[02]磷脂酶是水解磷脂中的酯键的酶。与它们在磷脂代谢中的重要性相对应的是， 这些酶广泛存在于真核和原核细胞中。磷脂酶影响生物膜的代谢、形成和再组织， 并且磷脂酶也参与信号的级联作用。已经知道了几种类型的磷脂酶，按照磷脂分 子中受到攻击的键的位置，它们在特异性上有所不同。磷脂酶A1(PLA1)除去 1-位的脂肪酸，产生游离的脂肪酸和1-溶血-2-酰基磷脂(1-lyso-2-acylphospholipid)。 磷脂酶A2(PLA2)去除2-位的脂肪酸，产生游离的脂肪酸和1-酰基-2-溶血磷脂 (1-acyl-2-lysophospholipid)。PLA1和PLA2酶可以是胞内酶或胞外酶，是膜结合的 酶或者可溶性酶。发现胞内的PLA2存在于几乎所有的哺乳动物细胞中。磷脂酶C (PLC)去除磷酸部分，产生1，2二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)产生1，2- 二酰基甘油磷酸和碱性基团(base group)。PLC和PLD对于细胞功能和信号传导是 重要的。PLD是生物催化中主要的磷脂酶(参见，如，Godfrey，T.and West S.(1996) Industrial enzymology，299-300，Stockton Press，New York)。马铃薯块茎储藏蛋白 (Patatins)是另一类磷脂酶，据认为其作用如同PLA(参见例如，Hirschberg HJ，et al.，(2001)，Eur J Biochem 268(19)：5037-44)。
[03]常见的含油种子，如大豆、油菜籽、向日葵籽、米糠油、芝麻和花生被用作油 的来源和原料。在榨油过程中，种子用机械和热处理。用溶剂从粗粉(meal)中分离 和分开油。然后应用蒸馏法，从油中分离出溶剂并回收。油经过“脱胶(degummed)” 并且进行精炼。粗粉中的溶剂组分可以通过“脱溶剂烤炉(desolventizer toaster)” 的热处理而蒸发掉，随后，粗粉干燥和冷却。当溶剂通过蒸馏分离掉以后，产生 的粗油经过特殊的脱胶程序和物理精炼的方法加工成为食用油。它也可以作为原 料用于产生脂肪酸和甲基酯。粗粉可以用做动物饲料(animal rations)。
[04]脱胶是植物油精炼的第一步，脱胶的目的是去除与油一起被抽提、但干扰随后 的油加工工艺的污染磷脂。这些磷脂仅仅溶于无水形式的植物油中，如果通过简 单的水合作用，磷脂可以沉淀并去除。水合作用一般通过少量的水与充分干燥的 油连续混合来完成。典型地，水的量是磷脂含量的75％，磷脂的量典型地是1到 1.5％。虽然在50℃到80℃的范围内，油的粘度会降低，水合胶的分离效果更好， 但是温度条件并不非常严格。
[05]很多油脱胶(oil degumming)的方法目前都在使用。油脱胶的过程可以通过使 用磷脂酶协助进行。磷脂酶A1和A2已经应用于各种商业过程中的油脱胶作用上， 如“ENZYMAXTM脱胶”(Lurgi Life Science Technologies GmbH，Germany)。也已 经考虑将磷脂酶C(PLC)应用于油的脱胶作用，因为磷脂酶C在磷脂上作用产生 的磷酸盐部分是极易溶于水的，并且容易去除，而且甘油二酯与油在一起，降低 了损失；参见，如Godfrey，T.and West S.(1996)Industrial Enzymology pp.299-300， Stockton Press，New York；Dahlke(1998)“An enzymatic process for the physical refining of seed oils，”Chem.Eng.Technol.21：278-281；Clausen(2001)“Enzymatic oil degumming by a novel microbial phospholipase，”Eur.J.Lipid Sci.Technol. 103：333-340。
[06]高磷脂油(high phosphatide oils)，例如黄豆、油菜和向日葵油的处理方法不 同于别的油如棕榈的处理方法。不像低磷脂油的蒸或“物理精炼”处理，这些高磷油 需要特别的化学和机械处理，以去除含磷的磷脂。这些油一般通过化学的方式精 炼，在化学精炼过程必需中和游离脂肪酸，以形成皂和不溶性的胶成分。中和过 程对于去除游离脂肪酸和磷脂非常有效，但是该过程也导致产率和质量显著降低。 在一些情况下，高磷脂的粗制油在碱中和之前的步骤中进行脱胶。用于卵磷脂的 大豆油就是这种情况，其中的油首先用水或者酸来脱胶。
[07]植物固醇(phytosterols)(植物甾醇(plant sterols))是天然产物三萜家族的成员，其 包括100种以上不同的植物固醇和4000种以上其它种类的三萜。一般而言，据认 为，植物甾醇是由于增加甾醇/磷脂配给导致膜硬化，从而稳定植物膜。在化学角 度上，植物甾醇在结构上非常类似于胆固醇，并被认为调节植物膜的膜流动性， 如胆固醇在动物膜所做的那样。主要的植物甾醇是β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇。 其它的植物甾醇包括豆甾烯醇(二氢β-谷甾醇)、二氢谷甾醇、24-脱氢胆固醇、 二氢菜油甾醇、chalinasterol、多孔甾醇、γ-谷甾醇和菜籽甾醇。
[08]植物甾醇是健康和营养行业中的重要的农产品。它们是用于制造化妆品的有用 乳化剂并且为激素药物的生产提供大多数甾体中间体和前体。植物甾醇的饱和类 似物以及它们的酯已经被认为是益于心血管健康的有效的降低胆固醇的试剂。植 物甾醇通过在肠腔中抑制胆固醇的吸收来降低血清中的胆固醇水平，并且植物甾 醇在极低的浓度时便具有免疫调节特性，包括T淋巴细胞的增强的细胞应答和抗 癌症细胞系的天然杀伤细胞的细胞毒性能力。此外，它们的治疗效应在治疗肺结 核、风湿性关节炎、控制HIV感染的病人和抑制马拉松选手的免疫压力的临床研 究中已经得到证明。
[09]植物甾醇的酯类，也指植物甾醇酯，由美国食品药品管理局(FDA)批准为 GRAS(一般认为安全，Generally Recognized As Safe)，用于人造黄油，并在1999 年得到推广。2000年9月，FDA也提出一个试行规定，该规定准许了含有植物甾 醇酯类的食品使用健康声明标记(health-claiming labeling)。因此，用植物甾醇酯 类强化的食品非常有望受到消费者的青睐。
[10]大豆油被广泛使用，是重要的粮食，占来自种子和水果的油产量的约30％。大 豆仅含有20％的油，在商业规模上通常通过使用溶剂诸如己烷来提取。其油公认 的质量和粗粉蛋白的营养价值使得大豆成为首要的含油种子。在提取之前，大豆 必需清洗，破碎并去皮，这是因为对油来说有效的溶剂提取需要破碎每一个油细 胞以提高物质转移水平。细胞壁主要由纤维素——其与半纤维素相关、果胶物质 和木质素组成，细胞壁也可以用酶破碎，以显著提高提取产量和速度。
[11]二酰甘油(DAG)油是食用油，相对天然脂肪酸含有80％或更多的DAG。已经 显示，在人中，消化DAG油乳剂之后，相比具有类似的脂肪酸组成的TAG油， 餐后乳糜微粒中的甘油三脂的升高水平明显较低。在以日本男子和美国男子和女 子为对象的研究中，长期食用DAG油促进体重减轻和身体脂肪减少。一项研究显 示用DAG油取代普通的烹饪油降低肥胖和其他危险因素的发生率。
发明概述
[12]本发明提供包括与本发明的示例性序列例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、 SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、 SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、 SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、 SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：173在至少大约10、15、20、25、 30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、 1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、 1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、 2500或者更多个的残基范围内具有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、 56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或者更多的或者完全的(100％)序列同一性的核酸 序列的分离的或者重组的核酸，在一个方面所述核酸编码具有磷脂酶(PL)活性 的至少一个多肽，所述磷脂酶活性例如磷脂酶A、C或D活性，或磷脂酶活性的 任何组合，例如PLA、PLC和/或PLD活性——作为多功能活性。在一个方面， 所述序列同一性用序列比较算法分析或者目测检查来确定。
[13]发明提供包括与SEQ ID NO：1在至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、 50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、 750、800、850或更多连续的残基范围内具有至少81％、82％、83％、84％、85 ％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的核酸序列的分 离的或者重组的核酸，在一个方面所述核酸编码具有磷脂酶活性(PL)的至少一 种多肽，所述磷脂酶活性例如磷脂酶A、C或D活性，或磷脂酶活性的任何组合， 例如PLA、PLC和/或PLD活性-作为多功能活性。在一个方面，所述序列同一性 用序列比较算法分析或者通过目测检查来确定。
[14]发明提供包括与SEQ ID NO：3在至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、 50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、 750、800、850或更多个的残基范围内具有至少78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的 核酸序列的分离的或者重组的核酸，在一个方面所述核酸编码具有磷脂酶活性 (PL)的至少一种多肽，所述磷脂酶活性例如磷脂酶A、C或D活性，或磷脂酶 活性的任何组合，例如PLA、PL C和/或PL D活性-作为多功能活性。在一个方面， 所述序列同一性用序列比较算法分析或者通过目测检查来确定。
[15]发明提供包括与SEQ ID NO：5在至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、 50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、 750、800、850或更多个的残基范围内具有至少78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的 核酸序列的分离的或者重组的核酸，在一个方面所述核酸编码具有磷脂酶活性 (PL)的至少一种多肽，所述磷脂酶活性例如磷脂酶A、C或D活性，或磷脂酶 活性的任何组合，例如PLA、PL C和/或PL D活性-作为多功能活性。在一个方面， 所述序列同一性用序列比较算法分析或者通过目测检查来确定。
[16]发明提供包括与SEQ ID NO：7在至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、 50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、 750、800、850或更多个的残基范围内具有至少50％、51％、52％、53％、54％、 55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、 68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或者更多，或者完全的(100％) 序列同一性的核酸序列的分离的或者重组的核酸，在一个方面所述核酸编码具有 磷脂酶活性(PL)的至少一种多肽，所述磷脂酶活性例如磷脂酶A、C或D活性， 或磷脂酶活性的任何组合，例如PLA、PL C和/或PL D活性-作为多功能活性。在 一个方面，所述序列同一性用序列比较算法分析或者通过目测检查来确定。
[17]在可选择的方面，分离的或者重组的核酸编码包含在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、 SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、 SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、 SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、 SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、 SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、 SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、 SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、 SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138；SEQ ID NO：140；SEQ ID NO：142；SEQ ID NO：144；NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：160、 SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172或SEQ ID NO：174中阐明序列的多肽。在一个方面，这 些多肽具有磷脂酶，例如磷脂酶A、B、C或D的活性，或磷脂酶活性的任何组合， 例如PLA、PL C和/或PL D活性-作为多功能活性。
[18]在一方面，序列比较算法是BLAST算法，如BLAST 2.2.2版算法。一方面， 筛选设置(filtering setting)设为blastall-p，blastp-d“nr pataa”-F F，所有其它可选 项(options)设为默认值。
[19]在一个方面，磷脂酶活性包括催化甘油磷酸酯键的水解(即，切割甘油磷酸酯 键)。磷脂酶活性可以包括催化植物油中磷脂的酯键的水解。植物油磷脂可以包 括油籽(oilseed)的磷脂。磷脂酶活性可以包括磷脂酶C(PLC)活性；磷脂酶A (PLA)活性，如磷脂酶A1或者磷脂酶A2活性；磷脂酶D(PLD)活性，如磷 脂酶D1或者磷脂酶D2活性；磷脂酶B(PLB)活性，例如磷脂酶和溶血磷脂酶 (LPL)活性或磷脂酶和溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性或磷脂酶和溶血磷脂酶 (LPL)活性和溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性；或马铃薯块茎蛋白(patatin)活性， 或其组合。磷脂酶活性可以包括水解糖蛋白，例如马铃薯块茎中发现的糖蛋白。 磷脂酶活性可以包括patatin酶活性。磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。 在一个方面，本发明的磷脂酶可以具有多功能的活性，例如本文中描述的一种或 多种酶活性的组合，例如本发明的磷脂酶可以具有PLC和PLA活性；PLB和PLA 活性；PLC和PLD活性；PLC和PLB活性；PLB和patatin活性；PLC和patatin 活性；PLD和PLA；PLD、PLA、PLB和PLC活性；或PLD、PLA、PLB、PLC 和patatin活性；或磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性或磷脂酶和溶血磷脂酶-转酰基 酶(LPTA)活性或磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性和溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活 性，或其任意组合。
[20]例如，在一个方面，本发明的多肽具有酶活性，但是缺少脂酶活性，例如缺少 影响中性油(甘油三酯)部分的任何酶活性。在特定的工艺中使用这种多肽可能是有 利的，例如在脱胶工艺中，中性油部分不受损(减少，例如水解)是重要的。因 此，在一个方面，本发明提供了脱胶工艺，该工艺包括使用本发明的具有磷脂酶 活性但不具有脂酶活性的多肽。
[21]在一个方面，分离的或重组的核酸编码具有磷脂酶活性的多肽，其是热稳定性 的。该多肽在一定的条件下，能够保持磷脂酶活性，这些条件包括20℃至约30℃ 之间、约25℃至约40C℃之间、约37℃至约95℃之间、约55℃至约85C℃之间、 约70℃至约95℃之间或约90℃至约95℃之间。在另一方面，分离的或重组的核 酸编码具有磷脂酶活性的多肽，其是耐热性的。在暴露于37℃以上至约95℃范围 内的温度、或55℃以上至约85℃范围内的任何温度后，该多肽能够保持磷脂酶活 性。在一个方面，在pH4.5，暴露于90℃以上至约95℃范围内的温度后，该多肽 保持磷脂酶活性。
[22]多肽在包括大约pH8、pH7.5、pH7、pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5或者pH 4.5的条件下可以保持磷脂酶的活性。多肽可以在包括温度范围为大约40℃至大约 70℃的条件下保持磷脂酶活性。
[23]一方面，分离的或者重组的核酸包含在严格条件下与在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、 SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、 SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、 SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、 SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、 SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、 SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、 SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、 SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、 SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、 SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、 SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：157、 SEQ IDNO：159、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：173中阐明的序列杂交 的序列，其中该核酸编码具有磷脂酶活性的多肽。如此处所述，核酸在长度上可 以是基因或者转录物的至少大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850个 或更多残基或者是基因或者转录物的全长，具有或者不具有信号序列。如此处所 述，严格条件可以是高度严格，中度严格或者低严格性。严格条件可以包括洗涤 步骤，如，包括在0.2×SSC，大约65℃条件下洗涤大约15分钟的洗涤步骤。
