在一个实施方案中，本文提供的是油，例如植物油，例如，芥花油或大豆油，以及食品或烘焙或烹饪产品，包括酱、卤汁、调味品、喷雾油、人造黄油、烘焙油、蛋黄酱、烹饪油、煎炸油、色拉油、可匙取和可倾倒的调料等，其中油或食品、烘焙或烹饪产品已经使用本文提供的酶进行了修饰。在一个方面，这些植物油，例如，芥花油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、池花籽油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、大豆油、葵花籽油、妥尔(tall)油、山茶油、经过遗传修饰的微生物(GMO)和传统的“育种”而具有改变的脂肪酸组成的“天然”油种类(例如高油酸、低亚麻酸或低饱和油(高油酸芥花油、低亚麻酸大豆油或高硬脂酸葵花籽油))、动物脂肪(牛油、猪油、黄油脂肪和鸡脂肪)、鱼油(烛鱼油、鳕鱼肝油、金狮油、沙丁鱼油、鲱鱼油和油鲱鱼油)或者上述任何油的共混物，以及食品或烘焙、煎炸或烹饪产品，包含具有更低的脂肪酸含量的油，包括棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、硬脂酸、辛酸等含量低的油，其通过使用本文提供的组合物或方法进行加工。
物油可被用于任何食品、食用物品、或烘烤、油炸或烹饪产品(例如，酱、卤汁、调味品、喷雾油、人造黄油、烘焙油、蛋黄酱、烹饪油、色拉油、可匙取和可倾倒的调料)等。在一个实施方案中，本文提供的是油，例如植物油，例如，芥花油或大豆油，以及食品或烘焙或烹饪产品，包括酱、卤汁、调味品、喷雾油、人造黄油、烘焙油、蛋黄酱、烹饪油、煎炸油、色拉油、可匙取和可倾倒的调料等，其中油或食品、烘焙或烹饪产品已经使用本文提供的酶进行了修饰。在一个方面，这些植物油，例如，芥花油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、池花籽油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、大豆油、葵花籽油、妥尔(tall)油、山茶油、经过遗传修饰的微生物(GMO)和传统的“育种”而具有改变的脂肪酸组成的“天然”油种类(例如高油酸、低亚麻酸或低饱和油(高油酸芥花油、低亚麻酸大豆油或高硬脂酸葵花籽油))、动物脂肪(牛油、猪油、黄油脂肪和鸡脂肪)、鱼油(烛鱼油、鳕鱼肝油、金狮油、沙丁鱼油、鲱鱼油和油鲱鱼油)或者上述任何油的共混物，以及食品或烘焙、煎炸或烹饪产品，包含具有更低的脂肪酸含量的油，包括棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、硬脂酸、辛酸等含量低的油，其通过使用本文提供的组合物或方法进行加工。
[0038] 在一个方面，本文提供的是多肽，例如，酶和催化抗体，其具有磷脂酶活性，例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC))，包括热稳定和耐热的酶活性，以及脂肪酸特异性或脂肪酸选择活性，和低或高的pH耐受酶活性，以及编码这些多肽的多核苷
酸，包括载体、宿主细胞、转基因植物和非人动物；以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。
酸，包括载体、宿主细胞、转基因植物和非人动物；以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。
[0039] 在另一个方面，本文提供的是分离的、合成的或重组的核酸，其包含以下的核酸序列：
[0040] (a)编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))酶活性的多肽，和
[0041] (i)相对于SEQ ID NO：5具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
97％、98％、99％或更多、或100％的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合，
[0043] 以及任选地，序列比对算法是BLAST 2.2.2版算法，其中过滤设置被设定为blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，所有其他选项均设置为缺省；
[0044] (ii)编码多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或
[0045] (iii)在严格条件下与包含SEQ ID NO：5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
[0047] (iv)包含或由序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10组成的核酸；或[0048] (v)相对于SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或100％的序列同一性；
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或100％的序列同一性；
[0049] (b)(a)的核酸序列，其编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸序列的多肽；
[0050] (c)(a)或(b)的核酸序列，其编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))酶活性但缺少天然启动子序列的多肽；
[0051] (d)(c)的核酸，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列；
[0052] (e)(a)～(d)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异源核苷酸序列；
[0053] (f)(e)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含或由编码异源(前导)信号序列、或标签或表位的序列组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；
[0054] (g)(d)、(e)或(f)的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，所述异源(前导)信号序列包含或由靶向内质网(ER)或内膜或者靶向植物内质网(ER)或
内膜系统的N-端和/或C-端延伸组成，或所述异源序列编码限制位点；
内膜系统的N-端和/或C-端延伸组成，或所述异源序列编码限制位点；
[0055] (h)(d)、(e)或(f)的核酸，其中所述异源启动子序列包含或由组成型或诱导型启动子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子组成；
[0056] (i)(a)～(h)中任一个的核酸，其中所述磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性是热稳定的；
[0057] (j)(a)～(h)中任一个的核酸，其中所述磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性是耐热的；
[0058] (k)与(a)～(j)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列。
[0059] 在一个方面，分离的、合成的或重组的核酸编码具有具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽或肽，其是热稳定的。由本文
提供的核酸编码的多肽和肽，或任何本文提供的多肽或肽，能够在以下条件下保留酶或结
合活性(例如，底物结合)，包括：温度范围为约-100℃～约-80℃、约-80℃～约-40℃、
约-40℃～约-20℃、约-20℃～约0℃、约0℃～约5℃、约5℃～约15℃、约15℃～约25℃、约25℃～约37℃、约37℃～约45℃、约45℃～约55℃、约55℃～约70℃、约70℃～约
75℃、约75℃～约85℃、约85℃～约90℃、约90℃～约95℃、约95℃～约100℃、约100℃～约105℃、约105℃～约110℃、约110℃～约120℃或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、
101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、
113℃、114℃、115℃或更高。本文提供的是在上述温度范围下，在约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH
8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高pH的条件下保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶
C(PI-PLC)))活性的热稳定多肽。
提供的核酸编码的多肽和肽，或任何本文提供的多肽或肽，能够在以下条件下保留酶或结
合活性(例如，底物结合)，包括：温度范围为约-100℃～约-80℃、约-80℃～约-40℃、
约-40℃～约-20℃、约-20℃～约0℃、约0℃～约5℃、约5℃～约15℃、约15℃～约25℃、约25℃～约37℃、约37℃～约45℃、约45℃～约55℃、约55℃～约70℃、约70℃～约
75℃、约75℃～约85℃、约85℃～约90℃、约90℃～约95℃、约95℃～约100℃、约100℃～约105℃、约105℃～约110℃、约110℃～约120℃或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、
101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、
113℃、114℃、115℃或更高。本文提供的是在上述温度范围下，在约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH
8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高pH的条件下保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶
C(PI-PLC)))活性的热稳定多肽。
[0060] 在一个方面，本文提供的多肽可以是耐热的，且经过暴露在以下温度范围后，仍然能够保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性：
约-100℃～约-80℃、约-80℃～约-40℃、约-40℃～约-20℃、约-20℃～约0℃、约0℃～
约5℃、约5℃～约15℃、约15℃～约25℃、约25℃～约37℃、约37℃～约45℃、约45℃～
约55℃、约55℃～约70℃、约70℃～约75℃、约75℃～约85℃、约85℃～约90℃、约
90℃～约95℃、约95℃～约100℃、约100℃～约105℃、约105℃～约110℃、约110℃～约
120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、
107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。
约-100℃～约-80℃、约-80℃～约-40℃、约-40℃～约-20℃、约-20℃～约0℃、约0℃～
约5℃、约5℃～约15℃、约15℃～约25℃、约25℃～约37℃、约37℃～约45℃、约45℃～
约55℃、约55℃～约70℃、约70℃～约75℃、约75℃～约85℃、约85℃～约90℃、约
90℃～约95℃、约95℃～约100℃、约100℃～约105℃、约105℃～约110℃、约110℃～约
120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、
107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。
[0061] 在一些实施方案中，耐热多肽经过暴露在上述温度范围后，在约pH 3.0、约pH3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH
7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH
11.5、约pH 12.0或更高pH的条件下，仍然保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇
特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性。
7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH
11.5、约pH 12.0或更高pH的条件下，仍然保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇
特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性。
[0062] 在另一个方面，本文提供的是用于分离、制造和/或鉴定编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽的核酸的核酸探针或扩
增引物。在一个实施方案中，核酸探针，例如，用于鉴定编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽的核酸的探针，包括一种包含或由
本文提供的序列或其片段或子序列的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、
75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、950、1000或更多个连续碱基的探针组成，其中所述探针通过结合或杂交来鉴定核酸。探针可以包含一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含本文提供的序列或其片段或子序列的
至少约10～50、约20～60、约30～70、约40～80或约60～100个连续碱基。探针可以
包括一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含本文提供的核酸序列或其子序列的至少约10～50、
约20～60、约30～70、约40～80或约60～100个连续碱基。
增引物。在一个实施方案中，核酸探针，例如，用于鉴定编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽的核酸的探针，包括一种包含或由
本文提供的序列或其片段或子序列的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、
75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、950、1000或更多个连续碱基的探针组成，其中所述探针通过结合或杂交来鉴定核酸。探针可以包含一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含本文提供的序列或其片段或子序列的
至少约10～50、约20～60、约30～70、约40～80或约60～100个连续碱基。探针可以
包括一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含本文提供的核酸序列或其子序列的至少约10～50、
约20～60、约30～70、约40～80或约60～100个连续碱基。
[0063] 在一个实施方案中，用于扩增编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽的核酸的扩增引物序列对，包括一种引物对，所述引物对包含或由能够扩增具有本文提供的序列或其片段或子序列的核酸的引物对组成。扩
增引物序列对的一个或每个成员可以包括一种包含序列中的至少约10～50个连续碱基的
寡核苷酸。
增引物序列对的一个或每个成员可以包括一种包含序列中的至少约10～50个连续碱基的
寡核苷酸。
[0064] 在一个实施方案中，扩增编码具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽的核酸的方法，包括用能够扩增本文提供的核酸序列或其片段或子序列的扩增引物序列对扩增模板核酸。
[0065] 在一个实施方案中，载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体含有本文提供的核酸或其子序列。在一个方面，载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体可以含有或包含在病毒载体、噬菌体、噬菌粒、粘粒、F黏粒、细菌噬菌体、人工染色体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关的病毒载体中；或，细菌人工染色体(BAC)、细菌噬菌体P1-衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
[0066] 在一个实施方案中，表达框含有本文提供的核酸或其子序列。在一个方面，表达框可以包括可操作地连接到启动子的核酸。启动子可以是病毒、细菌、哺乳动物或植物启动子。在一个方面，植物启动子可以是马铃著、水稻、玉米、小麦、烟草或大麦启动子。启动子可以是组成型启动子。组成型启动子可以包括CaMV35S。在另一个方面，启动子可以是诱导型启动子。在一个方面，启动子可以是组织特异性启动子或环境调控的或发育调控的启动
子。因而，启动子可以是，例如，种子特异性、叶特异性、根特异性、茎特异性或脱落诱导的启动子。在一个方面，表达框还可以包括植物或植物病毒表达载体。
子。因而，启动子可以是，例如，种子特异性、叶特异性、根特异性、茎特异性或脱落诱导的启动子。在一个方面，表达框还可以包括植物或植物病毒表达载体。
[0067] 在一个实施方案中，宿主细胞或转化细胞含有本文提供的核酸。在一个方面，宿主细胞或转化细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一个方面，植物细胞可以是马铃著、小麦、水稻、玉米、烟草或大麦细胞。转化细胞可以是任何一种本领域技术人员熟知的宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，例如细菌
细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性的细菌细胞包
括下列属中的任何种：埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属
(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属
(Staphylococcus)，其包括例如大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸球菌(Lactococcus
lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。示例
性的真菌细胞包括任何种的曲霉菌属(Aspergillus)。示例性的酵母细胞包括任何种的毕
赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或许
旺酵母属(Schwanniomyces)，包括毕赤酵母(Pichia pastoris)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。示例性的昆虫细胞包括任何种
的斜纹夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属(Drosophila)，包括果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。示例
性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤或任何小鼠或人细胞系。
细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性的细菌细胞包
括下列属中的任何种：埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属
(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属
(Staphylococcus)，其包括例如大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸球菌(Lactococcus
lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。示例
性的真菌细胞包括任何种的曲霉菌属(Aspergillus)。示例性的酵母细胞包括任何种的毕
赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或许
旺酵母属(Schwanniomyces)，包括毕赤酵母(Pichia pastoris)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。示例性的昆虫细胞包括任何种
的斜纹夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属(Drosophila)，包括果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。示例
性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤或任何小鼠或人细胞系。
[0068] 在另一个实施方案，转基因非人动物含有本文提供的核酸或本文提供的载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体。转基因非人动物可以是小鼠、大鼠、山羊、兔、绵羊、猪或牛。
[0069] 在一个实施方案中，转基因植物或种子包括本文提供的核酸或本文提供的载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体。在一个实施方案中，植物是玉米植物、高粱植物、马铃著植物、西红柿植物、小麦植物、油籽植物、油菜籽植物、大豆植物、水稻植物、大麦植物、草、棉籽、棕榈、芝麻种子植物、花生植物、向日葵植物或烟草植物；转基因种子。在一个实施方案中，种子是玉米种子、小麦仁、油籽、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、向日葵籽、芝麻种子、水稻、大麦、花生、棉籽、棕榈、花生、芝麻种子、向日葵籽或烟草植物种子。
[0070] 在一个方面，本文提供的是一种包含或由本文提供的核酸组成的反义寡核苷酸或抑制性RNA。
[0071] 在另一个方面，本文提供的是一种抑制细胞中磷脂酶信使(转录，mRNA)转移的方法，包括给予所述细胞或在所述细胞中表达包含或由本文提供的核酸序列组成的反义寡核
苷酸或抑制性RNA。
苷酸或抑制性RNA。
[0072] 在一个实施方案中，分离的、合成的或重组的具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽，或多肽能够产生对于磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))(例如，表位)的免疫应答特异性；且
在可选方面，本文提供的肽和多肽包括以下序列：
在可选方面，本文提供的肽和多肽包括以下序列：
[0073] (a)包含氨基酸序列：
[0074] (i)相对于SEQ ID NO：6具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％、或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
98％、99％、或更多、或100％的序列同一性，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所示氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种、或更多或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，
[0075] 其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查确定序列同一性；
[0076] (ii)由本文提供的核酸编码；
[0077] (iii)相对于SEQ ID NO：8具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、或更多、或100％的序列同一性；
97％、98％、99％、或更多、或100％的序列同一性；
[0078] (b)(a)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列；
[0079] (c)(a)或(b)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分；
[0080] (d)(c)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含或由异源(前导)信号序列、标签、可检测标记或表位组成；
[0081] (e)(d)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含或由靶向内质网(ER)或内膜或者靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸组成；
[0082] (f)(a)～(e)中任一个的多肽，其中所述磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))催化反应，包括：
[0083] 1-磷脂酰-1D-myo-肌醇4，5-二磷酸(也称作PIP2，磷脂酰肌醇二磷酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油；
[0084] (g)(a)～(f)的多肽，其中所述磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性是热稳定的；
[0085] (h)(a)～(f)的多肽，其中所述磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性是耐热的；
[0086] (i)(a)～(h)中任一个的多肽，其中：(i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii)(i)的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或O-连接的糖基
化；(iii)(i)或(ii)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv)(iii)
的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
化；(iii)(i)或(ii)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv)(iii)
的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母；
[0087] (j)(a)～(i)中任一个的多肽，还含有或包含在含有至少一个第二种酶或至少一个第二种磷脂酶的组合物中；或
[0088] (k)(j)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个其变体酶。
[0089] 在一个方面，分离的、合成的或重组的多肽可以包括本文提供的多肽，其缺少信号(肽)序列，例如，缺少其同源信号序列，以及在一个方面，包含异源信号(肽)序列。在一个方面，分离的、合成的或重组的多肽可以包括本文提供的多肽，其包含异源信号序列，例如异源磷脂酶或非磷脂酶(例如，非磷脂酶、非磷脂酶C或非磷脂酰肌醇特异性磷脂酶
C(PI-PLC))信号序列。在一个方面，嵌合蛋白包括包含本文提供的信号序列的第一结构域
和至少一个第二结构域。该蛋白可以是融合蛋白。第二结构域可以包括酶。该酶可以是本
文提供的磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))，或，另一种酶。
C(PI-PLC))信号序列。在一个方面，嵌合蛋白包括包含本文提供的信号序列的第一结构域
和至少一个第二结构域。该蛋白可以是融合蛋白。第二结构域可以包括酶。该酶可以是本
文提供的磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))，或，另一种酶。
[0090] 在一个方面，磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性包括在约37℃下约100～约1000单位/毫克蛋白范围内的比活性。在
另一个方面，磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性包
括约500～约750单位/毫克蛋白的比活性。可选择地，磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷
脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性包括在37℃下约500～约1200单位/毫克蛋白
范围内的比活性。在一个方面，磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶
C(PI-PLC)))活性包括在37℃下约750～约1000单位/毫克蛋白范围内的比活性。在另
一个方面，耐热性包括在被加热至高温后保留至少一半磷脂酶在37℃下的比活性。可选择
地，耐热性可以包括在被加热至高温后保留在37℃下约500～约1200单位/毫克蛋白范围
内的比活性。
另一个方面，磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性包
括约500～约750单位/毫克蛋白的比活性。可选择地，磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷
脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性包括在37℃下约500～约1200单位/毫克蛋白
范围内的比活性。在一个方面，磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶
C(PI-PLC)))活性包括在37℃下约750～约1000单位/毫克蛋白范围内的比活性。在另
一个方面，耐热性包括在被加热至高温后保留至少一半磷脂酶在37℃下的比活性。可选择
地，耐热性可以包括在被加热至高温后保留在37℃下约500～约1200单位/毫克蛋白范围
内的比活性。
[0091] 在一个实施方案中，本文提供的分离的、合成的或重组的多肽包括至少一个糖基化位点。在一个方面，糖基化可以是N-连接的糖基化。在一个方面，多肽可以在毕赤酵母
或裂殖酵母中或在植物中表达后被糖基化，例如产油植物，例如，大豆、油菜、水稻、向日葵或这些植物的遗传修饰的(GMO)变体。
或裂殖酵母中或在植物中表达后被糖基化，例如产油植物，例如，大豆、油菜、水稻、向日葵或这些植物的遗传修饰的(GMO)变体。
[0092] 在一个方面，多肽可以在包括约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5或pH4.0或更低pH的条件下保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶
C(PI-PLC)))活性。在另一个方面，多肽可以在包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12.0或更高pH的条件下保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性。
C(PI-PLC)))活性。在另一个方面，多肽可以在包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12.0或更高pH的条件下保留磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性。
[0093] 在一个实施方案中，蛋白制剂包括本文提供的多肽，其中所述蛋白制剂包括液体、固体或凝胶。
[0094] 在一个方面，本文提供的异二聚体包括多肽和第二结构域。在一个方面，第二结构域可以是多肽且异二聚体可以是融合蛋白。在一个方面，第二结构域可以是表位或标签。在一个方面，本文提供的同二聚体包括本文提供的多肽。
[0095] 在一个实施方案中，本文提供的固定化具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽，其中所述多肽包括本文提供的多肽、由本文提供的核酸编码的多肽、或包含本文提供的多肽和第二结构域的多肽。在一个方面，本文提供的多肽可以被固定化在细胞、囊泡、脂质体、胶片、薄膜、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、平板、晶体、片剂、丸剂、胶囊、粉末、团块、表面、多孔结构、阵列或毛细管上，或诸如谷物、糠、树皮、皮肤、头发、珐琅、骨头、贝壳等材料以及源自它们的材料上。本文提供的多核苷酸、多肽和酶可以被制成固体形态，例如粉末、冻干制剂、颗粒剂、片剂、块剂、晶体、胶囊、丸剂、小球；或液体形态，例如水溶液、气雾剂、凝胶、膏剂、浆液、水/油乳剂、乳膏、胶囊、或囊泡或胶束的悬液。
[0096] 在一个方面，本文提供的是特异性结合本文提供的多肽的分离的、合成的或重组的抗体。在另一个方面，分离的、合成的或重组的抗体是单克隆或多克隆抗体，或是其抗原结合片段。在一个方面，本文提供的是包含本文提供的抗体的杂交瘤。
[0097] 在一个实施方案中，本文提供的是包含本文提供的固定化多肽、固定化核酸或抗体或其组合的阵列。
[0098] 在一个实施方案中，动物食品添加剂包括本文提供的多肽，例如，由本文提供的核酸编码的多肽。在一个方面，食品添加剂中的多肽可被糖基化。在一个实施方案中，食用酶的递送基质包括本文提供的多肽，例如，由本文提供的核酸编码的多肽。在一个方面，递送基质包括小球。在一个方面，多肽可被糖基化。在一个方面，磷脂酶活性是耐热的。在另一个方面，磷脂酶活性是热稳定的。
[0099] 在一个实施方案中，分离或鉴定具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽的方法包括以下步骤：(a)提供本文提供的抗体；(b)提供包含多肽的样品；和(c)在抗体能够特异性结合多肽的条件下将步骤(b)的样品与步
骤(a)的抗体接触，从而分离或鉴定具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性
磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽。
骤(a)的抗体接触，从而分离或鉴定具有磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性
磷脂酶C(PI-PLC)))活性的多肽。
[0100] 在一个实施方案中，抗磷脂酶抗体的制备方法包括将本文提供的核酸或本文提供的多肽或其子序列以足够的量给予非人动物以产生体液的免疫应答，从而制备抗磷脂酶抗
体。本文提供的是抗磷脂酶抗体的制备方法，包括将本文提供的核酸或本文提供的多肽或
其子序列以足够的量给予非人动物以产生免疫应答。
体。本文提供的是抗磷脂酶抗体的制备方法，包括将本文提供的核酸或本文提供的多肽或
其子序列以足够的量给予非人动物以产生免疫应答。
[0101] 在一个实施方案中，生产重组多肽的方法包括以下步骤：A(a)提供本文提供的核酸，其中所述核酸任选地连接到启动子，其中所述核酸包括本文提供的核酸；和(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，从而生产重组多肽；或(B)(A)的方法，还包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，然后表达步骤(a)的核酸，从而在转化细胞中生产重组多肽。
[0102] 在一个实施方案中，鉴定具有磷脂酶活性的多肽的方法包括以下步骤：(a)提供本文提供的多肽；(b)提供水解酶底物；和(c)将多肽与步骤(b)的底物接触，并检测底物
量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加检测出具有磷脂酶
活性的多肽。
量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加检测出具有磷脂酶
活性的多肽。
[0103] 在一个实施方案中，鉴定磷脂酶底物的方法包括以下步骤：(a)提供本文提供的多肽；(b)提供待测底物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的待测底物接触，并检测底
物量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加鉴定出待测底物
是磷脂酶底物。
物量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加鉴定出待测底物
是磷脂酶底物。
[0104] 在另一个方面，测定待测化合物是否特异性结合多肽的方法包括以下步骤：(a)在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或包含核酸的载体，其中所述核酸包含本文提供
的核酸；(b)提供待测化合物；(c)将多肽与待测化合物接触；和(d)测定是否步骤(b)的
待测化合物特异性结合多肽。
的核酸；(b)提供待测化合物；(c)将多肽与待测化合物接触；和(d)测定是否步骤(b)的
待测化合物特异性结合多肽。
[0105] 在另一个方面，测定待测化合物是否特异性结合多肽的方法包括以下步骤：(a)提供本文提供的多肽；(b)提供待测化合物；(c)将多肽与待测化合物接触；和(d)测定是
否步骤(b)的待测化合物特异性结合多肽。
否步骤(b)的待测化合物特异性结合多肽。
[0106] 在一个实施方案中，鉴定磷脂酶活性的调节物的方法包括以下步骤：(A)(a)提供本文提供的多肽；(b)提供待测化合物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的待测化合物接
触并测量磷脂酶的活性，其中将在待测化合物存在下测量到的磷脂酶活性变化与在待测化
合物不存在下的活性进行比较，从而提供待测化合物调节磷脂酶活性的检测结果；(B)(A)
的方法，磷脂酶活性可以通过提供磷脂酶底物并检测底物量的减少或反应产物量的增加或
者底物量的增加或反应产物量的减少来进行测量；(C)(B)的方法，其中与不含待测化合物
的底物或反应产物的量相比，使底物量减少或反应产物量增加的待测化合物被鉴定为磷脂
酶活性的活化剂；或，(D)(B)的方法，其中与不含待测化合物的底物或反应产物的量相比，使底物量增加或反应产物量减少的待测化合物被鉴定为磷脂酶活性的抑制剂。
触并测量磷脂酶的活性，其中将在待测化合物存在下测量到的磷脂酶活性变化与在待测化
合物不存在下的活性进行比较，从而提供待测化合物调节磷脂酶活性的检测结果；(B)(A)
的方法，磷脂酶活性可以通过提供磷脂酶底物并检测底物量的减少或反应产物量的增加或
者底物量的增加或反应产物量的减少来进行测量；(C)(B)的方法，其中与不含待测化合物
的底物或反应产物的量相比，使底物量减少或反应产物量增加的待测化合物被鉴定为磷脂
酶活性的活化剂；或，(D)(B)的方法，其中与不含待测化合物的底物或反应产物的量相比，使底物量增加或反应产物量减少的待测化合物被鉴定为磷脂酶活性的抑制剂。
[0107] 在一个方面，从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的方法包括以下步骤：(A)(a)提供包含本文提供的核酸的多核苷酸探针；(b)从样品中分离核酸或处
理样品，使得样品中的核酸能够与步骤(a)的多核苷酸探针杂交；(c)将步骤(b)的分离
的核酸或处理的样品与步骤(a)的多核苷酸探针组合；和(d)分离与步骤(a)的多核苷酸
探针特异性杂交的核酸，从而从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸；(B)(A)的方法，其中所述样品是或包括环境样品；(C)(B)的方法，其中所述环境样品是或包
括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品；或(D)(C)的方法，其中所述生物样品衍生于细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
理样品，使得样品中的核酸能够与步骤(a)的多核苷酸探针杂交；(c)将步骤(b)的分离
的核酸或处理的样品与步骤(a)的多核苷酸探针组合；和(d)分离与步骤(a)的多核苷酸
探针特异性杂交的核酸，从而从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸；(B)(A)的方法，其中所述样品是或包括环境样品；(C)(B)的方法，其中所述环境样品是或包
括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品；或(D)(C)的方法，其中所述生物样品衍生于细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
[0108] 在一个实施方案中，从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的方法包括以下步骤：提供用于扩增编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的扩增引物序列，其中
所述引物对能够扩增本文提供的核酸；(b)从样品中分离核酸或处理样品，使得样品中的
核酸能够与扩增引物对杂交；和(c)将步骤(b)的核酸与步骤(a)的扩增引物对组合并
从样品扩增核酸，从而从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸。在一个实
施方案中，所述样品是环境样品，例如，水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品，例如，细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
扩增引物序列对的一个或每个成员可以包括寡核苷酸，其包含本文提供的序列的至少约
10～50或更多个连续碱基。
所述引物对能够扩增本文提供的核酸；(b)从样品中分离核酸或处理样品，使得样品中的
核酸能够与扩增引物对杂交；和(c)将步骤(b)的核酸与步骤(a)的扩增引物对组合并
从样品扩增核酸，从而从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸。在一个实
施方案中，所述样品是环境样品，例如，水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品，例如，细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
扩增引物序列对的一个或每个成员可以包括寡核苷酸，其包含本文提供的序列的至少约
10～50或更多个连续碱基。
[0109] 在一个实施方案中，增强磷脂酶多肽耐热性或热稳定性的方法包括糖基化磷脂酶多肽，其中所述多肽包括本文提供的多肽的至少30个连续氨基酸；或由本文提供的核酸序
列编码的多肽，从而增强磷脂酶多肽的耐热性或热稳定性。在一个方面，磷脂酶特异性活性在高于约37℃～约95℃的温度范围内可以是热稳定或耐热的。
列编码的多肽，从而增强磷脂酶多肽的耐热性或热稳定性。在一个方面，磷脂酶特异性活性在高于约37℃～约95℃的温度范围内可以是热稳定或耐热的。
[0110] 在一个实施方案中，在细胞中过表达重组磷脂酶(例如，磷脂酶C(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)))多肽的方法包括表达包含本文提供的核酸或本文提供的核酸序列的载体，其中序列同一性通过用序列比对算法进行分析或通过目视检查来确定，其
中通过使用高活性启动子、双顺反子载体或载体的基因扩增来进行过表达。
中通过使用高活性启动子、双顺反子载体或载体的基因扩增来进行过表达。
[0111] 在一个实施方案中，生产编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸变体的方法包括以下步骤：(A)(a)提供包含本发明的核酸的模板核酸；和(b)修饰、缺失或添加模板序列中的一种或多种核苷酸或其组合，以产生模板核酸变体；(B)(A)的方法，还包括表达变体核酸以
产生变体磷脂酶多肽；(C)(A)或(B)的方法，其中所述修饰、添加或缺失可以通过以下方法进行引入，包括易错PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)和其组合；(D)(A)～(C)中任一个的方法，其中所述修饰、
添加或缺失可以通过以下方法进行引入，包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、尿嘧啶-含有模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立和其组合；(E)(A)～(D)中任一个的方法，其中所述方法迭代重
复，直到产生与模板核酸编码的多肽相比具有改变的或不同的(变体)活性或改变的或不
同的(变体)稳定性的(变体)磷脂酶，或产生与模板核酸编码的多肽相比改变的或不同
的(变体)二级结构，或产生与模板核酸编码的多肽相比改变的或不同的(变体)转录后
修饰；(F)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽是耐热的，且在暴露于高温后仍保留一些
活性；(G)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽与模板核酸编码的磷脂酶相比具有增强的
糖基化；(H)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽在高温下具有磷脂酶活性，其中由模板
核酸编码的磷脂酶在高温下没有活性；(I)(A)～(H)中任一个的方法，其中所述方法迭代
重复，直到产生与模板核酸编码的相比具有改变的密码子应用的磷脂酶；或(J)(A)～(H)
中任一个的方法，其中所述方法迭代重复，直到产生与模板核酸编码的相比具有更高或更
低信息表达或稳定性水平的磷脂酶基因。
产生变体磷脂酶多肽；(C)(A)或(B)的方法，其中所述修饰、添加或缺失可以通过以下方法进行引入，包括易错PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)和其组合；(D)(A)～(C)中任一个的方法，其中所述修饰、
添加或缺失可以通过以下方法进行引入，包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、尿嘧啶-含有模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立和其组合；(E)(A)～(D)中任一个的方法，其中所述方法迭代重
复，直到产生与模板核酸编码的多肽相比具有改变的或不同的(变体)活性或改变的或不
同的(变体)稳定性的(变体)磷脂酶，或产生与模板核酸编码的多肽相比改变的或不同
的(变体)二级结构，或产生与模板核酸编码的多肽相比改变的或不同的(变体)转录后
修饰；(F)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽是耐热的，且在暴露于高温后仍保留一些
活性；(G)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽与模板核酸编码的磷脂酶相比具有增强的
糖基化；(H)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽在高温下具有磷脂酶活性，其中由模板
核酸编码的磷脂酶在高温下没有活性；(I)(A)～(H)中任一个的方法，其中所述方法迭代
重复，直到产生与模板核酸编码的相比具有改变的密码子应用的磷脂酶；或(J)(A)～(H)
中任一个的方法，其中所述方法迭代重复，直到产生与模板核酸编码的相比具有更高或更
低信息表达或稳定性水平的磷脂酶基因。
[0112] 在一个方面，修饰在编码磷脂酶多肽的核酸中的密码子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸，包括本文提供的核酸；和，(b)鉴定在步骤(a)的核酸中的密码子并用编码相同氨基酸的不同密码子作为替换密码子进行替换，
从而修饰在编码磷脂酶的核酸中的密码子。
从而修饰在编码磷脂酶的核酸中的密码子。
[0113] 在一个实施方案中，产生编码多个修饰的磷脂酶活性位点或底物结合位点的核酸的文库的方法，其中所述修饰的活性位点或底物结合位点衍生于第一核酸，其包含编码第
一活性位点或第一底物结合位点的序列，所述方法包括以下步骤：(A)(a)提供编码第一活
性位点或第一底物结合位点的第一核酸，其中所述第一核酸序列包含本文提供的核酸，并
且所述核酸编码磷脂酶活性位点或磷脂酶底物结合位点；(b)提供一套诱变的寡核苷酸，
其编码在第一核酸中多个目标密码子处的天然发生的氨基酸变体；和，(c)使用该套诱变
的寡核苷酸，产生一套编码活性位点或编码底物结合位点的变体核酸，其在诱变处理的每
个氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变化，从而产生编码多个修饰的磷脂酶活性位点
或底物结合位点的核酸文库；(B)(A)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一
核酸，包括最优化的定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)或合成连接再组装(SLR)；
(C)(A)或(B)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一核酸或变体，包括易错
PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)和其组合；或(D)(A)或(B)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一
核酸或变体，包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变、尿嘧啶-含有模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立和其组合。
一活性位点或第一底物结合位点的序列，所述方法包括以下步骤：(A)(a)提供编码第一活
性位点或第一底物结合位点的第一核酸，其中所述第一核酸序列包含本文提供的核酸，并
且所述核酸编码磷脂酶活性位点或磷脂酶底物结合位点；(b)提供一套诱变的寡核苷酸，
其编码在第一核酸中多个目标密码子处的天然发生的氨基酸变体；和，(c)使用该套诱变
的寡核苷酸，产生一套编码活性位点或编码底物结合位点的变体核酸，其在诱变处理的每
个氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变化，从而产生编码多个修饰的磷脂酶活性位点
或底物结合位点的核酸文库；(B)(A)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一
核酸，包括最优化的定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)或合成连接再组装(SLR)；
(C)(A)或(B)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一核酸或变体，包括易错
PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)和其组合；或(D)(A)或(B)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一
核酸或变体，包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变、尿嘧啶-含有模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立和其组合。
[0114] 在一个方面，制备小分子的方法包括以下步骤：(a)提供能够合成或修饰小分子的多种生物合成酶，其中酶中的一种包括由本文提供的核酸编码的磷脂酶；(b)提供步骤
(a)的至少一种酶的底物；和(c)在促进多种生物催化反应以通过一系列生物催化反应产
生小分子的条件下使步骤(b)的底物与酶反应。
(a)的至少一种酶的底物；和(c)在促进多种生物催化反应以通过一系列生物催化反应产
生小分子的条件下使步骤(b)的底物与酶反应。
[0115] 在另一个方面，修饰小分子的方法包括以下步骤：(A)(a)提供磷脂酶，其中所述酶包含本文提供的多肽或由本文提供的核酸编码的多肽；(b)提供小分子；和(c)在促进磷
脂酶催化的酶反应的条件下使步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子反应，从而通过磷脂酶反
应修饰小分子；(B)(A)的方法，包括步骤(a)的酶的多种小分子底物，从而生产通过磷脂酶催化的至少一个酶反应产生的修饰的小分子的文库；(C)(A)或(B)的方法，还包括在促进
酶的生物催化反应的条件下多种额外的酶，形成通过多个酶反应产生的修饰的小分子的文
库；(D)(C)的方法，还包括检测文库以确定表现出目标活性的特定修饰的小分子是否在文
库内的步骤；或(E)(D)的方法，其中所述测试文库的步骤还包括以下步骤系统地消除除了
用于在文库内产生多种修饰的小分子一部分的生物催化反应外的全部，通过对于有或没有
具有目标活性的特定修饰的小分子检测修饰的小分子的一部分，并鉴定产生具有目标活性
的特定修饰的小分子的至少一个特异性生物催化反应。
脂酶催化的酶反应的条件下使步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子反应，从而通过磷脂酶反
应修饰小分子；(B)(A)的方法，包括步骤(a)的酶的多种小分子底物，从而生产通过磷脂酶催化的至少一个酶反应产生的修饰的小分子的文库；(C)(A)或(B)的方法，还包括在促进
酶的生物催化反应的条件下多种额外的酶，形成通过多个酶反应产生的修饰的小分子的文
库；(D)(C)的方法，还包括检测文库以确定表现出目标活性的特定修饰的小分子是否在文
库内的步骤；或(E)(D)的方法，其中所述测试文库的步骤还包括以下步骤系统地消除除了
用于在文库内产生多种修饰的小分子一部分的生物催化反应外的全部，通过对于有或没有
具有目标活性的特定修饰的小分子检测修饰的小分子的一部分，并鉴定产生具有目标活性
的特定修饰的小分子的至少一个特异性生物催化反应。
[0116] 在另一个方面，测定磷脂酶的功能片段的方法包括以下步骤：(A)(a)提供磷脂酶，其中所述酶包含本文提供的多肽或由本文提供的核酸编码的多肽；和(b)从步骤(a)的
序列删除多个氨基酸残基并测试其余子序列的磷脂酶活性，从而测定磷脂酶的功能片段；
或，(B)(A)的方法，其中通过提供磷脂酶底物并且检测底物量减少或反应产物量增加来测
量磷脂酶活性。
序列删除多个氨基酸残基并测试其余子序列的磷脂酶活性，从而测定磷脂酶的功能片段；
或，(B)(A)的方法，其中通过提供磷脂酶底物并且检测底物量减少或反应产物量增加来测
量磷脂酶活性。
[0117] 在一个方面，通过使用实时代谢通量分析进行新或修饰的表型的整个细胞工程化的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过修饰细胞的遗传组合物制备修饰的细胞，其中所述遗传组合物通过向细胞中加入本文提供的核酸而修饰；(b)培养修饰的细胞以生产多种
修饰的细胞；(c)通过实时监测步骤(b)的细胞培养物测量细胞的至少一个代谢参数；和，
(d)分析步骤(c)的数据，以确定测得的参数是否不同于在相似条件下在未修饰的细胞中
的可比测量，从而使用实时代谢通量分析鉴定细胞中的工程化的表型；(B)(A)的方法，其
中所述细胞的遗传组合物通过以下方法修饰，包括细胞中的序列的缺失或序列的修饰，或
者，敲除基因表达；(C)(A)或(B)的方法，还包括选择包含新工程化的表型的细胞；或(D)
(C)的方法，还包括培养选择的细胞，从而生产包含新工程化的表型的细胞菌株。
修饰的细胞；(c)通过实时监测步骤(b)的细胞培养物测量细胞的至少一个代谢参数；和，
(d)分析步骤(c)的数据，以确定测得的参数是否不同于在相似条件下在未修饰的细胞中
的可比测量，从而使用实时代谢通量分析鉴定细胞中的工程化的表型；(B)(A)的方法，其
中所述细胞的遗传组合物通过以下方法修饰，包括细胞中的序列的缺失或序列的修饰，或
者，敲除基因表达；(C)(A)或(B)的方法，还包括选择包含新工程化的表型的细胞；或(D)
(C)的方法，还包括培养选择的细胞，从而生产包含新工程化的表型的细胞菌株。
[0118] 在一个实施方案中，转基因植物的制备方法包括以下步骤：(a)在植物细胞中引入异源核酸序列，其中所述异源核酸序列包括本文提供的核酸序列，从而生产转化的植物
细胞；和(b)从转化细胞生产转基因植物。在一个方面，步骤(a)还可以包括通过植物细胞
原生质体的电穿孔或微注射引入异源核酸序列。在另一个方面，步骤(a)还可以包括通过
DNA颗粒轰击直接向植物组织引入异源核酸序列。可选择地，步骤(a)还可以包括使用根瘤
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主在植物细胞DNA中引入异源核酸序列。在一个
方面，植物细胞可以是马铃著、玉米、水稻、小麦、烟草或大麦细胞。
细胞；和(b)从转化细胞生产转基因植物。在一个方面，步骤(a)还可以包括通过植物细胞
原生质体的电穿孔或微注射引入异源核酸序列。在另一个方面，步骤(a)还可以包括通过
DNA颗粒轰击直接向植物组织引入异源核酸序列。可选择地，步骤(a)还可以包括使用根瘤
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主在植物细胞DNA中引入异源核酸序列。在一个
方面，植物细胞可以是马铃著、玉米、水稻、小麦、烟草或大麦细胞。
[0119] 在一个实施方案中，在植物细胞中表达异源核酸序列的方法包括以下步骤：(a)使用可操作地连接到启动子的异源核酸序列转化植物细胞，其中所述异源核酸序列包括本
文提供的核酸；(b)在异源核酸序列能够在植物细胞中表达的条件下生长植物。
文提供的核酸；(b)在异源核酸序列能够在植物细胞中表达的条件下生长植物。
[0120] 在一个方面，本文提供的是洗涤剂组合物含有本文提供的磷脂酶多肽或由本文提供的核酸编码的磷脂酶多肽。在一个方面，磷脂酶是非表面活性的磷脂酶或表面活性的磷
脂酶。在另一个方面，磷脂酶配制成非水性液体组合物、流延固体、冻干粉末、颗粒形式、微粒形式、压片、小球、凝胶形式、糊剂、气雾剂或浆剂。
脂酶。在另一个方面，磷脂酶配制成非水性液体组合物、流延固体、冻干粉末、颗粒形式、微粒形式、压片、小球、凝胶形式、糊剂、气雾剂或浆剂。
[0121] 在一个实施方案中，用于洗涤目标物的方法包括以下步骤：(a)提供含有本文提供的磷脂酶多肽或由本文提供的核酸编码的多肽的组合物；(b)提供目标物；和(c)在所述
组合物能够洗涤目标物的条件下使步骤(a)的多肽与步骤(b)的目标物接触。
组合物能够洗涤目标物的条件下使步骤(a)的多肽与步骤(b)的目标物接触。
[0122] 在一个实施方案中，本文提供的是含有本文提供的磷脂酶多肽或由本文提供的核酸编码的多肽的组合物。
[0123] 在一个方面，改善、处理或预防脂多糖(LPS)介导的毒性的方法包括给予患者含有本文提供的多肽或由本文提供的核酸序列编码的多肽药物组合物。
[0124] 在另一个方面，本文提供的是含有本文提供的多肽或由本文提供的核酸编码的多肽的药物、药物前体和药物组合物。在另一个方面，本文提供的是制备药物、药物前体或药物组合物的方法，包括将由本文提供的核酸编码的多肽加到药物、药物前体或药物组合物
中。在一个方面，药物组合物用于预防、治疗或改善脂多糖(LPS)介导的毒性或用于内毒素解毒或从脂质A去酰基化2’或3’脂肪酸链。
中。在一个方面，药物组合物用于预防、治疗或改善脂多糖(LPS)介导的毒性或用于内毒素解毒或从脂质A去酰基化2’或3’脂肪酸链。
[0125] 在一个实施方案中，内毒素解毒的方法包括将内毒素与本文提供的多肽或由本文提供的核酸编码的多肽接触。
[0126] 在另一个实施方案中，制备在宿主细胞表达增加的变体磷脂酶编码序列的方法包括修饰本文提供的核酸，使得一个、几个或全部N-连接的糖基化位点编码基序被修饰成非
糖基化基序。
糖基化基序。
[0127] 在一个实施方案中，本文提供的是含有磷脂酶混合物的组合物，包括：(a)(i)本文提供的磷脂酶多肽或由本文提供的核酸编码的多肽，和(ii)至少一个第二种酶；(b)(a)
的组合物，其中所述至少一种酶是磷脂酶；或(c)(b)的组合物，其中所述至少一个第二种
磷脂酶包括SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4所示的多肽，或表8和9所示的至少一个变
体PLC酶。
的组合物，其中所述至少一种酶是磷脂酶；或(c)(b)的组合物，其中所述至少一个第二种
磷脂酶包括SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4所示的多肽，或表8和9所示的至少一个变
体PLC酶。
[0128] 在一个方面，制备生物燃料的方法，例如，生物柴油，包括以下步骤：(A)(a)提供本文提供的磷脂酶多肽，或由本文提供的核酸编码的磷脂酶，或包含本文提供的多肽的组合物；(b)提供含有脂质或烷基酯的组合物；(c)使(a)的磷脂酶多肽与(b)的组合物接触；
(B)(A)的方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含油和/或脂肪；或(C)(A)或
(B)的方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含藻类、植物油、直链植物油、原始植物油、废植物油、动物脂肪、油脂、牛油、猪油或黄油脂。在另一个方面，本文提供的是通过包括以下步骤的方法制备的燃料，例如，生物燃料，例如，生物柴油：(A)(a)提供本文提供的磷脂酶多肽，或由本文提供的核酸编码的磷脂酶，或包含本文提供的多肽的组合物；(b)提供含有脂质或烷基酯的组合物；(c)使(a)的磷脂酶多肽与(b)的组合物接触；(B)(A)的
方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含油和/或脂肪；或(C)(A)或(B)的方
法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含藻类、植物油、直链植物油、原始植物油、废植物油、动物脂肪、油脂、牛油、猪油或黄油脂。
(B)(A)的方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含油和/或脂肪；或(C)(A)或
(B)的方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含藻类、植物油、直链植物油、原始植物油、废植物油、动物脂肪、油脂、牛油、猪油或黄油脂。在另一个方面，本文提供的是通过包括以下步骤的方法制备的燃料，例如，生物燃料，例如，生物柴油：(A)(a)提供本文提供的磷脂酶多肽，或由本文提供的核酸编码的磷脂酶，或包含本文提供的多肽的组合物；(b)提供含有脂质或烷基酯的组合物；(c)使(a)的磷脂酶多肽与(b)的组合物接触；(B)(A)的
方法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含油和/或脂肪；或(C)(A)或(B)的方
法，其中所述含有脂质或烷基酯的组合物是或包含藻类、植物油、直链植物油、原始植物油、废植物油、动物脂肪、油脂、牛油、猪油或黄油脂。
[0129] 在另一个方面，可溶干酒糟(DDS)、干酒糟(DDG)、酒糟残液(CDS)、湿酒糟(DWG)或含可溶物的蒸馏干燥颗粒(DDGS)包含本文提供的多肽，或由本文提供的核酸编码的多肽，或本文提供的组合物。
[0130] 在另一个实施方案中，本文提供的是生物质，其包含(a)本文提供的多肽，或由本文提供的核酸编码的多肽，或本文提供的组合物；(b)(a)的生物质，其中所述生物质是或包含动物、藻类和/或植物生物质、或含脂质的或木质纤维素生物质、或废料。
[0131] 在另一个实施方案中，本文提供的是石油基产品，包含：
[0132] (a)本文提供的多肽，或由本文提供的核酸编码的多肽，或本文提供的组合物；(b)通过包括使用本文提供的多肽、或由本文提供的核酸编码的多肽、或本文提供的组合物的方法制备；或(c)(a)或(b)的石油基产品，包括油、生物柴油或汽油，或生物乙醇、生物丁醇、生物丙醇或生物甲醇；或者生物乙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇和/或生物柴油和汽油的混合物。
[0133] 在一个实施方案中，本文提供的是使脂质基质内的非水化磷脂(NHP)水合的方法，通过能够使NHP迁移到油-水界面。然后，使NHP反应和/或从脂质除去。在一个实施
方案中，所述方法包括：a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；和b)混
合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物。在某些实施方案中，步骤a)和/或
b)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案
中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm
的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或
b)中的混合产生包含至少约60、70、80、90、93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约
20μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案中，所述方法，还包括用水或酶使所述反
应混合物脱胶，得到脱胶油。在某些实施方案中，使用高剪切混合器进行步骤a)和/或b)
中的混合，尖端速度至少为约1400cm/s、1600cm/s、1800cm/s、2000cm/s、2100cm/s、2300cm/s、2500cm/s、3000cm/s或3500cm/s。
方案中，所述方法包括：a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；和b)混
合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物。在某些实施方案中，步骤a)和/或
b)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案
中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm
的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或
b)中的混合产生包含至少约60、70、80、90、93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约
20μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案中，所述方法，还包括用水或酶使所述反
应混合物脱胶，得到脱胶油。在某些实施方案中，使用高剪切混合器进行步骤a)和/或b)
中的混合，尖端速度至少为约1400cm/s、1600cm/s、1800cm/s、2000cm/s、2100cm/s、2300cm/s、2500cm/s、3000cm/s或3500cm/s。
[0134] 本领域技术人员认为适合的任何酸都可以用在本文提供的方法中。在某些实施方案中，所述酸选自磷酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和其混合物。本领域技术人员认为适合的任何碱都可以用在本文提供的方法中。在某些实施方案中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、硅酸钠、碳酸钠、碳酸钙和其组合。
[0135] 在某些实施方案中，水合食用油中的非水化磷脂的方法还包括水或酶脱胶得到脱胶油的步骤。在一个实施方案中，本文提供的是其中使NHP水合、然后酶处理并除去各种磷脂和卵磷脂的方法。所述方法可以针对粗制或水脱胶油实施。
[0136] 在某些实施方案中，本文提供的油脱胶方法包括：a)混合水性酸与食用油，得到pH约1～4的酸性混合物，b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，和
c)用水或酶使所述反应混合物脱胶，得到脱胶油。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中
的混合产生包含液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案中，步骤
a)和/或b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相
的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。
c)用水或酶使所述反应混合物脱胶，得到脱胶油。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中
的混合产生包含液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案中，步骤
a)和/或b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相
的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。
[0137] 在一个实施方案中，本文提供的是从植物油中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂(统称为“胶”)以制造可用于食物生产和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品的方法。在某些实
施方案中，本文提供的脱胶方法利用水、各种酸和/或各种碱或其组合。
施方案中，本文提供的脱胶方法利用水、各种酸和/或各种碱或其组合。
[0138] 在另一个方面，本文提供的是增强酶脱胶方法中使用的磷脂酶的反应速率的方法，使得酶反应的持续时间小于约1小时。
[0139] 在另一个方面，本文提供的是使油组合物脱胶的方法，其中水化和非水化磷脂在一个步骤中被处理，其中酶反应在小于约1小时内完成。
[0140] 在一个实施方案中，本文提供的是水解、破裂或分裂含有磷脂的组合物的方法，包括：
[0141] (A)(a)提供磷脂酶多肽；(b)提供含有磷脂的组合物；和(c)在所述磷脂酶水解、破裂或分裂所述含有磷脂的组合物的条件下使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触；
[0142] (B)(A)的方法，其中所述组合物包括含有磷脂的脂质双层或膜；或
[0143] (C)(A)或(B)中任一个的方法，其中所述组合物包含植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。
[0144] 在一个实施方案中，本文提供的是液化或除去含有磷脂的组合物的方法，包括：
[0145] (a)提供磷脂酶多肽；
[0146] (b)提供含有磷脂的组合物；和
[0147] (c)在所述磷脂酶除去或液化所述含有磷脂的组合物的条件下使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。
[0148] 在一个实施方案中，本文提供的是纯化植物甾醇或三萜烯的方法，包括：
[0149] (AI)(AIa)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
[0150] (AIb)提供含有植物甾醇或三萜烯的组合物；和
[0151] (AIc)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(AIa)的多肽与步骤(AIb)的组合物接触；
[0152] (BI)(AI)的方法，其中所述植物甾醇或三萜烯包括植物甾醇；
[0153] (CI)(BI)的方法，其中所述植物甾醇衍生于植物油；
[0154] (DI)(EI)的方法，其中所述植物油包括椰子油、芥花油、可可油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、衍生于米糠的油、红花油、芝麻油、大豆油或葵花籽油；
[0155] (EI)(AI)～(DI)中任一个的方法，还包括使用非极性溶剂定量提取游离植物甾醇和植物甾醇基脂肪酸酯；或
[0156] (FI)(EI)的方法，其中所述植物甾醇或三萜烯包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾烷醇、谷甾烷醇、链甾醇、海绵甾醇、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇或菜籽甾醇。
[0157] 在一个实施方案中，本文提供的是精制油或脂肪的方法，包括：
[0158] (A1)(A1a)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
[0159] (A1b)提供含有具有磷脂的油或脂肪的组合物；和
[0160] (A1c)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(A1a)的多肽与步骤(A1b)的组合物接触；
[0161] (B1)(A1)的方法，其中所述多肽处于被加到所述组合物中的水溶液中；
[0162] (C1)(B1)的方法，其中水量为约0.5～5％；
[0163] (D1)(A1)～(C1)中任一个的方法，其中处理时间小于约2小时；
[0164] (E1)(A1)～(C1)中任一个的方法，其中处理时间小于约60分钟；
[0165] (F1)(A1)～(C1)中任一个的方法，其中处理时间小于约30分钟、小于约15分钟或小于约5分钟；
[0166] (G1)(A1)～(F1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括约25℃～70℃的温度；
[0167] (H1)(A1)～(G1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括使用碱；
[0168] (I1)(A1)～(H1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括约pH 3～pH 10的pH；
[0169] (J1)(A1)～(I1)中任一个的方法，其中所述水解条件包括加入乳化剂和/或在步骤(A1)(A1c)的接触之后的混合；
[0170] (K1)(A1)～(J1)中任一个的方法，包括加入破乳剂和/或加热或冷却，以促进水相分离；
[0171] (L1)(A1)～(K1)中任一个的方法，包括在接触步骤之前脱胶以通过离心收集卵磷脂，然后加入PLC、PLC和/或PLA以除去非水化磷脂；
[0172] (M1)(A1)～(L1)中任一个的方法，包括对于食用油的粗制油水脱胶至小于10ppm的磷，然后对于生物柴油物理精制到小于约50ppm的磷；或
[0173] (N1)(A1)～(M1)中任一个的方法，包括加入酸以促进非水化磷脂的水合。
[0174] 在一个实施方案中，本文提供的是使油或脂肪脱胶的方法，包括：
[0175] (a1)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
[0176] (b1)提供含有具有磷脂的脂肪或油的组合物；和
[0177] (c1)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(a1)的多肽与步骤(b1)的组合物接触。
[0178] 在一个实施方案中，本文提供的是物理精制含有磷脂的组合物的方法，包括：
[0179] (A-1)(A-1a)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
[0180] (A-1b)提供含有磷脂的组合物；和
[0181] (A-1c)在物理精制之前、期间或之后使步骤(A-1a)的多肽与步骤(A-1b)的组合物接触；
[0182] (B-1)(A-1)的方法，其中所述多肽在物理精制之前加入，所述含有磷脂的组合物包含植物，并且所述多肽在所述植物中转基因地表达，所述多肽在种子或其他植物部分的
破碎过程中加入，或者，所述多肽在破碎之后或在精制之前加入；
破碎过程中加入，或者，所述多肽在破碎之后或在精制之前加入；
[0183] (C-1)(A-1)的方法，其中所述多肽在物理精制期间加入；
[0184] (D-1)(A-1)的方法，其中所述多肽在物理精制之后加入：在分离之前在剧烈混合器或保持混合器中；在加热步骤之后；在离心机中；在皂料中；在洗涤水中；或，在漂白或除臭步骤期间；或
[0185] (E-1)(A-1)～(D-1)中任一个的方法，还包括加入磷脂酶A(PLA)、磷脂酶B(PLB)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)或磷酸酶，或其任意组合。
[0186] 在一个实施方案中，本文提供的是对含有磷脂的组合物进行碱精制的方法，包括：
[0187] (A1)(A1a)提供含有具有磷脂酶活性的多肽的组合物；
[0188] (A1b)提供含有磷脂的组合物；和
[0189] (A1c)在碱精制之前、期间或之后使步骤(A1a)的多肽与步骤(A1b)的组合物接触；
[0190] (B1)(A1)的方法，其中所述多肽在加入酸或碱之前加入；
[0191] (C1)(A1)～(B1)中任一个的方法，其中所述多肽在碱精制期间加入，并且取决于磷水平和游离脂肪酸水平加入不同水平的酸和碱；或
[0192] (D1)(A1)～(B1)中任一个的方法，其中所述多肽在碱精制之后加入：在分离之前在剧烈混合器或保持混合器中；在加热步骤之后；在离心机中；在皂料中；在洗涤水中；或，在漂白或除臭步骤期间；
[0193] (E1)(A1)～(D1)中任一个的方法，其中碱精制条件通过加入浓碱溶液产生，或其中碱精制条件包括使用比11％的工业标准更浓的浓碱溶液，或其中碱精制条件包括使用浓
缩了约12％～50％的浓碱溶液；
缩了约12％～50％的浓碱溶液；
[0194] (F1)(A1)～(E1)中任一个的方法，其中所述含有磷脂的组合物包括植物；
[0195] (G1)(A1)～(F1)中任一个的方法，其中所述多肽在所述植物中转基因地表达；
[0196] (H1)(A1)～(G1)中任一个的方法，其中所述多肽种子或其他植物部分的破碎期间加入，或者，所述多肽在破碎之后或在精制之前加入；或
[0197] (I1)(A1)～(H1)中任一个的方法，包括如图10所示的方法；或如图10所示的方法，其中加入足量酸以促进钙和镁金属含量的降低。
[0198] 在一个实施方案中，本文提供的是从脂质A使2’或3’脂肪酸链脱去酰基的方法，包括使脂质A与磷脂酶多肽接触。
[0199] 在一个实施方案中，本文提供的是通过减少的油截留来减少胶质并提高中性油(甘油三酯)量的方法，包括：
[0200] (A1)(A1a)提供含有磷脂酶多肽的组合物；
[0201] (A1b)提供含有具有磷脂的脂肪或油的组合物；和
[0202] (A1c)在所述多肽能够催化所述组合物中的磷脂水解的条件下使步骤(A1a)的多肽与步骤(A1b)的组合物接触足以减少胶质并提高中性油的时间；
[0203] (B1)(A1)的蛋白制剂，其中所述蛋白制剂包括含有非水液体组合物的制剂、流延固体、粉末、冻干粉末、颗粒形式、微粒形式、压片、小球、丸剂、凝胶形式、水凝胶、糊剂、气雾剂、喷雾剂、洗液、浆剂、水/油乳剂、乳膏、胶囊、囊泡或胶束的悬液；或，
[0204] (C1)(A1)或(B1)的方法，包括对所述组合物使用高剪切混合，然后与本发明的具有磷脂酶活性的至少一种多肽无剪切混合或低剪切混合，从而允许磷脂底物与磷脂酶充分
接触。
接触。
[0205] 在一个实施方案中，本文提供的是通过本文提供的方法生产的油或脂肪。
[0206] 本文提供的方法中使用的酶包括具有磷脂酶活性的酶。磷脂酶活性包括例如磷脂酶C(PLC)活性、磷脂酶A(PLA)活性(包括磷脂酶A1或磷脂酶A2活性)、磷脂酶B(PLB)活
性(包括磷脂酶B1或磷脂酶B2活性)、磷脂酶D(PLD)活性(包括磷脂酶D1或磷脂酶D2
活性)。在一个实施方案中，本文中使用的酶包括具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)
或等效酶活性和/或另一种磷脂酶活性的多肽，包括磷脂酶A、B、C、D、patatin、磷脂酸磷酸酶(PAP)和/或脂酰水解酶(LAH)或等效酶活性。
性(包括磷脂酶B1或磷脂酶B2活性)、磷脂酶D(PLD)活性(包括磷脂酶D1或磷脂酶D2
活性)。在一个实施方案中，本文中使用的酶包括具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)
或等效酶活性和/或另一种磷脂酶活性的多肽，包括磷脂酶A、B、C、D、patatin、磷脂酸磷酸酶(PAP)和/或脂酰水解酶(LAH)或等效酶活性。
[0207] 在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的酶选自磷脂酶A、磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C或其组合。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的酶选自磷脂
酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C或其组合。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的
酶是本文中所述的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的酶选自磷脂酶C和包含SEQ ID NO：8的酶。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用
的酶是包含SEQ ID NO：8的酶。
酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C或其组合。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的
酶是本文中所述的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的酶选自磷脂酶C和包含SEQ ID NO：8的酶。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用
的酶是包含SEQ ID NO：8的酶。
[0208] 在另一个实施方案中，本文提供的是一种从食用油获得磷脂的方法。在某些实施方案中，通过本文提供的方法获得的磷脂包括各种磷脂，包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)、
磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱
(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酸(LPA)、胆碱(C)、乙醇胺(E)、丝氨酸(S)和肌醇(I)。
磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱
(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酸(LPA)、胆碱(C)、乙醇胺(E)、丝氨酸(S)和肌醇(I)。
[0209] 在另一个实施方案中，本文提供的是从食用油获得胆碱(C)、乙醇胺(E)、丝氨酸(S)或肌醇(I)的方法。
[0211] 在此引用的全部出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏在此出于各种目的而明确引入作为参考。
附图说明
[0212] 以下附图是对本发明的实施方案进行的解释，其并不意味着对权利要求的范围进行限制。
[0213] 图1示意性地示出使用本发明的磷脂酶的示例性植物油精制过程。
[0214] 图2示意性地示出对于物理精制油本发明的示例性脱胶方法，下面详细讨论。
[0215] 图3示意性地示出使用本发明的磷脂酶C的磷脂水解，下面详细讨论。
[0216] 图4示意性地示出本发明的示例性碱精制过程，并示出可选实施方案，包括使用本发明的磷脂酶C作为“碱精制助剂”(长混合碱精制)，下面详细讨论。
[0217] 图5示意性地示出使用本发明的磷脂酶C作为脱胶助剂，下面详细讨论。
[0218] 图6示意性地示出本发明的示例性碱精制过程，并示出可选实施方案包括使用本发明的磷脂酶C作为“碱精制助剂”(长混合碱精制)，下面详细讨论。
[0219] 图7示出本发明方法的另一种变型，其中在该方法中使用2个离心步骤，下面详细讨论。
[0220] 图8示出本发明方法的另一种变型，其中在该方法中使用3个离心步骤，下面详细讨论。
[0221] 图9示出该方法的另一种示例性变型，在脱胶步骤之前使用酸处理和具有离心步骤，下面详细讨论。
[0222] 图10示出各磷脂(PL)种类磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰胆碱(PC)相对于在用本发明的突变磷脂酶处理后剩余的PL的重量分数。
[0223] 图11示出被选择包含在基因再组装文库中的“基因位点饱和诱变”或“GSSM”向上突变，其包含本发明的示例性磷脂酶。
[0224] 图12示出可以组合使用本发明的酶的示例性醇处理。
[0225] 图13提供对照例中回收的湿胶的磷脂组成。
[0226] 图14提供对照例与使用本文提供的方法的实施例的磷脂比较，其中中步骤b)的pH被调节到pH 7.0。
[0227] 图15并排比较了在对照中性pH反应与在pH 7.0下pH调节反应中的中性油损失到胶相中。
[0228] 图16比较了在利用磷脂酶A1时各种pH条件下中性油损失到胶相中。
[0229] 图17示出根据实施例17A的方法获得的水相的液滴分布。
[0230] 图18示出根据实施例17B的方法获得的水相的液滴分布。
[0231] 图19示出根据实施例17C的方法获得的水相的液滴分布。
[0232] 图20示出根据实施例17D的方法获得的水相的液滴分布。
[0233] 图21示出根据实施例17A、17B、17C和17D的方法获得的水相的比较液滴分布。
[0234] 在各附图中的相似图标表示相似组成要素。
具体实施方式
[0235] 本文提供的是具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或等效酶活性和/或另一种磷脂酶活性的多肽和多核苷酸编码多肽，包括磷脂酶A、B、C、D、patatin、磷脂酸磷酸酶(PAP)和/或脂酰水解酶(LAH)或等效酶活性，以及编码它们的多核苷酸、与其特异性结合
的抗体和制备和使用它们的方法。
的抗体和制备和使用它们的方法。
[0236] 在一个实施方案中，本发明的多肽的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性包括：
[0237] 1-磷脂酰-1D-myo-肌醇4，5-二磷酸(也称作PIP2，磷脂酰肌醇二磷酸)+ 肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3，肌醇三磷酸)+二酰基甘油。
[0238] 在可选实施方案中，本发明的酶可以有效地裂解油中的甘油磷酸酯酯键，如植物油，例如，油籽磷脂，从而产生水可提取的磷酸化碱和甘油二酯。
[0239] 在可选实施方案中，本发明的磷脂酶具有脂酰水解酶(LAH)活性；或可以裂解磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸和/或鞘磷脂中的甘油磷酸酯酯键，或这些活性的组合。例如，在一个方面，本发明的磷脂酶对于一种或多种特异性底物是特异性的，例如，本发明的酶可以对于PE和PC；PE和PI；PE和PS；
PS和PC；PS和PI；PI和PC；PS、PI和PC；PE、PI和PC；PC、PE和PS；PE、PS和PI；或，PE、PS、PI和PC具有作用特异性。
PS和PC；PS和PI；PI和PC；PS、PI和PC；PE、PI和PC；PC、PE和PS；PE、PS和PI；或，PE、PS、PI和PC具有作用特异性。
[0240] 在可选实施方案中，本发明的磷脂酶(例如，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶或等效活性)可以用于油的酶脱胶，例如，粗制油，因为磷酸盐部分是溶于水的并且易于除去。甘油二酯产物将保持在油中，因此将减少损失。除了或代替市售油脱胶中的PLA1和
PLA2之外，还可以使用本发明的PLC如在 过程中，其中通过PLA1和PLA2使
磷脂水解。
PLA2之外，还可以使用本发明的PLC如在 过程中，其中通过PLA1和PLA2使
磷脂水解。
[0241] 在可选实施方案中，本发明的磷脂酶在高温度下和/或在低温度下是活性的，或者，在宽范围温度内是活性的，例如，在20℃～90℃、30℃～80℃或40℃～70℃的温度范围内可以是活性的。本发明还提供在碱性pH或酸性pH具有活性的磷脂酶，例如，低水酸度。
在可选方面，本发明的磷脂酶可以在低至pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0或更大酸性(即，＜pH 2.0)的酸性pH下具有活性。在可
选方面，本发明的磷脂酶可以在高至pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0、pH 9.5、pH 10.0或更大碱性(即，＞pH 10.0)下具有活性。在一个方面，本发明的磷脂酶在约40℃～约70℃、
75℃或80℃或更高的温度范围内是活性的，在低水活性(低水含量)的条件下。
在可选方面，本发明的磷脂酶可以在低至pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0或更大酸性(即，＜pH 2.0)的酸性pH下具有活性。在可
选方面，本发明的磷脂酶可以在高至pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0、pH 9.5、pH 10.0或更大碱性(即，＞pH 10.0)下具有活性。在一个方面，本发明的磷脂酶在约40℃～约70℃、
75℃或80℃或更高的温度范围内是活性的，在低水活性(低水含量)的条件下。
[0242] 本发明还提供制备PLC和/或改变本发明的示例性磷脂酶的活性以产生具有可选目标性能的酶的方法，例如，具有可选底物的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性，或在各种环境条件的活性，例如，不同温度、pH等。例如，通过本发明的方法产生的磷脂酶可以具有改变的底物特异性、底物结合特异性、底物裂解方式、热稳定性、pH/活性分布、pH/稳定性分布(如，在低例如pH＜6或pH＜5或高例如pH＞9的pH值下稳定性增大)、朝
向氧化的稳定性、Ca2+依赖性、特定活性等。本发明提供改变任何目标性能的方法。例如，改变可以导致与亲代磷脂酶相比具有改变的pH和温度活性分布的变体。
向氧化的稳定性、Ca2+依赖性、特定活性等。本发明提供改变任何目标性能的方法。例如，改变可以导致与亲代磷脂酶相比具有改变的pH和温度活性分布的变体。
[0243] 在可选实施方案中，本发明的磷脂酶用在各种油处理步骤中，如在油提取中，例如，在被称作“油脱胶”的方法中除去“磷脂胶”，如在此所述的。本发明提供处理油(例如，粗制油)和从各种来源(如米糠油、大豆、油菜籽、花生、芝麻、向日葵和玉米)生产油(例
如，植物油)的组合物(例如，包含本发明的酶)和方法。本发明的磷脂酶可以在任何植物
油处理步骤中用于代替PLA，例如，磷脂酶A2。
如，植物油)的组合物(例如，包含本发明的酶)和方法。本发明的磷脂酶可以在任何植物
油处理步骤中用于代替PLA，例如，磷脂酶A2。
[0244] 在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的适合酶包括一种或多种磷脂酶A(PLA)酶、磷脂酶C(PLC)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶或其组合。PLA酶包括磷
脂酶A1(PLA1)和/或磷脂酶A2(PLA2)。
脂酶A1(PLA1)和/或磷脂酶A2(PLA2)。
[0245] 在此使用的，“粗制油”(也称作非脱胶油)是指来自例如植物来源的压制或提取油或其混合物，包括但不限于巴西莓油、杏仁油、巴巴苏仁油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、芥花油、腰果油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻仁油、葡萄籽油、榛子油、其他坚果油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻籽油、夏威夷核果油、芒果仁油、绣线菊油、芥末油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、山核桃油、松仁油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、乳木果油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、tsubaki油、核桃油、经由遗传修饰的微生物(GMO)或传统的“育种”而具有改变的脂肪酸组成的“天然”油种类如高油酸、低亚麻酸或低饱和油(高油酸芥花油、低亚麻酸大豆油或高硬脂酸葵花籽油)。本文提供的方法中适合使用的进一步示例性的油在本文中
到处有记载。在某些实施方案中，粗制油中的总磷脂含量可以为0.5-3％w/w，相应的磷含
量为200-1200ppm或250-1200ppm。
到处有记载。在某些实施方案中，粗制油中的总磷脂含量可以为0.5-3％w/w，相应的磷含
量为200-1200ppm或250-1200ppm。
[0246] 在此使用的，“脱胶油”是指在从油中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂(统称为“胶”)以制造可用于食物生产和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品后获得的油。各种脱胶方法是本领域已知的并且上面描述了。在某些实施方案中，脱胶油的磷脂含量小于约200ppm的
磷、小于约150ppm的磷、小于约100ppm的磷、小于约50ppm的磷、小于约40ppm的磷、小于
约30ppm的磷、小于约20ppm的磷、小于约15ppm的磷、小于约10ppm的磷、小于约7ppm的
磷、小于约5ppm的磷、小于约3ppm的磷或小于约1ppm的磷。
磷、小于约150ppm的磷、小于约100ppm的磷、小于约50ppm的磷、小于约40ppm的磷、小于
约30ppm的磷、小于约20ppm的磷、小于约15ppm的磷、小于约10ppm的磷、小于约7ppm的
磷、小于约5ppm的磷、小于约3ppm的磷或小于约1ppm的磷。
[0247] 在此使用的，术语“非水化磷脂”或“NHP”是指磷脂酸和磷脂酸的盐，例如，磷脂酸的钙、镁和铁盐；和乙醇胺的钙、镁和铁盐。
[0248] 在此使用的，“水脱胶油”是指水脱胶处理后获得的油。在某些实施方案中，通过混合1-3％w/w的热水与温粗制油(60-90℃)达30-60分钟获得水脱胶油。在某些实施方案中，水脱胶步骤除去磷脂和在水合时不溶于油的粘胶。可以通过沉降、过滤或离心将水合磷脂和胶与油分离。
[0249] 生产和操作核酸
[0250] 本发明提供分离的、合成的和重组的核酸(例如，示例性的SEQ ID NO：5和编码SEQ ID NO：6的核酸)，其包含(和具有)表12～15中所示的一种或多种氨基酸残基变化
(例如，突变)，包括表达框如表达载体、编码本发明的多肽和磷脂酶。本发明还包括使用本发明的核酸发现新磷脂酶序列的方法。还提供的是修饰本发明的核酸的方法，例如，通过合成连接再组装、最优化的定向进化系统和/或饱和诱变。
(例如，突变)，包括表达框如表达载体、编码本发明的多肽和磷脂酶。本发明还包括使用本发明的核酸发现新磷脂酶序列的方法。还提供的是修饰本发明的核酸的方法，例如，通过合成连接再组装、最优化的定向进化系统和/或饱和诱变。
[0251] 可以通过例如cDNA文库的克隆和表达、PCR对信使或基因组DNA的扩增等来制备、分离和/或操作本发明的核酸。在本发明实施的方法时，可以通过操作模板核酸修饰同源
基因，如在此所述的。本发明可以使用本领域已知的任何方法或方案或装置实施，这些充分记载于科技和专利文献中。
基因，如在此所述的。本发明可以使用本领域已知的任何方法或方案或装置实施，这些充分记载于科技和专利文献中。
[0252] 在可选实施方案中，本发明的基因序列或用于实施本发明的基因，包括参与生产多肽链的DNA片段，尤其包括编码区域之前和之后的区域，如前导和末端序列、启动子和增强子，以及在适用时在各编码片段(外显子)之间的干预序列(内含子)。
[0253] 在可选实施方案中，本发明或用于实施本发明的核酸或核酸序列可以包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸、或这些中任一种的片段、可以是单链或双链且可以代表正义或反义链的基因组或合成来源的DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA、iRNA)、肽核酸(PNA)，或任何天然或合成来源的DNA-样或RNA-样材料，包括例如iRNA(“干扰”RNA)、核糖核蛋白
(例如，双链iRNA，例如，iRNP)。该术语包括核酸，即，寡核苷酸，其含有天然核苷酸的已知类似物。在可选实施方案中，本发明或用于实施本发明的核酸或核酸序列还包括具有合
成骨架的核酸-样结构，参见，例如，Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；
Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Drug Dev 6：153-156。
(例如，双链iRNA，例如，iRNP)。该术语包括核酸，即，寡核苷酸，其含有天然核苷酸的已知类似物。在可选实施方案中，本发明或用于实施本发明的核酸或核酸序列还包括具有合
成骨架的核酸-样结构，参见，例如，Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；
Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Drug Dev 6：153-156。
[0254] 一般技术
[0255] 用于实施本发明的核酸，不论是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂交物，均可以分离自多种来源，可以是基因工程化的、扩增的、和/或重组表达/产生的核酸。从这些核酸产生的重组多肽可以被单独分离或克隆，并检测其目标活性。可以使用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、真菌、昆虫或植物细胞表达系统。
[0256] 可选择地，这些核酸可以通过公知的化学合成技术进行体外合成，例如记载在Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acid Res.25：3440-3444；
Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33：
7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；
Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利No.4,458,066中。
Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33：
7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；
Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利No.4,458,066中。
[0257] 核酸操作技术，例如，亚克隆、标记探针(例如，用Klenow聚合酶进行随机引物标记、缺口翻译、扩增)、测序、杂交等在科技和专利文献中已有详细描述，参见，例
如，Sambrook，ed.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，
Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic acid probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
如，Sambrook，ed.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，
Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic acid probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
[0258] 获得和操作实施本发明的方法的核酸的另一种有效方式是对基因组样品进行克隆，并且如果需要的话对从例如基因组克隆或cDNA克隆中分离或扩增的插入物进行筛选
和再克隆。本发明的方法中使用的核酸来源包括基因组或cDNA文库，其包含于例如哺乳动
物人工染色体(MAC)中，参见，例如，美国专利No.5,721,118；6,025,155；人的人工染色体，参见，例如，Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，参见，例如，Woon(1998)Genomics 50：306-316；P1-衍生的载体(PAC)，参见，例如，Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；粘粒；重组病毒；噬菌体或质粒。
和再克隆。本发明的方法中使用的核酸来源包括基因组或cDNA文库，其包含于例如哺乳动
物人工染色体(MAC)中，参见，例如，美国专利No.5,721,118；6,025,155；人的人工染色体，参见，例如，Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，参见，例如，Woon(1998)Genomics 50：306-316；P1-衍生的载体(PAC)，参见，例如，Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；粘粒；重组病毒；噬菌体或质粒。
[0259] 在一个方面，编码本发明的多肽的核酸在合适的阶段被组装，从而前导序列能够引导翻译的多肽或其片段的分泌。
[0260] 本发明提供融合蛋白和编码它的核酸。本发明的多肽可以融合于异源肽或多肽，例如提供诸如增加的稳定性或简化的纯化等目标特性的N-端鉴别肽。本发明的肽和多肽
也可以与一个或更个额外的结构域相连接作为融合蛋白进行合成和表达，用于例如生产更
加具有免疫原性的肽、更容易分离重组合成的肽、鉴定和分离抗体和抗体-表达B细胞等
等。便于检测和纯化的结构域包括例如允许在固定化金属上纯化的金属螯合肽(例如聚组
氨酸束和组氨酸-色氨酸模块)、允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域、以及用
于FLAGS扩展/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)中的结构域。在纯化结构域
和含有基序的肽或多肽之间加入可裂解的接头序列，例如因子Xa或肠激酶(Invitrogen，
San Diego CA)，能够有利于纯化。例如，表达载体可以包括连接到六个组氨酸残基、然后连接到硫氧还蛋白和肠激酶裂解位点的表位-编码核酸序列(参见例如，Williams(1995)
Biochemistry 34：1787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12：404-414)。组氨酸残基有利于检测和纯化，肠激酶裂解位点提供了从剩余的融合蛋白中纯化表位的方法。关
于编码融合蛋白的载体的技术和融合蛋白的应用在科技和专利文献中已有详细描述，参见