[24]发明提供用于鉴定编码具有磷脂酶，例如磷脂酶活性的多肽的核酸的核酸探 针，其中该探针包括本发明的序列，例如在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、或者SEQ ID NO：7中阐明的序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、 90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、 800、850个或者更多的连续碱基，该探针通过结合或者杂交鉴定该核酸。该探针 可以包括在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7中阐 明的序列的至少大约10到50、大约20到60、大约30到70、大约40到80或者 大约60到100个连续碱基的寡核苷酸。
[25]本发明提供了用于鉴定编码具有磷脂酶，如磷脂酶活性多肽的核酸的核酸探 针，其中该探针包括本发明的核酸，例如在至少大约10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850或者更多连续残基的范围内，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：5、和/或SEQ ID NO：7或者它们的子序列具有至少50％、51％、52％、 53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、 65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、 77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或者 更多，或者完全的(100％)的序列同一性的核酸，并且在一个方面，序列同一性 通过序列比较算法分析或者目测检查确定。
[26]本发明提供用于扩增编码具有磷脂酶活性多肽的核酸的扩增引物序列对，其中 该引物对能够扩增包括本发明的序列或者片段或者其子序列的核酸序列。扩增引 物序列对的一个成员或每一个成员可以包括含有至少大约10到50个该序列连续 碱基，或者大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、或者25个该序列连续碱基的寡聚核苷酸。
[27]本发明提供扩增引物对，其中该引物对包括第一成员和第二成员，其中第一成 员具有本发明核酸的大约前(5′端)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、或者25个残基所阐明的序列，第二成员具有第一成员互补链的大约 前(5′)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或者25个残基 所阐明的序列。
[28]本发明提供了通过扩增产生的磷脂酶，例如使用本发明的扩增引物对的，聚合 酶链式反应(PCR)。本发明提供了通过扩增制备磷脂酶的方法，例如应用发明的 扩增引物对的聚合酶链式反应(PCR)。一方面，扩增引物对扩增来自文库的核酸， 例如基因文库，如环境文库。
[29]本发明提供了扩增编码具有磷脂酶活性多肽的核酸的方法，包括用能够扩增本 发明核酸序列或者片段或者其子序列的扩增引物序列对来扩增模板核酸序列。该 扩增引物对可以是本发明的扩增引物对。
[30]本发明提供包括本发明的核酸或者其子序列的表达盒(expression cassettes)。 一方面，表达盒可以包括可操作性地连接于启动子的核酸。启动子可以是病毒的， 细菌的，哺乳动物的或者植物启动子。一方面，植物启动子可以是马铃薯，水稻， 玉米，小麦，烟草或者大麦启动子。启动子可以是组成型启动子。组成型启动子 可以包括CaMV35S。另一方面，启动子可以是诱导型启动子。一方面，启动子可 以是组织特异性启动子或者环境调控或者发育调控启动子。因此，启动子可以是， 例如种子特异性，叶特异性，根特异性，茎特异性或者脱落诱导启动子。一方面， 表达盒可以进一步包括植物表达载体或者植物病毒表达载体。
[31]本发明提供包括本发明的表达盒(如载体)或者本发明的核酸的克隆载体。克 隆载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒(phagemid)、粘粒、F粘粒(fosmid)、 细菌噬菌体或者人工染色体。病毒载体可以包括腺病毒载体，逆转录病毒载体或 者腺相关病毒载体。克隆载体可以包括细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬 菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)、或者哺乳动物人工染色体 (MAC)。
[32]本发明提供含有本发明核酸或者本发明表达盒(如，载体)或者本发明克隆载 体的转化细胞。一方面，转化细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、 酵母细胞、昆虫细胞或者植物细胞。一方面，植物细胞可以是马铃薯、小麦、水 稻、玉米、烟草或者大麦细胞。
[33]本发明提供包括本发明的核酸或者本发明的表达盒(如，载体)的转基因非- 人类动物。在一方面，动物是小鼠、大鼠、牛、羊或其它哺乳动物。
[34]本发明提供包括本发明的核酸或者本发明的表达盒(如，载体)的转基因植物。 转基因植物可以是玉米植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、油籽植物、油 菜籽植物、大豆植物、水稻植物、大麦植物或烟草植物。本发明提供包括本发明 的核酸或本发明的表达盒(例如，载体)的转基因种子。转基因种子可以是玉米 种子、小麦种子、油籽、油菜籽(油菜植物)、大豆种子、棕榈仁、向日葵种子、 芝麻种子、花生、水稻或烟草植物种子。
[35]本发明提供含有与本发明的核酸互补或在严格条件下能够与本发明的核酸杂 交的核酸序列的反义寡核苷酸。本发明提供抑制细胞内磷脂酶信使翻译的方法， 该方法包括向细胞施用或在细胞中表达含有与本发明的核酸互补或在严格条件下 能够与本发明的核酸杂交的核酸序列的反义寡核苷酸。
[36]本发明提供含有与本发明的核酸互补或在严格条件下能够与本发明的核酸杂 交的核酸序列的反义寡核苷酸。本发明提供抑制细胞内磷脂酶信使翻译的方法， 该方法包括向细胞施用或在细胞中表达含有与本发明的核酸互补或在严格条件下 能够与本发明的核酸杂交的核酸序列的反义寡核苷酸。反义寡聚核苷酸的长度可 以是大约10到50、大约20到60、大约30到70、大约40到80、大约60到100、 大约70到110或者大约80到120个碱基。
[37]本发明提供抑制磷脂酶如细胞内磷脂酶信使翻译的方法，该方法包括向细胞施 用或在细胞中表达含有与本发明的核酸互补或在严格条件下能够与本发明的核酸 杂交的核酸序列的反义寡核苷酸。本发明提供包括本发明序列的子序列的双链抑 制性RNA(RNAi)分子。在一方面，RNAi长度是大约15，16，17，18，19，20，21，22， 23，24，25或者更多的双链核苷酸。本发明提供抑制磷脂酶如细胞内磷脂酶表达的 方法，该方法包括向细胞施用或者在细胞中表达双链抑制性RNA(RNAi)，其中 该抑制性RNA包括本发明序列的子序列。
[38]本发明提供了分离的或重组的多肽，该多肽包含与本发明示例性的多肽或肽 (例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、 SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、 SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、 SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、 SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、 SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO：70、 SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、 SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO：90、 SEQ IDNO：92、SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：96、SEQ IDNO：98、SEQ ID NO：100、 SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、 SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ IDNO：136、SEQ ID NO：138；SEQ ID NO：140；SEQ ID NO：142；SEQ ID NO：144；NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、 SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：160、SEQ IDNO：162、SEQ ID NO：164、SEQ IDNO：166、 SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172或SEQ ID NO：174)在多肽的 至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、 100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、400、450、500、 550或600或更多残基，或多肽的全长范围内，具有至少大约50％、51％、52％、 53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、 79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或更大，或完全(100％)的 序列同一性的氨基酸序列；并且，在一个方面，序列同一性通过序列比较算法分 析或者通过目测观察来确定。
[39]在一个方面，本发明提供包括与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的氨基酸 序列的分离的或者重组的多肽。在一个方面，本发明提供包括与SEQ ID NO：4具 有至少78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者 更多，或者完全的(100％)序列同一性的氨基酸序列的分离的或者重组的多肽。 在一个方面，本发明提供包括与SEQ ID NO：6具有至少78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者更多，或者完全的(100％)序列同 一性的氨基酸序列的分离的或者重组的多肽。在一个方面，发明提供包括与SEQ ID NO：8具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59 ％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的 氨基酸序列的分离的或者重组的多肽。
[40]本发明提供由本发明的核酸编码的分离的或者重组的多肽。在可选择的方面， 多肽可以具有如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：68、SEQ ID
NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID
NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ IDNO：88、SEQ ID
NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ IDNO：104、SEQ IDNO：106、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、 SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、 SEQ ID NO：138；SEQ ID NO：140；SEQ ID NO：142；SEQ ID NO：144；NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、 SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ IDNO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172或SEQ ID NO：174中 阐明的序列。多肽可以具有磷脂酶活性，如磷脂酶A，B，C或者D活性，或磷脂 酶活性的任何组合，例如PLA、PL C和/或PL D活性—作为多功能活性。例如， 在一个方面，本发明的多肽具有酶活性，但是缺少脂酶活性，例如缺少影响中性 油(甘油三酯)部分的任何酶活性。在一个方面，本发明提供了脱胶工艺，该工艺包 括使用具有磷脂酶活性但不具有脂酶活性的本发明的多肽，这样在脱胶工艺中， 任何中性油部分不受损害(减少、改变、降解，例如水解)。
[41]本发明提供了含有缺乏信号序列的本发明的多肽的分离的或者重组的多肽，在 一个方面，缺乏信号肽的多肽具有与SEQ ID NO：2的残基30到287有至少81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更多序列同一性；与SEQ ID NO：4的 残基25到283有至少78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86 ％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98 ％、99％、或者更多序列同一性的氨基酸序列；与SEQ ID NO：6的残基26到280 有至少78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者 更多序列同一性的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：8的残基40到330有至少50％、 51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、 63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、 75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％、或者更多的序列同一性的氨基酸序列。序列同一性通过序列比较算法分析 或者通过目测观察确定。
[42]本发明的另一方面提供分离的或者重组的多肽或者肽，该分离的或者重组的多 肽或者肽包括本发明的多肽或肽序列、与之基本相同的序列，和与之互补的序列 的至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85， 90，95或者100或者更多的连续碱基。该肽可以是，例如，免疫源性的片段、基 序(如，结合位点)或者活性位点。
[43]在一个方面，本发明分离的或重组的多肽(有或无信号序列)具有磷脂酶活性。 在一个方面，磷脂酶活性包括催化甘油磷酸酯键的水解(即，切割甘油磷酸酯键)。 磷脂酶活性可以包括催化植物油中磷脂的酯键的水解。植物油磷脂可以包括油籽 的磷脂。磷脂酶活性可以包括磷脂酶C(PLC)活性；磷脂酶A(PLA)活性，如 磷脂酶A1或者磷脂酶A2活性；磷脂酶D(PLD)活性，如磷脂酶D1或者磷脂 酶D2活性；磷脂酶B(PLB)活性，例如磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性，或磷脂 酶和溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性，或磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性和溶血 磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性；或patatin活性，或其组合。例如，在一个方面，磷 脂酶活性包括本文中描述的一种或多种酶活性的组合，例如磷脂酶可以具有PLC 和PLA活性；PLB和PLA活性；PLC和PLD活性；PLC和PLB活性；PLB和 patatin活性；PLC和patatin活性；PLD和PLA；PLD、PLA、PLB和PLC活性； 或PLD、PLA、PLB、PLC和patatin活性；或磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性或磷 脂酶和溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性或磷脂酶和溶血磷脂酶(LPL)活性和溶血 磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性，或其任意组合。
[44]磷脂酶活性可以包括水解糖蛋白，如马铃薯块茎中发现的糖蛋白。磷脂酶活性 可以包括patatin酶活性。磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。
[45]在一个方面，磷脂酶活性是热稳定性的。多肽可以在包括温度范围在大约20℃ 到大约30℃之间、大约25℃到大约40℃之间、大约37℃到大约95℃之间、大约 55℃到大约85℃之间、大约70℃到大约95℃之间、或者大约90℃到大约95℃之 间的条件下保持磷脂酶活性。在一个方面，磷脂酶活性可以是耐热的。多肽可以 在暴露于温度范围37℃以上到大约95℃、或者在55℃以上到大约85℃后仍保持 磷脂酶活性。在一个方面，多肽可以在pH4.5下，暴露于温度范围在90℃以上到 大约95℃后仍保持磷脂酶活性。
[46]在一个方面，多肽可以在包括大约pH6.5，pH6，pH5.5，pH5，pH4.5或者 pH4或pH更小(酸性更大)的条件下保持磷脂酶活性。在一个方面，多肽可以 在包括大约pH7，pH7.5，pH8.0，pH8.5，pH9，pH9.5，pH10，pH10.5，或pH 11 pH更大(碱性更大)的条件下保持磷脂酶活性。
[47]在一个方面，分离的或者重组的多肽可以包括本发明的多肽，其缺乏信号序列。 在一个方面，分离的或者重组的多肽可以包括含有异源信号序列，如异源磷脂酶 或者非-磷脂酶信号序列的本发明多肽。
[48]本发明提供分离的或者重组的肽，该肽含有与SEQ ID NO：2的1到29残基有 至少95％、96％、97％、98％、99％、或者更多序列同一性的，与SEQ ID NO：4 的1到24残基有至少95％、96％、97％、98％、99％、或者更多序列同一性的， 与SEQ ID NO：6的1到25残基有至少95％、96％、97％、98％、99％、或者更多 序列同一性的，或与SEQ ID NO：8的1到39残基，以及SEQ ID表中阐明的其他 信号序列有至少95％、96％、97％、98％、99％、或者更多序列同一性的氨基酸 序列，其中序列同一性通过序列比较算法分析或者通过目测观察来确定。这些肽 可以作为内源性磷脂酶或者其它磷脂酶，或者异源蛋白(非磷脂酶或者其它蛋白) 的信号肽序列。在一个方面，本发明提供包括第一结构域和至少第二结构域的嵌 合蛋白，第一结构域包括本发明的信号序列。该蛋白可以是融合蛋白。第二结构 域可以包括酶。酶可以是磷脂酶。
[49]本发明提供包括至少第一结构域和至少第二结构域的嵌合多肽，第一结构域包 括发明的信号肽(SP)或本发明磷脂酶的催化结构域(CD)，或活性位点，第二 结构域包括异源多肽或肽，其中异源多肽或者肽与信号肽(SP)或者催化结构域 (CD)之间没有天然的联系。在一个方面，异源多肽或者肽不是磷脂酶。异源多 肽或者肽可以在信号肽(SP)或者催化结构域(CD)的氨基末端，羧基末端或者 羧基和氨基末端。
[50]本发明提供编码嵌合多肽的分离的或者重组的核酸，其中嵌合多肽包括至少第 一结构域和至少第二结构域，第一结构域含有本发明多肽的信号肽(SP)或者催 化结构域(CD)或者活性位点，第二结构域包括异源多肽或者肽，其中异源多肽 或者肽与信号肽(SP)或者催化结构域(CD)之间没有天然的联系。
[51]在一个方面，磷脂酶活性包括在大约37℃下，每毫克蛋白大约10到大约100 单位范围的比活性。在另一方面，磷脂酶活性包括每毫克蛋白大约100到大约1000 单位，大约500到大约750单位范围的比活性。可选择地，磷脂酶活性包括在37℃ 下每毫克蛋白大约100到大约500单位的比活性。在一方面，磷脂酶活性包括在 37℃下每毫克蛋白大约500到大约1200单位的比活性。在另一方面，磷脂酶活性 包括在37℃下每毫克蛋白大约750到大约1000单位的比活性。在另一方面，耐热 性包含在加热至升高的温度以后，保持在37℃下的磷脂酶至少一半的比活性。可 选择的，耐热性包含在加热至升高的温度以后，保持在37℃下每毫克蛋白大约500 到大约1200单位的比活性。