例如，Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12：441-53。
也可以与一个或更个额外的结构域相连接作为融合蛋白进行合成和表达，用于例如生产更
加具有免疫原性的肽、更容易分离重组合成的肽、鉴定和分离抗体和抗体-表达B细胞等
等。便于检测和纯化的结构域包括例如允许在固定化金属上纯化的金属螯合肽(例如聚组
氨酸束和组氨酸-色氨酸模块)、允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域、以及用
于FLAGS扩展/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)中的结构域。在纯化结构域
和含有基序的肽或多肽之间加入可裂解的接头序列，例如因子Xa或肠激酶(Invitrogen，
San Diego CA)，能够有利于纯化。例如，表达载体可以包括连接到六个组氨酸残基、然后连接到硫氧还蛋白和肠激酶裂解位点的表位-编码核酸序列(参见例如，Williams(1995)
Biochemistry 34：1787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12：404-414)。组氨酸残基有利于检测和纯化，肠激酶裂解位点提供了从剩余的融合蛋白中纯化表位的方法。关
于编码融合蛋白的载体的技术和融合蛋白的应用在科技和专利文献中已有详细描述，参见
例如，Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12：441-53。
[0261] 转录和翻译的调控序列
[0262] 本发明提供可操作地连接到表达(例如，转录或翻译)调控序列(例如，启动子或增强子)以引导或调控RNA合成/表达的本发明的核酸(例如，DNA)序列。表达调控序列
可以位于表达载体中。示例性的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。
示例性的真核启动子包括CMV即刻早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的
LTR、以及小鼠金属硫蛋白I。
可以位于表达载体中。示例性的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。
示例性的真核启动子包括CMV即刻早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的
LTR、以及小鼠金属硫蛋白I。
[0263] 适于在细菌中表达多肽的启动子包括大肠杆菌lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子、λPL启动子、编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK))操作子的启动子、以及酸性磷酸酶启动子。真核启动子
包括CMV即刻早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热休克启动子、早期和晚期SV40启动子、
逆转录病毒的LTR、以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。还可以使用原核或真核细胞或其病毒
中调控基因表达的其他已知启动子。
包括CMV即刻早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热休克启动子、早期和晚期SV40启动子、
逆转录病毒的LTR、以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。还可以使用原核或真核细胞或其病毒
中调控基因表达的其他已知启动子。
[0264] 表达框、载体和克隆载体
[0265] 本发明提供包含本发明的核酸的表达载体和克隆载体，例如，编码本发明的磷脂酶的序列。本发明的表达载体和克隆载体可以包括病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、fosmid、细菌人工染色体、病毒DNA(例如，牛痘、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病和SV40的衍生物)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体、和任何其他针
对目标特异性宿主(例如芽孢杆菌、曲霉菌和酵母)的特异性载体。本发明的载体可以
包括染色体、非染色体和合成DNA序列。大量的合适载体是本领域技术人员已知的，以及
可市售购得。示例性的载体包括：细菌：pQE载体(Qiagen，San Diego，CA)，pBluescript质粒(Stratagene，San Diego，CA)、pNH载 体、(λ-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、
pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真 核：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，任何其他质粒或其他载体都可以使用，只要其在宿主中是可复制和能存活的。本发明可以使用低拷贝数或高拷贝数载体。
对目标特异性宿主(例如芽孢杆菌、曲霉菌和酵母)的特异性载体。本发明的载体可以
包括染色体、非染色体和合成DNA序列。大量的合适载体是本领域技术人员已知的，以及
可市售购得。示例性的载体包括：细菌：pQE载体(Qiagen，San Diego，CA)，pBluescript质粒(Stratagene，San Diego，CA)、pNH载 体、(λ-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、
pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真 核：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，任何其他质粒或其他载体都可以使用，只要其在宿主中是可复制和能存活的。本发明可以使用低拷贝数或高拷贝数载体。
[0266] 在可选实施方案中，术语″表达框″包括能够影响结构基因(即，蛋白编码序列，例如本发明的磷脂酶)在与该序列兼容的宿主中的表达的核苷酸序列。表达框可以至少包括可操作地与多肽编码序列连接的启动子；和，表达框可以包括可操作地连接有多肽编码
序列的至少一个启动子；并且，任选地，连接有其他序列，例如，转录终止信号。也可以使用其他必需的或有助于影响表达的因子，例如，增强子。在可选实施方案中，“可操作地连接”表示在DNA序列上游连接启动子，从而启动子介导DNA序列的转录。在可选实施方案中，表
达框还包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸露DNA”载体，等等。
序列的至少一个启动子；并且，任选地，连接有其他序列，例如，转录终止信号。也可以使用其他必需的或有助于影响表达的因子，例如，增强子。在可选实施方案中，“可操作地连接”表示在DNA序列上游连接启动子，从而启动子介导DNA序列的转录。在可选实施方案中，表
达框还包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸露DNA”载体，等等。
[0267] 在可选实施方案中，本发明的载体包括可以感染、转染、瞬时性或永久性转导细胞的核酸。在可选实施方案中，载体可以是裸露核酸，或与蛋白或脂质复合的核酸。载体任选地包括病毒或细菌核酸和/或蛋白，和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜，等)。载体包括但不限于复制子(例如，RNA复制子、细菌噬菌体)，其可以被DNA片段结合并使其复制。
因而，载体包括但不限于RNA、自发性自我复制的环状或链状DNA或RNA(例如，质粒、病毒
等，参见，例如，美国专利No.5,217,879)、以及包括表达和非表达质粒。如果重组微生物或细胞培养物被描述为使“表达载体”入驻宿主中，则其包括被整合到宿主染色体中的外-染色体环状和线性DNA。如果载体被维持于宿主细胞中，则该载体可以作为有丝分裂中的自发性结构被细胞稳定复制，或被整合到宿主基因组中。
因而，载体包括但不限于RNA、自发性自我复制的环状或链状DNA或RNA(例如，质粒、病毒
等，参见，例如，美国专利No.5,217,879)、以及包括表达和非表达质粒。如果重组微生物或细胞培养物被描述为使“表达载体”入驻宿主中，则其包括被整合到宿主染色体中的外-染色体环状和线性DNA。如果载体被维持于宿主细胞中，则该载体可以作为有丝分裂中的自发性结构被细胞稳定复制，或被整合到宿主基因组中。
[0268] 在可选实施方案中，本发明提供质粒，它可以由小写的前面“p”和/或后面的大写字母和/或数字表示。在可选实施方案中，“起始”质粒或者是不受限制的可市售购得的，或者可以根据公布的程序从可用质粒构建。在可选实施方案中，与在此所述的那些等效的质粒是本领域已知的并且对于本领域技术人员是显然的。
[0269] 在可选实施方案中，表达载体可以包括启动子、翻译起始和转录终止子的核糖体结合位点。载体还可以包含合适的序列用于扩增表达。哺乳动物表达载体可以包括复制来
源，任何必需核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、以及5’端非转录序列。在一些方面，序列衍生于SV40剪接和多聚腺苷酸化位点的DNA可用
于提供所需的非转录遗传元件。
源，任何必需核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、以及5’端非转录序列。在一些方面，序列衍生于SV40剪接和多聚腺苷酸化位点的DNA可用
于提供所需的非转录遗传元件。
[0270] 在一个方面，表达载体含有一种或多种可选标记基因以允许选择含有载体的宿主细胞。这种可选标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因或在真核细胞培养物中提供新霉素抗
性的基因、在大肠杆菌中提供四环素或氨苄青霉素抗性的基因、以及啤酒酵母TRP1基因。
可以使用氯霉素转移酶(CAT)载体或其他带有可选标记的载体从任何期望的基因中选择
启动子区域。
性的基因、在大肠杆菌中提供四环素或氨苄青霉素抗性的基因、以及啤酒酵母TRP1基因。
可以使用氯霉素转移酶(CAT)载体或其他带有可选标记的载体从任何期望的基因中选择
启动子区域。
[0271] 在真核细胞中表达多肽或其片段的载体还可以含有增强子以增强表达水平。增强子是DNA的顺式元件，通常长度为约10～约300bp，其作用于启动子以增强转录。其示例包
括位于复制起点后侧100～270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复
制起点后侧的多瘤增强子、以及腺病毒增强子。
括位于复制起点后侧100～270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复
制起点后侧的多瘤增强子、以及腺病毒增强子。
[0272] DNA序列可以通过多种程序插入载体。通常，DNA序列被连接到载体中的目标位点，然后使用合适的限制性核酸内切酶进行插入物和载体的消化。可选择地，插入物和载体的平端可以进行连接。多种克隆技术是本领域已知的，例如，描述于Ausubel和Sambrook。
这些和其他程序被认为是在本领域技术人员的范围内。
这些和其他程序被认为是在本领域技术人员的范围内。
[0273] 载体可以是质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。其他载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列、SV40衍生物；细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA组合的载体、病毒DNA(例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒以及假性狂犬病)。用于原核和真核宿主的多种克隆和表达载体描述于，例如，Sambrook。
[0274] 可以使用的特别的细菌载体包括含有众所周知的克隆载体的遗传元件的可市售购得的质粒：pBR322(ATCC 37017)、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，
Sweden)、GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、
pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。特别的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而，其他任何载体都可以使用，只要其在宿主细胞中可以复制且能存活的。
Sweden)、GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、
pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。特别的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而，其他任何载体都可以使用，只要其在宿主细胞中可以复制且能存活的。
[0275] 宿主细胞和转化细胞
[0276] 本发明还提供包含本发明的核酸序列的转化细胞，例如，编码本发明的磷脂酶、本发明的载体的序列。宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。本发明的酶可以在任何宿主细胞中表达，例如，任何细菌细胞、任何酵母细胞，例如，毕赤酵母、啤酒酵母或裂殖酵母。示例性的细菌细胞包括埃希氏菌属、杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属中的任何种，包括例如大肠杆菌、乳酸球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、荧光假单胞菌。示例性的真菌细胞包括曲霉属的任何种。示例性的酵母细胞包括毕赤酵母属、啤酒酵母菌属、裂殖酵母属或酵母菌属中的任何种，包括毕赤酵母、啤酒酵母或裂殖酵母。示例性的昆虫细胞包括斜纹夜蛾或果蝇中的任何种，包括果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤或任何小鼠或人细
胞系。选择合适的宿主是本领域技术人员的能力。
胞系。选择合适的宿主是本领域技术人员的能力。
[0277] 载体可以使用任何的各种技术引入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-介导的基因转移。特别的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
[0278] 在合适时，工程化的宿主细胞可以在被修饰适于激活启动子的常规营养培养基中进行培养，以筛选转化子或扩增本发明的基因。转化适当的宿主菌株并使宿主菌株生长至
合适的细胞密度后，选定的启动子可以通过合适的方式进行诱导(例如，改变温度或化学
诱导)，且细胞可以被进一步培养一段时间以允许其生产目标多肽或其片段。
合适的细胞密度后，选定的启动子可以通过合适的方式进行诱导(例如，改变温度或化学
诱导)，且细胞可以被进一步培养一段时间以允许其生产目标多肽或其片段。
[0279] 可以离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎，并且得到的粗提物保留用于进一步纯化。用于蛋白表达的微生物细胞可以通过任何便利的方法进行破碎，包括冻融循环、超声、机械破碎或使用细胞裂解剂。这些方法是本领域技术人员公知的。表达的多肽或其片
段可以通过以下方法从重组细胞培养物中回收并纯化：包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。在需要时，蛋白折叠步骤可以被用于完成多肽构型。如果需要，可以采用高效液相色谱(HPLC)进行最终纯化步骤。
段可以通过以下方法从重组细胞培养物中回收并纯化：包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。在需要时，蛋白折叠步骤可以被用于完成多肽构型。如果需要，可以采用高效液相色谱(HPLC)进行最终纯化步骤。
[0280] 各种哺乳动物细胞培养系统也可被用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的示例包括猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和能够从兼容性载体中表达蛋白的其他细胞系，例如
C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。
C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。
[0281] 宿主细胞的构建子可以常规方式用于生产由重组序列编码的基因产物。取决于重组生产过程所用的宿主，由含有载体的宿主细胞生产的多肽可以是糖基化的或可以是非糖
基化的。本发明的多肽还可以或可以不包括初始的甲硫氨酸残基。
基化的。本发明的多肽还可以或可以不包括初始的甲硫氨酸残基。
[0282] 也可以使用无细胞翻译系统来生产本发明的多肽。无细胞翻译系统可以在含有可操作地连接到编码多肽或其片段的核酸的启动子的DNA构建子中使用mRNA转录。在一些
方面，DNA构建子可以在进行体外转录反应前进行线性化。然后，将转录mRNA用合适的无
细胞翻译提取物(例如兔网织红细胞提取物)进行孵育，以生产目标多肽或其片段。
方面，DNA构建子可以在进行体外转录反应前进行线性化。然后，将转录mRNA用合适的无
细胞翻译提取物(例如兔网织红细胞提取物)进行孵育，以生产目标多肽或其片段。
[0283] 表达载体可以含有一种或多种可选标记基因，以提供表型特征，用于转化的宿主细胞的筛选，例如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌
中的四环素或氨苄青霉素抗性。
中的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0284] 示例性的PI-PLC酶(具有SEQ ID NO：6所示的序列，包括(和具有)表12～15中所示的一种或多种氨基酸残基变化(例如，突变))已经在各种宿主系统中以活性形式
过表达，包括革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌；革兰氏阳性菌，如任何杆菌(例如，枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌)；酵母宿主细胞(包括例如毕赤酵母、啤酒酵母，如酿酒酵母和裂殖酵
母)和乳酸乳球菌；或哺乳动物、真菌、植物或昆虫细胞。活性酶在每个宿主系统中从各种构建子表达。这些核酸表达构建子可以包含编码全长开放阅读框的(由信号序列、前序列
和成熟蛋白编码序列组成)的核苷酸或者它们可以包括这些遗传元件的子集，单独的或者
与作为成熟开放阅读框的信号序列和/或前序列的异源遗传元件组合。这些系统中的每一
个都可以作为商业生产的宿主，用于表达在先前所描述的酶油脱胶过程中使用的PLC。
过表达，包括革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌；革兰氏阳性菌，如任何杆菌(例如，枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌)；酵母宿主细胞(包括例如毕赤酵母、啤酒酵母，如酿酒酵母和裂殖酵
母)和乳酸乳球菌；或哺乳动物、真菌、植物或昆虫细胞。活性酶在每个宿主系统中从各种构建子表达。这些核酸表达构建子可以包含编码全长开放阅读框的(由信号序列、前序列
和成熟蛋白编码序列组成)的核苷酸或者它们可以包括这些遗传元件的子集，单独的或者
与作为成熟开放阅读框的信号序列和/或前序列的异源遗传元件组合。这些系统中的每一
个都可以作为商业生产的宿主，用于表达在先前所描述的酶油脱胶过程中使用的PLC。
[0285] 核酸的扩增
[0286] 在实施本发明时，编码本发明的多肽的核酸或修饰的核酸可以通过例如扩增进行复制。本发明提供用于扩增编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的扩增引物序列对。在一个
方面，引物对能够扩增本发明的核酸序列。本领域技术人员可以对于这些序列的任何部分
或全长进行扩增引物序列对的设计。
方面，引物对能够扩增本发明的核酸序列。本领域技术人员可以对于这些序列的任何部分
或全长进行扩增引物序列对的设计。
[0287] 本发明提供用于扩增编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的扩增引物序列对，其中所述引物对能够扩增包含本发明的序列或其片段或子序列的核酸。扩增引物序列对的一个
或每个成员可以包括寡核苷酸，其包含序列的至少约10～50个连续碱基，或序列的约12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基。
或每个成员可以包括寡核苷酸，其包含序列的至少约10～50个连续碱基，或序列的约12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基。
[0288] 本发明提供扩增引物对，其中所述引物对包括第一成员(具有起始的(5’)约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个本发明的核酸残基所示的序列)和第二成员(具有起始的(5’)约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个第一成员互补链的残基所示的序列)。本发明提供使用本发明的扩增引物对通过扩增(例如，聚合酶链
式反应(PCR))产生的磷脂酶。本发明提供使用本发明的扩增引物对通过扩增(例如，聚合
酶链式反应(PCR))制备磷脂酶的方法。在一个方面，扩增引物对从文库扩增核酸，例如，基因文库，如环境文库。
式反应(PCR))产生的磷脂酶。本发明提供使用本发明的扩增引物对通过扩增(例如，聚合
酶链式反应(PCR))制备磷脂酶的方法。在一个方面，扩增引物对从文库扩增核酸，例如，基因文库，如环境文库。
[0289] 扩增反应还可以被用于样品中的核酸定量(例如，细胞样品中的信使含量)、标记核酸(例如，将其用于点阵或印迹)、检测核酸或定量样品中的特异性核酸。在本发明的一
个方面，对分离自细胞或cDNA文库的信使进行扩增。本领域技术人员能够选择并设计适当
的寡核苷酸扩增引物。扩增方法同样是本领域公知的，其包括例如聚合酶链式反应(PCR)
(参见，例如，PCRPROTOCOLS，A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS，ed.Innis，Academic Press，N.Y.(1990)和PCR STRATEGIES(1995)，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.，连接酶链式反应(LCR)(参见，例如，Wu(1989)Genomics 4：560；Landegren(1988)Science
241：1077；Barringer(1990)Gene 89：117)；转录扩增(参见，例如，Kwoh(1989)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)；和，自我维持的序列复制(参见，例如，Guatelli(1990)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)；Q-β复制酶扩增(参见，例如，Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)，自动Q-β复制酶扩增分析(参见，例如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10：257-271)和其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；还参见Berger(1987)MethodsEnzymol.152：307-316；Sambrook；Ausubel；美国专利No.4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)Biotechnology 13：563-564。
个方面，对分离自细胞或cDNA文库的信使进行扩增。本领域技术人员能够选择并设计适当
的寡核苷酸扩增引物。扩增方法同样是本领域公知的，其包括例如聚合酶链式反应(PCR)
(参见，例如，PCRPROTOCOLS，A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS，ed.Innis，Academic Press，N.Y.(1990)和PCR STRATEGIES(1995)，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.，连接酶链式反应(LCR)(参见，例如，Wu(1989)Genomics 4：560；Landegren(1988)Science
241：1077；Barringer(1990)Gene 89：117)；转录扩增(参见，例如，Kwoh(1989)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)；和，自我维持的序列复制(参见，例如，Guatelli(1990)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)；Q-β复制酶扩增(参见，例如，Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)，自动Q-β复制酶扩增分析(参见，例如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10：257-271)和其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；还参见Berger(1987)MethodsEnzymol.152：307-316；Sambrook；Ausubel；美国专利No.4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)Biotechnology 13：563-564。
[0290] 测定序列同一性的程度
[0291] 本发明提供分离的和重组核酸，其包括在至少约50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、
1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或更多个残基的区域内相对于本发明的示例性核酸(例如，如实施例3中所讨论的，SEQ ID NO：5和编码表12～15中所示的一种或多种突
变，或其酶活性片段，和如实施例3中所讨论的，编码SEQ ID NO：6和编码表12～15中所
示的一种或多种突变的核酸，或其酶活性片段)具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高、或完全(100％)的序列同一性的序列。本发明提供多肽，其包括相对于本发明的示
例性的多肽具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、
61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高、或完全(100％)的序列同一性的序列。序列同一性(同源性)的程度可以使用任何计算机程序和相关参数进行测定，
包括在此描述的那些，例如BLAST 2.2.2.或FASTA version3.0t78，采用缺省参数。在可
选实施方案中，序列同一性可以跨越以下区域：核酸或多肽的至少约5、10、20、30、40、50、
100、150、200、250、300、350、400个连续残基或全长。序列同一性(同源性)的程度可以使用任何计算机程序和相关参数进行测定，包括在此描述的那些，例如BLAST 2.2.2.或
FASTAversion 3.0t78，采用缺省参数。
1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或更多个残基的区域内相对于本发明的示例性核酸(例如，如实施例3中所讨论的，SEQ ID NO：5和编码表12～15中所示的一种或多种突
变，或其酶活性片段，和如实施例3中所讨论的，编码SEQ ID NO：6和编码表12～15中所
示的一种或多种突变的核酸，或其酶活性片段)具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高、或完全(100％)的序列同一性的序列。本发明提供多肽，其包括相对于本发明的示
例性的多肽具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、
61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高、或完全(100％)的序列同一性的序列。序列同一性(同源性)的程度可以使用任何计算机程序和相关参数进行测定，
包括在此描述的那些，例如BLAST 2.2.2.或FASTA version3.0t78，采用缺省参数。在可
选实施方案中，序列同一性可以跨越以下区域：核酸或多肽的至少约5、10、20、30、40、50、
100、150、200、250、300、350、400个连续残基或全长。序列同一性(同源性)的程度可以使用任何计算机程序和相关参数进行测定，包括在此描述的那些，例如BLAST 2.2.2.或
FASTAversion 3.0t78，采用缺省参数。
[0292] 同源序列还包括在核酸序列中由尿嘧啶代替胸腺嘧啶的RNA序列。同源序列可以使用任何在此所述的程序获得，或可以来自对测序误差的校正。可以理解，在此所述的核
酸序列可以采用传统的单字母形式表示(参见，例如，Stryer，Lubert.Biochemistry，3rd Ed.，W.H Freeman & Co.，New York)或采用能够记录序列中的核苷酸同一性的任何其他形式。
酸序列可以采用传统的单字母形式表示(参见，例如，Stryer，Lubert.Biochemistry，3rd Ed.，W.H Freeman & Co.，New York)或采用能够记录序列中的核苷酸同一性的任何其他形式。
[0293] 在此鉴定的各种序列比对程序都可以用于本发明的这一方面。蛋白和/或核酸序列同一性(同源性)可以使用本领域已知的任何序列比对算法和程序进行评估。这些算
法和程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448，1988；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：
403-410、1990；Thompson 等 人，Nucleic Acid Res.22(2)：4673-4680，1994；Higgins 等人，Methods Enzymol.266：383-402，1996；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，
1990；Altschul等人，Nature Genetics 3：266-272，1993)。
法和程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448，1988；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：
403-410、1990；Thompson 等 人，Nucleic Acid Res.22(2)：4673-4680，1994；Higgins 等人，Methods Enzymol.266：383-402，1996；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，
1990；Altschul等人，Nature Genetics 3：266-272，1993)。
[0294] 同源性或同一性可以使用序列分析软件进行测量(例如，Genetics ComputerGroup的 序 列 分 析 软 件 包，University of Wisconsin Biotechnology Center，
1710University Avenue，Madison，WI 53705)。这些软件通过指定各种缺失、取代和其他修饰的同源性程度将相似序列进行配对。在两种或更多核酸或多肽序列的背景中，术语“同源性”和“同一性”是指当使用任何序列比对算法或通过手工比对和目视检查时，在比对窗口或指定区域中对两种或更多序列或子序列进行比较并进行最大相符对齐，完全相同或具有
特定百分比的氨基酸或核苷酸残基相同。在序列比对中，一条序列可以作为参比序列并将
待测序列与之进行比对。当使用序列比对算法时，将待测和参比序列输入计算机，如果需要的话指定子序列匹配，并指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定可选的参数。然后，序列比对算法基于程序参数计算待测序列相对于参比序列的序列同一性百
分比。
1710University Avenue，Madison，WI 53705)。这些软件通过指定各种缺失、取代和其他修饰的同源性程度将相似序列进行配对。在两种或更多核酸或多肽序列的背景中，术语“同源性”和“同一性”是指当使用任何序列比对算法或通过手工比对和目视检查时，在比对窗口或指定区域中对两种或更多序列或子序列进行比较并进行最大相符对齐，完全相同或具有
特定百分比的氨基酸或核苷酸残基相同。在序列比对中，一条序列可以作为参比序列并将
待测序列与之进行比对。当使用序列比对算法时，将待测和参比序列输入计算机，如果需要的话指定子序列匹配，并指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定可选的参数。然后，序列比对算法基于程序参数计算待测序列相对于参比序列的序列同一性百
分比。
[0295] 在此使用的“比对窗口”包括任何数量的连续残基片段。例如，在本发明的可选方面，在两条序列最优化对齐之后，范围为本发明示例性序列的20个至全长的连续残基
与参比序列的相同数量的连续位点进行比对。如果参比序列相对于本发明的示例性序
列具有需要的序列同一性，例如，相对于本发明的序列具有50％、51％、52％、53％、54％、
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，那么该序列在本发明的范围内。在可选实施方案中，在两条序列最优
化对齐之后，将范围为约20～600、约50～200和约100～150的子序列与参比序列的
相同数量的连续位点进行比对。用于比对的序列的对齐方法是本领域公知的。用于比对
的序列的最佳对齐可以采用例如Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2：
482，1981；Needleman和Wunsch的同源性对齐算法，J.Mol.Biol.48：443，1970；Person和Lipman的搜索相似度方法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer
Group，575Science Dr.，Madison，WI)；或手工比对和目视检查进行。除了BLAST程序
(国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具)外，测定同源性或同一性的其他算法还包
括例如ALIGN、AMAS(多比对的序列分析)、AMPS(蛋白多序列比对)、ASSET(比对的片段
统计估值工具)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(生物序列比较分析节点)、BLIMPS(BLocks
IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman算法、DARWIN、Las Vegas算法、FNAT(强力核
苷酸比对工具)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky序列分析包)、GAP(全局比对程序)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(敏感性序列比对)、LALIGN(局部序列比对)、LCP(局部内容程序)、MACAW(多比对构建和分析工作台)、MAP(多比对程序)、
MBLKP、MBLKN、PIMA(模式诱导的多序列比对)、SAGA(遗传算法的序列比对)和WHAT-IF。
这些比对程序还可以被用于筛选基因组数据库，以鉴定具有基本上同一序列的多核苷酸序
列。许多基因组数据库是可获得的，例如，人基因组的大部分都可以在人基因组测序项目
(Gibbs，1995)中获得。一些基因组已被测序，例如，生殖道支原体(M.Genitalium)(Fraser等人，1995)、甲烷球菌(M.Jannaschii)(Bult等人，1996)、流感嗜血菌(H.Influenzae)
(Fleischmann等人，1995)、大肠杆菌(Blattner等人，1997)、酵母(啤酒酵母)(Mewes等
人，1997)和黑腹果蝇(D.Melanogaster)(Adams等人，2000)。对于模型生物测序同样已有
了显著进步，例如小鼠、秀丽线虫(C.elegans)和十字花科(Arabadopsis sp.)。注解一些
功能信息的基因组信息数据库由不同组织进行维护，并可经由因特网获得。
与参比序列的相同数量的连续位点进行比对。如果参比序列相对于本发明的示例性序
列具有需要的序列同一性，例如，相对于本发明的序列具有50％、51％、52％、53％、54％、
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，那么该序列在本发明的范围内。在可选实施方案中，在两条序列最优
化对齐之后，将范围为约20～600、约50～200和约100～150的子序列与参比序列的
相同数量的连续位点进行比对。用于比对的序列的对齐方法是本领域公知的。用于比对
的序列的最佳对齐可以采用例如Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2：
482，1981；Needleman和Wunsch的同源性对齐算法，J.Mol.Biol.48：443，1970；Person和Lipman的搜索相似度方法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer
Group，575Science Dr.，Madison，WI)；或手工比对和目视检查进行。除了BLAST程序
(国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具)外，测定同源性或同一性的其他算法还包
括例如ALIGN、AMAS(多比对的序列分析)、AMPS(蛋白多序列比对)、ASSET(比对的片段
统计估值工具)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(生物序列比较分析节点)、BLIMPS(BLocks
IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman算法、DARWIN、Las Vegas算法、FNAT(强力核
苷酸比对工具)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky序列分析包)、GAP(全局比对程序)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(敏感性序列比对)、LALIGN(局部序列比对)、LCP(局部内容程序)、MACAW(多比对构建和分析工作台)、MAP(多比对程序)、
MBLKP、MBLKN、PIMA(模式诱导的多序列比对)、SAGA(遗传算法的序列比对)和WHAT-IF。
这些比对程序还可以被用于筛选基因组数据库，以鉴定具有基本上同一序列的多核苷酸序
列。许多基因组数据库是可获得的，例如，人基因组的大部分都可以在人基因组测序项目
(Gibbs，1995)中获得。一些基因组已被测序，例如，生殖道支原体(M.Genitalium)(Fraser等人，1995)、甲烷球菌(M.Jannaschii)(Bult等人，1996)、流感嗜血菌(H.Influenzae)
(Fleischmann等人，1995)、大肠杆菌(Blattner等人，1997)、酵母(啤酒酵母)(Mewes等
人，1997)和黑腹果蝇(D.Melanogaster)(Adams等人，2000)。对于模型生物测序同样已有
了显著进步，例如小鼠、秀丽线虫(C.elegans)和十字花科(Arabadopsis sp.)。注解一些
功能信息的基因组信息数据库由不同组织进行维护，并可经由因特网获得。
[0296] BLAST、BLAST 2.0和BLAST 2.2.2算法也用于实施本发明。它们描述于例如 Altschul(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；Altschul(1990)J.Mol.Biol.215：
403-410中。进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心获得。该算法涉及
首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字符来鉴定高分值序列对(HSP)，当其与数据库序
列中相同长度字符对齐后，其匹配或满足某些正向阀值分数T。T被称作临近字符分数阀值
(Altschul(1990)，同上)。这些初始命中临近字符作为用于启动搜索的种子，以发现含有它们的更长的HSP。命中字符沿着每条序列的两个方向进行延伸，只要累积对齐值可以增加。
对于核苷酸序列的累积分值使用参数M(对于一对匹配残基的回报分值；恒＞0)进行计算。
对于氨基酸序列，采用评分矩阵计算累积分值。命中字符沿着各方向进行延伸的终止条件
为：累积对齐分值由于分量X而从其最大实现值开始下降；由于一种或多种的负分值残基
对齐的积累，累积分值降至0或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T、和X决定了比对的敏感度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用缺省字长(W)11，期望值
(E)10，M＝5，N＝-4和双链比对。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用缺省字长3，期望值
(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 89：10915)比对，(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，和双链比对。BLAST算法还进行两条序列之间相似度的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 90：5873)。BLAST算法提供的计算相似度的方法是最小总数概率(P(N))，其提供
了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指示。例如，如果待测核酸与参比核
酸进行比对得到的最小总数概率小于约0.2、更优选小于约0.01和最优选小于约0.001，那
么该核酸被认为是与参比序列相似。在一个方面，使用基本局部比对搜索工具(“BLAST”)评价蛋白和核酸序列的同源性。例如，5种特异性BLAST程序可以被用于执行以下任务：
(1)BLASTP和BLAST3将氨基酸查询序列与蛋白序列数据库进行比对；(2)BLASTN将核苷酸
查询序列与核苷酸序列数据库进行比对；(3)BLASTX将查询核苷酸序列(双链)的6种读
框概念的翻译产物与蛋白序列数据库进行比对；(4)TBLASTN将查询蛋白序列与全部6种读
框翻译的核苷酸序列(双链)数据库进行比对；和(5)TBLASTX将核苷酸查询序列的6种
读框翻译与核苷酸序列数据库的6种读框翻译进行比对。BLAST程序通过鉴定相似片段来
鉴定同源序列，在此被称作查询氨基酸或核酸序列和优选来自蛋白或核酸序列数据库的测
试序列之间的“高分值片段对”。高分值片段对优选地可以通过评分矩阵进行鉴定(即，比对)，其中很多是本领域已知的。优选地，所用的评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet等人，
Science 256：1443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins 17：49-61，1993)。优选地，也可以采用PAM或PAM250矩阵(参见，例如，Schwartz和Dayhoff，eds.，1978，Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of Protein Sequence and Structure，Washington：National Biomedical Research Foundation)。
403-410中。进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心获得。该算法涉及
首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字符来鉴定高分值序列对(HSP)，当其与数据库序
列中相同长度字符对齐后，其匹配或满足某些正向阀值分数T。T被称作临近字符分数阀值
(Altschul(1990)，同上)。这些初始命中临近字符作为用于启动搜索的种子，以发现含有它们的更长的HSP。命中字符沿着每条序列的两个方向进行延伸，只要累积对齐值可以增加。
对于核苷酸序列的累积分值使用参数M(对于一对匹配残基的回报分值；恒＞0)进行计算。
对于氨基酸序列，采用评分矩阵计算累积分值。命中字符沿着各方向进行延伸的终止条件
为：累积对齐分值由于分量X而从其最大实现值开始下降；由于一种或多种的负分值残基
对齐的积累，累积分值降至0或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T、和X决定了比对的敏感度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用缺省字长(W)11，期望值
(E)10，M＝5，N＝-4和双链比对。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用缺省字长3，期望值
(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 89：10915)比对，(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，和双链比对。BLAST算法还进行两条序列之间相似度的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 90：5873)。BLAST算法提供的计算相似度的方法是最小总数概率(P(N))，其提供
了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指示。例如，如果待测核酸与参比核
酸进行比对得到的最小总数概率小于约0.2、更优选小于约0.01和最优选小于约0.001，那
么该核酸被认为是与参比序列相似。在一个方面，使用基本局部比对搜索工具(“BLAST”)评价蛋白和核酸序列的同源性。例如，5种特异性BLAST程序可以被用于执行以下任务：
(1)BLASTP和BLAST3将氨基酸查询序列与蛋白序列数据库进行比对；(2)BLASTN将核苷酸
查询序列与核苷酸序列数据库进行比对；(3)BLASTX将查询核苷酸序列(双链)的6种读
框概念的翻译产物与蛋白序列数据库进行比对；(4)TBLASTN将查询蛋白序列与全部6种读
框翻译的核苷酸序列(双链)数据库进行比对；和(5)TBLASTX将核苷酸查询序列的6种
读框翻译与核苷酸序列数据库的6种读框翻译进行比对。BLAST程序通过鉴定相似片段来
鉴定同源序列，在此被称作查询氨基酸或核酸序列和优选来自蛋白或核酸序列数据库的测
试序列之间的“高分值片段对”。高分值片段对优选地可以通过评分矩阵进行鉴定(即，比对)，其中很多是本领域已知的。优选地，所用的评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet等人，
Science 256：1443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins 17：49-61，1993)。优选地，也可以采用PAM或PAM250矩阵(参见，例如，Schwartz和Dayhoff，eds.，1978，Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of Protein Sequence and Structure，Washington：National Biomedical Research Foundation)。
[0297] 在本发明的一个方面，为了测定一种核酸是否具有本发明的范围内所需要的序列同一性，使用NCBI BLAST 2.2.2程序，采用缺省设置进行blastp。BLAST 2.2.2程序共有
约38个设置选项。在本发明的该示例性方面中，使用全部缺省值，除了缺省过滤设定(即，全部参数设定为缺省，除了过滤设定为OFF)；在该处采用“-F F”设定，其中取消了过滤。由于是短长度的序列，因此缺省过滤的使用经常导致Karlin-Altschul违例。
约38个设置选项。在本发明的该示例性方面中，使用全部缺省值，除了缺省过滤设定(即，全部参数设定为缺省，除了过滤设定为OFF)；在该处采用“-F F”设定，其中取消了过滤。由于是短长度的序列，因此缺省过滤的使用经常导致Karlin-Altschul违例。
[0298] 如上所述，本发明的该示例性方面中使用的缺省值包括：
[0299] ″低复杂度过滤：ON
[0300] ＞字长：3
[0301] ＞矩阵：Blosum62
[0302] ＞缺口成本：存在：11
[0303] ＞延伸：1″
[0304] 其他缺省设定为：低复杂度过滤OFF，用于蛋白的字长3，BLOSUM62矩阵，缺口存在惩罚-11和缺口延伸惩罚-1。
[0305] 示例性的NCBI BLAST 2.2.2程序设定示于下面的实施例1。注意，“-W”选项缺省为0。这表示如果不设定的话，用于蛋白的字长缺省为3，用于核苷酸的为11。
[0306] 核酸的杂交
[0307] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸，其在严格条件下杂交于本发明的示例性序列，例如，以下实施例3所示的，SEQ ID NO：5所示的序列和具有表12～15中所示的
一种或多种突变，或编码包含SEQ ID NO：6所示的序列的多肽和编码表12～15中所示的
一种或多种突变或其酶活性片段的核酸。
一种或多种突变，或编码包含SEQ ID NO：6所示的序列的多肽和编码表12～15中所示的
一种或多种突变或其酶活性片段的核酸。
[0308] 严格条件可以是高严格条件、中严格条件、低严格条件，包括在此描述的升高的或降低的严格条件。在可选实施方案中，按照在严格条件下杂交的能力进行定义的本发明的核酸可以在分子(例如，本发明的示例性核酸)的约5个残基和全长之间。例如，它们可以
是至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、55，60、65，70、75，80，90、100、150、200、250、300、350、
400或更多残基的长度。还包括比全长短的核酸。这些核酸可以用作例如杂交探针、标记探针、PCR寡核苷酸探针、iRNA(单链或双链)、反义或顺序编码抗体结合肽(表位)、基序、活性位点、结合结构域、调控结构域等。
是至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、55，60、65，70、75，80，90、100、150、200、250、300、350、
400或更多残基的长度。还包括比全长短的核酸。这些核酸可以用作例如杂交探针、标记探针、PCR寡核苷酸探针、iRNA(单链或双链)、反义或顺序编码抗体结合肽(表位)、基序、活性位点、结合结构域、调控结构域等。
[0309] 在一个方面，本发明的核酸由其在高严格条件下杂交的能力进行定义，包括条件为约50％甲酰胺、约37℃～42℃。在一个方面，本发明的核酸由其在降低的严格条件下杂
交的能力进行定义，包括条件为约35％～25％甲酰胺、约30℃～5℃。可选择地，本发明的核酸由其在高严格条件下杂交的能力进行定义，包括条件为42℃下，50％甲酰胺、5X SSPE、
0.3％SDS、以及重复序列阻断核酸(例如cot-1或鲑精DNA(例如，200ug/ml剪切和变性的
鲑精DNA))。在一个方面，本发明的核酸由其在降低的严格条件下杂交的能力进行定义，包括35％甲酰胺和在35℃的低温下。
交的能力进行定义，包括条件为约35％～25％甲酰胺、约30℃～5℃。可选择地，本发明的核酸由其在高严格条件下杂交的能力进行定义，包括条件为42℃下，50％甲酰胺、5X SSPE、
0.3％SDS、以及重复序列阻断核酸(例如cot-1或鲑精DNA(例如，200ug/ml剪切和变性的
鲑精DNA))。在一个方面，本发明的核酸由其在降低的严格条件下杂交的能力进行定义，包括35％甲酰胺和在35℃的低温下。
[0310] 杂交后，滤纸可以在50℃下用6X SSC、0.5％SDS洗涤。这些条件在高于25％甲酰胺的情况下被认为是“温和”条件，在低于25％甲酰胺下为“低”条件。“温和”杂交条件的具体例子是上述杂交在30％甲酰胺中进行时。“低严格”杂交条件的具体例子是上述杂交
在10％甲酰胺中进行时。
在10％甲酰胺中进行时。
[0311] 对应于特别的严格水平的温度范围可以通过计算目标核酸的嘌呤与嘧啶比来进一步缩窄，并据此调节温度。本发明的核酸还由其在如Ausubel和Sambrook所示的高、中
和低严格条件下杂交的能力进行定义。上述范围和条件的变化可以用于实施本发明并且是
本领域公知的。杂交条件进一步讨论如下。
和低严格条件下杂交的能力进行定义。上述范围和条件的变化可以用于实施本发明并且是
本领域公知的。杂交条件进一步讨论如下。
[0312] 寡核苷酸探针及其使用方法
[0313] 本发明还提供用于鉴定编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的核酸探针。在一个方面，探针包含或由本发明的核酸组成，例如，以下实施例3所示的具有SEQ ID NO：5所示的序列和具有表12～15中所示的一种或多种碱基变化(突变)的核酸，或编码包含SEQ ID
NO：6所示的序列的多肽和编码表12～15中所示的一种或多种氨基酸残基变化(突变)的
核酸或其酶活性片段。可选择地，本发明的探针可以是本发明的核酸序列的至少约5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、65、70、
75、80、85、90、95、100、或150、或更多、或约10～50、约20～60、约30～70个连续碱基。
NO：6所示的序列的多肽和编码表12～15中所示的一种或多种氨基酸残基变化(突变)的
核酸或其酶活性片段。可选择地，本发明的探针可以是本发明的核酸序列的至少约5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、65、70、
75、80、85、90、95、100、或150、或更多、或约10～50、约20～60、约30～70个连续碱基。
[0314] 探针通过结合或杂交鉴定核酸。在可选实施方案中，杂交包括核酸链通过碱基配对结合互补链的过程。杂交反应可以是敏感和选择性的，从而可以从样品中鉴定特别的目
标序列，即使其浓度很低。严格条件可以由以下条件适当定义，例如，预杂交和杂交液中的盐和甲酰胺浓度、或杂交温度，其是本领域公知的。例如，严格度可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或升高杂交温度、改变杂交时间来提高，如下详述。在可选方面，本发明的核酸由其在各种严格条件(例如，高、中和低)下杂交的能力进行定义，如在此所述的。
标序列，即使其浓度很低。严格条件可以由以下条件适当定义，例如，预杂交和杂交液中的盐和甲酰胺浓度、或杂交温度，其是本领域公知的。例如，严格度可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或升高杂交温度、改变杂交时间来提高，如下详述。在可选方面，本发明的核酸由其在各种严格条件(例如，高、中和低)下杂交的能力进行定义，如在此所述的。
[0315] 探针可被用于本发明的阵列，参见下文讨论，包括例如毛细管阵列。本发明的探针还可以被用于分离和/或鉴定其他编码磷脂酶的核酸或具有磷脂酶活性的多肽。
[0316] 本发明的探针可以被用于测定生物样品(例如，油样品)是否含有具备本发明的核酸序列的生物体。在该过程中，从样品中得到了潜在地含有分离核酸的生物样品的生物
体以及得到了核酸。核酸与探针进行接触，条件为其中允许探针与样品中存在的任何互补
序列特异性杂交。如果需要的话，允许探针与互补序列特异性杂交的条件可以通过将探针
与已知含有互补序列的样品中的互补序列以及不含有互补序列的对照序列接触进行测定。
杂交条件，例如杂交缓冲液的盐浓度、杂交缓冲液的甲酰胺浓度或杂交温度，可以进行变化以鉴定允许探针与互补核酸特异性杂交的条件(参见有关特异性杂交条件的讨论)。
体以及得到了核酸。核酸与探针进行接触，条件为其中允许探针与样品中存在的任何互补
序列特异性杂交。如果需要的话，允许探针与互补序列特异性杂交的条件可以通过将探针
与已知含有互补序列的样品中的互补序列以及不含有互补序列的对照序列接触进行测定。
杂交条件，例如杂交缓冲液的盐浓度、杂交缓冲液的甲酰胺浓度或杂交温度，可以进行变化以鉴定允许探针与互补核酸特异性杂交的条件(参见有关特异性杂交条件的讨论)。
[0317] 如果样品含有具备分离核酸的生物体，则进行探针的特异性杂交检测。杂交可以通过用可检测试剂标记探针进行检测，例如放射性同位素、荧光染料或能够催化形成可检
测产物的酶。用于标记的探针以检测样品中是否存在互补核酸的很多方法都是本领域技术
人员熟知的。其包括Southern印迹、Northern印迹、菌落杂交程序以及斑点印迹。这些方
法的规程在Ausubel和Sambrook中提供。
测产物的酶。用于标记的探针以检测样品中是否存在互补核酸的很多方法都是本领域技术
人员熟知的。其包括Southern印迹、Northern印迹、菌落杂交程序以及斑点印迹。这些方
法的规程在Ausubel和Sambrook中提供。
[0318] 可选择地，在扩增反应中可以使用多于一种探针(至少一种能够与核酸样品中存在的任何互补序列特异性杂交)以判断样品是否含有具备本发明的核酸序列的生物体(例
如，从中分离核酸的生物体)。在一个方面，探针包括寡核苷酸。在一个方面，扩增反应可以包括PCR反应。PCR规程描述于Ausubel和Sambrook(参见有关扩增反应的讨论)。在该
过程中，样品中的核酸与探针接触，进行扩增反应，并检测任何得到的扩增产物。扩增产物可以通过对反应产物进行凝胶电泳并使用诸如溴乙啶等嵌入剂来染色凝胶进行检测。可选
择地，可以用放射性同位素标记一种或多种的探针，并且可以在凝胶电泳后通过放射自显
影术检测放射性扩增产物的存在。
如，从中分离核酸的生物体)。在一个方面，探针包括寡核苷酸。在一个方面，扩增反应可以包括PCR反应。PCR规程描述于Ausubel和Sambrook(参见有关扩增反应的讨论)。在该
过程中，样品中的核酸与探针接触，进行扩增反应，并检测任何得到的扩增产物。扩增产物可以通过对反应产物进行凝胶电泳并使用诸如溴乙啶等嵌入剂来染色凝胶进行检测。可选
择地，可以用放射性同位素标记一种或多种的探针，并且可以在凝胶电泳后通过放射自显
影术检测放射性扩增产物的存在。
[0319] 衍生于本发明的核酸序列的近3’或5’端序列的探针还可以用于染色体步移过程，以鉴定含有另外的例如基因组序列的克隆。该方法允许从宿主生物体中分离编码额外
目标蛋白的基因。
目标蛋白的基因。
[0320] 在一个方面，本发明的核酸序列被用作探针以鉴定和分离相关核酸。在一些方面，如上鉴定的相关核酸可以是来自生物体的cDNA或基因组DNA，所述生物体不同于本发明的核酸被首次分离的来源。在该过程中，将核酸样品与探针接触，条件为其允许探针与相关序列特异性杂交。然后，使用任何上述方法检测探针与来自相关生物体的核酸的杂交。
[0321] 在核酸杂交反应中，用于获得特别的严格水平的条件根据被杂交核酸的性质发生变化。例如，可以在选择杂交条件时考虑核酸杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如，GC v.AT含量)和核酸类型(例如，RNA v.DNA)。在可选实施方案中，核酸固定化在
例如滤纸上。杂交可以在低严格、中严格或高严格的条件下进行。作为核酸杂交的示例，含有固定化变性核酸的聚合物膜首先在45℃下、含有0.9M NaCl、50mM NaH2PO4、pH 7.0、5.0mM Na2EDTA、0.5％SDS、10X Denhardt试剂和0.5mg/ml多核糖腺苷酸的溶液中预杂交30分钟。
7 8 32
然后将约2×10cpm(比活性4～9×10cpm/ug)的 P末端标记的寡核苷酸探针加至溶液
中。在可选实施方案中，在约12～16小时的孵育后，将膜在室温(RT)下在含有0.5％SDS
的1X SET(150mM NaCl、20mMTris盐酸、pH 7.8，1mM Na2EDTA)中洗涤30分钟，然后对于寡核苷酸探针在Tm-10℃温度下在新鲜的1X SET中洗涤30分钟。然后将膜露置于放射自显
影膜以检测杂交信号。
例如滤纸上。杂交可以在低严格、中严格或高严格的条件下进行。作为核酸杂交的示例，含有固定化变性核酸的聚合物膜首先在45℃下、含有0.9M NaCl、50mM NaH2PO4、pH 7.0、5.0mM Na2EDTA、0.5％SDS、10X Denhardt试剂和0.5mg/ml多核糖腺苷酸的溶液中预杂交30分钟。
7 8 32
然后将约2×10cpm(比活性4～9×10cpm/ug)的 P末端标记的寡核苷酸探针加至溶液
中。在可选实施方案中，在约12～16小时的孵育后，将膜在室温(RT)下在含有0.5％SDS
的1X SET(150mM NaCl、20mMTris盐酸、pH 7.8，1mM Na2EDTA)中洗涤30分钟，然后对于寡核苷酸探针在Tm-10℃温度下在新鲜的1X SET中洗涤30分钟。然后将膜露置于放射自显
影膜以检测杂交信号。
[0322] 通过改变用于鉴定核酸的杂交条件的严格性，例如与可探测探针杂交的cDNA或基因组DNA，可以鉴定和分离与探针具有不同同源性水平的核酸。严格性可以通过在低于探针融解温度的不同温度下进行杂交发生改变。融解温度Tm是50％的目标序列与优选的互
补探针杂交的温度。非常严格条件被选择为等于特定探针的Tm或低于约5℃。探针的融解
温度可以使用以下示例性的公式进行计算。对于14～70个核苷酸长度的探针而言，融解
温度(Tm)使用以下公式进行计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(600/N)，
其中N是探针长度。如果在含有甲酰胺的溶液中进行杂交，则融解温度可以使用以下公式
进行计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(0.63％甲酰胺)-(600/N)，其中
N是探针长度。预杂交可以在6X SSC、5X Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg鲑精DNA变性
片段或6X SSC、5X Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg鲑精DNA变性片段、50％甲酰胺中进
行。SSC和Denhardt试剂和其他溶液的配方见于例如Sambrook。
补探针杂交的温度。非常严格条件被选择为等于特定探针的Tm或低于约5℃。探针的融解
温度可以使用以下示例性的公式进行计算。对于14～70个核苷酸长度的探针而言，融解
温度(Tm)使用以下公式进行计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(600/N)，
其中N是探针长度。如果在含有甲酰胺的溶液中进行杂交，则融解温度可以使用以下公式
进行计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(0.63％甲酰胺)-(600/N)，其中
N是探针长度。预杂交可以在6X SSC、5X Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg鲑精DNA变性
片段或6X SSC、5X Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg鲑精DNA变性片段、50％甲酰胺中进
行。SSC和Denhardt试剂和其他溶液的配方见于例如Sambrook。
[0323] 通过添加可探测探针至上述预杂交液进行杂交。如果探针包括双链DNA，则其在添加至杂交液前进行变性。将滤纸与杂交液接触足够量的时间，以允许探针与含有其互补序列或同源序列的cDNA或基因组DNA杂交。对于长度超过200个核苷酸的探针而言，杂交可
以在低于Tm的15-25℃下进行。对于更短的探针，例如寡核苷酸探针，杂交可以在低于Tm
的5-10℃下进行。在一个方面，在6X SSC中的杂交在约68℃下进行。在一个方面，在含有
50％甲酰胺溶液中的杂交在约42℃下进行。所有前述杂交在高严格条件下进行。
以在低于Tm的15-25℃下进行。对于更短的探针，例如寡核苷酸探针，杂交可以在低于Tm
的5-10℃下进行。在一个方面，在6X SSC中的杂交在约68℃下进行。在一个方面，在含有
50％甲酰胺溶液中的杂交在约42℃下进行。所有前述杂交在高严格条件下进行。
[0324] 杂交后，洗涤滤纸以除去任何非特异性结合的可探测探针。用于洗涤滤纸的严格性也可以根据所杂交核酸的性质、所杂交核酸的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如，GC v.AT含量)和核酸类型(例如，RNA v.DNA)发生改变。可以用于实施本发明的渐进的更高
严格性条件洗涤的示例如下：2XSSC、0.1％SDS室温下15分钟(低严格)；0.1X SSC，0.5％
SDS室温下30分钟至1小时(中严格)；0.1X SSC，0.5％SDS在杂交温度和68℃之间的温
度下15～30分钟(高严格)；以及0.15M NaCl在72℃下15分钟(非常高严格)。最终
的低严格洗涤可以在0.1X SSC室温下进行。上述示例仅仅是对用于实施本发明的一套条
件进行的说明，例如用于洗涤滤纸。本领域技术人员知晓还有为数众多的不同严格性的洗
涤方法，它们都可以用于实施本发明。
严格性条件洗涤的示例如下：2XSSC、0.1％SDS室温下15分钟(低严格)；0.1X SSC，0.5％
SDS室温下30分钟至1小时(中严格)；0.1X SSC，0.5％SDS在杂交温度和68℃之间的温
度下15～30分钟(高严格)；以及0.15M NaCl在72℃下15分钟(非常高严格)。最终
的低严格洗涤可以在0.1X SSC室温下进行。上述示例仅仅是对用于实施本发明的一套条
件进行的说明，例如用于洗涤滤纸。本领域技术人员知晓还有为数众多的不同严格性的洗
涤方法，它们都可以用于实施本发明。
[0325] 与探针杂交的核酸可以通过放射自显影法或其他常规技术进行鉴定。可以对上述过程进行改变以鉴定相对于探针序列具有降低同源性水平的核酸。例如，为获得相对于可
+
检测探针具有降低同源性的核酸，可以使用较低的严格条件。例如，在具有Na 浓度约1M的杂交缓冲液中，杂交温度可以从68℃至42℃以5℃的差额进行降低。杂交后，滤纸可以在杂交温度下用2X SSC，0.5％SDS洗涤。这些条件在高于50℃下被认为是“温和”条件，在低
于50℃下被认为是“低”条件。“温和”杂交条件的例子是在55℃下进行上述杂交。“低严格”杂交条件的例子是在45℃下进行上述杂交。
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检测探针具有降低同源性的核酸，可以使用较低的严格条件。例如，在具有Na 浓度约1M的杂交缓冲液中，杂交温度可以从68℃至42℃以5℃的差额进行降低。杂交后，滤纸可以在杂交温度下用2X SSC，0.5％SDS洗涤。这些条件在高于50℃下被认为是“温和”条件，在低
于50℃下被认为是“低”条件。“温和”杂交条件的例子是在55℃下进行上述杂交。“低严格”杂交条件的例子是在45℃下进行上述杂交。
[0326] 在可选实施方案中，杂交可以在42℃温度下在缓冲液中进行，例如6XSSC，其含有甲酰胺。在这种情况下，杂交缓冲液中的甲酰胺浓度可以在50％至0％以5％的差额进行降低，以鉴定相对于探针具有降低同源性水平的克隆。杂交后，滤纸可以在50℃下用6X SSC，
0.5％SDS洗涤。在可选实施方案中，“温和”条件是高于25％甲酰胺，“低”条件是低于25％甲酰胺。在可选实施方案中，“温和”杂交条件是在30％甲酰胺下进行上述杂交时。在可选实施方案中，“低严格”杂交条件是在10％甲酰胺下进行上述杂交时。
0.5％SDS洗涤。在可选实施方案中，“温和”条件是高于25％甲酰胺，“低”条件是低于25％甲酰胺。在可选实施方案中，“温和”杂交条件是在30％甲酰胺下进行上述杂交时。在可选实施方案中，“低严格”杂交条件是在10％甲酰胺下进行上述杂交时。
[0327] 本发明的这些探针和方法可以被用于分离核酸，其包含相对于本发明的包含至少约10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400或500个连续碱基的核酸序列及其互补序列具有至少约99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少
90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少
50％同源性的序列。同源性可以使用比对算法进行测算，如在此所述的。例如，同源多核苷酸可以具有作为在此描述的编码序列之一的天然发生的等位变体的编码序列。这种等位变
体与本发明的核酸相比可以具有一种或多种核苷酸的取代、缺失或添加。
90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少
50％同源性的序列。同源性可以使用比对算法进行测算，如在此所述的。例如，同源多核苷酸可以具有作为在此描述的编码序列之一的天然发生的等位变体的编码序列。这种等位变
体与本发明的核酸相比可以具有一种或多种核苷酸的取代、缺失或添加。
[0328] 此外，本发明的探针和方法可用于分离核酸，其编码相对于本发明的包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的多肽具有至少约99％、至少
95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少
55％或至少50％序列同一性(同源性)的多肽，其中用序列比对算法进行测定(例如，
FASTA version 3.0t78算法，采用缺省参数，或BLAST 2.2.2程序，采用在此所述的示例性设定)。
95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少
55％或至少50％序列同一性(同源性)的多肽，其中用序列比对算法进行测定(例如，
FASTA version 3.0t78算法，采用缺省参数，或BLAST 2.2.2程序，采用在此所述的示例性设定)。
[0329] 抑制磷脂酶的表达
[0330] 本发明还提供与本发明的核酸互补的核酸(例如，反义序列)，例如，编码磷脂酶的核酸。反义序列能够抑制编码磷脂酶的基因的转运、剪切或转录。抑制可以通过靶向基
因组DNA或信使RNA(mRNA，转录)进行。目标核酸的转录或功能可以通过例如杂交和/或
裂解抑制。本发明提供的一组特别有用的抑制子包括能够结合磷脂酶基因和/或信使的寡
核苷酸，其在任一情况下防止或抑制磷脂酶的生产或功能。可以通过序列特异性杂交来进
行结合。另一组有用的抑制子包括导致磷脂酶信使失活或裂解的寡核苷酸。寡核苷酸可以
具有导致裂解的酶活性，例如核酶。寡核苷酸可以是化学修饰的或被偶联至能够裂解互补
核酸的酶或组合物。可以筛选很多不同寡核苷酸的库，以得到具有目标活性的寡核苷酸。
因组DNA或信使RNA(mRNA，转录)进行。目标核酸的转录或功能可以通过例如杂交和/或
裂解抑制。本发明提供的一组特别有用的抑制子包括能够结合磷脂酶基因和/或信使的寡
核苷酸，其在任一情况下防止或抑制磷脂酶的生产或功能。可以通过序列特异性杂交来进
行结合。另一组有用的抑制子包括导致磷脂酶信使失活或裂解的寡核苷酸。寡核苷酸可以
具有导致裂解的酶活性，例如核酶。寡核苷酸可以是化学修饰的或被偶联至能够裂解互补
核酸的酶或组合物。可以筛选很多不同寡核苷酸的库，以得到具有目标活性的寡核苷酸。
[0331] 抑制磷脂酶表达可以具有多种工业应用。例如，抑制磷脂酶表达可以减缓或防止腐败。在脂质或多肽(例如，结构脂质或多肽)酶降解时可能发生腐败。这可能会导致水果
和蔬菜的变质或腐烂。在一个方面，使用本发明的组合物抑制磷脂酶的表达和/或活性，例如，抗体、反义寡核苷酸、核酶和RNAi，被用来减缓或防止腐败。因此，在一个方面，本发明提供包括将本发明的抗体、反义寡核苷酸、核酶和RNAi应用到植物或植物产品(例如，果实、种子、根、叶等)上以减缓或防止腐败的方法和组合物。这些组合物也可以由植物(例如，
转基因植物)或另一种生物体(例如，用本发明的磷脂酶基因转化的细菌或其他微生物)
表达。
和蔬菜的变质或腐烂。在一个方面，使用本发明的组合物抑制磷脂酶的表达和/或活性，例如，抗体、反义寡核苷酸、核酶和RNAi，被用来减缓或防止腐败。因此，在一个方面，本发明提供包括将本发明的抗体、反义寡核苷酸、核酶和RNAi应用到植物或植物产品(例如，果实、种子、根、叶等)上以减缓或防止腐败的方法和组合物。这些组合物也可以由植物(例如，
转基因植物)或另一种生物体(例如，用本发明的磷脂酶基因转化的细菌或其他微生物)
表达。
[0332] 本发明的用于抑制磷脂酶表达的组合物(例如，反义、iRNA、核酶、抗体)可以用作药物组合物。
[0333] 反义寡核苷酸
[0334] 本发明提供反义寡核苷酸，其能够结合磷脂酶信使并通过靶向mRNA抑制磷脂酶活性。设计反义寡核苷酸的策略在科技和专利文献中已有详细描述，并且本领域技术
人员能够使用本发明的新型试剂来设计这类磷脂酶寡核苷酸。例如，用于筛选有效的反
义寡核苷酸的基因巡查法/RNA作图流程是本领域公知的，参见，例如，Ho(2000)Methods
Enzymol.314：168-183，其描述RNA作图分析，其基于标准分子技术以提供简单可靠的选择潜在反义序列的方法。还参见Smith(2000)Eur.J.Pharm.Sci.11：191-198。
人员能够使用本发明的新型试剂来设计这类磷脂酶寡核苷酸。例如，用于筛选有效的反
义寡核苷酸的基因巡查法/RNA作图流程是本领域公知的，参见，例如，Ho(2000)Methods
Enzymol.314：168-183，其描述RNA作图分析，其基于标准分子技术以提供简单可靠的选择潜在反义序列的方法。还参见Smith(2000)Eur.J.Pharm.Sci.11：191-198。
[0335] 天然产生的核酸被用作反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是任何长度；例如，在可选方面，反义寡核苷酸为约5～100、约10～80、约15～60、约18～40。最佳长度可
以通过常规筛选进行测定。反义寡核苷酸可以存在于任何浓度。最佳浓度可以通过常规
筛选进行测定。各种各样的合成的、非天然产生的核苷酸和核酸类似物是已知的，其可以
解决该潜在问题。例如，可以使用含有非离子骨架的肽核酸(PNA)，例如N-(2-氨基乙基)
甘氨酸单元。也可以使用具有硫代磷酸酯连接的反义寡核苷酸，如描述于WO 97/03211；WO
96/39154；Mata(1997)Toxicol Appl Pharmacol 144：189-197；Antisense Therapeutics，ed.Agrawal(Humana Press，Totowa，N.J.，1996)。本发明提供的具有合成DNA骨架类似物的反义寡核苷酸还可以包括二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3’-硫缩醛、亚甲基(甲亚氨基)、3’-N-氨基甲酸酯和吗啉基氨基甲酸酯核酸，如上所述。
以通过常规筛选进行测定。反义寡核苷酸可以存在于任何浓度。最佳浓度可以通过常规
筛选进行测定。各种各样的合成的、非天然产生的核苷酸和核酸类似物是已知的，其可以
解决该潜在问题。例如，可以使用含有非离子骨架的肽核酸(PNA)，例如N-(2-氨基乙基)
甘氨酸单元。也可以使用具有硫代磷酸酯连接的反义寡核苷酸，如描述于WO 97/03211；WO
96/39154；Mata(1997)Toxicol Appl Pharmacol 144：189-197；Antisense Therapeutics，ed.Agrawal(Humana Press，Totowa，N.J.，1996)。本发明提供的具有合成DNA骨架类似物的反义寡核苷酸还可以包括二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3’-硫缩醛、亚甲基(甲亚氨基)、3’-N-氨基甲酸酯和吗啉基氨基甲酸酯核酸，如上所述。
[0336] 可以使用组合化学方法制备多种寡核苷酸，其可以被快速筛选得到特异性寡核苷酸，后者具有合适的结合亲和性以及对任何目标(例如本发明的正义和反义磷脂酶序列)
的特异性(参见，例如，Gold(1995)J.of Biol.Chem.270：13581-13584)。
的特异性(参见，例如，Gold(1995)J.of Biol.Chem.270：13581-13584)。
[0337] 抑制性核酶
[0338] 本发明提供能够结合磷脂酶信使的核酶，其可以通过靶向mRNA抑制磷脂酶活性。设计核酶和选择用于靶向的磷脂酶特异性反义序列的策略在科技和专利文献中已有详细
描述，并且本领域技术人员能够使用本发明的新型试剂来设计这种核酶。核酶通过其目标
RNA结合部分结合至目标RNA以发生作用，结合部分紧邻RNA的酶部分，其裂解目标RNA。因
而，核酶通过互补碱基配对识别并结合目标RNA，并且一旦结合至正确位点，就进行酶催化裂解和失活目标RNA。如果裂解发生在编码序列中，那么以该方式进行的目标RNA裂解能够
破坏其引导编码蛋白合成的能力。在核酶结合并裂解其RNA目标后，其一般从RNA上进行
释放并从而能够反复结合和裂解新的目标。
描述，并且本领域技术人员能够使用本发明的新型试剂来设计这种核酶。核酶通过其目标
RNA结合部分结合至目标RNA以发生作用，结合部分紧邻RNA的酶部分，其裂解目标RNA。因
而，核酶通过互补碱基配对识别并结合目标RNA，并且一旦结合至正确位点，就进行酶催化裂解和失活目标RNA。如果裂解发生在编码序列中，那么以该方式进行的目标RNA裂解能够
破坏其引导编码蛋白合成的能力。在核酶结合并裂解其RNA目标后，其一般从RNA上进行
释放并从而能够反复结合和裂解新的目标。
[0339] 在一些情况下，核酶的酶性质相对于其他技术(例如反义技术(其中核酸分子简单结合核酸目标以阻断其转录、翻译或与另一分子结合)可以是有利的，因为作为治疗所
必需的有效核酶浓度可以比反义寡核苷酸的低。这种潜在优势反映了核酶进行酶作有的能
力。因而，单一的核酶分子能够裂解目标RNA的很多分子。此外，核酶一般是高特异性的
抑制剂，其抑制特异性不仅取决于结合的碱基配对机理，还取决于该分子抑制其结合的RNA表达的机理。即，抑制是由RNA目标的裂解导致的，从而特异性定义为目标RNA裂解速率与
非目标RNA裂解速率之间的比率。该裂解机理依赖于那些涉及碱基配对之外的因素。因而，核酶作用的特异性可以比结合相同RNA位点的反义寡核苷酸更显著。
必需的有效核酶浓度可以比反义寡核苷酸的低。这种潜在优势反映了核酶进行酶作有的能
力。因而，单一的核酶分子能够裂解目标RNA的很多分子。此外，核酶一般是高特异性的
抑制剂，其抑制特异性不仅取决于结合的碱基配对机理，还取决于该分子抑制其结合的RNA表达的机理。即，抑制是由RNA目标的裂解导致的，从而特异性定义为目标RNA裂解速率与
非目标RNA裂解速率之间的比率。该裂解机理依赖于那些涉及碱基配对之外的因素。因而，核酶作用的特异性可以比结合相同RNA位点的反义寡核苷酸更显著。
[0340] 酶活性核酶RNA分子可以形成锤头状基序，还可以形成发夹状、丁型肝炎病毒、I组内含子或RNaseP-样RNA(结合于RNA引导序列)基序。该锤头状基序的示
例描述于Rossi(1992)Aids Research and Human Retroviruses 8：183；发夹状基序
描 述于Hampel(1989)Biochemistry 28：4929，以及 Hampel(1990)Nuc.Acids Res.18：
299；丁型肝炎病毒基序描述于Perrotta(1992)Biochemistry 31：16；RNaseP基序
描述于Guerrier-Takada(1983)Cell 35：849；和I组内含子描述于Cech(美国专利
No.4,987,071)。详述这些特异性基序并不用于进行限制；本领域技术人员应当认识到本发明的酶RNA分子可以具有互补于一种或多种目标基因RNA区域的特异性底物结合位点，且
在该底物结合位点内部或附近具有核苷酸序列，其赋予该分子RNA裂解活性。
例描述于Rossi(1992)Aids Research and Human Retroviruses 8：183；发夹状基序
描 述于Hampel(1989)Biochemistry 28：4929，以及 Hampel(1990)Nuc.Acids Res.18：
299；丁型肝炎病毒基序描述于Perrotta(1992)Biochemistry 31：16；RNaseP基序
描述于Guerrier-Takada(1983)Cell 35：849；和I组内含子描述于Cech(美国专利
No.4,987,071)。详述这些特异性基序并不用于进行限制；本领域技术人员应当认识到本发明的酶RNA分子可以具有互补于一种或多种目标基因RNA区域的特异性底物结合位点，且
在该底物结合位点内部或附近具有核苷酸序列，其赋予该分子RNA裂解活性。
[0341] RNA干扰(RNAi)
[0342] 在一个方面，本发明提供RNA抑制性分子，所谓的“RNAi”分子，包括本发明的磷脂酶序列。RNAi分子包括双链RNA(dsRNA)分子。RNAi可以抑制磷脂酶基因的表达。在一个方面，RNAi分子是长度约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的双核苷酸。虽然本发明并不限于任何特别的作用机理，但是RNAi可以进入细胞并导致具有相似或同一序
列的单链RNA(ssRNA)的降解，包括内源性mRNA。当细胞被暴露于双链RNA(dsRNA)时，来自
同源基因的mRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程选择性地降解。RNAi后面的一种可能
的基本机理是将匹配特异性基因序列的双链RNA(dsRNA)破坏成短的部分，称为短链干扰
RNA，其触发了匹配该序列的mRNA的降解。在一个方面，本发明的RNAi被用于基因-沉默治
疗，参见，例如，Shuey(2002)Drug Discov.Today 7：1040-1046。在一个方面，本发明提供使用本发明的RNAi选择性降解RNA的方法。该方法可以在试管中、体外或体内进行。在一个
方面，本发明的RNAi分子可以用于在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。制备和使用
选择性降解RNA的RNAi分子的方法是本领域公知的，参见，例如，美国专利No.6,506,559；
6,511,824；6,515,109；6,489,127。
列的单链RNA(ssRNA)的降解，包括内源性mRNA。当细胞被暴露于双链RNA(dsRNA)时，来自
同源基因的mRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程选择性地降解。RNAi后面的一种可能
的基本机理是将匹配特异性基因序列的双链RNA(dsRNA)破坏成短的部分，称为短链干扰
RNA，其触发了匹配该序列的mRNA的降解。在一个方面，本发明的RNAi被用于基因-沉默治
疗，参见，例如，Shuey(2002)Drug Discov.Today 7：1040-1046。在一个方面，本发明提供使用本发明的RNAi选择性降解RNA的方法。该方法可以在试管中、体外或体内进行。在一个
方面，本发明的RNAi分子可以用于在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。制备和使用
选择性降解RNA的RNAi分子的方法是本领域公知的，参见，例如，美国专利No.6,506,559；
6,511,824；6,515,109；6,489,127。
[0343] 核酸的修饰
[0344] 本发明提供产生本发明的核酸变体的方法，例如，编码磷脂酶的那些。在可选实施方案中，本发明提供修饰本发明的酶的方法，例如，通过随机方法或非随机方法或“定向进TM化”方法对编码序列进行的突变，如基因位点饱和诱变 (GSSM)，以改变活性的酶pH范围或最佳活性的范围、活性的温度或最佳活性的范围、特异性、活性(动力学)；糖基化、磷酸化或金属(例如，Ca、Mg、Zn、Fe、Na)的酶用途，例如，影响pH/温度稳定性。本发明提供修饰本发明的酶的方法，例如，通过对编码序列进行的突变，例如，通过GSSM，以提高对蛋白酶活性的耐性。本发明提供修饰本发明的酶的方法，例如，通过对编码序列进行的突变，例如，通过GSSM，以改变对Ca、Mg、Na特异性的金属螯合剂的酶用途，但不螯合Zn。本发明提供修饰本发明的酶的方法，例如，通过对编码序列进行的突变，例如，通过GSSM，这将具有目标活性组合，例如，PI、PA和PC/PE特异性PLC。
[0345] 在一个实施方案中，“基因位点饱和诱变”(GSSM)或“GSSM”包括使用简并寡核苷酸引物将点突变引入多核苷酸的方法，下面详细说明。在一个实施方案中，“最优化的定向进化系统”或“最优化的定向进化”包括重组相关核酸序列的片段的方法，例如，相关基因，下面详细说明。在一个实施方案中，“合成连接再组装”或“SLR”包括以非随机方式连接寡核苷酸片段的方法，下面详细说明。
[0346] 在可选实施方案中，本发明提供本发明的示例性核酸和多肽的“变体”，包括例如SEQ ID NO：8，例如由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：9编码。在可选实施方案中，本发明的多核苷酸或多肽的变体是被修饰于一种或多种碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基(分别)但是仍然保留磷脂酶的生物活性的核酸或多肽。变体可以是由任何方法进行生产，包括以下方法：例如，易错PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、GSSM及其任意组合。生产在某pH或温度下具有例如不同于野生型磷脂酶的活性的
变体磷脂酶的技术在此包括在内。
变体磷脂酶的技术在此包括在内。
[0347] 这些方法可以重复进行或以各种组合方式使用，以产生相对于由模板核酸编码的磷脂酶而言具有改变的或不同的活性、或改变的或不同的稳定性的磷脂酶。这些方法还可
以重复进行或以各种组合方式使用，例如，以产生基因/信息表达、信息翻译或信息稳定性的变化。在另一个方面，细胞的遗传组合物通过例如体外同源基因的修饰、然后重新插入细胞中而发生改变。
以重复进行或以各种组合方式使用，例如，以产生基因/信息表达、信息翻译或信息稳定性的变化。在另一个方面，细胞的遗传组合物通过例如体外同源基因的修饰、然后重新插入细胞中而发生改变。
[0348] 本发明的核酸可以通过任何方式进行改变。例如，随机方法或非随机方法，或“定向进化”方法。
[0349] 基因随机突变方法是本领域公知的，参见，例如，美国专利No.5,830,696。例如，诱变剂可以被用于随机突变基因。诱变剂包括例如紫外线或γ射线，或化学诱变剂，例如，丝裂霉素、亚硝酸、光活化补骨脂素，其单独使用或组合使用，以诱导DNA断裂，从而进行重组修复。其他化学诱变剂包括例如亚硫酸氢钠、亚硝酸、羟胺、肼或甲酸。其他诱变剂是核苷酸前体类似物，例如，亚硝基胍、5-溴脲嘧啶、2-氨基嘌呤或吖啶。这些试剂可以被加入至PCR反应中代替核苷酸前体，从而突变序列。还可以使用嵌入剂，例如原黄素、吖啶黄素、奎纳克林等等。
[0350] 可以使用任何分子生物学技术，例如，随机PCR诱变，参见，例如，水稻(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5467-5471；或，组合多种盒式诱变，参见，例如，
Crameri(1995)Biotechniques 18：194-196。可选择地，核酸，例如，基因，可以在随机片段化后进行再组装，参见，例如，美国专利No.6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；
5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793。在可选方面，通过易错PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立、和/或这些方法与其他方法的组合，用于引入修饰、添加或缺失。
Crameri(1995)Biotechniques 18：194-196。可选择地，核酸，例如，基因，可以在随机片段化后进行再组装，参见，例如，美国专利No.6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；
5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793。在可选方面，通过易错PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立、和/或这些方法与其他方法的组合，用于引入修饰、添加或缺失。
[0351] 下述出版物描述了各种递归重组过程和/或方法，其可以包含于本发明的 方 法 中：Stemmer(1999)“Molecular breeding of viruses for targeting
and other clinical properties”Tumor Targeting 4：1-4；Ness(1999)Nature
Biotechnology17：893-896；Chang(1999)“Evolution of a cytokine using DNA
familyshuffling”Nature Biotechnology 17：793-797；Minshull (1999)“Protein
evolution by molecular breeding”Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；
Christians(1999)“Directed evolution of thymidine kinasefor AZT phosphorylation using DNA family shuffling”Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri(1998)“DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed
evolution”Nature 391：288-291；Crameri(1997)“Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling，”Nature Biotechnology 15：436-438；
Zhang(1997)“Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Patten等人(1997)“Applications of DNA shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri 等 人 (1996)“Construction and
evolution of antibody-phase libraries by DNA shuffling”Nature Medicine 2：
100-103；Gates等人(1996)“Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor`headpiece dimer`”Journal of
Molecular Biology 255：373-386；Stemmer(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR”In：
The Encyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers，New York.pp.447-457；
Crameri和Stemmer(1995)“Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtyPe cassettes”BioTechniques 18：194-195；
Stemmer等人(1995)“Single-step assembly of a gene and entire plasmid formlarge numbers of oligodeoxyribonucleotides”Gene，164：49-53；Stemmer(1995)“The
Evolution of Molecular Computation”Science 270：1510；Stemmer(1995)“Searching Sequence Space”Bio/Technology 13：549-553；Stemmer(1994)“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370：389-391；以及Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for
molecular evolution.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。
and other clinical properties”Tumor Targeting 4：1-4；Ness(1999)Nature
Biotechnology17：893-896；Chang(1999)“Evolution of a cytokine using DNA
familyshuffling”Nature Biotechnology 17：793-797；Minshull (1999)“Protein
evolution by molecular breeding”Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；
Christians(1999)“Directed evolution of thymidine kinasefor AZT phosphorylation using DNA family shuffling”Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri(1998)“DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed
evolution”Nature 391：288-291；Crameri(1997)“Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling，”Nature Biotechnology 15：436-438；
Zhang(1997)“Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Patten等人(1997)“Applications of DNA shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri 等 人 (1996)“Construction and
evolution of antibody-phase libraries by DNA shuffling”Nature Medicine 2：
100-103；Gates等人(1996)“Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor`headpiece dimer`”Journal of
Molecular Biology 255：373-386；Stemmer(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR”In：
The Encyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers，New York.pp.447-457；
Crameri和Stemmer(1995)“Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtyPe cassettes”BioTechniques 18：194-195；
Stemmer等人(1995)“Single-step assembly of a gene and entire plasmid formlarge numbers of oligodeoxyribonucleotides”Gene，164：49-53；Stemmer(1995)“The
Evolution of Molecular Computation”Science 270：1510；Stemmer(1995)“Searching Sequence Space”Bio/Technology 13：549-553；Stemmer(1994)“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370：389-391；以及Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for
molecular evolution.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。
[0352] 产生多样性的突变方法包括例如位点定向诱变(Ling等人(1997)“Approachesto DNA mutagenesis：an overview”Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale 等 人
(1996)“Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method”Methods Mo1.Bio1.57：369-374；Smith(1985)“In vitro mutagenesis”Ann.
Rev.Genet.19：423-462；Botstein 和 Shortle(1985)“Strategies and applications
of in vitro mutagenesis”Science 229：1193-1201；Carter(1986)“Site-directed
mutagenesis”Biochem.J.237：1-7； 和 Kunkel(1987)“The efficiency of
oligonucleotide directed mutagenesis”in Nucleic Acids & Molecular
Biology(Eckstein，F.和 Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；含 尿 嘧
啶 模 板 诱 变 (Kunkel(1985)“Rapid and efficient site-directed mutagenesis
without phenotyPic selection”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel 等
人 (1987)“Rapid and efficient site-directed mutagenesis without phenotyPic
selection”Methods in Enzymol.154，367-382；和 Bass 等 人 (1988)“Mutant Trp
repressors with new DNA-binding specificities”Science242：240-245)；寡 核 苷
酸 定 向 诱 变 (Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：
329-350(1987)；Zoller和Smith(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of
point mutations in any DNA fragment”Nucleic Acid Res.10：6487-6500；Zoller和S
mith(1983)“Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into
M13vectors”Methods in Enzymol.100：468-500；和Zoller和Smith(1987)“Oligonucle
otide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers
and a single-stranded DNA template”Methods in Enzymol.154：329-350)；硫代磷
酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等人(1985)“The use of phosphorothioate-modified
DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA”Nucl.Acids Res.13：
8749-8764；Taylor等人(1985)“The rapid generation of oligonucleotide-directed
mutations at highfrequency using phosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids
Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye(1986)“Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligo
nucleotide-directedmutagenesis”Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Sayers 等 人
(1988)“Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed
mutagenesis”Nucl.Acids Res.16：791-802；和Sayers等人(1988)“Strand specific
cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction
endonucleases in the presence of ethidium bromide”Nucl.Acids Res.16：
803-814)；使用缺口双链体DNA进行诱变(Kramer等人(1984)“The gapped duplex DNA
approach to oligonucleotide-directed mutation construction”Nucl.Acids Res.12：
9441-9456；Kramer 和 Fritz(1987)Methods in Enzymol.“Oligonucleotide-directe
d construction of mutations via gapped duplex DNA”154：350-367；Kramer 等 人
(1988)“Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations”Nucl.Acids Res.16：7207；
和Fritz 等人(1988)“Oligonucleotide-directed construction of mutations：a
gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro”Nucl.Acids
Res.16：6987-6999)。
(1996)“Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method”Methods Mo1.Bio1.57：369-374；Smith(1985)“In vitro mutagenesis”Ann.
Rev.Genet.19：423-462；Botstein 和 Shortle(1985)“Strategies and applications
of in vitro mutagenesis”Science 229：1193-1201；Carter(1986)“Site-directed
mutagenesis”Biochem.J.237：1-7； 和 Kunkel(1987)“The efficiency of
oligonucleotide directed mutagenesis”in Nucleic Acids & Molecular
Biology(Eckstein，F.和 Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；含 尿 嘧
啶 模 板 诱 变 (Kunkel(1985)“Rapid and efficient site-directed mutagenesis
without phenotyPic selection”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel 等
人 (1987)“Rapid and efficient site-directed mutagenesis without phenotyPic
selection”Methods in Enzymol.154，367-382；和 Bass 等 人 (1988)“Mutant Trp
repressors with new DNA-binding specificities”Science242：240-245)；寡 核 苷
酸 定 向 诱 变 (Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：
329-350(1987)；Zoller和Smith(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of
point mutations in any DNA fragment”Nucleic Acid Res.10：6487-6500；Zoller和S
mith(1983)“Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into
M13vectors”Methods in Enzymol.100：468-500；和Zoller和Smith(1987)“Oligonucle
otide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers
and a single-stranded DNA template”Methods in Enzymol.154：329-350)；硫代磷
酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等人(1985)“The use of phosphorothioate-modified
DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA”Nucl.Acids Res.13：
8749-8764；Taylor等人(1985)“The rapid generation of oligonucleotide-directed
mutations at highfrequency using phosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids
Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye(1986)“Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligo
nucleotide-directedmutagenesis”Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Sayers 等 人
(1988)“Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed
mutagenesis”Nucl.Acids Res.16：791-802；和Sayers等人(1988)“Strand specific
cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction
endonucleases in the presence of ethidium bromide”Nucl.Acids Res.16：
803-814)；使用缺口双链体DNA进行诱变(Kramer等人(1984)“The gapped duplex DNA
approach to oligonucleotide-directed mutation construction”Nucl.Acids Res.12：
9441-9456；Kramer 和 Fritz(1987)Methods in Enzymol.“Oligonucleotide-directe
d construction of mutations via gapped duplex DNA”154：350-367；Kramer 等 人
(1988)“Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations”Nucl.Acids Res.16：7207；
和Fritz 等人(1988)“Oligonucleotide-directed construction of mutations：a
gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro”Nucl.Acids
Res.16：6987-6999)。
[0353] 用于本发明的方法的其他方法包括点错配修复(Kramer(1984)“PointMismatch Repair”Cell 38：879-887)，使用修复缺失型宿主细胞进行诱变(Carter等
人 (1985)“Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13
vectors”Nucl.Acids Res.13：4431-4443；和Carter(1987)“Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors”Methods in Enzymol.154：
382-403)，缺失诱变(Eghtedarzadeh(1986)“Use of oligonucleotides to generate
large deletions”Nucl.Acids Res.14：5115)，限制性选择和限制性纯化(Wells等人
(1986)“Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition
state of subtilisin”Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423)，全基因合成诱 变
(Nambiar等 人 (1984)“Total synthesis and cloning of a gene coding for the
ribonuclease S protein”Science 223：1299-1301；Sakamar和 Khorana(1988)“Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide- 结 合 protein(transducin)”Nucl.Acids Res.14：6361-6372；
Wells 等 人 (1985)“Cassette mutagenesis：an efficient method for generation
of multiple mutations at defined sites”Gene 34：315-323；和Grundstrom 等 人
(1985)“Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale `shot-gun`gene
synthesis”Nucl.Acids Res.13：3305-3316)，双 链 断 裂 修 复 (Mandecki(1986)；
Arnold(1993)“Protein engineering for unusual environments”Current Opinion in Biotechnology 4：450-455.“Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis”Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181)。上述很多方法的其他细节见于Methods in
Enzymology Volume154，其还描述了对于各种诱变方法中排除问题的有效控制。
人 (1985)“Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13
vectors”Nucl.Acids Res.13：4431-4443；和Carter(1987)“Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors”Methods in Enzymol.154：
382-403)，缺失诱变(Eghtedarzadeh(1986)“Use of oligonucleotides to generate
large deletions”Nucl.Acids Res.14：5115)，限制性选择和限制性纯化(Wells等人
(1986)“Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition
state of subtilisin”Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423)，全基因合成诱 变
(Nambiar等 人 (1984)“Total synthesis and cloning of a gene coding for the
ribonuclease S protein”Science 223：1299-1301；Sakamar和 Khorana(1988)“Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide- 结 合 protein(transducin)”Nucl.Acids Res.14：6361-6372；
Wells 等 人 (1985)“Cassette mutagenesis：an efficient method for generation
of multiple mutations at defined sites”Gene 34：315-323；和Grundstrom 等 人
(1985)“Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale `shot-gun`gene
synthesis”Nucl.Acids Res.13：3305-3316)，双 链 断 裂 修 复 (Mandecki(1986)；
Arnold(1993)“Protein engineering for unusual environments”Current Opinion in Biotechnology 4：450-455.“Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis”Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181)。上述很多方法的其他细节见于Methods in
Enzymology Volume154，其还描述了对于各种诱变方法中排除问题的有效控制。
[0354] 还参见Stemmer的美国专利No.5,605,793(Feb.25，1997)，“Methods for体外Recombination”、Stemmer等人的美国专利No.5,811,238(Sep.22，1998)“Methods
for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative
Selection and Recombination”、Stemmer等 人 的 美 国 专 利 No.5,830,721(Nov.3，
1998)“DNA Mutagenesis by Random Fragementation and Reassembly”、Stemmer
等 人 的 美 国 专 利 No.5,834,252(Nov.10，1998)“End-Complementary Polymerase
Reaction”、Minshull等 人 的 美 国 专 利 No.5,837,458(Nov.17，1998)“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”、Stemmer 和 Crameri 的
WO 95/22625“Mutagenesis by RandomFragmentation and Reassembly”、Stemmer 和
Lipschutz的WO 96/33207“End Complementary Polymerase Chain Reaction”、Stemmer
和Crameri的WO97/20078“Methods for Generating Polynucleotides having Desired
Characteristics by Iterative Selection and Recombination”、WO 97/35966，Minshull和Stemmer“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”、
Punnonen等人的WO 99/41402“Targeting of Genetic Vaccine Vectors”、Punnonen等人的WO 99/41383“Antigen Library Immunization”、Punnonen等人的WO 99/41369“Genetic Vaccine Vector Engineering”、Punnonen 等 人 的 WO 99/41368“Optimization of
Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”、Stemmer 和 Crameri 的 EP
752008“DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”、Stemmer的EP
0932670“Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”、
Stemmer等人的WO 99/23107“Modification of Virus Tropism and Host Range by
Viral Genome Shuffing”、Apt等人的WO 99/21979“Human Papillomavirus Vecotrs”、del Cardayre 等人的 WO 98/31837“Evolution of Whole Cells and Organisms by
Recursive Sequence Recombination”、Patten 和Stemmer 的WO 98/27230“Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”、Stemmer等人的WO 98/27230“Methods
for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and
Selection”、WO 00/00632“Methods for Generating Highly Diverse Libraries”、WO
00/09679“Methods for Obtaining In vitro Recombined Polynucleotide Sequence
Banks and Resulting Sequences”、Arnold等 人 的 WO 98/42832“Recombination of
Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers”、Arnold等 人的 WO
99/29902“Method for Creating Polynucleotide and PolyPeptide Sequences”、Vind 的WO 98/41653“An in vitro Method forConstruction of a DNA Library”、Borchert等人的WO 98/41622“Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling”以及Pati和Zarling 的WO98/42727“Sequence Alterations using Homologous Recombination”。
for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative
Selection and Recombination”、Stemmer等 人 的 美 国 专 利 No.5,830,721(Nov.3，
1998)“DNA Mutagenesis by Random Fragementation and Reassembly”、Stemmer
等 人 的 美 国 专 利 No.5,834,252(Nov.10，1998)“End-Complementary Polymerase
Reaction”、Minshull等 人 的 美 国 专 利 No.5,837,458(Nov.17，1998)“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”、Stemmer 和 Crameri 的
WO 95/22625“Mutagenesis by RandomFragmentation and Reassembly”、Stemmer 和
Lipschutz的WO 96/33207“End Complementary Polymerase Chain Reaction”、Stemmer
和Crameri的WO97/20078“Methods for Generating Polynucleotides having Desired
Characteristics by Iterative Selection and Recombination”、WO 97/35966，Minshull和Stemmer“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”、
Punnonen等人的WO 99/41402“Targeting of Genetic Vaccine Vectors”、Punnonen等人的WO 99/41383“Antigen Library Immunization”、Punnonen等人的WO 99/41369“Genetic Vaccine Vector Engineering”、Punnonen 等 人 的 WO 99/41368“Optimization of
Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”、Stemmer 和 Crameri 的 EP
752008“DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”、Stemmer的EP
0932670“Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”、
Stemmer等人的WO 99/23107“Modification of Virus Tropism and Host Range by
Viral Genome Shuffing”、Apt等人的WO 99/21979“Human Papillomavirus Vecotrs”、del Cardayre 等人的 WO 98/31837“Evolution of Whole Cells and Organisms by
Recursive Sequence Recombination”、Patten 和Stemmer 的WO 98/27230“Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”、Stemmer等人的WO 98/27230“Methods
for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and
Selection”、WO 00/00632“Methods for Generating Highly Diverse Libraries”、WO
00/09679“Methods for Obtaining In vitro Recombined Polynucleotide Sequence
Banks and Resulting Sequences”、Arnold等 人 的 WO 98/42832“Recombination of
Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers”、Arnold等 人的 WO
99/29902“Method for Creating Polynucleotide and PolyPeptide Sequences”、Vind 的WO 98/41653“An in vitro Method forConstruction of a DNA Library”、Borchert等人的WO 98/41622“Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling”以及Pati和Zarling 的WO98/42727“Sequence Alterations using Homologous Recombination”。
[0355] 一些美国申请提供了关于产生各种多样性的额外细节，包括Patten等人提交 于 1999年 9 月28 日 的 (U.S.Ser.No.09/407,800)，“SHUFFLING OFCODON ALTERED GENES”；del Cardayre等 人 提 交 于1998年7 月15日 的(U.S.Ser.No.09/166,188)
和1999年 7月 15日 的 (U.S.Ser.No.09/354,922)“EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND
ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”；Crameri等人提交于1999年9
月28日的(U.S.Ser.No.09/408,392)，″OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEICACID″
和Crameri等人提交于2000年1月18日的(PCT/US00/01203)，″OLIGONUCLEOTIDE
MEDIATED NUCLEIC ACID ″；Welch 等 人 提 交 于 1999年 9 月 28 日 的 (U.S.Ser.
No.09/408,393)，″USE OF CODON-VARIEDOLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC
SHUFFLING″；Selifonov等人提交于2000年1月18日的(PCT/US00/01202)，″METHODS
FOR MAKING CHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED
CHARACTERIS TICS″，以及例如Selifonov等人提交于2000年7月18日的(U.S.Ser.
No.09/618,579)， ″ METHODS FOR MAKINGCHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDES &
POLYPEPTIDES HAVINGDESIRED CHARACTERISTICS″；Selifonov和Stemmer提交于2000年
1月18日的(PCT/US00/01138)，″METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE
IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS″；和Affholter提交于2000年9月6日的(U.S.Ser.
No.09/656,549)，″SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION″。
和1999年 7月 15日 的 (U.S.Ser.No.09/354,922)“EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND
ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”；Crameri等人提交于1999年9
月28日的(U.S.Ser.No.09/408,392)，″OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEICACID″
和Crameri等人提交于2000年1月18日的(PCT/US00/01203)，″OLIGONUCLEOTIDE
MEDIATED NUCLEIC ACID ″；Welch 等 人 提 交 于 1999年 9 月 28 日 的 (U.S.Ser.
No.09/408,393)，″USE OF CODON-VARIEDOLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC
SHUFFLING″；Selifonov等人提交于2000年1月18日的(PCT/US00/01202)，″METHODS
FOR MAKING CHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED
CHARACTERIS TICS″，以及例如Selifonov等人提交于2000年7月18日的(U.S.Ser.
No.09/618,579)， ″ METHODS FOR MAKINGCHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDES &
POLYPEPTIDES HAVINGDESIRED CHARACTERISTICS″；Selifonov和Stemmer提交于2000年
1月18日的(PCT/US00/01138)，″METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE
IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS″；和Affholter提交于2000年9月6日的(U.S.Ser.
No.09/656,549)，″SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION″。
[0356] 非随机，或“定向进化”方法包括例如使用饱和诱变(GSSMSM)、合成连接再组装(SLR)或其组合来修饰本发明的核酸以产生具有新的或改变的性质的磷脂酶(例如，在高
酸或碱性、高温等条件下具有活性)。由修饰的核酸编码的多肽在检测其磷脂酶或其他活性之前可以进行活性筛选。可以采用任何检测模型或方法，例如，毛细管阵列平台。参见，例如，美国专利No.6,280,926；5,939,250。
酸或碱性、高温等条件下具有活性)。由修饰的核酸编码的多肽在检测其磷脂酶或其他活性之前可以进行活性筛选。可以采用任何检测模型或方法，例如，毛细管阵列平台。参见，例如，美国专利No.6,280,926；5,939,250。
[0357] 饱和诱变或GSSM
[0358] 在本发明的一个方面，非随机基因修饰的“定向进化过程”被用于产生具有新的或改变的性质的磷脂酶。该方法的变型被命名为“基因位点诱变”、“位点饱和诱变”、“基因位点饱和诱变”或简单的“GSSM”。其可以与其他诱变处理过程联用。参见，例如，美国专利No.6,171,820；6,238,884。在一个方面，GSSM包括提供模板多核苷酸和多种寡核苷酸，其中各寡核苷酸包括模板多核苷酸的同源序列，从而其靶向模板多核苷酸的特异性序列，以及作为同源基因的变体的序列；通过采用寡核苷酸复制模板多核苷酸以产生包含非随机序
列变化的子代多核苷酸，从而产生包含同源基因序列变化的多核苷酸。
列变化的子代多核苷酸，从而产生包含同源基因序列变化的多核苷酸。
[0359] 在一个方面，含有简并N，N，G/T序列的密码子引物被用于向多核苷酸中引入点突变，从而产生一套子代多肽，其中在每个氨基酸位点具有全范围的单点氨基酸取代，例如，在修饰目标的酶活性位点或配体结合位点的氨基酸残基。这些寡核苷酸可以包括连续的第一同源序列，简并N，N，G/T序列，和任选地，包括第二同源序列。使用该寡核苷酸得到的下游子代翻译产品包括沿着多肽的每个氨基酸位点处所有可能的氨基酸改变，因为N，N，G/T序列的简并性包括全部20种氨基酸的密码子。在一个方面，一种这样的简并寡核苷酸(包
括例如一种简并N，N，G/T盒)被用于进行亲代多核苷酸模板中的各初始密码子的全范围的
密码子取代。在另一个方面，使用了至少两种简并盒，其位于相同或不同的寡核苷酸中，用于进行亲代多核苷酸模板中的至少两种初始密码子的全范围的密码子取代。例如，多于一
种的N，N，G/T序列可以被包含在一种寡核苷酸内，以在多于一个位点处引入氨基酸突变。
该多种N，N，G/T序列可以是一直连续的，或由一种或多种另外的核苷酸序列所隔开。在另一个方面，适用于引入添加和缺失的寡核苷酸可以被单独使用或与含有N，N，G/T序列的密码子组合使用，以引入任何组合或前突变的氨基酸添加、缺失、和/或取代。
括例如一种简并N，N，G/T盒)被用于进行亲代多核苷酸模板中的各初始密码子的全范围的
密码子取代。在另一个方面，使用了至少两种简并盒，其位于相同或不同的寡核苷酸中，用于进行亲代多核苷酸模板中的至少两种初始密码子的全范围的密码子取代。例如，多于一
种的N，N，G/T序列可以被包含在一种寡核苷酸内，以在多于一个位点处引入氨基酸突变。
该多种N，N，G/T序列可以是一直连续的，或由一种或多种另外的核苷酸序列所隔开。在另一个方面，适用于引入添加和缺失的寡核苷酸可以被单独使用或与含有N，N，G/T序列的密码子组合使用，以引入任何组合或前突变的氨基酸添加、缺失、和/或取代。
[0360] 在一个方面，使用含有连续N，N，G/T三联体，即简并(N，N，G/T)n序列的寡核苷酸同时诱变两个或更多连续的氨基酸位点。在另一个方面，使用具有简并性低于N，N，G/T序列的简并盒。例如，在一些情况下(例如，在寡核苷酸中)可能需要使用包括只有一个N的简并三联体序列，其中所述N可以位于三联体的第一、第二或第三位点。包括其任何组合和前突变的任何其他碱基都可被用于三联体剩余的两个位点。可选择地，在一些情况下(例
如，在寡核苷酸中)可能需要使用简并N，N，N三联体序列。
如，在寡核苷酸中)可能需要使用简并N，N，N三联体序列。
[0361] 在一个方面，简并三联体(例如，N，N，G/T三联体)的使用允许了系统方便地在多肽的每个氨基酸位点产生全范围的可能天然氨基酸(全部20种氨基酸)(在可选方面，该方法还包括在每个氨基酸残基或密码子、位点产生小于所有可能的取代)。例如，对于100
个氨基酸的多肽，可以产生2000个不同种类(即，每位点20种可能的氨基酸×100个氨基
酸位点)。通过使用寡核苷酸或含有简并N，N，G/T三联体的系列寡核苷酸，32种不同序列
可以编码全部20种可能的天然氨基酸。因而，在使用至少一种该寡核苷酸对亲代多核苷酸
序列进行饱和诱变的反应管中含有产生的编码20种不同多肽的32种不同子代多核苷酸。
相反，在位点定向诱变中使用非简并寡核苷酸导致每个反应管中只有一种子代多肽产物。
非简并寡核苷酸可以任选地与公开的简并引物联用；例如，非简并寡核苷酸可以被用于在
操作多核苷酸中产生特异性点突变。其提供了一种方法以产生特异性沉默点突变、导致相
应氨基酸改变的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段相应表达的点突变。
个氨基酸的多肽，可以产生2000个不同种类(即，每位点20种可能的氨基酸×100个氨基
酸位点)。通过使用寡核苷酸或含有简并N，N，G/T三联体的系列寡核苷酸，32种不同序列
可以编码全部20种可能的天然氨基酸。因而，在使用至少一种该寡核苷酸对亲代多核苷酸
序列进行饱和诱变的反应管中含有产生的编码20种不同多肽的32种不同子代多核苷酸。
相反，在位点定向诱变中使用非简并寡核苷酸导致每个反应管中只有一种子代多肽产物。
非简并寡核苷酸可以任选地与公开的简并引物联用；例如，非简并寡核苷酸可以被用于在
操作多核苷酸中产生特异性点突变。其提供了一种方法以产生特异性沉默点突变、导致相
应氨基酸改变的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段相应表达的点突变。
[0362] 在一个方面，各饱和诱变反应管含有编码至少20种子代多肽(例如，磷脂酶)分子的多核苷酸，从而在诱变处理的亲代多核苷酸中，全部20种天然氨基酸都出现于对应于
密码子位点的一个特异性氨基酸位点(其他方面使用小于全部20种天然组合)。产生于各
饱和诱变反应管的32倍简并子代多肽可以进行克隆扩增(例如，使用例如表达载体克隆入
适当的宿主，例如，大肠杆菌宿主)，并进行表达筛选。当各子代多肽通过筛选鉴定为能表现出有利的性质变化(与亲代多肽相比，例如在碱性或酸性条件下，增加的磷脂酶活性)，其
可以被测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸取代。
密码子位点的一个特异性氨基酸位点(其他方面使用小于全部20种天然组合)。产生于各
饱和诱变反应管的32倍简并子代多肽可以进行克隆扩增(例如，使用例如表达载体克隆入
适当的宿主，例如，大肠杆菌宿主)，并进行表达筛选。当各子代多肽通过筛选鉴定为能表现出有利的性质变化(与亲代多肽相比，例如在碱性或酸性条件下，增加的磷脂酶活性)，其
可以被测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸取代。
[0363] 在一个方面，亲代多肽每个氨基酸位点使用在此公开的饱和诱变进行诱变处理后，有利的氨基酸改变可以在多于一个氨基酸位点处进行鉴定。可以产生一种或多种新的
子代分子，其含有全部或部分的这些有利的氨基酸取代的组合。例如，如果在多肽的每3
个氨基酸位点中鉴定出2个有利的特异性氨基酸改变，则前突变包括在每个位点的3种可
能性(对于初始氨基酸无改变，以及二者之一发生有利的改变)和3个位点。因而，共有
3×3×3或27种可能性，包括7种之前考察过的-6个单独点突变(即，每3个位点有2个)
和在任何位点没有改变。
子代分子，其含有全部或部分的这些有利的氨基酸取代的组合。例如，如果在多肽的每3
个氨基酸位点中鉴定出2个有利的特异性氨基酸改变，则前突变包括在每个位点的3种可
能性(对于初始氨基酸无改变，以及二者之一发生有利的改变)和3个位点。因而，共有
3×3×3或27种可能性，包括7种之前考察过的-6个单独点突变(即，每3个位点有2个)
和在任何位点没有改变。
[0364] 在另一个方面，位点-饱和诱变可以与另一种随机或非随机方式联用以改变序列，例如，合成连接再组装(参见下文)、重排、嵌合、重组和其他诱变处理方法和诱变处理试剂。本发明提供任何诱变处理方法，包括饱和诱变，其以迭代方式使用。
[0365] 合成连接再组装(SLR)
[0366] 本发明提供非随机基因修饰系统，被称为“合成连接再组装”或简单的“SLR”、“定向进化过程”，其用于产生具有新的或改变的性质的磷脂酶。SLR是非随机性连接寡核苷酸片段的方法。该方法与随机寡核苷酸重排的不同之处在于，核酸砌块没有进行
随机重排、连接或嵌合，而是非随机性地进行组装。参见，例如，美国专利申请Serial
No.(USSN)09/332,835，标题“Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution”，
1999年6月14日提交(“USSN09/332,835”)。在一个方面，SLR包括以下步骤：(a)提供
模板多核苷酸，其中所述模板多核苷酸包括编码同源基因的序列；(b)提供多种砌块多核
苷酸，其中所述砌块多核苷酸被设计为按照预设的序列与模板多核苷酸进行交叉再组装，
且砌块多核苷酸包括作为同源基因变体的序列和与变体序列两侧的模板多核苷酸同源的
序列；(c)将砌块多核苷酸与模板多核苷酸结合，使得砌块多核苷酸与模板多核苷酸进行
交叉再组装，以产生包含同源基因序列变化的多核苷酸。
随机重排、连接或嵌合，而是非随机性地进行组装。参见，例如，美国专利申请Serial
No.(USSN)09/332,835，标题“Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution”，
1999年6月14日提交(“USSN09/332,835”)。在一个方面，SLR包括以下步骤：(a)提供
模板多核苷酸，其中所述模板多核苷酸包括编码同源基因的序列；(b)提供多种砌块多核
苷酸，其中所述砌块多核苷酸被设计为按照预设的序列与模板多核苷酸进行交叉再组装，
且砌块多核苷酸包括作为同源基因变体的序列和与变体序列两侧的模板多核苷酸同源的
序列；(c)将砌块多核苷酸与模板多核苷酸结合，使得砌块多核苷酸与模板多核苷酸进行
交叉再组装，以产生包含同源基因序列变化的多核苷酸。
[0367] SLR不依赖于要进行重排的多核苷酸之间存在的高水平同源性。因而，该方法可以100
被用于非随机产生子代分子的文库(或集合)，其包括超过10 不同的嵌合体。SLR可以
1000
被用于产生文库，其包括超过10 不同子代嵌合体。因此，本发明的各方面包括生产一系
列完成的嵌合核酸分子的非随机方法，其具有设计选择的全装配顺序。该方法包括以下步
骤：设计产生多种特异性核酸砌块，其具有合适的相互兼容的连接末端，以及组装这些核酸砌块，从而获得设计的全装配顺序。
被用于非随机产生子代分子的文库(或集合)，其包括超过10 不同的嵌合体。SLR可以
1000
被用于产生文库，其包括超过10 不同子代嵌合体。因此，本发明的各方面包括生产一系
列完成的嵌合核酸分子的非随机方法，其具有设计选择的全装配顺序。该方法包括以下步
骤：设计产生多种特异性核酸砌块，其具有合适的相互兼容的连接末端，以及组装这些核酸砌块，从而获得设计的全装配顺序。
[0368] 如果要组装的核酸砌块的相互兼容的连接末端能够将各砌块按照预设的顺序进行偶联，那么其被认为是“合适的”用于该类型的顺序装配。因而，核酸砌块可以偶联的全装配顺序由连接末端的设计决定。如果使用多于一种装配步骤，那么核酸砌块可以偶联的
全装配顺序还由装配步骤的顺序决定。在一个方面，退火的砌块用酶进行处理，例如连接酶(例如，T4DNA连接酶)，以获得共价结合的砌块。
全装配顺序还由装配步骤的顺序决定。在一个方面，退火的砌块用酶进行处理，例如连接酶(例如，T4DNA连接酶)，以获得共价结合的砌块。
[0369] 在一个方面，寡核苷酸砌块的设计是通过分析一系列前体核酸序列模板获得的，后者作为生产子代系列完成的嵌合多核苷酸的基础。这些亲代寡核苷酸模板从而作为序列
信息的来源辅助要进行诱变处理(例如，嵌合或重排)的核酸砌块的设计。
信息的来源辅助要进行诱变处理(例如，嵌合或重排)的核酸砌块的设计。
[0370] 在该方法的一个方面，对多种亲代核酸模板的序列进行比对来选择一种或多种分界点。分界点可以位于同源性区域，并由一种或多种核苷酸组成。这些分界点优选由至少
两种前体模板共享。从而分界点可以被用于描绘要产生的寡核苷酸砌块的边界，以重排亲
代多核苷酸。在前体分子中鉴定和选择的分界点作为最终嵌合的子代分子装配的潜在嵌合
点。分界点可以是由至少两种亲代多核苷酸序列共享的同源性区域(由至少一个同源核苷
酸碱基组成)。可选择地，分界点可以是由至少一半亲代多核苷酸序列共享的同源性区域，或者，其可以是由至少三分之二亲代多核苷酸序列共享的同源性区域。更优选的是，合适的分界点是由至少四分之三亲代多核苷酸序列共享的同源性区域，或，其可以是由几乎全部
亲代多核苷酸序列所共享的。在一个方面，分界点是由全部亲代多核苷酸序列所共享的同
源性区域。
两种前体模板共享。从而分界点可以被用于描绘要产生的寡核苷酸砌块的边界，以重排亲
代多核苷酸。在前体分子中鉴定和选择的分界点作为最终嵌合的子代分子装配的潜在嵌合
点。分界点可以是由至少两种亲代多核苷酸序列共享的同源性区域(由至少一个同源核苷
酸碱基组成)。可选择地，分界点可以是由至少一半亲代多核苷酸序列共享的同源性区域，或者，其可以是由至少三分之二亲代多核苷酸序列共享的同源性区域。更优选的是，合适的分界点是由至少四分之三亲代多核苷酸序列共享的同源性区域，或，其可以是由几乎全部
亲代多核苷酸序列所共享的。在一个方面，分界点是由全部亲代多核苷酸序列所共享的同
源性区域。
[0371] 在一个方面，完全进行连接再组装过程以产生子代嵌合多核苷酸的详尽文库。换言之，核酸砌块所有可能的顺序组合都被表示在完成的嵌合核酸分子中。同时，在另一个实施方案中，在每个组合中的装配顺序(即，在各完成的嵌合核酸的5’至3’序列中装配各砌块的顺序)按照如上所述进行设计(或非随机)。由于本发明的非随机性质，不想要的副产
物的可能性显著降低。
物的可能性显著降低。
[0372] 在另一个方面，连接再组装方法系统性地进行。例如，进行该方法以产生子代分子的系统性的区划文库，其各部分可以系统性地进行筛选，例如，一个接着一个地。换言之，本发明提供，通过选择性和判断性地使用特异性核酸砌块，其伴随着选择性和判断性地使用顺序步骤装配反应，可以在几个反应管中的每一个中进行设计制备特异性系列子代产物。
这允许进行系统性地检验和筛选过程。因而，这些方法允许潜在的非常巨大数量的子代分
子按照较小的组进行系统性检验。由于这些方法尤其是当前体分子间具有低同源性时能够
以高灵活性但是穷尽的和系统性的方式进行嵌合的能力，因此其提供了由大量子代分子组
成的文库(或集合)的产生。由于目前的连接再组装发明的非随机性质，产生的子代分子优
选包括完成的嵌合核酸分子的文库，其具有根据设计选定的全装配顺序。还可以使用饱和
诱变和最优化的定向进化方法产生不同子代分子种类。可以理解，本发明提供对于选择分
界点、核酸砌块的大小和数量、以及偶联的大小和设计的选择和控制自由度。还可以理解，为实施本发明，分子间同源性的需求可以是高松弛的。事实上，甚至可以在分子间同源性很小或不存在的区域选择分界点。例如，由于密码子摇摆，即，密码子简并性，可以向核酸砌块中引入核苷酸取代而不改变相应前体模板中原始编码的氨基酸。可选择地，密码子可以被
改变，从而初始氨基酸的编码发生改变。本发明提供可以在核酸砌块中引入取代以增强分
子间同源分界点的发生，并因而允许在砌块之间得到更多数量的偶联，其进一步允许产生
更多子代嵌合分子。
这允许进行系统性地检验和筛选过程。因而，这些方法允许潜在的非常巨大数量的子代分
子按照较小的组进行系统性检验。由于这些方法尤其是当前体分子间具有低同源性时能够
以高灵活性但是穷尽的和系统性的方式进行嵌合的能力，因此其提供了由大量子代分子组
成的文库(或集合)的产生。由于目前的连接再组装发明的非随机性质，产生的子代分子优
选包括完成的嵌合核酸分子的文库，其具有根据设计选定的全装配顺序。还可以使用饱和
诱变和最优化的定向进化方法产生不同子代分子种类。可以理解，本发明提供对于选择分
界点、核酸砌块的大小和数量、以及偶联的大小和设计的选择和控制自由度。还可以理解，为实施本发明，分子间同源性的需求可以是高松弛的。事实上，甚至可以在分子间同源性很小或不存在的区域选择分界点。例如，由于密码子摇摆，即，密码子简并性，可以向核酸砌块中引入核苷酸取代而不改变相应前体模板中原始编码的氨基酸。可选择地，密码子可以被
改变，从而初始氨基酸的编码发生改变。本发明提供可以在核酸砌块中引入取代以增强分
子间同源分界点的发生，并因而允许在砌块之间得到更多数量的偶联，其进一步允许产生
更多子代嵌合分子。
[0373] 在另一个方面，产生砌块的步骤的合成性质决定了其允许对核苷酸(例如，一种或多种的核苷酸，其可以是例如密码子或内含子或调控序列)进行设计和引入，其可以在
接下来的体外过程(例如，通过诱变)或体内过程(例如，通过利用宿主生物体的基因剪切
能力)中任选地被除去。可以理解，在很多情况下，除了创建合适分界点这一潜在优点外，引入这些核苷酸还可以是出于很多其他原因考虑的。
接下来的体外过程(例如，通过诱变)或体内过程(例如，通过利用宿主生物体的基因剪切
能力)中任选地被除去。可以理解，在很多情况下，除了创建合适分界点这一潜在优点外，引入这些核苷酸还可以是出于很多其他原因考虑的。
[0374] 在一个方面，核酸砌块被用于引入内含子。因而，功能性内含子被引入根据在此描述的方法制备的人造基因。人工引入的内含子可以在宿主细胞中具有基因剪切功能，其与天然产生的内含子的基因剪切功能非常相似。
[0375] 最优化的定向进化系统
[0376] 本发明提供非随机基因修饰系统，被称为“最优化的定向进化系统”，以产生具有新的或改变的性质的磷脂酶。最优化的定向进化用于减少的重配、重组和选择的重复循环，其允许通过重组进行核酸的定向分子进化。最优化的定向进化允许产生进化嵌合序列的大群体，其中产生的群体显著富集具有预设的交叉事件数量的序列。
[0377] 交叉事件是嵌合序列中的一个点，其中从一种亲代变体到另一种亲代变体发生序列迁移。所述点通常位于两种亲代寡核苷酸连接形成单一序列的结合处。该方法允许计算
寡核苷酸序列的正确浓度，从而最终嵌合的序列群体根据选定的交叉事件数量进行富集。
其对于选择具有预设的交叉事件数量的嵌合变体提供了更强的控制性。
寡核苷酸序列的正确浓度，从而最终嵌合的序列群体根据选定的交叉事件数量进行富集。
其对于选择具有预设的交叉事件数量的嵌合变体提供了更强的控制性。
[0378] 此外，该方法提供了一种较其他系统更为便利的方法用以搜索巨大数量的可能的13
蛋白变体空间。之前，如果在反应中产生了例如10 个嵌合分子，那么检测该高数量的嵌
合变体的特殊活性将会是非常困难的。此外，很大部分的子代群体将会具有非常高的交叉
事件数量，其结果是蛋白较不可能具有增加的特殊活性水平。通过使用这些方法，嵌合分子
13
的群体中可以富集具有特定的交叉事件数量的变体。因而，虽然在反应中还是产生了10
个嵌合分子，但是选择每种分子进一步分析的过程最可能仅具有例如三个交叉事件。由于
得到的子代群体可以倾向于具有预设的交叉事件数量，所以嵌合分子之间的功能多样性边
界被降低。在计算哪一种初始亲代多核苷酸的寡核苷酸可能导致对特定特征发生影响的时
候，其提供了更加可控的变量数量。
蛋白变体空间。之前，如果在反应中产生了例如10 个嵌合分子，那么检测该高数量的嵌
合变体的特殊活性将会是非常困难的。此外，很大部分的子代群体将会具有非常高的交叉
事件数量，其结果是蛋白较不可能具有增加的特殊活性水平。通过使用这些方法，嵌合分子
13
的群体中可以富集具有特定的交叉事件数量的变体。因而，虽然在反应中还是产生了10
个嵌合分子，但是选择每种分子进一步分析的过程最可能仅具有例如三个交叉事件。由于
得到的子代群体可以倾向于具有预设的交叉事件数量，所以嵌合分子之间的功能多样性边
界被降低。在计算哪一种初始亲代多核苷酸的寡核苷酸可能导致对特定特征发生影响的时
候，其提供了更加可控的变量数量。
[0379] 一种用于创建嵌合子代多核苷酸序列的方法是创建对应于各亲代序列的片段或部分的寡核苷酸。各寡核苷酸优选包括独特的重叠区域，从而将寡核苷酸一起混合产
生了一种新型变体，其具有以正确顺序装配的各寡核苷酸片段。额外信息可以参见USSN
09/332,835。每种亲代变体产生的寡核苷酸的数量与在最终创建的嵌合分子中得到的交叉
总数有关。例如，可以提供3个亲代核苷酸序列变体进行连接反应，以发现具有例如在高温下更大活性的嵌合变体。作为一个示例，可以对应于每种亲代变体的每个部分制备一系列
的50个寡核苷酸序列。因此，在连接再组装过程中，在每个嵌合序列内可能有多达50的交
叉事件。产生的每种嵌合多核苷酸中都含有改变顺序的来自各亲代变体的寡核苷酸的概率
非常低。如果每种寡核苷酸片段以等摩尔量存在于连接反应中，那么可能在一些位点处来
自相同亲代多核苷酸的寡核苷酸将会逐一相互连接，从而不产生交叉事件。如果在该例子
的任何连接步骤中，来自各亲代的每种寡核苷酸的浓度保持不变，那么有1/3的机会(假设
3个亲代)来自相同亲代变体的寡核苷酸将会在嵌合序列内连接而不产生交叉。
生了一种新型变体，其具有以正确顺序装配的各寡核苷酸片段。额外信息可以参见USSN
09/332,835。每种亲代变体产生的寡核苷酸的数量与在最终创建的嵌合分子中得到的交叉
总数有关。例如，可以提供3个亲代核苷酸序列变体进行连接反应，以发现具有例如在高温下更大活性的嵌合变体。作为一个示例，可以对应于每种亲代变体的每个部分制备一系列
的50个寡核苷酸序列。因此，在连接再组装过程中，在每个嵌合序列内可能有多达50的交
叉事件。产生的每种嵌合多核苷酸中都含有改变顺序的来自各亲代变体的寡核苷酸的概率
非常低。如果每种寡核苷酸片段以等摩尔量存在于连接反应中，那么可能在一些位点处来
自相同亲代多核苷酸的寡核苷酸将会逐一相互连接，从而不产生交叉事件。如果在该例子
的任何连接步骤中，来自各亲代的每种寡核苷酸的浓度保持不变，那么有1/3的机会(假设
3个亲代)来自相同亲代变体的寡核苷酸将会在嵌合序列内连接而不产生交叉。
[0380] 因此，可以测定概率密度函数(PDF)来预测在连接反应的各步骤中可能发生交叉事件的群体，其中给定亲代变体的系列数量、对应于各变体的寡核苷酸数量以及在连接反
应的各步骤中各变体的浓度。测定PDF后的统计学和数学在下文中描述。通过使用这些方
法，可以计算这种概率密度函数，并从而富集来自特定连接反应的预设交叉事件数量的嵌
合子代群体。此外，目标交叉事件数量可以是预设的，该系统然后按照程序计算连接反应
的各步骤中的各亲代寡核苷酸的起始数量，以产生预设的交叉事件数量的集中概率密度函
数。这些方法使用减少的重配、重组和选择的重复循环，其允许通过重组进行编码多肽的核酸的定向分子进化。该系统允许产生进化的嵌合序列的大群体，其中产生的群体中显著富
集具有预设的交叉事件数量的序列。交叉事件是嵌合序列中的一个点，其中从一种亲代变
体到另一种亲代变体发生序列迁移。所述点通常位于两种亲代寡核苷酸连接形成单一序列
的结合处。该方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，从而最终的嵌合序列群体根据选定
的交叉事件数量进行富集。其对于选择具有预设的交叉事件数量的嵌合变体提供了更强的
控制性。
应的各步骤中各变体的浓度。测定PDF后的统计学和数学在下文中描述。通过使用这些方
法，可以计算这种概率密度函数，并从而富集来自特定连接反应的预设交叉事件数量的嵌
合子代群体。此外，目标交叉事件数量可以是预设的，该系统然后按照程序计算连接反应
的各步骤中的各亲代寡核苷酸的起始数量，以产生预设的交叉事件数量的集中概率密度函
数。这些方法使用减少的重配、重组和选择的重复循环，其允许通过重组进行编码多肽的核酸的定向分子进化。该系统允许产生进化的嵌合序列的大群体，其中产生的群体中显著富
集具有预设的交叉事件数量的序列。交叉事件是嵌合序列中的一个点，其中从一种亲代变
体到另一种亲代变体发生序列迁移。所述点通常位于两种亲代寡核苷酸连接形成单一序列
的结合处。该方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，从而最终的嵌合序列群体根据选定
的交叉事件数量进行富集。其对于选择具有预设的交叉事件数量的嵌合变体提供了更强的
控制性。
[0381] 此外，这些方法提供了一种较其他系统更为便利的方法用以搜索巨大数量的可能的蛋白变体空间。通过使用在此所述的方法，嵌合分子的群体中可以富集具有特定的交叉
事件数量的变体。因而，虽然在反应中还是产生了10¨个嵌合分子，但是选择每种分子进
一步分析的过程最可能仅具有例如三个交叉事件。由于得到的子代群体可以倾向于具有
预设的交叉事件数量，所以嵌合分子之间的功能多样性边界被降低。在计算哪一种初始亲
代多核苷酸的寡核苷酸可能导致对特定特征发生影响的时候，其提供了更加可控的变量数
量。
事件数量的变体。因而，虽然在反应中还是产生了10¨个嵌合分子，但是选择每种分子进
一步分析的过程最可能仅具有例如三个交叉事件。由于得到的子代群体可以倾向于具有
预设的交叉事件数量，所以嵌合分子之间的功能多样性边界被降低。在计算哪一种初始亲
代多核苷酸的寡核苷酸可能导致对特定特征发生影响的时候，其提供了更加可控的变量数
量。
[0382] 在一个方面，该方法通过创建对应于各亲代序列的片段或部分的寡核苷酸来创建嵌合子代多核苷酸序列。各寡核苷酸优选包括独特的重叠区域，从而将寡核苷酸一
起混合产生了一种新型变体，其具有以正确顺序装配的各寡核苷酸片段。也参见USSN
09/332,835。
起混合产生了一种新型变体，其具有以正确顺序装配的各寡核苷酸片段。也参见USSN
09/332,835。
[0383] 每种亲代变体产生的寡核苷酸的数量与在最终创建的嵌合分子中得到的交叉总数有关。例如，可以提供3个亲代核苷酸序列变体进行连接反应，以发现具有例如在高温下更大活性的嵌合变体。作为一个示例，可以对应于每种亲代变体的每个部分制备一系列的
50个寡核苷酸序列。因此，在连接再组装过程中，在每个嵌合序列内可能有多达50的交叉
事件。产生的每种嵌合多核苷酸中都含有改变顺序的来自各亲代变体的寡核苷酸的概率非
常低。如果每种寡核苷酸片段以等摩尔量存在于连接反应中，那么可能在一些位点处来自
相同亲代多核苷酸的寡核苷酸将会逐一相互连接，从而不产生交叉事件。如果在该例子的
任何连接步骤中，来自各亲代的每种寡核苷酸的浓度保持不变，那么有1/3的机会(假设3
个亲代)来自相同亲代变体的寡核苷酸将会在嵌合序列内连接而不产生交叉。
50个寡核苷酸序列。因此，在连接再组装过程中，在每个嵌合序列内可能有多达50的交叉
事件。产生的每种嵌合多核苷酸中都含有改变顺序的来自各亲代变体的寡核苷酸的概率非
常低。如果每种寡核苷酸片段以等摩尔量存在于连接反应中，那么可能在一些位点处来自
相同亲代多核苷酸的寡核苷酸将会逐一相互连接，从而不产生交叉事件。如果在该例子的
任何连接步骤中，来自各亲代的每种寡核苷酸的浓度保持不变，那么有1/3的机会(假设3
个亲代)来自相同亲代变体的寡核苷酸将会在嵌合序列内连接而不产生交叉。
[0384] 因此，可以测定概率密度函数(PDF)来预测在连接反应的各步骤中可能发生交叉事件的群体，其中给定亲代变体的系列数量、对应于各变体的寡核苷酸数量以及在连接反
应的各步骤中各变体的浓度。测定PDF后的统计学和数学在下文中描述。可以计算这种概
率密度函数，并从而富集来自特定连接反应的预设交叉事件数量的嵌合子代群体。此外，目标交叉事件数量可以是预设的，该系统然后按照程序计算连接反应的各步骤中的各亲代寡
核苷酸的起始数量，以产生预设的交叉事件数量的集中概率密度函数。
应的各步骤中各变体的浓度。测定PDF后的统计学和数学在下文中描述。可以计算这种概
率密度函数，并从而富集来自特定连接反应的预设交叉事件数量的嵌合子代群体。此外，目标交叉事件数量可以是预设的，该系统然后按照程序计算连接反应的各步骤中的各亲代寡
核苷酸的起始数量，以产生预设的交叉事件数量的集中概率密度函数。
[0385] 测定交叉事件
[0386] 本发明的实施方案包括接受输入的目标交叉概率密度函数(PDF)、要再组装的亲代基因数量、以及再组装中的片段数量的系统和软件。该程序输出的是“片段PDF”，其可以被用于确定生产再组装基因的方法，以及这些基因的估计交叉PDF。在此描述的方法优选采TM
用MATLAB (The Mathworks，Natick，Massachusetts)进行，其是一种用于技术计算的程序语言和开发环境。
用MATLAB (The Mathworks，Natick，Massachusetts)进行，其是一种用于技术计算的程序语言和开发环境。
[0388] 在实施本发明时，这些进程可以迭代地重复。例如，对于有关改变的磷脂酶表型的核酸(或，核酸)进行鉴定、再分离、再修饰、再检测活性。该过程可以是迭代重复的，直至目标表型被工程化。例如，全部生物化学合成代谢或分解代谢途径可以被工程化进入细胞，包括磷脂酶活性。
[0389] 类似地，如果特定的寡核苷酸经测定对于目标特征根本没有作用(例如，新的磷脂酶表型)，其可以通过合成包含要除去的序列的更大亲代寡核苷酸作为变量进行除去。由于在更大的序列中引入序列可防止任何交叉事件，因此在子代多核苷酸中该序列不会再有
任何改变。这种测定何种寡核苷酸与目标特征最相关以及何种不相关的迭代过程允许更有
效地搜索全部可能的蛋白变体，其可能提供特别的特征或活性。
任何改变。这种测定何种寡核苷酸与目标特征最相关以及何种不相关的迭代过程允许更有
效地搜索全部可能的蛋白变体，其可能提供特别的特征或活性。
[0390] 体内重排
[0391] 本发明的方法中使用了分子的体内重排，其提供本发明的多肽的变体，例如，抗体、磷脂酶，等等。体内重排可以利用细胞的天然性质来进行重组多体。虽然重组体内已经提供了分子多样性的主要天然途径，但是遗传重组仍然是相对复杂的过程，其包括1)同源
性确认；2)链裂解、链侵入以及导致重组染色体交叉的生产的代谢步骤；以及最后3)染色
体交叉分解进入分离的重组分子。染色体交叉的形成需要识别同源序列。
性确认；2)链裂解、链侵入以及导致重组染色体交叉的生产的代谢步骤；以及最后3)染色
体交叉分解进入分离的重组分子。染色体交叉的形成需要识别同源序列。
[0392] 在一个方面，本发明提供用于从至少一种第一多核苷酸和第二多核苷酸生产杂交多核苷酸的方法。本发明可以用于通过在适当的宿主细胞中引入共有部分序列同源性的至
少一个区域的至少一种第一多核苷酸和第二多核苷酸来生产杂交多核苷酸。部分序列同源
性的区域促进了生产杂交多核苷酸的序列重组的过程。在此使用的，术语“杂交多核苷酸”包括本发明的方法所产生的任何核苷酸序列并且含有来自至少两种初始多核苷酸序列的
序列。该杂交多核苷酸可以来自分子间重组事件，其促进DNA分子间的序列整合。此外，该杂交多核苷酸可以来自分子内减少重配过程，其利用重复的序列以改变DNA分子中的核苷
酸序列。
少一个区域的至少一种第一多核苷酸和第二多核苷酸来生产杂交多核苷酸。部分序列同源
性的区域促进了生产杂交多核苷酸的序列重组的过程。在此使用的，术语“杂交多核苷酸”包括本发明的方法所产生的任何核苷酸序列并且含有来自至少两种初始多核苷酸序列的
序列。该杂交多核苷酸可以来自分子间重组事件，其促进DNA分子间的序列整合。此外，该杂交多核苷酸可以来自分子内减少重配过程，其利用重复的序列以改变DNA分子中的核苷
酸序列。
[0393] 生产序列变体
[0394] 本发明还提供制备本发明的核酸和磷脂酶序列的序列变体或使用本发明的核酸和多肽分离磷脂酶的方法。在一个方面，本发明提供本发明的磷脂酶基因的变体，其可以通过任何方式进行改变，包括例如随机方法或非随机或“定向进化”方法，如上所述。
[0395] 分离的变体可以是天然产生的。变体也可以体外构建。变体可以使用遗传工程技术(如位点定向诱变、随机化学诱变、核酸外切酶III缺失过程和标准克隆技术)进行构
建。可选择地，该变体、片段、类似物或衍生物可以使用化学合成或修饰过程进行构建。其他制备变体的方法也是本领域技术人员熟知的。这些包括对天然分离的核酸序列进行修饰
以产生编码具有增强的工业或实验室应用价值的多肽的核酸的过程。在该过程中，产生并
鉴定了相对于天然分离的核苷酸序列具有一处或多处核苷酸差异的大量变体序列。这些核
苷酸差异可能导致氨基酸相对于由天然分离的核酸所编码的多肽发生改变。
建。可选择地，该变体、片段、类似物或衍生物可以使用化学合成或修饰过程进行构建。其他制备变体的方法也是本领域技术人员熟知的。这些包括对天然分离的核酸序列进行修饰
以产生编码具有增强的工业或实验室应用价值的多肽的核酸的过程。在该过程中，产生并
鉴定了相对于天然分离的核苷酸序列具有一处或多处核苷酸差异的大量变体序列。这些核
苷酸差异可能导致氨基酸相对于由天然分离的核酸所编码的多肽发生改变。
[0396] 例如，变体可以使用易错PCR进行构建。在易错PCR中，PCR在DNA聚合酶的复制保真度很低的条件下进行，从而在PCR产物全长中获得高频率的点突变。易错PCR描述
于例如Leung，D.W.等人，Technique，1：11-15，1989)和Caldwell，R.C.&Joyce G.F.，PCR Methods Applic.，2：28-33，1992。简而言之，在该过程中，进行诱变处理的核酸与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶和合适浓度的dNTPs混合用于在PCR产物全长中获得高频率的点突变。例如，反应可以使用20fmole的进行诱变处理的核酸；30pmole的各
PCR引物；包含50mM KCl、10mM Tris HCl(pH 8.3)和0.01％明胶、7mMMgCl2、0.5mM MnCl2、
5单位的Taq聚合酶、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP和1mM dTTP的反应缓冲液进行。
PCR可以进行30个循环的94℃1min、45℃1min和72℃1min。然而，可以理解这些参数可
以根据需要进行变化。诱变处理的核酸被克隆入适宜载体中，并评价由诱变处理的核酸编
码的多肽的活性。
于例如Leung，D.W.等人，Technique，1：11-15，1989)和Caldwell，R.C.&Joyce G.F.，PCR Methods Applic.，2：28-33，1992。简而言之，在该过程中，进行诱变处理的核酸与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶和合适浓度的dNTPs混合用于在PCR产物全长中获得高频率的点突变。例如，反应可以使用20fmole的进行诱变处理的核酸；30pmole的各
PCR引物；包含50mM KCl、10mM Tris HCl(pH 8.3)和0.01％明胶、7mMMgCl2、0.5mM MnCl2、
5单位的Taq聚合酶、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP和1mM dTTP的反应缓冲液进行。
PCR可以进行30个循环的94℃1min、45℃1min和72℃1min。然而，可以理解这些参数可
以根据需要进行变化。诱变处理的核酸被克隆入适宜载体中，并评价由诱变处理的核酸编
码的多肽的活性。
[0397] 还可以使用寡核苷酸定向诱变创建变体以在任何目标克隆DNA中产生位点特异性突变。寡核苷酸诱变被描述于例如Reidhaar-Olson(1988)Science241：53-57。简而言
之，在该过程中合成了要引入克隆DNA的具有一种或多种突变的多种双链寡核苷酸，并将
其插入克隆DNA进行诱变处理。含有诱变处理DNA的克隆被回收，并评价它们所编码的多
肽的活性。
之，在该过程中合成了要引入克隆DNA的具有一种或多种突变的多种双链寡核苷酸，并将
其插入克隆DNA进行诱变处理。含有诱变处理DNA的克隆被回收，并评价它们所编码的多
肽的活性。
[0398] 用于产生变体的另一种方法是装配PCR。装配PCR涉及来自小DNA片段混合物的PCR产物的装配。大量的不同PCR反应在相同的管中平行进行，一种反应的产物引导另一反
应的产物。装配PCR被描述于例如美国专利No.5,965,408。
应的产物。装配PCR被描述于例如美国专利No.5,965,408。
[0399] 产生变体的另一种方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中，因为基于序列同源性的DNA分子随机片段化，所以不同但是高相关的DNA序列的DNA分子之间进行强迫的体
外同源重组，然后在PCR反应中通过引物延伸进行交叉的固定。有性PCR诱变被描述于例
如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。简而言之，在该过程中将要重组的多种核酸被DNase消化以产生具有平均大小为50-200个核苷酸的片段。目标平均
大小的片段被纯化并重悬于PCR混合物。在利于核酸片段之间重组的条件下进行PCR。例
如，PCR可以如下进行：以10-30ng/l的浓度将纯化片段重悬于含有0.2mM的各dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris HCl、pH 9.0和0.1％Triton X-100的溶液中。每100∶1的
反应混合物中加入2.5单位的Taq聚合酶，PCR按照如下方式进行：94℃60秒、94℃30秒、
50-55℃30秒、72℃30秒(30-45次)和72℃5分钟。然而，可以理解这些参数可以根据需
要进行变化。在一些方面，寡核苷酸可以包含在PCR反应中。在其他方面，可以在第一系列的PCR反应中使用DNA聚合酶I的Klenow片段，并在随后的系列PCR反应中使用Taq聚合
酶。分离重组序列并测定它们所编码的多肽的活性。
外同源重组，然后在PCR反应中通过引物延伸进行交叉的固定。有性PCR诱变被描述于例
如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。简而言之，在该过程中将要重组的多种核酸被DNase消化以产生具有平均大小为50-200个核苷酸的片段。目标平均
大小的片段被纯化并重悬于PCR混合物。在利于核酸片段之间重组的条件下进行PCR。例
如，PCR可以如下进行：以10-30ng/l的浓度将纯化片段重悬于含有0.2mM的各dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris HCl、pH 9.0和0.1％Triton X-100的溶液中。每100∶1的
反应混合物中加入2.5单位的Taq聚合酶，PCR按照如下方式进行：94℃60秒、94℃30秒、
50-55℃30秒、72℃30秒(30-45次)和72℃5分钟。然而，可以理解这些参数可以根据需
要进行变化。在一些方面，寡核苷酸可以包含在PCR反应中。在其他方面，可以在第一系列的PCR反应中使用DNA聚合酶I的Klenow片段，并在随后的系列PCR反应中使用Taq聚合
酶。分离重组序列并测定它们所编码的多肽的活性。
[0400] 变体还可以通过体内诱变进行创建。在一些实施方案中，通过在细菌菌株中扩增目标序列来产生目标序列中的随机突变，例如大肠杆菌菌株，其在一种或多种的DNA修复
途径中发生突变。这种“突变体”菌株具有比野生型亲本更高的随机突变率。在这些菌株之一中增殖DNA最终产生DNA中的随机突变。适用于体内诱变的突变体菌株描述于例如PCT
公开No.WO 91/16427。
途径中发生突变。这种“突变体”菌株具有比野生型亲本更高的随机突变率。在这些菌株之一中增殖DNA最终产生DNA中的随机突变。适用于体内诱变的突变体菌株描述于例如PCT
公开No.WO 91/16427。
[0401] 变体还可以使用盒式诱变产生。在盒式诱变中，双链DNA分子的小区域被替换为不同于原始序列的合成寡核苷酸“盒”。寡核苷酸通常含有完全和/或部分的随机化的原始序列。
[0402] 递归全体诱变也可用于产生变体。递归全体诱变是一种用于蛋白工程(蛋白诱变)的算法，其开发用于生产多样性群体的表现型相关突变体，其成员在氨基酸序列方面
不同。该方法使用反馈机制以控制连续回合的组合盒式诱变。递归全体诱变被描述于例如
Arkin(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815。
不同。该方法使用反馈机制以控制连续回合的组合盒式诱变。递归全体诱变被描述于例如
Arkin(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815。
[0403] 在一些实施方案中，使用指数全体诱变创建变体。指数全体诱变是一种用于产生具有高百分比的独特和功能性突变体的组合文库的方法，其中小群体的残基被平行随
机化以鉴定在各改变的位点中的形成功能性蛋白的氨基酸。指数全体诱变被描述于例如
Delegrave(1993)Biotechnology Res.11：1548-1552。随机和位点定向诱变被描述于例如
Arnold(1993)Current Opinion in Biotechnology 4：450-455。
机化以鉴定在各改变的位点中的形成功能性蛋白的氨基酸。指数全体诱变被描述于例如
Delegrave(1993)Biotechnology Res.11：1548-1552。随机和位点定向诱变被描述于例如
Arnold(1993)Current Opinion in Biotechnology 4：450-455。
[0404] 在一些实施方案中，使用重排过程创建变体，其中编码不同多肽的多种核酸的一部分被融合在一起创建嵌合核酸序列，其编码嵌合多肽，如描述于例如美国专利
No.5,965,408；5,939,250。
No.5,965,408；5,939,250。
[0405] 本发明还提供本发明的多肽的变体，其包含一种或多种氨基酸残基(例如，本发明的示例性的多肽的)被取代为保守或非保守氨基酸残基(例如，保守氨基酸残基)的序
列，且该取代的氨基酸残基可以或可以不被遗传密码编码。保守性取代是那些在多肽中的
给定氨基酸被另一种相似性质的氨基酸取代。因而，本发明的多肽包括具有本发明的保守
性取代序列的那些，包括但不限于以下替换：替换脂肪族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为另一脂肪族氨基酸；替换丝氨酸为苏氨酸或反之亦然；替换酸性残基例如
天冬氨酸和谷氨酸为另一酸性残基；替换带有酰胺基的残基例如天冬酰胺和谷氨酰胺为另
一带有酰胺基的残基；替换碱性残基例如赖氨酸和精氨酸为另一碱性残基；以及替换芳香
族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸为另一芳香族残基。其他变体是本发明的多肽的一种或多种氨基酸残基包括取代基的那些。
列，且该取代的氨基酸残基可以或可以不被遗传密码编码。保守性取代是那些在多肽中的
给定氨基酸被另一种相似性质的氨基酸取代。因而，本发明的多肽包括具有本发明的保守
性取代序列的那些，包括但不限于以下替换：替换脂肪族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为另一脂肪族氨基酸；替换丝氨酸为苏氨酸或反之亦然；替换酸性残基例如
天冬氨酸和谷氨酸为另一酸性残基；替换带有酰胺基的残基例如天冬酰胺和谷氨酰胺为另
一带有酰胺基的残基；替换碱性残基例如赖氨酸和精氨酸为另一碱性残基；以及替换芳香
族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸为另一芳香族残基。其他变体是本发明的多肽的一种或多种氨基酸残基包括取代基的那些。
[0406] 本发明范围之内的其他变体是多肽与另一种化合物连接的那些，例如用于增加多肽半衰期的化合物，例如，聚乙二醇。
[0407] 本发明范围之内的其他变体是其他氨基酸被融合于多肽的那些，例如前导序列、分泌序列、前蛋白序列或利于多肽纯化、富集或稳定化的序列。
[0408] 在一些方面，本发明的多肽的变体、片段、衍生物和类似物保留与示例性的多肽相同的生物功能或活性，例如，磷脂酶活性，如文中所述。在其他方面，变体、片段、衍生物或类似物包括前蛋白，从而变体、片段、衍生物或类似物可以通过裂解前蛋白部分进行激活以产生活性多肽。
[0409] 最优化密码子以获得宿主细胞中高水平的蛋白表达
[0410] 本发明提供用于修饰编码磷脂酶的核酸以修饰密码子用途的方法。在一个方面，本发明提供用于在编码磷脂酶的核酸中修饰密码子以增加或降低其在宿主细胞中的表达
的方法。本发明还提供编码经修饰以增加其在宿主细胞中表达的磷脂酶的核酸、修饰的磷
脂酶以及修饰的磷脂酶的制备方法。该方法包括在编码磷脂酶的核酸中鉴定“非优选的”
或“较差优选的”密码子，并替换一种或多种的这些非优选的或较差优选的密码子为“优选的密码子”，其与被替换的密码子编码相同的氨基酸，且在核酸中至少一个非优选的或较差优选的密码子被替换为编码相同氨基酸的优选的密码子。优选的密码子是过-表现于宿主
细胞基因的编码序列的密码子，非优选的或较差优选的密码子是低-表现于宿主细胞基因
的编码序列的密码子。
的方法。本发明还提供编码经修饰以增加其在宿主细胞中表达的磷脂酶的核酸、修饰的磷
脂酶以及修饰的磷脂酶的制备方法。该方法包括在编码磷脂酶的核酸中鉴定“非优选的”
或“较差优选的”密码子，并替换一种或多种的这些非优选的或较差优选的密码子为“优选的密码子”，其与被替换的密码子编码相同的氨基酸，且在核酸中至少一个非优选的或较差优选的密码子被替换为编码相同氨基酸的优选的密码子。优选的密码子是过-表现于宿主
细胞基因的编码序列的密码子，非优选的或较差优选的密码子是低-表现于宿主细胞基因
的编码序列的密码子。
[0411] 本发明的用于表达核酸、表达框和载体的宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，本发明提供用于将最优化密码子应用于全部这些细胞、密码子改变的核酸和由密码子-改变的核酸制备的多肽的方法。示例性的宿主细胞
包括革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌；革兰氏阳性菌，如任何杆菌(例如，蜡样芽孢杆菌)、
链霉菌、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸球菌、乳脂乳球菌(Lactococcus
cremoris)、枯草芽孢杆菌。示例性的宿主细胞还包括真核生物体，例如，各种酵母，例如酵母菌属，包括啤酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉；和哺乳动物细胞和细胞系以及昆虫细胞和
细胞系。因此，本发明还包括最优化用于在这些生物体和物种中表达的核酸和多肽。
包括革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌；革兰氏阳性菌，如任何杆菌(例如，蜡样芽孢杆菌)、
链霉菌、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸球菌、乳脂乳球菌(Lactococcus
cremoris)、枯草芽孢杆菌。示例性的宿主细胞还包括真核生物体，例如，各种酵母，例如酵母菌属，包括啤酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉；和哺乳动物细胞和细胞系以及昆虫细胞和
细胞系。因此，本发明还包括最优化用于在这些生物体和物种中表达的核酸和多肽。
[0412] 例如，对分离自细菌细胞的编码磷脂酶的核酸的密码子进行修饰，从而核酸被最优表达于与磷脂酶的来源细菌不同的细菌细胞、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中。最优化密码子的方法是本领域公知的，参见，例如，美国专利No.5,795,737；
Baca(2000)Int.J.Parasitol.30：113-118；Hale(1998)Protein Expr.Purif.12：
185-188；Narum(2001)Infect.Immun.69：7250-7253。 还 参 见 Narum(2001)Infect.
Immun.69：7250-7253，其描述了小鼠系统中的最优化密码子；Outchkourov(2002)Protein Expr.Purif.24：18-24，其描述了酵母中的最优化密码子；Feng(2000)Biochemistry 39：
15399-15409，其描述了大肠杆菌中的最优化密码子；Humphreys(2000)Protein Expr.
Purif.20：252-264，其描述了影响大肠杆菌分泌的最优化密码子的用途。
Baca(2000)Int.J.Parasitol.30：113-118；Hale(1998)Protein Expr.Purif.12：
185-188；Narum(2001)Infect.Immun.69：7250-7253。 还 参 见 Narum(2001)Infect.
Immun.69：7250-7253，其描述了小鼠系统中的最优化密码子；Outchkourov(2002)Protein Expr.Purif.24：18-24，其描述了酵母中的最优化密码子；Feng(2000)Biochemistry 39：
15399-15409，其描述了大肠杆菌中的最优化密码子；Humphreys(2000)Protein Expr.
Purif.20：252-264，其描述了影响大肠杆菌分泌的最优化密码子的用途。
[0413] 转基因非人动物
[0414] 本发明提供包含本发明的核酸、多肽、表达框、载体、转染或转化的细胞的转基因非人动物。转基因非人动物可以是例如山羊、兔、绵羊、猪、牛、大鼠和小鼠，其包含本发明的核酸。这些动物可以被用于例如作为体内模型研究磷脂酶活性，或作为模型筛选体内磷脂酶活性的调控剂。在转基因非人动物中要表达的多肽的编码序列可以被设计为组成
型的，或在组织-特异性、发育-特异性或诱导型转录调控因子的调控下。转基因非人动
物可以使用本领域已知的任何方法进行设计和产生；参见，例如，美国专利No.6,211,428；
6,187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；
5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，其 描述了制备和使用转化细胞和卵以及转基因的小鼠、大鼠、兔、羊、猪和牛。还参见，例如，Pollock(1999)J.Immunol.Methods 231：147-157，其描述了在转基因产奶动物的乳品中生产重组蛋白；Baguisi(1999)Nat.Biotechnol.17：456-461，其描述了转基因山羊的生产；
美国专利No.6,211,428，其描述了转基因非人哺乳动物的制备和使用，其在脑部表达包含
DNA序列的核酸构建子；美国专利No.5,387,742，其描述了在受精的小鼠卵中注射克隆重
组或合成DNA序列，将该注射的卵植入假孕的雌性体内并发育成为转基因小鼠，其细胞表
达与阿尔茨海默病理相关的蛋白；美国专利No.6,187,992，其描述了转基因小鼠的制备和
使用，其基因组包括破坏的编码淀粉样前蛋白(APP)的基因。
型的，或在组织-特异性、发育-特异性或诱导型转录调控因子的调控下。转基因非人动
物可以使用本领域已知的任何方法进行设计和产生；参见，例如，美国专利No.6,211,428；
6,187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；
5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，其 描述了制备和使用转化细胞和卵以及转基因的小鼠、大鼠、兔、羊、猪和牛。还参见，例如，Pollock(1999)J.Immunol.Methods 231：147-157，其描述了在转基因产奶动物的乳品中生产重组蛋白；Baguisi(1999)Nat.Biotechnol.17：456-461，其描述了转基因山羊的生产；
美国专利No.6,211,428，其描述了转基因非人哺乳动物的制备和使用，其在脑部表达包含
DNA序列的核酸构建子；美国专利No.5,387,742，其描述了在受精的小鼠卵中注射克隆重
组或合成DNA序列，将该注射的卵植入假孕的雌性体内并发育成为转基因小鼠，其细胞表
达与阿尔茨海默病理相关的蛋白；美国专利No.6,187,992，其描述了转基因小鼠的制备和
使用，其基因组包括破坏的编码淀粉样前蛋白(APP)的基因。
[0415] “敲除动物”也可以被用于实施本发明的方法。例如，在一个方面，本发明的转基因或修饰的动物包括“敲除动物”，例如，“敲除小鼠”，其被进行工程化从而不表达或不能表达磷脂酶。
[0416] 转基因植物和种子
[0417] 本发明提供转基因植物和种子，其包含本发明的核酸、多肽(例如，磷脂酶)、表达框或载体或转染或转化的细胞。本发明还提供植物产品，例如，油、种子、叶、提取物等，包含本发明的核酸和/或多肽(例如，磷脂酶)。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。本发明还提供制备和使用这些转基因植物和种子的方法。表达
本发明的多肽的转基因植物或植物细胞可以按照本领域已知的任何方法进行构建。参见，
例如，美国专利No.6,309,872。
本发明的多肽的转基因植物或植物细胞可以按照本领域已知的任何方法进行构建。参见，
例如，美国专利No.6,309,872。
[0418] 本发明的核酸和表达构建子可以通过任何方式被引入植物细胞。例如，核酸或表达构建子可以被引入目标植物宿主的基因组，或者核酸或表达构建子可以是游离基因。引
入目标植物的基因组可以使得宿主的磷脂酶生产由内源性转录或翻译控制元件进行调控。
本发明还提供“敲除植物”，其中通过例如同源重组插入基因序列破坏内源性基因的表达。
产生“敲除”植物的方法是本领域公知的，参见，例如，Strepp(1998)Proc Natl.Acad.Sci.USA 95：4368-4373；Miao(1995)Plant J 7：359-365。参见如下转基因植物的讨论。
入目标植物的基因组可以使得宿主的磷脂酶生产由内源性转录或翻译控制元件进行调控。
本发明还提供“敲除植物”，其中通过例如同源重组插入基因序列破坏内源性基因的表达。
产生“敲除”植物的方法是本领域公知的，参见，例如，Strepp(1998)Proc Natl.Acad.Sci.USA 95：4368-4373；Miao(1995)Plant J 7：359-365。参见如下转基因植物的讨论。
[0419] 本发明的核酸可用于在基本上任何植物中提供目标特征，例如，含有油籽的植物，如水稻、大豆、油菜籽、向日葵籽、芝麻和花生。本发明的核酸可以用于操作植物的代谢途径，以最优化或改变磷脂酶的宿主表达。其能够改变植物中的磷脂酶活性。可选择地，本发明的磷脂酶可被用于生产转基因植物以通过该植物进行生产非天然化合物。其能够降低生产成本或创造一种新产品。
[0420] 在一个方面，生产转基因植物的第一个步骤涉及制备表达构建子，其用于在植物细胞中表达。这些技术是本领域公知的。其可以包括选择和克隆启动子，一种编码用于使
核糖体与mRNA有效结合并选择合适的基因终止子序列的序列。一种示例性的组成型启动
子是来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S，其一般在植物中产生高度表达。其他启动子是更加特异性的，响应植物的内外环境的。示例性的光诱导型启动子是来自甘蓝(cab)基因的启动
子，其编码主叶绿素a/b结合蛋白。
核糖体与mRNA有效结合并选择合适的基因终止子序列的序列。一种示例性的组成型启动
子是来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S，其一般在植物中产生高度表达。其他启动子是更加特异性的，响应植物的内外环境的。示例性的光诱导型启动子是来自甘蓝(cab)基因的启动
子，其编码主叶绿素a/b结合蛋白。
[0421] 在一个方面，核酸被修饰以获得在植物细胞中更高的表达。例如，本发明的序列可能相对于植物具有更高的A-T核苷酸对百分比，其中一些植物优选G-C核苷酸对。因此，编码序列中的A-T核苷酸可以被替换为G-C核苷酸而不显著改变氨基酸序列，以增强基因产
物在植物细胞中的生产。
物在植物细胞中的生产。
[0422] 可以在基因构建子中加入标记基因以鉴定成功整合该转基因的植物细胞或组织。其可以是必需的，因为在植物细胞中能够包含和表达基因是小概率事件，其只有在少数目
标组织或细胞中才发生。可选标记基因编码提供试剂抗性的蛋白，所述试剂通常对植物而
言是有毒的，例如抗生素或除草剂。在含有合适的抗生素或除草剂的培养基上生长时，只有整合了可选标记基因的植物细胞能够存活。对于其他的插入基因，标记基因同样需要启动
子和终止序列用于适当的功能。
标组织或细胞中才发生。可选标记基因编码提供试剂抗性的蛋白，所述试剂通常对植物而
言是有毒的，例如抗生素或除草剂。在含有合适的抗生素或除草剂的培养基上生长时，只有整合了可选标记基因的植物细胞能够存活。对于其他的插入基因，标记基因同样需要启动
子和终止序列用于适当的功能。
[0423] 在一个方面，转基因植物或种子的制备包括在目标表达构建子(例如，质粒)中引入本发明的序列和任选地标记基因，以及定位启动子和终止子序列。其可以涉及
通过适当方法将修饰基因转移至植物。例如，构建子可以使用例如电穿孔和植物细胞
原生质体的微注射技术直接导入植物细胞的基因组DNA，或构建子可以使用轰击方法
直接导入植物组织，例如DNA颗粒轰击。例如，参见，例如，Christou(1997)Plant Mol.
Biol.35：197-203；Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6：17-30；Klein(1987)Nature 327：
70-73；Takumi(1997)Genes Genet.Syst.72：63-69，其中讨论了使用颗粒轰击在小麦中
引入转基因；以及如上Adam(1997)，使用颗粒轰击以在植物细胞中引入YAC。例如，如上
Rinehart(1997)，使用颗粒轰击以产生转基因棉花植物。加速颗粒的设备描述于美国专利
No.5,015,580；且，其可市售购得BioRad(Biolistics)PDS-2000颗粒加速装置；还参见，
John，美国专利No.5,608,148；和Ellis，美国专利No.5,681,730，其中描述了颗粒-介导
的裸子植物转化。
通过适当方法将修饰基因转移至植物。例如，构建子可以使用例如电穿孔和植物细胞
原生质体的微注射技术直接导入植物细胞的基因组DNA，或构建子可以使用轰击方法
直接导入植物组织，例如DNA颗粒轰击。例如，参见，例如，Christou(1997)Plant Mol.
Biol.35：197-203；Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6：17-30；Klein(1987)Nature 327：
70-73；Takumi(1997)Genes Genet.Syst.72：63-69，其中讨论了使用颗粒轰击在小麦中
引入转基因；以及如上Adam(1997)，使用颗粒轰击以在植物细胞中引入YAC。例如，如上
Rinehart(1997)，使用颗粒轰击以产生转基因棉花植物。加速颗粒的设备描述于美国专利
No.5,015,580；且，其可市售购得BioRad(Biolistics)PDS-2000颗粒加速装置；还参见，
John，美国专利No.5,608,148；和Ellis，美国专利No.5,681,730，其中描述了颗粒-介导
的裸子植物转化。
[0424] 在一个方面，可以将原生质体固定化并注入核酸，例如，表达构建子。虽然从原生质体的植物再生对于谷物而言并不容易，但是植物再生在豆类中的实现可以通过来自原生质体衍生的愈合组织的体浆胚胎发生。可以使用基因枪技术对有机体组织进行裸露DNA的
转化，其中DNA被包裹于钨微粒上并以1/100的细胞大小射入，其将DNA深入地输送到细胞
和细胞器。然后一般通过体浆胚胎发生来诱导转化组织再生。该技术已成功应用于几种谷
物，包括玉蜀黍和水稻。
转化，其中DNA被包裹于钨微粒上并以1/100的细胞大小射入，其将DNA深入地输送到细胞
和细胞器。然后一般通过体浆胚胎发生来诱导转化组织再生。该技术已成功应用于几种谷
物，包括玉蜀黍和水稻。
[0425] 核酸，例如，表达构建子，还可以使用重组病毒导入植物细胞。植物细胞可以使用病毒载体进行转化，例如，烟草花叶病毒衍生的载体(Rouwendal(1997)Plant Mol.