[52]本发明提供本发明分离的或者重组的多肽，其中多肽包括至少一个糖基化位 点。一方面，糖基化可以是N—连接糖基化。一方面，多肽可以是在巴斯德毕赤 酵母(P.pastoris)或者粟酒裂殖酵母(S.pombe)中表达后进行糖基化。
[53]本发明提供了磷脂酶和编码它们的核酸，该磷脂酶具有本发明任何示例性磷脂 酶的序列，其中一个或多个或所有糖基化位点被改变，如上所述。因此，本发明 提供了制备在宿主细胞中具有增加的表达水平的变体磷脂酶编码序列的方法，其 中该方法包括修饰本发明的磷脂酶编码序列，这样，一个、若干个或所有N-连接 的糖基化位点编码基序被修改为非糖基化基序。本发明也提供了由该方法制得的 磷脂酶编码序列，和它们编码的酶。
[54]本发明提供了制备变体磷脂酶编码序列的方法，该序列编码对蛋白酶具有增加 的耐受性的磷脂酶，该方法包括将等同于SEQ ID NO：2的位置131上的氨基酸修 改成一个、若干个或所有下述残基：赖氨酸(K)；丝氨酸(S)；甘氨酸(G)；精氨酸(R)； 谷氨酰胺(Q)；丙氨酸(A)；异亮氨酸(I)；组氨酸(H)；苯丙氨酸(F)；苏氨酸(T)；蛋 氨酸(M)；亮氨酸(L)，包括具有这些示例性修改的SEQ ID NO：2的变体(和编码 它们的核酸)。本发明也提供由该方法制得的序列所编码的分离的、合成的或重 组的磷脂酶。
[55]本发明提供了制备变体磷脂酶编码序列的方法，该序列编码对蛋白酶具有减少 的耐受性的磷脂酶，该方法包括将等同于SEQ ID NO：2的位置131上的氨基酸修 改成一个、若干个或所有下述残基：色氨酸(W)；谷氨酸(E)；酪氨酸(Y)，包括具 有这些示例性修改的SEQ ID NO：2的变体(和编码它们的核酸)。本发明也提供 由该方法制得的序列所编码的分离的、合成的或重组的磷脂酶。
[56]本发明提供包括本发明多肽的蛋白制备物，其中蛋白制备物包括液体，固体或 者凝胶制备物。
[57]本发明提供包括本发明多肽和第二种蛋白或者结构域的异源二聚物。异源二聚 物的第二个成员可以是不同的磷脂酶，不同的酶或者另一种蛋白。在一方面，第 二个结构域可以是多肽，且异源二聚物可以是融合蛋白。在一方面，第二个结构 域可以是表位(抗原决定簇)或者标记。在一方面，本发明提供包括本发明多肽的同 源二聚物。
[58]本发明提供具有磷脂酶活性的固定化多肽，其中多肽包含本发明的多肽，本发 明核酸编码的多肽，或者包括本发明多肽和第二个结构域的多肽(例如融合蛋白)。 在一方面，本发明多肽是固定在细胞、细胞小泡、脂质体、膜(film)、膜(membrane)、 金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、板、晶体、 片剂、丸、胶囊、粉末、附聚物、表面、多孔结构、阵列或者毛细管上。在一个 方面，本发明的多肽固定在物质诸如谷物、果壳、树皮、皮、毛、釉质、骨、壳 和由它们衍生而成的物质，或动物饲料，或其组合上。
[59]本发明的多肽(例如磷脂酶)也可以单独存在或以磷脂酶混合物或磷脂酶与其 他水解酶混合物的形式存在，其他水解酶诸如纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂 酶、淀粉酶、或氧化还原酶如漆酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、氧化酶或还原酶。 它们可以配制成固体形式如粉末、冻干制剂、颗粒、片剂、条、晶体、胶囊、丸、 小球，或液体形式如水溶液、气溶胶、凝胶、糊、浆、水/油乳状液、乳剂、及胶 囊、小泡或胶束的悬浮液。在一个方面，本发明的这些制剂可以包括任何下述组 分或它们的组合：多元醇如聚乙二醇、聚乙烯醇、丙三醇，糖类如蔗糖、山梨醇、 海藻糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖；胶凝剂如瓜尔树胶、鹿角菜胶、藻酸盐、葡聚 糖、纤维素衍生物、果胶；盐如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁、氯 化锌、硫酸锌、脂肪酸及其衍生物的盐；金属螯合剂如EDTA、EGTA、柠檬酸 钠；抗微生物剂如脂肪酸、其衍生物、对羟基苯甲酸酯、山梨酸酯、甲苯酸盐； 阻碍蛋白酶作用的其它化合物如大体积蛋白质(bulk protein)，诸如BSA、小麦 水解产物、硼酸盐化合物；乳化剂如非离子型和离子型洗涤剂可以单独或组合使 用；植物甾醇；维生素；氨基酸；可以包括还原剂如半胱氨酸或抗氧化化合物如 抗坏血酸以及分散剂。
[60]在一个方面，交联和蛋白质修饰作用如聚乙二醇化、脂肪酸修饰和糖基化被用 于提高本发明多肽的稳定性(例如酶稳定性)。在一个方面，多元醇和/或糖构成 制剂的约5％至约60％，或更多，制剂的约10％至约50％、制剂的约20％至约40％、 或制剂的约5％至约20％。在另一方面，胶凝剂构成制剂的约0.5％至约10％、制 剂的约1％至约8％、制剂的约2％至约5％、或制剂的约0.5％至约3％。在另一方 面，盐如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钙和/或氯化镁构成制剂的约1％至约30％、 制剂的约2％至约20％、制剂的约5％至约15％、或制剂的约1％至约10％。在另 一方面，氯化锌以约0.1mM至约20mM、约0.5mM至约10mM、约1mM至约 5mM、或约0.1mM至约5mM的浓度存在于制剂中。又在另一个方面，硫酸锌 以约0.1mM至约20mM、约0.5mM至约10mM、约1mM至约5mM、或约0.1 mM至约5mM的浓度存在于制剂中。在另一个方面，脂肪酸和/或其衍生物的盐 构成制剂的约5％至约40％、制剂的约10％至约30％、制剂的约15％至约25％、 或制剂的约5％至约20％。在另一方面，金属螯合剂如EDTA、EGTA和/或柠檬酸 钠以约0.1mM至约10mM、约0.5mM至约8mM、约1mM至约5mM或约0.1 mM至约1mM的浓度存在于制剂中。在另一方面，抗微生物剂如对羟基苯甲酸酯 类、山梨酸酯和/或甲苯酸盐构成制剂的约0.01％至约10％、制剂的约0.05％至约 5％、制剂的约0.1％至约1％、或制剂的约0.05％至约0.5％。又在另一个方面，大 量蛋白质如BSA和/或小麦水解产物构成制剂的约1％至约20％、制剂的约5％至 约15％、制剂的约2.5％至约7.5％、或制剂的约1％至约5％。在另一方面，乳化剂 如非离子型和/或离子型洗涤剂以一定浓度存在于制剂中，该浓度包括约1×临界胶 束浓度(CMC)至约10×CMC，约2.5×CMC至约7.5×CMC，约1×CMC至约5×CMC， 或约3×至约6×CMC。在另一个方面，维生素、氨基酸、还原剂和/或抗氧化化合 物构成制剂的约0.1％至约5％、制剂的约0.5％至约4％、制剂的约1％至约2.5％、 制剂的约0.1％至约1％。
[61]本发明提供包含固定化多肽的阵列，其中多肽是本发明的磷脂酶或者本发明核 酸编码的多肽。本发明提供含有本发明的固定化核酸的阵列。本发明提供含有本 发明的固定化抗体的阵列。
[62]本发明提供特异性地结合于本发明多肽或者本发明的核酸编码的多肽的分离 的或者重组的抗体。抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。本发明提供含有本 发明抗体的杂交瘤。
[63]本发明提供分离和鉴定具有磷脂酶活性的多肽的方法，包括以下步骤：(a) 提供本发明的抗体；(b)提供含有多肽的样品；以及(c)在抗体能够特异性地 结合于该多肽的条件下，将步骤(b)的样品与步骤(a)的抗体接触，从而分离 和鉴定磷脂酶。本发明提供制备抗-磷脂酶抗体的方法，包括向非人类动物施用足 以产生体液免疫应答的量的本发明核酸或者本发明多肽，从而制备抗磷脂酶抗体。
[64]本发明提供生产重组多肽的方法，包含以下的步骤：(a)提供可操作地连接 于启动子的本发明的核酸，以及(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的 核酸，从而生产重组多肽。该核酸可以包括与SEQ ID NO：1序列在至少大约100 个残基的范围内，具有至少85％的序列同一性的序列，与SEQ ID NO：3的序列在 至少大约100个残基的范围内，具有至少80％的序列同一性的序列，与SEQ ID NO：5序列在至少大约100个残基的范围内，具有至少80％的序列同一性的序列， 或者与SEQ ID NO：7序列在至少大约100个残基的范围内，具有至少70％的序列 同一性的序列，其中序列同一性通过序列比较算法分析或者目测观察来确定。核 酸可以包括在严格的条件下与SEQ ID NO：1所阐述的核酸或者其子序列，与SEQ ID NO：3所阐述的核酸或者其子序列，与SEQ ID NO：5所阐述的核酸或者其子序 列，与SEQ ID NO：7所阐述的核酸或者其子序列杂交的核酸。该方法可以进一步 包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，随后表达步骤(a)的核酸，从而在转化细 胞中生产重组多肽。该方法可以进一步包括把步骤(a)的核酸插入到非人类动物 宿主中，随后表达步骤(a)的核酸，从而在非人动物宿主中生产重组多肽。
[65]本发明提供鉴定具有磷脂酶活性的多肽的方法，包括以下的步骤：(a)提供 本发明的多肽或由本发明核酸编码的多肽，或其片段或变异体，(b)提供磷脂酶 底物；和(c)将步骤(a)的多肽或其片段或变异体与步骤(b)的底物接触，并 检测底物量的增加或者产物量的减少，其中底物量的减少或者产物量的增加说明 检测到了具有磷脂酶活性的多肽。在可选择的方面，核酸包括与SEQ ID NO：1在 至少大约100个残基的范围内具有至少85％的序列同一性的序列，与SEQ ID NO：3 在至少大约100个残基的范围内具有至少80％的序列同一性的序列，与SEQ ID NO：5在至少大约100个残基的范围内具有至少80％的序列同一性的序列，或者与 SEQ ID NO：7在至少大约100个残基的范围内具有至少70％的序列同一性的序列， 其中序列同一性通过序列比较算法分析或者目测观察来确定。在可选择的方面， 核酸可以在严格的条件下与SEQ ID NO：1所阐述的核酸或者其子序列，与SEQ ID NO：3所阐述的核酸或者其子序列，与SEQ ID NO：5所阐述的核酸或者其子序列， 与SEQ ID NO：7所阐述的核酸或者其子序列杂交。
[66]本发明提供确定磷脂酶底物的方法，包括以下步骤：(a)提供本发明的多肽或 者本发明核酸编码的多肽；(b)提供测试底物；以及(c)将步骤(a)的多肽与 步骤(b)的测试底物接触，检测底物量的增加或者产物量的减少，其中底物量的 减少或者产物量的增加确定测试底物为磷脂酶底物。在可选择的方面，核酸可以 与SEQ ID NO：1在至少大约100个残基的范围内具有至少85％的序列同一性，与 SEQ ID NO：3在至少大约100个残基的范围内具有至少80％的序列同一性，与SEQ ID NO：5在至少大约100个残基的范围内具有至少80％的序列同一性，或者与SEQ ID NO：7在至少大约100个残基的范围内具有至少70％的序列同一性，其中序列 同一性通过序列比较算法分析或者目测观察来确定。在可选择的方面，核酸在严 格的条件下与SEQ ID NO：1所阐述的核酸或者其子序列，SEQ ID NO：3所阐述的 核酸或者其子序列，SEQ ID NO：5所阐述的核酸或者其子序列，SEQ ID NO：7所阐 述的核酸或者其子序列杂交。
[67]本发明提供确定化合物是否特异性地结合于磷脂酶的方法，包括以下步骤： (a)在允许核酸翻译成多肽的条件下，表达核酸或者包含该核酸的载体，其中该 核酸和载体包括本发明的核酸或者载体；或者，提供本发明的多肽，(b)使多肽 与测试化合物接触；和(c)确定测试化合物是否特异性地结合于多肽，从而确定 该化合物是否特异地结合于磷脂酶。在可选择的方面，核酸序列与SEQ ID NO：1 在至少大约100个残基的范围内，具有至少85％的序列同一性，与SEQ ID NO：3 在至少大约100个残基的范围内，具有至少80％的序列同一性，与SEQ ID NO：5 在至少大约100个残基的范围内，具有至少80％的序列同一性，或者与SEQ ID NO：7在至少大约100个残基的范围内，具有至少70％的序列同一性，其中序列同 一性通过序列比较算法分析或者目测观察来确定。在可选择的方面，核酸在严格 的条件下与SEQ ID NO：1所阐述核酸或其子序列，与SEQ ID NO：3所阐述核酸或 其子序列，与SEQ ID NO：5所阐述核酸或其子序列，与SEQ ID NO：7所阐述核酸 或其子序列杂交。
[68]本发明提供鉴定磷脂酶活性的调节物的方法，包括以下步骤：(a)提供本发 明的多肽或者本发明核酸编码的多肽；(b)提供测试化合物；以及(c)将步骤 (a)的多肽与步骤(b)的测试化合物接触；并测定磷脂酶的活性，其中在测试 化合物存在的条件下测得的磷脂酶活性与在无测试化合物存在的条件下测得的磷 脂酶活性相比得到的变化证明测试化合物调节了磷脂酶的活性。在可选择的方面， 核酸可以与SEQ ID NO：1在至少大约100个残基的范围内，具有至少85％的序列 同一性，与SEQ ID NO：3在至少大约100个残基的范围内，具有至少80％的序列 同一性，与SEQ ID NO：5在至少大约100个残基的范围内，具有至少80％的序列 同一性，或者与SEQ ID NO：7在至少大约100个残基的范围内，具有至少70％的 序列同一性，其中序列同一性通过序列比较算法分析或者目测观察来确定。在可 选择的方面，核酸可以在严格的条件下与选自SEQ ID NO：1所阐述核酸或其子序 列；SEQ ID NO：3所阐述核酸或其子序列；SEQ ID NO：5所阐述核酸或其子序列； 和SEQ ID NO：7所阐述核酸或其子序列的核酸序列杂交。
[69]在一个方面，磷脂酶活性通过提供磷脂酶底物并且检测底物量的增加或者产物 量的减少来测定。与不存在测试化合物的条件下底物或者产物的量相比，在存在 测试化合物的条件下，底物量的减少或者产物量的增加证明测试化合物是磷脂酶 活性的激活剂。与不存在测试化合物的条件下底物或者产物的量相比，在存在测 试化合物的条件下，底物量的增加或者产物量的减少证明测试化合物是磷脂酶活 性的抑制剂。
[70]发明提供包含处理器和数据存储设备的计算机系统，其中所述的数据存储设备 上已存储了本发明的多肽序列或者本发明的核酸序列。
[71]一方面，计算机系统可以进一步包括序列比较算法，和其上已经存储了至少一 个参照序列的数据存储设备。序列比较算法可以包括表明多态性的计算机程序。 计算机系统可以进一步包括鉴定所述序列的一个或者多个特征的标识符 (identifier)。
[72]本发明提供已存储了包括本发明多肽序列或本发明核酸序列的序列的计算机 可读存储介质。
[73]本发明提供了鉴定序列中的特征的方法，包括以下步骤：(a)应用鉴定序列 的一个或者多个特征的计算机程序来读取序列，其中该序列包括本发明的多肽序 列或者本发明的核酸序列；和(b)用计算机程序鉴定序列中的一个或者多个特征。
[74]本发明提供比较第一序列和第二序列的方法，该方法包括以下步骤：(a)应 用比较序列的计算机程序读取第一序列和第二序列，其中第一序列包括本发明的 多肽序列或者本发明的核酸序列；并且(b)用计算机程序确定第一序列和第二序 列间的差异。在一个方面，确定第一序列和第二序列间差异的步骤进一步包括鉴 定多态性的步骤。在一个方面，该方法进一步包括鉴定序列中一个或者多个特征 的标识符(以及标识符的应用)。在一个方面，该方法包括用计算机程序读取第 一序列，并鉴定该序列中的一个或者多个特征。
[75]本发明提供从环境样品中分离或者回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的 方法，包括以下步骤：(a)提供扩增编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的扩增引 物序列对，其中引物对能够扩增本发明的核酸(如SEQ ID NO：1或其子序列，SEQ ID NO：3或其子序列，SEQ ID NO：5核酸或其子序列，SEQ ID NO：7核酸或其子序 列，等等)；(b)从环境样品中分离核酸或者处理环境样品以便样品中的核酸可 以与扩增引物对杂交；和(c)将步骤(b)的核酸和步骤(a)的扩增引物对结合， 并且从环境样品中扩增核酸，从而从环境样品中分离或者回收编码具有磷脂酶活 性的多肽的核酸。在一方面，扩增引物序列对的每一个成员包括含有本发明的核 酸序列的至少大约10到50个连续碱基的寡核苷酸。在一方面，扩增引物序列对 是本发明的扩增对。
[76]本发明提供从环境样品中分离或者回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的 方法，包括以下步骤：(a)提供包含本发明的核酸序列或其子序列的多核苷酸探 针；(b)从环境样品中分离核酸或者处理环境样品以便样品中的核酸可以与步骤 (a)的多核苷酸探针杂交；(c)将步骤(b)的分离的核酸或者经处理的环境样 品与步骤(a)的多核苷酸探针结合；和(d)分离与步骤(a)的多核苷酸探针特 异性杂交的核酸，因此从环境样品中分离或者回收编码具有磷脂酶活性的多肽的 核酸。在可选择的方面，环境样品包括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品 或者生物样品。在可选择的方面，生物样品来源于细菌细胞、原生动物细胞、昆 虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞、藻类细胞、地衣细胞或者哺乳动物细 胞。
[77]本发明提供产生编码磷脂酶的核酸的变异体的方法，包括以下步骤(a)提供 包括本发明核酸的模板核酸；(b)在模板序列中修饰，缺失或者添加一个或者多 个核苷酸，或其组合从而产生模板核酸的变异体。
[78]在一方面，该方法进一步包括表达变异核酸，产生变体磷脂酶多肽。在可选择 的方面，修饰、添加或者缺失由易错PCR(error-prone PCR)、重排(shuffling)、寡聚 核苷酸定向诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis)、装配PCR(assembly PCR)、 有性PCR诱变(sexual PCR mutagenesis)、体内诱变(in vivo mutagenesis)、盒式诱变 (cassette mutagenesis)、回归整体诱变(recursive ensemble mutagenesis)、指数整体诱 变(exponential ensemble mutagenesis)、位点专一性诱变(site-specific mutagenesis)、 基因重装配(gene reassembly)、基因位点饱和诱变TM(Gene Site Saturation Mutagenesis，GSSMTM)、合成连接重装配(synthetic ligation reassembly，SLR)和/或 其组合的方法来引入。在可选择的方面，修饰、添加或者缺失通过选自下述方法 引入：重组、回归序列重组(recursive sequence recombination)、硫代磷酸酯-修饰的 DNA诱变(phosphothioate-modified DNA mutagenesis)、含尿嘧啶的模板诱变 (uracil-containing template mutagenesis)、缺口二重诱变(gapped duplex mutagenesis)、 点错配修复诱变(point mismatch repair mutagenesis)、修复-缺陷型宿主株诱变 (repair-deficient host strain mutagenesis)、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制- 选择诱变(restriction-selection mutagenesis)、限制-纯化诱变(restriction-purification mutagenesis)、人工基因合成(artificial gene synthesis)、整体诱变(ensemble mutagenesis)、嵌合核酸多聚体生成(chimeric nucleic acid multimer creation)和/或其 组合。
[79]在一方面，该方法被反复重复，直到产生与模板核酸编码的磷脂酶相比，具有 改变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的磷脂酶。在一方面，改变的或 不同的活性是在酸性条件下的磷脂酶活性，其中模板核酸编码的磷脂酶在酸性条 件下没有活性。一方面，改变的或不同的活性是在高温下的磷脂酶活性，其中模 板核酸编码的磷脂酶在高温的条件下没有活性。一方面，该方法反复重复，直到 产生与模板核酸的密码子选择相比具有改变的密码子选择的磷脂酶编码序列。该 方法反复重复，直到产生与模板核酸的信息表达或者信息稳定性相比具有更高或 更低水平的信息表达或者信息稳定性的磷脂酶基因。