Biol.33：989-999)，参见Porta(1996)“Use of viral replicons for the expression of genes in plants”，Mol.Biotechnol.5：209-221。
Biol.33：989-999)，参见Porta(1996)“Use of viral replicons for the expression of genes in plants”，Mol.Biotechnol.5：209-221。
[0426] 可选择地，核酸，例如，表达构建子，可以与适当的T-DNA侧区域结合并导入常规的根瘤农杆菌宿主载体。当细胞被该细菌感染时，根瘤农杆菌宿主的毒性功能将构建子和邻近的标记插入植物细胞DNA中。根瘤农杆菌-介导的转化技术，包括消除防御和二元
载体的使用，被充分描述于科技文献。参见，例如，Horsch(1984)Science 233：496-498；
Fraley(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803(1983)；Gene Transfer to Plants，
Potrykus，ed.(Springer-Verlag，Berlin 1995)。根瘤农杆菌细胞中的DNA被包含于细菌
染色体以及另一种称为Ti(肿瘤-诱导的)质粒的结构中。Ti质粒含有称为T-DNA(～
20kb长)的伸长的DNA，其在感染过程中被转移入植物细胞；以及一系列的vir(毒性)基
因，其引导感染过程。根瘤农杆菌只能通过伤口感染植物：当植物的根或干受到损伤时，其释放某些化学信号，响应于这些信号，根瘤农杆菌的vir基因被激活并引导一系列将T-DNA
从Ti质粒转移到植物的染色体所必需的事件。然后T-DNA通过伤口进入植物细胞。一种
推测是T-DNA等到植物DNA被复制或转录之后才插入暴露的植物DNA。为了使用根瘤农杆
菌作为转基因载体，需要除去T-DNA的肿瘤-诱导部分，同时保留T-DNA边界区域和vir基
因。然后将所述转基因插入T-DNA边界区域之间，其从该处被转移至植物细胞并整合入植
物的染色体。
载体的使用，被充分描述于科技文献。参见，例如，Horsch(1984)Science 233：496-498；
Fraley(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803(1983)；Gene Transfer to Plants，
Potrykus，ed.(Springer-Verlag，Berlin 1995)。根瘤农杆菌细胞中的DNA被包含于细菌
染色体以及另一种称为Ti(肿瘤-诱导的)质粒的结构中。Ti质粒含有称为T-DNA(～
20kb长)的伸长的DNA，其在感染过程中被转移入植物细胞；以及一系列的vir(毒性)基
因，其引导感染过程。根瘤农杆菌只能通过伤口感染植物：当植物的根或干受到损伤时，其释放某些化学信号，响应于这些信号，根瘤农杆菌的vir基因被激活并引导一系列将T-DNA
从Ti质粒转移到植物的染色体所必需的事件。然后T-DNA通过伤口进入植物细胞。一种
推测是T-DNA等到植物DNA被复制或转录之后才插入暴露的植物DNA。为了使用根瘤农杆
菌作为转基因载体，需要除去T-DNA的肿瘤-诱导部分，同时保留T-DNA边界区域和vir基
因。然后将所述转基因插入T-DNA边界区域之间，其从该处被转移至植物细胞并整合入植
物的染色体。
[0427] 本发明提供使用本发明的核酸转化单子叶植物的方法，包括重要的谷物，参见Hiei(1997)Plant Mol.Biol.35：205-218。还参见，例如，Horsch，Science(1984)233：
496；Fraley(1983)Proc.Natl.Acad.Sci USA 80：4803；如上Thykjaer(1997)；Park(1996)Plant Mol.Biol.32：1135-1148，其讨论了将T-DNA整合入基因组DNA。还参见D’Halluin，美国专利No.5,712,135，其描述了包含谷物或其他单子叶植物的细胞中功能性基因的DNA
的稳定整合过程。
496；Fraley(1983)Proc.Natl.Acad.Sci USA 80：4803；如上Thykjaer(1997)；Park(1996)Plant Mol.Biol.32：1135-1148，其讨论了将T-DNA整合入基因组DNA。还参见D’Halluin，美国专利No.5,712,135，其描述了包含谷物或其他单子叶植物的细胞中功能性基因的DNA
的稳定整合过程。
[0428] 在一个方面，第三个步骤可以包括选择和再生能够将导入的靶基因传递至下一代的完整植物。该再生技术依赖对组织培养的生长培养基中的一些植物激素进行操作，一般
依赖与目标核苷酸序列一起被导入的杀虫剂和/或除草剂标记。培养的原生质体中的植物
再生描述于Evans等人，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985。
再生还可以通过植物愈合组织、外植体、器官或其部分来获得。该再生技术一般描述于
Klee(1987)Ann.Rev.ofPlant Phys.38：467-486。为了从转基因组织例如未成熟胚中获得
完整植物，其可以在控制的环境条件下生长于一系列含有营养物和激素的培养基中，一种
称为组织培养的过程。一旦产生了完整植物并生产了种子，即开始对子代进行评价。
依赖与目标核苷酸序列一起被导入的杀虫剂和/或除草剂标记。培养的原生质体中的植物
再生描述于Evans等人，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985。
再生还可以通过植物愈合组织、外植体、器官或其部分来获得。该再生技术一般描述于
Klee(1987)Ann.Rev.ofPlant Phys.38：467-486。为了从转基因组织例如未成熟胚中获得
完整植物，其可以在控制的环境条件下生长于一系列含有营养物和激素的培养基中，一种
称为组织培养的过程。一旦产生了完整植物并生产了种子，即开始对子代进行评价。
[0429] 在表达框被稳定导入转基因植物后，其可以通过有性杂交被导入其他植物。可以使用多种标准育种技术中的任一种，其取决于要杂交的品种。由于本发明的核酸的转基因
表达导致表型改变，包含本发明的重组核酸的植物可以与第二植物进行有性杂交以获得最
终产物。因而，本发明的种子可以衍生于本发明的两种转基因植物的杂交，或本发明的植物和另一植物的杂交。当两种亲代植物都表达本发明的多肽(例如，磷脂酶)时，目标效果
(例如，表达本发明的多肽以产生具有改变的成熟行为的植物)可以被增强。目标效果可以
通过标准繁殖方式被传递至植物后代。
表达导致表型改变，包含本发明的重组核酸的植物可以与第二植物进行有性杂交以获得最
终产物。因而，本发明的种子可以衍生于本发明的两种转基因植物的杂交，或本发明的植物和另一植物的杂交。当两种亲代植物都表达本发明的多肽(例如，磷脂酶)时，目标效果
(例如，表达本发明的多肽以产生具有改变的成熟行为的植物)可以被增强。目标效果可以
通过标准繁殖方式被传递至植物后代。
[0430] 本发明的核酸和多肽被表达于或插入任何植物或种子。本发明的转基因植物可以是双子叶或单子叶的。本发明的单子叶转基因植物的示例是草类，例如草甸草(蓝
草，Poa)；饲料草，例如羊茅、黑麦草；温带草，例如剪股草(Agrostis)；以及谷物，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。本发明的双子叶转基因植物的示例是烟草、豆类例如羽扇豆、马铃著、甜菜、豌豆、豆和大豆，以及十字花科(Brassicaceae)植物，例如花椰菜、油菜籽，以及密切相关的模型生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。因
而，本发明的转基因植物和种子包括大范围的植物，包括但不限于以下属的各种：腰果
(Anacardium)、花生(Arachis)、芦笋(Asparagus)、颠茄(Atropa)、燕麦(Avena)、油菜
(Brassica)、柑橘(Citrus)、西瓜(Citrullus)、辣椒(Carthamus)、红花(Capsicum)、茯
苓(Cocos)、咖啡(Coffea)、黄瓜(Cucumis)、南瓜(Cucurbita)、胡萝卜(Daucus)、油棕
(Elaeis)、草莓(Fragaria)、大豆(Glycine)、棉花(Gossypium)、向日葵(Helianthus)、萱草(Heterocallis)、大麦(Hordeum)、莨菪(Hyoscyamus)、莴苣(Lactuca)、亚麻(Linum)、黑麦草(Lolium)、羽扇豆(Lupinus)、番茄(Lycopersicon)、苹果(Malus)、木著(Manihot)、马约喇纳(Majorana)、苜蓿(Medicago)、烟草(Nicotiana)、木犀(Olea)、水稻(Oryza)、
稷(Panieum)、狼尾草(Pannisetum)、鳄梨(Persea)、绿豆(Phaseolus)、阿月浑子
(Pistachia)、豌豆(Pisum)、梨(Pyrus)、樱桃(Prunus)、萝卜(Raphanus)、蓖麻(Ricinus)、黑麦(Secale)、千里光(Senecio)、芥(Sinapis)、茄(Solanum)、高粱(Sorghum)、可可
(Theobromus)、胡芦(Trigonella)、小麦(Triticum)、蚕豆(Vicia)、葡萄(Vitis)、豇豆
(Vigna)和玉蜀黍(Zea)。
草，Poa)；饲料草，例如羊茅、黑麦草；温带草，例如剪股草(Agrostis)；以及谷物，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。本发明的双子叶转基因植物的示例是烟草、豆类例如羽扇豆、马铃著、甜菜、豌豆、豆和大豆，以及十字花科(Brassicaceae)植物，例如花椰菜、油菜籽，以及密切相关的模型生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。因
而，本发明的转基因植物和种子包括大范围的植物，包括但不限于以下属的各种：腰果
(Anacardium)、花生(Arachis)、芦笋(Asparagus)、颠茄(Atropa)、燕麦(Avena)、油菜
(Brassica)、柑橘(Citrus)、西瓜(Citrullus)、辣椒(Carthamus)、红花(Capsicum)、茯
苓(Cocos)、咖啡(Coffea)、黄瓜(Cucumis)、南瓜(Cucurbita)、胡萝卜(Daucus)、油棕
(Elaeis)、草莓(Fragaria)、大豆(Glycine)、棉花(Gossypium)、向日葵(Helianthus)、萱草(Heterocallis)、大麦(Hordeum)、莨菪(Hyoscyamus)、莴苣(Lactuca)、亚麻(Linum)、黑麦草(Lolium)、羽扇豆(Lupinus)、番茄(Lycopersicon)、苹果(Malus)、木著(Manihot)、马约喇纳(Majorana)、苜蓿(Medicago)、烟草(Nicotiana)、木犀(Olea)、水稻(Oryza)、
稷(Panieum)、狼尾草(Pannisetum)、鳄梨(Persea)、绿豆(Phaseolus)、阿月浑子
(Pistachia)、豌豆(Pisum)、梨(Pyrus)、樱桃(Prunus)、萝卜(Raphanus)、蓖麻(Ricinus)、黑麦(Secale)、千里光(Senecio)、芥(Sinapis)、茄(Solanum)、高粱(Sorghum)、可可
(Theobromus)、胡芦(Trigonella)、小麦(Triticum)、蚕豆(Vicia)、葡萄(Vitis)、豇豆
(Vigna)和玉蜀黍(Zea)。
[0431] 在可选实施方案中，本发明的核酸在植物(例如，作为转基因植物)中表达，如含有油籽的植物，如水稻、大豆、油菜籽、向日葵籽、芝麻和花生。本发明的核酸可以在含有纤维细胞的植物中表达，包括例如棉花、丝光木棉(木棉花、Ceiba pentandra)、沙漠柳、木馏油灌木、winterfat、筏、苎麻、红麻、大麻、洛神葵、黄麻、剑麻蕉麻和亚麻。在可选实施方案中，本发明的转基因植物可以是棉花属的成员，包括任何棉属，例如亚洲棉(G.arboreum)、草棉(G.herbaceum)、海岛棉(G.barbadense)和陆地棉(G.hirsutum)的成员。
[0432] 本发明还提供可以被用于生产大量的本发明的多肽(例如，磷脂酶或抗体)的转基因植物。例如，参见Palmgren(1997)Trends Genet.13：348；Chong(1997)Transgenic
Res.6：289-296(在转基因马铃著植物中使用生长素-诱导的双向甘露碱合酶(mas1’，2’)启动子与根瘤农杆菌-介导的叶盘转化方法进行生产人乳蛋白β-酪蛋白)。
Res.6：289-296(在转基因马铃著植物中使用生长素-诱导的双向甘露碱合酶(mas1’，2’)启动子与根瘤农杆菌-介导的叶盘转化方法进行生产人乳蛋白β-酪蛋白)。
[0433] 使用已知方法，本领域技术人员能够通过检测转基因植物中转基因mRNA或蛋白的增加或降低来筛选得到本发明的植物。检测和定量mRNA或蛋白的方法是本领域公知的。
[0434] 多肽和肽
[0435] 本发明提供分离的、合成的或重组的多肽，其相对于本发明的示例性序列具有序列同一性(例如，至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、
61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高、或完全(100％)的序列同一性)，例如，如下面实施例3中所讨论的，表12～15中所示的SEQ ID NO：6并具有一个或
更多序列变化(例如，突变)，或其酶活性片段。
61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高、或完全(100％)的序列同一性)，例如，如下面实施例3中所讨论的，表12～15中所示的SEQ ID NO：6并具有一个或
更多序列变化(例如，突变)，或其酶活性片段。
[0436] 如上面所讨论的，同一性可以是全长的多肽，或，同一性可以跨越其子序列，例如，至少约50、60、70、80，90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多残基的区域。本发明的多肽也可以短于示例性多肽的全长。在可选实施方案中，本发明提供大小在约5至全长多肽范围内的多肽(肽，片段)，例如，酶，例如，磷脂酶；示例性的大小为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400或更多残基，例如，示例性磷脂酶的连续残基。本发明的肽可以用作例如标记探针、抗原、耐受原、基序、磷脂酶活性位点、结合结构域、调控结构域等。
[0437] 在一个方面，本发明提供具有SEQ ID NO：6所示的序列的多肽，其包含(和具有)表12～15中所示的一种或多种氨基酸残基变化(例如，突变)，和其子序列，例如，它们的
具有磷脂酶活性的活性位点(“催化结构域”)，例如，磷脂酶C(PLC)活性，例如，PI-PLC活性。在一个方面，多肽具有磷脂酶活性但缺乏中性油(甘油三酯)水解活性。例如，在一个
方面，多肽具有磷脂酶活性但缺乏影响中性油(甘油三酯)部分的任何活性。在一个方面，
本发明提供一种脱胶方法，包括使用本发明的具有磷脂酶活性但不是脂肪酶活性的多肽。
具有磷脂酶活性的活性位点(“催化结构域”)，例如，磷脂酶C(PLC)活性，例如，PI-PLC活性。在一个方面，多肽具有磷脂酶活性但缺乏中性油(甘油三酯)水解活性。例如，在一个
方面，多肽具有磷脂酶活性但缺乏影响中性油(甘油三酯)部分的任何活性。在一个方面，
本发明提供一种脱胶方法，包括使用本发明的具有磷脂酶活性但不是脂肪酶活性的多肽。
[0438] 在此使用的“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或任何上述这些的片段、部分或亚单位，以及天然产生的或合成的分子。
[0439] 在此使用的术语“多肽”和“蛋白”是指通过肽键或修饰的肽键相互连接的氨基酸，即，肽等配物，并可以含有修饰的、不同于20种基因-编码的氨基酸的氨基酸。术语“多肽”还包括肽和多肽片段、基序等等。该术语还包括糖基化的多肽。本发明的肽和多肽还包括所有“模拟肽”和“素拟肽”形式，如下详述。
[0440] 在此使用的，术语“分离的”是指从材料的初始环境(例如，天然环境，如果它是天然产生的)除去它。例如，存在于活动物中的天然产生的多核苷酸或多肽未分离，但是从天然系统中的一些或所有共存材料分开的相同的多核苷酸或多肽被分离。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然分离，使得
载体或组合物不是天然环境的一部分。在此使用的，分离的材料或组合物也可以是“纯化
的”组合物，即，它并不需要绝对的纯度；相反，意图作为相对定义。从文库获得的各核酸可以常规地纯化到电泳均匀性。在可选方面，本发明提供从基因组DNA或从文库中的其他序
列或其他环境已经纯化至少1、2、3、4、5以上量级的核酸。
载体或组合物不是天然环境的一部分。在此使用的，分离的材料或组合物也可以是“纯化
的”组合物，即，它并不需要绝对的纯度；相反，意图作为相对定义。从文库获得的各核酸可以常规地纯化到电泳均匀性。在可选方面，本发明提供从基因组DNA或从文库中的其他序
列或其他环境已经纯化至少1、2、3、4、5以上量级的核酸。
[0441] 本发明的多肽和肽可以分离自天然来源的、合成的、或重组产生的多肽。肽和蛋白可以在体外或体内重组表达。本发明的肽和多肽可以使用本领域已知的任何方法进行制备和分离。本发明的多肽和肽还可以使用本领域公知的化学方法进行合成，全合成或是部
分合成。参见例如，Caruthers(1980)Nucleic Acid Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)
Nucleic Acid Res.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and
Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA。例如，肽合成可以使用各种固相技术(参见例如，Roberge(1995)
Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)来进行，并且自动合成可以例如根据生产商的说明使用ABI 431A肽合成器(Perkin Elmer)来实现。
分合成。参见例如，Caruthers(1980)Nucleic Acid Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)
Nucleic Acid Res.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and
Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA。例如，肽合成可以使用各种固相技术(参见例如，Roberge(1995)
Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)来进行，并且自动合成可以例如根据生产商的说明使用ABI 431A肽合成器(Perkin Elmer)来实现。
[0442] 本发明的肽和多肽还可以被糖基化。糖基化可以在翻译后通过化学方法或细胞生物合成机理进行添加，其中后者包括使用已知的糖基化基序，其对于序列而言可以是天然
的或可以作为肽添加或加入至核酸编码序列。糖基化可以是O-连接的或N-连接的。
的或可以作为肽添加或加入至核酸编码序列。糖基化可以是O-连接的或N-连接的。
[0443] 本发明的肽和多肽，如上述定义，包括全部“模拟肽”和“素拟肽”形式。术语“模拟肽”和“素拟肽”是指一种合成化学化合物，其具有与本发明的多肽基本上相同的结构和/或功能性质。模拟肽可以全部由氨基酸合成的非天然类似物组成，或，是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟肽还可以包括任何数量的天然氨基酸保守性取代，只要该取代同样基本上不改变模拟物的结构和/或活性。对于本发明的保守性变
体多肽而言，进行常规实验即可测定模拟物是否属于本发明的范围，即，其结构和/或功能基本上不改变。因而，在一个方面，如果模拟物组合物具有磷脂酶活性，那么其属于本发明的范围。
体多肽而言，进行常规实验即可测定模拟物是否属于本发明的范围，即，其结构和/或功能基本上不改变。因而，在一个方面，如果模拟物组合物具有磷脂酶活性，那么其属于本发明的范围。
[0444] 本发明的多肽模拟物组合物可以含有任何非天然结构组分的组合。在可选方面，本发明的模拟物组合物包括以下三种结构基团的一种或全部：a)不同于天然酰胺键(“肽
键”)连接的残基连接基团；b)非天然残基代替天然产生的氨基酸残基；或c)诱导二级结
构模拟的残基，即，诱导或稳定二级结构，例如，β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象，等等。例如，当本发明的多肽的全部或一些残基通过不同于天然肽键的化学方式进行连接时，其可以被认为是模拟肽。个别的素拟肽残基可以通过肽键、其他化学键或偶联方式连接，例如，戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能的马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)。可代替传统酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括例
如羰基亚甲基(例如，-C(＝O)-CH2-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、乙烯基、
烯基(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆向酰胺、硫酰胺或酯(参见，例如，Spatola(1983)，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp 267-357，“Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY)。
键”)连接的残基连接基团；b)非天然残基代替天然产生的氨基酸残基；或c)诱导二级结
构模拟的残基，即，诱导或稳定二级结构，例如，β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象，等等。例如，当本发明的多肽的全部或一些残基通过不同于天然肽键的化学方式进行连接时，其可以被认为是模拟肽。个别的素拟肽残基可以通过肽键、其他化学键或偶联方式连接，例如，戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能的马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)。可代替传统酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括例
如羰基亚甲基(例如，-C(＝O)-CH2-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、乙烯基、
烯基(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆向酰胺、硫酰胺或酯(参见，例如，Spatola(1983)，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp 267-357，“Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY)。
[0445] 本发明的多肽还可以通过含有全部或一些非天然残基代替天然产生的氨基酸残基而被作为模拟物。非天然残基在科技和专利文献中已有详细描述；一些示例性的非天然
组合物作为天然氨基酸残基的模拟物和方法如下所述。芳香族氨基酸的模拟物可以产生
自被下述替换，例如，D-或L-萘基丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸；
D-或L-1、-2、3-、或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨
酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯
基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸；D-对-氟-苯丙氨酸；
D-或L-对-联苯基苯丙氨酸；D-或L-对-甲氧基-联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷
基)丙氨酸；和，D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环族的包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香族环。
组合物作为天然氨基酸残基的模拟物和方法如下所述。芳香族氨基酸的模拟物可以产生
自被下述替换，例如，D-或L-萘基丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸；
D-或L-1、-2、3-、或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨
酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯
基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸；D-对-氟-苯丙氨酸；
D-或L-对-联苯基苯丙氨酸；D-或L-对-甲氧基-联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷
基)丙氨酸；和，D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环族的包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香族环。
[0446] 酸性氨基酸的模拟物可以产生自以下取代，例如，保留负电荷的非羧化氨基酸；(膦酰基)丙氨酸；硫酸化苏氨酸。羧基侧链基团(例如，天冬氨酰或谷氨酰)可以通过与
碳二亚胺(R’-N-C-N-R’)反应进行选择性修饰，例如，1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)
碳二亚胺或1-乙基-3(4-氮阳离子-4，4-二甲氧基戊基)碳二亚胺。天冬氨酰或谷氨酰
还可以通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰和谷氨酰基残基。碱性氨基酸的模拟物可以产
生自下述取代，例如，(除了赖氨酸和精氨酸外的)氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸或(胍基)-乙酸
或(胍基)烷基-乙酸，其中烷基如上述定义。腈衍生物(例如，含有CN-部分代替COOH)
可以用于取代天冬酰胺或谷氨酰胺。天冬酰胺酰和谷氨酰基残基可以被去氨基化为相应的
天冬氨酰或谷氨酰残基。精氨酸残基模拟物可以通过精氨酰与例如一种或多种常规试剂反
应产生，包括例如苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或茚三酮，优选在碱性条件下反应。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰与例如芳香族的重氮化合物或四硝基甲烷反应产
生。N-乙酰咪唑和四硝基甲烷可以分别用于形成O-乙酰酪氨酰化合物和3-硝基衍生物。
半胱氨酸残基模拟物可以通过半胱氨酰残基与例如α-卤代乙酸酯(例如2-氯乙酸或氯
乙酰胺)和相应胺类反应产生；以得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟
物还可以通过半胱氨酰残基与下述物质反应产生，例如，溴-三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪
唑)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基
二硫化物；对氯汞苯甲酸酯；2-氯汞-4-硝基苯酚；或，氯-7-硝基苯并-氧杂-1，3-二唑。
赖氨酸模拟物可以(和氨基末端残基可以进行改变)通过赖氨酰与例如琥珀酸或其他羧
酸酐反应产生。赖氨酸和其他含α-氨基残基模拟物还可以通过与亚胺酯反应产生，例如
甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4戊二酮和酰氨基转移酶催化的乙醛酸反应。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例甲硫氨酸亚砜的反
应产生。脯氨酸的模拟物包括例如哌啶酸、四氢噻唑羧酸、3-或4-羟脯氨酸、脱水脯氨酸、
3-或4-甲基脯氨酸或3，3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰与例如二
乙基焦碳酸酯或对溴苯酰甲基溴反应产生。其他模拟物包括例如通过脯氨酸和赖氨酸的羟
基化产生的那些；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化产生的那些；赖氨酸、精氨酸和组
氨酸的α-氨基的甲基化产生的那些；N-端胺的乙酰化产生的那些；主链酰胺残基的甲基
化或被N-甲基氨基酸取代产生的那些；或C-端羧基的酰胺化产生的那些。
碳二亚胺(R’-N-C-N-R’)反应进行选择性修饰，例如，1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)
碳二亚胺或1-乙基-3(4-氮阳离子-4，4-二甲氧基戊基)碳二亚胺。天冬氨酰或谷氨酰
还可以通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰和谷氨酰基残基。碱性氨基酸的模拟物可以产
生自下述取代，例如，(除了赖氨酸和精氨酸外的)氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸或(胍基)-乙酸
或(胍基)烷基-乙酸，其中烷基如上述定义。腈衍生物(例如，含有CN-部分代替COOH)
可以用于取代天冬酰胺或谷氨酰胺。天冬酰胺酰和谷氨酰基残基可以被去氨基化为相应的
天冬氨酰或谷氨酰残基。精氨酸残基模拟物可以通过精氨酰与例如一种或多种常规试剂反
应产生，包括例如苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或茚三酮，优选在碱性条件下反应。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰与例如芳香族的重氮化合物或四硝基甲烷反应产
生。N-乙酰咪唑和四硝基甲烷可以分别用于形成O-乙酰酪氨酰化合物和3-硝基衍生物。
半胱氨酸残基模拟物可以通过半胱氨酰残基与例如α-卤代乙酸酯(例如2-氯乙酸或氯
乙酰胺)和相应胺类反应产生；以得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟
物还可以通过半胱氨酰残基与下述物质反应产生，例如，溴-三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪
唑)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基
二硫化物；对氯汞苯甲酸酯；2-氯汞-4-硝基苯酚；或，氯-7-硝基苯并-氧杂-1，3-二唑。
赖氨酸模拟物可以(和氨基末端残基可以进行改变)通过赖氨酰与例如琥珀酸或其他羧
酸酐反应产生。赖氨酸和其他含α-氨基残基模拟物还可以通过与亚胺酯反应产生，例如
甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4戊二酮和酰氨基转移酶催化的乙醛酸反应。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例甲硫氨酸亚砜的反
应产生。脯氨酸的模拟物包括例如哌啶酸、四氢噻唑羧酸、3-或4-羟脯氨酸、脱水脯氨酸、
3-或4-甲基脯氨酸或3，3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰与例如二
乙基焦碳酸酯或对溴苯酰甲基溴反应产生。其他模拟物包括例如通过脯氨酸和赖氨酸的羟
基化产生的那些；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化产生的那些；赖氨酸、精氨酸和组
氨酸的α-氨基的甲基化产生的那些；N-端胺的乙酰化产生的那些；主链酰胺残基的甲基
化或被N-甲基氨基酸取代产生的那些；或C-端羧基的酰胺化产生的那些。
[0447] 本发明的多肽的残基，例如，氨基酸，还可以被相反手性的氨基酸(或素拟肽残基)替换。因而，任何天然产生的L构型氨基酸(其还可以称作R或S构型，取决于化学本
体的结构)可以被替换为相同化学结构类型、但是相反手性的氨基酸或素拟肽，称作D-氨
基酸，还可以称作R-或S-构型。
体的结构)可以被替换为相同化学结构类型、但是相反手性的氨基酸或素拟肽，称作D-氨
基酸，还可以称作R-或S-构型。
[0448] 本发明还提供通过天然处理，例如后翻译处理(例如，磷酸化、酰化等)或通过化学修饰技术对本发明的多肽进行修饰的方法，以及所得到的修饰多肽。修饰可以发生于多
肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以理解相同类型的修饰可
以相同或不同程度地存在于给定多肽的几个位点处。给定多肽还可以具有很多类型的修
饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价结合黄素、共价结合血红素基、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联
环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、消旋化、硒化、硫酸化、以及转移-RNA介导的添加氨基酸至蛋白例如精氨酰化。参见，例如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pp.1-12(1983)。
肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以理解相同类型的修饰可
以相同或不同程度地存在于给定多肽的几个位点处。给定多肽还可以具有很多类型的修
饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价结合黄素、共价结合血红素基、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联
环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、消旋化、硒化、硫酸化、以及转移-RNA介导的添加氨基酸至蛋白例如精氨酰化。参见，例如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pp.1-12(1983)。
[0449] 还可以使用固相化学肽合成方法合成本发明的多肽或其片段。该方法自从20世纪60年代初期已经是本领域公知的(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，
1963)(还 参 见Stewart，J.M.和 Young，J.D.，Solid Phase Petide，2nd Ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.，pp.11-12))，最近其可以在可市售购得的实验室肽设计和合成试剂盒(Cambridge Research Biochemicals)中应用。该可市售购得实验室试剂盒已
被广泛应用于H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导中，并提供了在许多连接在单一平板上的“棒”或“针”的尖端上进行肽合成。当使用该系统时，将具有棒或针的平板倒置插入具有相应孔或槽的第二平板，其含有将合适的氨基酸连接或锚
定至棒或针尖端的溶液。通过重复该处理步骤，即，将棒或针尖端倒置插入合适的溶液中，氨基酸被构建成为目标肽。此外，可以使用许多可获得的FMOC肽合成系统。例如，多肽或
TM
片段可以在固相载体上使用Applied Biosystems，Inc.Model 431A 自动肽合成仪进行装
配。该设备提供了本发明的肽的简易获得方法，其可以直接合成，也可以合成能够使用其他已知技术进行偶联的一系列片段来获得。
1963)(还 参 见Stewart，J.M.和 Young，J.D.，Solid Phase Petide，2nd Ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.，pp.11-12))，最近其可以在可市售购得的实验室肽设计和合成试剂盒(Cambridge Research Biochemicals)中应用。该可市售购得实验室试剂盒已
被广泛应用于H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导中，并提供了在许多连接在单一平板上的“棒”或“针”的尖端上进行肽合成。当使用该系统时，将具有棒或针的平板倒置插入具有相应孔或槽的第二平板，其含有将合适的氨基酸连接或锚
定至棒或针尖端的溶液。通过重复该处理步骤，即，将棒或针尖端倒置插入合适的溶液中，氨基酸被构建成为目标肽。此外，可以使用许多可获得的FMOC肽合成系统。例如，多肽或
TM
片段可以在固相载体上使用Applied Biosystems，Inc.Model 431A 自动肽合成仪进行装
配。该设备提供了本发明的肽的简易获得方法，其可以直接合成，也可以合成能够使用其他已知技术进行偶联的一系列片段来获得。
[0450] 磷脂酶
[0451] 本发明提供具有磷脂酶活性的多肽、编码它的核酸、与其结合的抗体、代表酶抗原位点(表位)和活性位点的肽、调控和结合结构域以及其制备和使用方法。在一个方面，本发明的多肽可以具有磷脂酶活性或磷脂酶活性的任何组合，如在此所述的(例如，磷脂酰
肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性等)。在可选方面，本发明的磷脂酶具有从在此所述的
示例性磷脂酶修饰后的活性。
肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性等)。在可选方面，本发明的磷脂酶具有从在此所述的
示例性磷脂酶修饰后的活性。
[0452] 在此使用的，术语“磷脂酶”包括具有任何磷脂酶活性的酶，例如，裂解甘油磷酸酯酯键(催化甘油磷酸酯酯键的水解)，例如，在油中，如粗制油或植物油。本发明的磷脂酶活性可以产生水可提取的磷酸化碱和甘油二酯。术语“磷脂酶活性”是指甘油磷酸酯酯键
在高温、低温、碱性pH值和酸性pH值下的水解，裂解甘油磷酸酯产生水可提取的磷酸化碱
和甘油二酯，切割磷脂中的甘油和磷酸的酯键，和其他活性，如结合和水解底物的能力，如油，例如，粗制油或植物油，底物也包括植物和动物磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂酶活性可以包括磷脂酶C(PLC)活性；PI-PLC活性、磷脂酶A(PLA)活性，
如磷脂酶A1或磷脂酶A2活性；磷脂酶B(PLB)活性，如磷脂酶B1或磷脂酶B2活性，包括溶
血磷脂酶(LPL)活性和/或溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性；磷脂酶D(PLD)活性，如磷
脂酶D1或磷脂酶D2活性；和/或patatin活性或其任意组合。磷脂酶活性可以包括水解
糖蛋白，例如，作为在马铃著块茎或马铃著属的任何植物中发现的糖蛋白，例如，马铃著。在可选实施方案中，磷脂酶活性可以包括patatin酶活性，如patatin酯酶活性(参见，例如，Jimenez(2002)Biotechnol.Prog.18：635-640)。在某些实施方案中，磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。
在高温、低温、碱性pH值和酸性pH值下的水解，裂解甘油磷酸酯产生水可提取的磷酸化碱
和甘油二酯，切割磷脂中的甘油和磷酸的酯键，和其他活性，如结合和水解底物的能力，如油，例如，粗制油或植物油，底物也包括植物和动物磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂酶活性可以包括磷脂酶C(PLC)活性；PI-PLC活性、磷脂酶A(PLA)活性，
如磷脂酶A1或磷脂酶A2活性；磷脂酶B(PLB)活性，如磷脂酶B1或磷脂酶B2活性，包括溶
血磷脂酶(LPL)活性和/或溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性；磷脂酶D(PLD)活性，如磷
脂酶D1或磷脂酶D2活性；和/或patatin活性或其任意组合。磷脂酶活性可以包括水解
糖蛋白，例如，作为在马铃著块茎或马铃著属的任何植物中发现的糖蛋白，例如，马铃著。在可选实施方案中，磷脂酶活性可以包括patatin酶活性，如patatin酯酶活性(参见，例如，Jimenez(2002)Biotechnol.Prog.18：635-640)。在某些实施方案中，磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。
[0453] 在可选实施方案中，本发明的PLC磷脂酶利用(例如，催化水解)各种磷脂底物，包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和/或磷
脂酸(PA)或其组合。此外，这些酶对于这些磷脂的溶血磷脂形式可以具有不同程度的活
性。在各方面，本发明的PLC酶可以对磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺作为底物表现出偏好性。
脂酸(PA)或其组合。此外，这些酶对于这些磷脂的溶血磷脂形式可以具有不同程度的活
性。在各方面，本发明的PLC酶可以对磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺作为底物表现出偏好性。
[0454] 在可选实施方案中，本发明的磷脂酰肌醇PLC磷脂酶利用各种磷脂底物，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸或其组合。在可选实施方案中，这些酶对于这些磷脂的溶血磷脂形式可以具有不同程度的活性。在各方面，本发明的磷脂酰肌醇PLC酶可以对磷脂酰肌醇作为底物表现出偏好性。
[0455] 在可选实施方案中，磷脂酶活性可以包括对于一种或多种特异性底物是特异性的，例如，本发明的酶可以对于PE和PC；PE和PI；PE和PS；PS和PC；PS和PI；PI和PC；PS、PI和PC；PE、PI和PC；PC、PE和PS；PE、PS和PI；或，PE、PS、PI和PC或其任意组合具有作用特异性。
[0456] 在可选实施方案中，本发明的磷脂酶可以具有多功能活性，例如，在此所述的一种或多种酶活性的组合。例如，在一个方面，本发明的多肽是酶活性，但缺乏脂肪酶活性或缺乏影响中性油(甘油三酯)部分的任何酶活性。在特定过程中可能需要使用这样的多肽，例如，在脱胶过程中，其中重要的是，中性油部分不会受到损害(减少、退化，例如，水解)。
因此，在一个方面，本发明提供一种脱胶方法，包括使用本发明的具有磷脂酶活性但不是脂肪酶活性的多肽。
因此，在一个方面，本发明提供一种脱胶方法，包括使用本发明的具有磷脂酶活性但不是脂肪酶活性的多肽。
[0457] 在可选实施方案中，本发明的具有patatin酶活性的多肽可以利用各种磷脂底物，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇，和磷脂酸或其组合。此外，这些酶对于这些磷脂的溶血磷脂形式可以具有不同程度的活性。在各方面，本发明的
patatin基于氨基酸序列相似度的保守。在各方面，这些酶表现出多样化的生化特性并可以发挥PLA1、PLA2、PLC或PLD酶类的反应特点。
patatin基于氨基酸序列相似度的保守。在各方面，这些酶表现出多样化的生化特性并可以发挥PLA1、PLA2、PLC或PLD酶类的反应特点。
[0458] 在可选实施方案中，本发明的具有本发明的PLD磷脂酶的多肽可以利用各种磷脂底物，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸或其组合。此外，这些酶对于这些磷脂的溶血磷脂形式可以具有不同程度的活性。在一个方面，这些酶可以用于进行酯交换反应。产生结构性磷脂。
[0459] 在可选实施方案中，本发明的多肽具有活性，包括裂解甘油磷酸酯酯键，水解磷酸酯酯键的能力，包括patatin、脂酰水解酶(LAH)、磷脂酶A、B、C和/或磷脂酶D活性，或其任意组合。
[0460] 在此使用的，1个酶单位是在指定条件下导致反应处理1微摩尔物质分钟所需的酶的量。
[0461] 在可选实施方案中，本发明提供有和没有信号序列的多肽，以及信号序列本身(例如，分离的信号序列肽)。本发明包括本发明的酶的片段或子序列，例如，肽或多肽包含或由催化结构域(“活性位点”)、结合位点、调控结构域、表位、信号序列、初前结构域等组成。本发明还包括固定化磷脂酶、抗磷脂酶抗体和其片段。本发明包括杂复合体，例如，融合蛋白、异二聚体等，包括本发明的磷脂酶。可以通过常规筛选方式测定代表酶抗原位点(表位)、活性位点、结合位点、信号序列等的肽。
[0462] 本发明的这些酶和方法可以用于实现对高磷油更完全的脱胶，特别是，水稻、大豆、玉米、芥花和葵花籽油。例如，在一个方面，经PI-PLC的裂解，磷脂酰肌醇转化为二酰基甘油和磷酸肌醇。二酰基甘油分配到水相(改善油产率)，磷酸肌醇分配到水相，在那里作
为离心期间的重相成分除去。本发明的酶，例如，本发明的PI-PLC，可以加到化学或物理油精制过程。
为离心期间的重相成分除去。本发明的酶，例如，本发明的PI-PLC，可以加到化学或物理油精制过程。
[0463] 在可选方面，本发明的酶具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)活性、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性、磷脂酸磷酸酶活性、磷脂酶A活性和/或patatin相关的磷脂酶
活性。这些酶可以单独使用或者彼此或与其他本发明的酶或其他酶组合使用。在一个方面，本发明提供其中这些酶(包括磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PIPLC)、磷脂酰胆碱特异性磷脂
酶C和/或磷脂酶D(与磷酸酶结合)、磷脂酸磷酸酶、磷脂酶A、本发明的patatin相关的
磷脂酶)单独使用或与油脱胶组合使用的方法，例如，植物油，例如，高磷油，如大豆、玉米、芥花、米糠和葵花籽油。本发明的这些酶和方法可以用于实现对高磷油更完全的脱胶，特别是，大豆、玉米、芥花、米糠和葵花籽油。，经PI-PLC的裂解，磷脂酰肌醇转化为二酰基甘油和磷酸肌醇。二酰基甘油分配到水相(改善油产率)，磷酸肌醇分配到水相，在那里作为离
心期间的重相成分除去。本发明的酶，例如，本发明的PI-PLC，可以加到化学或物理油精制过程。
活性。这些酶可以单独使用或者彼此或与其他本发明的酶或其他酶组合使用。在一个方面，本发明提供其中这些酶(包括磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PIPLC)、磷脂酰胆碱特异性磷脂
酶C和/或磷脂酶D(与磷酸酶结合)、磷脂酸磷酸酶、磷脂酶A、本发明的patatin相关的
磷脂酶)单独使用或与油脱胶组合使用的方法，例如，植物油，例如，高磷油，如大豆、玉米、芥花、米糠和葵花籽油。本发明的这些酶和方法可以用于实现对高磷油更完全的脱胶，特别是，大豆、玉米、芥花、米糠和葵花籽油。，经PI-PLC的裂解，磷脂酰肌醇转化为二酰基甘油和磷酸肌醇。二酰基甘油分配到水相(改善油产率)，磷酸肌醇分配到水相，在那里作为离
心期间的重相成分除去。本发明的酶，例如，本发明的PI-PLC，可以加到化学或物理油精制过程。
[0464] 在一个方面，本发明提供组合物，例如，在中性pH下的含有柠檬酸钠的溶液，用于水合非水化物。例如，本发明提供pH为约4～9，或者，5～8，或者，6～7的柠檬酸钠溶液，可以使用水合高磷油中的非水化磷脂(包括本发明的酶)。在一个方面，通过螯合与磷脂相关的钙和镁进行非水化磷脂的水合，从而使以前不溶性的磷脂盐更容易分配到水相。在一
个方面，一旦磷脂移动到水/油界面或进入水相，本发明的磷脂酶(例如，本发明的磷脂酶
特异性磷酸水解酶)或另一种磷脂酶就将磷脂转换成二酰基甘油和磷酸酯。在一个方面，
钙和镁金属含量在加入酸和碱时降低(参见碱过程的讨论)。
个方面，一旦磷脂移动到水/油界面或进入水相，本发明的磷脂酶(例如，本发明的磷脂酶
特异性磷酸水解酶)或另一种磷脂酶就将磷脂转换成二酰基甘油和磷酸酯。在一个方面，
钙和镁金属含量在加入酸和碱时降低(参见碱过程的讨论)。
[0465] 本发明的酶是高度选择性的催化剂。象其他酶一样，它们催化反应，可以具有常规合成化学中不可能发生的立体、区域和化学选择性。此外，本发明的酶可以是明显多方面的。它们可以在有机溶剂中作用，在极端pH(例如，高pH和低pH)、极端温度(例如，高温和低温)、极端盐度(例如，高盐度和低盐度)下操作，并催化与其天然的、生理的底物在结构上不相关的化合物发生反应。本发明的酶可以被设计成对宽范围的天然和非天然底物是反
应性的，从而使几乎所有的有机前导化合物被修饰。本发明的酶也可以被设计成是高度对
映体和区域选择性的。这些酶表现出的高度官能团特异性使得能够对合成序列中的每一反
应保持跟踪，从而导致新的活性化合物。本发明的酶也可以被设计成催化许多不同的反应，与它们天生的生理功能在性质上无关。
应性的，从而使几乎所有的有机前导化合物被修饰。本发明的酶也可以被设计成是高度对
映体和区域选择性的。这些酶表现出的高度官能团特异性使得能够对合成序列中的每一反
应保持跟踪，从而导致新的活性化合物。本发明的酶也可以被设计成催化许多不同的反应，与它们天生的生理功能在性质上无关。
[0466] 本发明利用酶的独特的催化性能。然而在化学变化中使用生物催化剂(即，纯化或粗制酶，非活或活细胞)通常需要鉴定与特定起始化合物反应的特定生物催化剂。本发
明使用选定的生物催化剂，即，本发明的酶，和对于在许多起始化合物中存在的官能团特异性的反应条件。每种生物催化剂对于一个官能团或几个相关的官能团是特异性的，并且可
以与许多含有这种官能团的起始化合物反应。生物催化反应从单一起始化合物产生衍生物
群体。这些衍生物可以受到另一回合的生物催化反应，产生衍生物化合物的第二群体。可
以使用生物催化衍生的每一次迭代产生初始化合物数以千计的变型。
明使用选定的生物催化剂，即，本发明的酶，和对于在许多起始化合物中存在的官能团特异性的反应条件。每种生物催化剂对于一个官能团或几个相关的官能团是特异性的，并且可
以与许多含有这种官能团的起始化合物反应。生物催化反应从单一起始化合物产生衍生物
群体。这些衍生物可以受到另一回合的生物催化反应，产生衍生物化合物的第二群体。可
以使用生物催化衍生的每一次迭代产生初始化合物数以千计的变型。
[0467] 本发明提供鉴定文库内的单一活性PLC酶的方法，文库的特征在于产生它的一系列生物催化反应，所谓的“生物合成历史”。一个实施方案包括筛选生物活性的文库，并且跟踪生物合成历史来识别产生活性化合物的特异性反应序列。反应序列可以重复并且合成化
合物的结构决定。在该实施方案中，对于这种识别模式，固定化技术不需要；可以使用几乎任何类型的筛选分析自由地合成和测试化合物。在本实施方案中，酶反应对官能团的高度
特异性允许“跟踪”组成生物催化产生的文库的特异性酶反应。
合物的结构决定。在该实施方案中，对于这种识别模式，固定化技术不需要；可以使用几乎任何类型的筛选分析自由地合成和测试化合物。在本实施方案中，酶反应对官能团的高度
特异性允许“跟踪”组成生物催化产生的文库的特异性酶反应。
[0468] 本发明还提供使用本发明的核酸、多肽和抗体发现新的磷脂酶的方法。在一个方面，筛选λ噬菌体文库以基于表达发现磷脂酶。使用λ噬菌体文库筛选允许检测毒性克
隆；改进的底物结合；对于工程化宿主的降低的需求，绕过来自大规模切除文库的任何偏
好的可能性；以及，在低克隆密度下的快速生长。筛选λ噬菌体文库可以是在液相或在固
相中进行。液相筛选可以提供比固相筛选更大的分析条件弹性；额外的底物灵活性；弱克
隆的更高敏感性；以及简化自动操控。
隆；改进的底物结合；对于工程化宿主的降低的需求，绕过来自大规模切除文库的任何偏
好的可能性；以及，在低克隆密度下的快速生长。筛选λ噬菌体文库可以是在液相或在固
相中进行。液相筛选可以提供比固相筛选更大的分析条件弹性；额外的底物灵活性；弱克
隆的更高敏感性；以及简化自动操控。
[0469] 在可选实施方案中，使用机器人自动化进行过程步骤；例如，每天进行数千个生物催化反应和筛选分析，以及保证高水平的精确性和可复制性(参见下述关于阵列的讨论)。因而，衍生物化合物库可以在几周左右进行生产。关于分子修饰的进一步教导，包括小分
子，参见PCT/US94/09174。
子，参见PCT/US94/09174。
[0470] 磷脂酶信号序列
[0471] 本发明提供磷脂酶信号序列(例如，信号肽(SP))，例如，包括信号序列的肽和/或嵌合多肽，其中肽或嵌合体具有在此所述的信号序列。本发明提供编码这些信号序列(SP，例如，具有包含/由本发明的多肽的氨基末端残基组成的序列的肽)的核酸。在一个方面，本发明提供包括肽的信号序列，所述肽包含/由本发明的多肽的残基1～20、1～21、1～
22、1～23、1～24、1～25、1～26、1～27、1～28、1～28、1～30、1～31、1～32或1～
33所示的序列组成，例如，包括SEQ IDNO：6所示的序列并具有表12～15中所示的一种或
多种突变的多肽，或其酶活性片段。这些肽可以是嵌合蛋白的一部分，例如，重组蛋白。信号序列肽可以与另一种本发明的酶(例如，本发明的磷脂酶未从其衍生)或者与另一种磷
脂酶或任何多肽匹配，如下面进一步讨论的。
22、1～23、1～24、1～25、1～26、1～27、1～28、1～28、1～30、1～31、1～32或1～
33所示的序列组成，例如，包括SEQ IDNO：6所示的序列并具有表12～15中所示的一种或
多种突变的多肽，或其酶活性片段。这些肽可以是嵌合蛋白的一部分，例如，重组蛋白。信号序列肽可以与另一种本发明的酶(例如，本发明的磷脂酶未从其衍生)或者与另一种磷
脂酶或任何多肽匹配，如下面进一步讨论的。
[0472] 示例性的信号序列包括SEQ ID NO：4的残基1～37和SEQ ID NO：6的残基1～23。
[0473] 在一些方面，本发明的磷脂酶不具有信号序列。在一个方面，本发明提供缺少全部或部分信号序列的本发明的磷脂酶。在一个方面，本发明提供编码来自一种可操作地连接到不同磷脂酶的核酸序列的磷脂酶的信号序列的核酸序列，或任选地，可以需要来自非磷
脂酶蛋白的信号序列。
脂酶蛋白的信号序列。
[0474] 磷脂酶初前(prepro)结构域、结合结构域和催化结构域
[0475] 除了上面讨论的信号序列(例如，信号肽(SP))之外，本发明提供初前结构域、结合结构域(例如，底物结合结构域)和催化结构域(CD)。本发明的SP结构域、结合结构域、
初前结构域和/或CD可以是分离的、合成的或重组的肽或者可以是融合蛋白的一部分，例
如，作为嵌合蛋白中的异源结构域。本发明提供编码这些催化结构域(CD)(例如，“活性位点”)、初前结构域、结合结构域和信号序列(SP，例如，具有包含/由本发明的多肽的氨基末端残基组成的序列的肽)。
初前结构域和/或CD可以是分离的、合成的或重组的肽或者可以是融合蛋白的一部分，例
如，作为嵌合蛋白中的异源结构域。本发明提供编码这些催化结构域(CD)(例如，“活性位点”)、初前结构域、结合结构域和信号序列(SP，例如，具有包含/由本发明的多肽的氨基末端残基组成的序列的肽)。
[0476] 本发明的磷脂酶信号序列(SP)、结合结构域、催化结构域(CD)和/或初前序列可以是分离的肽，或，连接到另一种磷脂酶或非磷脂酶多肽的序列，例如，作为融合(嵌合)蛋白。在一个方面，包含本发明的磷脂酶信号序列SP和/或初前的多肽包括异源于本发明的
磷脂酶的序列(例如，融合蛋白，其包含本发明的SP和/或初前和来自另一种磷脂酶或非
磷脂酶蛋白的序列)。在一个方面，本发明提供具有异源CD、SP和/或初前序列的本发明
的磷脂酶，例如，具有酵母信号序列的序列。本发明的磷脂酶可以在载体中包括异源CD、SP和/或初前，例如，pPIC系列载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
磷脂酶的序列(例如，融合蛋白，其包含本发明的SP和/或初前和来自另一种磷脂酶或非
磷脂酶蛋白的序列)。在一个方面，本发明提供具有异源CD、SP和/或初前序列的本发明
的磷脂酶，例如，具有酵母信号序列的序列。本发明的磷脂酶可以在载体中包括异源CD、SP和/或初前，例如，pPIC系列载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
[0477] 在一个方面，在鉴定新型磷脂酶多肽后对本发明的SP、CD和/或初前序列进行鉴定。蛋白分类和转移至其合适的细胞位置的途径通常被称为蛋白靶向途径。所有这些
靶向系统的一种最重要元件是位于新合成的多肽的氨基末端的短氨基酸序列，称为信号序
列。该信号序列引导蛋白到其合适的细胞位置，且其在转运过程中或当蛋白抵达其终点
时被除去。大多数溶酶体、膜或分泌蛋白都具有氨基端信号序列，其对它们进行标记用于
转运至内质网的腔体内。信号序列可以有不同长度，从13～45或更多氨基酸残基。各
种识别信号序列的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一个方面，新型水解酶信号肽
被通过称为信号P的方法进行了鉴定。信号P使用同时识别信号肽及其裂解位点的组合
神经网络。(Nielsen等人，“Identification of prokaryotic and eukaryotic signal
peptides and prediction of their cleavae sites.”Protein Engineering，vol.10，
no.1，p.1-6(1997)。
靶向系统的一种最重要元件是位于新合成的多肽的氨基末端的短氨基酸序列，称为信号序
列。该信号序列引导蛋白到其合适的细胞位置，且其在转运过程中或当蛋白抵达其终点
时被除去。大多数溶酶体、膜或分泌蛋白都具有氨基端信号序列，其对它们进行标记用于
转运至内质网的腔体内。信号序列可以有不同长度，从13～45或更多氨基酸残基。各
种识别信号序列的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一个方面，新型水解酶信号肽
被通过称为信号P的方法进行了鉴定。信号P使用同时识别信号肽及其裂解位点的组合
神经网络。(Nielsen等人，“Identification of prokaryotic and eukaryotic signal
peptides and prediction of their cleavae sites.”Protein Engineering，vol.10，
no.1，p.1-6(1997)。
[0478] 在一些方面，本发明的磷脂酶可以不含SP和/或初前序列、和/或催化结构域(CD)。在一个方面，本发明提供缺失全部或部分SP、CD和/或初前结构域的磷脂酶。在一
个方面，本发明提供编码来自一种可操作地连接到不同磷脂酶的核酸序列的磷脂酶的信号
序列(SP)、CD和/或初前的核酸序列，或任选地，可以需要来自非磷脂酶蛋白的信号序列
(SP)、CD和/或初前结构域。
个方面，本发明提供编码来自一种可操作地连接到不同磷脂酶的核酸序列的磷脂酶的信号
序列(SP)、CD和/或初前的核酸序列，或任选地，可以需要来自非磷脂酶蛋白的信号序列
(SP)、CD和/或初前结构域。
[0479] 本发明还提供包含本发明的信号序列(SP)、初前结构域和/或催化结构域(CD)和异源序列的分离的、合成的或重组的多肽。异源序列是用SP、初前结构域和/或CD非天然
连接到(例如，磷脂酶)的序列。SP、初前结构域和/或CD非天然连接的序列可以位于SP、
初前结构域和/或CD的氨基末端、羧基末端、和/或SP和/或CD二者的末端。在一个方
面，本发明提供分离的、合成的或重组的多肽，所述多肽包括包含本发明的信号序列(SP)、初前结构域和/或催化结构域(CD)或由其组成的多肽，条件为其不与任何天然连接的序列
(例如，磷脂酶序列)相连。相似地，在一个方面，本发明提供编码这些多肽的分离的、合成的或重组的核酸。因此，在一个方面，本发明的分离的、合成的或重组的核酸包括本发明的信号序列(SP)、初前结构域和/或催化结构域(CD)的编码序列和异源序列(即，非天然连
接到本发明的信号序列(SP)、初前结构域和/或催化结构域(CD)的序列)。异源序列可以
位于SP、初前结构域和/或CD编码序列的3’末端、5’末端、和/或两端。
连接到(例如，磷脂酶)的序列。SP、初前结构域和/或CD非天然连接的序列可以位于SP、
初前结构域和/或CD的氨基末端、羧基末端、和/或SP和/或CD二者的末端。在一个方
面，本发明提供分离的、合成的或重组的多肽，所述多肽包括包含本发明的信号序列(SP)、初前结构域和/或催化结构域(CD)或由其组成的多肽，条件为其不与任何天然连接的序列
(例如，磷脂酶序列)相连。相似地，在一个方面，本发明提供编码这些多肽的分离的、合成的或重组的核酸。因此，在一个方面，本发明的分离的、合成的或重组的核酸包括本发明的信号序列(SP)、初前结构域和/或催化结构域(CD)的编码序列和异源序列(即，非天然连
接到本发明的信号序列(SP)、初前结构域和/或催化结构域(CD)的序列)。异源序列可以
位于SP、初前结构域和/或CD编码序列的3’末端、5’末端、和/或两端。
[0480] 本发明的多肽包括活性形式或非活性形式的磷脂酶。例如，本发明的多肽包括初前序列的“成熟作用”或处理之前的前蛋白，例如，通过前蛋白处理酶，例如前蛋白转化酶以产生“活性”成熟蛋白。本发明的多肽包括由于其他原因而失活的磷脂酶，例如，被“激活”前，其中激活通过后翻译处理事件进行，例如，内-或外-肽酶或蛋白酶作用、磷酸化
事件、酰胺化、糖基化、去糖基化、硫酸化、二聚化事件，等等。鉴定“初前”结构域序列、CD、结合结构域和信号序列的方法是常规的和本领域公知的，参见，例如，Van de Ven(1993)
Crit.Rev.Oncog.4(2)：115-136；用于鉴定蛋白-蛋白相互作用的酵母两次杂交筛选，被
描述于例如Miller(2004)Methods Mol.Biol.261：247-62；Heyninck(2004)Methods Mol.
Biol.282：223-41，USPN 6,617,122；6,190,874。例如，为了鉴定初前序列，从胞外空间纯化蛋白并测定N-端蛋白序列，并将其与未处理的形式进行比较。
事件、酰胺化、糖基化、去糖基化、硫酸化、二聚化事件，等等。鉴定“初前”结构域序列、CD、结合结构域和信号序列的方法是常规的和本领域公知的，参见，例如，Van de Ven(1993)
Crit.Rev.Oncog.4(2)：115-136；用于鉴定蛋白-蛋白相互作用的酵母两次杂交筛选，被
描述于例如Miller(2004)Methods Mol.Biol.261：247-62；Heyninck(2004)Methods Mol.
Biol.282：223-41，USPN 6,617,122；6,190,874。例如，为了鉴定初前序列，从胞外空间纯化蛋白并测定N-端蛋白序列，并将其与未处理的形式进行比较。
[0481] 本发明的多肽可以配制成任何液体、固体或半固体或凝胶形式，作为蛋白制剂。例如，本发明的蛋白制剂可以包括含有非水液体组合物的制剂、流延固体、粉末、冻干粉末、颗粒形式、微粒形式、压片、小球、丸剂、凝胶形式、水凝胶、糊剂、气雾剂、喷雾剂、洗液或浆剂。
[0482] 本发明的多肽包括全部活性形式，包括活性子序列，例如，本发明的酶的催化结构域(CD)或活性位点。在一个方面，本发明提供催化结构域或活性位点，如下所示。在一个方面，本发明提供包含或由活性位点结构域组成的肽或多肽，如应用数据库例如Pfam(其
为涵盖多种常规蛋白家族的多序列比对和隐马尔可夫模型的大集合，The Pfam protein
families database，A.Bateman，E.Birney，L.Cerruti，R.Durbin，L.Etwiller，S.R.Eddy，S.Griffiths-Jones，K.L.Howe，M.Marshall，以 及 E.L.L.Sonnhammer，Nucleic Acids Research，30(1)：276-280、2002)所预测的那样，或其等价物。
为涵盖多种常规蛋白家族的多序列比对和隐马尔可夫模型的大集合，The Pfam protein
families database，A.Bateman，E.Birney，L.Cerruti，R.Durbin，L.Etwiller，S.R.Eddy，S.Griffiths-Jones，K.L.Howe，M.Marshall，以 及 E.L.L.Sonnhammer，Nucleic Acids Research，30(1)：276-280、2002)所预测的那样，或其等价物。
[0483] 本发明提供将本发明的酶的N-端或C-端子序列(例如，信号序列、初前序列)与其他多肽、活性蛋白或蛋白片段进行融合。本发明的酶(例如，磷脂酶C酶)还可以通过将
酶表达为无活性的融合蛋白来生产，后者之后通过蛋白水解裂解事件(使用内源性或外源
性蛋白酶活性，例如，胰蛋白酶)进行激活，其导致融合蛋白伴侣与成熟酶，例如，磷脂酶C酶发生分离。在一个方面，本发明的融合蛋白表达自杂交核苷酸构建子，其编码一个单独的开放式阅读框，含有以下元件：融合蛋白的核苷酸序列、接头序列(定义为编码连接两种弹性较差的蛋白结构域的弹性氨基酸序列的核苷酸序列)、蛋白酶裂解识别位点、以及成熟酶(例如，任何本发明的酶，例如，磷脂酶)序列。在可选方面，融合蛋白可以包括果胶裂解酶的序列、木聚糖酶的序列、磷脂酸磷酸酶序列，或另一种序列，例如，之前已显示在目标宿主系统中过表达的序列。
酶表达为无活性的融合蛋白来生产，后者之后通过蛋白水解裂解事件(使用内源性或外源
性蛋白酶活性，例如，胰蛋白酶)进行激活，其导致融合蛋白伴侣与成熟酶，例如，磷脂酶C酶发生分离。在一个方面，本发明的融合蛋白表达自杂交核苷酸构建子，其编码一个单独的开放式阅读框，含有以下元件：融合蛋白的核苷酸序列、接头序列(定义为编码连接两种弹性较差的蛋白结构域的弹性氨基酸序列的核苷酸序列)、蛋白酶裂解识别位点、以及成熟酶(例如，任何本发明的酶，例如，磷脂酶)序列。在可选方面，融合蛋白可以包括果胶裂解酶的序列、木聚糖酶的序列、磷脂酸磷酸酶序列，或另一种序列，例如，之前已显示在目标宿主系统中过表达的序列。
[0484] 可以采用任何宿主系统(参见上述讨论)，例如，任何细菌，例如，革兰氏阳性菌，如杆菌，或革兰氏阴性菌，如大肠杆菌，或任何酵母，例如，毕赤酵母。核苷酸序列在嵌合核苷酸构建中的排列可以根据各融合构建子所获得的蛋白表达水平来进行测定。按照从核苷酸构建子的5’末端至构建子的3’末端，在一个方面，核苷酸序列按照如下方式进行组装：
信号序列/融合蛋白/接头序列/蛋白酶裂解识别位点/成熟酶(例如，任何本发明的酶，
例如，磷脂酶)或信号序列/前序列/成熟酶/接头序列/融合蛋白。酶作为无活性融合
蛋白的表达(例如，任何本发明的酶，例如，磷脂酶)可以改善酶序列的整体表达，可以减少活性酶过表达带来的任何潜在毒性和/或可以增加酶在使用前的保质期，因为直到融合蛋
白例如果胶裂解酶被从酶例如磷脂酶蛋白中分离之前，酶是无活性的。
信号序列/融合蛋白/接头序列/蛋白酶裂解识别位点/成熟酶(例如，任何本发明的酶，
例如，磷脂酶)或信号序列/前序列/成熟酶/接头序列/融合蛋白。酶作为无活性融合
蛋白的表达(例如，任何本发明的酶，例如，磷脂酶)可以改善酶序列的整体表达，可以减少活性酶过表达带来的任何潜在毒性和/或可以增加酶在使用前的保质期，因为直到融合蛋
白例如果胶裂解酶被从酶例如磷脂酶蛋白中分离之前，酶是无活性的。
[0485] 在各方面，本发明提供用于激活本发明的作为融合蛋白表达的磷脂酶的特异性制剂。在一个方面，初始作为无活性融合蛋白表达的磷脂酶活性通过使用蛋白水解活性或潜
在蛋白水解活性以及氨基-端或羧基-端肽酶来激活。该激活事件可以在油脱胶应用之
前的生产/存储过程的各时间点通过多种方式进行。本发明的示例性过程包括：由生产宿
主表达的内源活性裂解分泌到发酵培养基中的融合构建子；由被激活的或通过宿主细胞破
碎而能够接触到胞内表达的融合构建子的内源性蛋白酶活性进行裂解；将粗制的或纯化的
融合构建子移至固定化蛋白酶活性的柱子上以在酶形成前完成裂解和酶(例如，本发明的
磷脂酶，例如，磷脂酶C)激活；用蛋白水解活性的可溶来源处理粗制的或纯化的融合构建
子；在油精炼厂使用可溶或不溶来源的蛋白水解活性在工艺即将使用之前马上激活磷脂酶
(例如，本发明的磷脂酶，例如，磷脂酶C)；和/或，在降低的温度下(例如，约4℃～20℃的任何温度)通过在固定化蛋白酶活性的柱子中连续循环融合构建子组分来激活磷脂酶(例
如，本发明的磷脂酶，例如，磷脂酶C)活性。该激活事件可以在运输至应用位置之前完成或在油精炼厂中现场发生。
在蛋白水解活性以及氨基-端或羧基-端肽酶来激活。该激活事件可以在油脱胶应用之
前的生产/存储过程的各时间点通过多种方式进行。本发明的示例性过程包括：由生产宿
主表达的内源活性裂解分泌到发酵培养基中的融合构建子；由被激活的或通过宿主细胞破
碎而能够接触到胞内表达的融合构建子的内源性蛋白酶活性进行裂解；将粗制的或纯化的
融合构建子移至固定化蛋白酶活性的柱子上以在酶形成前完成裂解和酶(例如，本发明的
磷脂酶，例如，磷脂酶C)激活；用蛋白水解活性的可溶来源处理粗制的或纯化的融合构建
子；在油精炼厂使用可溶或不溶来源的蛋白水解活性在工艺即将使用之前马上激活磷脂酶
(例如，本发明的磷脂酶，例如，磷脂酶C)；和/或，在降低的温度下(例如，约4℃～20℃的任何温度)通过在固定化蛋白酶活性的柱子中连续循环融合构建子组分来激活磷脂酶(例
如，本发明的磷脂酶，例如，磷脂酶C)活性。该激活事件可以在运输至应用位置之前完成或在油精炼厂中现场发生。
[0486] 糖基化
[0487] 本发明的肽和多肽(例如，磷脂酶、抗体)还可以被糖基化，例如，在一个方面，包含至少一个糖基化位点，例如，N-连接的或O-连接的糖基化。在一个方面，多肽可以在毕赤酵母或裂殖酵母中表达后被糖基化。糖基化可以在翻译后通过化学方法或细胞生物合成
机制进行添加，其中后者包括使用已知的糖基化基序，其对于序列而言可以是天然的或可
以是作为肽添加的或被添加至核酸编码序列。
机制进行添加，其中后者包括使用已知的糖基化基序，其对于序列而言可以是天然的或可
以是作为肽添加的或被添加至核酸编码序列。
[0488] 磷脂酶活性的分析
[0489] 本发明提供具有磷脂酶活性或磷脂酶活性的任何组合的分离的、合成的或重组的多肽(例如，酶，抗体)，和编码它们的核酸。本领域已知的多种磷脂酶活性分析中的任一种都可以用于确定具有磷脂酶活性的多肽是否在本发明的范围内。测定磷脂酶A、B、D和C、
patatin和脂酰水解酶活性或脂肪酶活性的常规方案是本领域公知的。
patatin和脂酰水解酶活性或脂肪酶活性的常规方案是本领域公知的。
[0490] 示例性的活性分析包括浊度分析法、甲基umbelliferyl磷酸胆碱(荧光)分析法、Amplex Red(荧光)磷脂酶分析法、薄层色谱分析法(TLC)、细胞毒性分析法和对硝基苯基磷酸基胆碱分析法。使用这些分析法，可以迅速筛选多肽、肽或抗体的磷脂酶活性。
[0491] 磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。参见，例如，Jimenez(2001)Lipids36：1169-1174，描述了用于测定patatin的脂酰水解酶活性的八亚乙基二醇单十二烷基醚
基混合的胶束分析法。Pinsirodom(2000)J.Agric.FoodChem.48：155-160，描述了示例性的脂酰水解酶(LAH)patatin活性。
基混合的胶束分析法。Pinsirodom(2000)J.Agric.FoodChem.48：155-160，描述了示例性的脂酰水解酶(LAH)patatin活性。
[0492] 浊度分析法测定磷脂酶活性描述在例如Kauffmann(2001)“Conversionof Bacillus thermocatenulatus lipase into an efficient phospholipase
with increased activity towards long-chain fatty acyl substrates by
directed evolution and rational design，”Protein Engineering 14：919-928；
Ibrahim(1995)“Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of
Candida albicans，”Infect.Immun.63：1993-1998。
with increased activity towards long-chain fatty acyl substrates by
directed evolution and rational design，”Protein Engineering 14：919-928；
Ibrahim(1995)“Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of
Candida albicans，”Infect.Immun.63：1993-1998。
[0493] 甲基umbelliferyl(荧光)磷酸胆碱分析法测定磷脂酶活性描述在例如Goode(1997)“Evidence for cell surface and internal phospholipase activityin
ascidian eggs，”Develop.Growth Differ.39：655-660；Diaz(1999)“Direct
fluorescence-based lipase activity assay，”BioTechniques 27：696-700。
ascidian eggs，”Develop.Growth Differ.39：655-660；Diaz(1999)“Direct
fluorescence-based lipase activity assay，”BioTechniques 27：696-700。
[0494] Amplex Red(荧光)磷脂酶分析法测定磷脂酶活性可作为试剂盒使用，例如，使用来自Molecular Probes Inc.(Eugene，OR)的Amplex Red磷脂酰胆碱特异性磷脂酶分析
试剂盒，根据制造商指示，检测磷脂酰胆碱特异性磷脂酶。使用在560±10nm下的激励和在
590±10nm下的荧光检测在荧光酶标仪上测量荧光。这种分析法在非常低的酶浓度下是灵
敏的。
试剂盒，根据制造商指示，检测磷脂酰胆碱特异性磷脂酶。使用在560±10nm下的激励和在
590±10nm下的荧光检测在荧光酶标仪上测量荧光。这种分析法在非常低的酶浓度下是灵
敏的。
[0495] 薄层色谱分析法(TLC)测定磷脂酶活性描述在例如Reynolds(1991)Methods inEnzymol.197：3-13；Taguchi(1975)“Phospholipase from Clostridium novyi type
A.I，”Biochim.Biophys.Acta 409：75-85。薄层色谱法(TLC)是广泛用于检测磷脂酶
活性的技术。对于该方法的各种改进已被用于从水性分析混合物中提取磷脂。在一些
PLC分析法中，通过将氯仿/甲醇(2∶1)加到反应混合物中停止水解。未反应的原料
和二酰基甘油提取到有机相中，并可以经TLC分馏，头组产物仍然在水相中。对于磷脂消
化的更精确测量，可以使用放射性标记的底物(参见，例如，Reynolds(1991)Methods in
Enzymol.197∶3-13)。产物和反应物的比例可以用于计算每单位时间水解的底物的实际
摩尔数。如果所有的组分都同量提取，则提取中的任何损失将同样会影响所有组分。可以
使用氯仿/甲醇/水(65∶25∶4)作为溶剂系统通过硅胶TLC实现磷脂消化产物的分离
(参见，例如，Taguchi(1975)Biochim.Biophys.Acta 409：75-85)。
A.I，”Biochim.Biophys.Acta 409：75-85。薄层色谱法(TLC)是广泛用于检测磷脂酶
活性的技术。对于该方法的各种改进已被用于从水性分析混合物中提取磷脂。在一些
PLC分析法中，通过将氯仿/甲醇(2∶1)加到反应混合物中停止水解。未反应的原料
和二酰基甘油提取到有机相中，并可以经TLC分馏，头组产物仍然在水相中。对于磷脂消
化的更精确测量，可以使用放射性标记的底物(参见，例如，Reynolds(1991)Methods in
Enzymol.197∶3-13)。产物和反应物的比例可以用于计算每单位时间水解的底物的实际
摩尔数。如果所有的组分都同量提取，则提取中的任何损失将同样会影响所有组分。可以
使用氯仿/甲醇/水(65∶25∶4)作为溶剂系统通过硅胶TLC实现磷脂消化产物的分离
(参见，例如，Taguchi(1975)Biochim.Biophys.Acta 409：75-85)。
[0496] 对硝基苯基磷酸基胆碱分析法测定磷脂酶活性描述在例如Korbsrisate(1999)J.Clin.Microbiol.37：3742-3745；Berka(1981)Infect.Immun.34：1071-1074。该分析法基于底物类似物对硝基苯基磷酸基胆碱的酶水解，释放黄色的发色化合物对硝基苯酚，可
在405nm下检测。这种底物对于高通量筛选很方便。
在405nm下检测。这种底物对于高通量筛选很方便。
[0497] 细胞溶解分析法可以基于红细胞溶解利用细胞溶解活性检测磷脂酶。毒性磷脂酶可以与真核细胞膜相互作用并水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂，从而导致细胞溶解。参见，例如，Titball(1993)Microbiol.Rev.57：347-366。
[0498] 杂交的(嵌合的)磷脂酶和肽文库
[0499] 在一个方面，本发明提供杂交的磷脂酶和融合蛋白，包括肽文库，其包含本发明的序列。本发明的肽文库可以被用于分离目标物的肽调控子(例如，激活子或抑制子)。如磷脂酶底物、受体、酶。本发明的肽文库可以被用于鉴定目标物的正式结合伴侣，例如配体，例如，细胞因子、激素等等。在一个方面，本发明提供包含本发明的信号序列(SP)和/或催化结构域(CD)以及异源序列(见上)的嵌合蛋白。
[0500] 本发明还提供酶使用本发明的核酸和多肽生产“改进的”和杂交的磷脂的方法。例如，本发明提供在极碱性pH和/或酸性pH、高温和低温、渗透条件等下生产具有活性的酶的方法，例如，磷脂酶活性(例如，磷脂酶A、B、C或D活性、patatin酯酶活性、甘油磷酸酯酯键的裂解、植物油的磷脂中的酯键的裂解)。本发明提供生产杂交酶的方法(例如，杂交的磷脂酶).
[0501] 在一个方面，本发明的方法通过利用细胞过程生产新的杂交的多肽，其中整合第一多核苷酸的序列使得获得的杂交多核苷酸编码表现出衍生于第一生物活性多肽的活性
的多肽。例如，第一多核苷酸可以是编码本发明的示例性磷脂酶的示例性核酸序列。第一
核酸可以编码来自在特定环境条件下(例如，高盐度)功能有效的一种生物体的酶。其可
以与由来自在不同环境条件下(例如，极高温度)功能有效的不同生物体的第二多核苷酸
编码的酶“整合”。例如，当两个核酸可以通过例如重组和/或减少的重配而产生杂交分子时。含有来自第一和第二初始多核苷酸的序列的杂交多核苷酸可以编码表现出由初始多核
苷酸编码的酶的特性的酶。因此，由杂交多核苷酸编码的酶可以在由第一和第二初始多核
苷酸编码的酶共有的环境条件下功能有效，例如，高盐度和极端温度。
的多肽。例如，第一多核苷酸可以是编码本发明的示例性磷脂酶的示例性核酸序列。第一
核酸可以编码来自在特定环境条件下(例如，高盐度)功能有效的一种生物体的酶。其可
以与由来自在不同环境条件下(例如，极高温度)功能有效的不同生物体的第二多核苷酸
编码的酶“整合”。例如，当两个核酸可以通过例如重组和/或减少的重配而产生杂交分子时。含有来自第一和第二初始多核苷酸的序列的杂交多核苷酸可以编码表现出由初始多核
苷酸编码的酶的特性的酶。因此，由杂交多核苷酸编码的酶可以在由第一和第二初始多核
苷酸编码的酶共有的环境条件下功能有效，例如，高盐度和极端温度。
[0502] 可选择地，从本发明的这种方法获得的杂交的多肽可以表现出不会显示在初始酶中的专有酶活性。例如，在编码磷脂酶活性的多核苷酸的重组和/或减少的重配后，得到的由杂交多核苷酸编码的杂交的多肽可以针对从每种初始酶获得的专有活性进行筛选，即，
磷脂酶起作用的键类型和磷脂酶发挥功能的温度。因此，例如，磷脂酶可以被筛选以确定区分杂交的磷脂酶与初始磷脂酶的化学功能性，如：(a)酰胺(肽键)，即，磷脂酶；(b)酯键，即，磷脂酶和脂肪酶；(c)缩醛，即，糖苷酶，以及例如杂交的多肽发挥功能的温度、pH或盐浓度。
磷脂酶起作用的键类型和磷脂酶发挥功能的温度。因此，例如，磷脂酶可以被筛选以确定区分杂交的磷脂酶与初始磷脂酶的化学功能性，如：(a)酰胺(肽键)，即，磷脂酶；(b)酯键，即，磷脂酶和脂肪酶；(c)缩醛，即，糖苷酶，以及例如杂交的多肽发挥功能的温度、pH或盐浓度。
[0503] 将要与本发明的核酸“整合”的多核苷酸来源可以从各生物体分离(“分离物”)、可以是在限定培养基中生长的生物体的集合(“富集培养物”)或者未培养的生物体(“环境样品”)。使用与培养物无关的技术来从环境样品衍生编码新的生物活性的多核苷酸是最优选的，因为这允许访问未开发的生物多样性资源。“环境文库”从环境样品产生并代表在克隆载体中归档的天然产生的生物体的集体基因组，可以在适当的原核宿主中传播。由于
克隆的DNA最初直接从环境样品中提取，所以该文库不局限于可以在纯培养物中生长的原
核生物的一小部分。此外，在这些样品中存在的环境DNA的标准化可以允许更平等地表示
来自初始样品中存在的所有物种的DNA。这样可以极大地提高从样品的微量成分寻找相关
基因的效率，与主要物种相比样品少几个数量级。
克隆的DNA最初直接从环境样品中提取，所以该文库不局限于可以在纯培养物中生长的原
核生物的一小部分。此外，在这些样品中存在的环境DNA的标准化可以允许更平等地表示
来自初始样品中存在的所有物种的DNA。这样可以极大地提高从样品的微量成分寻找相关
基因的效率，与主要物种相比样品少几个数量级。
[0504] 例如，从产生于一种或多种未培养的微生物的基因文库筛选相关活性。编码相关生物活性分子的潜在通路首先在基因表达文库形式的原核细胞中捕获。编码相关活性的多
核苷酸从这种文库分离出来并引入宿主细胞。宿主细胞在促进重组和/或减少的重配的条
件下生长，从而产生潜在活性的生物分子，具有新型或增强的活性。
核苷酸从这种文库分离出来并引入宿主细胞。宿主细胞在促进重组和/或减少的重配的条
件下生长，从而产生潜在活性的生物分子，具有新型或增强的活性。
[0505] 可以制备杂交多核苷酸的微生物包括原核微生物，如真细菌和古细菌，和低级真核微生物，如真菌、一些藻类和原生动物。多核苷酸可以从环境样品中分离。核酸可以在无需培养生物体的情况下被回收，或者从一种或多种培养的生物体回收。在一个方面，这些
微生物可以是嗜极生物，如嗜热菌、嗜冷性生物、嗜冷性细菌、嗜盐菌、嗜压菌和嗜酸菌。在一个方面，从嗜极微生物分离的编码磷脂酶的多核苷酸被用来制造杂交酶。这种酶可以在
温度高于100℃下发挥功能，例如，陆地温泉和深海热喷口，在温度低于0℃下发挥功能，例如，北极水，在死海的饱和盐环境中发挥功能，例如，pH值在0左右，例如，在煤沉积物和地热性富硫泉中，或在pH值大于11下发挥功能，例如，污水污泥。例如，从嗜极生物体克隆和表达的磷脂酶可以在整个温度和pH值范围内表现出高活性。
微生物可以是嗜极生物，如嗜热菌、嗜冷性生物、嗜冷性细菌、嗜盐菌、嗜压菌和嗜酸菌。在一个方面，从嗜极微生物分离的编码磷脂酶的多核苷酸被用来制造杂交酶。这种酶可以在
温度高于100℃下发挥功能，例如，陆地温泉和深海热喷口，在温度低于0℃下发挥功能，例如，北极水，在死海的饱和盐环境中发挥功能，例如，pH值在0左右，例如，在煤沉积物和地热性富硫泉中，或在pH值大于11下发挥功能，例如，污水污泥。例如，从嗜极生物体克隆和表达的磷脂酶可以在整个温度和pH值范围内表现出高活性。
[0506] 如在此所述的经选择和分离的多核苷酸，包含至少一种本发明的核酸，被引入适合的宿主细胞。适合宿主细胞是能够促进重组和/或减少的重配的任一种细胞。选定的多
核苷酸可以在包含适宜调控序列的载体中。宿主细胞可以是高级真核细胞，如哺乳动物细
胞，或低级真核细胞，如酵母细胞，或优选地，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。将构建子引入宿主细胞可以通过钙磷酸酯转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔进行(Davis
等人，1986)。
核苷酸可以在包含适宜调控序列的载体中。宿主细胞可以是高级真核细胞，如哺乳动物细
胞，或低级真核细胞，如酵母细胞，或优选地，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。将构建子引入宿主细胞可以通过钙磷酸酯转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔进行(Davis
等人，1986)。
[0507] 示例性的适宜宿主可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细
胞。示例性的细菌细胞包括下列属中的任何种：埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆
菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属
(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，其包括例如大肠杆菌(Escherichia
coli)、乳酸球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽胞
杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和荧光假单胞菌
(Pseudomonas fluorescens)。示例性的真菌细胞包括任何种的曲霉菌属(Aspergillus)。
示例性的酵母细胞包括任何种的毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖
酵母属(Schizosaccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)，包括毕赤酵母(Pichia
pastoris)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces
pombe)。示例性的昆虫细胞包括任何种的斜纹夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属
(Drosophila)，包括果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤
或任何小鼠或人细胞系。选择合适的宿主是本领域技术人员的能力。针对重组和/或减
少的重配或只针对重组蛋白的表达选择适宜的宿主基于本文的教导被认为在本领域技术
人员的范围内。可用于重组和/或减少的重配或只用于重组蛋白的表达的哺乳动物细胞
培养物系统包括例如猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，描述在“SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants”(Gluzman，1981)，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包括复制起点、适合的启动子和增强子以
及必须的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接给体和受体位点、转录终止序列和5′侧非转录序列。衍生于SV40剪接和多聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非
转录遗传元件。
胞。示例性的细菌细胞包括下列属中的任何种：埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆
菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属
(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，其包括例如大肠杆菌(Escherichia
coli)、乳酸球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽胞
杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和荧光假单胞菌
(Pseudomonas fluorescens)。示例性的真菌细胞包括任何种的曲霉菌属(Aspergillus)。
示例性的酵母细胞包括任何种的毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖
酵母属(Schizosaccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)，包括毕赤酵母(Pichia
pastoris)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces
pombe)。示例性的昆虫细胞包括任何种的斜纹夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属
(Drosophila)，包括果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤
或任何小鼠或人细胞系。选择合适的宿主是本领域技术人员的能力。针对重组和/或减
少的重配或只针对重组蛋白的表达选择适宜的宿主基于本文的教导被认为在本领域技术
人员的范围内。可用于重组和/或减少的重配或只用于重组蛋白的表达的哺乳动物细胞
培养物系统包括例如猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，描述在“SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants”(Gluzman，1981)，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包括复制起点、适合的启动子和增强子以
及必须的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接给体和受体位点、转录终止序列和5′侧非转录序列。衍生于SV40剪接和多聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非
转录遗传元件。
[0508] 含有目标多核苷酸(针对重组和/或减少的重配或只针对重组蛋白的表达)的宿主细胞可以在适宜时经修饰的用于激活启动子、选择转化子或扩增基因的常规营养培养基
中培养。培养条件，如温度、pH等，之前针对表达的所选宿主细胞中使用的那些，并且对于本领域技术人员是显而易见的。然后，可以对被鉴定为具有指定酶活性的克隆测序，以鉴定编码具有增强活性的酶的多核苷酸序列。
中培养。培养条件，如温度、pH等，之前针对表达的所选宿主细胞中使用的那些，并且对于本领域技术人员是显而易见的。然后，可以对被鉴定为具有指定酶活性的克隆测序，以鉴定编码具有增强活性的酶的多核苷酸序列。
[0509] 在另一个方面，本发明的核酸和方法可以用于产生用于生化通路的新型多核苷酸，例如，来自一种或多种操作子或基因簇或其部分的通路。例如，细菌和许多真核生物具有调控基因的协调机制，其产品牵涉到相关过程。基因在单一染色体上成簇，在结构上称
为“基因簇”，并在单一调控序列的控制下一起转录，包括引发整个簇转录的单一启动子。因此，基因簇是通常在功能方面相同或相关的相邻基因的组。
为“基因簇”，并在单一调控序列的控制下一起转录，包括引发整个簇转录的单一启动子。因此，基因簇是通常在功能方面相同或相关的相邻基因的组。
[0510] 基因簇DNA可以从不同生物体分离并连接到载体，特别是含有表达调控序列的载体，可以控制和调控从连接的基因簇产生可检测的蛋白或蛋白相关的阵列活性。使用对于
外源DNA导入具有特大容量的载体特别适合使用这种基因簇，并在此处以举例方式描述为
包括大肠杆菌的f-因子(或繁殖因子)。大肠杆菌的f-因子是影响其本身在共轭期间高
频转移的质粒，并理想地实现和稳定地传播大的DNA片段，如来自混合微生物样品的基因
簇。“F黏粒”、粘粒或细菌人工染色体(BAC)载体可以用作克隆载体。这些都衍生于大肠杆菌的f-因子，其能够稳定地集成基因组DNA的大片段。当与来自混合的未培养的环境样品
DNA整合时，可以实现稳定的“环境DNA文库”形式的大基因组片段。粘粒载体最初设计成
克隆和传播基因组DNA的大片段。克隆到粘粒载体详细描述在Sambrook等人，Molecular
Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
一旦连接到合适的载体，含有不同聚酮合酶基因簇的两种或更多高载体可以被引入到合适
的宿主细胞。基因簇共享的部分序列同源性的区域将推动进程，产生序列重组，导致杂交的基因簇。然后新型杂交的基因簇可以被筛选没有在初始基因簇中发现的增强活性。
外源DNA导入具有特大容量的载体特别适合使用这种基因簇，并在此处以举例方式描述为
包括大肠杆菌的f-因子(或繁殖因子)。大肠杆菌的f-因子是影响其本身在共轭期间高
频转移的质粒，并理想地实现和稳定地传播大的DNA片段，如来自混合微生物样品的基因
簇。“F黏粒”、粘粒或细菌人工染色体(BAC)载体可以用作克隆载体。这些都衍生于大肠杆菌的f-因子，其能够稳定地集成基因组DNA的大片段。当与来自混合的未培养的环境样品
DNA整合时，可以实现稳定的“环境DNA文库”形式的大基因组片段。粘粒载体最初设计成
克隆和传播基因组DNA的大片段。克隆到粘粒载体详细描述在Sambrook等人，Molecular
Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
一旦连接到合适的载体，含有不同聚酮合酶基因簇的两种或更多高载体可以被引入到合适
的宿主细胞。基因簇共享的部分序列同源性的区域将推动进程，产生序列重组，导致杂交的基因簇。然后新型杂交的基因簇可以被筛选没有在初始基因簇中发现的增强活性。
[0511] 因此，在一个方面，本发明涉及一种使用本发明的核酸生产生物活性的杂交的多肽和筛选所述多肽活性(例如，增强活性)的方法，包括：
[0512] (1)至少将可操作连接的第一多核苷酸(例如，本发明的核酸)和可操作连接的第二多核苷酸引入适合宿主细胞，所述至少第一多核苷酸和第二多核苷酸共享部分序列同源
性的至少一个区域；
性的至少一个区域；
[0513] (2)在促进序列重组而生成可操作连接的杂交多核苷酸的条件下生长所述宿主细胞；
[0514] (3)表达由所述杂交多核苷酸编码的杂交的多肽；
[0515] (4)在促进目标生物活性(例如，增强的磷脂酶活性)鉴定的条件下筛选所述杂交的多肽；和
[0516] (5)分离编码所述杂交的多肽的多核苷酸。
[0517] 筛选各种酶活性的方法是本领域技术人员已知的，并在在本说明书中讨论了。当分离本发明的多肽和多核苷酸时，可以使用这些方法。
[0518] 体内重配可以集中于“分子间”进程，统称作“重组”。在细菌中，一般观察到“RecA依赖性”现象。本发明可以依靠宿主细胞的重组过程以重组和再重配序列，或者细胞介导减少性过程的能力降低了由缺失带来的细胞中准重复序列的复杂性。这种“减少的重配”的过程在“分子内”发生，RecA依赖性进程。因此，在本发明的一个方面，使用本发明的核酸，通过减少的重配过程产生新型多核苷酸。该方法涉及到产生含有连续序列(初始编码序列)的构建子，其插入合适的载体，随后引入适当的宿主细胞。各个分子特性的重配通过处理同源性区域的构建子的连续序列之间的组合过程发生，或者在准重复单元之间发生。重组过
程重组和/降低了重复序列的复杂性和程度，导致生成在新的分子物种。
程重组和/降低了重复序列的复杂性和程度，导致生成在新的分子物种。
[0519] 各种处理可应用于提高重组率。这些可能包括用紫外光处理，或DNA损伤化学品处理，和/或使用显示出“遗传不稳定”水平更高的宿主细胞系。因此，重组过程可能涉及同源重组或准重复序列的天然属性，以指导自身的进化。
[0520] 重复或“准重复”序列在遗传不稳定性方面发挥作用。“准重复”是不限于其初始单元结构的重复。准重复单元可以表示为在构建子中的序列的阵列；类似序列的连续单元。一旦连接，连续序列之间的交界处成为基本上不可见的，并且所产生的构建子的准重复性
质目前在分子水平上是连续的。细胞进行的降低所产生的构建子复杂性的缺失过程在准重
复序列之间操作。准重复单元提供了模板的几乎无限的组成部分，由此可能发生延误事件。
因而，含有准重复的构建子有效地提供足够的分子弹性，缺失(和潜在的插入)事件几乎在
准重复单元内的任何地方发生。当准重复序列连接在同一方向上时，例如头尾或反之亦然，细胞不能区分这些单元。因此，减少过程可以在整个序列内发生。相反，例如，当各单元头头存在而不是头尾时，倒置描绘了相邻单元的端点，使得缺失形成将有利于离散单元的损失。
因此，在本发明的一个方面，将要重配的序列在同一方向上。准重复序列的随机取向将导致重配效率损失，而序列的一致方向将提供最高的效率。然而，尽管在同一方向上具有较少的连续序列降低了效率，但对于新型分子的有效回收仍然可以提供足够的弹性。可以使用在
同一方向的准重复序列制备构建子，以允许更高的效率。
质目前在分子水平上是连续的。细胞进行的降低所产生的构建子复杂性的缺失过程在准重
复序列之间操作。准重复单元提供了模板的几乎无限的组成部分，由此可能发生延误事件。
因而，含有准重复的构建子有效地提供足够的分子弹性，缺失(和潜在的插入)事件几乎在
准重复单元内的任何地方发生。当准重复序列连接在同一方向上时，例如头尾或反之亦然，细胞不能区分这些单元。因此，减少过程可以在整个序列内发生。相反，例如，当各单元头头存在而不是头尾时，倒置描绘了相邻单元的端点，使得缺失形成将有利于离散单元的损失。
因此，在本发明的一个方面，将要重配的序列在同一方向上。准重复序列的随机取向将导致重配效率损失，而序列的一致方向将提供最高的效率。然而，尽管在同一方向上具有较少的连续序列降低了效率，但对于新型分子的有效回收仍然可以提供足够的弹性。可以使用在
同一方向的准重复序列制备构建子，以允许更高的效率。
[0521] 序列可以使用任一种方法头尾方向被组装，包括以下：a)可以利用引物，其包含聚-A头和聚-T尾，当制备单链时提供方向。通过具有从RNA得到的引物的前几个碱基和
因而容易除去的RNase H来实现。b)可以利用引物，其包含独特的限制性裂解位点。需要
多个位点、一组独特的序列和重复的合成和连接步骤。c)引物的内部几个碱基可以被硫醇
化，核酸外切酶用于产生适当的尾分子。
因而容易除去的RNase H来实现。b)可以利用引物，其包含独特的限制性裂解位点。需要
多个位点、一组独特的序列和重复的合成和连接步骤。c)引物的内部几个碱基可以被硫醇
化，核酸外切酶用于产生适当的尾分子。
[0522] 重配的序列的回收依赖于用减少的重复指数(RI)对克隆载体的鉴定。然后，重配的编码序列可以通过扩增回收。产物是重新克隆和表达的。用减少的RI回收克隆载体可
以按下述进行：1)使用当构建子复杂性降低时仅稳定维持的载体。2)通过物理过程物理回
收缩短的载体。在这种情况下，使用标准质粒分离程序回收克隆载体，在琼脂糖凝胶上按大小分馏，或利用标准程序的低分子量截留柱。3)回收含有间断基因的载体，当插入尺寸减小时可以选择。4)使用直接选择技术，利用表达载体和适当的选择。
以按下述进行：1)使用当构建子复杂性降低时仅稳定维持的载体。2)通过物理过程物理回
收缩短的载体。在这种情况下，使用标准质粒分离程序回收克隆载体，在琼脂糖凝胶上按大小分馏，或利用标准程序的低分子量截留柱。3)回收含有间断基因的载体，当插入尺寸减小时可以选择。4)使用直接选择技术，利用表达载体和适当的选择。
[0523] 来自相关生物体的编码序列(例如，基因)可能表现出高度的同源性并编码相当多样化的蛋白产品。这些类型的序列特别适于在本发明中用作准重复。然而，这种过程不
仅限于接近相同的重复。
仅限于接近相同的重复。
[0524] 以下是本发明的示例性方法。编码核酸序列(准重复)衍生于3个物种，包含本发明的核酸。每个序列编码具有不同属性的蛋白，包含本发明的酶。每个序列在序列的独
特位的一个或几个碱基对不同。准重复序列分别或共同扩增并连接成随机装配，使得所有
可能的前突变和组合能够在连接分子的群体中获得。通过装配条件可以控制准重复单元的
数量。准重复单元在构建子中的平均数量定义作重复指数(RI)。一旦形成，根据公布的协
议，构建子可以或可以不在琼脂糖凝胶上按大小分馏，插入克隆载体，和转染到适当的宿主细胞。然后，细胞传播并进行“减少的重配”。在需要时，可以通过引入DNA损伤来刺激减少的重配过程速率可以。无论RI的减少由经由“分子内”机制的重复序列之间的缺失形成所
介导，或者经由“分子间”机制的重组类事件所介导，这都不重要。最终结果是分子重配成所有可能的组合。在一个方面，该方法包括额外步骤，筛选重排池的文库成员，以鉴定具有结合或其他相互作用能力的各重排文库成员，或催化与预定大分子的特定反应(例如，如
酶的催化结构域)，例如，蛋白类受体、低聚糖、病毒粒子或其他预定的化合物或结构。从该文库鉴定的多肽，例如，磷脂酶，可以使用各种用途，例如，在此所述的工业过程和/或可以进行重排和/或分泌的一个或多个额外循环。
特位的一个或几个碱基对不同。准重复序列分别或共同扩增并连接成随机装配，使得所有
可能的前突变和组合能够在连接分子的群体中获得。通过装配条件可以控制准重复单元的
数量。准重复单元在构建子中的平均数量定义作重复指数(RI)。一旦形成，根据公布的协
议，构建子可以或可以不在琼脂糖凝胶上按大小分馏，插入克隆载体，和转染到适当的宿主细胞。然后，细胞传播并进行“减少的重配”。在需要时，可以通过引入DNA损伤来刺激减少的重配过程速率可以。无论RI的减少由经由“分子内”机制的重复序列之间的缺失形成所
介导，或者经由“分子间”机制的重组类事件所介导，这都不重要。最终结果是分子重配成所有可能的组合。在一个方面，该方法包括额外步骤，筛选重排池的文库成员，以鉴定具有结合或其他相互作用能力的各重排文库成员，或催化与预定大分子的特定反应(例如，如
酶的催化结构域)，例如，蛋白类受体、低聚糖、病毒粒子或其他预定的化合物或结构。从该文库鉴定的多肽，例如，磷脂酶，可以使用各种用途，例如，在此所述的工业过程和/或可以进行重排和/或分泌的一个或多个额外循环。
[0525] 在另一个方面，预期在重组或重配之前或期间，通过本发明的方法生产的多核苷酸可以接触用于促进将突变引入初始多核苷酸的试剂或进程。引入突变会增加得到的杂
交多核苷酸和从其获得的多肽编码的多样性。促进诱变的试剂或进程可以包括但不限于：
(+)-CC-1065，或合成类似物，如(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤(参见，Sun和Hurley，(1992)；
能够抑制DNA合成的N-乙酰化或脱乙酰化4′-氟-4-氨基联苯加合物(参见，例如，van
de Poll等人(1992))；或能够抑制DNA合成的N-乙酰化或脱乙酰化4-氨基联苯加合物
(也参见，van de Poll等人(1992)，pp.751-758)；三价铬、三价铬盐、能够抑制DNA复制的多环芳香烃(PAH)DNA加合物，如7-溴甲基-苯并[a]蒽(“BMA”)、三(2，3-二溴丙基)磷
酸酯(“Tris-BP”)、1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯并[a]芘-7，
8-二氢二醇-9，10环氧化物(“BPDE”)、铂(II)卤盐、N-羟基-2-氨基-3-甲基咪唑并
[4，5-f]喹啉(“N-羟基-IQ”)和N-羟基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-f]吡
啶(“N-羟基-PhIP”)。减缓或停止PCR扩增的特别优选的技术紫外光(+)-CC-1065和
(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)。特别包含的技术是DNA加合物或包含来自多核苷酸或多核苷
酸池的DNA加合物的多核苷酸，它们可以通过包括在进一步处理之前加热含有多核苷酸的
溶液的方法来释放或除去。
交多核苷酸和从其获得的多肽编码的多样性。促进诱变的试剂或进程可以包括但不限于：
(+)-CC-1065，或合成类似物，如(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤(参见，Sun和Hurley，(1992)；
能够抑制DNA合成的N-乙酰化或脱乙酰化4′-氟-4-氨基联苯加合物(参见，例如，van
de Poll等人(1992))；或能够抑制DNA合成的N-乙酰化或脱乙酰化4-氨基联苯加合物
(也参见，van de Poll等人(1992)，pp.751-758)；三价铬、三价铬盐、能够抑制DNA复制的多环芳香烃(PAH)DNA加合物，如7-溴甲基-苯并[a]蒽(“BMA”)、三(2，3-二溴丙基)磷
酸酯(“Tris-BP”)、1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯并[a]芘-7，
8-二氢二醇-9，10环氧化物(“BPDE”)、铂(II)卤盐、N-羟基-2-氨基-3-甲基咪唑并
[4，5-f]喹啉(“N-羟基-IQ”)和N-羟基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-f]吡
啶(“N-羟基-PhIP”)。减缓或停止PCR扩增的特别优选的技术紫外光(+)-CC-1065和
(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)。特别包含的技术是DNA加合物或包含来自多核苷酸或多核苷
酸池的DNA加合物的多核苷酸，它们可以通过包括在进一步处理之前加热含有多核苷酸的
溶液的方法来释放或除去。
[0526] 筛选方法和“在线”监控设备
[0527] 在实施本发明的方法时，可以对本发明的多肽和核酸采用多种设备和方法，例如，筛选磷脂酶活性的多肽，筛选作为活性的潜在调节子的化合物(例如，酶活性的增强或抑制)，结合本发明的多肽的抗体，能够与本发明的核酸杂交的核酸等。
[0528] 固定化酶固体载体
[0529] 磷脂酶、其片段和编码酶和片段的核酸可以被固定于固体载体上。这在工业过程使用磷脂酶中经常是经济有效的。例如，用于特异性化学反应中的联合或混合的磷脂酶
(或其活性片段)可以被结合于固体载体并浸入反应釜，即可以发生酶反应，然后，固体载
体可以与其固定的酶一起从反应釜取出，用于重复使用。在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的核酸被固定于固体载体上。在本发明的另一个实施方案中，固体载体选自凝胶、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极及其任意组合。
(或其活性片段)可以被结合于固体载体并浸入反应釜，即可以发生酶反应，然后，固体载
体可以与其固定的酶一起从反应釜取出，用于重复使用。在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的核酸被固定于固体载体上。在本发明的另一个实施方案中，固体载体选自凝胶、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极及其任意组合。
[0530] 例如，本发明中使用的固体载体包括凝胶。凝胶的一些示例包括琼脂糖、明胶、戊二醛、壳聚糖-处理的戊二醛、白蛋白-戊二醛、壳聚糖-黄原胶、toyopearl凝胶(聚合物凝胶)、海藻酸盐、海藻酸盐-聚赖氨酸、卡拉胶、琼脂、乙醛酰琼脂糖、磁性琼脂糖、葡聚糖-琼脂糖、聚(甲酰磺酸盐)水凝胶、BSA-PEG水凝胶、磷酸化聚乙烯醇(PVA)、单氨基乙
基-N-氨基乙基(MANA)、氨基或其任何组合。
基-N-氨基乙基(MANA)、氨基或其任何组合。
[0531] 本发明中使用的其他固体载体是树脂或聚合物。树脂或聚合物的一些示例包括TM TM
纤维素、丙烯酰胺、尼龙、人造丝、聚酯、阴离子交换树脂、AMBERLITE XAD-7、AMBERLITE TM TM
XAD-8、AMBERLITE IRA-94、AMBERLITE IRC-50、聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其任意组合。
纤维素、丙烯酰胺、尼龙、人造丝、聚酯、阴离子交换树脂、AMBERLITE XAD-7、AMBERLITE TM TM
XAD-8、AMBERLITE IRA-94、AMBERLITE IRC-50、聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其任意组合。
[0532] 本发明中使用的另一种类型的固体载体是陶瓷。一些示例包括非多孔陶瓷、多孔陶瓷、SiO2、Al2O3。本发明中使用的另一种类型的固体载体是玻璃。一些示例包括非多孔玻璃、多孔玻璃、氨基丙基玻璃或其任意组合。可以使用的另一种类型的固体载体是微电极。
一个示例是聚乙烯基亚胺涂布的磁铁。石墨颗粒可以被用作固体载体。
一个示例是聚乙烯基亚胺涂布的磁铁。石墨颗粒可以被用作固体载体。
[0534] 固定化方法
[0535] 存在本领域技术人员已知的多种方法用于将酶或其片段或核酸固定在固体载体上。所述方法的一些示例包括例如静电液滴产生、电化学方式、经由吸附、经由共价结
合、经由交联、经由化学反应或过程、经由包封、经由截留、经由海藻酸钙或经由聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)。这些方法描述在Methods in Enzymology，Immobilized Enzymes
and Cells，Part C.1987.Academic Press.Edited by S.P.Colowick 和 N.O.Kaplan.
Volume 136；和 Immobilization Enzymes and Cells.1997.Humana Press.Edited by
G.F.Bickerstaff.Series：Methods in Biotechnology，Edited by J.M.Walker。
合、经由交联、经由化学反应或过程、经由包封、经由截留、经由海藻酸钙或经由聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)。这些方法描述在Methods in Enzymology，Immobilized Enzymes
and Cells，Part C.1987.Academic Press.Edited by S.P.Colowick 和 N.O.Kaplan.
Volume 136；和 Immobilization Enzymes and Cells.1997.Humana Press.Edited by
G.F.Bickerstaff.Series：Methods in Biotechnology，Edited by J.M.Walker。
[0536] 毛细管阵列
[0537] 毛细管阵列，例如GIGAMATRIXTM，Diversa Corporation，San Diego，CA，可以被用于本发明的方法。本发明的核酸或多肽可以被固定化或用于阵列，包括毛细管阵列。阵列可以被用于筛选或监控组合物的文库(例如，小分子、抗体、核酸等)，针对其结合或调控本发明的核酸或多肽的活性的能力。毛细管阵列提供了保存和筛选样品的另一种系统。例如，样品筛选设备可以包括多个与相邻毛细管形成阵列的毛细管，其中各毛细管至少包括形成保存样品的腔体的管壁。该设备还可以包括间质材料，其位于阵列中的相邻毛细管之间，以及一种或多种形成于间质材料中的参考标记。用于筛选样品的毛细管，其中毛细管适于在毛
细管阵列中结合，可以包括限定样品保存腔的第一管壁，以及由过滤材料形成的第二管壁，以过滤提供给腔体以激发样品的激发能。
细管阵列中结合，可以包括限定样品保存腔的第一管壁，以及由过滤材料形成的第二管壁，以过滤提供给腔体以激发样品的激发能。
[0538] 多肽或核酸，例如，配体，可以包含于第一组分中进入毛细管阵列中至少一部分毛细管。毛细管阵列的各毛细管都可以包括至少一个限定第一组分保存腔的第一管壁。在引入第一组分后可以在毛细管中引入气泡。第二组分可以被引入毛细管，其中第二组分通过
气泡与第一组分分离。目标样品可以作为用可探测颗粒标记的第一液体被引入毛细管阵列
的毛细管，其中毛细管阵列的各毛细管包括至少一个限定第一液体和可探测颗粒保存腔的
第一管壁，及其中至少一个管壁用结合材料进行涂布以结合可探测颗粒至至少一个管壁。
该方法还可以包括从毛细管除去第一液体，其中结合的可探测颗粒留在毛细管中，并引入
第二液体至毛细管。
气泡与第一组分分离。目标样品可以作为用可探测颗粒标记的第一液体被引入毛细管阵列
的毛细管，其中毛细管阵列的各毛细管包括至少一个限定第一液体和可探测颗粒保存腔的
第一管壁，及其中至少一个管壁用结合材料进行涂布以结合可探测颗粒至至少一个管壁。
该方法还可以包括从毛细管除去第一液体，其中结合的可探测颗粒留在毛细管中，并引入
第二液体至毛细管。
[0539] 毛细管阵列可以包括多个独立的毛细管，其包括至少一个限定腔体的外管壁。毛细管的外管壁可以是一个或更多管壁融合在一起的。类似地，管壁可以限定圆柱形、方形、六角形或任何其他几何形状的腔体，只要管壁能够形成保留液体或样品的腔体即可。毛细
管阵列的毛细管可以非常近地保持在一起形成平面结构。毛细管可以通过并排地熔融(例
如，其中毛细管由玻璃制成)、胶合、粘合或夹持而结合在一起。毛细管阵列可以由任何数量的各毛细管形成，例如，100～4,000,000个毛细管。毛细管阵列可以形成微滴板，其中约
100,000或更多个各毛细管相互结合。
管阵列的毛细管可以非常近地保持在一起形成平面结构。毛细管可以通过并排地熔融(例
如，其中毛细管由玻璃制成)、胶合、粘合或夹持而结合在一起。毛细管阵列可以由任何数量的各毛细管形成，例如，100～4,000,000个毛细管。毛细管阵列可以形成微滴板，其中约
100,000或更多个各毛细管相互结合。
[0540] 阵列，或“生物芯片”
[0541] 本发明的核酸或多肽可以被固定化或用于阵列。阵列可以被用于筛选或监控组合物的文库(例如，小分子、抗体、核酸，等)，针对其结合或调控本发明的核酸或多肽的活性的能力。例如，在本发明的一个方面，一种监控参数是磷脂酶基因的转录表达。一种或多种、或全部细胞转录物可以通过以下方式测量：包含细胞转录物的样品，或，代表或互补于细胞转录物的核酸进行杂交，其中通过杂交于阵列或“生物芯片”上固定化的核酸。通过在微芯片上使用核酸“阵列”，部分或全部细胞转录物可以同时进行定量。可选择地，包含基因组核酸的阵列还可以用于测定通过本发明的方法制备得到的新型工程化菌株的基因型。“多肽
阵列”还可以用于同时定量多种蛋白。
阵列”还可以用于同时定量多种蛋白。
[0542] 在可选实施方案中，本发明提供包括多种目标元件的“阵列”或“微阵列”或“生物芯片”或“芯片”，其中各目标元件包含给定量的一种或多种多肽(包括抗体)或核酸，其固定化在给定的底物表面区域上，并且至少一种核酸和/或多肽是本发明的核酸和/或多肽。
[0543] 本发明可以使用任何已知的“阵列”实施或可以包括它，其也被称为“微阵列”或“核酸阵列”或“多肽阵列”或“抗体阵列”或“生物芯片”或其变型。阵列通常是多个“点”或“目标元件”，各目标元件包含给定量的一种或多种生物分子，例如，寡核苷酸，其固定化在给定的底物表面区域上，用于特异性结合样品分子，例如，mRNA转录物。
[0544] 在实施本发明的方法时，任何已知的阵列和/或制备和使用阵列的方法可以都被完整或部分地并入，或其变体，如下所述，例如，美国专利No.6,277,628；6,277,489；
6,261,776；6,258,606；6,054,270；6,048,695；6,045,996；6,022,963；6,013,440；
5,965,452；5,959,098；5,856,174；5,830,645；5,770,456；5,632,957；5,556,752；
5,143,854；5,807,522；5,800,992；5,744,305；5,700,637；5,556,752；5,434,049；
还参见，例如，WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958；还参 见，例
如，Johnston(1998)Curr.Biol.8：R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques 23：
1087-1092；Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；Solinas-Toldo(1997)Genes，
Chromosomes & Cancer 20：399-407；Bowtell(1999)Nature Genetics Supp.21：25-32。
还参见公开的美国专利申请No.20010018642；20010019827；20010016322；20010014449；
20010014448；20010012537；20010008765。
6,261,776；6,258,606；6,054,270；6,048,695；6,045,996；6,022,963；6,013,440；
5,965,452；5,959,098；5,856,174；5,830,645；5,770,456；5,632,957；5,556,752；
5,143,854；5,807,522；5,800,992；5,744,305；5,700,637；5,556,752；5,434,049；
还参见，例如，WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958；还参 见，例
如，Johnston(1998)Curr.Biol.8：R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques 23：
1087-1092；Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；Solinas-Toldo(1997)Genes，
Chromosomes & Cancer 20：399-407；Bowtell(1999)Nature Genetics Supp.21：25-32。
还参见公开的美国专利申请No.20010018642；20010019827；20010016322；20010014449；
20010014448；20010012537；20010008765。
[0545] 抗体和基于抗体的筛选方法
[0546] 本发明提供分离的、合成的或重组的抗体，其特异性结合本发明的磷脂酶。这些抗体可以被用于分离、鉴定或定量本发明的磷脂酶或相关多肽。这些抗体可以被用于抑制本发明的酶的活性。这些抗体可以被用于分离其他本发明的相关多肽，例如相关的磷脂酶。
[0547] 本发明的“抗体”可以包括肽或多肽，其衍生于、模仿、或基本上由免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因或其片段所编码，其能够特异性结合抗原或表位，参见，例如，Fundamental Immunology，Third Edition，W.E Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)；
Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.
Methods 25：85-97。术语抗体包括抗原-结合部分，即，“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDR))，其保留抗原结合能力，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过二硫桥在铰链区结合的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组
成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；
和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体同样被包括于术语“抗体”中。
Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.
Methods 25：85-97。术语抗体包括抗原-结合部分，即，“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDR))，其保留抗原结合能力，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过二硫桥在铰链区结合的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组
成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；
和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体同样被包括于术语“抗体”中。
[0548] 抗体可被用于免疫沉淀、染色(例如，FACS)、免疫亲和柱，等等。如果需要，编码特异性抗原的核酸序列可以免疫产生，然后分离多肽或核酸，扩增或克隆并将多肽固定化在本发明的阵列上。
[0549] 可选择地，本发明的方法可以被用于修饰通过修饰的细胞产生的抗体的结构，例如，可以增加或减少抗体的亲和性。此外，制备或修饰抗体的能力可以通过本发明的方法进行表型工程化至细胞中。
[0550] 免疫、生产和分离抗体(多克隆和单克隆)的方法是本领域技术人员已知的，并描述于科技和专利文献中，参见，例如，Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(7th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：
PRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring
HarborPublications，New York。除了传统的使用动物的体内方法外，抗体还可以体外产
生，例如，使用表达重组抗体结合位点的噬菌体展示文库。参见，例如，Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：
27-45。
PRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring
HarborPublications，New York。除了传统的使用动物的体内方法外，抗体还可以体外产
生，例如，使用表达重组抗体结合位点的噬菌体展示文库。参见，例如，Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：
27-45。
[0551] 多肽可以被用于产生抗体，其特异性结合本发明的多肽。得到的抗体可以用于免疫亲和性层析过程以分离或纯化多肽或判断多肽是否存在于生物样品中。在该过程中，蛋
白制剂例如提取物或生物样品与能够特异性结合本发明的一种多肽的抗体接触。
白制剂例如提取物或生物样品与能够特异性结合本发明的一种多肽的抗体接触。
[0552] 在免疫亲和性过程中，抗体被结合至固相载体，例如小球或其他柱状基质。蛋白制剂与抗体接触，其条件为抗体特异性结合本发明的一种多肽。在洗涤除去非特异性结合蛋白后，将特异性结合多肽进行洗脱。
[0553] 生物样品中的蛋白结合抗体的能力可以使用本领域技术人员熟知的任何过程进行测定。例如，可以通过用可探测标记，例如荧光剂、酶标签或放射性同位素标记抗体来测定结合。可选择地，抗体结合至样品可以使用具有该可探测标记的第二抗体进行测定。具
体分析法包括ELISA分析法、夹心分析法、放射免疫分析法以及Western印迹。
体分析法包括ELISA分析法、夹心分析法、放射免疫分析法以及Western印迹。
[0554] 本发明的多肽的多克隆抗体可以通过直接注射多肽至动物体或给予多肽至动物(例如，非人)获得。如此获得的抗体然后结合到多肽自身。按此方式，甚至是只编码多肽
片段的序列也可以被用于产生抗体，其可能结合完整的天然多肽。然后，该抗体可以被用于从表达多肽的细胞中分离多肽。
片段的序列也可以被用于产生抗体，其可能结合完整的天然多肽。然后，该抗体可以被用于从表达多肽的细胞中分离多肽。
[0555] 为了制备单克隆抗体，可以采用任何能够提供产生自连续细胞系培养物的抗体的技术。示例包括杂交瘤技术、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(参
见，例如，Cole(1985)，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
见，例如，Cole(1985)，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
[0556] 可以采用对于单链抗体生产所描述的技术(参见，例如，美国专利No.4,946,778)以生产本发明的多肽的单链抗体。可选择地，转基因小鼠可以被用于表达这些多肽或其片
段的人源化抗体。
段的人源化抗体。
[0557] 本发明的多肽的抗体可以用于从其他生物体和样品中筛选相似多肽。在该技术中，生物体的多肽与抗体进行接触，并检测特异性结合抗体的那些多肽。任何如上所述的过程可被用于检测抗体结合。
[0558] 试剂盒
[0559] 本发明提供包含组合物的试剂盒，例如，本发明的核酸、表达框、载体、细胞、多肽(例如，含有至少一种本发明的磷脂酶的试剂盒)和/或抗体(例如，含有至少一种本发明的抗体的试剂盒)。试剂盒可以含有用于加工(制造)生物燃料、洗涤剂或用于处理或加工
食品、饲料、生物质、食品或饲料添加剂或营养补充品等的酶。试剂盒还可以含有说明性材料，其教导本发明的方法和工业应用，如文中所述的。
食品、饲料、生物质、食品或饲料添加剂或营养补充品等的酶。试剂盒还可以含有说明性材料，其教导本发明的方法和工业应用，如文中所述的。
[0560] 本发明的酶的工业和医疗应用
[0561] 本发明提供使用本发明的多肽的很多工业应用和医疗应用，例如，磷脂酶和其他本发明的酶，例如，磷脂酶A、B、C和D、patatin，包括转化非水化磷脂为水化形式，制造生物燃料和加工生物质、油脱胶、从植物、鱼、藻类等的油处理，在此仅列举一些应用。在这些可选工业应用和医疗应用的任一种中，可以特定顺序加入酶，例如，以特定顺序加入具有不同特异性的磷脂酶，例如，首先加入具有PC-和PE-水解活性的酶(或加入两种酶，一种具有
PC-水解活性，另一种具有PE-水解活性)，然后加入具有PI-水解活性的酶(例如，PLC或
PI-PLC活性)，或其任意组合。
PC-水解活性，另一种具有PE-水解活性)，然后加入具有PI-水解活性的酶(例如，PLC或
PI-PLC活性)，或其任意组合。
[0562] 本发明的任何或所有的方法可以用于“生产规模”，例如，规模约15,000；25,000；50,000；75,000；或100,000lbs的精制油/天至高达约1、2、3、4、5或6以上百万lbs精制
油/天的油处理或精制。
油/天的油处理或精制。
[0563] 在工业应用中使用磷脂酶的方法是本领域公知的。例如，本发明的磷脂酶和方法可以用于处理脂肪和油，例如描述在JP专利申请公开H6-306386中，描述了将油和脂肪中
存在的磷脂转化为含有磷酸基团的水溶性物质。
存在的磷脂转化为含有磷酸基团的水溶性物质。
[0564] 本发明的磷脂酶可以用于处理植物油和磷脂，如衍生于或分离于以下的那些：米糠、大豆、芥花、棕榈、棉籽、玉米、棕榈仁、椰子、花生、芝麻、向日葵。本发明的磷脂酶可以用于处理精油，例如，得自果实种子油的那些，例如，葡萄籽、杏、琉璃苣等。本发明的磷脂酶可以用于处理不同形式的油和磷脂，包括粗制形式、脱胶、胶、洗涤水、粘、硅石、皂料等。本发明的磷脂可以用于处理高磷油、鱼油、动物油、植物油、藻类油等。在本发明的任何方面，任何时间都可以使用磷脂酶C，替代地包括使用本发明的磷脂酶D和磷酸酶(例如，使用PLD/
磷酸酶组合，以提高高磷油产量，如大豆油)。
磷酸酶组合，以提高高磷油产量，如大豆油)。
[0565] 本发明的磷脂酶可以用于处理和制造食用油、生物柴油、药物和化妆品用的脂质体，结构性磷脂和结构性脂质。本发明的磷脂酶可以用在油提取中。本发明的磷脂酶可以
用于处理和制造各种皂。
用于处理和制造各种皂。
[0566] 在另一个实施方案中，本文提供的是一种从食用油获得磷脂的方法。在某些实施方案中，通过本文提供的方法获得的磷脂包括各种磷脂，包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)、
磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱
(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酸(LPA)、胆碱(C)、乙醇胺(E)、丝氨酸(S)和肌醇(I)。
磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱
(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酸(LPA)、胆碱(C)、乙醇胺(E)、丝氨酸(S)和肌醇(I)。
[0567] 处理食用油：产生1，3-二酰基甘油(1，3DAG)
[0568] 本发明提供使用本发明的酶制造1，3-二酰基甘油(1，3DAG)的方法。在一个方面，磷脂酶C或磷脂酶D+磷酸酶产生1，2-二酰基甘油；这样提高了食用油精制过程中的油产量。当用在包括碱中和步骤的方法中时，例如，作为碱精制助剂，高达70％的1，2-二酰基甘油(1，2-DAG)发生酰基迁移并转化为1，3-DAG。1，3-DAG具有改进的健康益处，因而，使用PLC作为碱精制助剂产生了营养价值增加的油。
[0569] 本发明提供使用本发明的酶制造和处理食用油的方法，包括产生1，3-DAG量提高的食用油。二酰基甘油是许多食用油中发现的天然产生的化合物。在本发明方法的一个方
面，例如，油脱胶方法，碱使得由PLC产生的1，2-DAG异构化成1，3-DAG，与1，2-DAG相比，提供了营养健康益处，例如，1，3-DAG作为能量燃烧而不是作为脂肪存储(象1，2-DAG那
样)。通过在碱精制过程前端加入PLC(随后加入酸和碱)，本发明的方法产生升高水平的
1，3-DAG(1，2-DAG降低)。在营养方面，1，3-DAG比1，2-DAG更好。在可选方面，本发明包括使用本发明的PLC的油脱胶方法，由此最终脱胶油产物含有不小于0.5％、1.0％、2.0％或
3.0％或更多的1，3-DAG。
面，例如，油脱胶方法，碱使得由PLC产生的1，2-DAG异构化成1，3-DAG，与1，2-DAG相比，提供了营养健康益处，例如，1，3-DAG作为能量燃烧而不是作为脂肪存储(象1，2-DAG那
样)。通过在碱精制过程前端加入PLC(随后加入酸和碱)，本发明的方法产生升高水平的
1，3-DAG(1，2-DAG降低)。在营养方面，1，3-DAG比1，2-DAG更好。在可选方面，本发明包括使用本发明的PLC的油脱胶方法，由此最终脱胶油产物含有不小于0.5％、1.0％、2.0％或
3.0％或更多的1，3-DAG。
[0570] 因此，本发明提供制造(通过酯交换)精制油(例如，二酰基甘油油)的方法，包括食用油，含有提高水平的1，3-二酰基甘油(1，3-DAG)，其中磷脂酶，如本发明的酶，是“前端加载的”或在加入酸或碱之前加入。通过从甘油三酯发生DAG的酶水解经由酯交换从1，
2DAG产生1，3DAG。含有1，3DAG-的食用油与传统食用油相比表现出不同的代谢效果。1，
3DAG和1，2DAG或甘油三酯之间的代谢途径差异允许来自1，3二酰基甘油的更大部分的脂
肪酸作为能量燃烧而不是作为脂肪存储。临床研究表明，经常食用DAG油作为明智饮食的
一部分可以帮助个人管理自己的体重和身体脂肪。此外，1，3DAG的代谢降低了血液中的循环餐后甘油三酯。由于肥胖和高血脂质作为慢性疾病的危险因素相关联，包括心血管疾病
和II型糖尿病，所以在经常食用DAG油时，这些生活方式相关的健康条件可能以有益的方
式受到影响。
2DAG产生1，3DAG。含有1，3DAG-的食用油与传统食用油相比表现出不同的代谢效果。1，
3DAG和1，2DAG或甘油三酯之间的代谢途径差异允许来自1，3二酰基甘油的更大部分的脂
肪酸作为能量燃烧而不是作为脂肪存储。临床研究表明，经常食用DAG油作为明智饮食的
一部分可以帮助个人管理自己的体重和身体脂肪。此外，1，3DAG的代谢降低了血液中的循环餐后甘油三酯。由于肥胖和高血脂质作为慢性疾病的危险因素相关联，包括心血管疾病
和II型糖尿病，所以在经常食用DAG油时，这些生活方式相关的健康条件可能以有益的方
式受到影响。
[0571] 食用含有DAG的油可以通过各种手段进行。因此，在一个方面，本发明提供使用本发明的酶制备食物的方法，例如，具有提高水平的1，3-DAG二酰基甘油的烤物和包括二酰基甘油油的焙烤食品。在一个方面，焙烤食品是饼干、蛋糕和类似焙烤食品。
[0572] 在可选实施方案中，本发明的方法中可以使用的各种酶的组合，包括食用油的处理，包括(其中组合中的一种、几种或所有的酶包括本发明的酶)：
[0573] ○PLC+PI-PLC+PLA(在完成PLC反应后加入PLA)；
[0574] ○PLD+磷酸酶+PI-PLC，然后PLA；或，
[0575] ○PLC或(PLC+PI-PLC)+磷脂酸特异性PLA(所有酶一起或顺序加入)。
[0576] 油脱胶和植物油处理
[0577] 本发明的酶(例如，本发明的具有脂肪酶、磷脂酶、酯酶和/或糖苷酶或等效活性的多肽)可以用在各种植物油处理步骤中，如在植物油提取中，尤其是，在被称作“油脱胶”的方法中除去“磷脂胶”。
[0578] 本发明的这些方法可以用于“生产规模”，例如，规模约15,000；25,000；50,000；75,000；或100,000lbs的精制油/天至高达约1、2、3、4、5或6以上百万lbs精制油/天。
[0579] 在一个方面，本发明提供油脱胶方法，包括使用本发明的磷脂酶，例如，PLC，例如，本发明的PI-PLC。在一个方面，所述方法还包括加入另一种磷脂酶(其也可以是本发明的磷脂酶)，例如，另一种PLC、PLA、PLB、PLB或本发明的patatin，或具有溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性或溶血磷脂酶(LPL)活性的酶(其也可以是本发明的酶)和溶血磷脂酶-转
酰基酶(LPTA)或其组合，和/或patatin样磷脂酶(其也可以是本发明的酶)。在一个方
面，所有酶一起加入，或者，可选择地，可以特定顺序加入酶，例如，加入PLC，然后加入PLA和/或patatin；或，首先加入本发明的具有PC和PE活性的酶，然扣加入PI-PLC。
酰基酶(LPTA)或其组合，和/或patatin样磷脂酶(其也可以是本发明的酶)。在一个方
面，所有酶一起加入，或者，可选择地，可以特定顺序加入酶，例如，加入PLC，然后加入PLA和/或patatin；或，首先加入本发明的具有PC和PE活性的酶，然扣加入PI-PLC。
[0580] 在一个方面，该方法由于磷脂酶(例如，本发明的PLC)处理的原因提供了产量改进。在一个方面，该方法由于磷脂酶(例如，本发明的PLA)处理的原因提供了油中的磷含
量额外的降低。
量额外的降低。
[0581] 在一个方面，本发明提供包括使用本发明的磷脂酶通过减少的油截留来减少胶质并提高中性油(甘油三酯)量的方法，例如，本发明的PLC或PI-PLC。在一个方面，本发明
提供包括使用本发明的磷脂酶提高中性油和二酰基甘油(DAG)生产而有助于油相的方法，
例如，本发明的PLC，例如，本发明的PI-PLC。在可选方面，本发明的方法(例如，脱胶方法)可包括一种或多种其他酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、另一种磷脂酶(包括例如本发明的酶)、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、galactanase、木聚糖酶、氧化酶，例如，乳糖酶和/或过氧化物酶，或具有等效活性的多肽或其组合。
提供包括使用本发明的磷脂酶提高中性油和二酰基甘油(DAG)生产而有助于油相的方法，
例如，本发明的PLC，例如，本发明的PI-PLC。在可选方面，本发明的方法(例如，脱胶方法)可包括一种或多种其他酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、另一种磷脂酶(包括例如本发明的酶)、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、galactanase、木聚糖酶、氧化酶，例如，乳糖酶和/或过氧化物酶，或具有等效活性的多肽或其组合。
[0582] 本发明的磷脂酶可以用在各种植物油处理步骤中，如在植物油提取中，尤其是，在被称作“油脱胶”的方法中除去“磷脂胶”，如上所述。本发明提供处理来自各种来源的植物油的方法，如米糠、大豆、油菜籽、花生和其他坚果、芝麻、向日葵、棕榈和玉米。所述方法可以与基于用己烷提取的方法结合，随后将粗制提取物精制成食用油，包括使用本发明的方法和酶。精制中的第一步骤被称为“脱胶”过程，用于通过加入水除去磷脂。分离脱胶析出的材料并进一步处理成卵磷脂的混合物。市售卵磷脂，如大豆卵磷脂和向日葵卵磷脂，是半固体或极粘性材料。它们由极性脂质混合物(主要是磷脂)和油(主要是甘油三酯)组成。
[0583] 本发明的磷脂酶可以用在任何“脱胶”过程中，包括水脱胶、ALCON油脱胶(例如，TM对于大豆)、safinco脱胶、“超脱胶”、UF脱胶、TOP脱胶、单一脱胶、干脱胶和ENZYMAX 脱胶。参见，例如，美国专利No.6,355,693；6,162,623；6,103,505；6,001,640；5,558,781；
5,264,367。本发明的方法并入的各种“脱胶”程序记载在Bockisch，M.(1998)In Fats and Oils Handbook，The extraction of Vegetable Oils(Chapter 5)，345-445，AOCS Press，Champaign，Illinois。本发明的磷脂酶可以用在甘油三酯油的酶脱胶工业应用中，例如，EP
513709中所述。
5,264,367。本发明的方法并入的各种“脱胶”程序记载在Bockisch，M.(1998)In Fats and Oils Handbook，The extraction of Vegetable Oils(Chapter 5)，345-445，AOCS Press，Champaign，Illinois。本发明的磷脂酶可以用在甘油三酯油的酶脱胶工业应用中，例如，EP
513709中所述。
[0584] 在一个方面，本发明的磷脂酶用于处理植物油，例如，粗制油，如米糠、大豆、芥花、花等。在一个方面，这改进了脱胶过程的效率。在一个方面，本发明提供了在低水条件下酶脱胶的方法，例如，在约0.1％～0％水或者0.5％～10％水的范围内。在一个方面，这导致了在离心期间重相从油相的分离改进。这些相的改进分离可以导致更有效地从油中除去磷脂，包括水化和非水化油。在一个方面，这可以产生含有较少夹带的中性油(甘油三酯)的
胶部分，从而改善了在脱胶过程中油的总收率。
胶部分，从而改善了在脱胶过程中油的总收率。
[0585] 在一个方面，本发明的磷脂酶，例如，具有PLC活性的多肽，例如，PI-PLC活性，用于处理油(例如，植物油，包括粗制油，如米糠、大豆、芥花、花等)，例如，在脱胶方法中，以通过减少的油截留减少胶质和提高中性油量。在一个方面，本发明的磷脂酶，例如，具有PLC活性的多肽，用于二酰基甘油(DAG)生产并且有助于油相。
[0586] 本发明的磷脂酶可以用在酶脱胶的工业应用中，例如，在CA 1102795中所述的，其描述了通过加入至少50重量％的水从谷物脂质分离极性脂质的方法。该方法是改变的
脱胶，利用了将水加到粗制油混合物中的原理。
脱胶，利用了将水加到粗制油混合物中的原理。
[0587] 在一个方面，本发明提供包括使用本发明的磷脂酶的酶方法(例如，PLC，例如，PI-PLC)，包括在温度约20℃～40℃下，在碱性pH下，例如，pH为约pH 8～pH 10，使用反
应时间约3～10分钟，水解油中的非水合的磷脂。这可以导致小于10ppm的最终油磷水平。
本发明还提供包括使用本发明的磷脂酶(例如，PI-PLC)的酶方法，包括在温度约50℃～
60℃下，在pH略微中性以下，例如，约pH 5～pH 6.5，使用反应时间约30～60分钟，水解
油中的水化和非水化磷脂。这可以导致小于10ppm的最终油磷水平。
应时间约3～10分钟，水解油中的非水合的磷脂。这可以导致小于10ppm的最终油磷水平。
本发明还提供包括使用本发明的磷脂酶(例如，PI-PLC)的酶方法，包括在温度约50℃～
60℃下，在pH略微中性以下，例如，约pH 5～pH 6.5，使用反应时间约30～60分钟，水解
油中的水化和非水化磷脂。这可以导致小于10ppm的最终油磷水平。
[0588] 在一个方面，本发明提供酶利用磷脂酶C酶水解甘油磷酸酯键并因而能够将磷脂的二酰基甘油部分返回到油的方法，例如，植物油、鱼油或藻类油(“磷脂酶C(PLC)碱精制助剂”)；和，将脱胶步骤中的磷脂含量降低到低至足以使高磷油物理精制的水平(“磷脂酶C(PLC)脱胶助剂”)。这两种技术可以产生不同的值并具有不同的目标应用。
[0589] 在各种本发明的示例性方法中，层次分明的步骤数量包括在核心漂白和除臭精制过程之前的脱胶过程。这些步骤包括加热、混合、保持、分离和干燥。在加热步骤后，加入水和经常的酸并混合以使不溶性磷脂“胶”凝聚成可以分离的颗粒。尽管水分离脱胶中的多
数磷脂，但是部分磷脂是非水化磷脂(NHP)，作为钙或镁盐存在。脱胶方法通过加入酸来解决这些NHP。在磷脂的水合后，混合油、保持并通过离心分离。最后，油干燥和储存，运输或精制，例如，如图1所示。对于卵磷脂产品，生成的胶进一步处理，或加回到餐中。
数磷脂，但是部分磷脂是非水化磷脂(NHP)，作为钙或镁盐存在。脱胶方法通过加入酸来解决这些NHP。在磷脂的水合后，混合油、保持并通过离心分离。最后，油干燥和储存，运输或精制，例如，如图1所示。对于卵磷脂产品，生成的胶进一步处理，或加回到餐中。
[0590] 在一个实施方案中，本文提供的是使脂质基质内的非水化磷脂水合的方法，通过使其迁移到油-水界面。然后，使非水化磷脂反应和/或从脂质除去。在一个实施方案中，
所述方法包括a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；和b)混合碱与所
述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中所述步骤a)和/或b)中的混合产生包
含平均液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案中，步骤a)和/或
b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液，其
中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，本文提供的方法使脂质基质内的
非水化磷脂迁移到油-水界面。
所述方法包括a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；和b)混合碱与所
述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中所述步骤a)和/或b)中的混合产生包
含平均液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液。在某些实施方案中，步骤a)和/或
b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液，其
中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，本文提供的方法使脂质基质内的
非水化磷脂迁移到油-水界面。
[0591] 在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15-40μm、15-35μm、17-40μm、20-40μm、20-30μm、25-30μm、25-40μm或25-35μm的水相的乳液。在某些实施方案中，步骤a)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15-40μm、
15-35μm、17-40μm、20-40μm、20-30μm、25-30μm、25-40μm或25-35μm的水相的乳液。
在某些实施方案中，步骤b)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15-40μm、15-35μm、
17-40μm、20-40μm、20-30μm、25-30μm、25-40μm或25-35μm的水相的乳液。在某些
实施方案中，平均液滴尺寸为约15μm、17μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、
35μm或40μm。在某些实施方案中，平均液滴尺寸为约20μm。
15-35μm、17-40μm、20-40μm、20-30μm、25-30μm、25-40μm或25-35μm的水相的乳液。
在某些实施方案中，步骤b)中的混合产生包含平均液滴尺寸为约15-40μm、15-35μm、
17-40μm、20-40μm、20-30μm、25-30μm、25-40μm或25-35μm的水相的乳液。在某些
实施方案中，平均液滴尺寸为约15μm、17μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、
35μm或40μm。在某些实施方案中，平均液滴尺寸为约20μm。
[0592] 在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约20μm～约40μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些
实施方案中，混合步骤产生包含至少约60-95％、60-90％、60-80％、70-95％、80-95体积％的液滴尺寸为约20-40μm、20-35μm、25-40μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混
合产生包含至少约60、70、80、90,93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约15-45μm、
20-40μm、20-45μm、25-40μm、20-35μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳
液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)中的混合产生包含
至少约60、70、80、90、93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约15-45μm、20-40μm、
20-45μm、25-40μm、20-35μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳液，其中水
相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤b)中的混合产生包含至少60、
70、80、90、93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约15-45μm、20-40μm、20-45μm、
25-40μm、20-35μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约10-30
体积％的液滴尺寸小于约10μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在
某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约20-25体积％的液滴尺寸小
于约10μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约60-95体积％的液滴尺寸大于约10μm的水相的乳
液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合
产生包含至少约70-80体积％的液滴尺寸大于约10μm的水相的乳液，其中水相的百分比
按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约90体
积％的平均液滴尺寸约20μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。
实施方案中，混合步骤产生包含至少约60-95％、60-90％、60-80％、70-95％、80-95体积％的液滴尺寸为约20-40μm、20-35μm、25-40μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混
合产生包含至少约60、70、80、90,93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约15-45μm、
20-40μm、20-45μm、25-40μm、20-35μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳
液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)中的混合产生包含
至少约60、70、80、90、93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约15-45μm、20-40μm、
20-45μm、25-40μm、20-35μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳液，其中水
相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤b)中的混合产生包含至少60、
70、80、90、93、95、96、97、98或99体积％的液滴尺寸为约15-45μm、20-40μm、20-45μm、
25-40μm、20-35μm、30-40μm、35-40μm或25-45μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约10-30
体积％的液滴尺寸小于约10μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在
某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约20-25体积％的液滴尺寸小
于约10μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约60-95体积％的液滴尺寸大于约10μm的水相的乳
液，其中水相的百分比按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合
产生包含至少约70-80体积％的液滴尺寸大于约10μm的水相的乳液，其中水相的百分比
按水相的总体积计。在某些实施方案中，步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约90体
积％的平均液滴尺寸约20μm的水相的乳液，其中水相的百分比按水相的总体积计。
[0593] 尽管不受到任何特定理论的约束，但是据认为，在步骤a)中，磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的钙、镁和铁盐分解。游离的钙、镁和铁阳离子与例如来自酸的柠檬酸根、乙酸根或磷酸根阴离子反应，形成金属盐。在步骤b)中，来自碱的金属阳离子，例如，例如，钠或钾离子，与形成磷脂酸或磷脂酰乙醇胺复合物。在某些实施方案中，所述方法还包括加入水，然后高剪切混合，形成机械乳液。然后通过化学脱胶除去乳化的磷脂或在酶脱胶中反应。
[0594] 本领域技术人员认为适合的任何剪切和/或混合装置可以用于在本文提供的方法中混合。在某些实施方案中，混合包括剪切和搅拌。在某些实施方案中，混合装置是顶
置式混合器，包括带平叶浆的IKA RW 20digital混合器。在某些实施方案中，混合装置
正常搅拌在约50rpm、100rpm、150rpm或200rpm下运转，剧烈搅拌在约250rpm、300rpm、
350rpm、400rpm或更大下运转。在某些实施方案中，剪切混合用IKA’s Ultra-Turrax均质器T-50basic在10,000rpm下完成，其带有S 50N-G 45G分散元件。
置式混合器，包括带平叶浆的IKA RW 20digital混合器。在某些实施方案中，混合装置
正常搅拌在约50rpm、100rpm、150rpm或200rpm下运转，剧烈搅拌在约250rpm、300rpm、
350rpm、400rpm或更大下运转。在某些实施方案中，剪切混合用IKA’s Ultra-Turrax均质器T-50basic在10,000rpm下完成，其带有S 50N-G 45G分散元件。
[0595] 在某些实施方案中，混合器是转子/定子高剪切混合器，尖端速度(混合室中的径向速度)为至少约1400cm/s。在某些实施方案中，混合器消耗的功率为至少1.0KW/吨产品
/h。在某些实施方案中，以约1400cm/s～2300cm/s或甚至更高的尖端速度获得工业规模
的油/水乳液。在某些实施方案中，尖端速度为约1400cm/s、1600cm/s、1800cm/s、2000cm/s、2100cm/s、2300cm/s、2500cm/s、3000cm/s或3500cm/s。在某些实施方案中，尖端速度为约2300cm/s。在某些实施方案中，混合器消耗的功率为约1.0～约2.0KW/吨产品/h。在
某些实施方案中，混合器消耗的功率为约2.0KW/吨产品/h。在某些实施方案中，对于连续
处理过程，对于10吨油/小时需要10KW的高剪切混合器有效功耗。
/h。在某些实施方案中，以约1400cm/s～2300cm/s或甚至更高的尖端速度获得工业规模
的油/水乳液。在某些实施方案中，尖端速度为约1400cm/s、1600cm/s、1800cm/s、2000cm/s、2100cm/s、2300cm/s、2500cm/s、3000cm/s或3500cm/s。在某些实施方案中，尖端速度为约2300cm/s。在某些实施方案中，混合器消耗的功率为约1.0～约2.0KW/吨产品/h。在
某些实施方案中，混合器消耗的功率为约2.0KW/吨产品/h。在某些实施方案中，对于连续
处理过程，对于10吨油/小时需要10KW的高剪切混合器有效功耗。
[0596] 在某些实施方案中，酸的混合包括剪切小于约1分钟。在某些实施方案中，酸的混合包括剪切约1秒、3秒、5秒、8秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒或60秒。在某些实施方案中，酸的混合包括剪切至少约1分钟。在某些实施方案中，酸的混合包括剪切至少约1秒至达到约10分钟，至少约1秒至达到约10分钟，至少约1秒至达到约7分钟，至少约1秒
至达到约5分钟，至少约1秒至达到约3分钟或至少约1秒至达到约2分钟。在某些实施
方案中，酸的混合包括剪切至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。
至达到约5分钟，至少约1秒至达到约3分钟或至少约1秒至达到约2分钟。在某些实施
方案中，酸的混合包括剪切至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。
[0597] 在某些实施方案中，酸的混合包括剪切，然后搅拌约1分钟～达到约5小时。在某些实施方案中，酸性混合物搅拌至少约1分钟。在某些实施方案中，酸的搅拌持续约10分
钟至约5小时或更高。在某些实施方案中，酸的搅拌持续约30分钟至约5小时或更高。在
某些实施方案中，酸的搅拌持续约30分钟至约3小时或更高。在某些实施方案中，酸的搅
拌持续约30分钟至约2小时或更高。在某些实施方案中，酸的搅拌持续约1、10、20、30、40、
50、60、70、80，90、120、150或180分钟。
钟至约5小时或更高。在某些实施方案中，酸的搅拌持续约30分钟至约5小时或更高。在
某些实施方案中，酸的搅拌持续约30分钟至约3小时或更高。在某些实施方案中，酸的搅
拌持续约30分钟至约2小时或更高。在某些实施方案中，酸的搅拌持续约1、10、20、30、40、
50、60、70、80，90、120、150或180分钟。
[0598] 在某些实施方案中，步骤a)中使用的酸选自磷酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和其混合物。在一个实施方案中，酸是柠檬酸。
[0599] 在某些实施方案中，步骤a)中的酸性混合物的pH为约1～约4。在某些实施方案中，步骤a)中的酸性混合物的pH为约1、1.5、2、2.5、3、3.5或4。
[0600] 在某些实施方案中，酸的混合持续到磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的钙、镁和铁盐分解。
[0601] 在某些实施方案中，按酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约5重量％的酸。在某些实施方案中，按酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少
约5至约90％、约5至约80％、约5至约70％、约10至约90％、约20至约60％、约30至
约60％或约40至约60重量％的酸。在某些实施方案中，按酸和水的组合重量计，方法中
使用的水性酸包括至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、85、90重量％的酸。在某些实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约5重量％的柠檬酸。在某些实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60重量％的柠檬酸。在某些实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约40、45、50、55或60重量％的柠檬酸。在一个实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括约50重
量％的柠檬酸。在某些实施方案中，按磷酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、85、90重量％的磷酸。
约5至约90％、约5至约80％、约5至约70％、约10至约90％、约20至约60％、约30至
约60％或约40至约60重量％的酸。在某些实施方案中，按酸和水的组合重量计，方法中
使用的水性酸包括至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、85、90重量％的酸。在某些实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约5重量％的柠檬酸。在某些实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60重量％的柠檬酸。在某些实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约40、45、50、55或60重量％的柠檬酸。在一个实施方案中，按柠檬酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括约50重