[80]本发明提供修饰编码磷脂酶的核酸中密码子以增强其在宿主细胞中表达的方 法，该方法包括(a)提供本发明的编码磷脂酶的核酸；(b)鉴定步骤(a)的核 酸中的非偏爱(non-preferrd)或者不太偏爱(less preferred)的密码子，并且用编 码相同氨基酸的偏爱的或者中立使用(neutrally used)的密码子作为替代密码子替 换之，其中偏爱密码子是在宿主细胞基因的编码序列中出现频率较多的密码子， 而非偏爱或不太偏爱的密码子是在宿主细胞基因的编码序列中出现频率较低的密 码子，由此修饰该核酸以增加其在宿主细胞中的表达。
[81]本发明提供修饰编码磷脂酶的核酸中的密码子的方法，该方法包括(a)提供 本发明的编码磷脂酶的核酸；并且(b)确定步骤(a)的核酸中的密码子，并用 编码相同氨基酸的不同的密码子作为替代密码子来替换之，从而修饰编码磷脂酶 的核酸中的密码子。
[82]本发明提供修饰编码磷脂酶的核酸中的密码子以增强其在宿主细胞中的表达 的方法，该方法包括(a)提供本发明的编码磷脂酶的核酸，和(b)鉴定步骤(a) 的核酸中的非偏爱的或者不太偏爱的密码子，并用编码相同氨基酸的偏爱的或者 中立使用的密码子作为替代密码子来替换之，其中偏爱密码子是在宿主细胞基因 的编码序列中出现频率较多的密码子，非-偏爱或不太偏爱的密码子是在宿主细胞 基因的编码序列中出现频率较少的密码子，由此修饰该核酸以增加其在宿主细胞 中的表达。
[83]本发明提供修饰编码磷脂酶的核酸中的密码子以降低其在宿主细胞的表达的 方法，该方法包括(a)提供本发明的编码磷脂酶的核酸；和(b)鉴别步骤(a) 的核酸中的至少一个偏爱的密码子，并用编码相同氨基酸的非偏爱的或者不太偏 爱的密码子作为替代密码子替换之，其中偏爱密码子是在宿主细胞基因的编码序 列中出现频率较高的密码子，非偏爱或不太偏爱的密码子是在宿主细胞基因的编 码序列中出现频率较低的密码子，由此修饰该核酸以减少其在宿主细胞中的表达。 在可选择的方面，宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物 细胞、藻类细胞、地衣细胞或哺乳动物细胞。
[84]本发明提供产生编码多个经修饰的磷脂酶活性位点或底物结合位点的核酸文 库的方法，其中经修饰的活性位点或者底物结合位点来源于包括编码第一活性位 点或者第一底物结合位点的序列的第一核酸，该方法包括：(a)提供编码第一个 活性位点或者第一个底物结合位点的第一核酸，其中第一核酸序列包括本发明的 核酸，(b)提供一套在第一核酸的多个靶密码子处编码天然产生的氨基酸变体的 诱变寡核苷酸；和(c)应用该套诱变的寡核苷酸产生一套编码活性位点或者编码 底物结合位点的变体核酸，在每一个被诱变的氨基酸密码子处，变体核酸编码一 定范围的氨基酸变异，从而产生编码多个修饰的磷脂酶活性位点或者底物结合位 点的核酸文库。在可选择的方面，本方法包括通过下列的方法诱变步骤(a)的第 一核酸，所述方法包括优化的定向进化系统(optimized directed evolution system)、 基因位点饱和诱变TM(Gene Site-Saturation MutagenesisTM)(GSSMTM)、合成连接 重装配(SLR)。该方法可以进一步包括通过下列方法诱变诱变步骤(a)的第一 核酸或变体，所述包括易错PCR、重排、寡核苷酸定点突变、装配PCR、有性PCR 诱变、体内诱变、盒式诱变、回归整体诱变、指数整体诱变、位点专一性诱变、 基因重装配、基因位点饱和诱变TM(GSSMTM)、合成连接重装配(SLR)及其组 合。本方法可以进一步包括通过以下的方法诱变步骤(a)的第一核酸或变异体， 所述方法包括重组、回归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模 板诱变、缺口二重诱变、点错配修复诱变、修复-缺陷型宿主株诱变、化学诱变、 放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、 嵌合核酸多聚体生成及其组合。
[85]本发明提供制备小分子的方法，包括以下步骤(a)：提供可以合成或者修饰 小分子的多个生物合成酶，其中之一包括由本发明核酸编码的磷脂酶；(b)提供 用于步骤(a)的至少一种酶的底物，并且(c)在利于许多生物催化反应进行的条 件下，将步骤(b)的底物和酶反应，通过一系列生物催化反应产生小分子。
[86]本发明提供修饰小分子的方法，包括以下步骤：(a)提供由本发明核酸编码 的磷脂酶；(b)提供小分子；和(c)在利于磷脂酶催化的酶反应进行的条件下， 将步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子反应，从而通过磷脂酶酶促反应修饰小分 子。一方面，该方法包括为步骤(a)的酶提供多种的小分子底物，从而产生了经 修饰的小分子文库，该小分子文库由磷脂酶催化的至少一种酶促反应产生。一方 面，该方法进一步包括多种额外酶，在有利于进行由该酶催化的多种生物催化反 应的条件下，通过多种酶促反应形成经修饰的小分子文库。在一方面，该方法进 一步包括检测文库以确定在文库中是否存在表现出期望活性的特定修饰小分子的 步骤。检测文库的步骤可以进一步包括系统地去除文库中用来产生部分多个修饰 小分子的除一种反应之外的所有生物催化反应，通过检测一部分修饰小分子中是 否存在具有所需活性的特定的修饰小分子，鉴定产生具有所需活性的特定修饰小 分子的至少一种特定的生物催化反应。
[87]本发明提供用于确定磷脂酶的功能性片段方法，包括以下步骤：(a)提供包 括本发明氨基酸序列的磷脂酶；和(b)缺失步骤(a)序列中的多个氨基酸残基， 并且测定剩余序列的磷脂酶活性，从而确定磷脂酶的功能性片段。一方面，磷脂 酶活性通过提供磷脂酶底物，检测底物量的增加或者反应产物量的减少来测定。 一方面，与不存在测试化合物条件下确定的底物或者反应产物的量相比较，在测 试化合物存在的条件下，酶底物量的减少或者反应产物量的增加表明测试化合物 是磷脂酶活性的激活剂。
[88]本发明提供切割甘油磷酸酯键的方法，包括以下步骤：(a)提供具有磷脂酶 活性的多肽，其中该多肽包括本发明的氨基酸序列，或者该多肽由本发明的核酸 序列编码；(b)提供包含甘油磷酸酯键的组合物；和(c)在该多肽切割甘油磷 酸酯键的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。一方面，该条 件包括大约pH5到大约8.5之间，或者大约pH4.5(或酸性更大，即pH<4.5)到 大约9.0(或碱性更大，即pH>9)之间。一方面，该条件包括大约40℃到大约70℃ 之间的温度。一方面，该组合物包括植物油。一方面，该组合物包括油籽磷脂。 一方面，切割反应可以产生水可抽提的磷酸化的碱和甘油二酯。
[89]本发明提供了水解、分解或破裂含磷脂组合物的方法，该方法包括提供具有磷 脂酶活性的至少一种本发明的多肽，或由本发明的至少一种核酸编码的具有磷脂 酶活性的多肽；提供包含磷脂的组合物；以及在磷脂酶水解、分解或破裂含磷脂 组合物的条件下将所述多肽与所述组合物接触。在一个方面，该方法包括使用高 剪切力混合该组合物，然后以无剪切力或低剪切力与至少一种具有磷脂酶活性的 本发明的多肽混合，以使磷脂底物与磷脂酶充分“接触”。具有磷脂酶活性的至少一 种多肽也可以存在于高剪切力混合步骤中。该方法可以以任何规模实施，例如以 包括约1克(g)至约500、1000、2000、2500、5000g或更多，或该范围内的任何数 量。
[90]本发明提供油的脱胶(oil degumming)方法，包括以下步骤：(a)提供具有 磷脂酶活性的至少一种多肽，其中多肽包括本发明的氨基酸序列，或者多肽由本 发明的核酸序列编码；(b)提供包括植物油的组合物；和(c)在多肽可以切割 植物油中酯键的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的植物油接触，从而进 行油的脱胶。在一方面，植物油包括油籽。植物油可以包括米糠油(rice bran oils)、 棕榈油，油菜籽油，玉米油，大豆油，油菜油(canola oil)，芝麻油，花生油，或 者葵花子油。在一方面，该方法进一步包括加入发明的磷脂酶，其它磷脂酶或其 组合。在一个方面，将一种以上具有磷脂酶活性的多肽加入到该方法中，其中至 少一种多肽是本发明的酶。在一个方面，酶以特定顺序加入，例如，具有不同特 性的PLC以特定顺序加入，例如具有PC和PE活性的酶被首先加入(或者两种酶 同时加入，一种具有PC活性，另一种具有PE活性)，然后加入具有PI PLC活性 的酶，或其任意组合。
[91]在油的脱胶方法的一个方面，含油组合物包括植物油、动物油、藻类油或鱼油 或脂肪。植物油可以包括米糠油、大豆油、油菜籽油、玉米油、来自棕榈果仁的 油、油菜油、向日葵油、芝麻油或花生油。多肽可以水解含油组合物中来自水合 和/或非水合磷脂的磷脂。在一个方面，多肽在甘油磷酯键水解磷脂从而产生甘油 二酯和水溶性磷酸盐化合物。在一个方面，多肽具有磷脂酶C的活性。在一个方 面，多肽是磷脂酶D，且也可以加入磷酸酶。
[92]在油的脱胶方法的一个方面，接触步骤包括水解油中的水合磷脂。水解条件可 以包括碱性条件，例如在一个方面，该条件包括在碱性pH条件下约20℃至40℃ 的温度。碱性条件可以包括约pH8至pH10，或更大的pH。在该方法的任何时刻， 水解条件都可以被变为碱性，例如在一个方面，在该条件变成碱性之前，加入磷 脂酶诸如PLC(例如，含酸油诸如磷脂酸的“碱性中合”)。
[93]在油的脱胶方法的一个方面，在PLC的作用下，碱将使1，2-DAG异构成 1，3-DAG，1，3-DAG的营养健康价值超过1，2-DAG，例如1，3-DAG作为能源被燃 烧掉，而不是作为脂肪储存起来(如1，2-DAG)。因此，本发明提供了碱性油精 炼工艺，其中磷脂酶例如本发明的酶包括PLC，“在前期(at the front end)”加入， 即在加入任何酸和碱之前加入，例如，如图13的示范性方法中所示。在本发明的 碱性精炼工艺的前端加入PLC(参见下面进一步的论述)以及随后加入酸和碱的结 果之一就是产生了提高水平的1，3-DAG(不是1，2-DAG)。这可能是酸或碱催化的酰 基转移的结果。从营养角度讲，1，3-D AG胜于1，2-DAG。因此，本发明包括使用 本发明的PLC进行的油脱胶工艺，因而最终的脱胶油产物含有不少于约0.5％、 1.0％、2.0％、3.0％、4.0％或5.0％的1，3-DAG。
[94]在油的脱胶方法的一个方面，水解条件可以包括反应时间约3至10分钟或更 多时间。水解条件可以包括在约50℃至60℃的温度下，在约pH5至pH6.5，或 约pH5至pH7.5，或约pH5至pH8.0，水解油中的水合或非水合的磷脂，反应时 间是约30至60分钟。
[95]在油的脱胶方法的一个方面，多肽被结合到过滤器上，并使含磷脂的脂肪或油 通过过滤器。该多肽可以被加入到包括含磷脂脂肪或油的溶液中，然后使该溶液 通过过滤器。
[96]在油的脱胶方法的一个方面，该方法还包括通过物理的方法除去脱胶工艺产生 的胶，这是通过加入硬化物质例如云母或等同物进行的。在一个方面，这增加了 油产量。
[97]本发明还提供转化非水合的磷脂成水合形式的磷脂的方法，包括以下步骤： (a)提供具有磷脂酶活性的多肽，其中多肽包括本发明的氨基酸序列，或者多肽 由本发明的核酸编码；(b)提供包括非水合磷脂的组合物；和(c)在多肽能够 切割非水合磷脂中的酯键的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的非水合磷 脂接触，从而将非水合磷脂转化为水合形式。
[98]本发明提供使油脱胶的方法，包括以下步骤：(a)提供包括具有磷脂酶活性 的本发明的多肽，或者由本发明核酸编码的多肽的组合物；(b)提供包括含有磷 脂的脂肪或者油的组合物；(c)在多肽能够对含磷脂的组合物进行脱胶的条件下 (在本发明的多肽能够催化磷脂水解的条件下)，将步骤(a)的多肽与步骤(b) 的组合物接触。在一方面，含油的组合物包括植物、动物、藻或者鱼的油。植物 油可以包括米糠油、大豆油、油菜籽油、玉米油、棕榈仁的油、油菜油、葵花子 油、芝麻油或者花生油。多肽可以水解含油组合物中水合和/或非水合磷脂中的磷 脂。多肽可以在甘油磷脂键水解磷脂，产生甘油二酯和水溶性的磷酸盐化合物。 多肽可以具有磷脂酶C，B，A或者D的活性。在一方面，加入了磷脂酶D活性 和磷酸酶活性。接触可以包括油中的水合磷脂的水解。水解条件可以包括在碱性 pH下，温度为大约20℃到40℃。碱性条件可以包括大约pH8到pH10的pH。水 解条件可以包括反应时间为3到10分钟。水解条件可以包括在温度为大约50℃到 60℃，pH大约为pH5到pH6.5，反应时间为大约30到60分钟，水解油中水合的 或者非水合的磷脂。多肽可以结合于过滤器，并使含有磷脂的脂肪或者油通过过 滤器。多肽可以加入到包含含磷脂的脂肪或者油的溶液中，然后使溶液通过过滤 器。
[99]本发明提供将非水合的磷脂转化为水合形式的方法，包括以下的步骤：(a) 提供包括具有本发明磷脂酶活性的多肽，或者由本发明的核酸序列编码的多肽的 组合物；(b)提供包括非水合的磷脂的组合物；和(c)在多肽将非水合磷脂转 化为水合形式的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)组合物接触。多肽可以 具有磷脂酶C的活性。多肽可以具有磷脂酶D的活性，并且也加入磷酸酶。
[100]发明提供碱法精炼含磷脂的组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供包 含磷脂酶，其可以是本发明的具有磷脂酶活性的多肽，或者由本发明核酸编码的 多肽的组合物；(b)提供包含磷脂的组合物；和(c)在碱法精炼之前，碱法精 炼期间或者之后，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。多肽可以具有 磷脂酶活性，例如PLC、PLB、PLD和/或PLA活性。多肽可以在碱性精炼之前即 在该方法的“前期(front end)”，在加入酸或碱之前加入，如图13所示。
[101]多肽(其可以是本发明的酶，例如PLC)可以在碱性精炼期间加入，并根 据磷水平和游离脂肪酸的水平，可以加入变化水平的酸或碱。多肽(其可以是本 发明的酶)可以在碱性精炼之前或之后加入：分离以前，在强混合器(intense mixer) 或阻滞混合器(retention mixer)中；加热步骤之后；在离心机中；在皂脚中；在 洗涤水中；和/或在漂白或除臭步骤中。该方法可以包括使用浓的碱溶液，例如浓 度比11％的工业标准更高，以降低胶的质量(mass of gum)。在可选择的方面， 浓的碱溶液是在约12％至50％之间，例如约20％、30％、40％、50％或60％或更浓。
[102]含磷脂的组合物可以包括植物。多肽可以通过转基因的方式在该植物中表 达。具有磷脂酶活性的多肽可以在破碎种子或植物其他部分期间加入，或者具有 磷脂酶活性的多肽在破碎之后或精炼之前加入。
[103]还提供了使用本发明的多肽水解油(例如植物油)中的磷脂，以产生甘油 二酯(DAG)和水溶性磷酸酯的碱法精炼工艺。在一个方面，本发明的酶必须在碱法 精炼工艺中，包括可选地低含量水和/或在约55℃至约70℃的温度范围内操作。在 该温度范围内，以低水条件使用碱法精炼工艺，将通过增加DAG和减少气体夹带 油(entrained oil)而使产量最大化。在一个方面，在本发明的碱法精炼工艺中使用的 酶对磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)具有非常好的活性，在约pH6至pH9具 有活性，在高达75℃下具有活性，在低含量水例如约2％至5％水的具有活性，例 如SEQ ID NO：2的序列编码的酶，SEQ ID NO：1的序列编码的酶。
[104]在本发明用于水解油中磷脂的碱法精炼工艺的另一方面，使用了两种酶： PI-特异性PLC(水解PI)和水解PC、PE及PA的PC-PLC。该实施方案产生适合于 化学或物理精炼的油，并使DAG的产量增加最大化，并减少气体夹带的油。
[105]发明提供纯化植物甾醇或者三萜的方法，包括以下的步骤：(a)提供包 括本发明的具有磷脂酶活性的多肽或者由本发明核酸编码的多肽的组合物；(b) 提供含有植物甾醇或者三萜的组合物；和(c)在多肽可以催化组合物中磷脂的水 解的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。该多肽可以具有磷 脂酶C的活性。植物甾醇或者三萜可以包括植物甾醇(plant sterol)。该植物甾醇 可以来源于植物油。植物油可以包括米糠油(a rice bran oil)、椰子油、油菜油(canola oil)、可可黄油、玉米油、棉籽油、亚麻油、橄榄油、棕榈油、花生油、来自米 糠的油、红花油、芝麻油、大豆油、或者葵花子油。该方法可以包括应用非极性 溶剂来定量地提取游离的植物甾醇和甾醇脂肪酸酯。植物甾醇或者三萜可以包括 β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾烷醇、谷甾烷醇、链甾醇 (desmosterol)、海绵甾醇、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇或者菜籽甾醇。
[106]本发明提供精炼粗制油的方法，包括以下步骤：(a)提供包括本发明的 具有磷脂酶活性的多肽，或者由本发明核酸编码的多肽的组合物；(b)提供包括 含磷脂的油的组合物；和(c)在多肽催化组合物中的磷脂水解的条件下，将步骤 (a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。该多肽可以具有磷脂酶C的活性。多肽 可以在水溶液加入到组合物的情况下具有磷脂酶活性。水的水平可以是在0.5到5 ％之间。处理时间可以大约2小时以下，大约60分钟以下，大约30分钟以下， 大约15分钟以下，或者5分钟以下。水解条件可以包括温度范围在大约25℃到 70℃之间。水解条件可以包括使用苛性碱。可以使用碱的浓溶液，例如比11％的 工业标准更浓的浓度，以减少胶的质量。在可选择的方面，碱的浓溶液是在约12％ 至50％之间，例如约20％、30％、40％、50％或60％或更浓的浓度。
[107]水解条件可以包括pH范围在大约pH3到pH10之间、在大约pH4到pH9 之间、或者在大约pH5到pH8之间。水解条件可以包括在接触步骤(c)后加入 乳化剂和/或进行混合。该方法可以包括加入乳化剂破乳剂(emulsifiers-breaker) 和/或加热或冷却(例如在约4℃至约-20℃之间，或更低温度)，来促进水相的分 离。该方法可以包括在接触步骤前进行脱胶，通过离心收集卵磷脂，然后再加入 PLC，PLC和/或PLA以去除非水合的磷脂。对于食用油，该方法可以包括对粗油 进行水脱胶到少于10ppm的磷，对于生物柴油，然后通过物理精炼到少于大约50 ppm的磷。该方法可以包括加入酸来增强非水合磷脂的水合作用。在一个方面， 加入酸来促进钙和镁金属含量的降低。
[108]本发明提供了改善或防止脂多糖(LPS)-介导的毒性的方法，该方法包括给 予患者包含本发明多肽的药物组合物。本发明提供了内毒素的解毒方法，包括使 内毒素与本发明的多肽接触。本发明提供了从类脂A上脱去2′或3′脂肪酸链的脱 酰基方法，包括将类脂A与本发明的多肽接触。
[109]本发明提供了精炼润滑剂的方法，包括以下步骤：(a)提供包括本发明 的酶的组合物；(b)提供润滑剂；和(c)在酶可以选择性地水解润滑剂中的油 的条件下，用酶处理润滑剂，从而精炼该润滑剂。该润滑剂可以是液压油。
[110]本发明提供了处理织物的方法，包括下述步骤：(a)提供包括本发明的 酶的组合物；(b)提供织物；和(c)用该酶处理织物。织物的处理可以包括最 终织物的手感和褶皱的改善、染色、获得阻燃性、获得防水性、获得光学亮度或 者获得树脂整理。该织物可以包括棉、粘胶纤维、人造纤维、lyocell、亚麻(flax)、 亚麻(linen)、苎麻、其所有的混合物，或者它们与聚酯、羊毛、聚酰胺、丙烯酸类 或聚丙烯酸类的混合物。本发明提供了包含本发明的酶的织物、纱线或纤维。该 酶可以被吸附，吸附或固定在织物、纱或纤维的表面。
[111]本发明提供了表达磷脂酶C方法，该方法包括提供具有Mut+表型的毕赤 酵母菌株；将异源的磷脂酶C-编码核酸插入毕赤酵母菌株；并将毕赤酵母菌株培 养在表达磷脂酶C的条件下。该方法还可以包括用锌补充培养条件。本发明也提 供了用于表达磷脂酶C的细胞体系，分离的细胞和细胞系，包括Mut+表型毕赤酵 母菌株，其含有可操作性地连接于毕赤酵母菌株中可以操作的启动子的异源的磷 脂酶C-编码核酸。
[112]本发明提供了用于表达异源蛋白的耐zeocin的酵母细胞体系(例如酵母细 胞、细胞系、单个细胞)，包括步骤：提供含有能够表达异源蛋白的异源核酸的 毕赤酵母某种(Pichia sp.)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))细胞；在含某 一初始浓度zeocin的条件下培养该细胞；挑选对初始浓度的zeocin有抗性的细胞， 并在含有较高浓度zeocin的条件下再培养；并挑选出步骤(C)中培养的耐较高浓 度zeocin的细胞。在一个方面，异源蛋白是酶，或任选地是磷脂酶，或任选地是 磷脂酶C(PLC)，例如本发明的任何酶。
[113]本发明的一个或者多个实施方案的细节在附图和以下的说明书中进行阐 明。本发明的其它特征，目标，以及优势将通过阅读说明书和附图以及权利要求 得变得显而易见。
[114]出于各种目的，本文所引用的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序 列以及美国模式菌种保藏中心(ATCC)保藏物，特意并入本文作为参考。
附图简述
[115]下图是本发明的实施方案的例示性说明，并不为了限制权利要求所包含的 发明范围。
[116]图1是计算机系统的框图，具体的细节说明参见下文。
[117]图2是过程200的一个方面的流程图，为了确定新序列和数据库中的序列 之间的同源性水平，把新的核苷酸或蛋白质序列与数据库中的序列相比较，具体 的细节说明参见下文。
[118]图3是举例说明在计算机中确定两个序列是否是同源的过程的实施方案的 流程图，具体细节说明参见下文。
[119]图4是举例说明标识符过程的一个方面的流程图，该标识符过程用于检测 序列中特征的存在与否，具体的细节说明参见下文。
[120]图5A、5B和5C用图表说明用于模拟PLC-介导的脱胶的典型两相系统， 具体的细节说明参见下文。
[121]图6用图表说明了应用本发明的磷脂酶的典型的植物油精炼过程。
[122]图7用图表说明用于物理精炼油的发明的典型脱胶过程，具体的细节说明 参见下文。
[123]图8用图表说明用本发明的磷脂酶C进行的磷脂水解，具体的细节说明参 见下文。
[124]图9用图表说明了本发明的示例性碱法精炼工艺，说明了用本发明的磷脂 酶C作为“碱法精炼辅助剂”(长混合碱法精炼)的一个可选择的实施方案，具体 的细节说明参见下文。
[125]图10用图表说明了用本发明的磷脂酶C作为脱胶辅助剂，具体的细节说 明参见下文。
[126]图11用图表描述了本发明的示例性核酸和多肽的选择的特征，如在下面 进一步详细描述地。
[127]图12图示了来自本发明的两个酶系统的数据，如在下面实施例3中所述。
[128]图13图示了本发明的示例性碱炼工艺，并示出了一个可选的实施方案， 包括应用本发明的酶C作为“碱炼助剂”(长混合碱炼(Long Mix Caustic Refining))， 如下面详细描述地。
[129]图14示出了本发明方法的另一种示例性变化，其中在工艺中使用了两个 离心步骤，如下面详细描述地。
[130]图15示出了本发明方法的另一种示例性变化，其中在工艺中使用了三个 离心步骤，如下面详细描述地。
[131]图16示出了本发明方法的另一种示例性变化，其使用酸处理并在脱胶步 骤之前具有离心步骤，如下面详细描述地。
[132]图17示出了体外消化试验的结果，其中本发明的磷脂酶C变体，如下面 实施例4中详细描述地。
[133]图18示出了使用本发明的示例性酶进行的分批发酵罐培养的结果，如下 面实施例5中详细描述地。
[134]图19示出了本发明的巴斯德毕赤酵母MutS菌株的氧吸收速率(＂OUR＂)比 较结果，如下面实施例5中详细描述地。
[135]图20示出了本发明的巴斯德毕赤酵母MutS菌株的甲醇消耗图结果，如下 面实施例5中详细描述地。
[136]图21示出了本发明SEQ ID NO：2的示例性PLC酶的重组形式的培养物的 “OUR”图，如下面实施例5中详细描述地。
[137]图22示出了SDS-PAGE的结果，显示了在培养物中产生的PLC蛋白的质 量，和与之相应的、本发明SEQ ID NO：2的示例性PLC酶的重组形式的培养物的 “OUR”图，如下面实施例5中详细描述地。
[138]图23示出了SDS-PAGE的结果，显示了活性PLC的数量，该活性PLC 位于本发明SEQ ID NO：2的示例性PLC酶的重组形式的培养物的胞内，如下面实 施例5中详细描述地。
[139]图24示出了与活性PLC相关的酵母细胞形态学变化的可视化图——本发 明SEQ ID NO：2的示例性PLC酶的重组形式，如下面实施例5中详细描述地。
[140]图25用概述了数据，显示了在95 h TFT(总发酵时间)，在毕赤酵母中， 使用本发明SEQ ID NO：2的示例性PLC酶进行的PLC生产性能的状态，如下面实 施例5中详细描述地。
[141]图26是表，概述了数据，这些数据来自对本发明的示例性zeocin-适应的 细胞菌落的表达筛选，如下面实施例5中详细描述地。
[142]图27示出了数据，这些数据显示，在含有本发明的示例性zeocin-适应的 细胞菌落的培养物中，PLC蛋白水平是较高的，如下面实施例5中详细描述地。
[143]图28示出了数据，这些数据显示了本发明的zeocin-适应的细胞菌落与对 照的生长比较，如下面实施例5中详细描述地。
[144]图29示出了加热试验的结果，显示了本发明SEQ ID NO：2的示例性酶的 热稳定性，图中指出了条件，如下面实施例5中详细描述地。
[145]图30示出了总结加热试验的NMR数据，证明了本发明SEQ ID NO：2的 示例性酶的热稳定性，如下面实施例6中详细描述地。
[146]图31、32和33示出了数据，这些数据证明了SEQ ID NO：2的热稳定性， 使用p-NPPC，条件为图中显示的条件，如下面实施例6中详细描述地。
[147]图34示出了数据，这些数据证明了SEQ ID NO：2的热稳定性，使用DSC 分析，如下面实施例6中详细描述地。
[148]不同图中的类似参考符号表明类似的元素。
发明祥述
[149]本发明提供了磷脂酶，例如，具有磷脂酶A、B、C和D、patatin、磷脂酸 磷脂酶(PAP)和/或脂酰水解酶(LAH)或等同活性的多肽，编码它们的多核苷酸，以 及制备和应用它们的方法。本发明提供了有效地切割油诸如植物油中的甘油磷酸 酯键，例如油籽磷脂，从而产生水可提取的磷酸化的碱和甘油二酯的酶。一方面， 本发明的磷脂酶具有脂酰水解酶(LAH)的活性。在可选择的方面，本发明的磷 脂酶可以切割磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌 醇(PI)、磷脂酸和/或鞘磷脂或它们的组合中的甘油磷酸酯键(glycerophosphate ester linkage)。例如，在一个方面，本发明的磷脂酶对一种或多种特定的底物具有特异 性，例如本发明的酶可以对PE和PC；PE和PI；PE和PS；PS和PE；PS和PI； PI和PE；PS、PI和PC；PE、PI和PC；或PE、PS、PI和PC具有特异性作用。
[150]本发明的磷脂酶(如，具有磷脂酶A、B、C和D、patatin、磷脂酸磷脂酶 (PAP)和/或脂酰水解酶(LAH)或等同活性的多肽)可以用于植物油的酶法脱胶，这 是因为磷酸部分可溶于水，并且容易去除。甘油二酯产物将仍存留在油中，从而 降低损失。本发明的PLCs可以用作在商业上的油脱胶诸如工艺中的 PLA1s和PLA2s的补充或者替代，在所述工艺中磷脂是由PLA1和 PLA2水解的。
[151]在一方面，本发明的磷脂酶在高温和/或低温下，或者在较宽的温度范围内， 具有活性，例如，它们可以在20℃到90℃，30℃到80℃，或者在40℃到70℃的 温度范围具有活性。本发明也提供在碱性pH或者酸性pH，例如低的水酸度具有 活性的本发明的磷脂酶。在可选择的方面，本发明的磷脂酶可以在酸性pH低至 pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5、pH4.0和pH3.5或更加酸性(即pH<3.5) 的条件下仍具有活性。在可选择的方面，本发明的磷脂酶可以在碱性pH高至 pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH9.5、pH10或碱性更大(即pH>10)的条件下具 有活性。一方面，本发明的磷脂酶在低水活度(低的水含量)条件下，在约40℃ 到约70℃、75℃或80℃或更高温度之间的温度下具有活性。
[152]本发明也提供了用于进一步修饰本发明的示范性磷脂酶以产生具有期望 特性的酶的方法。例如，由本发明方法产生的磷脂酶可以具有改变了的底物特异 性、底物结合特异性、底物切割型式、热稳定性、pH/活性曲线、pH/稳定性曲线 (如在较低pH值，例如pH<6或者pH<5，或者较高的pH值，如pH>9的情况下 稳定性提高)、对于氧化作用的稳定性、Ca2+依赖性、比活性和类似特性。本发 明提供对于任何感兴趣特性的改变。例如，这些改变可以产生与母本磷脂酶相比 具有改变的pH和温度活性曲线的变异体。
[153]在一方面，本发明的磷脂酶被用于各种植物油处理步骤中，如植物油提取 中，特别地，用在称为“油脱胶”的过程中去除“磷脂胶(phospholipid gums)”，如本 文所述。本发明提供了组合物(例如包含本发明的酶)和由各种来源生产植物油 的工艺，所述各种来源如米糠、大豆、油菜、花生、芝麻、向日葵和玉米。本发 明的磷脂酶可以在任何植物油加工步骤中被用于替代PLA，例如磷脂酶A2。
定义
[154]术语“磷脂酶”包括具有任何磷脂酶活性的酶，例如，切割油中，如植物油 中的甘油磷酸酯键(催化水解甘油磷酸酯键)。本发明的磷脂酶活性可以产生可 水提取的磷酸化的碱以及甘油二酯。本发明的磷脂酶活性也包括在高温、低温、 碱性pH和酸性pH条件下水解甘油磷酸酯键。术语“磷脂酶活性”也包括切割甘油 磷酸酯以产生可水提取的磷酸化的碱以及甘油二酯。术语“磷脂酶活性”也包括切割 磷脂中甘油和磷酸的酯键。术语“磷脂酶活性”也包括其它的活性，如结合并水解底 物的能力，底物如油，例如植物油，底物也包括植物和动物磷脂酰胆碱、磷脂酰 乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂酶活性可以包括磷脂酶C(PLC)活性；磷 脂酶A(PLA)活性，如磷脂酶A1或者磷脂酶A2活性；磷脂酶B(PLB)活性， 如磷脂酶B1或者磷脂酶B2活性，包括溶血磷脂酶(LPL)活性和/或溶血磷脂酶-转 酰基酶(LPTA)活性；磷脂酶D(PLD)活性，如磷脂酶D1或者磷脂酶D2活性； 和/或patatin活性或它们的任何组合。磷脂酶活性可以包括水解糖蛋白，如马铃薯 块茎中或者任何茄属植物(Solanum)如马铃薯(Solanum tuberosum.)中的糖蛋 白。磷脂酶活性可以包括patatin酶活性，如patatin酯酶活性(见，例如，Jimenez (2002)Biotechnol.Prog.18：635-640)。磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH) 活性。磷脂酶活性可以包括对一种或多种特定的底物具有特异性，例如本发明的 酶可以对PE和PC；PE和PI；PE和PS；PS和PE；PS和PI；PI和PE；PS、PI 和PC；PE、PI和PC；或PE、PS、PI和PC，或它们的任何组合具有特异性作用。
[155]在一个方面，本发明的磷脂酶可以具有多功能活性，例如一种或多种本文 中描述的酶活性的组合。例如，在一个方面，本发明的多肽具有酶活性，但是缺 少脂酶活性，或缺少影响中性油(甘油三酯)组分的任何酶活性。在特定的工艺中， 例如在脱胶工艺中使用这样的多肽可能是有利的，在脱胶工艺中，中性油组分不 受损害(减少、降解例如水解)是重要的。因此，在一个方面，本发明提供了脱 胶工艺，该工艺包括使用具有磷脂酶活性但是缺少脂酶活性的本发明多肽。
[156]在一个方面，本发明的PLC磷脂酶利用(例如催化水解)各种磷脂底物， 包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和/ 或磷脂酸或它们的组合。此外，这些酶对这些磷脂的溶血磷脂形式具有不同程度 的活性。在各个方面，本发明的PLC酶可以对磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺作为底 物显示出偏好性。
[157]在一个方面，本发明的磷脂酰肌醇PLC磷脂酶利用各种磷脂底物，包括磷 脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸或它们的组合。 此外，这些酶可以对溶血磷脂形式的这些磷脂具有不同程度的活性。在不同的方 面，本发明的磷脂酰肌醇PLC酶可以对磷脂酰肌醇作为底物显示出偏好性。
[158]在一个方面，本发明的patatin酶利用各种磷脂底物，包括磷脂酰胆碱、磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸或它们的组合。此外，这些酶 可以对溶血磷脂形式的这些磷脂具有不同程度的活性。在不同的方面，本发明的 patatin可以基于氨基序列相似性的保守性。在不同的方面，这些酶展示出多组不 同的生物化学特性，并可以进行PLA1、PLA2、PLC或PLD酶类的特征性反应。
[159]在一个方面，本发明的PLD磷脂酶利用各种磷脂底物，包括磷脂酰胆碱、 磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸或它们的组合。此外，这些 酶可以对溶血磷脂形式的这些磷脂具有不同程度的活性。在一个方面，这些酶可 用于进行转酯反应，以产生具有一定结构的磷脂。
[160]术语“抗体”包括源自、建模自(modeled after)或者实质上编码自一种或 多种免疫球蛋白基因或其片段的肽或者多肽，其能够特异地结合于抗原或者表位， 参见，例如Fundamental lmmunology，Third Edition，W.B.Paul，ed.，Raven Press，N.Y. (1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush(1992)J. Biochem.Biophys.Methods 25：85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即，“抗原结 合位点”(例如，保持了结合抗原能力的片段、子序列、互补决定区(CDRs)，包 括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2 片段，包括在铰链区通过二硫键连接两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和 CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段， (v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)； 以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也被包括于术语“抗体”中。
[161]在此应用的术语“阵列(array)”或者“微阵列(microarray)”或者“生物芯片 (biochip)”或者“芯片(chip)”是许多靶元素，每一个靶元素包括确定量的一个或者多 个多肽(包括抗体)或者固定于底物表面积的确定区域上的核酸，参见下面进一 步的具体讨论。
[162]正如在此所用地，术语“计算机”，“计算机程序”和“处理器”以它们最广的 含义使用，并整合所有这样的设备，如以下详细描述的。
[163]特定的多肽或者蛋白的“编码序列”或者“编码特定的多肽或者蛋白的序 列”，是指当置于合适的调控序列的控制下可以转录和翻译成多肽或者蛋白的核酸 序列。
[164]在此使用的术语“表达盒(expression cassette)”是指在宿主细胞中可以影 响结构基因表达(即，编码蛋白质，如本发明的磷脂酶的序列)的核苷酸序列， 所述宿主细胞与所述核苷酸序列相容。表达盒包括至少一个可以可操作地连接至 编码多肽的序列上的启动子；并且，可选择地，连接有其它的序列例如，转录终 止信号。也可以应用进行表达所必要的或有帮助的额外的因子，例如，增强子。 如在此所应用的“可操作地连接(Operably linked)”是指连接DNA序列上游的启 动子，这样该启动子能够介导该DNA序列的转录。因此，表达盒也包括质粒、表 达载体、重组病毒、任何形式的重组的“裸露DNA”载体，和类似物。“载体”包括 可以感染、转染、瞬间或者永久转导细胞的核酸。将被认识到，载体可以是裸露 的核酸，或者与蛋白或者脂类复合的核酸。载体可选择地包括病毒或者细菌的核 酸和/或蛋白，和/或膜(如，细胞膜，病毒的脂包膜，等等)。载体包括，但不限 于复制子(如，RNA复制子，细菌噬菌体)，DNA片段可以连接到其上，并被复 制。载体因此包括，但不限于是RNA，自主复制的环状或者线性的DNA或者RNA (如，质粒、病毒以及类似物，参见，如，美国专利No.5,217,879)，并且也包 括表达载体和非表达质粒。当重组微生物或者细胞培养物被描述容纳“表达载体” 时，其包括染色体外的环状和线性DNA，和已经整合进入宿主染色体的DNA。当 载体由宿主细胞维持时，该载体可以在细胞有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳 定地复制，或者整合入宿主基因组中。
[165]“质粒”的命名为在大写字母和/或数字之前和/或之后加上小写字母“p”。在 此使用的起始质粒(starting plasmid)可以通过商业渠道获得，通过公共渠道自由 获得，或者按照公开的程序从可利用的质粒构建得到。此外，与那些在此描述的 质粒等价的质粒是在本领域是已知的，并且对普通技术人员而言是显而易见的。
[166]术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA片段，包括，在编码区的前面和 后面的区域，如头部和尾部，启动子和增强子，以及适当情况下，单个编码片段 (外显子)之间的插入序列(内含子)，等等。
[167]如在此应用的短语“核酸”或者“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷 酸、或者是指它们中的任何之一的片段，是指基因组或者合成来源的DNA或者 RNA(如，mRNA、rRNA、tRNA、iRNA)，其可以是单链的或者双链的，并且 可以代表有义链或者无义链，是指肽核酸(PNA)，或者是指任何DNA样或者 RNA样的物质，天然的或者合成来源的，包括如，iRNA，核糖核蛋白(如双链iRNA， 如iRNPs)。该术语包括核酸，即，寡核苷酸，包括天然核苷酸的已知类似物。该 术语也包括具有合成骨架的核酸样结构，见，如，Mata(1997)Toxicol.Appl. Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstag (1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-156。
[168]在此应用的“氨基酸”或者“氨基酸序列”是指寡肽，肽，多肽，或者蛋白序 列，或者是指这些序列中的任何序列的片段、部分或亚基，并且是指天然产生的 或者合成的分子。
[169]在此应用的术语“多肽”和“蛋白”是指通过肽键或者修饰的肽键相互连接在 一起的氨基酸，即，肽等排体，可以含有除了20个基因编码的氨基酸外的修饰氨 基酸。术语“多肽”也指肽或者多肽片段，基序(motif)和类似物。该术语也包括 糖基化的多肽。本发明的肽或者多肽也包括所有“模拟”和“肽模拟”形式，如下面进 一步描述地。
[170]如在此所应用的，术语“分离的”是指从起始的环境(如，如果是天然发生 的，那么就是天然环境)中移取的物质。例如，存在于活动物中的天然发生的多 核苷酸或者多肽不是分离的，但是，如果该同样的多核苷酸或者多肽，与天然系 统中的一些或者所有的共存物分离，那么就是分离的。这样的多核苷酸可以是载 体的一部分和/或这样的多核苷酸或者多肽可以是一个组合物的一部分，并且仍然 是分离，这是因为这样的载体或者组合物不是天然环境的一部分。正如在此使用 的，分离的物质或者组合物也可以是“纯化”的组合物，即，它并不需要绝对的纯度； 相反，认为其是相对性的定义。从文库中得到的单个核酸可以经过常规纯化为具 有电泳均一性。可选择的方面，本发明提供从基因组DNA或者从文库中的其它序 列中或者其它的环境中纯化至少一个、两个、三个、四个、五个或者更多数量级 的核酸。