量％的柠檬酸。在某些实施方案中，按磷酸和水的组合重量计，方法中使用的水性酸包括至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、85、90重量％的磷酸。
[0602] 在某些实施方案中，按油的总重量计，水性酸使用至少约0.01重量％。在某些实施方案中，按油的总重量计，水性酸使用至少约0.05重量％。在某些实施方案中，按油的总重量计，水性酸使用至少约0.01至约10％、约0.01至约5％、约0.05至约5％、约0.05至
约3％、约0.05至约2％或约0.1至约2重量％。在某些实施方案中，按油的总重量计，水
性酸使用约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、1、2、5、7或10重量％。
约3％、约0.05至约2％或约0.1至约2重量％。在某些实施方案中，按油的总重量计，水
性酸使用约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、1、2、5、7或10重量％。
[0603] 碱与酸性混合物混合，在水相得到pH约6-9的反应混合物。持续混合使脂质基质内的非水化磷脂迁移到油-水界面。本领域技术人员认为适合的任何碱都可以用在步骤b)
中。在某些实施方案中，碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、硅酸钠、碳酸钠、碳酸钙和其组合。在一个实施方案中，碱是氢氧化钠。在某些实施方案中，碱作为稀水溶液加入，使得碱不会皂化任何中性油。在某些实施方案中，碱作为约0.1至约8M、约1至约4M、约1至约3M，或约
0.5至约3M水溶液加入。在某些实施方案中，碱作为约0.1M、0.5M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M或8M水溶液加入。在一个实施方案中，用于除去NHP有效的碱最小量使得水相的pH升到
至少约6。在某些实施方案中，碱的用量足以将水相的pH升到约6、6.5、7、7.5或8。在某
些实施方案中，碱的混合持续至少约1分钟。在某些实施方案中，碱的混合持续约1分钟至
约5小时或更高。在某些实施方案中，碱的混合持续约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、
120、150或180分钟。
中。在某些实施方案中，碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、硅酸钠、碳酸钠、碳酸钙和其组合。在一个实施方案中，碱是氢氧化钠。在某些实施方案中，碱作为稀水溶液加入，使得碱不会皂化任何中性油。在某些实施方案中，碱作为约0.1至约8M、约1至约4M、约1至约3M，或约
0.5至约3M水溶液加入。在某些实施方案中，碱作为约0.1M、0.5M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M或8M水溶液加入。在一个实施方案中，用于除去NHP有效的碱最小量使得水相的pH升到
至少约6。在某些实施方案中，碱的用量足以将水相的pH升到约6、6.5、7、7.5或8。在某
些实施方案中，碱的混合持续至少约1分钟。在某些实施方案中，碱的混合持续约1分钟至
约5小时或更高。在某些实施方案中，碱的混合持续约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、
120、150或180分钟。
[0604] 本文提供的方法可以在本领域技术人员认为适合的任何温度下进行。在某些实施方案中，过程中的温度为约200℃～约100℃、约200℃～约90℃、约400℃～约80℃或
约400℃～约70℃。在某些实施方案中，过程中的温度为约20、30、40、50、60、70、80、90或
100℃。
约400℃～约70℃。在某些实施方案中，过程中的温度为约20、30、40、50、60、70、80、90或
100℃。
[0605] 在某些实施方案中，按反应混合物的总体积计，与碱反应后水的加入量为约0.1～5％或更多，然后进行高剪切混合，形成机械乳液，从而使磷脂在化学脱胶中乳化或
在酶脱胶中反应。在某些实施方案中，按反应混合物的总体积计，水加入约0.1、0.5、1、2、3、
4、5％或更多。
在酶脱胶中反应。在某些实施方案中，按反应混合物的总体积计，水加入约0.1、0.5、1、2、3、
4、5％或更多。
[0606] 在一个实施方案中，本文提供的是其中使NHP水合、然后酶处理并除去各种磷脂和卵磷脂的方法。所述方法可以针对粗制或水脱胶油实施。
[0607] 在某些实施方案中，本文提供的油脱胶方法包括：a)混合水性酸与食用油，得到pH约1～4的酸性混合物，b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，和
c)用水或酶使所述反应混合物脱胶，得到脱胶油，其中步骤a)和/或b)中的混合使用高剪
切混合器进行。
c)用水或酶使所述反应混合物脱胶，得到脱胶油，其中步骤a)和/或b)中的混合使用高剪
切混合器进行。
[0608] 在酶用在脱胶步骤中的实施方案中，一种或更多种酶可以单独或一起加到油中。可以控制包括温度、pH和酶浓度在内的酶反应参数，以在特定油系统中针对特定酶组合优
化反应。多种酶和其等效物适于用在本文提供的方法中，包括可市售得到的磷脂酶A和磷
脂酶C家族。示例性的酶描述在本文中各处。
化反应。多种酶和其等效物适于用在本文提供的方法中，包括可市售得到的磷脂酶A和磷
脂酶C家族。示例性的酶描述在本文中各处。
[0609] 在某些实施方案中，酶脱胶步骤中一起使用的不同磷脂酶混合在一起，然后加到将要处理的油中。可选择地，各酶单独地、相继地或同时加到油中。
[0610] 本文提供的方法中使用的酶量取决于反应条件、油类型和使用的酶类型。在某些实施方案中，其量为10～20,000单位、20～10,000单位、50～5,000单位或100～2,000
单位，每1kg油。
单位，每1kg油。
[0611] 在一个实施方案中，本文提供的是从植物油中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂(统称为“胶”)以制造可用于食物生产和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品的方法。在某些实
施方案中，本文提供的脱胶方法利用水、各种酸和/或各种碱或其组合。
施方案中，本文提供的脱胶方法利用水、各种酸和/或各种碱或其组合。
[0612] 在一个实施方案中，本文提供的方法适用于从植物油除去磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的盐。在某些实施方案中，在步骤a)中形成钙和镁柠檬酸盐。本文提供的方法针对反应后
设备消除了与由于钙和镁柠檬酸盐沉积造成的设备结垢有关的问题。在酶反应和进一步处
理在本文提供的方法中进行的pH值下，钙和镁柠檬酸盐是可溶的。
设备消除了与由于钙和镁柠檬酸盐沉积造成的设备结垢有关的问题。在酶反应和进一步处
理在本文提供的方法中进行的pH值下，钙和镁柠檬酸盐是可溶的。
[0613] 在某些实施方案中，本文提供的是增强酶脱胶中使用的磷脂酶的反应速率的方法，使得酶反应的持续时间小于约6、5、4、3、2或1小时。在某些实施方案中，反应速率的增强高剪切混合步骤b)的反应混合物实现，形成与酶反应的机械乳液。
[0614] 在另一个方面，本文提供的是脱胶植物油组合物的方法，其中水化和非水化磷脂在一个步骤中被处理，其中酶反应在小于约1小时内完成。
[0615] 在某些实施方案中，油包括Neochloris oleoabundans油、二形栅藻(Scenedesmus dimorphus) 油、眼 虫 藻(Euglena gracilis) 油、三 角 褐 指 藻 (Phaeodactylumtricornutum)油、颗石藻(Pleurochrysis carterae)油、小定鞭金藻(Prymnesium
parvum) 油、扁 藻 (Tetraselmis chui)油、四 爿 藻(Tetraselmis suecica) 油、绿
光等 鞭金 藻(Isochrysis galbana)油、微拟 球藻(Nannochloropsis salina) 油、
丛 粒 藻(Botryococcus braunii)油、杜 氏 藻(Dunaliella tertiolecta)油、微 球
藻(Nannochloris) 油、螺 旋 藻(Spirulina) 油、绿 藻(Chlorophycease) 油、硅 藻
(Bacilliarophy)油、巴西莓油、杏仁油、巴巴苏仁油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、芥花油、腰果油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻仁油、葡萄籽油、榛子油、其他坚果油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻籽油、夏威夷核果油、芒果仁油、绣线菊油、芥末油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、山核桃油、松仁油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、乳木果油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、tsubaki油、核桃油、经由遗传修饰的微生物(GMO)或传统的“育种”而具有改变的脂肪酸组成的“天然”油种类如高油酸、低亚麻酸或低饱和油(高油酸芥花油、低亚麻酸大豆油或高硬脂酸葵花籽油)或其共混物。在一个实施方案中，可被处理的油包括但不限于下面
的：芥花油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、绣线菊油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、tsubaki油和植物油。
parvum) 油、扁 藻 (Tetraselmis chui)油、四 爿 藻(Tetraselmis suecica) 油、绿
光等 鞭金 藻(Isochrysis galbana)油、微拟 球藻(Nannochloropsis salina) 油、
丛 粒 藻(Botryococcus braunii)油、杜 氏 藻(Dunaliella tertiolecta)油、微 球
藻(Nannochloris) 油、螺 旋 藻(Spirulina) 油、绿 藻(Chlorophycease) 油、硅 藻
(Bacilliarophy)油、巴西莓油、杏仁油、巴巴苏仁油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、芥花油、腰果油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻仁油、葡萄籽油、榛子油、其他坚果油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻籽油、夏威夷核果油、芒果仁油、绣线菊油、芥末油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、山核桃油、松仁油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、乳木果油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、tsubaki油、核桃油、经由遗传修饰的微生物(GMO)或传统的“育种”而具有改变的脂肪酸组成的“天然”油种类如高油酸、低亚麻酸或低饱和油(高油酸芥花油、低亚麻酸大豆油或高硬脂酸葵花籽油)或其共混物。在一个实施方案中，可被处理的油包括但不限于下面
的：芥花油、蓖麻油、椰子油、香菜油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、绣线菊油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、tsubaki油和植物油。
[0616] 在某些实施方案中，本文提供的方法将油的磷脂含量减小到小于约30ppm的磷、小于约20ppm的磷、小于约15ppm的磷、小于约10ppm的磷、小于约7ppm的磷、小于约5ppm
的磷或小于约3ppm的磷。在某些实施方案中，本文提供的方法将油的磷脂含量减小到约
10ppm的磷、约7ppm的磷、约5ppm的磷或约3ppm的磷。
的磷或小于约3ppm的磷。在某些实施方案中，本文提供的方法将油的磷脂含量减小到约
10ppm的磷、约7ppm的磷、约5ppm的磷或约3ppm的磷。
[0617] 在脱胶步骤后，脱胶油可以与胶分离，并进行本领域已知的进一步处理步骤，包括漂白或除臭，取决于脱胶油产品的预期最终用途这可能是必须的或希望的。
[0618] 在某些实施方案中，本文提供的是获得磷脂的方法，包括：
[0619] a)混合水性酸与食用油，得到pH小于约4的酸性混合物；
[0620] b)混合碱与所述酸性混合物，得到pH约6-9的反应混合物，其中步骤a)和/或b)中的混合产生包含至少约60体积％的液滴尺寸为约15μm～约45μm的水相的乳液；
[0621] c)混合选自磷脂酶A、磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C或其组合的酶；和
[0622] d)分离磷脂。
[0623] 在本发明的各示例性方法中，磷水平降低到足以进行物理精制。分离过程可能导致比碱精制潜在更高的产量损失。此外，脱胶过程可能产生废物，不能卵磷脂销售，参见，例如，图2，对于物理精制油的示例性的脱胶过程。因此，这些方法没有取得主要市场份额，并且碱精制过程继续主导行业，针对米糠、大豆、芥花和向日葵。然而，应注意，特殊脱胶过程中使用的磷脂酶C减少磷脂形成，并将磷脂的甘油二酯部分返回到油。
[0624] 在一个方面，本发明提供在胶部分中使用本发明的PI-PLC的方法。在该方法的一个方面，油被加到粗制油中，以产生乳液，导致磷脂酰胆碱、磷脂酰-乙醇胺和磷脂酰肌醇移动到水相(水脱胶)中。在离心后，这些磷脂是水性胶部分的主要组分。胶部分中的磷
脂可以用磷脂酶C或磷脂酶D+磷酸酶(或其他组合，见下)处理，以产生二酰基甘油(DAG)
和磷酸酯。此时，DAG从其他胶组分提取出来，并在适于DAG酯交换的条件下用脂肪酶处理，产生目标甘油三酯(结构性脂质)。
脂可以用磷脂酶C或磷脂酶D+磷酸酶(或其他组合，见下)处理，以产生二酰基甘油(DAG)
和磷酸酯。此时，DAG从其他胶组分提取出来，并在适于DAG酯交换的条件下用脂肪酶处理，产生目标甘油三酯(结构性脂质)。
[0625] 在另一个方面，通过在PLC反应后增大胶的pH，大部分，1，2-DAG可以转化成1，3-DAG例如，通过加入碱。然后，1，3-DAG可以从胶提取出来，并在适当条件与脂肪酶反应，在sn2位使1，3-DAG转酯化，以生成目标结构性甘油三酯。
[0626] 在可选方面，酯交换反应中使用的脂肪酸可以来自于各种来源，包括在粗制油中发现的游离脂肪酸。
[0627] 在一个方面，来自水脱胶的磷脂与本发明的PLC组合使用，以产生结构性脂质。水-脱胶油可以接触PLC和/或PLD(之一或二者可以是本发明的酶)+磷酸酶或这些组合
中的一种，然后加入PLA(可以是本发明的酶)，以将磷降低到适于碱或物理精制的水平。
中的一种，然后加入PLA(可以是本发明的酶)，以将磷降低到适于碱或物理精制的水平。
[0628] 在可选实施方案中，本发明的方法中可以使用的各种酶的组合，包括这些脱胶方法，包括(其中组合中的一种、几种或所有的酶包括本发明的酶)：
[0629] ○PLC+PI-PLC+PLA(在完成PLC反应后加入PLA)；
[0630] ○PLD+磷酸酶+PI-PLC，然后PLA；或，
[0631] ○PLC或(PLC+PI-PLC)+磷脂酸特异性PLA(所有酶一起或顺序加入)。
[0632] 碱精制
[0633] 本发明提供在碱精制中使用磷脂酶(包括本发明的酶)的方法，其中酶用作碱精制助剂。在可选方面，PLC或PLD和/或磷酸酶以滴入方式用在方法中，在碱中和精制过程
之前、期间或之后(连续或间歇精制)。酶的加入量可以根据方法变化。在过程中使用的
水量可以很低，例如，约0.5～5％。可选择地，将碱多次加到过程中。此外，该方法可以在不同温度(25℃～70℃)下进行，使用不同的酸或碱，在不同pH(4-12)下。可以使用例如
比11％的工业标准更浓的浓碱溶液来降低胶量。在可选方面，浓碱溶液的浓度为约12％～
50％，例如，约20％、30％、40％、50％或60％或更多。
之前、期间或之后(连续或间歇精制)。酶的加入量可以根据方法变化。在过程中使用的
水量可以很低，例如，约0.5～5％。可选择地，将碱多次加到过程中。此外，该方法可以在不同温度(25℃～70℃)下进行，使用不同的酸或碱，在不同pH(4-12)下。可以使用例如
比11％的工业标准更浓的浓碱溶液来降低胶量。在可选方面，浓碱溶液的浓度为约12％～
50％，例如，约20％、30％、40％、50％或60％或更多。
[0634] 在一个方面，发明的磷脂酶C酶水解磷脂的甘油基磷酸酯键，产生甘油二酯和水溶性磷酸酯化合物。水解的磷脂移到水相，甘油二酯留在油相，如图3所示。PLC“碱精制
助剂”的一个目的是将在中和中形成的磷脂胶转化成迁移回到油相的二酰基甘油。相比之
下，“PLC脱胶助剂”的一个目的是降低粗制油中的磷至磷当量小于10ppm。
助剂”的一个目的是将在中和中形成的磷脂胶转化成迁移回到油相的二酰基甘油。相比之
下，“PLC脱胶助剂”的一个目的是降低粗制油中的磷至磷当量小于10ppm。
[0635] 碱精制过程中可以使用的酸包括但不限于磷酸、柠檬酸、抗坏血酸、硫酸、富马酸、马来酸、盐酸和/或乙酸。酸用于水合非水化磷脂。可以使用的碱包括但不限于KOH和NaOH。碱用于中和游离脂肪酸。可选择地，磷脂酶，或更特别的是，PLC或PLD和磷酸酶，用于从胶/皂料纯化植物甾醇。
[0636] 本发明的在碱精制前加入磷脂酶的可选实施方案是表达植物中的磷脂酶。在另一个实施方案中，磷脂酶在植物、种子或其他植物部分的破碎过程中加入。可选择地，磷脂酶在破碎之后但在精制之前加入(即，在保持容器中)。此外，磷脂酶在精制预处理中加入，有酸或没有酸。
[0637] 如上所述，本发明的另一个实施方案是在碱精制过程中加入磷脂酶。在该方法中，酸和碱的水平随着磷的水平和游离脂肪酸的水平变化。此外，在该方法中使用宽温度和pH值范围，取决于使用的酶类型。
[0638] 在本发明的另一个实施方案中，在碱精制后加入磷脂酶(图5)。在一个例子中，在分离之前在剧烈混合器中或在保留混合器中加入磷脂酶。可选择地，磷脂酶在加热步骤之后加入。在另一个实施方案中，磷脂酶在离心步骤中加入。在另一个实施方案中，磷脂酶加到皂料中。可选择地，磷脂酶加到洗涤水中。在另一个例子中，磷脂酶在漂白和/或除臭步骤中加入。
[0639] 在一个方面，在漂白和除臭之前，本发明的磷脂酶，例如，磷脂酶C酶将水解中和的粗制和脱胶油中的来自水化和非水化磷脂的磷脂。本发明的示例性“碱精制”方法示于图4和图6。图4包括静态混合器(30～60min，50～60℃，pH 5～6.5)和保持混合器(3～
10min，20～40℃)的示例性时间、温度和pH。目标酶可以作为滴入产品加到现有的碱中和
过程中，如图4所示。在这方面，如果在加入碱后再加入，则酶将不会被要求承受极端的pH值。如图6所示(酶“前端加载”的示例性过程)，任何磷脂酶，包括例如本发明的磷脂酶，如PLC、PI-PLC、PLB、PLA和/或PLC，可以用在粗制油脱胶方法中，描述在例如Bailey’s Industrial Oil & Fat Products v.4(ed.Y.H.Hui)。图7和图8分别示出2个或3个离心
步骤用在过程中的本发明方法的变形，可以用于处理任何油，例如，植物油，如粗制大豆油，如图中所示。图8的示例性方法在碱精制(除了碱精制之后和水洗涤之前以及水洗涤之后
的离心步骤之外)之前具有离心步骤，而图7的示例性方法在碱精制不具有离心步骤。图
9示出使用酸处理和在脱胶步骤之前具有离心步骤的该方法的另一种示例性变形；该示例
性方法可以用于处理任何油，例如，植物油，如粗制大豆油，如图中所示。
10min，20～40℃)的示例性时间、温度和pH。目标酶可以作为滴入产品加到现有的碱中和
过程中，如图4所示。在这方面，如果在加入碱后再加入，则酶将不会被要求承受极端的pH值。如图6所示(酶“前端加载”的示例性过程)，任何磷脂酶，包括例如本发明的磷脂酶，如PLC、PI-PLC、PLB、PLA和/或PLC，可以用在粗制油脱胶方法中，描述在例如Bailey’s Industrial Oil & Fat Products v.4(ed.Y.H.Hui)。图7和图8分别示出2个或3个离心
步骤用在过程中的本发明方法的变形，可以用于处理任何油，例如，植物油，如粗制大豆油，如图中所示。图8的示例性方法在碱精制(除了碱精制之后和水洗涤之前以及水洗涤之后
的离心步骤之外)之前具有离心步骤，而图7的示例性方法在碱精制不具有离心步骤。图
9示出使用酸处理和在脱胶步骤之前具有离心步骤的该方法的另一种示例性变形；该示例
性方法可以用于处理任何油，例如，植物油，如粗制大豆油，如图中所示。
[0640] 在一个方面，本发明的磷脂酶能够使磷被除去至物理精制中可接受的低水平。在一个方面，在漂白和除臭之前，本发明的PLC将水解粗制油中的来自水化和非水化磷脂的
磷脂。目标酶可以作为滴入产品加到现有的脱胶操作中，参见，例如，图5。鉴于在商用设备中的亚最佳混合，可能需要酸使非水化磷脂在油/水界面与酶接触。因此，在一个方面，使用酸稳定的本发明的PLC。
磷脂。目标酶可以作为滴入产品加到现有的脱胶操作中，参见，例如，图5。鉴于在商用设备中的亚最佳混合，可能需要酸使非水化磷脂在油/水界面与酶接触。因此，在一个方面，使用酸稳定的本发明的PLC。
[0641] 在一个方面，本发明的PLC脱胶助剂可以避免表4中所示的一个或全部三个区域的损失。由于除去磷脂，PLC过程中相关的损失按质量计估计为约0.8％vs.5.2％。
[0642] 表4：PLC产品解决的损失
[0643]碱精制助剂 脱胶助剂
1)胶配制&分离中的油损失2.1％ X X
2)碱加入时的皂化油3.1％ X
3)漂白时粘土中带的油*＜1.0％ X X
总产率损失～5.2％ ～2.1％ ～5.2％
1)胶配制&分离中的油损失2.1％ X X
2)碱加入时的皂化油3.1％ X
3)漂白时粘土中带的油*＜1.0％ X X
总产率损失～5.2％ ～2.1％ ～5.2％
[0644] 本发明的该方法的额外潜在优点包括下面的：
[0645] ●减少了吸附剂-对于较低(＜5ppm)的磷要求更少的吸附剂
[0646] ●较低的化学品使用-与非水化磷脂的水合相关的化学和处理成本更少
[0647] ●较低的废物产生-从油除去磷需要的水更少
[0648] 通过本发明的方法处理(例如，“脱胶”)的油包括植物油籽，例如，大豆油、菜籽油、米糠油和葵花籽油。在一个方面，与现有碱精制过程相比，本发明的“PLC碱精制助剂”可以节省1.2％。精制助剂应用解决了对于卵磷脂已经脱胶的大豆油并且这些也从值/负荷计算中排除。
[0649] 本发明方法的性能目标可以根据应用和更具体是酶加入点而有所不同，参见表5。
[0650] 表5：应用的性能目标
[0651]
[0652]
[0653] 可以使用本发明的磷脂酶例如磷脂酶A1的其他方法能够将非水化天然磷脂转化成水化形式。在一个方面，酶对热敏感，这可能是可取的，因为加热油可以会破坏酶。然而，脱胶反应必须调整到pH 4-5和60℃，以适应这种酶。在300单位/kg油饱和剂量时，该示
例性方法成功地使之前吸水的-脱胶油磷含量降到≤10ppm P。优点可以是降低的H2O含
量以及带来的用途、处理和废物节约。表6列出本发明酶的工业应用的示例性应用：
例性方法成功地使之前吸水的-脱胶油磷含量降到≤10ppm P。优点可以是降低的H2O含
量以及带来的用途、处理和废物节约。表6列出本发明酶的工业应用的示例性应用：
[0654] 表6：示例性应用
[0655]
[0656] 除了这些不同“脱胶”方法之外，本发明的磷脂酶可以用在任何植物油处理步骤中。例如，本发明的磷脂酶可以用于在任何植物油处理步骤中代替PLA，例如，磷脂酶A2。在本发明的方法中被“处理”或“脱胶”的油包括大豆油、菜籽油、玉米油、棕榈仁油、芥花油、葵花籽油、芝麻油、花生油、米糠油等。来自该方法的主要产品包括甘油三酯。
[0657] 在一个示例性方法中，当酶被加入并与粗制油反应时，磷脂酶的用量为约10-10,000单位，或者，可选择地，约100-2,000单位，每1kg粗制油。酶处理进行5min至
10小时，在温度30℃～90℃下，或可选择地，约40℃～70℃。这些条件可以取决于酶的最
佳温度而有所不同。加入溶解酶的水量为5-1,000重量份/100重量份的粗制油，或者，可
选择地，约10～200重量份/100重量份的粗制油。
10小时，在温度30℃～90℃下，或可选择地，约40℃～70℃。这些条件可以取决于酶的最
佳温度而有所不同。加入溶解酶的水量为5-1,000重量份/100重量份的粗制油，或者，可
选择地，约10～200重量份/100重量份的粗制油。
[0658] 在完成这种酶处理后，用适当的装置，如离心分离器分离酶液体，并且得到经处理的油。在该方法中通过酶分解胶状物质而产生的含磷化合物几乎全部转移到水相中，从油相中除去。在完成酶处理后，如果有必要，还可以用水或有机或无机酸或者用盐溶液洗涤处理的油，例如，乙酸、柠檬酸、磷酸、琥珀酸和等效酸。
[0660] 在磷脂酶介导的物理精制助剂用的一个示例性方法中，水和酶加到粗制油(例如，粗制植物油)中。在一个方面，本发明的PLC或PLD和磷酸酶用在该方法中。在磷脂酶
介导的物理精制中，水量可以很低，即0.5-5％，处理时间应该很短(小于2小时，或者，小于
60分钟，或者，小于30分钟，或者，小于15分钟，或者，小于5分钟)。处理可以在不同温度下运行(25℃～70℃)，使用不同的酸和/或碱，在不同的pH值(例如，3-10)下。
介导的物理精制中，水量可以很低，即0.5-5％，处理时间应该很短(小于2小时，或者，小于
60分钟，或者，小于30分钟，或者，小于15分钟，或者，小于5分钟)。处理可以在不同温度下运行(25℃～70℃)，使用不同的酸和/或碱，在不同的pH值(例如，3-10)下。
[0661] 在替代方面，首先进行水脱胶以通过离心收集卵磷脂，然后加入本发明的PLC或PLC以除去非水化磷脂(该过程应该在低水浓度下进行)。在另一个方面，粗制油的水脱胶
到小于10ppm(食用油)，并且随后进行物理精制(对于生物柴油，小于50ppm)。在一个方
面，加入乳化剂和/或粗制油被加到剧烈混合器以促进混合。可选择地，加入破乳剂和/或
粗制油被加热以促进水相的分离。在另一个方面，酸被加入以促进非水化磷脂的水合。此
外，磷脂酶可以用于介导植物甾醇从胶/皂料的纯化。
到小于10ppm(食用油)，并且随后进行物理精制(对于生物柴油，小于50ppm)。在一个方
面，加入乳化剂和/或粗制油被加到剧烈混合器以促进混合。可选择地，加入破乳剂和/或
粗制油被加热以促进水相的分离。在另一个方面，酸被加入以促进非水化磷脂的水合。此
外，磷脂酶可以用于介导植物甾醇从胶/皂料的纯化。
[0662] 在一个方面，本发明提供用于油脱胶的组合物和方法(可以包括使用本发明的磷脂酶)，包括使用不同量的酸和碱而没有形成皂料。使用本发明的用于油脱胶的这一方面，酸(包括磷酸和/或柠檬酸)可以用于在高磷油(包括大豆、芥花和向日葵)中水合非水
化磷脂。一旦磷脂被水合，可以使用碱加入来提高水相的pH：碱的加入量可以产生对于酶
活性有利的pH值，但不会导致在油中形成明显的皂料部分。由于皂料未形成，因此油中的
游离脂肪酸可以在下游除去，在脱胶步骤后，在漂白和除臭过程中。
化磷脂。一旦磷脂被水合，可以使用碱加入来提高水相的pH：碱的加入量可以产生对于酶
活性有利的pH值，但不会导致在油中形成明显的皂料部分。由于皂料未形成，因此油中的
游离脂肪酸可以在下游除去，在脱胶步骤后，在漂白和除臭过程中。
[0663] 本发明的酶用来改善油提取和油脱胶(例如，植物油)。在一个方面，本发明的PLC和至少一个植物细胞壁降解菌(例如，纤维素酶、半纤维素酶等，软化壁并增大提取产率)用于本发明的方法中。在这种使用本发明的酶以改善油提取和油脱胶的示例性方法中，本
发明的磷脂酶C以及其他水解酶(例如，纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶和/或磷酸
酶)在油生产相关的破碎步骤中使用(包括但不限于大豆、芥花、向日葵、米糠油)。通过在油提取之前使用酶或代替溶剂提取，可以增加油产率并降低水化和非水化磷脂在粗制油中
的量。非水化磷脂的减少可能是由于在与钙或镁复合之前潜在的非水化磷脂转化为二酰基
甘油和相应的磷酸酯。粗制油中磷脂的整体减少将导致精制中的产率提高，优点在于消除
了对在漂白和除臭之前的单独脱胶步骤的需求。
发明的磷脂酶C以及其他水解酶(例如，纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶和/或磷酸
酶)在油生产相关的破碎步骤中使用(包括但不限于大豆、芥花、向日葵、米糠油)。通过在油提取之前使用酶或代替溶剂提取，可以增加油产率并降低水化和非水化磷脂在粗制油中
的量。非水化磷脂的减少可能是由于在与钙或镁复合之前潜在的非水化磷脂转化为二酰基
甘油和相应的磷酸酯。粗制油中磷脂的整体减少将导致精制中的产率提高，优点在于消除
了对在漂白和除臭之前的单独脱胶步骤的需求。
[0664] 在一个方面，本发明提供在改进的“有机精制方法”中使用本发明的磷脂酶(例如，本发明的磷脂酶特异性磷酸水解酶)或另一种磷脂酶的方法，可以包括在柠檬酸保持
槽中加入酶(例如，PI-PLC)。
槽中加入酶(例如，PI-PLC)。
[0665] 本发明的酶可以用在任何油处理方法中，例如，脱胶或等效过程。例如，本发明的酶可以用在美国专利No.5,558,781；5,264,367；6,001,640中记载的方法中。USPN
5,558,781中记载的方法使用磷脂酶A1、A2或B，基本上使油中的卵磷脂破碎，起到乳化剂
的作用。
5,558,781中记载的方法使用磷脂酶A1、A2或B，基本上使油中的卵磷脂破碎，起到乳化剂
的作用。
[0666] 本发明的酶和方法可以用在降低含有大量非水化磷的食用油中的含磷组分的方法中，其中使用本发明的磷脂酶，例如，具有磷脂酶A和/或B活性的多肽，例如被描述在EP专利No.EP 0869167中。在一个方面，食用油是粗制油，所谓的“非脱胶油”。在一个方面，该方法处理非脱胶油，包括压制油或提取油或其混合物，来自例如油菜籽、大豆、芝麻、花生、玉米、米糠或向日葵。粗制油中的磷脂含量可以为0.5～3％w/w，对应于磷含量200～
1200ppm，或者，在250～1200ppm的范围。除了磷脂之外，粗制油也可以含有小浓度的碳水化合物、糖类化合物和Ca、Mg和Fe金属/磷脂酸钙复合物。在一个方面，该方法包括用本
发明的磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂，从而水解脂肪酰基。在一个方面，磷脂或溶血磷脂包括卵磷脂或溶血卵磷脂。在该方法的一个方面，食用油的磷含量为约50～250ppm，该方法包
括用本发明的磷脂酶处理油，从而水解大部分磷脂并从油分离含有水解的磷脂的水相。在
一个方面，在酶脱胶处理之前，油被水脱胶。在一个方面，该方法提供动物饲料的生产，包括混合本发明的磷脂酶与饲料物质和至少一种磷脂。
1200ppm，或者，在250～1200ppm的范围。除了磷脂之外，粗制油也可以含有小浓度的碳水化合物、糖类化合物和Ca、Mg和Fe金属/磷脂酸钙复合物。在一个方面，该方法包括用本
发明的磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂，从而水解脂肪酰基。在一个方面，磷脂或溶血磷脂包括卵磷脂或溶血卵磷脂。在该方法的一个方面，食用油的磷含量为约50～250ppm，该方法包
括用本发明的磷脂酶处理油，从而水解大部分磷脂并从油分离含有水解的磷脂的水相。在
一个方面，在酶脱胶处理之前，油被水脱胶。在一个方面，该方法提供动物饲料的生产，包括混合本发明的磷脂酶与饲料物质和至少一种磷脂。
[0667] 本发明的酶和方法可以用在油脱胶的方法中，例如被描述在WO 98/18912中。本发明的磷脂酶可以用于降低食用油中的磷脂含量。该方法可以包括用本发明的磷脂酶处
理油，从而水解大部分磷脂并从油分离含有水解的磷脂的水相。该方法适用于纯化含有磷
脂的任何食用油，例如，植物油，如大豆油、米糠油、菜籽油和葵花籽油、鱼油、藻类和动物油等。在酶处理之前，植物油优选被预处理，以除去粘质物(粘液)，例如通过湿法精制。油
可以含有约50～250ppm或50～约1500ppm或更高的磷，作为在用磷脂酶开始处理时的磷
脂，并且本发明的该方法可以降低该值到小于约5～10ppm。
理油，从而水解大部分磷脂并从油分离含有水解的磷脂的水相。该方法适用于纯化含有磷
脂的任何食用油，例如，植物油，如大豆油、米糠油、菜籽油和葵花籽油、鱼油、藻类和动物油等。在酶处理之前，植物油优选被预处理，以除去粘质物(粘液)，例如通过湿法精制。油
可以含有约50～250ppm或50～约1500ppm或更高的磷，作为在用磷脂酶开始处理时的磷
脂，并且本发明的该方法可以降低该值到小于约5～10ppm。
[0668] 本发明的酶可以用在1993年4月25日提交的JP申请No.：H5-132283中记载的方法中，包括纯化油和脂肪的方法，包括以下步骤：将油和脂肪中存在的磷脂转化成含有磷酸基团的水溶性物质并作为水溶性物质除去它们。酶作用被用来转化成水溶性物质。具有
磷脂酶C活性的酶优选用作该酶。
磷脂酶C活性的酶优选用作该酶。
[0669] 本发明的酶可以用在被描述作为“有机精制过程”(ORP)(IPH，Omaha，NE)的方法中，这是一种精制种子油的方法。ORP与传统化学精制相比的优点在于，包括提高的精制油产率，附加值产品，降低的资本成本和较低的环境成本。
[0670] 本发明的酶可以用在处理半加工或精制而成的油或脂肪、动物或植物、原材料的方法中，包括向油或脂肪中加入至少一种本发明的酶，从而使油中所含的非甘油类化合物
水解和/或脱聚，例如，记载在EP申请No.82870032.8中。用于使油中的非甘油类化合物
水解和/或脱聚的本发明示例性方法是：
水解和/或脱聚，例如，记载在EP申请No.82870032.8中。用于使油中的非甘油类化合物
水解和/或脱聚的本发明示例性方法是：
[0671] 1)在油和脂肪的混合物中加入之前溶解在少量适当溶剂(例如，水)中的本发明的酶或酶复合物。一定量的溶剂是可能的，但是对于酶选择无毒的和适当的溶剂。这种加
入可以使用连续装载以及连续工艺的方法进行。根据该方法，需要加到油和脂肪中的酶量
可以根据酶和半要处理的产品变化，为约5～400ppm或约20～400ppm；例如，对于1000kg
油或脂肪，0.005kg～0.4kg酶，优选5～100ppm，即，对于1000kg油，0.005～0.1kg酶，这些值被理解为是针对浓缩的酶，即，没有稀释剂或溶剂。
入可以使用连续装载以及连续工艺的方法进行。根据该方法，需要加到油和脂肪中的酶量
可以根据酶和半要处理的产品变化，为约5～400ppm或约20～400ppm；例如，对于1000kg
油或脂肪，0.005kg～0.4kg酶，优选5～100ppm，即，对于1000kg油，0.005～0.1kg酶，这些值被理解为是针对浓缩的酶，即，没有稀释剂或溶剂。
[0672] 2)使油或脂肪通过在固体或半固体载体上的本发明酶的固定或不溶性过滤床，优选呈现出多孔或纤维状结构。在这种技术中，酶被捕集在载体的多孔纤维结构的微腔中。这些包括例如树脂或合成聚合物、碳酸纤维素、凝胶如琼脂糖、聚合物或共聚物具有多孔结构的细丝，在微腔的溶液中捕集酶的小液滴。关于酶浓度，可以达到载体的饱和状态。
[0673] 3)油和脂肪在稀释酶溶液中分散成微液滴，在可选方面，含有约0.05～4％或含有约0.2～4％的体积的本发明的酶。这种技术描述在例如比利时专利No.595,219中。高
度数米的带有锥形盖的圆柱子用稀释的酶溶液填充。为此，选择在将要处理的油或脂肪中
无毒且不互溶的溶剂，优选水。柱子的底部装有分布系统，其中油或脂肪以极为分散的形式
2
连续注入(大约10,000流理/m)。因此，形成无限多的油或脂肪的液滴，在酶的溶液中慢
慢上升并到达表面，在反应器的锥形盖的顶部连续疏散。
度数米的带有锥形盖的圆柱子用稀释的酶溶液填充。为此，选择在将要处理的油或脂肪中
无毒且不互溶的溶剂，优选水。柱子的底部装有分布系统，其中油或脂肪以极为分散的形式
2
连续注入(大约10,000流理/m)。因此，形成无限多的油或脂肪的液滴，在酶的溶液中慢
慢上升并到达表面，在反应器的锥形盖的顶部连续疏散。
[0674] 在用本发明的酶处理之前，棕榈油可以被预处理。例如，约30kg的原棕榈油被加热到+50℃。在蒸馏水中制备纤维素酶和果胶酶的1％溶液。在强烈搅拌下几分钟内将600g
各溶液加到油的水溶液中。油在温和搅拌下保持于+50℃，总反应时间2小时。然后，温度
升到+90℃，使酶失活，并制备用于过滤和进一步处理的混合物。油真空干燥并用过滤助剂过滤。
各溶液加到油的水溶液中。油在温和搅拌下保持于+50℃，总反应时间2小时。然后，温度
升到+90℃，使酶失活，并制备用于过滤和进一步处理的混合物。油真空干燥并用过滤助剂过滤。
[0675] 本发明的酶可以用在EP专利EP 0513709B2记载的方法中。例如，本发明提供通过使用本发明的磷脂酶的酶分解来降低动物和植物油中的含磷组分含量的方法。在可选方
面，磷含量为约50～1500ppm或者约50～250ppm的预脱粘质物的动物和植物油与有机羧
酸搅拌，得到的混合物的pH值设置为约pH 4～pH 6，在湍流搅拌下将含有本发明的磷脂酶
A1、A2或B的酶溶液加到混合容器中的混合物中，形成微细液滴，形成相对于油0.5～5重
量％的乳液，所述乳化在湍流运动下通过至少一个后续反应管进行，反应时间0.1～10小
时，温度20～80℃，分离水溶液后，处理油的磷含量低于5ppm。
面，磷含量为约50～1500ppm或者约50～250ppm的预脱粘质物的动物和植物油与有机羧
酸搅拌，得到的混合物的pH值设置为约pH 4～pH 6，在湍流搅拌下将含有本发明的磷脂酶
A1、A2或B的酶溶液加到混合容器中的混合物中，形成微细液滴，形成相对于油0.5～5重
量％的乳液，所述乳化在湍流运动下通过至少一个后续反应管进行，反应时间0.1～10小
时，温度20～80℃，分离水溶液后，处理油的磷含量低于5ppm。
[0676] 有机精制过程适用于粗制和脱胶油。该方法利用在在控制过程条件下有机酸的直线加入，与传统的离心分离相结合。从植物油磷脂(″VOP″)天然分离的水被回收和重复
使用。作为有机精制过程的结果，总的水使用可以大大减少。
使用。作为有机精制过程的结果，总的水使用可以大大减少。
[0677] 本发明的磷脂酶和方法还可以用在食用油的酶处理中，例如被描述在美国专利No.6,162,623中。在这个示例性的方法中，本发明提供两性酶。例如，通过制备含有连续疏水相和包含有酶和酶用载体的分散水相的乳液并从分散相除去水直到该相变成固体酶包
被的颗粒，从而可以固定该酶。该酶可以是脂肪酶。固定化脂肪酶可以用于脂肪酶催化的
反应，如酯的单、双或甘油三酯的酯交换，甘油三酯油的脱酸化，或当脂肪酶是磷脂酶时从甘油三酯油除去磷脂。水相可以含有发酵液体，食用甘油三酯油可以是疏水相，载体包括糖类、淀粉、葡聚糖、水溶性纤维素衍生物和发酵残渣。该示例性的方法可以用于处理甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯、甘油、磷脂、糖脂质或脂肪酸，这些可以在疏水相。在一个方面，用于从甘油三酯油除去磷脂的该方法包括混合含有磷脂的甘油三酯油与含有本发明的磷脂
酶的制剂；水解磷脂成溶血磷脂；从油中分离水解的磷脂，其中所述磷脂酶是固定化磷脂
酶。
被的颗粒，从而可以固定该酶。该酶可以是脂肪酶。固定化脂肪酶可以用于脂肪酶催化的
反应，如酯的单、双或甘油三酯的酯交换，甘油三酯油的脱酸化，或当脂肪酶是磷脂酶时从甘油三酯油除去磷脂。水相可以含有发酵液体，食用甘油三酯油可以是疏水相，载体包括糖类、淀粉、葡聚糖、水溶性纤维素衍生物和发酵残渣。该示例性的方法可以用于处理甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯、甘油、磷脂、糖脂质或脂肪酸，这些可以在疏水相。在一个方面，用于从甘油三酯油除去磷脂的该方法包括混合含有磷脂的甘油三酯油与含有本发明的磷脂
酶的制剂；水解磷脂成溶血磷脂；从油中分离水解的磷脂，其中所述磷脂酶是固定化磷脂
酶。
[0678] 本发明的磷脂酶和方法还可以用在食用油的酶处理中，例如被描述在美国专利No.6,127,137中。该示例性的方法水解完整磷脂中的脂肪酰基。在该示例性的方法中使
用的本发明的磷脂酶没有脂肪酶活性并且在非常低的pH值下是活性的。这些特性使得它
非常适合用在油脱胶中，因为油的酶和碱性水解(皂化)都可以被抑制。在一个方面，本发
明提供水解磷脂或溶血磷脂中的脂肪酰基的方法，包括用水解磷脂中的脂肪酰基并且基本
上没有脂肪酶活性的磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂。在一个方面，本发明的磷脂酶的最佳温
度为约50℃，在pH 3～pH 4下测量10分钟，最佳pH为约pH 3，在40℃下测量约10分钟。
在一个方面，磷脂或溶血磷脂包括卵磷脂或溶血卵磷脂。在一个方面，在水解大部分磷脂
后，从油分离含有水解的磷脂的水相。在一个方面，本发明提供从食用油除去磷脂的方法，包括用本发明的磷脂酶的水溶液分散体在pH 1.5～3下处理油，并从油分离含有水解的磷
脂的水相。在一个方面，在用磷脂酶处理之前，油被处理以除去粘质物。在一个方面，在用磷脂酶处理之前的油含有对应于50～250ppm磷的量的磷脂。在一个方面，用磷脂酶处理
在30℃～45℃下进行1～12小时，磷脂酶剂量为0.1～10mg/l，在0.5～5％水存在下。
用的本发明的磷脂酶没有脂肪酶活性并且在非常低的pH值下是活性的。这些特性使得它
非常适合用在油脱胶中，因为油的酶和碱性水解(皂化)都可以被抑制。在一个方面，本发
明提供水解磷脂或溶血磷脂中的脂肪酰基的方法，包括用水解磷脂中的脂肪酰基并且基本
上没有脂肪酶活性的磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂。在一个方面，本发明的磷脂酶的最佳温
度为约50℃，在pH 3～pH 4下测量10分钟，最佳pH为约pH 3，在40℃下测量约10分钟。
在一个方面，磷脂或溶血磷脂包括卵磷脂或溶血卵磷脂。在一个方面，在水解大部分磷脂
后，从油分离含有水解的磷脂的水相。在一个方面，本发明提供从食用油除去磷脂的方法，包括用本发明的磷脂酶的水溶液分散体在pH 1.5～3下处理油，并从油分离含有水解的磷
脂的水相。在一个方面，在用磷脂酶处理之前，油被处理以除去粘质物。在一个方面，在用磷脂酶处理之前的油含有对应于50～250ppm磷的量的磷脂。在一个方面，用磷脂酶处理
在30℃～45℃下进行1～12小时，磷脂酶剂量为0.1～10mg/l，在0.5～5％水存在下。
[0679] 本发明的磷脂酶和方法还可以用在食用油的酶处理中，例如被描述在美国专利No.6,025,171中。在该示例性的方法中，通过制备含有连续疏水相(例如，甘油三酯油)和
包含两性酶(例如，脂肪酶或本发明的磷脂酶)和在水相中部分溶解和部分不溶的载体的
分散水相的乳液并从水相除去水直到该相变成固体酶包被的载体颗粒，从而可以固定本发
明的酶。载体材料的不溶部分可以是在水和油中不溶的材料，或者由于水相已经用水溶性
材料饱和而处于不溶形式的水溶性材料。水相可以用含有发酵残渣和能够用作载体材料的
生物质的粗制脂肪酶发酵液体形成。固定化脂肪酶用于油中的酯重排和脱酸化。在反应后，固定化的酶通过加入水得到载体的部分溶液而可再生用于后续反应，其中产生的酶和含有
载体的水相分散在疏水相中，水再次蒸发形成酶包被的载体颗粒。
包含两性酶(例如，脂肪酶或本发明的磷脂酶)和在水相中部分溶解和部分不溶的载体的
分散水相的乳液并从水相除去水直到该相变成固体酶包被的载体颗粒，从而可以固定本发
明的酶。载体材料的不溶部分可以是在水和油中不溶的材料，或者由于水相已经用水溶性
材料饱和而处于不溶形式的水溶性材料。水相可以用含有发酵残渣和能够用作载体材料的
生物质的粗制脂肪酶发酵液体形成。固定化脂肪酶用于油中的酯重排和脱酸化。在反应后，固定化的酶通过加入水得到载体的部分溶液而可再生用于后续反应，其中产生的酶和含有
载体的水相分散在疏水相中，水再次蒸发形成酶包被的载体颗粒。
[0680] 本发明的磷脂酶和方法还可以用在食用油的酶处理中，例如被描述在美国专利No.6,143,545中。该示例性的方法用于使用本发明的磷脂酶减少具有高含量非水化磷的
食用油中的含磷组分含量。在一个方面，该方法用于减少在具有至少50ppm的非水化磷含
量的食用油中的含磷组分含量，通过在60℃下预处理食用油测量，包括在30分钟内加入柠
檬酸在水中的溶液(加入的水vs.油＝4.8％w/w；(柠檬酸)水相中＝106mM，水/油乳液
中＝4.6mM)；将10ml油乳液中的预处理水转移到管中；在沸水浴中加热乳液30分钟；在
5000rpm下离心10分钟，将约8ml上层(油)相转移到新的管，放置沉降24小时；从上层透
明相取出2g，用于测量食用油中的非水化磷含量(ppm)。该方法还可以包括将pH约5～8
的油与本发明的磷脂酶A或B(例如，PLA1、PLA2或PLB)的水溶液接触，溶液在油中乳化，
直到油的磷含量减小到小于11ppm，然后从处理的油分离水相。
食用油中的含磷组分含量。在一个方面，该方法用于减少在具有至少50ppm的非水化磷含
量的食用油中的含磷组分含量，通过在60℃下预处理食用油测量，包括在30分钟内加入柠
檬酸在水中的溶液(加入的水vs.油＝4.8％w/w；(柠檬酸)水相中＝106mM，水/油乳液
中＝4.6mM)；将10ml油乳液中的预处理水转移到管中；在沸水浴中加热乳液30分钟；在
5000rpm下离心10分钟，将约8ml上层(油)相转移到新的管，放置沉降24小时；从上层透
明相取出2g，用于测量食用油中的非水化磷含量(ppm)。该方法还可以包括将pH约5～8
的油与本发明的磷脂酶A或B(例如，PLA1、PLA2或PLB)的水溶液接触，溶液在油中乳化，
直到油的磷含量减小到小于11ppm，然后从处理的油分离水相。
[0681] 本发明的磷脂酶和方法还可以用在食用油的酶处理中，例如在美国专利No.5,532,163中所描述的。本发明提供用于精制油和脂肪的方法，通过该方法可以有效分
解和去除将要处理的油和脂肪中的磷脂。在一个方面，本发明提供用于精制油和脂肪的方
法，包括在乳液中使油和脂肪与本发明的酶(例如，具有活性的酶)发生反应，以分解与甘
油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键(例如，本发明的PLA2)；在另一种方法中，酶处理的油和脂
肪用水或酸性水溶液洗涤。在一个方面，在洗涤步骤中使用的酸性水溶液是至少一种酸的
溶液，例如，柠檬酸、乙酸、磷酸及其盐。在一个方面，通过每100重量份的油和脂肪使用30重量份以上的水形成乳化条件。由于油和脂肪能够在不采用常规碱精制步骤的情况下纯
化，因此能够减少洗涤废水和工业废物的产生。此外，由于在本发明的方法中不会发生因包含在废物中造成的中性油和脂肪损失，从而提高了油的回收率。在一个方面，本发明提供用于精制含有约100～10,000ppm磷脂的油和脂肪的方法，包括：在乳化条件下，使所述油和
脂肪与本发明的具有活性的酶反应，以分解甘油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键。在一个方面，本发明提供用于精制含有约100～10,000ppm磷脂的油和脂肪的方法，包括：在乳化条件
下，使油和脂肪与本发明的具有活性的酶反应，以分解甘油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键；接下来用洗涤水洗涤处理的油和脂肪。
解和去除将要处理的油和脂肪中的磷脂。在一个方面，本发明提供用于精制油和脂肪的方
法，包括在乳液中使油和脂肪与本发明的酶(例如，具有活性的酶)发生反应，以分解与甘
油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键(例如，本发明的PLA2)；在另一种方法中，酶处理的油和脂
肪用水或酸性水溶液洗涤。在一个方面，在洗涤步骤中使用的酸性水溶液是至少一种酸的
溶液，例如，柠檬酸、乙酸、磷酸及其盐。在一个方面，通过每100重量份的油和脂肪使用30重量份以上的水形成乳化条件。由于油和脂肪能够在不采用常规碱精制步骤的情况下纯
化，因此能够减少洗涤废水和工业废物的产生。此外，由于在本发明的方法中不会发生因包含在废物中造成的中性油和脂肪损失，从而提高了油的回收率。在一个方面，本发明提供用于精制含有约100～10,000ppm磷脂的油和脂肪的方法，包括：在乳化条件下，使所述油和
脂肪与本发明的具有活性的酶反应，以分解甘油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键。在一个方面，本发明提供用于精制含有约100～10,000ppm磷脂的油和脂肪的方法，包括：在乳化条件
下，使油和脂肪与本发明的具有活性的酶反应，以分解甘油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键；接下来用洗涤水洗涤处理的油和脂肪。
[0682] 本发明的磷脂酶和方法还可以用在食用油的酶处理中，例如，在美国专利No.5,264,367中所描述的。已经通过湿法精制去除粘质物的食用植物油或动物油(诸如大
豆油等油)，通过使油与本发明的酶(例如，磷脂酶A1、A2或B)的水溶液接触，然后使水相
与处理的油分离，从而利用酶分解降低了含磷组分的含量和铁含量。在一个方面，本发明提供用于减少已经精制去除粘质物的油中含磷和含铁组分的含量的酶促法。已经精制去除粘
质物的油能够用本发明的酶处理，例如，磷脂酶C、A1、A2或B。能够实现磷含量小于5ppm
和铁含量小于1ppm。低的铁含量能够有利于油的稳定性。
豆油等油)，通过使油与本发明的酶(例如，磷脂酶A1、A2或B)的水溶液接触，然后使水相
与处理的油分离，从而利用酶分解降低了含磷组分的含量和铁含量。在一个方面，本发明提供用于减少已经精制去除粘质物的油中含磷和含铁组分的含量的酶促法。已经精制去除粘
质物的油能够用本发明的酶处理，例如，磷脂酶C、A1、A2或B。能够实现磷含量小于5ppm
和铁含量小于1ppm。低的铁含量能够有利于油的稳定性。
[0683] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于制备转酯化的油，例如，在美国专利No.5,288,619中所描述的。本发明提供用于制备具有低的反式酸和低的中链脂肪酸含量
的人造黄油的酶促酯交换的方法。所述方法包括以下步骤：提供含有硬脂酸原料和食用液
体植物油的酯交换反应混合物，利用1-、3-位特异性脂肪酶使硬脂酸原料和植物油进行酯
交换，然后最终氢化处理脂肪酸混合物，以提供用于植物油循环反应的循环硬脂酸原料。本发明还提供用于制备转酯化的油的逆流法。所述方法包括以下步骤：提供含有1-、3-位特
异性脂肪酶的酯交换反应区，引入植物油到酯交换区，引入硬脂酸原料，传导超临界气体或亚临界液态气体逆流流体，在反应区中甘油三酯流与硬脂酸或硬脂酸单酯流进行酯交换反
应，回收转酯化的甘油三酯人造黄油，回收逆流流体相，氢化处理转酯化的硬脂酸或硬脂酸单酯以提供氢化的循环硬脂酸原料，并引入氢化的循环硬脂酸原料到反应区。
的人造黄油的酶促酯交换的方法。所述方法包括以下步骤：提供含有硬脂酸原料和食用液
体植物油的酯交换反应混合物，利用1-、3-位特异性脂肪酶使硬脂酸原料和植物油进行酯
交换，然后最终氢化处理脂肪酸混合物，以提供用于植物油循环反应的循环硬脂酸原料。本发明还提供用于制备转酯化的油的逆流法。所述方法包括以下步骤：提供含有1-、3-位特
异性脂肪酶的酯交换反应区，引入植物油到酯交换区，引入硬脂酸原料，传导超临界气体或亚临界液态气体逆流流体，在反应区中甘油三酯流与硬脂酸或硬脂酸单酯流进行酯交换反
应，回收转酯化的甘油三酯人造黄油，回收逆流流体相，氢化处理转酯化的硬脂酸或硬脂酸单酯以提供氢化的循环硬脂酸原料，并引入氢化的循环硬脂酸原料到反应区。
[0684] 在一个方面，通过适当地使用本发明的磷脂酶C以除去在sn-3位的磷酸基团，然后进行1，3脂肪酶酰基酯合成，高度不饱和的磷脂化合物可以转化成甘油三酯。2-取代的
磷脂可以直接用作功能食品成分，或者随后可以在反应器160中使用本发明的固定化磷脂
酶C选择性地水解，产生1-甘油二酯，然后进行在此所述的酶酯化，产生具有2-取代的多
不饱和脂肪酸组分的甘油三酯产物。
磷脂可以直接用作功能食品成分，或者随后可以在反应器160中使用本发明的固定化磷脂
酶C选择性地水解，产生1-甘油二酯，然后进行在此所述的酶酯化，产生具有2-取代的多
不饱和脂肪酸组分的甘油三酯产物。
[0685] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于例如美国专利No.6,001,640所描述的植物油酶脱胶法中。本发明的此方法包括在生产食用油中的脱胶步骤。通过先前的水脱胶法去除
水化磷脂的植物油从利用本发明的磷脂酶通过酶处理的非水化磷脂中分离出来。该方法温
和、经济且环境友好。在此脱胶法中所用的磷脂酶仅水解溶血卵磷脂，而不水解卵磷脂。
水化磷脂的植物油从利用本发明的磷脂酶通过酶处理的非水化磷脂中分离出来。该方法温
和、经济且环境友好。在此脱胶法中所用的磷脂酶仅水解溶血卵磷脂，而不水解卵磷脂。
[0686] 在一个方面，为允许本发明的酶发挥作用，必须紧密混合含有酶的油相和水相这两相。仅仅搅拌它们是不充分的。如果酶溶解于少量水中，例如，0.5-5重量％(相对于
油)，并且以此种形式在油中乳化以形成小于直径10微米的液滴(重量平均)，那么有助于
酶在油中的良好分散。液滴可以小于1微米。可以大于100cm/sec的径向速度实施湍流搅
拌。还可以使用外部回转泵使油在反应器中流动。含有酶的水相也可以利用超声作用精细
分散。可以使用分散装置。
油)，并且以此种形式在油中乳化以形成小于直径10微米的液滴(重量平均)，那么有助于
酶在油中的良好分散。液滴可以小于1微米。可以大于100cm/sec的径向速度实施湍流搅
拌。还可以使用外部回转泵使油在反应器中流动。含有酶的水相也可以利用超声作用精细
分散。可以使用分散装置。
[0687] 酶反应可能在油相和水相之间的界面发生。这是所有这些用于混合而产生含有酶的水相的最大可能表面的方法的目的。表面活性剂的加入增加了水相的微分散。因此，在一些情况下，HLB值大于9的表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠，被加到酶溶液中，例如在EP-A
0513709中所描述的。用于改善乳化作用的相似有效的方法是加入溶血卵磷脂。加入量可
以是0.001％～1％(相对于油)。酶处理过程中的温度不是关键性的。可以使用20℃～
80℃的温度，但80℃仅能短时间应用。在这方面，使用具有良好温度和/或低pH耐受性的
本发明的磷脂酶。最佳应用温度是30℃～50℃。根据温度决定处理周期并且随温度升高
可以缩短。基本充分的时间为0.1～10小时，或者1～5小时。反应可以在脱胶反应器中
发生，分为几个阶段，例如DE-A 4339556中所描述的。因此连续操作和间歇操作都是可能
的。反应能够在不同温度阶段下进行。例如，可以在40℃下进行孵育3小时，然后在60℃
下孵育1小时。如果反应过程分阶段进行，则还能够在各阶段调整不同的pH值。例如，第
一阶段，溶液的pH值调了为7，例如，第二阶段通过加入柠檬酸调了为2.5。然而，在至少一个阶段，酶溶液的pH值必须小于4，或者小于3。如果后面将pH值调节到低于该水平，则会
产生负影响。因此，在酶溶液混合到油中之前将柠檬酸加入到酶溶液中。
0513709中所描述的。用于改善乳化作用的相似有效的方法是加入溶血卵磷脂。加入量可
以是0.001％～1％(相对于油)。酶处理过程中的温度不是关键性的。可以使用20℃～
80℃的温度，但80℃仅能短时间应用。在这方面，使用具有良好温度和/或低pH耐受性的
本发明的磷脂酶。最佳应用温度是30℃～50℃。根据温度决定处理周期并且随温度升高
可以缩短。基本充分的时间为0.1～10小时，或者1～5小时。反应可以在脱胶反应器中
发生，分为几个阶段，例如DE-A 4339556中所描述的。因此连续操作和间歇操作都是可能
的。反应能够在不同温度阶段下进行。例如，可以在40℃下进行孵育3小时，然后在60℃
下孵育1小时。如果反应过程分阶段进行，则还能够在各阶段调整不同的pH值。例如，第
一阶段，溶液的pH值调了为7，例如，第二阶段通过加入柠檬酸调了为2.5。然而，在至少一个阶段，酶溶液的pH值必须小于4，或者小于3。如果后面将pH值调节到低于该水平，则会
产生负影响。因此，在酶溶液混合到油中之前将柠檬酸加入到酶溶液中。
[0688] 在酶处理完成后，例如利用离心将酶溶液与其中所含的NHP的分解产物一起从油相中间歇地或连续地分离出来。由于酶的特性在于高稳定性并且溶液中所含的分解产物的
量略少(它们可以作为污泥沉淀)，所以相同的酶水相能够多次使用。这样还可以分离污
泥的酶，参见，例如，DE-A 4339556，使得从基本上没有污泥的酶溶液可以再次使用。在此脱胶法的一个方面，获得含有小于15ppm的磷的油。一个目的是磷含量小于10ppm；或，小于
5ppm。磷含量小于10ppm时，能容易地根据蒸馏去酸化法进一步处理油。大量的其他离子，如镁、钙、锌和铁，能够从油中除去，例如，小于0.1ppm。因此，该产物在进一步处理和储存中拥有良好抗氧化性的理想先决条件。
量略少(它们可以作为污泥沉淀)，所以相同的酶水相能够多次使用。这样还可以分离污
泥的酶，参见，例如，DE-A 4339556，使得从基本上没有污泥的酶溶液可以再次使用。在此脱胶法的一个方面，获得含有小于15ppm的磷的油。一个目的是磷含量小于10ppm；或，小于
5ppm。磷含量小于10ppm时，能容易地根据蒸馏去酸化法进一步处理油。大量的其他离子，如镁、钙、锌和铁，能够从油中除去，例如，小于0.1ppm。因此，该产物在进一步处理和储存中拥有良好抗氧化性的理想先决条件。
[0689] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于降低植物油和动物油中含磷组分的量，例如欧洲专利EP 0513709所描述的。在此方法中，利用本发明的磷脂酶A1、A2或B，通过酶性变
质减少含磷组分(尤其是磷脂，如卵磷脂)的含量与植物油和动物油(前面已经提及过的
植物油和动物油，例如大豆油)中的铁含量。
质减少含磷组分(尤其是磷脂，如卵磷脂)的含量与植物油和动物油(前面已经提及过的
植物油和动物油，例如大豆油)中的铁含量。
[0690] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于精制例如JP 06306386所描述的脂肪或油。本发明提供用于精制脂肪或油的方法，包括将脂肪或油中的磷脂转化为水溶性含有磷基团的
物质以及除去此物质的步骤。本发明的酶(例如，PI-PLC)用于将磷脂转化为所述物质。因
此，可以在没有进行碱精制步骤的条件下精制脂肪或油，其中会产生含有碱性废水和大量
油的工业废物。能够实现产率的改善，因为从废物中脱离的中性脂肪或油能够减少至零。在一个方面，将粘性物质转化为水溶性物质，并且在粗制油的脱胶阶段和进行酶处理阶段中
通过加入具有活性磷脂酶C的本发明的酶除去水溶性物质。在一个方面，本发明的磷脂酶
具有切断磷脂中甘油和磷酸的酯键的活性。如果必要的话，该方法可以包括用水或酸性水
溶液洗涤酶处理的油。在一个方面，将加入本发明的酶加到粗制油中并与其反应。磷脂酶
C的用量可以是每1kg粗制油10～10,000单位，或者约100～2,000单位。
物质以及除去此物质的步骤。本发明的酶(例如，PI-PLC)用于将磷脂转化为所述物质。因
此，可以在没有进行碱精制步骤的条件下精制脂肪或油，其中会产生含有碱性废水和大量
油的工业废物。能够实现产率的改善，因为从废物中脱离的中性脂肪或油能够减少至零。在一个方面，将粘性物质转化为水溶性物质，并且在粗制油的脱胶阶段和进行酶处理阶段中
通过加入具有活性磷脂酶C的本发明的酶除去水溶性物质。在一个方面，本发明的磷脂酶
具有切断磷脂中甘油和磷酸的酯键的活性。如果必要的话，该方法可以包括用水或酸性水
溶液洗涤酶处理的油。在一个方面，将加入本发明的酶加到粗制油中并与其反应。磷脂酶
C的用量可以是每1kg粗制油10～10,000单位，或者约100～2,000单位。
[0691] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于水脱胶法，例如，Dijkstra，Albert J.等人，Oleagineux，Corps Gras，Lipides(1998)，5(5)，367-370中所描述的。在该示例性方法中，水脱胶法用于生产卵磷脂并使用脱胶酸和漂白土进行干脱胶法。此方法仅对于具有低磷脂含量的油经济可行，例如，棕榈油、月桂油等。对于具有高NHP含量的种子油，使用酸精制法，由此该方法在油坊实施以允许经由餐点弃去胶。在一个方面，这种酸精制油是在物理精制之前进行的可能“抛光”操作。
[0692] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于脱胶法，例如Dijkstra等人，Res.Dev.Dep.，N.V.Vandemoortele Coord.Cent.，Izegem，Belg.JAOCS，J.Am.Oil Chem.Soc.(1989)，66：
1002-1009中所描述的。在此示例性方法中，总脱胶法涉及将诸如H3PO4或柠檬酸等酸分散
至大豆油，允许接触一段时间，然后将诸如碳酸钠或硅酸钠此类的碱加入至油包酸乳液中。
这样保持足够低的中和度以避免形成皂，而形成皂会导致油损失的增加。随后，油流过离心分离机，在这里从油流除去大部分胶，以获得油含量最小的胶相。然后油流通过第二个离心分离机，除去所有残留的胶，以获得被再循环的稀释胶相。洗涤和干燥或直线碱精制完全了该过程。在采取总脱胶法后，与经典的碱精制法相比，整体产率改善了约0.5％。随后，全部脱胶油可以进行碱精制、漂白和除臭，或漂白和物理精制。
1002-1009中所描述的。在此示例性方法中，总脱胶法涉及将诸如H3PO4或柠檬酸等酸分散
至大豆油，允许接触一段时间，然后将诸如碳酸钠或硅酸钠此类的碱加入至油包酸乳液中。
这样保持足够低的中和度以避免形成皂，而形成皂会导致油损失的增加。随后，油流过离心分离机，在这里从油流除去大部分胶，以获得油含量最小的胶相。然后油流通过第二个离心分离机，除去所有残留的胶，以获得被再循环的稀释胶相。洗涤和干燥或直线碱精制完全了该过程。在采取总脱胶法后，与经典的碱精制法相比，整体产率改善了约0.5％。随后，全部脱胶油可以进行碱精制、漂白和除臭，或漂白和物理精制。
[0693] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于从诸如大豆油等植物油中除去非水化磷脂，例如Hvolby等人，Sojakagefabr.，Copenhagen，Den.，J.Amer.Oil Chem.Soc.(1971)48：
503-509中所描述的。在此示例性方法中，水脱胶油在不同的固定pH值下与存在或不存在
+
Ca 的缓冲溶液、Mg/Ca-结合剂和表面活性剂混合。非水化磷脂可以非转化态作为胶束或混合乳化剂的组分除去。此外，非水化磷脂还可以通过转过为解离形式除去，例如，通过从磷脂中除去Mg和Ca，可以通过酸化作用或利用Mg/Ca络合剂或Mg/Ca沉淀剂处理来实现。除
去或化学转化非水化磷脂能够减少乳液的形成，并促进脱酸油从乳液层和皂料中的分离。
503-509中所描述的。在此示例性方法中，水脱胶油在不同的固定pH值下与存在或不存在
+
Ca 的缓冲溶液、Mg/Ca-结合剂和表面活性剂混合。非水化磷脂可以非转化态作为胶束或混合乳化剂的组分除去。此外，非水化磷脂还可以通过转过为解离形式除去，例如，通过从磷脂中除去Mg和Ca，可以通过酸化作用或利用Mg/Ca络合剂或Mg/Ca沉淀剂处理来实现。除
去或化学转化非水化磷脂能够减少乳液的形成，并促进脱酸油从乳液层和皂料中的分离。
[0694] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于植物油的脱胶，例如，Buchold等人，Frankfurt/Main，Germany.Fett Wissenschaft Technologie(1993)，95(8)，300-304中所描述的。在本发明的用于脱胶食用植物油的示例性方法中，本发明的酶的水性悬液，例如，磷脂酶A2，被用水解在磷脂的sn-2位结合的脂肪酸，得到不溶于油的1-酰基-溶血磷脂，
由此，更适于物理分离。即使加入相当于约700lecitase单位/kg油的少量，仍然导致残留
P浓度小于10ppm，使得化学精制可被物理精制代替，消除了对中和、皂料分解和废水处理
的必须性。
由此，更适于物理分离。即使加入相当于约700lecitase单位/kg油的少量，仍然导致残留
P浓度小于10ppm，使得化学精制可被物理精制代替，消除了对中和、皂料分解和废水处理
的必须性。
[0695] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于植物油的脱胶，例如，EnzyMax，Dahlke，Klaus，Dept.G-PDO，Lurgi Ol-Gas，Chemie，GmbH，Frankfurt，Germany.Oleagineux，Corps Gras，Lipides(1997)，4(1)，55-57中所描述的。此示例性方法是用于物理精制几乎任何种类的油的脱胶法。通过酶催化水解，磷脂被转化为水溶性溶血磷脂，其可通过离心从油中分离出来。在酶法脱胶油中的残留磷含量低至2ppm P。
[0696] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于植物油的脱胶，例如，Cleenewerck等人，N.V.Vamo Mills，Izegem，Belg.Fett Wissenschat Technologie(1992)，94：317-22 和
Clausen，Kim；Nielsen，Munk.Novozymes A/S，Den.Dansk Kemi(2002)83(2)：24-27中所描述的。本发明的磷脂酶和方法可以包括用酸预精制植物油，例如，Nilsson-Johansson
等 人，Fats Oils Div.，Alfa-Laval Food Eng.AB，Tumba，Swed.Fett Wissenschaft
Technologie(1988)，90(11)，447-51 和 Munch，Ernst W.Cereol Deutschland GmbH，
Mannheim，Germany.Editor(s)：Wilson，Richard F。Proceedings of the World
Conference on Oilseed Processing Utilization，Cancun，MX，Nov.12-17，(2001)，
Meeting Date 2000、17-20中所描述的。
Clausen，Kim；Nielsen，Munk.Novozymes A/S，Den.Dansk Kemi(2002)83(2)：24-27中所描述的。本发明的磷脂酶和方法可以包括用酸预精制植物油，例如，Nilsson-Johansson
等 人，Fats Oils Div.，Alfa-Laval Food Eng.AB，Tumba，Swed.Fett Wissenschaft
Technologie(1988)，90(11)，447-51 和 Munch，Ernst W.Cereol Deutschland GmbH，
Mannheim，Germany.Editor(s)：Wilson，Richard F。Proceedings of the World
Conference on Oilseed Processing Utilization，Cancun，MX，Nov.12-17，(2001)，
Meeting Date 2000、17-20中所描述的。
[0697] 本发明的磷脂酶和方法还可以用于植物油的脱胶，例如，Jerzewska等人，Inst.Przemyslu Miesnego i Tluszczowego，Warsaw，Pol.，Tluszcze Jadalne(2001)，36(3/4)，
97-110中所描述的。在本发明的此方法中，利用本发明的磷脂酶A2使水合低芥酸油菜籽油
进行酶脱胶。酶能够催化脂肪酸酯键水解成为磷脂中甘油部分的中心碳原子。其能够水解
非水化磷脂为相应的水化溶血化合物。利用未纯化的酶制剂，加入2％制剂4小时能够得到
更好的结果(87％P除去)。
97-110中所描述的。在本发明的此方法中，利用本发明的磷脂酶A2使水合低芥酸油菜籽油
进行酶脱胶。酶能够催化脂肪酸酯键水解成为磷脂中甘油部分的中心碳原子。其能够水解
非水化磷脂为相应的水化溶血化合物。利用未纯化的酶制剂，加入2％制剂4小时能够得到
更好的结果(87％P除去)。
[0698] 在本发明的另一种示例性的油脱胶法(或使用本发明的酶的油脱胶法)中，加入酸性聚合物，例如，藻酸盐或果胶。在本发明的这种油脱胶法中，酸性聚合物(例如，藻酸或果胶或更可溶的盐形式)被加到带有少量水(例如，约0.5～5％)的粗制油。在这方面，
酸性聚合物能够通过结合粗制油中的钙和/或镁来还原和/或分解磷脂-金属络合物，从
而改善非水化磷脂的溶解性。在可选方面，这些磷脂会移至油/水界面或进入水相，或者
被转化成二酰基甘油和相对应的侧链，或者完整的磷脂作为重相的组分通过随后的离心除
去。水相中酸性聚合物的存在还可以增加水相的密度，并且造成重相与油(轻)相的分离
改进。
酸性聚合物能够通过结合粗制油中的钙和/或镁来还原和/或分解磷脂-金属络合物，从
而改善非水化磷脂的溶解性。在可选方面，这些磷脂会移至油/水界面或进入水相，或者
被转化成二酰基甘油和相对应的侧链，或者完整的磷脂作为重相的组分通过随后的离心除
去。水相中酸性聚合物的存在还可以增加水相的密度，并且造成重相与油(轻)相的分离
改进。
[0699] 本发明的示例性的油脱胶法(或使用本发明的酶的油脱胶法)改变了除臭过程而得到二酰基甘油(DAG)部分。在可选方面，如果必要或需要的话，在酶辅助脱胶后，可以改变除臭条件(温度、压力、蒸馏装置的结构)，目的是改善游离脂肪酸(FFA)与二酰基甘油
/甘油三酯部分的分离，或者进一步改变，以使二酰基甘油部分与甘油三酯部分分离。由于这些改变的结果，通过利用本发明的方法，如果本发明的酶(例如，磷酸酶，或者，PLC，或者PLC和磷酸酶的组合)被用于在以物理精制法中脱胶食用油，那么可以得到食品级FFA和二
酰基甘油。
/甘油三酯部分的分离，或者进一步改变，以使二酰基甘油部分与甘油三酯部分分离。由于这些改变的结果，通过利用本发明的方法，如果本发明的酶(例如，磷酸酶，或者，PLC，或者PLC和磷酸酶的组合)被用于在以物理精制法中脱胶食用油，那么可以得到食品级FFA和二
酰基甘油。
[0700] 在各方面，实施在此所述的本发明的方法(或使用本发明的酶)具有诸如以下的优点：减少或消除溶剂和溶剂回收；成本较低；降低下游精制成本，降低化学品的使用、设备、加工时间、能量(加热)和水的使用/废水的产生；生产更高质量的油；榨油机压
榨的油在烹饪中无需精制便可使用，以及煸应用(这种压榨油具有优异的稳定性，颜色和
气味特性和高的生育酚含量)；生产更高质量的饮食；生产较低脂肪含量的饮食(目前，
机械压榨的饮食在反刍动物中产生了消化问题)；生产改善的营养型硫代葡萄糖苷、单宁
酸、芥子碱、植酸(例如，在Technology and Solvents for Extracting Oilseeds and
Nonpetroleum Oils，AOCS 1997中所描述的)的属性降低水平。
榨的油在烹饪中无需精制便可使用，以及煸应用(这种压榨油具有优异的稳定性，颜色和
气味特性和高的生育酚含量)；生产更高质量的饮食；生产较低脂肪含量的饮食(目前，
机械压榨的饮食在反刍动物中产生了消化问题)；生产改善的营养型硫代葡萄糖苷、单宁
酸、芥子碱、植酸(例如，在Technology and Solvents for Extracting Oilseeds and
Nonpetroleum Oils，AOCS 1997中所描述的)的属性降低水平。
[0701] 在一个方面，本发明提供精制植物油(例如，大豆油、玉米油、棉籽油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、葵花籽油、芝麻籽油、米糠油、椰子油或芥花油)以及它们的副产品的方法，和为卵磷脂除臭的方法，例如，在美国专利No.6,172,248或6,172,247中所描述的，其中所述方法包括使用至少一种本发明的酶，例如，本发明的磷脂酶C。因此，本发明提供卵磷脂和包括至少一种本发明的酶的植物油。在示性例的有机酸精制法中，植物油与稀
释的有机酸水溶液结合，并经由高剪切在油中细微地分散酸溶液。所得到的酸和油的混合
物在低剪切下混合充分时间，以将污染物隔离至水合杂质相，从而制备纯化的植物油相。在此示例性方法中，可以使用混合器或再循环系统(例如，再循环水罐)和/或磷脂或卵磷脂
储存罐，例如，在美国专利No.4,240,972、4,049,686、6,172,247或6,172,248中所描述的。
这些方法能够作为间歇过程或连续过程进行。粗制或脱胶植物油能够从储存罐中供应(例
如，通过泵)并且可以被加热。纯化的植物油可以是粗制油或″脱胶″油。
释的有机酸水溶液结合，并经由高剪切在油中细微地分散酸溶液。所得到的酸和油的混合
物在低剪切下混合充分时间，以将污染物隔离至水合杂质相，从而制备纯化的植物油相。在此示例性方法中，可以使用混合器或再循环系统(例如，再循环水罐)和/或磷脂或卵磷脂
储存罐，例如，在美国专利No.4,240,972、4,049,686、6,172,247或6,172,248中所描述的。
这些方法能够作为间歇过程或连续过程进行。粗制或脱胶植物油能够从储存罐中供应(例
如，通过泵)并且可以被加热。纯化的植物油可以是粗制油或″脱胶″油。
[0702] 在一个方面，本发明的磷脂酰肌醇-PLC(PI-PLC)酶用于植物油脱胶。本发明的PI-PLC酶可以单独使用或与其他酶(例如，本发明的PLC、PLD、磷酸酶)混合使用，以改善
植物油(包括大豆、芥花和向日葵)脱胶过程中油的产率。PI-PLC优选地将磷脂酰肌醇转
化为1，2-二酰基甘油(DAG)和磷酸肌醇，但其对于包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酸或其组合在内的其他磷脂仍会表现出活性。由于在从植物油的酶处理引起
的较小胶部分中夹带的油量减少，从而随着在酶处理的植物油中的DAG量增加以及中性油
的增加实现了产率的提高。
植物油(包括大豆、芥花和向日葵)脱胶过程中油的产率。PI-PLC优选地将磷脂酰肌醇转
化为1，2-二酰基甘油(DAG)和磷酸肌醇，但其对于包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酸或其组合在内的其他磷脂仍会表现出活性。由于在从植物油的酶处理引起
的较小胶部分中夹带的油量减少，从而随着在酶处理的植物油中的DAG量增加以及中性油
的增加实现了产率的提高。
[0703] 油籽的酶处理
[0704] 本发明提供用于油籽的酶处理的组合物(例如，酶)和方法，包括大豆、芥花、椰子、鳄梨和橄榄酱。在一个方面，本发明的这些方法能够增加油产率并改善得到的膳食的营养质量。在一些方面，采用本发明的酶和方法的油籽的酶处理提供了经济和环境效益，以及为人和动物消费提供了油提取和处理食品的可选技术。在可选方面，本发明的方法包括使
用本发明的磷脂酶、其他磷脂酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、木糖聚酶、淀粉酶(例如，α-淀粉酶)、葡聚糖酶(例如，β-葡聚糖酶)、聚半乳糖醛酸酶、半乳糖酯酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和其他植物细胞壁降解酶，以及混合酶制剂和细胞裂解物。
用本发明的磷脂酶、其他磷脂酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、木糖聚酶、淀粉酶(例如，α-淀粉酶)、葡聚糖酶(例如，β-葡聚糖酶)、聚半乳糖醛酸酶、半乳糖酯酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和其他植物细胞壁降解酶，以及混合酶制剂和细胞裂解物。
[0705] 在可选方面，本发明的方法可以与其他方法结合在一起实施，例如，酶处理，例如，使用糖酶，包括纤维素酶、半纤维素酶和其他副降解活性，或者，化学方法，例如，大豆油的正己烷提取。当在溶剂提取之前进行酶处理时，酶处理能够增加8-10％的油提取率。
[0706] 在可选方面，本发明的方法能够用水提取法实施。水提取法是油提取的更环境清洁的可选技术。水方法的低提取产率能够通过利用形成油籽细胞壁的水解结构性多糖，
或水解形成细胞或脂质体膜的蛋白来克服，例如，利用包括从大豆细胞提取油的纤维素
酶、半纤维素酶和/或原果胶酶。在一个方面，使用本发明的酶实施方法，如Kasai(2003)
J.Agric.Food Chem.51：6217-6222中所描述的，其报道了消化细胞壁最有效的酶是纤维素酶。
或水解形成细胞或脂质体膜的蛋白来克服，例如，利用包括从大豆细胞提取油的纤维素
酶、半纤维素酶和/或原果胶酶。在一个方面，使用本发明的酶实施方法，如Kasai(2003)
J.Agric.Food Chem.51：6217-6222中所描述的，其报道了消化细胞壁最有效的酶是纤维素酶。
[0707] 在一个方面，与本发明的方法结合使用蛋白酶。操作变量、蛋白酶的酶活性和纤维素酶对油的组合影响以及与其他过程参数结合的和蛋白提取率进行了评估，其中过程参数例如是酶浓度、水解时间、粒度和固体对液体的比率。在一个方面，使用本发明的酶实施方法，如Rosenthal(2001)Enzyme andMicrob.Tech.28：499-509中所描述的，其报道了使用
蛋白酶与使用加热处理的面粉对照相比获得了显著更高的油和蛋白的产率。
蛋白酶与使用加热处理的面粉对照相比获得了显著更高的油和蛋白的产率。
[0708] 在一个方面，与本发明的方法结合使用全部提取的蛋白、果胶和半纤维素酶。植物细胞由一系列经常与蛋白或酚属化合物相关或被其取代的多糖组成。这些糖类大部分
只有部分被消化或极少被消化酶利用。通过处理酶或降解酶破坏这些结构能够改善它们
的营养利用度。在一个方面，利用本发明的酶实施方法，例如Ouhida(2002)J.Agric.Food Chem.50：1933-1938中所描述的，其报道了在完全提取蛋白、果胶和半纤维素酶后，实现了大豆细胞壁纤维素酶的显著降解(达到20％)。
只有部分被消化或极少被消化酶利用。通过处理酶或降解酶破坏这些结构能够改善它们
的营养利用度。在一个方面，利用本发明的酶实施方法，例如Ouhida(2002)J.Agric.Food Chem.50：1933-1938中所描述的，其报道了在完全提取蛋白、果胶和半纤维素酶后，实现了大豆细胞壁纤维素酶的显著降解(达到20％)。
[0709] 在一个方面，本发明的方法还包括在处理例如芥花籽等种子中合并多种酶处理，这些处理包括使用蛋白酶、纤维素酶和半纤维素酶(彼此组合并且与本发明中一种以上
的酶组合)。例如，该方法可以包括在常规方法之前在酶的孵育期间20～40水分中酶处
理芥花籽，例如，在Sosulski(1990)Proc.Can.Inst.Food Sci.Technol.3：656中所描述
的。本发明的方法还可以包括合并蛋白酶、淀粉酶、聚半乳糖醛酸酶(彼此组合并且与本
发明中一种以上的酶组合)以水解椰食粕的细胞材料并释放椰子油，可以通过离心回收，
例如，McGlone(1986)J.of Food Sci.51：695-697中所描述的。本发明的方法还包括合
并果胶酶、淀粉酶、蛋白酶、不同组合纤维素酶(彼此组合并且与本发明中一种以上的酶
组合)，以在鳄梨油的酶提取期间得到显著改善的产率(最好的情况下～70％)，例如，
Buenrostro(1986)Biotech.Letters 8(7)：505-506中所描述的。在本发明的方法提取橄
榄油时，用纤维素酶、半纤维素酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基转移酶、蛋白酶和其组合(彼此组合并且与本发明中一种以上的酶组合)，例如，Montedoro(1976)Acta Vitamin.
Enzymol.(Milano)30：13中所描述的。
的酶组合)。例如，该方法可以包括在常规方法之前在酶的孵育期间20～40水分中酶处
理芥花籽，例如，在Sosulski(1990)Proc.Can.Inst.Food Sci.Technol.3：656中所描述
的。本发明的方法还可以包括合并蛋白酶、淀粉酶、聚半乳糖醛酸酶(彼此组合并且与本
发明中一种以上的酶组合)以水解椰食粕的细胞材料并释放椰子油，可以通过离心回收，
例如，McGlone(1986)J.of Food Sci.51：695-697中所描述的。本发明的方法还包括合
并果胶酶、淀粉酶、蛋白酶、不同组合纤维素酶(彼此组合并且与本发明中一种以上的酶
组合)，以在鳄梨油的酶提取期间得到显著改善的产率(最好的情况下～70％)，例如，
Buenrostro(1986)Biotech.Letters 8(7)：505-506中所描述的。在本发明的方法提取橄
榄油时，用纤维素酶、半纤维素酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基转移酶、蛋白酶和其组合(彼此组合并且与本发明中一种以上的酶组合)，例如，Montedoro(1976)Acta Vitamin.
Enzymol.(Milano)30：13中所描述的。
[0710] 从植物油纯化植物甾醇
[0711] 本发明提供从植物油纯化植物甾醇和三萜烯或者植物甾醇的方法。使用本发明的磷脂酶和方法纯化的植物甾醇包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾烷醇、谷甾烷醇、链甾醇、海绵甾醇、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇和菜籽甾醇。植物甾醇是对健康和营养业重要的农产品。因此，本发明的磷脂酶和方法用于为化妆品制造商制备乳化剂以
及用于制备生产激素药物的甾体中间体和前体。本发明的磷脂酶和方法用于制备(例如，
纯化)植物甾醇的类似物，并且它们的酯类用作对心脏病健康有利的降胆固醇药物。本发
明的磷脂酶和方法用于纯化植物甾醇，通过在肠腔中抑制胆固醇的吸收来降低血清胆固醇
水平。本发明的磷脂酶和方法用于纯化植物甾醇，其在极低浓度下具有免疫调节性，包括增加细胞T淋巴球的细胞反应和对抗癌细胞系的天然杀死细胞的细胞毒素的能力。本发明的
磷脂酶和方法用于纯化治疗肺结核、风湿性关节炎、HIV-寄生患者控制和抑制免疫压力的
植物甾醇。
及用于制备生产激素药物的甾体中间体和前体。本发明的磷脂酶和方法用于制备(例如，
纯化)植物甾醇的类似物，并且它们的酯类用作对心脏病健康有利的降胆固醇药物。本发
明的磷脂酶和方法用于纯化植物甾醇，通过在肠腔中抑制胆固醇的吸收来降低血清胆固醇
水平。本发明的磷脂酶和方法用于纯化植物甾醇，其在极低浓度下具有免疫调节性，包括增加细胞T淋巴球的细胞反应和对抗癌细胞系的天然杀死细胞的细胞毒素的能力。本发明的
磷脂酶和方法用于纯化治疗肺结核、风湿性关节炎、HIV-寄生患者控制和抑制免疫压力的
植物甾醇。
[0712] 本发明的磷脂酶和方法用于纯化存在于农产品植物油(例如，椰子、芥花、可可、玉米、棉籽、亚麻籽、橄榄、棕榈、花生、米糠、红花、芝麻、大豆、葵花籽油)的甾醇部分的甾醇组分，如谷甾醇(40.2-92.3％)、菜油甾醇(2.6-38.6％)、豆甾醇(0-31％)和5-燕麦甾醇(1.5-29％)。
[0713] 本发明的方法可以包括植物源性甾醇，通过用氯仿-甲醇、正己烷、二氯甲烷或丙酮溶剂提取在油籽中分离，然后通过皂化和层析纯化获得丰富的总甾醇。可选择地，植物样品能够通过使用超临界二氧化碳的超临界流体提取，得到可以从其富集和分离甾醇的全部脂质提取物。对于甾醇化合物的后续表征和量化，可以通过包括柱层析(CC)、气相层析、薄层层析法(TLC)、正相高效液相色谱法(HPLC)、逆向HPLC和毛细管电层析在内的各种层析
技术纯化和分离粗分离物。在所有的层析分离和分离技术中，CC和TLC程序对于样品的清
洁、测试样品中的甾醇的纯化、定性分析和初步估计是最可取、经济和适合的。
技术纯化和分离粗分离物。在所有的层析分离和分离技术中，CC和TLC程序对于样品的清
洁、测试样品中的甾醇的纯化、定性分析和初步估计是最可取、经济和适合的。
[0714] 在食用油精制过程期间，植物甾醇在植物油中作为副产品损失。本发明的磷脂酶和方法使用从该副产物分离的植物甾醇，以制备从该副产品分离的植物甾醇富集产品。
本发明的植物甾醇分离和纯化方法可以含有油处理业的副产品，可以包括诸如分子蒸馏、
液-液提取和结晶化等操作。
本发明的植物甾醇分离和纯化方法可以含有油处理业的副产品，可以包括诸如分子蒸馏、
液-液提取和结晶化等操作。
[0715] 本发明的方法可以包含提取脂质以提取植物甾醇的方法。例如，本发明的方法可以采用非极性溶剂如正己烷(通常用于提取大部分类型的植物油)定量地提取游离的植物
甾醇和植物甾醇基脂肪酸酯。甾醇糖苷和脂肪-酰基甾醇糖苷用正己烷只能部分提取，增
加溶剂的极性会提高提取百分比。可以使用的一种程序是Bligh和Dyer的氯仿-甲醇法，
用于提取包括磷脂的所有甾醇脂质类。对于定性分离和定量分析植物甾醇脂质类的一种示
例性方法包括将脂质提取物注入HPLC系统。
甾醇和植物甾醇基脂肪酸酯。甾醇糖苷和脂肪-酰基甾醇糖苷用正己烷只能部分提取，增
加溶剂的极性会提高提取百分比。可以使用的一种程序是Bligh和Dyer的氯仿-甲醇法，
用于提取包括磷脂的所有甾醇脂质类。对于定性分离和定量分析植物甾醇脂质类的一种示
例性方法包括将脂质提取物注入HPLC系统。
[0716] 本发明的磷脂酶和方法可以用于从脂肪和油除去甾醇，例如，在美国专利No.6,303,803中所描述的。这是一种用于降低含甾醇的脂肪和油的甾醇的方法。其是基于
胆固醇和其他甾醇对于形成疏水的流体双层(如磷脂双层)的两性分子的亲和性的一种经
济有效的方法。磷脂凝聚体与例如含甾醇的脂肪或油在水环境中接触，然后混合。该凝集
的磷脂混合物的分子结构对胆固醇和其他甾醇具有高的亲和性，能够选择性地从脂肪和油
除去这种分子。水分离混合物混合足够的时间，以通过将甾醇分配至磷脂凝聚体的一部分
中来选择性地减少脂肪/油产品的甾醇含量。减少甾醇的脂肪或油从水分离混合物中分离
出来。可选择地，相应的甾醇富集部分也可以从水分离混合物中分离出来。作为能够热降
解的产品，这些步骤能够在室温下进行，加热成本最小化。此外，需要最少量的装置，并且由于所有需要的材料都是食品级的，因此这些方法在关于处理、废物处理或终产品的污染方
面不需要特别的预防措施。
胆固醇和其他甾醇对于形成疏水的流体双层(如磷脂双层)的两性分子的亲和性的一种经
济有效的方法。磷脂凝聚体与例如含甾醇的脂肪或油在水环境中接触，然后混合。该凝集
的磷脂混合物的分子结构对胆固醇和其他甾醇具有高的亲和性，能够选择性地从脂肪和油
除去这种分子。水分离混合物混合足够的时间，以通过将甾醇分配至磷脂凝聚体的一部分
中来选择性地减少脂肪/油产品的甾醇含量。减少甾醇的脂肪或油从水分离混合物中分离
出来。可选择地，相应的甾醇富集部分也可以从水分离混合物中分离出来。作为能够热降
解的产品，这些步骤能够在室温下进行，加热成本最小化。此外，需要最少量的装置，并且由于所有需要的材料都是食品级的，因此这些方法在关于处理、废物处理或终产品的污染方
面不需要特别的预防措施。
[0717] 本发明的磷脂酶和方法可以用于从脂肪和油中除去甾醇，例如，在美国专利No.5,880,300中所描述的。磷脂凝聚体与例如含甾醇的脂肪或油在水环境中接触，然后混
合。在充分混合后，减少甾醇的脂肪或油从水分离混合物中分离出来。可选择地，相应的甾醇富集磷脂也可以从水分离混合物中分离出来。植物(例如，蔬菜)油含有植物甾醇，也可
以使用本发明的方法除出。该方法适用于在商业性处理周期的任何阶段的脂肪/油产品。
例如，本发明的方法可以应用于精制、漂白和除臭的油(″RBD油″)，或在达到RBD状态之
前的任何处理阶段。尽管与预RBD油相比RBD油可以具有改变的密度，但是通过改变磷脂
含量、磷脂组成、磷脂：水比例、温度、压力、混合条件和和分离条件，本发明的方法也容易适用于RBD或预RBD油，或适用于其他脂肪/油产品，如下所述的。
合。在充分混合后，减少甾醇的脂肪或油从水分离混合物中分离出来。可选择地，相应的甾醇富集磷脂也可以从水分离混合物中分离出来。植物(例如，蔬菜)油含有植物甾醇，也可
以使用本发明的方法除出。该方法适用于在商业性处理周期的任何阶段的脂肪/油产品。
例如，本发明的方法可以应用于精制、漂白和除臭的油(″RBD油″)，或在达到RBD状态之
前的任何处理阶段。尽管与预RBD油相比RBD油可以具有改变的密度，但是通过改变磷脂
含量、磷脂组成、磷脂：水比例、温度、压力、混合条件和和分离条件，本发明的方法也容易适用于RBD或预RBD油，或适用于其他脂肪/油产品，如下所述的。
[0718] 可选择地，本发明的酶和方法可以用于在油处理的中间步骤分离植物甾醇或其他甾醇。例如，已知的是，在植物油的除臭过程中植物甾醇失去。例如来自处理的中间步骤的含有甾醇的蒸馏部分能够经受如上所述的甾醇提取过程。这样提供了能够进一步处理以回
收提取的甾醇的甾醇富集的卵磷脂或其他磷脂材料。
收提取的甾醇的甾醇富集的卵磷脂或其他磷脂材料。
[0719] 洗涤剂组合物
[0720] 本发明提供含有一种或多种本发明的磷脂酶的洗涤剂组合物以及制备和使用这些组合物的方法。本发明包括制备和使用洗涤剂组合物的所有方法，参见，例如，美国专利No.6,413,928；6,399,561；6,365,561；6,380,147。洗涤剂组合物可以是单组分和两组分的水性组合物、非水性液体组合物、流延固体、颗粒形式、微粒形式、压缩片、胶体和/或糊剂和浆体形式。本发明还提供能够使用这些洗涤剂组合物快速除去粗的食品污物、食物残
渣的膜和其他副食物组合物的方法。本发明的磷脂酶能够通过催化水解磷脂促进除去污
渍。本发明的磷脂酶可以用于纺织品洗涤剂和洗碗精。
渣的膜和其他副食物组合物的方法。本发明的磷脂酶能够通过催化水解磷脂促进除去污
渍。本发明的磷脂酶可以用于纺织品洗涤剂和洗碗精。
[0721] 实际活性的酶含量取决于制造洗涤剂组合物的方法，并且不是关键的，只要洗涤剂溶液具有所需的酶活性。在一个方面，最终溶液中存在的磷脂酶的量为约0.001mg～
0.5mg每g洗涤剂组合物。根据最终用途的条件，包括物理产品形式、使用pH、使用温度以
及待降解或改变的污物类型，来选择本发明的方法和产品中使用的特定酶。对于用途条件
的任何设定，酶可被选择以提供最佳活性和稳定性。在一个方面，本发明的多肽在pH范围
为约4～12和温度在约20℃～95℃下具有活性。本发明的洗涤剂可以含有阳离子、半极
性非离子或两性离子表面活性剂；或它们的混合物。
0.5mg每g洗涤剂组合物。根据最终用途的条件，包括物理产品形式、使用pH、使用温度以
及待降解或改变的污物类型，来选择本发明的方法和产品中使用的特定酶。对于用途条件
的任何设定，酶可被选择以提供最佳活性和稳定性。在一个方面，本发明的多肽在pH范围
为约4～12和温度在约20℃～95℃下具有活性。本发明的洗涤剂可以含有阳离子、半极
性非离子或两性离子表面活性剂；或它们的混合物。
[0722] 本发明的磷脂酶可以配制成pH为4.0～12.0的约0.01～5重量％(优选0.1％～0.5重量％)的粉末或液体洗涤剂。这些洗涤剂组合物还可以含有其他酶(如已知的蛋白
酶、纤维素酶、脂肪酶或内糖苷酶)，以及增洁剂和稳定剂。将本发明的磷脂酶加到常规清洗组合物中不会产生任何特殊的用途限制。换言之，只要pH值在上述范围内并且温度低于所
述酶的变性温度，那么适合于洗涤剂的任何温度和pH值也适合本发明的组合物。此外，本
发明的多肽可以用在没有洗涤剂的清洗组合物中，或者单独或者与增洁剂和稳定剂结合使
用。
酶、纤维素酶、脂肪酶或内糖苷酶)，以及增洁剂和稳定剂。将本发明的磷脂酶加到常规清洗组合物中不会产生任何特殊的用途限制。换言之，只要pH值在上述范围内并且温度低于所
述酶的变性温度，那么适合于洗涤剂的任何温度和pH值也适合本发明的组合物。此外，本
发明的多肽可以用在没有洗涤剂的清洗组合物中，或者单独或者与增洁剂和稳定剂结合使
用。
[0724] 在一个方面，本发明提供用于洗涤物体的方法，其包括在洗涤的充分条件下将物体与本发明的磷脂酶接触。本发明的磷脂酶可以作为洗涤剂添加剂而被包含。本发明的洗
涤剂组合物可以例如配制成含有本发明的磷脂酶的手洗或机洗用洗涤剂组合物。适于预处
理染色织物的洗衣添加剂可以包含本发明的磷脂酶。织物柔软剂组合物可以包含本发明的
磷脂酶。可选择地，本发明的磷脂酶可以配制成用于普通家庭硬面清洗操作的洗涤剂组合
物。在可选方面，本发明的洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其他酶，如
蛋白酶、脂肪酶、角质酶、另一种磷脂酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如，乳糖酶和/或过氧物酶)。选择本发明的酶的性质以
与选择的洗涤剂相容(即，最佳的pH，与其他酶和非酶成分等的相容性)，并且酶以有效量
存在。在一个方面，本发明的磷脂酶用于从织物除去有恶臭的材料。在实施本发明中可以
使用的各种洗涤剂组合物及其制备方法描述在例如美国专利No.6,333,301；6,329,333；
6,326,341；6,297,038；6,309,871；6,204,232；6,197,070；5,856,164中。
涤剂组合物可以例如配制成含有本发明的磷脂酶的手洗或机洗用洗涤剂组合物。适于预处
理染色织物的洗衣添加剂可以包含本发明的磷脂酶。织物柔软剂组合物可以包含本发明的
磷脂酶。可选择地，本发明的磷脂酶可以配制成用于普通家庭硬面清洗操作的洗涤剂组合
物。在可选方面，本发明的洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其他酶，如
蛋白酶、脂肪酶、角质酶、另一种磷脂酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如，乳糖酶和/或过氧物酶)。选择本发明的酶的性质以
与选择的洗涤剂相容(即，最佳的pH，与其他酶和非酶成分等的相容性)，并且酶以有效量
存在。在一个方面，本发明的磷脂酶用于从织物除去有恶臭的材料。在实施本发明中可以
使用的各种洗涤剂组合物及其制备方法描述在例如美国专利No.6,333,301；6,329,333；
6,326,341；6,297,038；6,309,871；6,204,232；6,197,070；5,856,164中。
[0725] 废物处理
[0726] 本发明的磷脂酶可以用于废物处理。在一个方面，本发明提供使用本发明的磷脂酶的固体废物消化方法。该方法可以包括减少基本上未处理的固体废物的质量和体积。在
可控温度下在酶溶液(包含本发明的磷脂酶)存在下，可以用酶消化法处理固体废物。固
体废物可以被转化为液化废物和任何残留的固体废物。所得的液化废物能够从所述任何残
留固化废物中分离。参见，例如，美国专利No.5,709,796。
可控温度下在酶溶液(包含本发明的磷脂酶)存在下，可以用酶消化法处理固体废物。固
体废物可以被转化为液化废物和任何残留的固体废物。所得的液化废物能够从所述任何残
留固化废物中分离。参见，例如，美国专利No.5,709,796。
[0727] 脱毒作用
[0728] 磷脂酶(例如，本发明的PI-PLC)可以用于脱毒处理，例如，用于内毒素的脱毒，例如，含有脂多糖(LPS)的组合物，并且本发明提供使用至少一种本发明的酶的脱毒法，例如，包括SEQ ID NO：6所示的序列和具有表12～15中所示的一种或多种突变的多肽，或其
酶活性片段。
酶活性片段。
[0729] 在一个方面，本发明的磷脂酶用于脱毒脂多糖(LPS)。在一个方面，这种脱毒作用是通过从脂质A对2’和/或3’脂肪酸链的脱酰基实现的。在一个方面，本发明的磷脂酶(例如，PI-PLC)用于从脂质水解2’-月桂酰基和/或3’-肉豆蔻酰基链，例如，脂质A(例
如，来自细菌内毒素)。在一个方面，本发明的方法用于破坏内毒素，例如，来自革兰氏阴性菌的毒素，例如，大肠杆菌。在一个方面，本发明的磷脂酶(例如，PI-PLC)用于改善毒素中毒的作用(例如，从正在生长的革兰氏阴性菌)，或者，用于预防性地阻止感染(例如，动物或人的感染)过程中内毒素的作用。因此，本发明提供含有本发明的磷脂酶的药物组合物
(例如，PI-PLC)以及使用本发明的磷脂酶的方法，从而改善和预防例如在败血症期间的脂
多糖(LPS)毒性作用。
如，来自细菌内毒素)。在一个方面，本发明的方法用于破坏内毒素，例如，来自革兰氏阴性菌的毒素，例如，大肠杆菌。在一个方面，本发明的磷脂酶(例如，PI-PLC)用于改善毒素中毒的作用(例如，从正在生长的革兰氏阴性菌)，或者，用于预防性地阻止感染(例如，动物或人的感染)过程中内毒素的作用。因此，本发明提供含有本发明的磷脂酶的药物组合物
(例如，PI-PLC)以及使用本发明的磷脂酶的方法，从而改善和预防例如在败血症期间的脂
多糖(LPS)毒性作用。
[0730] 处理食品
[0731] 本发明的磷脂酶可以用于处理食品，例如，改变食品的稳定性、保存寿命、风味、质地，改善营养状态等。例如，在一个方面，本发明的磷脂酶用于产生酸性磷脂而控制食品的苦味。
[0732] 在一个方面，本发明提供使用本发明的磷脂酶制造奶酪的方法(由此，本发明还提供含有本发明的磷脂酶的奶酪)。在一个方面，本发明的酶(例如，磷脂酶A、溶血磷脂
酶或其组合)用于处理增强调味的奶酪，从而增加产率和/或用于“稳定化”奶酪，例如，
通过降低“出油”趋势，或者，在一个方面，本发明的酶用于从奶酪用乳生产奶酪。本发明的这些方法可以包含任何的方法和协议，例如，在美国专利No.6,551,635和6,399,121、WO
03/070013、WO00/054601中所描述的。例如，在一个方面，本发明的磷脂酶用于稳定牛奶或含有牛奶的组合物中的脂肪乳液，例如，乳膏，并用于稳定牛奶组合物，例如，用于制造乳膏或乳膏酒类。在一个方面，本发明提供使用至少一种本发明的酶的用于增强奶酪味道的方
法，该方法包括在生产增强奶酪味道(例如，减少苦味)的条件下在水性介质中孵育蛋白、
脂肪和蛋白酶和脂肪酶，例如，在WO 99/66805中所描述的。在一个方面，本发明的磷脂酶用于通过在高温(例如约75℃～95℃)下与水、蛋白酶和脂肪酶(本发明的)混合来增强
奶酪味道，例如，在美国专利No.4,752,483中所描述的。在一个方面，本发明的磷脂酶用于加速奶酪老化，包括在添加促凝剂至牛奶中之前添加本发明的酶(例如，脂肪酶或磷脂酶)
至奶酪(例如，奶酪用乳)中，或者在压制前之前添加本发明的酶至含盐的凝乳中，例如，在美国专利No.4,707,364中所描述的。在一个方面，本发明的脂肪酶用于使乳脂中的甘油三
酯降解以释放游离脂肪酸，从而得到调味剂。蛋白酶还可以用于本发明的这些方法中的任
一种，参见，例如，Brindisi(2001)J.of Food Sci.66：1100-1107。在另一个方面，酯酶、脂肪酶、磷脂酶和/或蛋白酶的组合可以用于本发明的这些或任何方法。
酶或其组合)用于处理增强调味的奶酪，从而增加产率和/或用于“稳定化”奶酪，例如，
通过降低“出油”趋势，或者，在一个方面，本发明的酶用于从奶酪用乳生产奶酪。本发明的这些方法可以包含任何的方法和协议，例如，在美国专利No.6,551,635和6,399,121、WO
03/070013、WO00/054601中所描述的。例如，在一个方面，本发明的磷脂酶用于稳定牛奶或含有牛奶的组合物中的脂肪乳液，例如，乳膏，并用于稳定牛奶组合物，例如，用于制造乳膏或乳膏酒类。在一个方面，本发明提供使用至少一种本发明的酶的用于增强奶酪味道的方
法，该方法包括在生产增强奶酪味道(例如，减少苦味)的条件下在水性介质中孵育蛋白、
脂肪和蛋白酶和脂肪酶，例如，在WO 99/66805中所描述的。在一个方面，本发明的磷脂酶用于通过在高温(例如约75℃～95℃)下与水、蛋白酶和脂肪酶(本发明的)混合来增强
奶酪味道，例如，在美国专利No.4,752,483中所描述的。在一个方面，本发明的磷脂酶用于加速奶酪老化，包括在添加促凝剂至牛奶中之前添加本发明的酶(例如，脂肪酶或磷脂酶)
至奶酪(例如，奶酪用乳)中，或者在压制前之前添加本发明的酶至含盐的凝乳中，例如，在美国专利No.4,707,364中所描述的。在一个方面，本发明的脂肪酶用于使乳脂中的甘油三
酯降解以释放游离脂肪酸，从而得到调味剂。蛋白酶还可以用于本发明的这些方法中的任
一种，参见，例如，Brindisi(2001)J.of Food Sci.66：1100-1107。在另一个方面，酯酶、脂肪酶、磷脂酶和/或蛋白酶的组合可以用于本发明的这些或任何方法。
[0733] 在一个方面，本发明的磷脂酶用于降低食物中磷组分的含量，例如，油，如具有高非水化磷含量的植物油，例如，在WO 98/26057中所描述的。
[0734] 生物质转化和生产清洁生物燃料
[0735] 本发明提供多肽，其包含本发明的酶(磷脂酶(PL)，例如，本发明的PLA、PLC或PLD)和抗体，以及将生物质或任何木质纤维素材料(例如，包括纤维素、半纤维素和木质素的任何材料)转化为燃料(例如，生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物戊醇、生物甲醇、生物柴油)的方法，除了饲料、食品和化学品之外。例如，在可选实施方案中，用于生物质转化和用于生产生物燃料的本发明的酶可以具有一种或多种磷脂酶活性，包括磷脂酶C(PLC)活
性；PI-PLC活性，磷脂酶A(PLA)活性，如磷脂酶A1或磷脂酶A2活性；磷脂酶D(PLD)活性，
如磷脂酶D1或磷脂酶D2活性；磷脂酶B(PLB)活性，例如，磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性
或磷脂酶和溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性或磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性和溶血
磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性；或patatin活性或其组合。
性；PI-PLC活性，磷脂酶A(PLA)活性，如磷脂酶A1或磷脂酶A2活性；磷脂酶D(PLD)活性，
如磷脂酶D1或磷脂酶D2活性；磷脂酶B(PLB)活性，例如，磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性
或磷脂酶和溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性或磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性和溶血
磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性；或patatin活性或其组合。
[0736] 因此，本发明的组合物和方法提供使用石油基产品(例如，生物燃料(如生物甲醇、生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇等)的混合物)作为柴油、汽油、煤油等的有效和持续替代物或助剂。本发明提供表达本发明的酶的生物体，其参与涉及天然生物质转化的化学循
环。在一个方面，转化用的酶和方法用在磷脂处理的酶全体中。本发明提供发现和实施最
有效的酶以能够实现这些重要的新型“生物质”和替代能源工业加工的方法。
环。在一个方面，转化用的酶和方法用在磷脂处理的酶全体中。本发明提供发现和实施最
有效的酶以能够实现这些重要的新型“生物质”和替代能源工业加工的方法。
[0737] 本发明的组合物和方法可以用于提供使用石油基产品作为生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物戊醇、生物甲醇和/或生物柴油和汽油的混合物的有效和持续替代物或助
剂。本发明提供表达本发明的酶的生物体，其参与涉及天然生物质转化的化学循环。本发
明提供发现和实施最有效的酶以能够实现这些重要的新型“生物质”和替代能源工业加工
的方法。
剂。本发明提供表达本发明的酶的生物体，其参与涉及天然生物质转化的化学循环。本发
明提供发现和实施最有效的酶以能够实现这些重要的新型“生物质”和替代能源工业加工
的方法。
[0738] 本发明提供用于处理材料的方法、本发明的酶和酶的混合物或“鸡尾酒”，其中所述材料例如是生物质材料，包括纤维寡糖、阿拉伯糖基木聚糖低聚物、木质素、木质纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素和/或可发酵糖，包括使所述组合物与本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽接触，其中任选地，所述材料衍生于农作物(例如，小麦、大麦、马铃著、柳枝稷、白杨木)、食品或饲料生产的副产品、木质纤维素的废品、或植物残留物或废纸或废纸产品，并且任选地，植物残留物包括茎、叶、壳、糠、玉米或玉米棒、玉米秸秆、玉米纤维、干草、稻草(例如，水稻稻草或小麦稻草)、蔗渣、甜菜渣、柑橘渣、桔皮、木头、木头间伐材、木片、木浆、废纸浆、废木浆、木屑和锯屑、建筑和/或拆除废物和碎片(例如，木头、木屑和锯屑)，并且任选地，废纸包括丢弃的或用过的影印用纸、电脑打印纸、笔记本纸、记事本纸、打印纸、报纸、杂志、硬纸板和纸基包装材料和回收纸材料。此外，城市废物(例如，城市固体垃圾的纸部分、城市木材废物和城市的无污染废物)可以与含有糖、淀粉和/或纤维素的其他材料一起使用。在可选方面，处理材料，例如，生物质材料，产生生物醇类，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇。
[0739] 可选择地，本发明的多肽可以在生物质植物材料或原料本身中表达。
[0740] 本发明的方法还包括收集处理的或“转化的”(例如，通过包括使用本发明的酶的方法)生物质或植物材料，例如，含脂质或木质纤维素的材料(例如，通过本发明的酶处理)并且通过发酵(例如，用酵母)和/或通过化学合成使其成为燃料(例如，生物醇类，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)。在一个方面，生产的糖类是发酵的和/或不可发酵的产品是气化的。
[0741] 本发明的方法还包括使用本发明的酶转化藻类、诸如原始植物油或废植物油等植物油、动物脂肪和油脂(例如，牛油、猪油和黄油脂)或污水，并通过发酵和/或化学合成或转化使其成为燃料(例如，生物醇类，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)。
[0742] 本发明的酶(包括例如生物体，如微生物，例如，真菌、酵母或细菌，制备以及在一些方面分泌本发明的重组酶)可以用在任何生物质转化法的任何步骤中或包括/整合，例如，在任何一个步骤、若干步骤，或包含在所有步骤中，或者生物质转化法的所有以下方法或所有这些生物燃料替代物中：
[0743] ■直接燃烧：通过直接加热燃烧材料而且是最简单的生物质技术；如果附近有生物质源，那么是非常经济的。
[0748] ■发酵
[0749] ■醇发酵：通过转化纤维素质和/或淀粉至糖，发酵糖产生醇，然后通过蒸馏分离醇水混合物，由此生产燃料醇。原料如专用作物(例如，小麦、大麦、马铃著、柳枝稷、白杨木)、农业残留物和废物(例如，水稻稻草、玉米秸秆、小麦稻草、蔗渣、水稻壳、玉米纤维、甜菜渣、柑橘渣和桔皮)、林业废物(例如，硬木和软木间伐材、来自木材操作的硬木和软木废物、木屑和锯屑)、城市废物(例如，城市固体废物的纸部分、城市木材废物、城市无污染废物)、木材废料(例如，制材厂废料、纸浆废液、建筑废料、拆毁建筑垃圾、木屑和锯屑)和废纸或其他被能够转化为糖之后用酵母发酵成醇的含有糖、淀粉和/或纤维素的材料。可选择地，含有糖的材料能够通过发酵被直接转化为醇。
[0750] ■酯交换：所谓酯交换的示例性反应是将油转化为生物柴油。酯交换法指醇(如甲醇)与植物油、动物脂肪或回收的油脂中所含的甘油三酯油反应，形成脂肪酸烷基酯(生
物柴油)和甘油。反应需要加热以及诸如氢氧化钠或氢氧化钾等强碱催化剂。
物柴油)和甘油。反应需要加热以及诸如氢氧化钠或氢氧化钾等强碱催化剂。
[0751] ■生物柴油：生物柴油是由植物油、动物脂肪或回收的油脂制成的脂肪酸烷基酯混合物。生物柴油在其纯形式时可以用作交通工具的燃料，但其通常用作石化柴油添加剂
以降低来自柴油机车辆的微粒、一氧化碳、碳氢化合物以及空气污染物。
以降低来自柴油机车辆的微粒、一氧化碳、碳氢化合物以及空气污染物。
[0752] ■水解：包括水解使用本发明的酶催化的化合物，例如，生物质，如木质纤维素材料。
[0753] ■废热发电：是指利用单一燃料和设备同时生产多于一种形式的能量。在一个方面，生物质废热发电比生物质发电本身更有发展潜质，是因为废热发电既产生热又产生电。
[0754] 在一个方面，本发明的多肽具有水解酶活性，例如，磷脂酶、糖蛋白和/或其他用于从有机材料生产燃料(例如，生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)的相关的酶活性，其中有机材料，例如，生物质，如衍生于植物和动物的组合物，包括任何农作物或其他可再生原料、农业残留物或动物废物、城市有机成分和工业废料、或建筑或拆卸废物或碎片、或微生物如藻类或酵母。
[0755] 在一个方面，本发明的多肽用在将任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含有脂质或木质纤维素的生物质的植物生物质)转化为燃料(例如，生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)的方法中，或用在水解或消化生物材料的方法中，使得它们可以用作燃料(例如，生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)，或用于使生物质更易于被加工成燃料。
[0756] 本发明的酶，包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”，还可以用于甘油精制。甘油副产品含有未反应的催化剂和用酸中和的皂。除去水和醇产生了50％～80％的粗制甘油。残留的污染物包括可以用本发明的多肽处理的未反应的脂肪和油。在本发明的大量生物柴油
植物中，对于药物和化妆品行业，可以进一步纯化甘油，例如，至99％或更高的纯度。
植物中，对于药物和化妆品行业，可以进一步纯化甘油，例如，至99％或更高的纯度。
[0757] 使用本发明的多肽(包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”)生产的燃料(包括生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)，可以与燃料汽油一起使用以改善燃烧特性。加入氧气导致更加完全的燃烧，这样降低了一氧化碳的排放量。这是
利用生物燃料(例如，本发明的燃料)代替石油燃料的另一个环境效益。使用本发明的组
合物和/或方法生产的生物燃料可以与汽油共混，形成E10共混物(约5％～10％乙醇和
约90％～95％汽油)，但是其可以用于更高浓度如E85或纯形式。使用本发明的组合物和
/或方法生产的生物燃料可以与石化柴油共混，形成B20共混物(20％生物柴油和80％石化
柴油)，但是可以使用达到B100的其他共混水平(纯的生物柴油)。
利用生物燃料(例如，本发明的燃料)代替石油燃料的另一个环境效益。使用本发明的组
合物和/或方法生产的生物燃料可以与汽油共混，形成E10共混物(约5％～10％乙醇和
约90％～95％汽油)，但是其可以用于更高浓度如E85或纯形式。使用本发明的组合物和
/或方法生产的生物燃料可以与石化柴油共混，形成B20共混物(20％生物柴油和80％石化
柴油)，但是可以使用达到B100的其他共混水平(纯的生物柴油)。
[0758] 本发明还提供从含有任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含有脂质或木质纤维素的生物质的植物生物质)的组合物生产生物燃料(包括生物醇，例如，生物乙醇、生
物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)的方法。生物质材料可以从农作物获得，作为食品或饲料产品的副产品，或作为木质纤维素废物，如植物残留物，废纸或建筑和/或拆卸废料或碎片。使用本发明的多肽处理的合适植物源或植物残留物的例子包括海藻、藻类、谷物、种子、茎、叶、外壳、茧衣、玉米棒、玉米秸秆、稻草、草(例如，印度草，如印度落芒草；或，柳枝稷，例如，黍类，如柳枝稷(Panicum virgatum)等，以及木材、木片、木材间伐材和锯屑。
适于使用本发明的多肽处理的废纸的例子包括废弃影印纸、电脑打印纸、笔记本纸、记事本纸、打印纸等，以及报纸、杂志、硬纸板、和纸基包装材料。建筑和拆卸废料和碎片的例子包括木材、木屑、刨花和锯屑。
物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)的方法。生物质材料可以从农作物获得，作为食品或饲料产品的副产品，或作为木质纤维素废物，如植物残留物，废纸或建筑和/或拆卸废料或碎片。使用本发明的多肽处理的合适植物源或植物残留物的例子包括海藻、藻类、谷物、种子、茎、叶、外壳、茧衣、玉米棒、玉米秸秆、稻草、草(例如，印度草，如印度落芒草；或，柳枝稷，例如，黍类，如柳枝稷(Panicum virgatum)等，以及木材、木片、木材间伐材和锯屑。
适于使用本发明的多肽处理的废纸的例子包括废弃影印纸、电脑打印纸、笔记本纸、记事本纸、打印纸等，以及报纸、杂志、硬纸板、和纸基包装材料。建筑和拆卸废料和碎片的例子包括木材、木屑、刨花和锯屑。
[0759] 在一个实施方案中，本发明的酶(包括本发明的酶混合物和“鸡尾酒”)和方法可以用于与更多“传统”的从生物质生产乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙醇和/或柴油的方法结合，例如，作为包括通过在反应器中使干的任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含有脂质
或木质纤维素生物质材料的植物生物质)接触由强酸和金属盐的稀溶液组成的催化剂来
水解脂质和/或木质纤维素材料的方法；这样可以降低纤维素水解的活化能或温度，得到
更高的糖产量；参见，例如，美国专利No.6,660,506和6,423,145。
或木质纤维素生物质材料的植物生物质)接触由强酸和金属盐的稀溶液组成的催化剂来
水解脂质和/或木质纤维素材料的方法；这样可以降低纤维素水解的活化能或温度，得到
更高的糖产量；参见，例如，美国专利No.6,660,506和6,423,145。
[0760] 使用本发明的酶(包括本发明的酶混合物和“鸡尾酒”)的另一种示例性的方法包括水解任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含有脂质或木质纤维素(含有半纤维素、
纤维素和木质素)生物质的植物生物质，或任何其他能够被本发明的酶水解的多糖)，通过
在水性介质中，在被选定初步进行半纤维素解聚而没有主要解聚纤维素至葡萄糖的温度和
压力下，对材料进行第一阶段水解步骤。该步骤得到浆液，其中液体水相含有来自解聚半纤维素的溶解单糖，固相含有纤维素和木质素。第二阶段水解步骤可以包括使至少主要部分
纤维素解聚的条件，该步骤得到的液体水相含有溶解的/可溶的纤维素解聚产物。参见，例如，美国专利No.5,536,325。可以在本示例性方法的任何阶段加入本发明的酶(包括本发
明的酶混合物或“鸡尾酒”)。
纤维素和木质素)生物质的植物生物质，或任何其他能够被本发明的酶水解的多糖)，通过
在水性介质中，在被选定初步进行半纤维素解聚而没有主要解聚纤维素至葡萄糖的温度和
压力下，对材料进行第一阶段水解步骤。该步骤得到浆液，其中液体水相含有来自解聚半纤维素的溶解单糖，固相含有纤维素和木质素。第二阶段水解步骤可以包括使至少主要部分
纤维素解聚的条件，该步骤得到的液体水相含有溶解的/可溶的纤维素解聚产物。参见，例如，美国专利No.5,536,325。可以在本示例性方法的任何阶段加入本发明的酶(包括本发
明的酶混合物或“鸡尾酒”)。
[0761] 使用本发明的酶(包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”)的另一种示例性的方法包括处理任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含脂质或木质纤维素生物质材料的植物生
物质)，通过用约0.4％～2％强酸的稀酸水解的一个或多个阶段；利用碱性去木质素作用
处理酸水解的生物质材料的未反应的固态木质纤维素组分，用于产生可生物降解的热塑性
塑料和衍生物的前体。参见，例如，美国专利No.6,409,841。可以在本示例性方法的任何阶段加入本发明的酶。
物质)，通过用约0.4％～2％强酸的稀酸水解的一个或多个阶段；利用碱性去木质素作用
处理酸水解的生物质材料的未反应的固态木质纤维素组分，用于产生可生物降解的热塑性
塑料和衍生物的前体。参见，例如，美国专利No.6,409,841。可以在本示例性方法的任何阶段加入本发明的酶。
[0762] 使用本发明的酶(包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”)的另一种示例性的方法包括在预水解反应器中预水解任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含脂质或木质纤维素
生物质材料的植物生物质)；加入酸性液体至固体材料(例如，木质纤维素材料)以制备混
合物；加热混合物至反应温度；保持反应温度足够时间，以将木质纤维素材料分馏成含有
至少约20％的来自木质纤维素材料的木质素的溶解部分和含有纤维素的固体部分；在反
应温度或接近反应温度下从固体部分中除去溶解部分，其中固体部分中的纤维素更易于酶
消化；回收溶解部分。参见，例如，美国专利No.5,705,369。可以在本示例性方法的任何阶段加入本发明的酶。
生物质材料的植物生物质)；加入酸性液体至固体材料(例如，木质纤维素材料)以制备混
合物；加热混合物至反应温度；保持反应温度足够时间，以将木质纤维素材料分馏成含有
至少约20％的来自木质纤维素材料的木质素的溶解部分和含有纤维素的固体部分；在反
应温度或接近反应温度下从固体部分中除去溶解部分，其中固体部分中的纤维素更易于酶
消化；回收溶解部分。参见，例如，美国专利No.5,705,369。可以在本示例性方法的任何阶段加入本发明的酶。
[0763] 本发明提供用于制造发动机燃料组合物(例如，用于火花点火发动机)的方法，其基于与使用本发明的酶或方法制备的燃料级醇共混的液体碳氢化合物。在一个方面，
通过使用本发明的酶制备的燃料包括例如煤气液化气或天然气液体-乙醇共混物。在
一个方面，共溶剂是指衍生于生物质的2-甲基四氢呋喃(MTHF)。参见，例如，美国专利
No.6,712,866。
通过使用本发明的酶制备的燃料包括例如煤气液化气或天然气液体-乙醇共混物。在
一个方面，共溶剂是指衍生于生物质的2-甲基四氢呋喃(MTHF)。参见，例如，美国专利
No.6,712,866。
[0764] 在一个方面，本发明的用于酶降解任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含有脂质或木质纤维素的生物质的植物生物质)的方法，例如，用于从任何有机材料生产生物
燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)，还可以包括使用生物质材料的超声处理；参见，例如，美国专利No.6,333,181。
燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)，还可以包括使用生物质材料的超声处理；参见，例如，美国专利No.6,333,181。
[0765] 在另一个方面，本发明的用于从纤维素底物生产生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)的方法包含提供浆液形式的含有纤
维素底物、本发明的酶和发酵剂的反应混合物(例如，在反应管内，如半连续的固体床生物反应器)，反应混合物在足以启动和保持发酵反应的条件下反应(例如，在美国专利申请
No.20060014260中所描述的)。在一个方面，实验或理论计算可以决定最佳的送料频率。
在一个方面，根据最佳的送料频率以一定时间间隔向反应器中提供纤维素底物和酶的额外
量。
维素底物、本发明的酶和发酵剂的反应混合物(例如，在反应管内，如半连续的固体床生物反应器)，反应混合物在足以启动和保持发酵反应的条件下反应(例如，在美国专利申请
No.20060014260中所描述的)。在一个方面，实验或理论计算可以决定最佳的送料频率。
在一个方面，根据最佳的送料频率以一定时间间隔向反应器中提供纤维素底物和酶的额外
量。
[0766] 本发明的用于生产生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)的一种示例性方法描述在美国专利No.20050069998；20020164730中；在一个方面，包括碾磨任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含有脂质或木质纤维素的生物质的植物生物质)的阶段(例如，至大小15-30mm)，使得到的产物在反应器中经由蒸
汽喷发预处理(例如，在190-230℃下)达1～10分钟；在旋风分离器中收集预处理材料
或相关的制造产品；在压滤机中通过过滤分离液体和固体部分，向发酵沉淀中引入固体部
分，并且加入本发明的一种或多种酶，例如，纤维素酶和或β-葡糖苷酶(例如，溶解于pH
为4.8的缓冲液中)。
汽喷发预处理(例如，在190-230℃下)达1～10分钟；在旋风分离器中收集预处理材料
或相关的制造产品；在压滤机中通过过滤分离液体和固体部分，向发酵沉淀中引入固体部
分，并且加入本发明的一种或多种酶，例如，纤维素酶和或β-葡糖苷酶(例如，溶解于pH
为4.8的缓冲液中)。
[0767] 用于使用本发明的酶生产生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇，或生物柴油)的另一种示例性方法包括预处理含有任何生物质的原料，例如，动物、藻类和/或包括含脂质或木质纤维素生物质原料(至少包括半纤维素和纤维素)
的植物生物质。在一个方面，原料包括马铃著、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗或一种组分或废物或食品或饲料生产的副产物。原始材料(“原料”)在破
坏植物纤维结构的条件下反应，以进行半纤维素和纤维素的至少部分水解。破坏条件可以
包括例如使原料处于平均温度为180℃～270℃，pH为0.5～2.5下约5秒～60分钟；或，
处于温度为220℃～270℃，pH为0.5～2.5下5秒～120秒，等等。这样产生更易被酶消
化的原料，例如，本发明的纤维素酶。美国专利No.6,090,595。
的植物生物质。在一个方面，原料包括马铃著、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗或一种组分或废物或食品或饲料生产的副产物。原始材料(“原料”)在破
坏植物纤维结构的条件下反应，以进行半纤维素和纤维素的至少部分水解。破坏条件可以
包括例如使原料处于平均温度为180℃～270℃，pH为0.5～2.5下约5秒～60分钟；或，
处于温度为220℃～270℃，pH为0.5～2.5下5秒～120秒，等等。这样产生更易被酶消
化的原料，例如，本发明的纤维素酶。美国专利No.6,090,595。
[0768] 使用本发明的酶水解任何生物质(例如，动物、藻类和/或包括含有脂质或木质纤维素的生物质的植物生物质)的示例性条件包括在温度约30℃～48℃下和/或pH约
4.0～6.0下的反应。其他示例性条件包括温度约30℃～60℃和pH约4.0～8.0。
4.0～6.0下的反应。其他示例性条件包括温度约30℃～60℃和pH约4.0～8.0。
[0769] 本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶(例如，二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)可以用于将生物质转化为燃料，以及生产乙醇，例如，在PCT申请No.WO 0043496和WO 8100857中所描述的。本发明
的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶(例如，二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)可以用于生产可发酵糖和能够被转化成燃
料乙醇的含有葡聚糖的生物质。
的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶(例如，二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)可以用于生产可发酵糖和能够被转化成燃
料乙醇的含有葡聚糖的生物质。
[0770] 生物柴油-使用本发明的酶来制备
[0771] 本发明提供用于制备生物柴油燃料的含有本发明的酶的组合物和方法，包括任何生物燃料，例如，生物柴油，包括从植物油和/或动物脂肪的酯交换制成的烷基酯。
[0772] 例如，在可选方面，本发明的多肽(包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”)用在酯交换过程的方法中，使醇(如乙醇、丙醇、丁醇、丙醇、甲醇)与植物油、动物脂肪或回收油脂中所含的甘油三酯油反应，形成脂肪酸烷基酯(含有生物柴油)和甘油。在一个方面，生物柴油从大豆油或回收的食用油制成。取决于成本和可用性，动物脂肪、其他植物油和其他回收的油也可以用于(通过本发明的酶(例如，磷脂酶)处理)产生生物柴油。在另一个方面，
所有种类的脂肪和油的共混物用于使用本发明的酶产生本发明的生物柴油燃料。
所有种类的脂肪和油的共混物用于使用本发明的酶产生本发明的生物柴油燃料。
[0773] 本发明提供用于处理“黄油脂”的含有本发明的酶的组合物和方法，“黄油脂”是由提炼与加工工业最初创造的术语。可以使用本发明的组合物和方法处理的黄油脂包括来自炸油的油脂，例如，来自油炸锅或餐厅的除油器，或来自各种(例如，低质量的)级别的化制厂的牛油。因此，本发明还提供含有至少一种本发明的酶的油、油脂、炸油、植物油、餐厅废弃油脂和处理等级牛油。
[0774] 使用本发明的组合物处理的黄油脂，包括本发明的酶和方法，可以用于喷涂公路，例如，用于防尘，或用于动物饲料添加剂或饲料，或用于食品添加剂。
[0775] 在另一个方面，本发明的组合物，包括本发明的酶和方法，可以用于处理脂质，例如，油脂如餐厅废弃油脂，制备生物燃料，例如，生物柴油燃料，例如，用于汽车、公共汽车、卡车或船。在一个方面，使用本发明的组合物或方法制成的生物柴油可以从任何可再生植物源产生，例如，大豆，和/或来自油脂，如“黄油脂”。
[0776] 本发明的组合物，包括本发明的酶和方法，可以用于处理“SVO”，或“直链植物油”，包括可以供以燃料于柴油机的任何植物油，例如，其中处理包括酯交换燃料中的脂质，例如，用于在低温下使用。
[0777] 本发明的组合物，包括本发明的酶和方法，可以用于处理“WVO”，或废植物油，以制备例如包括来自餐厅的油脂的黄油脂；在一个方面，油脂必须过滤以除去食物残渣。通过本发明的组合物处理的黄油脂(包括任何油脂，例如，可以含有牛油和其他动物产品的餐厅废弃油脂)，包括本发明的酶和方法，可以落入SVO/WVO类别。
[0778] 干酒糟加工
[0779] 在另一个方面，本发明的酶(例如，磷脂酶)可以用于处理/加工“可溶干酒糟(DDS)”、“干酒糟(DDG)”、“酒糟残液(CDS)”、“湿酒糟(DWG)”和“干酒糟及可溶物(DDGS)”；
干酒糟可以是蒸馏过程中的谷物副产物，可以包括可溶物。这些方法可以包括干磨植物副
产品，例如，用于饲料应用，例如，喂养家禽、牛、猪和其他家养动物。因此，本发明的酶可以用于处理/加工粮食，例如，谷物，其是任何蒸馏过程的副产物，包括使用任何谷物源的方法，例如，来自酿酒者的传统原料，或可选择地，来自生产乙醇的工厂(制造厂、磨坊等)。本发明的酶可以用于处理/加工来自蒸馏厂的干饲料；随后这种饲料可以用于各种目的，例
如，用作牲畜的饲料，特别是反刍动物；因此，本发明提供为诸如反刍动物等牲畜处理饲料的方法，以及含有本发明植酸酶的酶处理的饲料。
干酒糟可以是蒸馏过程中的谷物副产物，可以包括可溶物。这些方法可以包括干磨植物副
产品，例如，用于饲料应用，例如，喂养家禽、牛、猪和其他家养动物。因此，本发明的酶可以用于处理/加工粮食，例如，谷物，其是任何蒸馏过程的副产物，包括使用任何谷物源的方法，例如，来自酿酒者的传统原料，或可选择地，来自生产乙醇的工厂(制造厂、磨坊等)。本发明的酶可以用于处理/加工来自蒸馏厂的干饲料；随后这种饲料可以用于各种目的，例
如，用作牲畜的饲料，特别是反刍动物；因此，本发明提供为诸如反刍动物等牲畜处理饲料的方法，以及含有本发明植酸酶的酶处理的饲料。
[0780] 本发明的酶可以单独或与其他酶一起用于处理“可溶干酒糟(DDS)”、“干酒糟(DDG)”、“酒糟残液(CDS)”、“湿酒糟(DWG)”和“干酒糟及可溶物(DDGS)”。例如，本发明的酶可以用于如图12所示的醇生产法中的任何步骤。本发明的酶可以用于提高任何生物
燃料或潜在生物燃料中的磷的生物利用度，包括在“可溶干酒糟(DDS)”、“干酒糟(DDG)”、“酒糟残夜(CDS)”、“湿酒糟(DWG)”和“干酒糟及可溶物(DDGS)”中发现的磷(参见，例如，C.Martinez Amezcua，2004 Poultry Science 83：971-976)。
燃料或潜在生物燃料中的磷的生物利用度，包括在“可溶干酒糟(DDS)”、“干酒糟(DDG)”、“酒糟残夜(CDS)”、“湿酒糟(DWG)”和“干酒糟及可溶物(DDGS)”中发现的磷(参见，例如，C.Martinez Amezcua，2004 Poultry Science 83：971-976)。
[0781] 烈酒或饮料类醇生产
[0782] 本发明的酶还可以用于处理用于醇生产的干酒糟，如“烈酒”中的醇，例如，啤酒或威士忌酒生产(除了在制备生物燃料时用于处理生物质)。本发明的酶可以在酒厂中使用，例如，用于处理诸如玉米之类的谷物。干酒糟可以通过首先碾磨谷物(例如，玉米)制成粗
产品，加入热水来制得。冷却后，加入酵母，混合物发酵若干天到一周。发酵后残留的固体是酒糟。本发明的植酸酶可以在该方法的任何步骤中使用。
产品，加入热水来制得。冷却后，加入酵母，混合物发酵若干天到一周。发酵后残留的固体是酒糟。本发明的植酸酶可以在该方法的任何步骤中使用。
[0783] 制剂
[0784] 本发明提供含有本发明的酶的新型制剂，以及用于本发明的磷脂酶的制剂，包括含有本发明的新型酶的制剂。本发明的酶可以单独使用或配制，或者作为本发明的磷脂酶，或其他磷脂酶，或其他诸如木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等酶，或其他诸如漆酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、氧化酶或还原酶等氧化还原酶的混合物使用或配制。它们可以配制成固体形式，如粉末、冻干剂、颗粒、片剂、棒、晶体、胶囊、药丸、球粒，或液体形式，如水溶液、气溶胶、凝胶、浆糊、浆液，水/油乳剂、乳膏、胶囊或在囊泡/胶束中的悬液。本发明的制剂可以含有任何或以下成分的组合：多元醇，如聚乙二醇、聚乙烯醇、甘油，糖类，如蔗糖、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖，胶凝剂，如瓜尔胶、卡拉胶、藻酸盐、右旋糖酐、纤维素衍生物、果胶，盐如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁、氯化锌、硫酸锌、脂肪酸的盐和脂肪酸衍生物，金属螯合剂，如EDTA、EGTA、柠檬酸钠，抗菌剂，如脂肪酸或脂肪酸衍生物、对羟基苯甲酸酯、三梨酸盐、苯甲酸盐、用于阻止酶(如蛋白酶)的影响的额外的调节化合物，大块蛋白，如BSA，小麦水解产物，硼酸盐化合物，氨基酸或肽，合适的pH或温度调节化合物，乳化剂，如非离子和/或离子洗涤剂，氧化还原剂，如胱氨酸/半胱氨
酸、谷胱甘肽、氧化的谷胱甘肽，还原或抗氧化化合物，如抗坏血酸、或分散剂。
酸、谷胱甘肽、氧化的谷胱甘肽，还原或抗氧化化合物，如抗坏血酸、或分散剂。
[0785] 交联和蛋白质修饰(如聚乙二醇化、脂肪酸改性、糖基化)也可以用于改善酶稳定性。
[0786] 本发明的磷脂酶的其他用途
[0787] 本发明的磷脂酶还可以用于研究磷酸肌醇(PI)信号系统；在对双相型障碍治疗的诊断、预后和处理(参见，例如，Pandey(2002)Neuropsychopharmacology26：216-228)；
作为抗氧化剂；作为改性磷脂；作为发泡和胶凝剂；产生血管化组织用的血管新生脂质；鉴定磷脂酶，例如，PLA、PLB、PLC、PLD和/或patatin调节物(激动剂或拮抗剂)，例如，用作抗新生物、抗炎的抑制剂和作为镇痛剂。它们可以用于产生控制食品和药物中苦味的酸性
磷脂。它们可以用于脂肪纯化。它们可以用于鉴定肽抑制剂，用于治疗病毒性、炎性、过敏性和心血管疾病。它们可以用于制备疫苗。它们可以用于制备多不饱和脂肪酸甘油酯和磷
脂酰甘油。
作为抗氧化剂；作为改性磷脂；作为发泡和胶凝剂；产生血管化组织用的血管新生脂质；鉴定磷脂酶，例如，PLA、PLB、PLC、PLD和/或patatin调节物(激动剂或拮抗剂)，例如，用作抗新生物、抗炎的抑制剂和作为镇痛剂。它们可以用于产生控制食品和药物中苦味的酸性
磷脂。它们可以用于脂肪纯化。它们可以用于鉴定肽抑制剂，用于治疗病毒性、炎性、过敏性和心血管疾病。它们可以用于制备疫苗。它们可以用于制备多不饱和脂肪酸甘油酯和磷
脂酰甘油。
[0788] 本发明的磷脂酶，例如，PLC酶，用于产生免疫毒素和针对各种抗癌治疗的疗法。
[0789] 本发明的磷脂酶可以与用于脱色(即，叶绿素除去)和洗涤剂中(见上)的其他酶一起使用，例如，与其他酶(例如，脂肪酶、蛋白酶、酯酶、磷酸酶)一起使用。例如，在使用PLC的任何情况下，PLD和磷酸酶可以一起使用，产生与单独PLC相同的结果。
[0790] 下表7总结了本发明的几个示例性方法和配方：
[0791] 表7
[0792]
[0793]
[0794]
[0795]
[0796] 糖基化对酶活性的失活和调控
[0797] 本发明提供包括使用重组技术来制备和表达具有生物活性的酶或其他蛋白的方法，例如，有害或有毒酶，(其中酶或其他蛋白不正常糖基化)，处于失活或低活性但可再激活的形式。该方法包括通过对结合有新糖基化位点的编码序列工程化将一个或多个糖基化
位点(例如，N-连接的或O-连接的糖基化)加到具有生物活性的酶或其他蛋白(例如，本
发明的酶)中；在真核细胞中表达变体编码序列或等效工程化的或能够翻译后糖基化的体
外系统。例如，3氨基酸序列NXS/T是真核细胞中的糖基化位点，原核细胞不会糖基化。因
此，本发明包括将至少一个3氨基酸序列NXS/T加到蛋白中，使得其活性由于翻译后糖基化
而降低或失活。
位点(例如，N-连接的或O-连接的糖基化)加到具有生物活性的酶或其他蛋白(例如，本
发明的酶)中；在真核细胞中表达变体编码序列或等效工程化的或能够翻译后糖基化的体
外系统。例如，3氨基酸序列NXS/T是真核细胞中的糖基化位点，原核细胞不会糖基化。因
此，本发明包括将至少一个3氨基酸序列NXS/T加到蛋白中，使得其活性由于翻译后糖基化
而降低或失活。
[0798] 糖基化可以导致2分子N-乙酰氨基葡萄糖(NGlucNac)被加到N残基上。后续添加可以是生物体特异性的。在大多数物种中，然后甘露糖(Mann)被加到NGlucNac上，Mann
残基数量为10～100。在某些物种中也可加入唾液酸。在Pichia中，在加入NGlucNac后，
可以加入10～25Mann残基。
残基数量为10～100。在某些物种中也可加入唾液酸。在Pichia中，在加入NGlucNac后，
可以加入10～25Mann残基。
[0799] 这些方法包括使用任何去糖基化酶或一组酶，许多已经被鉴定和/或可市售购得。例如，内糖苷酶H酶在最后的NGlucNac裂解，留下一个NGlucNac仍连接到N残基。
PNGaseF酶从所有糖裂解，并将N残基的氨基侧链转化成羟基，从而使N氨基酸成为酶中的
天门冬氨酸(D)氨基酸。因此，因此，该方法包括体内或体外使用内糖苷酶H和/或PNGaseF
或等效酶，以使工程化的“暂时失活的”蛋白部分或完全地重新激活。
PNGaseF酶从所有糖裂解，并将N残基的氨基侧链转化成羟基，从而使N氨基酸成为酶中的
天门冬氨酸(D)氨基酸。因此，因此，该方法包括体内或体外使用内糖苷酶H和/或PNGaseF
或等效酶，以使工程化的“暂时失活的”蛋白部分或完全地重新激活。
[0800] 该方法包括靶向酶或其他多肽到宿主分泌途径，从而使酶被糖基化。设计新的糖基化位点，从而糖基化使酶失活或改变其活性，例如，降低其活性或以其他方式改变活性，如阻断底物结合位点。因为酶是失活的或活性低，有害或有毒酶可以在较高水平表达，这是由于其活性的负面影响不再是多少蛋白可以在宿主细胞中积累的限制。通过除去糖类，失
活的、糖基化的酶可以被重新激活(部分或完全地)，例如，使用可市售购得的去糖基化酶，例如，通过体外除去糖，或使用全细胞工程技术体内除去糖类。
活的、糖基化的酶可以被重新激活(部分或完全地)，例如，使用可市售购得的去糖基化酶，例如，通过体外除去糖，或使用全细胞工程技术体内除去糖类。
[0801] 在一个方面，真核糖基化目标位点如NXS/T被加到任何蛋白中，例如，本发明的酶。这样本领域技术人员能够将糖基化位点加到目标蛋白上，并预期当通过在真核宿主细
胞中表达该蛋白并将该蛋白靶向宿主细胞分泌途径使该蛋白被糖基化时，该蛋白转化成临
时失活的蛋白。
胞中表达该蛋白并将该蛋白靶向宿主细胞分泌途径使该蛋白被糖基化时，该蛋白转化成临
时失活的蛋白。
[0802] 因此，本发明提供生产通常过于有害或有毒而不能由宿主细胞大量耐受的酶的方法。效果可以是暂时的，因为可以再生活性酶(通过去糖基化，例如翻译后修饰/去糖基
化)，以进行需要活性酶的进一步工作。
化)，以进行需要活性酶的进一步工作。
[0803] 在一个方面，本发明提供制备和表达具有生物活性的蛋白的方法，其活性通过糖基化暂时失活，包括：(a)提供编码具有生物活性的蛋白的核酸，其中所述蛋白不是天然糖基化的；(b)将至少一个糖基化基序编码序列插入编码蛋白的核酸，其中蛋白的糖基化形
式是失活的；(c)将靶向序列插入蛋白，使其被导向宿主细胞分泌途径，其中所述宿主细胞能够识别糖基化基序并糖基化蛋白；和(d)在宿主细胞中表达修饰的核酸。在一个方面，该方法还包括使表达的蛋白去糖基化，从而重新激活蛋白的活性，例如，酶，如本发明的酶。在一个方面，宿主细胞是真核细胞。在一个方面，失活的表达重组蛋白通过去糖基化体外重新激活，通过化学或酶法。
式是失活的；(c)将靶向序列插入蛋白，使其被导向宿主细胞分泌途径，其中所述宿主细胞能够识别糖基化基序并糖基化蛋白；和(d)在宿主细胞中表达修饰的核酸。在一个方面，该方法还包括使表达的蛋白去糖基化，从而重新激活蛋白的活性，例如，酶，如本发明的酶。在一个方面，宿主细胞是真核细胞。在一个方面，失活的表达重组蛋白通过去糖基化体外重新激活，通过化学或酶法。
[0804] 测定一个或多个糖基化基序使蛋白暂时失活的位置仅涉及到制备编码变体蛋白的核酸的常规方法，例如，GSSM，以及常规筛选方案，例如，活性或结合分析法。
[0805] 活性不利于宿主细胞的酶由于糖基化而呈现失活的。因为它是失活的，所以可以真核宿主细胞中更高水平的积累。因为它不再有活性，所以不再能够发挥负面影响。有毒酶的失活是暂时的，因为使用EndoH或PNGase F使酶去糖基化导致酶的正常活性完全恢复。
大量的糖基化的失活酶积累在培养基中，表明宿主对失活形式耐受性良好。
大量的糖基化的失活酶积累在培养基中，表明宿主对失活形式耐受性良好。
[0806] 应该了解，上述详细说明和伴随的例子只是说明性的，不作为对主题范围的限制。对所披露实施方案做出的各种变化和修改将是本领域技术人员显而易见的。这些变化和修
改，包括但不限于有关本文提供的使用方法，可以在不偏离本发明精神和范围之内作出。提到的专利、专利出版物和其他出版物纳入本文参考。
改，包括但不限于有关本文提供的使用方法，可以在不偏离本发明精神和范围之内作出。提到的专利、专利出版物和其他出版物纳入本文参考。
[0807] 本发明将参考以下实施例进行进一步描述；然而，应当理解本发明并不限于这些实施例。
[0808] 实施例
[0809] 实施例1：用于序列鉴定剖析的BLAST程序
[0810] 本实施例描述用于测定一种核酸是否在本发明范围内的示例性的序列同一性程序。使用NCBI BLAST 2.2.2程序，采用缺省设置进行blastp。使用全部缺省值，除了缺省
过滤设定(即，全部参数设定为缺省，除了过滤设定为OFF)；在该处采用“-F F”设定，其中取消了过滤。由于是短长度的序列，因此缺省过滤的使用经常导致Karlin-Altschul违例。
该实施例中使用的缺省值：
过滤设定(即，全部参数设定为缺省，除了过滤设定为OFF)；在该处采用“-F F”设定，其中取消了过滤。由于是短长度的序列，因此缺省过滤的使用经常导致Karlin-Altschul违例。
该实施例中使用的缺省值：
[0811] ″低复杂度过滤：ON
[0812] ＞字长：3
[0813] ＞矩阵：Blosum62
[0814] ＞缺口成本：存在：11
[0815] ＞延伸：1″
[0816] 其他缺省设定为：低复杂度过滤OFF，用于蛋白的字长3，BLOSUM62矩阵，缺口存在惩罚-11和缺口延伸惩罚-1。“-W”选项设定为缺省为0。这表示如果不设定的话，用于蛋白的字长缺省为3，用于核苷酸的为11。设定读取：
[0817]
[0818]
[0819]
[0820] 实施例2：修饰成PLC酶(ePLC)
[0821] 本实施例描述制备本发明的PLC酶的示例性方案，包括本发明的PI-PLC酶。本实施例描述可以用于实施本发明的酶，例如，与本发明的PLC酶(例如，具有SEQ ID NO：8所示或如表12～15所示的序列的酶)组合使用。可以用于实施本发明的酶，例如，组合或包含
本发明的PLC酶的混合物，包括任何磷脂酶，包括具有如表8或表9所示或WO 2008/036863
中记载的序列的酶。在可选实施方案中，可以用于实施本发明的酶包括具有SEQ ID NO：2
和/或SEQID NO：4中所示的序列的多肽，和其如下表8和表9中所示的变体。
本发明的PLC酶的混合物，包括任何磷脂酶，包括具有如表8或表9所示或WO 2008/036863
中记载的序列的酶。在可选实施方案中，可以用于实施本发明的酶包括具有SEQ ID NO：2
和/或SEQID NO：4中所示的序列的多肽，和其如下表8和表9中所示的变体。
[0822] 具有SEQ ID NO：2所示的序列的磷脂酶C酶(例如由SEQ ID NO：1编码)是更长序列SEQ ID NO：4(例如由SEQ ID NO：3编码)的酶活性子序列。SEQ ID NO：4具有SEQ
ID NO：2的残基1～37(粗体)的前导序列。SEQ IDNO：4，由SEQ ID NO：3编码，用作使用
GSSM技术进一步修饰的模板。位置从N-端蛋氨酸开始编号。突变加下划线和粗体(这里
编号为N100D、N168S和N171D)。
ID NO：2的残基1～37(粗体)的前导序列。SEQ IDNO：4，由SEQ ID NO：3编码，用作使用
GSSM技术进一步修饰的模板。位置从N-端蛋氨酸开始编号。突变加下划线和粗体(这里
编号为N100D、N168S和N171D)。
[0823] MKKKVLALAA MVALAAPVQS VVFAQTNNSE SPAPILRWSA EDKHNEGINS
[0824] HLWIVNRAID IMSRNTTIVN PNETALLNEW RADLENGIYS ADYENPYYDD
[0825] STYASHFYDP DTGTTYIPFA KHAKETGAKY FNLAGQAYQN QDMQQAFFYL
[0826] GLSLHYLGDV NQPMHAASFT DLSYPMGFHS KYENFVDTIK NNYIVSDSNG
[0827] YWNWKGANPE DWIEGAAVAA KQDYPGVVND TTKDWFVKAA VSQEYADKWR
[0828] AEVTPVTGKR LMEAQRVTAG YIHLWFDTYV NR(SEQID NO：4)
[0829] WSA EDKHNEGINS
[0830] HLWIVNRAID IMSRNTTIVN PNETALLNEW RADLENGIYS ADYENPYYDD
[0831] STYASHFYDP DTGTTYIPFA KHAKETGAKY FNLAGQAYQN QDMQQAFFYL
[0832] GLSLHYLGDV NQPMHAASFT DLSYPMGFHS KYENFVDTIK NNYIVSDSNG
[0833] YWNWKGANPE DWIEGAAVAA KQDYPGVVND TTKDWFVKAA VSQEYADKWR
[0834] AEVTPVTGKR LMEAQRVTAG YIHLWFDTYV NR(SEQID NO：2)
[0835] ATGAAAAAGAAAGTATTAGCACTAGCAGCTATGGTTGCTTTAGCTGCGC
[0836] CAGTTCAAAGTGTAGTATTTGCACAAACAAATAATAGTGAAAGTCCTGC
[0837] ACCGATTTTAAGATGGTCAGCTGAGGATAAGCATAATGAGGGGATTAAC
[0838] TCTCATTTGTGGATTGTAAATCGTGCAATTGACATCATGTCTCGTAATA
[0839] CAACGATTGTGAATCCGAATGAAACTGCATTATTAAATGAGTGGCGTGC
[0840] TGATTTAGAAAATGGTATTTATTCTGCTGATTACGAGAATCCTTATTAT
[0841] GATGATAGTACATATGCTTCTCACTTTTATGATCCGGATACTGGAACAA
[0842] CATATATTCCTTTTGCGAAACATGCAAAAGAAACAGGCGCAAAATATTT
[0843] TAACCTTGCTGGTCAAGCATACCAAAATCAAGATATGCAGCAAGCATTC
[0844] TTCTACTTAGGATTATCGCTTCATTATTTAGGAGATGTGAATCAGCCAA
[0845] TGCATGCAGCATCTTTTACGGATCTTTCTTATCCAATGGGTTTCCATTC
[0846] TAAATACGAAAATTTTGTTGATACAATAAAAAATAACTATATTGTTTCA
[0847] GATAGCAATGGATATTGGAATTGGAAAGGAGCAAACCCAGAAGATTGGA
[0848] TTGAAGGAGCAGCGGTAGCAGCTAAACAAGATTATCCTGGCGTTGTGAA
[0849] CGATACGACAAAAGATTGGTTTGTAAAAGCAGCCGTATCTCAAGAATAT
[0850] GCAGATAAATGGCGTGCGGAAGTAACACCGGTGACAGGAAAGCGTTTAA
[0851] TGGAAGCGCAGCGCGTTACAGCTGGTTATATTCATTTGTGGTTTGATAC
[0852] GTATGTAAATCGCTAA(SEQIDNO：3)
[0853] TGGTCAGCTGAGGATAAGCATAATGAGGGGATTAACTCTCATTTGTGGA
[0854] TTGTAAATCGTGCAATTGACATCATGTCTCGTAATACAACGATTGTGAA
[0855] TCCGAATGAAACTGCATTATTAAATGAGTGGCGTGCTGATTTAGAAAAT
[0856] GGTATTTATTCTGCTGATTACGAGAATCCTTATTATGATGATAGTACAT
[0857] ATGCTTCTCACTTTTATGATCCGGATACTGGAACAACATATATTCCTTT
[0858] TGCGAAACATGCAAAAGAAACAGGCGCAAAATATTTTAACCTTGCTGGT
[0859] CAAGCATACCAAAATCAAGATATGCAGCAAGCATTCTTCTACTTAGGAT
[0860] TATCGCTTCATTATTTAGGAGATGTGAATCAGCCAATGCATGCAGCATC
[0861] TTTTACGGATCTTTCTTATCCAATGGGTTTCCATTCTAAATACGAAAAT
[0862] TTTGTTGATACAATAAAAAATAACTATATTGTTTCAGATAGCAATGGAT
[0863] ATTGGAATTGGAAAGGAGCAAACCCAGAAGATTGGATTGAAGGAGCAGC
[0864] GGTAGCAGCTAAACAAGATTATCCTGGCGTTGTGAACGATACGACAAAA
[0865] GATTGGTTTGTAAAAGCAGCCGTATCTCAAGAATATGCAGATAAATGGC
[0866] GTGCGGAAGTAACACCGGTGACAGGAAAGCGTTTAATGGAAGCGCAGCG
[0867] CGTTACAGCTGGTTATATTCATTTGTGGTTTGATACGTATGTAAATCGC
[0868] TAA(SEQID NO：1)
[0869] 使用上述基因位点饱和诱变(GSSM)方法进行单残基突变并分析磷脂酶活性。为了筛选目的，表达载体是E.coli宿主Top10中的pASK。GSSM命中选自PA/PI乳液用作底
31
物和通过LCMS分析样品的初级筛选。然后，对大豆油确认这些初级命中并通过 PNMR和
HPLC分析。
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物和通过LCMS分析样品的初级筛选。然后，对大豆油确认这些初级命中并通过 PNMR和
HPLC分析。
[0870] 通过NMR分析制备样品的大豆油分析和程序如下：
[0871] 通过在900mL水中溶解25g脱氧酸、5.84g EDTA、5.45g Tris base制备NMR洗涤剂，然后使用KOH颗粒将pH调节到10.5。NMR内标是在HPLC级异丙醇中的50mM TIP和
12.5mM TBP。氧化氘(D，99.9％)低顺磁得自于Cambridge Isotope Laboratories Inc.
(DLM-11-100)。NMR对照是Avanti卵磷脂(International Lecithin & Phospholipids
Society mixed soy phospholipids reference Standard oil)，Avanti Polar Lipids
Inc，#95309。
12.5mM TBP。氧化氘(D，99.9％)低顺磁得自于Cambridge Isotope Laboratories Inc.
(DLM-11-100)。NMR对照是Avanti卵磷脂(International Lecithin & Phospholipids
Society mixed soy phospholipids reference Standard oil)，Avanti Polar Lipids
Inc，#95309。
[0872] 这些标准和样品制备如下：
[0873] 彻底混合一批粗制大豆油
[0874] 将1mL油分散到2mL管中。加入60μL纯化的酶(用于对照，18单位)或纯的细胞裂解液(用于筛选突变体)；混合15秒。单位定义为在37℃、pH 7.3下水解1μmol PC/
分钟。
分钟。
[0875] 在热混合器中在60℃孵育48小时，在14000rpm下晃动，间歇性涡旋。
[0876] 孵育后，使用涡旋彻底混合样品
[0877] 每个样品称量出250mg(+/-0.2mg)，加到2mL管中，称量出10mg(+/-0.1mg)Avanti卵磷脂作为NMR对照。
[0878] 加入900μL NMR洗涤剂，然后加入100μL D2O到每个样品。
[0879] 通过在Eppendorf热混合器中涡旋和晃动彻底混合样品，在30-37℃、14000rpm下30分钟
[0880] 在13,000RPM下离心10分钟
[0881] 仔细除去上层油层
[0882] 将750μL正己烷加到每个样品中，温和涡旋*
[0883] 在13,000RPM下离心10分钟
[0884] 仔细除去600μL底层水层并转移到新管
[0885] 加入25μL内标，充分混合
[0886] 转移500μL到5mm NMR管。
[0887] 根据以下方案，通过定量HPLC测量DAG释放：
[0888] 混合大约50μl油样品和950μl正己烷/异丙醇(9∶1)成为1ml的样品溶TM
液。标准溶液例如是0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml的ENOVA 油(Kao
Corporation，Itasca，IL)。Enova油是高DAG油，其脂肪酸分布类似于规格植物油(1，3-DAG和1，2-DAG)。
液。标准溶液例如是0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml的ENOVA 油(Kao
Corporation，Itasca，IL)。Enova油是高DAG油，其脂肪酸分布类似于规格植物油(1，3-DAG和1，2-DAG)。
[0889] HPLC 设置
[0890] 柱子：ChromegasphereTM SI-60、15cm×4.6mm
[0891] 温度：40℃
[0892] 流量：2mL/min
[0893] 注射量：20ul
[0894] 流动相A：正己烷
[0895] 流动相B：正己烷/异丙醇/乙酸乙酯/甲酸＝800∶100∶100∶1
[0896] 梯度洗脱：
[0897]时间(min) 0 8 8.5 15 15.1 19
％B 2 35 98 98 2 2
％B 2 35 98 98 2 2
[0898] 蒸发光散射检测器(ELSD法)设置：示例性的设置是温度40℃，增益5，氮气3.5bar。通过比较保留时间与标准确定DAG峰。量化基于检测器响应(峰面积)与分析物
浓度之间的关系。
浓度之间的关系。
[0899] 表8描述可以用于实施本发明的序列，例如，与本发明的多肽(参见，例如，表12～15)组合，例如，作为混合物或酶组合。
[0900] 基于：NMR和HPLC数据，选择下表8所示的突变。下表8表明起始氨基酸、氨基酸改变的位码和改变的氨基酸(对于SEQ ID NO：4)。表8还表明初始密码子、替换密码
子和相同改变到氨基酸的其他密码子。例如，第二行，“E41A”，表明在41位的氨基酸最初是“E”(谷氨酸)，但改变到“A”(丙氨酸)。变化E41A的初始密码子是“GAG”，但改变到“GCA”。然而，密码子“GCG”、“GCC”或“GCT”也可以使用。表8所示的密码子变体以相对于“野生型”(SEQIDNO：4)最好变化或“改良”产生(SEQ ID NO：4的)变体，用于PA水解。本发明提供核酸，和编码它的多肽，包括表8所示的一个、几个或全部或变体，或全部变体的等效物。
子和相同改变到氨基酸的其他密码子。例如，第二行，“E41A”，表明在41位的氨基酸最初是“E”(谷氨酸)，但改变到“A”(丙氨酸)。变化E41A的初始密码子是“GAG”，但改变到“GCA”。然而，密码子“GCG”、“GCC”或“GCT”也可以使用。表8所示的密码子变体以相对于“野生型”(SEQIDNO：4)最好变化或“改良”产生(SEQ ID NO：4的)变体，用于PA水解。本发明提供核酸，和编码它的多肽，包括表8所示的一个、几个或全部或变体，或全部变体的等效物。
[0901] 在图10中，各磷脂(PL)物种的重量分数相对于反应后剩余的总PL给出，反映了突变体对特定物种的特异性。这里，物种是磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇
(PI)、磷脂酰胆碱(PC)。“TIP”是指NMR内标。通过HPLC测量“释放的DAG”，反映总1，
3-DAG和1，2-DAG的样品和对照之间的相对值。阳性对照是E41A突变体的纯化样品，先前
描述在Tan等人，Biochemistry37：4275-4279(1998)中。结果表明，突变体充分释放DAG，并且对不同物种具有良好的活性，包括磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，与模板(SEQ IDNO：4)相当或更好。例如，D100L和D100M表明对PA特别的活性。Q265R表明对PI特别
的活性。这些突变可以组合以提供对各种底物具有目标活性的酶。
(PI)、磷脂酰胆碱(PC)。“TIP”是指NMR内标。通过HPLC测量“释放的DAG”，反映总1，
3-DAG和1，2-DAG的样品和对照之间的相对值。阳性对照是E41A突变体的纯化样品，先前
描述在Tan等人，Biochemistry37：4275-4279(1998)中。结果表明，突变体充分释放DAG，并且对不同物种具有良好的活性，包括磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，与模板(SEQ IDNO：4)相当或更好。例如，D100L和D100M表明对PA特别的活性。Q265R表明对PI特别
的活性。这些突变可以组合以提供对各种底物具有目标活性的酶。
[0902] 表8：GSSM命中
[0903]
[0904]
[0905] 在可选实施方案中，本发明提供PLC酶的组合(混合物)，或编码它们的核酸，包括核酸序列SEQ ID NO：3(编码多肽SEQ ID NO：4)和/或核酸序列SEQ ID NO：1(编码多肽SEQ ID NO：2)；或PLC酶的(混合物)，包括SEQ IDNO：2和/或SEQ ID NO：4。
[0906] 在可选实施方案中，本发明提供PLC酶的组合(混合物)，或编码它们的核酸，包括具有编码上表8例出的氨基酸突变的1个、2个或更高或所有核酸(突变)的核酸序列SEQID NO：3(编码多肽SEQ ID NO：4)和/或核酸序列SEQID NO：1(编码多肽SEQ ID NO：2)，
包括例如在此所述的密码子改变。在可选实施方案中，本发明提供由这些核酸编码的PLC
酶的组合(混合物)，例如，由表8所示的1个、几个或所有的SEQ ID NO：3和/或SEQ ID
NO：1核酸序列变体编码的PLC酶的组合(混合物)。
包括例如在此所述的密码子改变。在可选实施方案中，本发明提供由这些核酸编码的PLC
酶的组合(混合物)，例如，由表8所示的1个、几个或所有的SEQ ID NO：3和/或SEQ ID
NO：1核酸序列变体编码的PLC酶的组合(混合物)。
[0907] 在筛选出GSSM命中并选定最高命中(见上表8)后，在卵黄板上进行进一步表征分析，以缩小使用基因重组技术进行的单个GSSM突变体的数量。表10示出卵黄分析数据
(卵黄分析如下所述)，以及油分析和热耐受性残余活性测定的结果。图11示出被选择包
括在基因重组过程中的单个GSSM向上突变体。基因重组按在此所述的进行。
(卵黄分析如下所述)，以及油分析和热耐受性残余活性测定的结果。图11示出被选择包
括在基因重组过程中的单个GSSM向上突变体。基因重组按在此所述的进行。
[0908] 下表9列出可以用于实施本发明的288个多肽序列，例如，与本发明的多肽结合(参见，例如，表12～15)，例如，作为混合物或酶组合。通过选定的GSSM向上突变体的基
因重组组合创建表9的序列。所有都是起始氨基酸序列SEQ ID NO：4的变体(“野生型”
或“WT”序列)。
因重组组合创建表9的序列。所有都是起始氨基酸序列SEQ ID NO：4的变体(“野生型”
或“WT”序列)。
[0909] 为了帮助阅读表9，例如，对于表征为“进化的”磷脂酶1的磷脂酶(表的第二行)：
[0910] -在残基位置41(SEQ ID NO：4的)的野生型氨基酸残基“E”，或谷氨酸(glu)被修饰成“Y”，或酪氨酸(tyr)残基；
[0911] -在残基位置100(SEQ ID NO：4的)的野生型氨基酸残基“N”，或天冬酰胺酸(asp)被修饰成“M”，或蛋氨酸(met)残基；
[0912] -在残基位置168(SEQ ID NO：4的)的野生型氨基酸残基“N”，或天冬酰胺酸(asp)被修饰成“S”或丝氨酸(ser)残基；
[0913] -在残基位置171(SEQ ID NO：4的)的野生型氨基酸残基“N”，或天冬酰胺酸(asp)保持“N”；和，
[0914] -在残基位置176(SEQ ID NO：4的)的野生型氨基酸残基“M”，或蛋氨酸(met)保持“M”。
[0915] 表9：来自单个GSSM向上突变体的基因重组组合的磷脂酶文库
[0916]“进化的”磷脂酶 E41 N100 N168 N171 M176
[0917]1 Y M S N M
2 F W S E M
3 A M N E W
4 Y F S E M
5 Y Y S N M
6 R F N E M
7 E Y N E M
8 E F N N W
9 A W S E M
10 Y Y S N W
11 E L S N W
12 A F N N M
13 W M N N M
14 W Y S E M
15 R L N E W
16 W W S E W
17 W N S N M
18 W L N E M
19 R N N E M
20 F N N N W
21 Y N S E M
22 R N S N W
23 F Y S N W
24 F L N E W
25 A N N E M
26 A W N N M
27 W M N E W
28 F L S E W
29 Y F S N M
30 F F N N M
31 E W N E M
32 E W N N W
33 E W S E M
34 E Y S N M
35 E N S N M
36 E L N E W
37 Y M N E M
38 F N S N W
39 W N N E W
40 E M S N M
41 Y N S N M
42 Y Y N E M
43 Y L N E M
44 F M N N W
45 F N S E M
46 F M S N W
47 E F S N W
48 W Y N E W
49 F F N E M
2 F W S E M
3 A M N E W
4 Y F S E M
5 Y Y S N M
6 R F N E M
7 E Y N E M
8 E F N N W
9 A W S E M
10 Y Y S N W
11 E L S N W
12 A F N N M
13 W M N N M
14 W Y S E M
15 R L N E W
16 W W S E W
17 W N S N M
18 W L N E M
19 R N N E M
20 F N N N W
21 Y N S E M
22 R N S N W
23 F Y S N W
24 F L N E W
25 A N N E M
26 A W N N M
27 W M N E W
28 F L S E W
29 Y F S N M
30 F F N N M
31 E W N E M
32 E W N N W
33 E W S E M
34 E Y S N M
35 E N S N M
36 E L N E W
37 Y M N E M
38 F N S N W
39 W N N E W
40 E M S N M
41 Y N S N M
42 Y Y N E M
43 Y L N E M
44 F M N N W
45 F N S E M
46 F M S N W
47 E F S N W
48 W Y N E W
49 F F N E M
[0918]50 R M S N W
51 A N N E W
52 R W S N M
53 R L S N M
54 R W N E M
55 F W N N M
56 E L N N W
57 E L S E M
58 A Y S N W
59 E Y S N W
60 W N N E M
61 W N N N W
62 A F S N M
63 Y M S E W
64 R F S N M
65 A M N N M
66 F N N E M
67 E M N E M
68 E Y S E M
69 E F S E M
70 E W S N M
71 F W S N W
72 E W N E W
73 Y L N N W
74 Y N S N W
75 A Y S E W
76 E F S N M
77 W L S N M
78 Y N N E M
79 E F N E M
80 W N S E M
81 E M S E M
82 W N S N W
83 E W S N W
84 Y M N E W
85 E Y N N W
86 F M N E W
87 R L S E W
88 W F S N M
89 E L S N M
90 E L N E M
91 Y F N N W
92 Y L S E M
93 A N S N W
94 E N N N W
95 E M S N W
96 R N N E W
97 E M N E W
98 F W S E W
51 A N N E W
52 R W S N M
53 R L S N M
54 R W N E M
55 F W N N M
56 E L N N W
57 E L S E M
58 A Y S N W
59 E Y S N W
60 W N N E M
61 W N N N W
62 A F S N M
63 Y M S E W
64 R F S N M
65 A M N N M
66 F N N E M
67 E M N E M
68 E Y S E M
69 E F S E M
70 E W S N M
71 F W S N W
72 E W N E W
73 Y L N N W
74 Y N S N W
75 A Y S E W
76 E F S N M
77 W L S N M
78 Y N N E M
79 E F N E M
80 W N S E M
81 E M S E M
82 W N S N W
83 E W S N W
84 Y M N E W
85 E Y N N W
86 F M N E W
87 R L S E W
88 W F S N M
89 E L S N M
90 E L N E M
91 Y F N N W
92 Y L S E M
93 A N S N W
94 E N N N W
95 E M S N W
96 R N N E W
97 E M N E W
98 F W S E W
[0919]99 W W N N M
100 W N N N M
101 E N S E W
102 R W S E W
103 A W S E W
104 A Y S E M
105 F Y S E W
106 A Y N N W
107 R N S N M
108 F F N N W
109 Y N N E W
110 E W S E W
111 R N S E M
112 E L N N M
113 E N S N W
114 R W S N W
115 F W N E M
116 Y Y N E W
117 F Y N N W
118 W Y S N W
119 A N S N M
120 A L S N W
121 E Y N E W
122 E Y S E W
123 W N S E W
124 E M N N M
125 E N N E M
126 Y W N E W
127 A W N N W
128 Y Y S E M
129 W Y N N W
130 F Y N E M
131 A N S E M
132 A L S E W
133 E F N E W
134 R N S E W
135 F N S E W
136 E W N N M
137 E N N E W
138 W W N E W
139 Y W S N W
140 W Y N E M
141 R Y S N W
142 F Y S N M
143 Y F S N W
144 R L N E M
145 F N N E W
146 Y N S E W
147 R N N N M
100 W N N N M
101 E N S E W
102 R W S E W
103 A W S E W
104 A Y S E M
105 F Y S E W
106 A Y N N W
107 R N S N M
108 F F N N W
109 Y N N E W
110 E W S E W
111 R N S E M
112 E L N N M
113 E N S N W
114 R W S N W
115 F W N E M
116 Y Y N E W
117 F Y N N W
118 W Y S N W
119 A N S N M
120 A L S N W
121 E Y N E W
122 E Y S E W
123 W N S E W
124 E M N N M
125 E N N E M
126 Y W N E W
127 A W N N W
128 Y Y S E M
129 W Y N N W
130 F Y N E M
131 A N S E M
132 A L S E W
133 E F N E W
134 R N S E W
135 F N S E W
136 E W N N M
137 E N N E W
138 W W N E W
139 Y W S N W
140 W Y N E M
141 R Y S N W
142 F Y S N M
143 Y F S N W
144 R L N E M
145 F N N E W
146 Y N S E W
147 R N N N M
[0920]148 E Y N N M
149 R W S E M
150 Y W N N W
151 A W S N W
152 R Y S E M
153 R Y N E M
154 W Y S E W
155 A Y N E W
156 Y M N N W
157 Y F N N M
158 A N S E W
159 Y N N N M
160 E F N N M
161 Y W S E M
162 Y W N E M
163 W W N N W
164 F Y N E W
165 W Y S N M
166 A Y N E M
167 F F S E W
168 W L S E M
169 Y Y S E W
170 E L S E W
171 F N N N M
172 E N N N M
173 W W S E M
174 A W N E M
175 R Y N N W
176 A Y S N M
177 R Y S N M
178 R Y S E W
179 R M N E W
180 W F N E M
181 E F S E W
182 E M S E W
183 A N N N M
184 E N S E M
185 F W N N W
186 F W S N M
187 R Y N E W
188 Y Y N N W
189 F Y S E M
190 F N S N M
191 R F S E W
192 F L S N W
193 W Y N N M
194 A L N N M
195 F L N N M
196 A F S E W
149 R W S E M
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151 A W S N W
152 R Y S E M
153 R Y N E M
154 W Y S E W
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156 Y M N N W
157 Y F N N M
158 A N S E W
159 Y N N N M
160 E F N N M
161 Y W S E M
162 Y W N E M
163 W W N N W
164 F Y N E W
165 W Y S N M
166 A Y N E M
167 F F S E W
168 W L S E M
169 Y Y S E W
170 E L S E W
171 F N N N M
172 E N N N M
173 W W S E M
174 A W N E M
175 R Y N N W
176 A Y S N M
177 R Y S N M
178 R Y S E W
179 R M N E W
180 W F N E M
181 E F S E W
182 E M S E W
183 A N N N M
184 E N S E M
185 F W N N W
186 F W S N M
187 R Y N E W
188 Y Y N N W
189 F Y S E M
190 F N S N M
191 R F S E W
192 F L S N W
193 W Y N N M
194 A L N N M
195 F L N N M
196 A F S E W
[0921]197 W F S E W
198 A F N E W
199 R L S N W
200 W L N E W
201 Y L S N W
202 R M N E M
203 A M S E W
204 Y W S N M
205 R Y N N M
206 Y M N N M
207 W M N N W
208 F F S E M
209 Y F S E W
210 W F S E M
211 W L S N W
212 R L N N W
213 W L N N W
214 W M S N W
215 W M S E W
216 R W N E W
217 R L N N M
218 R F N N M
219 A N N N W
220 Y F N E M
221 W F N N W
222 R F S E M
223 F L S N M
224 F L S E M
225 A M S E M
226 A M S N M
227 R M S E M
228 R W N N W
229 A Y N N M
230 Y W N N M
231 E M N N W
232 A F S E M
233 W F N E W
234 W F S N W
235 A L S E M
236 Y L N E W
237 F M S E M
238 W M S E M
239 F M S E W
240 Y W S E W
241 W F N N M
242 W L N N M
243 R M N N W
244 R F N N W
245 A F N N W
198 A F N E W
199 R L S N W
200 W L N E W
201 Y L S N W
202 R M N E M
203 A M S E W
204 Y W S N M
205 R Y N N M
206 Y M N N M
207 W M N N W
208 F F S E M
209 Y F S E W
210 W F S E M
211 W L S N W
212 R L N N W
213 W L N N W
214 W M S N W
215 W M S E W
216 R W N E W
217 R L N N M
218 R F N N M
219 A N N N W
220 Y F N E M
221 W F N N W
222 R F S E M
223 F L S N M
224 F L S E M
225 A M S E M
226 A M S N M
227 R M S E M
228 R W N N W
229 A Y N N M
230 Y W N N M
231 E M N N W
232 A F S E M
233 W F N E W
234 W F S N W
235 A L S E M
236 Y L N E W
237 F M S E M
238 W M S E M
239 F M S E W
240 Y W S E W
241 W F N N M
242 W L N N M
243 R M N N W
244 R F N N W
245 A F N N W
[0922]246 F F N E W
247 A L N E W
248 Y L S N M
249 F M S N M
250 Y M S E M
251 F M N E M
252 F W N E W
253 Y L N N M
254 R W N N M
255 Y N N N W
256 R F S N W
257 A F S N W
258 A F N E M
259 A L N N W
260 A L N E M
261 R M S E W
262 W M S N M
263 R M S N M
264 A W S N M
265 R M N N M
266 F Y N N M
267 A M N N W
268 F F S N M
269 Y F N E W
270 F L N E M
271 Y L S E W
272 F L N N W
273 Y M S N W
274 A M N E M
275 A W N E W
276 W W S N W
277 F M N N M
278 Y Y N N M
279 R N N N W
280 F F S N W
281 R F N E W
282 A L S N M
283 W L S E W
284 R L S E M
285 W M N E M
286 A M S N W
287 W W N E M
288 W W S N M
247 A L N E W
248 Y L S N M
249 F M S N M
250 Y M S E M
251 F M N E M
252 F W N E W
253 Y L N N M
254 R W N N M
255 Y N N N W
256 R F S N W
257 A F S N W
258 A F N E M
259 A L N N W
260 A L N E M
261 R M S E W
262 W M S N M
263 R M S N M
264 A W S N M
265 R M N N M
266 F Y N N M
267 A M N N W
268 F F S N M
269 Y F N E W
270 F L N E M
271 Y L S E W
272 F L N N W
273 Y M S N W
274 A M N E M
275 A W N E W
276 W W S N W
277 F M N N M
278 Y Y N N M
279 R N N N W
280 F F S N W
281 R F N E W
282 A L S N M
283 W L S E W
284 R L S E M
285 W M N E M
286 A M S N W
287 W W N E M
288 W W S N M
[0923] 表10总结了分析本发明的示例性酶的各种酶活性和表达系统行为(并且在毕赤酵母表达系统的情况下，编码它们的核酸的表达活性)的分析结果，所有本发明的多肽是
起始磷脂酶序列SEQ ID NO：4(例如由核酸序列SEQ IDNO：3编码)的序列变体。
起始磷脂酶序列SEQ ID NO：4(例如由核酸序列SEQ IDNO：3编码)的序列变体。
[0924] 表10：活性分析和总结
[0925]
[0926]
[0927] 卵黄分析
[0928] 卵黄分析如下：
[0929] 通过在高压灭菌前将0.5％(wt.)的卵黄磷脂酰胆碱加到培养基中准备卵黄板。如果在对培养基进行高压灭菌前将磷脂酰胆碱用高剪切混合器分散，则该板更均匀。
[0930] 在琼脂中冲孔并将等体积(例如，2ml)的系列稀释样品，包括阳性对照，装填到孔中。
[0931] 将板在37℃下放置3-12小时，在这段时间内酶从孔扩散，水解卵黄卵磷脂，由于形成二酰基甘油而形成沉淀区。
[0932] 对于沉淀环内的面积，按环直径或积分密度值(IDV)测量，相对于阳性对照的标准曲线绘制，以测定样品磷脂酶的活性。整个过程可以用于测定样品的未知的PLC活性。该方法是半定量的。
[0933] 磷脂酰胆碱(PC)：From Sigma，Catalog No.P 5394
[0934] 来自干燥卵黄的PC，Type X-E，大约60％PC，TLC。
[0935] 在可选实施方案中，本发明提供本发明的酶的组合或混合物以及实施例2所示的酶，包括例如，表8和表9以及WO 2008/036863中所示的所有酶变体。
[0936] 实施例3：制备本发明的示例性的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶
[0937] 本实施例描述本发明的示例性磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶，包括具有SEQ ID NO：8所示的序列的多肽，和具有表12～15所示的PI-PLC活性的多肽；和制备和
使用它们的示例性方法，以及测定它们的磷脂酶活性的分析法。
使用它们的示例性方法，以及测定它们的磷脂酶活性的分析法。
[0938] 在可选实施方案中，本发明提供具有PI-PLC酶活性的多肽。在一些实施方案中，这些多肽通过以下方法构造：
[0939] 对于这一系列的实施方案，具有SEQ ID NO：6(例如由编码SEQ ID NO：5)的氨基酸序列的多肽被选定为用于进一步修饰(或“进化”)的“亲代”或“野生型”序列；特别是，SEQ ID NO：6(或SEQ ID NO：5)的下划线(见下)子序列用于加入起始蛋氨酸(例如，
MASSINV...)，作为“进化”或序列改变而制造酶变体用的“亲代”或起始序列。注意，“进化”用的“亲代”或起始序列缺少最初的30个氨基酸，包括信号序列(斜体)，或
MASSINV...)，作为“进化”或序列改变而制造酶变体用的“亲代”或起始序列。注意，“进化”用的“亲代”或起始序列缺少最初的30个氨基酸，包括信号序列(斜体)，或
[0940] MNNKKFILKLFICSMVLSAFVF，例如由以下编码：
[0941] ATGAACAATAAGAAGTTTATTTTGAAGTTATTCATATGTAGTATGGTaCTTAGCGCCTTTGTATTT
[0942] “进化”用的“亲代”或起始序列也缺少预测的裂解位点(粗斜体)GCTTTC(核酸)或AF(氨基酸残基)。
[0943] 使用以下的下划线序列在SEQ ID NO：5上使用“基因位点饱和诱变”(GSSM)和基因重组(参见，上面对于GSSM和基因重组的描述)进行“进化”(序列改变或“突变”)，加
入编码起始“M”或蛋氨酸(例如，对于编码的氨基酸序列，MASSINV...)的核酸，作为“进化”用的亲代或起始序列：
入编码起始“M”或蛋氨酸(例如，对于编码的氨基酸序列，MASSINV...)的核酸，作为“进化”用的亲代或起始序列：
[0944] SEQ IDNO：5：
[0945] ATGAACAATAAGAAGTTTATTTTGAAGTTATTCATATGTAGTATGGTACTTAGCGCCTTT
[0946] GTATTTGCTTTCAATGATAAGAAAACCGTTGCAGCTAGCTCTATTAATGTGCTTGAA
[0947] AATTGGTCTAGATGGATGAAACCTATAAATGATGACATACCGTTAGCACGAATTTCA
[0948] ATTCCAGGAACACATGATAGTGGAACGTTCAAGTTGCAAAATCCGATAAAGCAAGT
[0949] GTGGGGAATGACGCAAGAATATGATTTTCGTTATCAAATGGATCATGGAGCTAGAA
[0950] TTTTTGATATAAGAGGGCGTTTAACAGATGATAATACGATAGTTCTTCATCATGGGC
[0951] CATTATATCTTTATGTAACACTGCACGAATTTATAAACGAAGCGAAACAATTTTTAA
[0952] AAGATAATCCAAGTGAAACGATTATTATGTCTTTAAAAAAAGAGTATGAGGATATG
[0953] AAAGGGGCGGAAAGCTCATTTAGTAGTACGTTTGAGAAAAATTATTTTCGTGATCCA
[0954] ATCTTTTTAAAAACAGAAGGGAATATAAAGCTTGGAGATGCTCGTGGGAAAATTGT
[0955] ATTACTAAAAAGATATAGTGGTAGTAATGAATCTGGGGGATATAATAATTTCTATTG
[0956] GCCAGACAATGAGACGTTTACCTCAACTATAAATCAAAATGTAAATGTAACAGTAC
[0957] AAGATAAATATAAAGTGAGTTATGATGAGAAAATAAACGCTATTAAAGATACATTA
[0958] AATGAAACGATTAACAATAGTGAAGATGTTAATCATCTATATATTAATTTTACAAGC
[0959] TTGTCTTCTGGTGGTACAGCATGGAATAGTCCATATTATTATGCGTCCTACATAAATC
[0960] CTGAAATTGCAAATTATATGAAGCAAAAGAATCCTACGAGAGTGGGCTGGATAATA
[0961] CAAGATTATATAAATGAAAAATGGTCACCATTACTTTATCAAGAAGTTATAAGAGC
[0962] GAATAAGTCACTTGTAAAATAG
[0963] SEQ IDNO：6：
[0964] MNNKKFILKLFICSMVLSAFVFAFNDKKTVAASSINVLENWSRWMKPINDDIPLARISIPG
[0965] THDSGTFKLQNPIKQVWGMTQEYDFRYQMDHGARIFDIRGRLTDDNTIVLHHGPLYLY
[0966] VTLHEFINEAKQFLKDNPSETIIMSLKKEYEDMKGAESSFSSTFEKNYFRDPIFLKTEGNI
[0967] KLGDARGKIVLLKRYSGSNESGGYNNFYWPDNETFTSTINQNVNVTVQDKYKVSYDEK
[0968] INAIKDTLNETINNSEDVNHLYINFTSLSSGGTAWNSPYYYASYINPEIANYMKQKNPTR
[0969] VGWIIQDYINEKWSPLLYQEVIRANKSLVK
[0970] 因此，GSSM用的起始序列是编码下面的核酸：
[0971] MASSINVLENWSRWMKPINDDIPLARISIPGTHDSGTFKLQNPIKQVWGMTQEYDFRYQ
[0972] MDHGARIFDIRGRLTDDNTIVLHHGPLYLYVTLHEFINEAKQFLKDNPSETIIMSLKKEYE
[0973] DMKGAESSFSSTFEKNYFRDPIFLKTEGNIKLGDARGKIVLLKRYSGSNESGGYNNFYWP
[0974] DNETFTSTINQNVNVTVQDKYKVSYDEKINAIKDTLNETINNSEDVNHLYINFTSLSSGG
[0975] TAWNSPYYYASYINPEIANYMKQKNPTRVGWIIQDYINEKWSPLLYQEVIRANKSLVK
[0976] “进化的”核酸变体(通过使SEQ ID NO：5进行GSSM制成的新核酸序列)被亚克隆以在大肠杆菌(对于GSSM态)中或在荧光假单胞菌(对于基因重组态)中表达。
[0977] GSSM按例如美国专利No.6,171,820；6,238,884(也参见，本文的解释)中所述的进行。也参见WO 2008/036863。
[0978] 使用高通量分析来分析生成的新“变体”或“进化的”核酸和多肽序列，如下：
[0979] 高通量热稳定性分析的SOP
[0980] GSSM筛选使用大肠杆菌宿主XL1Blue(Stratagene，San Diego，CA)，具有pASK载体(IBA GmbH， 基因重组筛选使用荧光假单胞菌宿主(Dow Global
Technologies Inc.，US专利公开申请NO.20050130160、US专利公开申请NO.20050186666
和US专利公开申请NO.20060110747)，具有pDOW1169载体(Dow Global Technologies
Inc.，US专利公开申请NO.20080058262)，并通过在M9最小培养基中生长而选择(Dow
Global Technologies Inc.，US专利公开申请NO.20050186666)。
Technologies Inc.，US专利公开申请NO.20050130160、US专利公开申请NO.20050186666
和US专利公开申请NO.20060110747)，具有pDOW1169载体(Dow Global Technologies
Inc.，US专利公开申请NO.20080058262)，并通过在M9最小培养基中生长而选择(Dow
Global Technologies Inc.，US专利公开申请NO.20050186666)。
[0981] 母板
[0982] 1.通过菌落采集GSSM或基因重组变体进入含有50μL培养基/孔的384孔板创建母板。
[0983] a.用于生长GSSM变体的培养基是LB，基因重组变体使用M9(-尿嘧啶)。
[0984] 2.母板在湿润孵育器中在30℃下生长过夜。然后，加入20％甘油，然后将板在-80℃下保存。
[0985] 表达板
[0986] 1.在复制之前将母板在室温或30℃下解冻。
[0987] 2.使用384孔针头复制母板，接种含有60μL培养基的表达板。相同的培养基用于作为母板的表达板。
[0988] 3.表达板在湿润孵育器中在30℃下生长过夜(大约16hr)。
[0989] 4.GSSM筛选用的表达板用200ng/mL无水四环素(AHT)诱导，基因重组板诱导至最终浓度0.3mM IPTG。
[0990] 5.表达板在湿润孵育器中在30℃下生长过夜。
[0991] 6.然后，表达板保存在-20℃下直到冷冻，通常过夜，以裂解宿主细胞。
[0992] 7.在分析表达板之前，在室温或30℃下解冻。
[0993] 机器人耐热性筛选
[0994] 1.对机器人编程以从表达板转移10μL到分析RT板和分析热板。
[0996] 表11.初级和次级机器人筛选用的温度。
[0997]筛选 GSSM变体的温度处理 基因重组变体的温度处理
初级 50℃、55℃ 65℃
次级 57℃、60℃ 70℃
初级 50℃、55℃ 65℃
次级 57℃、60℃ 70℃
[0998] 3.在热处理40μL底物后，使用titertek加入甲基umbelliferyl myo-肌醇磷酸酯(MUPI)。底物制备成浓度3mM，使得在分析板中的最终浓度为2.5mM。
[1000] 残余活性％的计算
[1001] 1.各分析板含有12个阳性和12个阴性对照。阳性对照含有野生型酶，阴性对照含有仅在宿主生物体内的载体。
[1002] 2.对于每个384孔板取阴性对照荧光的平均值，并从分析RT板和分析热板的GSSM或基因重组变体的荧光中减去。
[1003] 3.然后，将分析热板的各孔除以分析RT板的相应孔，得到每种变体的残余活性百分比(％RA)。
[1004] 4.％RA用于对高通量机器人筛选中的最耐热性变体分级。在额外的分析中确认这些命中。
[1005] 次级筛选
[1006] 1.对于选定的命中使用次级筛选确认改进的耐热性。从初级筛选母板中再次摘取命中进入新母板，并在表11所列的高温下分析。分析方案与上面针对初级筛选所述的方案
相同。
相同。
[1007] 表12：总结了针对基因重组文库构造选定的高耐热性GSSM变体的序列和残余活性百分比(％)。
[1008]
[1009] 表12的点突变体和相关数据示于下表13。注意，在表13中，氨基酸位置的编号开始于加入的起始蛋氨酸(例如，氨基酸“M”是位置1，氨基酸“A”是位置2，氨基酸“S”是位置3，氨基酸“S”是位置4，氨基酸“I”是位置5，氨基酸“N”是位置6，等等)。重要的是要明确：对于SEQ ID NO：6的变体，氨基酸改变的编号开始于SEQ ID NO：6的氨基酸31，氨基酸31(“A”)用蛋氨酸(“M”)取代。
[1010]
[1011]
[1012]
[1013]
[1014]
[1015]
[1016]
[1017] 使用来自GSSM态的高热稳定的突变体按在此所述的在核酸上进行基因重组；基因重组变体的分析条件按上面标题为“高通量热稳定性分析用的SOP”。(重申：编码SEQ
ID NO：6(例如由编码SEQ ID NO：5)的31个氨基酸的核酸被除去，对于在GSSM和基因重
组中“进化的”核酸加入编码起始蛋氨酸的核苷酸)。
ID NO：6(例如由编码SEQ ID NO：5)的31个氨基酸的核酸被除去，对于在GSSM和基因重
组中“进化的”核酸加入编码起始蛋氨酸的核苷酸)。
[1018] 基因重组(在来自GSSM态的热稳定的突变体上)后的酶变体的最佳组合示于下表14。本发明提供酶和编码它们的核酸，包含表14中所示的1个、几个或所有的氨基酸改
变。例如，从表14的第一行，本发明的一种示例性酶是包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序
列的酶，但氨基酸改变如下：N176F、Q191G、Y205L、N244T、Y252R、Y276F、S282H、L284F和/或R291N。
变。例如，从表14的第一行，本发明的一种示例性酶是包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序
列的酶，但氨基酸改变如下：N176F、Q191G、Y205L、N244T、Y252R、Y276F、S282H、L284F和/或R291N。
[1019] 本发明的这些示例性酶的活性数据示于下表15。
[1020]
[1021]
[1022]
[1023]
[1024] 前导基因重组命中＝“G2”，或由SEQ ID NO：7编码的SEQ ID NO：8：
[1025] SEQ ID NO：7：
[1026] ATGGCTAGCTCTATTAATGTGCTTGAAAATTGGTCTAGATGGATGAAACC
[1027] TATAAATGATGACATACCGTTAGCACGAATTTCAATTCCAGGAACACATG
[1028] ATAGTGGAACGTTCAAGTTGCAAAATCCGATAAAGCAAGTGTGGGGAATG
[1029] ACGCAAGAATATGATTTTCGTTATCAAATGGATCATGGAGCTAGAATTTT
[1030] TGATATAAGAGGGCGTTTAACAGATGATAATACGATAGTTCTTCATCATG
[1031] GGCCATTATATCTTTATGTAACACTGCACGAATTTATAAACGAAGCGAAA
[1032] CAATTTTTAAAAGATAATCCAAGTGAAACGATTATTATGTCTTTAAAAAA
[1033] AGAGTATGAGGATATGAAAGGGGCGGAAAGCTCATTTAGTAGTACGTTTG
[1034] AGAAAAATTATTTTCGTGATCCAATCTTTTTAAAAACAGAAGGAAATATA
[1035] AAGCTTGGAGATGCTCGTGGGAAAATTGTATTACTAAAAAGATATAGTGG
[1036] TAGTAATGAATCTGGGGGATATAATTTTTTCTATTGGCCAGACAATGAGA
[1037] CGTTTACCTCAACTATAAATGGTAATGTAAATGTAACAGTACAAGATAAA
[1038] TATAAAGTGAGTTTGGATGAGAAAATAAACGCTATTAAAGATACATTAAA
[1039] TGAAACGATTAACAATAGTGAAGATGTTAATCATCTATATATTAATTTTA
[1040] CAAGCTTGTCTTCTGGTGGTACAGCATGGACGAGTCCATATTATTATGCG
[1041] TCCAGGATAAATCCTGAAATTGCAAATTATATTAAGCAAAAGAATCCTAC
[1042] GAGAGTGGGCTGGATAATACAAGATTTTATAAATGAAAAATGGCATCCAT
[1043] TACTTTATCAAGAAGTTATAAATGCGAATAAGTCACTTGTAAAATGA
[1044] SEQIDNO：8：
[1045] MASSINVLENWSRWMKPINDDIPLARISIPGTHDSGTFKLQNPIKQVWGMT
[1046] QEYDFRYQMDHGARIFDIRGRLTDDNTIVLHHGPLYLYVTLHEFINEAKQFLKDN
[1047] PSETTTMSLKKEYEDMKGAESSFSSTFEKNYFRDPTFLKTEGNTKLGDARGKTVLLK
[1048] RYSGSNESGGYNFFYWPDNETFTSTTNGNVNVTVQDKYKVSLDEKTNATKDTLNE
[1049] TTNNSEDVNHLYTNFTSLSSGGTAWTSPYYYASRTNPETANYTKQKNPTRVGWTTQD
[1050] FTNEKWHPLLYQEVTNANKSLVK
[1051] 油筛选数据：基因重组命中的磷脂含量的小规模筛选总结在下表。按下面的标题为“小规模油程序”中所述的方案，使用酶处理油(或在对照的情况下未进行处理)。然后，使用以下方案使用NMR分析样品的磷脂含量：
[1052] 小规模油程序
[1053] 目标：检测在酶反应期间ePLC和PI-PLC在粗制大豆油的各时间的活性。
[1054] 油：
[1055] 粗制大豆油
[1056] FFA：0.24％
[1057] pH：6.97
[1058] DAG：0.27％1，2+0.24％1，3＝0.51％总DAG
[1059] PL：0.21％PA，0.43％PE，0.25％PI，0.44％PC(1.34％总PLs)；没有LPA，0.01％LPE，没有LPI，0.02％LPC，没有1-LPL；0.01％A，没有E，I或C；661ppm总磷，628.6ppm来自PL
[1060] CP：742ppm P，73.8ppm Ca，69.8ppm Mg，0.0ppm Fe
[1061] 酶：
[1062] 进化的磷酸脂肪酶8(实施例2，表9)-11.5单位/mg
[1063] 需要5.5单位×15样品＝82.5单位总/11.5单位/mg～7mg
[1064] 称量12.1mg×11.5U/mg＝139.15单位，重悬于120uL 20mM Hepes pH7.4中，1mMZnSO4＝1.16单位/uL
[1065] 需要5.5单位，10uL
[1066] 5.5单位/(1.16单位/uL)＝4.7uL+5.3uL＝10uL
[1067] 准备原液94uL 1.16单位/uL和106uL 20mM Hepes pH 7.4，1mMZnSO4。
[1068] 加10uL到反应
[1069] SEQ ID NO：8-4.2单位/mg
[1070] 需要0.02单位×15样品＝0.3单位总/4.2单位/mg～1mg
[1071] 称量4.2mg ×4.2U/mg＝17.64单位，重悬于120uL 20mM Hepes pH7.4，1mM ZnSO4＝0.147单位/uL
[1072] 需要0.02单位，10uL
[1073] 0.02单位/(0.147单位/uL)＝0.14uL+9.86uL＝10uL
[1074] 准备原液3uL 0.147单位/uL和197uL 20mM Hepes pH 7.4，1mM ZnSO4.