[171]正如在此应用的，术语“重组子”是邻接于“骨架”核酸的核酸，而在天然环 境下它们并不邻接。在一方面，核酸代表了核酸“骨架分子”群体中5％或者更多数 目的核酸插入物。本发明的“骨架分子”包括核酸，如表达载体、自主复制核酸、病 毒、整合性核酸，和用于维持或者操作感兴趣的核酸插入物的其他的载体或者核 酸。在一方面，富集的核酸代表了重组骨架分子群体中的15％、20％、30％、40 ％、50％、60％、70％、80％、90％或者更多数目的核酸插入物。“重组”多肽或者 蛋白是指由重组DNA技术产生的多肽或者蛋白，如，从用编码所需多肽或者蛋白 的外源DNA构建物转化的细胞产生。“合成的”多肽或者蛋白是那些通过化学合成 制备的多肽或者蛋白，如下面进一步描述地。
[172]如下面进一步讨论地，当在启动子处启动转录的RNA聚合酶将编码序列 转录成为mRNA时，启动子序列被“可操作地连接于”编码序列。
[173]“寡核苷酸”是指单链多脱氧核苷酸或者两个互补的多脱氧核苷酸链，它们 可以通过化学合成。这样合成寡核苷酸在5’没有磷酸，因此在激酶存在时，不通 过ATP加入磷酸的情况下，不能连接于另一个寡核苷酸。合成的寡核苷酸将连接 于没有脱磷酸化的片段。
[174]在两核酸或者多肽上下文中的短语“实质上相同(substantially identical)”， 是指当为了获得最大对应性(correspondence)而比较和比对时，具有至少50％、 60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％的核苷酸或者氨基 酸残基(序列)同一性的两个或者多个序列，所述最大对应性用任何已知的序列 比较算法测量，如以下详细讨论的，或者通过目测的方法测量。在可选择的方面， 本发明提供与本发明的示范性序列，如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8等等在 核酸或者多肽的至少大约100个残基、150个残基、200个残基、300个残基、400 个残基的区域内或者从约50个残基到全长之间的区域内，实质上相同的核酸和多 肽序列。本发明的核酸序列可以在多肽编码区域的整个长度上实质上相同。
[175]另外的，“实质上相同(substantially identical)”的氨基酸序列是与参考序 列差异一个或者多个保守性或者非保守性的氨基酸取代、缺失或者插入的序列， 特别地，当这样的取代发生在分子的非活性位点的位置上，只要多肽基本上保留 了它的功能特性。保守氨基酸的取代，例如，用一个氨基酸取代另一个同类的氨 基酸(如，将一个疏水氨基酸，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸置换 为另一个疏水氨基酸，或者将极性氨基酸置换为另一个极性氨基酸，如，将赖氨 酸置换为精氨酸，将谷氨酸置换为天冬氨酸或者，将谷酰胺置换为天冬酰胺)。 可以缺失一个或者多个氨基酸，例如，从磷脂酶多肽中缺失一个或者多个氨基酸， 从而对多肽结构进行修饰，而并不显著改变其生物活性。例如，可以去除对于磷 脂酶的生物活性并不需要的氨基或者羧基端氨基酸。可以通过很多的方法分析本 发明修饰的多肽序列的磷脂酶活性，包括将修饰的多肽序列与磷脂酶底物接触， 并且确定是否修饰的多肽减少了分析中的特异底物的量或者增加了功能性磷脂酶 与底物的酶促反应的生物产物的量，如下面进一步论述地。
[176]“杂交”是指通过碱基配对，核酸链与互补链结合的过程。杂交反应可能是 敏感的并且具有选择性，这样可以鉴定在样品中以低浓度存在的感兴趣的特定的 序列。合适的严格条件可以通过例如，预杂交和杂交溶液中的盐和甲酰胺浓度， 或者杂交温度来确定，并且本领域是熟知的。例如，严格性的增加可以通过降低 盐浓度，增加甲酰胺的浓度，或者提高杂交温度，改变杂交时间予以实现，如下 面所详细描述地。在可选择的方面，本发明的核酸通过它们可以在各种的严格条 件下(如，高，中，和低)杂交的能力来确定，如在此所阐明地。
[177]术语“变异体”是指在一个或者多个碱基对、密码子、内含子、外显子、或 者氨基酸残基(分别地)被修饰，但仍保持本发明的磷脂酶的生物活性的本发明 的多核苷酸或者多肽。变异体可以通过很多种方法产生，例如，易错PCR、重排、 寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体外诱变、盒式诱变、递归整体 诱变、指数整体诱变、定点诱变、基因重装配，GSSMTM和它们的组合。在此包括 了产生在一定的pH或温度下具有活性的磷脂酶，例如，不同与野生型磷脂酶的突 变体技术。
[178]术语“饱和诱变(saturation mutagenesis)”、基因位点饱和诱变TM(GSSMTM) 或者“GSSMTM”，包括应用简并的寡核苷酸引物将点突变引入多核苷酸中的方法， 如下的详细解释。
[179]术语“优化的定向进化系统(optimized directed evolution system)”或者“优 化的定向进化(optimized directed evolution)”包括对相关核酸序列，例如，相关 基因的片段重新进行装配的方法，并在下面进行了详细解释。
[180]术语“合成连接重装配(synthetic ligation reassembly)”或者“SLR”包括以非 随机的方式连接寡核苷酸片段的方法，并在下面进行了详细解释。
核酸的产生和操作
[181]本发明提供分离的或重组的核酸(例如示范性的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、 SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、 SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、 SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、 SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、 SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、 SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、 SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、 SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、 SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、 SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、 SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：157、 SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：173)，包括编码本发明 的多肽和磷脂酶的表达盒，如表达载体。本发明也包括应用本发明的核酸发现新 的磷脂酶序列的方法。也提供用于修饰本发明核酸的方法，例如，合成连接重装 配、优化的定向进化系统和/或饱和诱变。
[182]通过，如，克隆和表达cDNA文库，通过PCR扩增信使或者基因组DNA， 和类似方法，发明的核酸可以制备，合成和/或进行操作。在实践本发明的方法中， 通过操作模板核酸，可以修饰同源基因，正如在此所述的。本发明可以和本领域 已知的其它任何方法或者方案或者装置结合进行实践，这些方法或者方案或者装 置在科学和专利的文献中得到充分描述。
一般技术
[183]用于实践本发明的核酸，不管是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组 DNA、载体、病毒或者它们的杂合体，都可以自不同的来源分离，进行遗传工程 改造，扩增，和/或表达/重组产生。从这些核酸产生的重组多肽可以单独分离或者 克隆，并且检测所需的活性。可以应用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、 酵母、昆虫或者植物细胞表达系统。
[184]可选择地，这些核酸可以通过已知的化学合成技术在体外合成，如在如 Adams(1983)J.Am.Chem，Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res. 25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994) Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979) Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利4,458,066 中描述的。
[185]用于核酸操作的技术，如，亚克隆，探针标记(如，使用Klenow聚合酶 的随机引物标记，切口平移，扩增)，测序，杂交等等，这些方法在科学和专利 文献中已充分描述，参见，如，Sambrook，ed.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(2ND ED.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory， (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel，ed.John Wiley&Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMSTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed. Elsevier，N.Y.(1993)。
[186]获得和操作用于实践本发明方法的核酸另一有用方法是从基因组样品中 克隆，并且如果需要，筛选和再克隆从例如，基因组克隆或者cDNA克隆中分离 或者扩增的插入物。在发明方法中使用的核酸的来源包括包含于如，哺乳动物人 工染色体(MACs)中的基因组或者cDNA文库，见如，美国专利5,721,118， 6,025,155；人类人工染色体，见，如，Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335， 酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，见，如， Woon(1998)Genomics 50：306-316；P1衍生的载体(PACs)，见，如，Kern(1997) Biotechniques 23：120-124，粘粒、重组病毒、噬菌体或者质粒。
[187]在一方面，编码本发明多肽的核酸在适当的阶段与能够指导翻译的多肽或 者片段分泌的前导序列装配在一起。
[188]本发明提供融合蛋白和编码融合蛋白的核酸。本发明的多肽可以与异源的 肽或者多肽融合，如N-末端鉴定肽，其赋予了所需的特征，如增加的稳定性或者 简化的纯化方法。本发明的肽和多肽也可以以与一个或者多个连接其上的额外的 结构域形成融合蛋白的形式合成并表达，从而，如，产生更具免疫源性的肽，更 容易分离重组合成肽，鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞，等等。有利于检测 和纯化的结构域包括，如，允许在固定化金属上纯化的金属螯合肽，如，聚组氨 酸序列(polyhistidine tracks)和组氨酸-色氨酸模块(histidine-tryptophan modules)， 允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及在FLAGS延伸/亲和纯化 系统(FLAGS extension/affinity purification system，Immunex Corp，Seattle WA)中 使用的结构域。在纯化结构域和含有基序的肽或者多肽之间，包含可以切割的连 接序列如因子Xa或者肠激酶(lnvitrogen，San Diego CA)的接头序列，以便于纯 化。例如，表达载体可能包括连接于六个组氨酸残基的编码表位的核酸序列，然 后是硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(见，如，Williams(1995)Biochemistry 34： 1787-1797，Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12：404-414)。组氨酸残基有利于 检测和纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白的剩余物中纯化表位的方法。与 编码融合蛋白的载体相关的技术以及应用融合蛋白的技术，在科学和专利文献中 已充分描述，参见例如例如Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12：441-53。
转录和翻译控制序列
[189]本发明提供可操作地与表达(如，转录和翻译)控制序列如，启动子或者 增强子连接以指导或者调控RNA的合成/表达的本发明核酸(如，DNA)序列。 表达控制序列可以在表达载体中。示例性的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、 gpt、λ PR、PL和trp启动子。典型的真核启动子包括CMV即刻早期、HSV胸腺 嘧啶激酶、早期和晚期SV40，来自逆转录病毒的LTRs和鼠金属硫蛋白I。
[190]适于在细菌中表达多肽的启动子包括大肠杆菌lac或者trp启动子，lacI启 动子，lacZ启动子，T3启动子，T7启动子，gpt启动子，λ PR启动子，λ PL启 动子，来自编码糖酵解的酶如，3-磷酸甘油激酶(PGK)的操纵子的启动子，和酸 性磷酸酶启动子。真核启动子包括CMV即刻早期启动子，HSV胸腺嘧啶激酶启 动子，热休克启动子，早期和晚期SV40启动子，来自逆转录病毒的LTRs，和鼠 金属硫蛋白I启动子。也可以应用已知的在原核或者真核细胞或者其病毒中控制基 因表达的其它启动子。
表达载体和克隆载体
[191]本发明提供包括发明的核酸，如，编码发明的磷脂酶的序列的表达载体和 克隆载体。本发明的表达载体和克隆载体可以包括病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、 质粒、噬菌粒、粘粒、fosmids、细菌人工染色体、病毒DNA(如，牛痘、腺病毒、 禽类痘病毒、伪狂犬病病毒和SV40衍生物)，以P1为基础的人工染色体、酵母 质粒、酵母人工染色体以及对感兴趣的特定宿主(如杆菌属(Bacillus)，曲霉属 (Aspergillus)和酵母)特异的任何其它载体。本发明的载体可以包括染色体的，非 染色体的和合成的DNA序列。很多合适的载体为本领域技术熟练人员所了解，并 且可以买到。典型的载体包括：细菌的：pQE载体(Qiagen)、pBluescript质粒、 pNH载体、λ-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T (Pharmacia)；真核的：PXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、 pSVLSV40(Pharmacia)。然而，也可以应用任何其它的质粒或其他的载体，只要 它们可以在宿主中复制并且有活力。低拷贝数或者高拷贝数的载体可以应用于本 发明。
[192]表达载体可以包括启动子，用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止 子。载体也包括用于扩增表达的合适序列。哺乳动物表达载体可以包括复制起始 位点，任何必要的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转 录终止序列，和5′侧非转录序列。在一些方面，源于SV40的剪接和多聚腺苷酸化 位点的DNA序列可以用于提供所需的非-转录遗传元件。
[193]在一个方面，表达载体含有一个或者多个选择性标记基因，使得可以选择 含有该载体的宿主细胞。这些选择标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因或对赋予 真核细胞培养物对新霉素有抗性的基因，大肠杆菌中赋予抗四环素或者抗氨苄青 霉素的基因，以及酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1基因。启动子区域可以使用氯 霉素转移酶(CAT)载体或者具有选择标记的其它载体，从任何所需基因中选择。 [194]在真核细胞中表达多肽或者其片段的载体也包含增加表达水平的增强子。 增强子是DNA的顺式作用元件，一般长度从大约10到大约300bp，其作用于启动 子，增强启动子的转录。例子包括在复制起点的旁侧100到270bp的SV40增强子， 巨细胞病毒的早期启动子增强子，在复制起点的旁侧的多瘤增强子，和腺病毒增 强子。
[195]DNA序列可以以各种的程序插入到载体中。一般而言，用适合的限制性 内切酶消化插入片段和载体之后，将DNA序列连接于载体的期望位置上。各种克 隆技术是本领域已知的，例如，如在Ausubel和Sambrook中所描述的技术。这样 的程序和其它程序被认为是在本领域的技术人员的知识范围之内。
[196]载体可以是质粒，病毒颗粒或者噬菌体的形式。其它的载体包括染色体的， 非染色体的和合成的DNA序列，SV40的衍生物；细菌质粒，噬菌体DNA，杆状 病毒，酵母质粒，源于质粒和噬菌体DNA组合的载体，病毒DNA如牛痘，腺病 毒，禽类痘病毒，和伪狂犬病病毒。例如，Sambrook描述了原核和真核宿主中使 用的多种克隆和表达载体。
[197]可以应用的特定细菌载体包括可以从商业渠道获得的质粒，包括下述为人 熟知的克隆载体的遗传元件：pBR322(ATCC 37017)、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)pQE70、 pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174、pBlueScript II KS、pNH8A、pNH16a、 pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK223-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。特别的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、 pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而， 也可以应用任何其它的载体，只要它在宿主细胞可以复制和繁殖。
宿主细胞和转化的细胞
[198]本发明也提供包括发明核酸序列，如，编码本发明磷脂酶的序列，本发明 的载体的转化的细胞。宿主细胞可以是本领域技术熟练人员所熟悉的任何宿主细 胞，包括原核细胞，真核细胞，如，细菌细胞，真菌细胞，酵母细胞，哺乳动物 细胞，昆虫细胞，或者植物细胞。本发明的酶可以在任何宿主细胞中表达，例如 任何细菌细胞、任何酵母细胞，例如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母或粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。示范性的细菌细胞包括大肠杆菌(E.coli)、乳 酸乳球菌(Lactococcus lactis)、链霉菌属(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和杆菌属(Bacillus)、链霉 菌属和葡萄球菌属(staphylococcus)中的任何菌株。示例性的昆虫细胞包括果蝇S2 (Drosophila S2)和草地夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)。示例性的动物细胞包括CHO、 COS或者黑色素瘤(Bowes melanoma)或者任何小鼠或者人类细胞系。适当的宿 主的选择是在本领域技术人员的能力之内。
[199]可以应用任何不同的技术将载体引入到宿主细胞，这些技术包括转化、转 染、转导、病毒感染、基因枪或者Ti-介导的基因转移。特定的方法包括磷酸钙转 染、DEAE-Dextran介导的转染、脂质体转染或者电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.， Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
[200]适当地，工程化的宿主细胞可以在传统营养培养基中培养，该培养基经修 改以适于激活启动子，选择转化子或者扩增发明的基因。随后转化适当的宿主株， 并且该宿主株生长至适当的细胞密度，通过适当的方法(如，温度变换或者化学 诱导)诱导所选择的启动子，细胞可以被额外培养一段时间，以使得它们产生所 需的多肽或者其片段。
[201]细胞通过离心收集，通过物理或者化学的方法破碎，得到的粗提取物保留 用于进一步的纯化。用于表达蛋白的微生物细胞可以通过任何方便的方法破碎， 包括冷冻-解冻循环、超声波破碎、机械破碎，或者应用细胞裂解剂。这样的方法 为本领域技术人员所熟悉。表达的多肽或者片段可以通过下述方法从重组细胞培 养物中回收纯化，这些方法包括硫酸铵或者乙醇沉淀、酸法抽提、阴离子或阳离 子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析 和植物凝集素层析。如果必要的话，可以在实现多肽的构象化作用中应用蛋白重 新折叠步骤。如果需要，可以应用高效液相色谱(HPLC)进行最终的纯化步骤。
[202]各种哺乳动物培养系统可以用来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子 包括猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和能够从相容性载体中表达蛋白的其它的细胞 系，如C127、3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。
[203]宿主细胞中的构建物可以以传统的方式用来产生重组序列编码的基因产 物。取决于在重组产生程序中采用的宿主，含有载体的宿主细胞产生的多肽可以 是糖基化的或者是非糖基化的。本发明的多肽可以包括，也可以不包括起始的甲 硫氨酸氨基酸残基。
[204]无细胞的翻译系统可能也用于产生本发明的多肽。无细胞翻译系统可以应 用从含有可操作性地连接到编码多肽或其片段的核酸的启动子的DNA构建物转录 得到的mRNA。在一些方面，DNA构建物可以，在进行体外转录反应前，先线性 化。然后转录的mRNA与合适的无细胞翻译提取物如，兔网织红细胞提取物一起 温育，来产生所需的多肽或者其片段。
[205]表达载体可以含有一个或者多个选择性标记基因，提供用于选择转化的宿 主细胞的表型特征，如，二氢叶酸还原酶和用于真核细胞培养物的新霉素抗性， 或者如大肠杆菌中的四环素或者氨苄青霉素抗性。
[206]示范性磷脂酶C酶(具有SEQ ID NO：2中阐明的序列)已在各种宿主系统 中以活性形式被过量表达，这些系统包括革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌，革兰 氏阳性细菌，诸如任何杆菌属菌株(例如枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus))、酵母宿主细胞(包括例如巴斯德毕赤酵母、酵母属某种(Saccharomyces sp.)，诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)和粟酒裂殖酵母)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或哺乳动物、真菌、植物或昆虫细胞。在每一宿主系统中，由各种构建物 表达活性酶。这些核酸表达构建物可以包含编码全长开放阅读框(由信号序列、 前序列和成熟蛋白编码序列组成)的核苷酸，或它们可以包含这些遗传元件的亚 组，单独或者与异源遗传元件组合，其充当信号序列和/或成熟开放阅读框的前序 列。这些系统中的每一个可以充当表达PLC的商用生产性宿主，以用于之前描述 的酶法油脱胶工艺。
核酸的扩增
[207]在实践本发明时，编码本发明多肽的核酸，或者修饰的核酸可以例如通过 扩增被复制。本发明提供用于扩增编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的扩增引物 序列对。在一方面，引物对能够扩增本发明的核酸序列，如，包括示范性的SEQ ID NO：1，或者其子序列；如SEQ ID NO：3所阐明的序列，或者其子序列；如SEQ ID NO：5所阐明的序列，或者其子序列；如SEQ ID NO：7所阐明的序列，或者其子序 列，等等。本领域技术人员可以设计用于这些序列的任何部分或全长的扩增引物 序列对。
[208]本发明提供用于扩增编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的扩增引物序列 对，其中引物对可以扩增包括本发明序列或者其片段或子序列的核酸。扩增引物 序列对的其中一个或每一个成员可以包括含有该序列的至少大约10到50个连续 碱基的寡核苷酸，或者包括含有该序列的大约12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24或者25个连续碱基的寡核苷酸。
[209]本发明提供扩增引物对，其中引物对包括具有在本发明核酸的大约前(5′ 端)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或者25个残基中阐 明的序列的第一成员，和具有在第一成员的互补链的大约前(5′)12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24或者25个残基中阐明的序列的第二成员。 本发明提供通过扩增产生的磷脂酶，如应用本发明的扩增引物对进行聚合酶链式 反应(PCR)。本发明提供使用本发明的扩增引物对，通过扩增，例如，聚合酶链 式反应(PCR)制备磷脂酶的方法。在一方面，扩增引物对从文库，例如，基因文 库，如环境文库中扩增核酸。
[210]扩增反应也可以用于定量样品中的核酸(如在细胞样品中的信息的量)， 标记核酸(如，用于阵列或者印迹)，检测核酸，或者定量样品中特异核酸的量。 在发明的一个方面，扩增分离自细胞或者DNA文库的信息。技术人员可以选择和 设计合适的寡核苷酸扩增引物。扩增的方法是本领域所熟知的，并且包括，如， 聚合酶链式反应，PCR(见，如，PCR PROTOCOLS，A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS，ed.Innis，Academic Press，N.Y.(1990)和PCR STRATEGIES (1995)，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.，连接酶链式反应(LCR)(见，如， Wu(1989)Genomics4：560，Landegren(1988)Science 241：1077；Barringer(1990) Gene 89：117)；转录扩增(见，如，Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)， 和自支持序列复制(见如，Guatelli(1990)Proc.Natl，Asad.Sci.USA 87：1874)； Qβ复制酶扩增(见，如，Simth(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)；自动 的Qβ复制酶扩增分析(见，如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10：257-271)和其 它RNA聚合酶介导的技术(如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；也见， 例如，Berger(1987)Methods Enzymol.152：307-316；Sambrook；Ausubel；美国 专利4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)Biotechnology 13：563-564。
确定序列同一性的程度
[211]本发明提供包括与本发明的示例性核酸(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、 SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、 SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、 SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、 SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、 SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、 SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、 SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、 SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、 SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、 SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、 SEQ IDNO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：157、 SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：173，和编码SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ IDNO：112、 SEQ ID NO：114、SEQ IDNO：116、SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、 SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、 SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、 SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172或SEQ ID NO：174的核酸)在至少大 约50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、 1350、1400、1450、1500、1550或者更多个残基的范围内具有至少大约50％、51％、 52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、 65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、 78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更多的或者完全的(100 ％)序列同一性的序列的分离的或者重组的核酸。序列同一性(同源性)的程度 可以应用任何计算机程序和相关参数来确定，包括那些在本文所描述的，如用默 认参数的BLAST 2.2.2.或者FASTA 3.0t78版。在可选择的实施方案中，序列同一 性可以是在核酸或者多肽的至少大约5、10、20、30、40、50、100、150、200、 250、300、350、400个连续残基，或者全长的范围内。序列同一性(同源性)的 程度可以应用任何计算机程序和相关联的参数来确定，包括那些在本文所说明的， 如使用默认参数的BLAST 2.2.2.或者FASTA 3.0t78版。
[212]图11用图表描述了本发明的示例性核酸和多肽的选择的特征，包括示例 性序列与公共数据库的序列同一性比较。图11中描述的所有序列已针对两组数据 库进行了BLAST搜索(如在下面详细描述的)。第一数据库获自NCBI(美国国家生 物技术信息中心)。对这些数据库进行搜索所获得的所有结果参见名称为“NR描述 (NR Description)”、“NR登记码(NR Accession Code)”、“NR E值(NR Evalue)”或“NR 生物(NR Organism)”的各栏。“NR”指由NCBI维护的非冗余(Non-Redundant)核苷酸 数据库。该数据库是GenBank、GenBank更新和EMBL更新的综合。栏“NR描述 (NR Description)”中的条目指任何给定的NCBI记录中的描述行(definition line)， 其包括了对序列的描述，诸如来源生物、基因名称/蛋白质名称，或对序列的一些 功能描述。“NR登记码(NR Accession Code)”一栏中的条目指给予序列记录的独特 标识符(identifier)。“NRE值(NR Evalue)”一栏中的条目指期望值(E值)，其代表 了这样的可能性：同在询问序列(query sequence)(本发明的序列)与数据库序列之间 发现的比对分值一样良好的比对分值，发现于在随机序列之间相同的数量的比较 中的概率，如在当前的BLAST搜索中所进行的。“NR生物(NR Organism)”一栏 中的条目指被鉴定为关系最密切的BLAST命中(hit)的序列的来源生物。第二组数 据库统称为GeneseqTM数据库，其可从Thomson Derwent(Philadelphia，PA)获得。 对该数据库所作搜索的所有结果参见名称为“Geneseq蛋白质描述(Geneseq Protein Description)”、“Geneseq蛋白质登记码(Geneseq Protein Accession Code)”、“Geneseq 蛋白质E值(Geneseq Protein Evalue)”、“Geneseq DNA描述(Geneseq DNA Description)”、“Geneseq DNA登记码(Geneseq DNA Accession Code)”、“Geneseq DNAE值(Geneseq DNA Evalue)”各栏中。这些栏中发现的信息与上述NR各栏中 发现的信息类似，除了它来自对GeneseqTM数据库而不是对NCBI数据库进行的 BLAST搜索。此外，该表包括“预测的EC编号(Predicted EC No.)”一栏。EC编号 是根据标准化的酶命名法的方案赋予一类酶的编号，该命名法是由国际生物化学 和分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会的酶部(Enzyme Commission of the Nomenclature Committee of International Union of Biochemistry and Molecular Biology)开发的。在“预测的EC编号”栏中的结果是由对Kegg(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库的BLAST搜索结果来确定的。如果最高BLAST匹 配(top BLAST match)的E值等于或小于e-6，那么赋予该最高匹配的EC编号进入 表中。最高命中(top hit)的EC编号用作向导，用于指出本发明序列的EC编号可能 是什么。“询问DNA长度(Query DNA Length)”和“询问蛋白质长度(Query Protein Length)”这两栏分别指本发明的序列中核苷酸的数目或氨基酸的数目，本发明的序 列被用于对NCBI或Geneseq数据库进行搜索或查询。“Geneseq或NR DNA长度 (Geneseq or NR DNA Length)”、“Geneseq或NR蛋白质长度(Geneseq or NR Protein Length)”这两栏分别指从BLAST搜索获得的最高匹配的序列中的核苷酸的数目或 氨基酸的数目。这些栏中给出的结果是来自返回(return)了较低的E值的搜索， 它们或者来自NCBI数据库或者来自Geneseq数据库。“Geneseq或NR ％ID蛋白 质(Geneseq or NR ％ID Protein)”和“Geneseq或NR ％ID DNA(Geneseq or NR ％ID DNA)”指本发明序列与最高BLAST匹配的序列之间的序列同一性百分比。这些栏 中给出的结果是来自返回(return)了较低的E值的搜索，它们或者来自NCBI数 据库或者来自Geneseq数据库。
[213]同源性序列也包括RNA序列，其中尿嘧啶替代了在核酸序列中的胸腺嘧 啶。同源序列可以应用在此描述的任何程序得到或者可以由校正测序错误得到。 应该理解到的是，在此所列的核酸序列可以以传统的单字符格式来表示(见，如， Stryer，Lubert.Biochemistry 3rd Ed.，W.H.Freeman & Co.，New York)或者以记录 序列中的核苷酸的身份的任何其他格式来表示。
[214]在本发明的这一方面，可以使用在此指明的各种序列比较程序。蛋白和/ 或核酸序列同一性(同源性)可以应用本领域已知的任何序列比较算法和程序评 估。这样的算法和程序包括，但不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、 和CLUSTALW(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448， 1988；Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Thompson et al.，Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680，1994；Higgins et al.，Methods Enzymol.266：383-402， 1996；Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Altschul et al.，Nature Genetics 3：266-272，1993)。
[215]同源性或者同一性可以应用序列分析软件来测定(如，遗传学计算机组的 序列分析软件包，Uinversity of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)。这样的软件通过对各种缺失、替换和其它修饰进 行同源性水平赋值来匹配相似的序列。在两个或者多个核酸或者多肽序列的情况 下，术语“同源性”和“同一性”是指两个或者多个序列或者子序列，当在比较窗口或 者指定区域中应用任何数量的序列比较算法或者手动比对和目测来测定，通过比 较和比对以便获得最大的一致性时，它们是相同的或者具有特定百分比的相同氨 基酸残基或者核苷酸。对于序列比较，一个序列可以作为参照序列(示范性序列 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，等等)与待测序列进行比较。当应用序 列比较算法，待测序列和参照序列被输入到计算机中，指定子序列坐标，如果必 要，指定序列算法程序参数。可以应用默认程序参数，或者指定选择性参数。依 据程序参数，序列比较算法计算待测序列和参照序列的序列同一性百分比。