[1075] 加10uL到反应
[1076] 反应条件：
[1077] 使用Glison distriman将1mL油等分到2mL管中。
[1078] 油在60℃下预热30分钟，在1400rpm下晃动入热混合器，然后加入酶。
[1079] 酶加到各样品，然后均质化30秒，连续晃动下在60℃孵育。
[1080] 在各时间点取出样品。
[1081] 在各时间点取出样品后，样品立即准备进行NMR分析。加入NMR洗涤剂pH10.5，停止酶反应.
[1082] 准备磷脂和产品的31P NMR测定用试剂、标准和样品：
[1083] 使用在pH 10.5下的TMP(2，2，6，6-四甲基哌啶)/磷酸三丁酯(TBP)或TMP/三31
甲基补骨脂素(TIP)作为两个 P内标。从光谱重叠来看TIP是最免疫的，但与TBP的1.02
秒相比它确实具有较长的弛豫时间(2.76秒)。磷酸三丁酯与PC、PE和PI的T1值匹配，而
TIP更与PA匹配。使用TIP，从使用正常循环延迟1.74秒vs.21.6秒的二次循环获得的数
据计算饱和因子，对于每单位时间的最佳S/N使用58度尖角。这可能是优选的方法。尽管
由于较短的T1而更有效的TBP具有在PI和PC之间的化学迁移，并且是高温度依赖性的，
遭受重叠。
甲基补骨脂素(TIP)作为两个 P内标。从光谱重叠来看TIP是最免疫的，但与TBP的1.02
秒相比它确实具有较长的弛豫时间(2.76秒)。磷酸三丁酯与PC、PE和PI的T1值匹配，而
TIP更与PA匹配。使用TIP，从使用正常循环延迟1.74秒vs.21.6秒的二次循环获得的数
据计算饱和因子，对于每单位时间的最佳S/N使用58度尖角。这可能是优选的方法。尽管
由于较短的T1而更有效的TBP具有在PI和PC之间的化学迁移，并且是高温度依赖性的，
遭受重叠。
[1084] 这提供了以下优点：
[1085] (i)pH 10.5干净地分离LPI与PE(它们在pH 8.6和9.5重叠)，
[1086] (ii)TBP和TIP内标允许更快速地再循环NMR延迟，每单位时间的S/N改善大约2.8，
[1087] (iii)对于2mM TBP/TIP和2mM TMP参考提供内部检查，
[1088] (iv)允许基于需求(PL或产品，例如)选择不同的NMR条件。
[1089] 试剂的准备
[1090] 1.5％脱氧酸(DOC)：将5.0g脱氧酸Na盐溶于100ml HPLC级水中。
[1091] 2.50mM EDTA/112.5mM TRIS：将1.46g EDTA酸和1.3624g TRIS base加到100mlHPLC级水中。
[1092] 3.5：4DOC/(EDTA/TRIS)，pH 10.5洗涤剂：混合50ml DOC Na和40mlEDTA/TRIS。加入颗粒状KOH，直到pH为10.5(几颗)。洗涤剂含有50mMTRIS，用于pH缓冲。
[1093] 4.总之，制得900ml洗涤剂：25g DOC，5.84g EDTA，5.45g Tris base，900ml H2O，使用KOH颗粒调节pH到10.5。
[1094] 5.50mM TMP和50mM TBP内标在HPLC级异丙醇(IPA)中：首先分别在IPA中制备100mM TMP(MW 140.08)和100mM TBP(MW 266.32)，然后将它们以1∶1的比例混合。分析
的每周准备新储液，并在4℃下保存以维持稳定性。
的每周准备新储液，并在4℃下保存以维持稳定性。
[1095] 准备标准和样品
[1096] 6.PL校准溶液：准确称量(+/-0.1mg)大约10mgAvanti卵磷脂(PA 5.9％，PE10.4％，PI 8.3％，PC 14.0％，LPC 0.5％)到2ml小瓶中。加入40μl 50mMTMP/50mM TBP
内标、100μl D2O和860μl洗涤剂，通过涡旋彻底混合半小时，在旋转一会后，取500μl透明水溶液进入标准5mm NMR管*。TMP和TBP的浓度分别是2000μM和2000μM；PA、PE、
PI、PC和PLC的分子量分别约为697、716、857、758和496，所以对于10.0mg/ml Avanti卵
磷脂，PA为0.846mM，PE为1.453mM，PI为0.968mM，PC为1.847mM，LPC为0.101mM。
内标、100μl D2O和860μl洗涤剂，通过涡旋彻底混合半小时，在旋转一会后，取500μl透明水溶液进入标准5mm NMR管*。TMP和TBP的浓度分别是2000μM和2000μM；PA、PE、
PI、PC和PLC的分子量分别约为697、716、857、758和496，所以对于10.0mg/ml Avanti卵
磷脂，PA为0.846mM，PE为1.453mM，PI为0.968mM，PC为1.847mM，LPC为0.101mM。
[1097] 7.粗制大豆油样品溶液：旋涡油和准确称量(+/-0.2mg)大约100mg油到2ml小瓶。加入100μl D2O和900μl洗涤剂，通过涡旋彻底混合半小时，在旋转一会后，取600μl透明水溶液进入小瓶*，加入24μl 50mM TMP/50mMTBP内标，彻底混合，然后取500μl透明水溶液进入标准5mm NMR管。
[1098] 8.脱胶油样品溶液：旋涡油和准确称量(+/-0.2mg)大约250mg油到2ml小瓶。加入100μl D2O和900μl洗涤剂，通过涡旋彻底混合半小时，在旋转一会后，取600μl透明
水溶液进入小瓶*，加入24μl 50mM TMP/50mM TBP内标，彻底混合，然后取500μl透明水
溶液进入标准5mm NMR管。
水溶液进入小瓶*，加入24μl 50mM TMP/50mM TBP内标，彻底混合，然后取500μl透明水
溶液进入标准5mm NMR管。
[1099] 9.胶样品溶液：称量大约10mg胶(+/-0.1mg)(不超过11mg)到2ml小瓶。加入40μl 50mM TMP/12.5mM TBP内标、100μl D2O和860μl洗涤剂，通过涡旋彻底混合半小
时，在旋转一会后，取500μl透明水溶液进入标准5mm NMR管*。
时，在旋转一会后，取500μl透明水溶液进入标准5mm NMR管*。
[1100] *样品溶液在旋转后变成两层。使用针注射器将透明水溶液的下层转移到NMR管。谨慎使用，不要打扰上层。
[1101] 10.粗制芥花油样品溶液：旋涡油和准确称量(+/-0.2mg)大约250mg油到2ml小瓶。加入100μl D2O和900μl洗涤剂，通过涡旋彻底混合半小时，在旋转一会后，取600μl透明水溶液进入小瓶*，加入24μl 50mM TMP/50mM TBP内标，彻底混合，然后取500μl透
明水溶液进入标准5mm NMR管。
明水溶液进入标准5mm NMR管。
[1102] 11.水废物样品溶液：估计水废物中的油％v。旋涡水废物，取0.5ml进入2ml小瓶，并准确称量(大约500mg)。加入100μl D2O和大约400μl洗涤剂，得到1ml溶液(不
包括水废物中夹带的油)，通过涡旋彻底混合。在旋转一会后，取600μl透明水溶液进入小瓶*，加入24μl 50mM TMP/50mMTBP内标，彻底混合，然后取500μl透明水溶液进入标准
5mm NMR管。
包括水废物中夹带的油)，通过涡旋彻底混合。在旋转一会后，取600μl透明水溶液进入小瓶*，加入24μl 50mM TMP/50mMTBP内标，彻底混合，然后取500μl透明水溶液进入标准
5mm NMR管。
[1103] *样品溶液在旋转后变成两层。使用针注射器将透明水溶液的下层转移到NMR管。谨慎使用，不要打扰上层。
[1104] 磷脂和产品的31P NMR测定的数据收集
[1105] 针对高缺省功率编码的58度尖端角度的自动化ICONNMRTM(Bruker BioSpinCorporation，Fremont，CA)操作已经设置数据参数集。使用“ej”/”ij”命令插入探针至样品。检查edte＝300.0。在TopSpin时，首先使用“rpar”操作，然后参数集P31_TBP_TMP_
std中读取。去带有“acqu”的采集窗口，使用“wobb”命令对于31P和1H旋转QNP探针。
使用相同参数表“ej”样品，然后进行IconNMR自动化。在自动化时，样品事先排队和间隙地轮流运行。可编辑参数为NS和D1。对于分配时间，NS＝512-2048提供足够的S/N。考
虑到不同弛豫时间的缩放因子已经累积并且应该在随任何样品运行的Avanti卵磷脂样品
上检查。
std中读取。去带有“acqu”的采集窗口，使用“wobb”命令对于31P和1H旋转QNP探针。
使用相同参数表“ej”样品，然后进行IconNMR自动化。在自动化时，样品事先排队和间隙地轮流运行。可编辑参数为NS和D1。对于分配时间，NS＝512-2048提供足够的S/N。考
虑到不同弛豫时间的缩放因子已经累积并且应该在随任何样品运行的Avanti卵磷脂样品
上检查。
[1106]
[1107]
[1108]
[1109] 大规模脱胶使用PI-PLC和ePLC或PI-PLC与PLC(SEQ ID NO：2)，结果总结在下表20、21和22。使用“大规模油程序”用酶处理油(或在对照的情况下未进行处理)：
[1110] 大规模油程序
[1111] 目标：上面实施例2的比较PLC、PI-PLC、“进化的”PLC(或“ePLC”)在2k g粗制大豆油中的活性。
[1112] 油：
[1113] 粗制大豆油
[1114] FFA：0.24％
[1115] pH：6.97
[1116] DAG：0.27％1，2+0.24％1，3＝0.51％总DAG
[1117] PL：0.21％PA，0.43％PE，0.25％PI，0.44％PC(1.34％总PLs)；没有LPA，0.01％LPE，没有LPI，0.02％LPC，没有1-LPL；0.01％A，没有E，I或C；661ppm总磷，628.6ppm来自PL
[1118] CP：742ppm P，73.8ppm Ca，69.8ppm Mg，0.0ppm Fe
[1119] 酶：
[1120] PLC(SEQ ID NO：2)
[1121] 需要5.5单位＝200ppm＝0.4g/2000g油
[1122] 预加热油到60℃，在200rpm下连续混合。
[1123] 将预热的油移到高剪切混合器。
[1124] 开始低速混合。
[1125] 混合下将0.4g PLC(SEQ ID NO：2)+60g室温水加到预热的油中。
[1126] 调节高剪切混合器到6(最高速度)保持1分钟。
[1127] 将样品移回到桨式混合器，在60℃、200rpm下继续搅拌2小时。
[1128] 调节温度到80℃。收集未离心的油样品，保存在室温下，用于分析。
[1129] 一旦油温到达80℃，使用Gyro测试离心机进行离心。
[1130] 进化的磷酸脂肪酶8(实施例2，表9)-11.5U/mg
[1131] 需要5.5单位/g油，反应2kg或2000g＝11000单位总
[1132] 需要11,000单位/11.5U/mg＝957mg
[1133] 粗制油：称量958.6mg ×11.5U/mg＝11,024单位。在60g水中重悬样品，然后立即加到粗制油中。
[1134] 进化的磷酸脂肪酶156(实施例2，表9)-17.2U/mg
[1135] 需要5.5单位/g油，反应2kg或2000g＝11000单位总
[1136] 需要11,000单位/17.2U/mg＝640mg
[1137] 粗制油：称量642.49mg×17.2U/mg＝11,049单位。在60g水中重悬样品，然后立即加到粗制油中。
[1138] SEQ ID NO：8-4.2U/mg
[1139] 需要0.02单位/g油，反应2kg或2000g＝40单位总
[1140] 需要40单位/4.2U/mg＝9.5mg
[1141] 粗制油：称量9.6mg×4.2U/mg＝40.32单位。在60g水中重悬样品，然后立即加到粗制油中。
[1142] 进化的磷酸脂肪酶8+SEQ ID NO：8-2hr：称量959.2mg进化的磷酸脂肪酶8PH045×11.5U/mg＝11,031单位。称量9.8mg SEQ ID NO：8×4.2U/mg＝41.16单位
[1143] 进化的磷酸脂肪酶8+SEQ ID NO：8-4hr：称量959.1mg进化的磷酸脂肪酶8PH045×11.5U/mg＝11,030单位。称量9.8mg SEQ ID NO：8×4.2U/mg＝41.16单位
[1144] 在60g水中重悬样品，然后立即加到粗制油中，同时，加入进化的磷酸脂肪酶8+SEQ ID NO：8。
[1145] 反应条件：
[1146] 称量2000g油到4L烧杯。油在热板上预加热到60℃，反馈温度控制(Barnstead/Themolyne mirak)
[1147] 油在60℃下预加热，在～200rpm下连续混合，然后加入酶。
[1148] 样品移到高速混合器，酶+60g室温水加到预热油中，同时在低速下混合，然后立即高剪切混合(混合速度)保持1分钟。
[1149] 将样品移回到桨式混合器，在60℃、200rpm下继续搅拌2小时。
[1150] 调节温度到80℃。收集未离心的油样品，保存在-2℃下，用于分析。
[1151] 一旦油温到达80℃，使用高速离心机进行离心。
[1152]
[1153]
[1154]
[1155]
[1156]
[1157] 然后，如下所述，使用NMR分析样品的磷酸脂质含量(PL数据)。使用以下HPLC方案分析样品的DAG含量(DAG FFA)：
[1158] 使用带有蒸发光散射检测器的高效液相色谱测定植物油中的二酰基甘油
[1159] 该方法基于AOCS方法Cd 11d-96，如在通过HPLC-ELSD测定甘油单酯和甘油二酯TM
中所述的(AOCS Official Method Cd 11d-96)，有一些修改。一个明显变化是采用ENOVA
油作为定量目的的标准。AOCS方法使用二棕榈酸甘油酯(C16:0)作为标准。然而，在植物
油中，C16:0仅占～10％，而C18:0、C18:1和C18:2占接近90％。在HPLC色谱法中，不仅
二棕榈酸甘油酯的峰形不同于植物油中实际的二酰基甘油(DAG)，而且检测器对二棕榈酸
甘油酯的响应也不同于C18DAG。这两个因素影响量化结果，因为蒸发光散射检测器(ELSD)
TM
是非线性检测器。ENOVA 油是通过ADM的专利工艺使用大豆油和芥花油作为原料生产的
高-DAG油，其脂肪酸分布相似于规则植物油，因此对植物油中的DAG量化是更好的标准。
31 TM
可以使用AOCSOfficial Method Cd 11b-91(2)和 P NMR方法(3，4)测定ENOVA 油中的
DAG量。
中所述的(AOCS Official Method Cd 11d-96)，有一些修改。一个明显变化是采用ENOVA
油作为定量目的的标准。AOCS方法使用二棕榈酸甘油酯(C16:0)作为标准。然而，在植物
油中，C16:0仅占～10％，而C18:0、C18:1和C18:2占接近90％。在HPLC色谱法中，不仅
二棕榈酸甘油酯的峰形不同于植物油中实际的二酰基甘油(DAG)，而且检测器对二棕榈酸
甘油酯的响应也不同于C18DAG。这两个因素影响量化结果，因为蒸发光散射检测器(ELSD)
TM
是非线性检测器。ENOVA 油是通过ADM的专利工艺使用大豆油和芥花油作为原料生产的
高-DAG油，其脂肪酸分布相似于规则植物油，因此对植物油中的DAG量化是更好的标准。
31 TM
可以使用AOCSOfficial Method Cd 11b-91(2)和 P NMR方法(3，4)测定ENOVA 油中的
DAG量。
[1160] 样品和标准溶液的制备：
[1161] 1.样品溶液：准确称量大约50μl油样品，加入950μl正己烷/异丙醇9∶1成为1ml溶液。
[1162] 2.标准溶液：标准溶液中的1，2-DAG和1，3-DAG范围应该覆盖样品溶液中的实际TM
DAG浓度。一个例子是5个ENOVA 油溶液，浓度分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml。
DAG浓度。一个例子是5个ENOVA 油溶液，浓度分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml。
[1163] HPLC设置：
[1164] 柱子：ChromegasphereTM SI-60、15cm×4.6mm
[1165] 温度：40℃
[1166] 流量：2mL/min
[1167] 注射量：20ul
[1168] 流动相A：正己烷
[1169] 流动相B：正己烷/异丙醇/乙酸乙酯/甲酸＝800∶100∶100∶1
[1170] 梯度洗脱：
[1171]时间(min) 0 8 8.5 15 15.1 19
％B 2 35 98 98 2 2
％B 2 35 98 98 2 2
[1172] ELSD设置：
[1173] Sedex 75ELSD的参数应被优化以最大化灵敏度。这些包括温度、增益、喷雾器压力和玻璃室的位置。一般例子是温度40℃，增益5，氮气3.5bar。
[1174] 峰识别和量化
[1175] 通过比较保留时间与标准的保留时间识别DAG峰。量化基于检测器响应I(峰面M
积)和分析物浓度C之间的关系：I＝K*C，这里K和M是实验条件相关的常数。
积)和分析物浓度C之间的关系：I＝K*C，这里K和M是实验条件相关的常数。
[1176] 参考文献
[1177] 1.Mono-and Diglycerides Determination by HPLC-ELSD(AOCS OfficialMethod Cd 11d-96).
[1178] 2.Determination of Mono-and Diglycerides by Capillary GasChromatography(AOC S Official Method Cd 11b-91).
[1179] 3.Spyros，A.；Dais，P.Application of 31P NMRSpectroscopy in FoodAnalysis.1.Quantitative Determination of the Mono-and Diglyceride composition
of Olive Oils，J.Agric.Food Chem.2000、48，802-805.
of Olive Oils，J.Agric.Food Chem.2000、48，802-805.
[1180] 4.Vigli，G.；Philippids，A.；Spyros，A.；Dais，P.Classification ofEdible31 1
Oils by Employing P and H NMR Spectroscopy in Combination with Multivariate
Statistical Analysis.A Proposal for the Detection of Seed Oil Adulteration in
Virgin Olive Oils，J.Agric.Food Chem.2003，51，5715-5722.
Oils by Employing P and H NMR Spectroscopy in Combination with Multivariate
Statistical Analysis.A Proposal for the Detection of Seed Oil Adulteration in
Virgin Olive Oils，J.Agric.Food Chem.2003，51，5715-5722.
[1181] 前导GR命中“G2”被密码子优化：
[1182] 对于亚克隆ORF(G2密码子opt V1和G2密码子opt V2)尝试两种不同方式的密码子优化，第二种方法提供可更高度表达的变体。对于G2密码子opt V1，在亚克隆的ORF
中，其使用率对于荧光假单胞菌降到低于15-25％的初始密码子改变到荧光假单胞菌中的
使用率＞30％的密码子。此外，2个TGA停止密码子用在ORF的3’端。
中，其使用率对于荧光假单胞菌降到低于15-25％的初始密码子改变到荧光假单胞菌中的
使用率＞30％的密码子。此外，2个TGA停止密码子用在ORF的3’端。
[1183] G2 codon opt V1(SEQ ID NO：9)：
[1184] ATGGCCAGCAGCATCAACGTCCTCGAAAACTGGTCGCGCTGGATGAAGCCG
[1185] ATCAACGACGACATCCCGCTGGCCCGCATCAGCATCCCGGGCACCCACGAC
[1186] AGCGGCACCTTCAAGCTGCAGAACCCGATCAAGCAGGTCTGGGGCATGACC
[1187] CAGGAATACGACTTCCGCTACCAGATGGACCACGGCGCCCGCATCTTCGAC
[1188] ATCCGCGGCCGCCTGACCGACGACAACACCATCGTGCTGCACCACGGCCCG
[1189] CTGTACCTGTACGTGACCCTGCACGAATTCATCAACGAAGCCAAGCAGTTCC
[1190] TGAAGGACAACCCGAGCGAAACCATCATCATGAGCCTGAAGAAAGAATACG
[1191] AAGACATGAAGGGCGCCGAAAGCAGCTTCAGCAGCACCTTCGAAAAGAACT
[1192] ACTTCCGCGACCCGATCTTCCTGAAGACCGAAGGCAACATCAAGCTGGGCG
[1193] ACGCCCGCGGCAAGATCGTCCTCCTGAAGCGCTACAGCGGCAGCAACGAAA
[1194] GCGGCGGCTACAACTTCTTCTACTGGCCGGACAACGAAACCTTCACCAGCA
[1195] CCATCAACGGCAACGTGAACGTGACCGTGCAGGACAAGTACAAGGTGAGCC
[1196] TGGACGAAAAGATCAACGCCATCAAGGACACCCTGAACGAAACCATCAACA
[1197] ACAGCGAAGACGTGAACCACCTGTACATCAACTTCACCAGCCTGAGCAGCG
[1198] GCGGCACCGCCTGGACCAGCCCGTACTACTACGCCAGCCGCATCAACCCGG
[1199] AAATCGCCAACTACATCAAGCAGAAGAACCCGACCCGCGTGGGCTGGATCA
[1200] TCCAGGACTTCATCAACGAAAAGTGGCACCCGCTGCTGTACCAGGAAGTGA
[1201] TCAACGCGAACAAGAGCCTGGTCAAGTGATGA
[1202] 对于G2密码子opt V2，选择荧光假单胞菌密码子，使得其使用率(％)最紧密匹配初始ORF中发现的各密码子的使用率(％)。这是被称作密码子使用率转移的方法。此外，
转录的预测mRNA二级结构被最小化，以防止在翻译起始的干环和发夹(在mRNA的-65～
+65的核苷酸窗口，其中翻译在“ATG”的“A”核苷酸的+1开始，其是蛋白的第一蛋氨酸的编码)。在这种最小化中，具有类似使用率(％)的同义密码子被用来减少不必要的核苷
酸-核苷酸配对。如前所述，两个TGA停止密码子用在ORF的3’端。
转录的预测mRNA二级结构被最小化，以防止在翻译起始的干环和发夹(在mRNA的-65～
+65的核苷酸窗口，其中翻译在“ATG”的“A”核苷酸的+1开始，其是蛋白的第一蛋氨酸的编码)。在这种最小化中，具有类似使用率(％)的同义密码子被用来减少不必要的核苷
酸-核苷酸配对。如前所述，两个TGA停止密码子用在ORF的3’端。
[1203] G2 codon opt V2(SEQ ID NO：10)：
[1204] ATGGCGAGCAGCATCAACGTCTTGGAGAACTGGTCCCGGTGGATGAAGCCCAT
[1205] CAACGACGATATCCCACTGGCCCGTATCTCGATCCCGGGCACCCACGACAGCGGCAC
[1206] CTTTAAACTCCAGAACCCAATCAAACAGGTCTGGGGCATGACCCAGGAGTACGACTTC
[1207] CGCTACCAGATGGACCACGGCGCCCGGATCTTCGACATCCGGGGGCGCCTGACCGAC
[1208] GACAACACCATCGTGCTGCACCACGGGCCGCTGTACCTGTACGTGACCTTGCATGAGT
[1209] TCATCAATGAGGCGAAGCAGTTCCTGAAGGACAACCCGAGCGAAACCATCATCATGTC
[1210] CCTGAAGAAAGAATACGAAGACATGAAGGGGGCGGAGAGTTCGTTCAGCAGCACCTT
[1211] CGAAAAGAACTACTTCCGCGACCCGATTTTCCTGAAGACCGAGGGCAACATCAAACTG
[1212] GGCGACGCCCGCGGCAAGATCGTGCTGTTGAAGCGGTACAGCGGCAGCAACGAGTC
[1213] CGGGGGCTACAACTTCTTTTACTGGCCGGATAACGAAACCTTCACTTCGACGATCAAC
[1214] GGCAACGTGAACGTGACCGTGCAGGACAAGTACAAGGTCAGCCTCGACGAAAAGATC
[1215] AATGCCATCAAGGACACCCTGAACGAGACCATCAATAACAGCGAGGACGTGAACCACT
[1216] TGTACATCAACTTCACCAGTCTCTCCTCCGGCGGCACCGCCTGGACCAGCCCGTACTA
[1217] CTACGCGAGTCGTATCAACCCCGAGATCGCCAACTACATCAAACAGAAAAACCCCACC
[1218] CGGGTCGGTTGGATCATCCAGGACTTCATCAACGAGAAGTGGCACCCGCTGCTGTAC
[1219] CAGGAGGTGATCAACGCGAACAAATCGCTGGTGAAGTGATGA
[1220] 比较G2(SEQ ID NO：8)的30L发酵和其密码子优化版本(SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10)的数据总结在表24。发酵在前述的荧光假单胞菌系统中。比较密码子优化的SEQ
ID NO：10vs.SEQ ID NO：8之间的耐热性的数据总结在表25。耐热性按前述测量。
ID NO：10vs.SEQ ID NO：8之间的耐热性的数据总结在表25。耐热性按前述测量。
[1221] 表24
[1222]时间 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：10
24 1.90E+06
28 3.31E+06
29 8.98E+05
32 3.82E+06
33 1.62E+06
36 4.94E+06
37 2.47E+06
40 4.81E+06
41 3.82E+06
44 5.46E+06
45 5.28E+06
46 4.38E+06
48 5.26E+06
49 6.04E+06
50 9.02E+06
52 5.64E+06
53 5.27E+06
54 1.14E+07
56 1.19E+07
58 2.02E+07
60 6.22E+06
62 1.93E+07
66 1.88E+07
70 1.53E+07
75 1.22E+07
24 1.90E+06
28 3.31E+06
29 8.98E+05
32 3.82E+06
33 1.62E+06
36 4.94E+06
37 2.47E+06
40 4.81E+06
41 3.82E+06
44 5.46E+06
45 5.28E+06
46 4.38E+06
48 5.26E+06
49 6.04E+06
50 9.02E+06
52 5.64E+06
53 5.27E+06
54 1.14E+07
56 1.19E+07
58 2.02E+07
60 6.22E+06
62 1.93E+07
66 1.88E+07
70 1.53E+07
75 1.22E+07
[1223] 表25
[1224]
[1225] 比较G2(SEQ ID NO：8)的活性和其密码优化版本(SEQ ID NO：10)的数据总结在表26。使用上述小规模油程序进行该分析。
[1226]
[1227]
[1228] 剂量
[1229] 通过将要处理的每克油加入的酶的“单位”数来定义酶的剂量，其中1单位(U)定义为在pH 7.5和30℃下1分钟内从4.5mM 4-甲基umbelliferyl myo-肌醇-1-磷酸酯、
N-甲基-吗啉盐释放1umole 4-甲基umbelliferone所需的酶量。在一个实施方案中，
PLC(例如，使用SEQ ID NO：2)或ePLC的剂量为1-50U/g油，而PI-PLC的剂量为0.05-20U/
g油。在另一个实施方案中，使用PLC或ePLC的1-20U/g油和PI-PLC的0.05-2U/g油的剂
量。在另一个实施方案中，使用PLC或ePLC的2-10U/g油和PI-PLC的0.1-1U/g油的剂量。
在可选实施方案中，PLC(例如，使用SEQ ID NO：2)或ePLC的剂量是5.5U/g油，PI-PLC的
剂量是0.2U/g油。
N-甲基-吗啉盐释放1umole 4-甲基umbelliferone所需的酶量。在一个实施方案中，
PLC(例如，使用SEQ ID NO：2)或ePLC的剂量为1-50U/g油，而PI-PLC的剂量为0.05-20U/
g油。在另一个实施方案中，使用PLC或ePLC的1-20U/g油和PI-PLC的0.05-2U/g油的剂
量。在另一个实施方案中，使用PLC或ePLC的2-10U/g油和PI-PLC的0.1-1U/g油的剂量。
在可选实施方案中，PLC(例如，使用SEQ ID NO：2)或ePLC的剂量是5.5U/g油，PI-PLC的
剂量是0.2U/g油。
[1230] 可选择地，通过使用酶的比活性将每克油所需的酶单位数换算为每克油所需的酶重量(ug)来测定剂量。具体而言，用所需的单位数除以酶的比活性(U/mg)，得到酶的所需
ug。例如，0.2U酶/克油的剂量除以比活性90.1U/mg，得到剂量2.22ug酶/g油。因此，在
一个实施方案中，PI-PLC的剂量为0.55-222ug酶/g油。在另一个实施方案中，使用PI-PLC
的0.55-22.2ug酶/g油的剂量。在另一个实施方案中，使用PI-PLC的1.11-11.1ug酶/g
油的剂量。在可选实施方案中，PI-PLC的剂量是2.22ug酶/g油。
ug。例如，0.2U酶/克油的剂量除以比活性90.1U/mg，得到剂量2.22ug酶/g油。因此，在
一个实施方案中，PI-PLC的剂量为0.55-222ug酶/g油。在另一个实施方案中，使用PI-PLC
的0.55-22.2ug酶/g油的剂量。在另一个实施方案中，使用PI-PLC的1.11-11.1ug酶/g
油的剂量。在可选实施方案中，PI-PLC的剂量是2.22ug酶/g油。
[1231] 在可选实施方案中，本发明还提供酶的组合或混合物，包括本发明的PI-PLC和至少一个其他酶，例如，磷脂酶，例如，表8或表9中或WO2008/036863中所述的。例如，在可选实施方案中，本发明还提供酶的组合或混合物，包括本发明的PI-PLC和SEQ ID NO：2，不具有信号序列，例如由编码SEQ ID NO：1；或SEQ ID NO：4，具有信号序列(相当于具有信号序列的SEQ ID NO：2)，例如由SEQ ID NO：3编码；或包括实施例2中所述的任一种ePLC
酶(例如，参见表8和9)，和在WO 2008/036863中，其描述了SEQ ID NO：4(例如由SEQ ID
NO：3编码)的变体。在可选实施方案中，本发明还提供酶的组合或混合物，包括本发明的
PI-PLC，例如，在此所述的SEQ ID NO：6(例如由SEQ ID NO：5编码)的变体，或SEQ ID NO：
8(例如由SEQ ID NO：7编码，密码子优化的SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)的变体。
酶(例如，参见表8和9)，和在WO 2008/036863中，其描述了SEQ ID NO：4(例如由SEQ ID
NO：3编码)的变体。在可选实施方案中，本发明还提供酶的组合或混合物，包括本发明的
PI-PLC，例如，在此所述的SEQ ID NO：6(例如由SEQ ID NO：5编码)的变体，或SEQ ID NO：
8(例如由SEQ ID NO：7编码，密码子优化的SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)的变体。
[1232] 实施例4-9是对照例。实施例10-16描述了本文提供的示例性方法。
[1233] 在下面的各实施例中，顶置式混合器是带平叶浆的IKA’s RW 20 digital 混合器；正常搅拌在200rpm下运转，剧烈搅拌在350rpm下运转。离心机是De Laval
Gyro-Tester，其安装有连续分离用的“转鼓单元”。离心机转鼓用安装的螺栓封闭。剪切混合用IKA’s Ultra-Turrax均质器T-50 basic在10,000rpm下完成，其带有S 50N-G 45G
分散元件。PLA1酶是NovozymesA/S of Denmark出售的 Ultra(批号LYN05015A
含有11.7单位/mg)。PLC酶是Verenium Corporation of San Diego，California提
供的 PLC(批号90BU006A1或190DU001A1，分别含有26.0或28.6单位/mg)和
PI-PLC(SEQ ID NO：8)，含有4单位/mg。反应在4升烧杯中进行，并用塑料包盖住，以减少或消除任何水损失。根据American Oil Chemists’Society Official Method Ca 20-99，“Analysis of Phosphorus in Oil by Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy”的方法，测量处理过的油中残留的磷脂量，以ppm P为单位。利用American Oil Chemists’Society Official Method Ca 5a-40测量游离脂肪酸(FFA)。使用American Oil Chemists’Society Official Method Ca 2c-25测量水分。中性油使用下面的附录
中列出的方法测量。使用American Oil Chemists’Society Official Method Ja 4-46
测量包含磷脂的丙酮不溶物。使用American Oil Chemists’Society Official Method
Ja 6-55测量酸值。按照Verenium Corporation(后来被称作Diversa Corporation)
在American Oil Chemists Society 2007会议上的“Analytical Profiling of Small
Scale Reactions of phospholipase-C mediated Vegetable Oil Degumming”所道的，进行P-31NMR程序和利用带有蒸发光散射检测器的高效液相色谱法(HPLC-ELSD)对二酰基甘
油(DAG)的测量。
Gyro-Tester，其安装有连续分离用的“转鼓单元”。离心机转鼓用安装的螺栓封闭。剪切混合用IKA’s Ultra-Turrax均质器T-50 basic在10,000rpm下完成，其带有S 50N-G 45G
分散元件。PLA1酶是NovozymesA/S of Denmark出售的 Ultra(批号LYN05015A
含有11.7单位/mg)。PLC酶是Verenium Corporation of San Diego，California提
供的 PLC(批号90BU006A1或190DU001A1，分别含有26.0或28.6单位/mg)和
PI-PLC(SEQ ID NO：8)，含有4单位/mg。反应在4升烧杯中进行，并用塑料包盖住，以减少或消除任何水损失。根据American Oil Chemists’Society Official Method Ca 20-99，“Analysis of Phosphorus in Oil by Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy”的方法，测量处理过的油中残留的磷脂量，以ppm P为单位。利用American Oil Chemists’Society Official Method Ca 5a-40测量游离脂肪酸(FFA)。使用American Oil Chemists’Society Official Method Ca 2c-25测量水分。中性油使用下面的附录
中列出的方法测量。使用American Oil Chemists’Society Official Method Ja 4-46
测量包含磷脂的丙酮不溶物。使用American Oil Chemists’Society Official Method
Ja 6-55测量酸值。按照Verenium Corporation(后来被称作Diversa Corporation)
在American Oil Chemists Society 2007会议上的“Analytical Profiling of Small
Scale Reactions of phospholipase-C mediated Vegetable Oil Degumming”所道的，进行P-31NMR程序和利用带有蒸发光散射检测器的高效液相色谱法(HPLC-ELSD)对二酰基甘
油(DAG)的测量。
[1234] 实施例4：对照-水脱胶，中性pH
[1235] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2001.2克含有696.3ppm磷的粗制大豆油加热到70-74℃。向温油中加入60.0克去离子水。将油/水混合物在450rpm下搅拌1分钟。
将搅拌器减速至100rpm保持30分钟，使胶絮凝并水合。然后离心水处理的油；收集分离的
油和湿胶。水脱胶油中的残留磷为80.0ppm，FFA为0.22％，DAG为0.34％。收集的湿胶重
量108.5克。
将搅拌器减速至100rpm保持30分钟，使胶絮凝并水合。然后离心水处理的油；收集分离的
油和湿胶。水脱胶油中的残留磷为80.0ppm，FFA为0.22％，DAG为0.34％。收集的湿胶重
量108.5克。
[1236] 实施例5：对照-PLC脱胶，中性pH
[1237] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2003.8克含有696.3ppm磷的粗制大豆油加热到60℃。将温度维持在60℃，加入0.50克Verenium’s PLC脂肪酶(批号
90BU006A1)，然后加入60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温度
60℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。中性pH
PLC处理的油中的残留磷产生残留磷为47.0ppm的脱胶油。FFA为0.20％，DAG为0.61％。
收集的湿胶重量85.5克。
90BU006A1)，然后加入60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温度
60℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。中性pH
PLC处理的油中的残留磷产生残留磷为47.0ppm的脱胶油。FFA为0.20％，DAG为0.61％。
收集的湿胶重量85.5克。
[1238] 实施例6：对照-PI-PLC(SEQ ID NO：8)脱胶，中性pH
[1239] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2001.8克含有696.3ppm磷的粗制大豆油加热到60℃。将温度维持在60℃，将0.0110克Verenium提供的PI-PLC(SEQ ID NO：8)加到
10ml烧杯中，并溶解到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解到水中，就将酶溶液加到油中。
烧杯用大约1ml水淋洗3次，从而确保所有酶加入。加入其余水，使加入的水总量为60克。
将油酶水混合物剪切混合60秒。将油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌120分钟。然
后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。中性pH PI-PLC处理的反应所产生的脱胶油中
的残留磷为50.3ppm。FFA为0.18％，DAG为0.49％。收集的湿胶重量102.5克。
10ml烧杯中，并溶解到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解到水中，就将酶溶液加到油中。
烧杯用大约1ml水淋洗3次，从而确保所有酶加入。加入其余水，使加入的水总量为60克。
将油酶水混合物剪切混合60秒。将油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌120分钟。然
后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。中性pH PI-PLC处理的反应所产生的脱胶油中
的残留磷为50.3ppm。FFA为0.18％，DAG为0.49％。收集的湿胶重量102.5克。
[1240] 实施例7：对照-PLC+PI-PLC(SEQ ID NO：8)脱胶，中性pH
[1241] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2000.2克含有696.3ppm磷的粗制大豆油加热到60℃。将温度维持在60，将0.50克Verenium’s PLC脂肪酶(批号90BU006A1)
加到油中，然后将0.0104克Verenium提供的PI-PLC(SEQ ID NO：8)加到10ml烧杯中，
并溶解到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解，就将酶溶液加到油中。烧杯用大约1ml水
淋洗3次，从而确保所有酶加到油中。加入其余水，使加入的水总量为60克。将油混合
物在温度45℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。
PLA1-PI-PLC在中性pH下处理的反应中的残留磷产生残留磷为50.0ppm的脱胶油。FFA为
0.24％，DAG为0.85％。收集的湿胶重量84.2克。
加到油中，然后将0.0104克Verenium提供的PI-PLC(SEQ ID NO：8)加到10ml烧杯中，
并溶解到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解，就将酶溶液加到油中。烧杯用大约1ml水
淋洗3次，从而确保所有酶加到油中。加入其余水，使加入的水总量为60克。将油混合
物在温度45℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。
PLA1-PI-PLC在中性pH下处理的反应中的残留磷产生残留磷为50.0ppm的脱胶油。FFA为
0.24％，DAG为0.85％。收集的湿胶重量84.2克。
[1242] 实施例8：对照-PLA1脱胶，中性pH
[1243] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2000.6克含有694.1ppm磷的粗制大豆油加热到45℃。将温度维持在45℃，加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，
批号LYN05015)，然后加入60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。PLA1在
中性pH下处理的反应中的残留磷产生残留磷为27.2ppm的脱胶油。FFA为0.60％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量90.0克。
批号LYN05015)，然后加入60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。PLA1在
中性pH下处理的反应中的残留磷产生残留磷为27.2ppm的脱胶油。FFA为0.60％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量90.0克。
[1244] 实施例9：对照-PLA1脱胶，pH 4.5
[1245] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2001.2克含有641.6ppm磷的粗制大豆油加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅
拌1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将1.8毫升4摩尔的氢氧
化钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批
号LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在
温度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。PLA1
在pH 4.5下处理的油中的残留磷产生残留磷为0.5ppm的脱胶油。FFA为0.54％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量91.4克。
拌1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将1.8毫升4摩尔的氢氧
化钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批
号LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在
温度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。PLA1
在pH 4.5下处理的油中的残留磷产生残留磷为0.5ppm的脱胶油。FFA为0.54％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量91.4克。
[1246] 除了实验6之外，残留磷表明，实施例4-10中所述的脱胶过程并没有除去和/或使粗制油中存在的全部磷脂反应。实验6显示在正常反应条件下 Ultra酶的脱
胶。在表27中，列出了收集的湿胶的磷脂分布。
胶。在表27中，列出了收集的湿胶的磷脂分布。
[1247] 表27.中性对照例的分析结果。
[1248]
[1249]
[1250] 从表29可以看出，水脱胶证实了水化磷脂的乳化能力，能够除去所有磷脂种类，甚至一些非水化种类。然而，大部分NHP保留在油中，这可由脱胶油中的残留磷、钙、镁和铁证实(参见表29)。利用磷脂酶C的脱胶能够使基本上所有磷脂酰胆碱和显著量的磷脂酰
乙醇胺反应。磷脂酰肌醇和磷脂酸未反应。收集的胶量明显比水脱胶实施例低(85.5克
vs.108.5克)，但是大量的NHP保留在油中，这可由接近50ppm的残留磷和油中的残留Ca、
Mg和Fe证实。从表29可以看出，使用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶的脱胶产生了湿胶，所有对
照例的最高量PC和PE。实施例4～10中回收的湿胶的磷脂组成也示于图13。
乙醇胺反应。磷脂酰肌醇和磷脂酸未反应。收集的胶量明显比水脱胶实施例低(85.5克
vs.108.5克)，但是大量的NHP保留在油中，这可由接近50ppm的残留磷和油中的残留Ca、
Mg和Fe证实。从表29可以看出，使用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶的脱胶产生了湿胶，所有对
照例的最高量PC和PE。实施例4～10中回收的湿胶的磷脂组成也示于图13。
[1251] 表28.回收的胶的磷脂组成。
[1252]
[1253] b.d.＝低于检测限
[1254] 所有PI均与磷脂酶C反应，产生磷酰肌醇。象实施例4和5中那样，大量的NHP保留在油中，这可由表29中报道的痕量金属分析。
[1255] 表29.中性对照例的元素分析结果。
[1256]
[1257] 回收的胶油中存在的水分和中性油记录于表29a。
[1258] 表29a：回收的胶中存在的水分和中性油。
[1259]
[1260] 在实施例7中，使用PLC和PI-PLC的脱胶均证实PC、PE和PI的显著酶水解(表27和图13)，但是没在实施例5或6中单独加入一种酶那样好。此外，油中的残留磷由于磷
脂酸和磷脂酰乙醇胺的盐水解过程不稳定而保持在大约50ppm。在实施例8中，使用PLA1
脱胶使湿胶中存在的几乎所有磷脂水解成它们的溶血形式，如图13所示，并由存在的显著
量溶血-磷脂证实(表28)。然而，即使在4小时后，显著量的PA也保留在油中，这是因为
NHP不能接近酶。
脂酸和磷脂酰乙醇胺的盐水解过程不稳定而保持在大约50ppm。在实施例8中，使用PLA1
脱胶使湿胶中存在的几乎所有磷脂水解成它们的溶血形式，如图13所示，并由存在的显著
量溶血-磷脂证实(表28)。然而，即使在4小时后，显著量的PA也保留在油中，这是因为
NHP不能接近酶。
[1261] 在对照实验6中，在pH 4.5下PLA1处理的油证实了磷脂酶A1使所有磷脂种类反应的能力，从而产生小于1ppm残留磷的脱胶油，并且基本上所有胶都被转化成它们的
水溶性溶血种类，这可由图13和表30和31证实。钙、镁和铁阳离子不再连接到NHP，相
反现在是在水相中。钙、镁和铁阳离子从磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的盐解离。结果，现在二
价元素与水相中存在的柠檬酸反应，形成钙、镁或铁的柠檬酸盐，它们在水相的反应pH下
不溶于水相。这些不溶性盐从溶液析出，形成覆盖在所有管道、热交换器和甚至离心机上
的“硬水”，直到经由离心过程除去包含反应的胶、水和盐的混合物的重相。Dayton等人在U.S.2007/0134777中公开了一种改进的酶脱胶过程，其中弱缓冲酶反应的pH在酶反应完
成使柠檬酸盐解离后从4.5降低到例如3.5～4.2，从而避免了设备污垢，特别是热交换器
和分离用离心机，这是由于在酶活性所需的最佳pH下钙和镁盐析出造成的。
水溶性溶血种类，这可由图13和表30和31证实。钙、镁和铁阳离子不再连接到NHP，相
反现在是在水相中。钙、镁和铁阳离子从磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的盐解离。结果，现在二
价元素与水相中存在的柠檬酸反应，形成钙、镁或铁的柠檬酸盐，它们在水相的反应pH下
不溶于水相。这些不溶性盐从溶液析出，形成覆盖在所有管道、热交换器和甚至离心机上
的“硬水”，直到经由离心过程除去包含反应的胶、水和盐的混合物的重相。Dayton等人在U.S.2007/0134777中公开了一种改进的酶脱胶过程，其中弱缓冲酶反应的pH在酶反应完
成使柠檬酸盐解离后从4.5降低到例如3.5～4.2，从而避免了设备污垢，特别是热交换器
和分离用离心机，这是由于在酶活性所需的最佳pH下钙和镁盐析出造成的。
[1262] 如以下实施例证实的，本文提供的方法包括用酸处理油以使pH降低到小于3，使磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的盐(NHP)解离，然后将水相的pH调节回中性pH 7，然后在水脱胶
中使磷脂水合或者使磷脂与磷脂酶反应，以允许NHP迁移到油水界面，从而对于磷脂酶允
许更好的水合和更好的底物可用性(NHP)。下表30提供了对按下述进行的过程的实施例总
结。
中使磷脂水合或者使磷脂与磷脂酶反应，以允许NHP迁移到油水界面，从而对于磷脂酶允
许更好的水合和更好的底物可用性(NHP)。下表30提供了对按下述进行的过程的实施例总
结。
[1263] 表30.pH调节实施例的分析结果。
[1264]
[1265]
[1266] 实施例10：在调节的pH 7.0下的水脱胶
[1267] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2002.2克含有640.1ppm磷的粗制大豆油加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅拌
1小时。将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。向温油中加入56.0克去离
子水(总共60克水，包括柠檬酸和氢氧化钠)。将油/水混合物在450rpm下搅拌1分钟。
将搅拌器减速至100rpm保持30分钟，使胶絮凝并水合。然后离心水处理的油；收集分离的
油和湿胶。水脱胶油中的残留磷为26.9ppm，FFA为0.24％，DAG为0.39％。收集的湿胶重
量112.0克。
1小时。将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。向温油中加入56.0克去离
子水(总共60克水，包括柠檬酸和氢氧化钠)。将油/水混合物在450rpm下搅拌1分钟。
将搅拌器减速至100rpm保持30分钟，使胶絮凝并水合。然后离心水处理的油；收集分离的
油和湿胶。水脱胶油中的残留磷为26.9ppm，FFA为0.24％，DAG为0.39％。收集的湿胶重
量112.0克。
[1268] 与初始中性pH实施例(80.0ppm P)相比，实施例10中的在pH被调节到7的残留磷(26.9ppm P)表明，对于水合或机械截留更多磷脂是可用的。此外，从表31可以看出，在回收的胶中磷脂酸和磷脂酰乙醇胺(NHP)的浓度均增大。
[1269] 表31.实施例10-16的回收的胶中的磷脂组成
[1270]
[1271] b.d.＝低于检测限
[1272] 实施例10-16的回收的胶中存在的水分和中性油记录于表31a。
[1273] 表31a.回收的胶中存在的水分和中性油。
[1274]
[1275] 实施例11：在调节的pH 7.0下的PLC脱胶
[1276] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2002.0克粗制大豆油含有640.1ppm磷加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅拌
1小时。将油冷却到60℃，然后将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。将
温度维持在60℃，加入0.50克Verenium’s PLC脂肪酶(批号190DU001A1)，然
后加入60克去离子水的其余部分，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温度60℃
下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。酸/碱pH 7.0
调节的PLC处理的油中的残留磷产生残留磷为14.4ppm的脱胶油。FFA为0.21％，DAG为
1.11％。收集的湿胶重量80.0克。
1小时。将油冷却到60℃，然后将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。将
温度维持在60℃，加入0.50克Verenium’s PLC脂肪酶(批号190DU001A1)，然
后加入60克去离子水的其余部分，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温度60℃
下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。酸/碱pH 7.0
调节的PLC处理的油中的残留磷产生残留磷为14.4ppm的脱胶油。FFA为0.21％，DAG为
1.11％。收集的湿胶重量80.0克。
[1277] 该实验的结果证实了从油中除去磷脂和磷脂酶将磷脂转化成二酰基甘油或油的能力。二酰基甘油从对照水脱胶实验中的原料油(0.31％)或0.34％增加到在调节的pH
7.0下的酶脱胶实验中的1～1.11％。油中的残留磷从对照实验中的47.0ppm减小到pH
调节实验中的14.4ppm。表32表明，其他痕量金属也显著减少。
7.0下的酶脱胶实验中的1～1.11％。油中的残留磷从对照实验中的47.0ppm减小到pH
调节实验中的14.4ppm。表32表明，其他痕量金属也显著减少。
[1278] 表32.实施例10-16的元素分析结果
[1279]
[1280]
[1281] 重要的是认识到，在所有应用实验中，收集的胶减少到最低水平(80.0克)。磷脂组成表明，接近全部的PC和PE转化成含磷胆碱和含磷乙醇胺(表31)，从而形成在回收的
油中发现的二酰基甘油。在收集的胶中的磷脂酸量也增大，进一步证实了底物的可用性，可以被水合/机械“截留”或可以经酶促反应。
油中发现的二酰基甘油。在收集的胶中的磷脂酸量也增大，进一步证实了底物的可用性，可以被水合/机械“截留”或可以经酶促反应。
[1282] 实施例12：在调节的pH 7.0下的PI-PLC脱胶
[1283] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2000.0克含有694.1ppm磷的粗制大豆油加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅拌
1小时。将油冷却到60℃，然后将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。将
温度维持在60℃，将0.0108克Verenium提供的PI-PLC(SEQ ID NO：8)加到10ml烧杯中，
并溶解到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解到水中，就将酶溶液加到油中。烧杯用大约
1ml水淋洗3次，从而确保所有酶加入。加入其余水，使加入的水总量为60克。将整个混合
物剪切混合60秒。将油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理
的油；收集分离的油和湿胶。酸/碱pH 7.0调节的PI-PLC处理的油中的残留磷产生残留
磷为13.5ppm的脱胶油。FFA为0.22％，DAG为0.61％。收集的湿胶重量100.8克。
1小时。将油冷却到60℃，然后将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。将
温度维持在60℃，将0.0108克Verenium提供的PI-PLC(SEQ ID NO：8)加到10ml烧杯中，
并溶解到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解到水中，就将酶溶液加到油中。烧杯用大约
1ml水淋洗3次，从而确保所有酶加入。加入其余水，使加入的水总量为60克。将整个混合
物剪切混合60秒。将油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理
的油；收集分离的油和湿胶。酸/碱pH 7.0调节的PI-PLC处理的油中的残留磷产生残留
磷为13.5ppm的脱胶油。FFA为0.22％，DAG为0.61％。收集的湿胶重量100.8克。
[1284] 象之前两个实施例中那样，与对照实验相比，在pH调节的实验中收集的胶中存在的PA量增大。此外，在收集的胶中存在PC和PE的最大量，因此100.8克湿胶。由于磷脂
酰肌醇特异性磷脂酶主要仅与PI反应，所以DAG中的增加小于实验8中的磷脂酶反应，并
且含磷肌醇是收集的胶中存在的主要含磷化合物(表31)。
酰肌醇特异性磷脂酶主要仅与PI反应，所以DAG中的增加小于实验8中的磷脂酶反应，并
且含磷肌醇是收集的胶中存在的主要含磷化合物(表31)。
[1285] 实施例13：在调节的pH 7.0下的PLC+PI-PLC脱胶
[1286] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2003.8克含有641.6ppm磷的粗制大豆油加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅拌
1小时。将油冷却到60℃，然后将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。将
温度维持在60℃，将0.50克Verenium’s PLC脂肪酶(批号190DU001A1)加到
油中，然后将0.0094克Verenium提供的PI-PLC(SEQ ID NO：8)加到10ml烧杯中，并溶解
到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解，就将酶溶液加到油中。烧杯用大约1ml水淋洗3
次，从而确保所有酶加入。加入其余水，使加入的水总量为60克。将整个混合物剪切混合
1分钟。然后将油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；
收集分离的油和湿胶。在调节的pH 7.0下PLC-PI-PLC处理的油中的残留磷产生残留磷为
18.7ppm的脱胶油。FFA为0.21％，DAG为1.04％。收集的湿胶重量84.4克。
1小时。将油冷却到60℃，然后将3.65毫升4摩尔的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。将
温度维持在60℃，将0.50克Verenium’s PLC脂肪酶(批号190DU001A1)加到
油中，然后将0.0094克Verenium提供的PI-PLC(SEQ ID NO：8)加到10ml烧杯中，并溶解
到1ml去离子水中。一旦蛋白已经溶解，就将酶溶液加到油中。烧杯用大约1ml水淋洗3
次，从而确保所有酶加入。加入其余水，使加入的水总量为60克。将整个混合物剪切混合
1分钟。然后将油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌120分钟。然后离心酶处理的油；
收集分离的油和湿胶。在调节的pH 7.0下PLC-PI-PLC处理的油中的残留磷产生残留磷为
18.7ppm的脱胶油。FFA为0.21％，DAG为1.04％。收集的湿胶重量84.4克。
[1287] 胶中收集的PC、PE和PI的有限量(表31)；胶中的大量含磷胆碱、含磷乙醇胺和含磷肌醇(表31)；和回收的油中的高水平的二酰基甘油清楚地表明PLC和PI-PLC在粗制
油中发生酶反应。胶中回收的PA也大于实施例7中发现的对照酶组合。
油中发生酶反应。胶中回收的PA也大于实施例7中发现的对照酶组合。
[1288] 实施例14：在调节的pH 5.5下的PLA1脱胶
[1289] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2001.2克含有641.6ppm磷的粗制大豆油加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅拌
1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将2.55毫升4摩尔的氢氧化
钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批号
LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。在pH
5.5下PLA1处理的油中的残留磷产生残留磷为1.6ppm的脱胶油。FFA为0.54％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量91.7克。
1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将2.55毫升4摩尔的氢氧化
钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批号
LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。在pH
5.5下PLA1处理的油中的残留磷产生残留磷为1.6ppm的脱胶油。FFA为0.54％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量91.7克。
[1290] 实施例15：在调节的pH 6.5下的PLA1脱胶
[1291] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2001.6克含有641.6ppm磷的粗制大豆油加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅拌
1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将3.31毫升4摩尔的氢氧化
钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批号
LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。在pH
6.5下PLA1处理的油中的残留磷产生残留磷为3.4ppm的脱胶油。FFA为0.51％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量88.7克。
1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将3.31毫升4摩尔的氢氧化
钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批号
LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。在pH
6.5下PLA1处理的油中的残留磷产生残留磷为3.4ppm的脱胶油。FFA为0.51％，DAG为
0.33％。收集的湿胶重量88.7克。
[1292] 实施例16：在调节的pH 7.0下的PLA1脱胶
[1293] 利用顶置式混合器在正常搅拌下将2001.6克含有641.6ppm磷的粗制大豆油加热到70℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式混合器对油正常搅拌
1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将3.31毫升4摩尔的氢氧化
钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批号
LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。在pH
7.0下PLA1处理的油中的残留磷产生残留磷为3.4ppm的脱胶油。FFA为0.52％，DAG为
0.39％。收集的湿胶重量93.1克。
1小时。在正常速度搅拌下使油冷却，直到油温为45℃，然后将3.31毫升4摩尔的氢氧化
钠溶液加到油中，并混合。加入0.10克Novozymes’ Ultra(PLA1脂肪酶，批号
LYN05015)，然后加入总量60克去离子水，将整个混合物剪切混合60秒。将油混合物在温
度45℃下以正常速度搅拌240分钟。然后离心酶处理的油；收集分离的油和湿胶。在pH
7.0下PLA1处理的油中的残留磷产生残留磷为3.4ppm的脱胶油。FFA为0.52％，DAG为
0.39％。收集的湿胶重量93.1克。
[1294] 实施例14、15和16表明从对于酶的最佳条件pH 4.5增大到对于磷脂酶A酶的分别为5.5、6.5和7.0的调节pH的效果。由于降低pH到3.5～4.2的结构材料和成本的原
因，在中性pH 7.0下而不是4.5下运行反应的能力可以提高工业过程的经济生存性，从而
防止工业设备的污垢。总之，实验13清楚地表明，在油中可以实现低残留磷，同时仍然能够使胶中存在的所有磷脂反应至其溶血形式，从而最大化这类酶反应的油产率。
因，在中性pH 7.0下而不是4.5下运行反应的能力可以提高工业过程的经济生存性，从而
防止工业设备的污垢。总之，实验13清楚地表明，在油中可以实现低残留磷，同时仍然能够使胶中存在的所有磷脂反应至其溶血形式，从而最大化这类酶反应的油产率。
[1295] 图14并排比较了对照中性pH反应与在pH 7.0下pH调节反应的磷脂组成。显然可以看出，酸处理、然后稀碱处理以使水相变为中性pH的所有反应提高了收集的胶中NHP
水平和/或允许这些NHP转化成溶血或含磷形式，从而增大了总产率，并最小化过程带来的
任何废物。
水平和/或允许这些NHP转化成溶血或含磷形式，从而增大了总产率，并最小化过程带来的
任何废物。
[1296] 图15并排比较了在对照中性pH反应与在pH 7.0下pH调节反应中的中性油损失到胶相中。显然可以看出，在酸处理、然后稀碱处理以使水相变为中性pH的所有反应中，中性油损失到胶相中的量降低。
[1297] 图16比较了在利用磷脂酶A1时各种pH条件下中性油损失到胶相中。除了“中性”反应之外，所有反应具有调节的pH。这表明，与在没有酸或碱被加入以辅助NHP脱胶过程可用性的中性未调节反应中相比，在pH已经被调节到7.0时，中性油量最低。
[1298] 实施例17：粒径分布研究
[1300] 在该研究中使用Malvern Mastersizer颗粒(液滴)尺寸分析仪模型2000分析粒径，使用该设备带有的软件计算颗粒和体积分布。
[1301] 实施例17A：在利用磁力搅拌器的正常搅拌下将600ml烧杯中的300g脱胶大豆油加热到90℃。向其中加入1.8g去离子水，然后加入0.565g磷酸85％。然后，使用带有S
50N-G 45G分散元件的Ultra-Turrax均质器T-50basic将混合物在10,000下剪切30秒
(该均质器供应商认为等同于US专利4,698,185中使用的Ultra Turrax T-45)。
50N-G 45G分散元件的Ultra-Turrax均质器T-50basic将混合物在10,000下剪切30秒
(该均质器供应商认为等同于US专利4,698,185中使用的Ultra Turrax T-45)。
[1302] 然后，在Malvern 2000中分析形成的乳液样品。水相的平均液滴尺寸为3.963μm，并且液滴中出现的90％的水相其直径小于6.675μm(表33)。液滴分布示于图
17。
17。
[1303] 表33
[1304]
[1305]
[1306]
[1307] 实施例17B：在利用磁力搅拌器的正常搅拌下将4000ml烧杯中的2000g脱胶大豆油加热到90℃。将12g去离子水加到油中，然后加入3.767g磷酸85％。然后，使用带有S
50N-G 45G分散元件的Ultra-Turrax均质器T-50basic将混合物在10,000下剪切30秒。
50N-G 45G分散元件的Ultra-Turrax均质器T-50basic将混合物在10,000下剪切30秒。
[1308] 然后，在Malvern 2000中分析形成的乳液样品。水相的平均液滴尺寸为3.905μm，并且液滴中出现的90％的水相其直径小于6.405μm(表33)。液滴分布示于图
18。
18。
[1309] 实施例17C：在利用磁力搅拌器的正常搅拌下将4000ml烧杯中的2000.3g粗制大豆油加热到60℃。加入2.0克50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。将3.650毫升4摩尔
的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。加入0.50克Purifine PLC酶，然后加入总量60克去
离子水，使用带有S 50N-G 45G分散元件的Ultra-Turrax均质器T-50basic将整个混合物
在10,000下剪切混合30秒。
的氢氧化钠溶液加到油中，并混合。加入0.50克Purifine PLC酶，然后加入总量60克去
离子水，使用带有S 50N-G 45G分散元件的Ultra-Turrax均质器T-50basic将整个混合物
在10,000下剪切混合30秒。
[1310] 然后，在Malvern 2000中分析形成的乳液样品。水相的平均液滴尺寸为19.957μm，并且液滴中出现的90％的水相其直径小于36.998μm(表33)。液滴分布示于
图19。
图19。
[1311] 实施例17D：通过Silverson混合器的再循环将600ml烧杯中的0.6L(大约560g)脱胶大豆油加热到40℃。将混合器在水浴中冷却，以避免实验中温度升高。加入0.6g 50％w/w柠檬酸溶液，然后加入1.095毫升4摩尔的氢氧化钠溶液。加入0.028g(50ppm)Lecitase Ultra PLA酶，然后加入总量16.8g去离子水。
[1312] 15min后收集形成的乳液样品，从而允许体系平衡。然后，在Malvern2000中分析样品。水相的平均液滴尺寸为12.691μm，并且液滴中出现的90％的水相其直径小于
20.333μm(表33)。液滴分布示于图20。作为在线混合器，Silverson持续减小液滴尺寸，
最终获得平均粒径9μm。
20.333μm(表33)。液滴分布示于图20。作为在线混合器，Silverson持续减小液滴尺寸，
最终获得平均粒径9μm。
[1313] 图21示出得自于实施例17A、17B、17C和17D的液滴(颗粒)尺寸分布的叠加。
[1314] 表34提供实施例17A、17B、17C和17D的比较粒径的数据。
[1315] 表34
[1316]
[1317] 从数据可以看出，实施例17C产生极为不同的液滴分布，具有更高的平均粒径。实施例17C的平均粒径被发现比实施例17A和17B的大5倍左右，比实施例17D的大1.6倍。
[1318] 从数据可以看出，对于实施例17C，多于76％的水相在液滴中，直径大于10μm，而对于实施例17A，52％的水相在液滴中，直径大于10μm，在实施例17D中，小于0.65％的水相在液滴中，直径大于10μm。
[1319] 实施例18：通过各种方法得到的胶的比较研究
[1320] 在本实施例中，对于根据US专利No.4,698,185报道的方法和以上实施例4-16记载的方法处理的油提供比较数据。
[1321] 根据US专利No.4,698,185所述的以下方案处理各种油(表35中列出)：
[1322] -油加热到高于75℃
[1323] -水加到提高浓度至0.6％wt
[1324] -将约20-60wt％磷酸加到水脱胶油中
[1325] -酸分散30秒
[1326] -混合持续3分钟
[1327] -碱溶液加入约2体积％
[1328] -混合物在5,000rpm下离心30分钟
[1329] -油相分离，用2wt％去矿物水洗涤
[1330] -在5,000rpm下离心30分钟除去洗涤水
[1331] -分析油中的胶
[1332] 下表35提供从处理的油样品分离的胶的组成数据：
[1333]
[1334] 下表36提供根据上述实施例10、11、12、13和16处理的油样品中的磷脂的数据：
[1335] 表36：
[1336]实施例10 实施例11 实施例12 实施例13 实施例16
磷脂
PA 11.6 18.9 11.6 20.1 0.0
LPA 1.1 3.3 1.8 3.6 14.1
“A” 0.7 1.5 0.9 1.8 1.0
PC 31.4 1.5 31.0 6.7 0.6
LPC 2.4 3.3 2.7 2.2 32.9
“C” b.d. 19.3 1.6 23.3 0.3
PE 32.1 4.3 30.4 10.5 1.9
LPE 2.0 1.1 1.0 0.5 31.5
“E” b.d. 13.7 11.2 15.8 b.d.
PI 17.3 30.3 9.6 4.4 0.3
LPI 1.4 2.5 b.d. b.d. 17.1
“I” b.d. 0.3 17.3 11.2 0.4
磷脂
PA 11.6 18.9 11.6 20.1 0.0
LPA 1.1 3.3 1.8 3.6 14.1
“A” 0.7 1.5 0.9 1.8 1.0
PC 31.4 1.5 31.0 6.7 0.6
LPC 2.4 3.3 2.7 2.2 32.9
“C” b.d. 19.3 1.6 23.3 0.3
PE 32.1 4.3 30.4 10.5 1.9
LPE 2.0 1.1 1.0 0.5 31.5
“E” b.d. 13.7 11.2 15.8 b.d.
PI 17.3 30.3 9.6 4.4 0.3
LPI 1.4 2.5 b.d. b.d. 17.1
“I” b.d. 0.3 17.3 11.2 0.4
[1337] 下表37提供对于根据上述实施例4、5、6、7、8、10、11、12、13和16处理的油样品中的所用酶、反应的pH和磷脂的数据的总结。
[1338]
[1339] 从数据可以看出，通过在此所述的方法获得的磷脂具有独特的组成。
[1340] 上述的要求保护主题的实施方案仅是示例性的，本领域技术人员应该明白或能够使用不超过常规实验来确定特定化合物、材料和过程的多种等同物。所有这些等同物都被
认为在要求保护主题的范围内并涵盖在所附权利要求中。
认为在要求保护主题的范围内并涵盖在所附权利要求中。
[1341] 尽管已经结合某些示例性方面描述了本发明，但是应当理解可以在所要求保护的精神和范围内做出各种修改和变化。
[1342] 进行各种修饰而不偏离本文提供的精神和范围。因此，其他实施方案同样属于以下权利要求的范围。
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