[216]在此应用的“比较窗口(comparison window)”，包括涉及任一数目的连续 残基的片段。例如，在发明可选择的方面，当两个序列优化比对后，将范围从20 到本发明的示范性序列的全长的连续残基，与相同数目的连续位置的参照序列进 行比较，所述示范性序列例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8等等。如果参 照序列与发明的示范性序列例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8等具有必要 的序列同一性，如，50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、 59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％，或者更多的序列同一性，那么该序列是属于本 发明的范围。在可选择的实施方案中，当两个序列优化地比对后，将范围从大约 20到600、大约50到200、和大约100到150的序列，与同样数目的连续位置的 参照序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域所熟知的。用于比较的优 化序列比对可以用下述方法实施，例如，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482， 1981的局部同源性算法、Needleman & Wunsch，J.Mo l.Biol.48：443，1970的同源比 对算法、Person & Lipman，Proc，Nat′1.Acad.Sci.USA 85：2444，1988的相似性搜索 法、这些算法的计算机化执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，于Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison， WI)，或者通过手动比对和目测完成。用于确定同源性或者同一性的其它算法包括， 例如，除了BLAST程序外(在美国国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool))、ALIGN、AMAS(多比对的序列分析 (Analysis of Multiply Aligned Sequences))、AMPS(蛋白多序列比对(Protein Multiple Sequence Alignment))、ASSET(比对片段的统计评估工具(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool))、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(生物序列比较 分析节点(Biological Sequence Comparative Analysis Node))、BLIMPS(BLocks IMProved Searcher)、FASTA，Intervals & Points，BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman算法、 DARWIN、Las Vegas算法、FNAT(强迫核苷酸比对工具(Forced Nucleotide Alignment Tool))、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky 序列分析包)、GAP(通用比对程序(Global Alignment Program))、GENAL、 GIBBS、GenQuest、ISSC(灵敏性序列比较(Sensitive Sequence Comparison))、 LALIGN(局部序列比对(Local Sequence Alignment))、LCP(局部含量程序(Local Content Program))、MACAW(多比对构建和分析工作台(Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench))、MAP(多比对程序(Multiple Alignment Program))、MBLKP、MBLKN、PIMA(模式诱导的多序列比对(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment))、SAGA(遗传算法进行的序列比对(Sequence Alignment by Genetic Algorithm))和WHAT-IF。这样的比对程序也可以用于筛选基因组数据 库，鉴定具有实质上相同的序列的多核苷酸序列。目前已经有很多基因组数据库 可用，例如，人类基因组的实质部分可以作为人类基因组测序计划(Gibbs，1995) 的一部分。几个基因组已经测序完成，如，生殖道支原体(M.genitalium)(Fraser et al.，1995)，甲烷球菌(M.jannaschii)(Bult et al.，1996)，流感嗜血菌(H. influenzae)(Fleischmann et al.，1995)，大肠杆菌(Blattner et al.，1997)，和酵 母(S.cerevisiae)(Mewes et al.，1997)，和果蝇(D.melanogaster)(Adams et al.，2000)。模式生物的基因组测序中已经取得了显著的进展，如小鼠，线虫(C. elegans)，和拟南芥(Arabadopsis sp.)。含有具有某些功能性信息注解的基因组 信息的数据库由不同的组织保持，并且可以通过因特网进行访问。
[217]BLAST、BLAST 2.0和BLAST 2.2.2算法也用于实践发明。这些算法在， 如，Altschul(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；Altschul(1990)J.Mol.Biol. 215：403-410中有描述。进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息 中心(the National Center for Biotechnology Information)公开得到。这一算法包括 首先通过鉴别待询序列(query sequence)中长度为W的短的字串来确定高分序列 对(high scoring sequence pairs，HSPs)，所述高分序列对在与数据库序列中同样 长度的字串联配时，匹配或者满足某个正值的阈值T。T是指邻近字串 (neighborhood word)的分数阈值(Altschul等，如上)。这些初始的邻近字串被 用来启动搜索以发现包含有它们的更长的HSPs。所述字串沿着每一个序列向两个 方向延伸，只要累积的联配分数在增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹 配残基的奖励分数；总是大于0)来计算累积分数；对于氨基酸序列，使用记分矩 阵来计算累计分数。出现下面情况时，字串在各个方向上的延伸便停止：累积的 联配分数由达到的最大值下降了数量X；由于一个或者多个记分为负的残基联配 的累积，累积分数达到0或者0以下；或者延伸到了任一序列的末端。BLAST算 法的参数W、T和X决定了联配的灵敏度和速率。BLASTN程序(对于核苷酸序 列)默认的是：字串长度(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，对两条 链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认：字串长度为3，期望值(E) 为10，BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89：10915)联配(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，对两条链 进行比较。BLAST算法也进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如， Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873)。由BLAST算法提 供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sum probability，P(N))，其表示两 个核苷酸或者氨基酸序列间的匹配将偶然发生的概率。例如，在受测核酸和参考 核酸的比较中，如果最小合计概率小于大约0.2，更优选地小于0.01，最优选地小 于大约0.001，就认为该核酸与参考序列相似。一方面，应用基本局部对比搜索工 具(“BLAST”)来评价蛋白和核酸序列同源性。例如，五个特定的BLAST程序可 以用来进行以下的任务：(1)BLASTP和BLAST3把氨基酸待询序列与蛋白质序 列数据库进行比较；(2)BLASTN把核苷酸待询序列与核苷酸序列数据库进行比 较；(3)BLASTX把待询核苷酸序列(两条链)的六个阅读框架的概念上的翻译 产物与蛋白序列数据库进行比较；(4)TBLASTN把待询蛋白序列与核苷酸序列 数据库的所有六个阅读框架(两条链)的翻译结果进行比较；(5)TBLASTX把 核苷酸待询序列的六个框架的翻译结果与核苷酸序列数据库的六个框架的翻译结 果进行比较。BLAST程序通过确定相似片段来确定同源性序列，所述相似片段在 此是指在待查询的氨基酸或核酸序列与受测序列之间的“高分片段对(high-scoring segment pairs)”，该受测序列优选地从蛋白或者核酸序列数据库得到。高分片段 对优选地利用记分矩阵来鉴定(即，联配)，很多的记分矩阵在本领域是已知的。 优选地，应用的记分矩阵为BLOSUM62矩阵(Gonnet等，Science 256：1443-1445， 1992；Henikoff和Henikoff，Proteins 17：49-61，1993)。较少不优选地，也可以 应用PAM或者PAM250矩阵(参见如，Schwartz和Dayhoff，eds.，1978，Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of protein Sequence and Structure，Washingion： National Biomedical Research Foundation)。
[218]本发明的一方面，为了确定是否核酸具有发明范围内的必需的序列同一 性，应用NCBI BLAST 2.2.2程序，默认值的选择是blastp。在BLAST 2.2.2程序 中，有大约38个设置选择。在发明的该示范性方面，除了默认的过滤设置外，应 用所有的默认值(即除了过滤设置为关闭(OFF)外，所有的参数设定为默认值)， 在该位置上应用“-F F”设置，其使得不能进行过滤。由于短的序列长度的缘故，默 认过滤的使用经常导致与Karlin-Altschul犯规。
[219]如上所述，用于本发明的该示范性方面并被用来测定图11中值的默认值 包括：
“低复杂性过滤器(Filter for low complexity)：开启(ON)
>字长：3
>矩阵：Blosum62
>缺口成本：存在值：11
>延伸：1”
其它的默认值设置为：低复杂性过滤器关闭(off)，蛋白质字长为3， BLOSUM62矩阵，缺口存在罚值-11，并且缺口延伸罚值—1。
[220]示范性的NCBI BLAST 2.2.2程序设置在下面的实施例1中阐明。注意， “-W”选项默认值为0。这是指，如果没有设置，对于蛋白，字长默认值为3，对于 核苷酸，字长默认值为11。
计算机系统和计算机程序产品
[221]为了确定和鉴定序列同一性、结构同源性、基序等等，本发明的多肽或核 酸序列可以在计算机可以读取和访问的任何介质上储存，记录和操作。相应地， 本发明提供计算机，计算机系统，计算机可读介质，计算机程序产品和类似物， 在其上记录和储存有本发明的核酸和多肽序列，例如，本发明的示例性序列，如， SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，等。正如在此使用的，词语“记录”和“存储” 是指将信息存储到计算机介质中的过程。技术人员很容易地采用任何已知的方法 将信息记录到计算机可读介质上，从而产生包括发明的一个或者多个核酸和/或多 肽序列的产品。
[222]本发明的另一方面是其上已记录有发明的至少一个核酸和/或多肽序列的 计算机可读介质。计算机可读介质包括磁性可读介质、光学可读介质、电子可读 介质和磁性/光学介质、闪存。例如，计算机可读介质可以是硬盘、软盘、磁带、 闪存、CD-ROM、数码多功能光盘(DVD)、随机存储器(RAM)、或只读存储器 (ROM)或本领域技术人员知道的任何类型的介质。
[223]本发明的方面包括系统(如，以因特网为基础的系统)，特别地计算机系 统，其存储和操作在此描述的序列和序列信息。计算机系统100的一个例子描述 在图1的方块图中。正如在此所使用的，“计算机系统”是指用于分析本发明的核苷 酸和多肽序列的硬件组件、软件组件以及数据存储组件。计算机系统100可以包 括用于序列数据处理、访问和操作的处理器。处理器105可以是任何已知类型的 中央处理器如，例如，Intel公司的奔腾III处理器或者Sun，Motorola，Compaq、 AMD或者International Business Machines(IBM)类似的处理器。计算机系统100 是一种通用系统，其包括处理器105和用于存储数据的一个或者多个内部数据存 储组件110，和一个或者多个用于检索存储于数据存储装置的数据的数据检索装 置。本领域技术人员可以很容易地知道，任何一个目前可得到的计算机系统是合 适的。
[224]在一方面，计算机系统100包括连接于总线(bus)的处理器105，该总线 连接于主存储器115(优选地，作为RAW执行)和一个或者更多的内部数据存储 装置110，如硬盘驱动器和/或其上存储有数据的其它计算机可读介质。计算机系 统100可以进一步包括一个或者多个用于读取存储于内部数据存储装置110上的 数据的数据检索装置118。
[225]数据检索装置118可以为，例如，软盘驱动器、光盘驱动器、磁带驱动器， 或者可以(如通过因特网)连接于远端数据存储系统的调制解调器等等。在一些 实施方案中，内部的数据存储装置110是可移动的计算机可读介质，例如含有控 制逻辑和/或在其中记录有数据的软盘、光盘、磁带等。有利的是，计算机系统100 可以包括或运行适当的软件程序，从插入到数据检索装置中的数据存储部分读取 控制逻辑和/或数据。
[226]计算机系统100包括用于给计算机应用者显示输出的结果的显示器120。 应当注意到，计算机系统100可以在网络中或者宽域网中与其它的计算机系统 125a-c相联，提供集中化的计算机系统100访问。访问和处理本发明的核苷酸或 者氨基酸序列的软件可以在执行过程中驻留在主存储器115中。
[227]在一些方面，计算机系统100可以进一步包括比较发明的核酸序列的序列 比较算法。算法和序列可以储存在计算机可读的介质中。“序列比较算法”是指一个 或多个程序，其可在计算机系统100上(本地或远程)执行以比较核苷酸序列和 数据储存装置中存储的其它的核苷酸序列和/或化合物。例如，序列比较算法可将 储存在计算机可读介质上的示范性序列，例如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID.NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SBQ ID NO：8 等的核苷酸序列与储存在计算机可读介质上的参考序列比较，以鉴定同源性或结 构基序。
[228]以上算法应用的参数可以依据所研究的序列长度和同源性水平而加以调 整。在一些方面，在使用者没有给出指令的情况下，算法使用的参数可以应用默 认参数。图2是说明过程200的一个方面的流程图，这个处理过程是为了确定新 序列和数据库中的序列间的同源性水平，把新的核苷酸或者蛋白序列与数据库中 的序列加以比较。含有序列的数据库可以是存储于计算机系统100的私人数据库， 或者公共的数据库，如通过因特网可以访问到的GENBANK。过程200开始于起 始状态201，然后移至状态202，其中待比较的新序列存储在计算机系统100的存 储器上。如上讨论，存储器可以是任何形式的存储器，包括RAM或者内部存储设 备。
[229]过程200然后移至状态204，其中序列数据库被打开以用于分析和比较。 然后，过程200移至状态206，其中存储在数据库的第一个序列读取到计算机的存 储器中。然后在状态210中进行比较，确定第一序列是否与第二序列相同。重要 的是，注意到这一步骤并不限于在所述新序列和数据库中的第一序列间进行准确 的比较。本领域技术人员熟知比较两个核苷酸或者蛋白序列的方法，尽管它们并 不完全相同。例如，为了提高两个待测序列间的同源性水平，可以在一个序列中 引入空位。在比较过程中控制是否往序列中引入空位或者其它特征的参数一般由 计算机系统的使用者输入。
[230]一旦在状态210下进行两个序列的比较，在决定状态210下作出两个序列 是否相同的决定。当然，术语“相同”并不限于绝对相同的序列。在过程200中，在 使用者输入的同源性参数范围内的序列将标记为“相同”。如果决定了两个序列是相 同的，过程200移至状态214，其中给使用者显示了来自数据库的所述序列的名称。 这一状态可以告诉使用者具有被显示的名称的序列满足输入的同源性限制。一旦 被存储的序列的名称显示给使用者，过程200移至决定状态218，其中确定在数据 库中是否存在更多的序列。如果在数据库中没有更多的序列存在，那么过程200 终止于结束状态220。然而，如果在数据库中存在更多的序列，那么过程200移至 状态224，其中指示器移至数据库的下一个序列以便可以与所述的新序列比较。以 这种方式，所述的新序列与数据库中的每一个序列进行联配和比较。
[231]应当注意，如果在决定状态212作出了决定，序列没有同源性，那么过程 200将立即移至决定状态218，以确定在数据库中是否有任何其它的序列用于比较。 同样地，发明的一方面是包括处理器，其上储存有本发明的核酸序列的数据存储 装置以及用于进行比较的序列比较器的计算机系统。序列比较器可以指示待比较 序列之间的同源性水平或者鉴定结构基序，或者可以确定与这些核酸代码和多肽 代码相比较的序列中的结构基序。
[232]图3是说明在计算机中确定两个序列是否具有同源性的过程250的一个实 施方案的流程图。过程250开始于起始状态252，然后移至状态254，其中待比较 的第一序列被存储于存储器中。待比较的第二序列然后在状态256被存储于存储 器中。过程250然后移至状态260，其中读取第一序列的第一个字符，然后到状态 262，其中读取第二序列的第一个字符。应当理解，如果序列是核苷酸序列，那么 所述字符一般将是A、T、C、G或者U。如果序列是蛋白质序列，那么它可以是 单字母的氨基酸代码，以便第一序列和第二序列可以很容易地进行比较。然后在 决定状态264作出是否两个字符是否相同的确定结果。如果它们是相同的，那么 过程250移至状态268，其中读取第一序列和第二序列的下一个字符。然后确定所 述的下一字符是否相同。如果相同，那么过程250继续这一循环直到两个字符是 不同的。如果确定了接下来的两个字符并不相同，过程250移至决定状态274，确 定在两个序列中是否有任何更多的字符要读取。如果没有任何更多的字符被读取， 那么过程250移至状态276，其中第一序列和第二序列的同源性水平显示给使用者。 通过计算序列间相同字符占第一序列中字符总数的比例来确定同源性水平。这样， 如果第一个100核苷酸序列的每一个字符都与第二序列的每一个字符联配，那么 同源性水平将是100％。
[233]可选择地，计算机程序可以比较参照序列与本发明的序列，以确定是否序 列在一个或者多个位置上不同。程序可以记录本发明序列或参照序列中插入、缺 失或者替换的核苷酸或者氨基酸残基的长度和同一性。计算机程序可以是确定是 否参照序列与本发明的序列相比，含有单核苷酸多态性(SNP)，或者是否本发明 的序列含有已知序列的SNP的程序。因此，在一些方面，计算机程序是鉴定SNPs 的程序。该方法可以通过以上描述的计算机系统和描述在图3中的方法来完成。 该方法可以通过应用计算机程序读取本发明序列和参照序列，并且用计算机程序 来鉴定差异来进行。
[234]在其他方面，以计算机为基础的系统包括鉴定本发明的核酸或者多肽中的 特征的标识符(identifier)。“标识符”是指鉴定核酸序列中的某些特征的一个或者 多个程序。例如，标识符可以包括鉴定核酸序列中的开放阅读框架(ORF)的程 序。图4是说明用于检测序列中特征存在与否的标识符过程300的一个方面的流 程图。过程300起始于起始状态302，然后移至状态304，其中待检测特征的第一 序列存储于计算机系统100的存储器115上。过程300然后移至状态306，在该状 态下，打开具有序列特征的数据库。这样数据库将包括一系列每一个特征的属性 和特征的名称。例如，特征名称可以是“起始密码子”，特征属性为“ATG”。另一个 例子是特征名称为“TAATAA盒”，特征属性为“TAATAA”。这样的数据库的例子 是由威斯康辛大学遗传学计算机组(University of Wisconsin Genetics Computer Group)制作。可选择地，特征可以是结构多肽基序，如α螺旋、β折叠，或者功 能性多肽基序，如酶的活性位点、螺旋-转角-螺旋基序或者本领域技术知道的其他 基序。一旦在状态306打开特征数据库，过程300移至状态308，其中第一特征从 数据库中读取。然后在状态310中进行第一特征的属性与第一序列的比较。然后 在决定状态316下作出决定，是否在第一序列中发现所述特征的属性。如果发现 该属性，过程300移至状态318，其中所发现的特征的名称显示给使用者。过程 300然后移至决定状态320，在其中作出是否在数据库中存在更多的特征的决定。 如果不存在更多的特征，过程300终止于结束状态324。然而，如果数据库中确实 存在有更多的特征，那么过程300在状态326读取下一个序列特征，并且循环回 到状态310，其中该下一个特征的属性与第一序列进行比较。如果在决定状态316 中所述特征的属性没有在所述第一序列中发现，那么为了决定在数据库中是否存 在更多特征，过程300直接移至决定状态320。因此，在一方面，本发明提供了鉴 定开放阅读框架(ORFs)的计算机程序。
[235]本发明的核酸序列，或本发明的多肽序列可在各种数据处理程序中以多种 格式被储存和进行操作。例如，本发明的核酸序列，或本发明的多肽序列，可以 以文本形式储存在字处理文件如Microsoft WORD或WORDPERFECT中，或以 ASCII文件储存在各种本领域技术人员所熟悉的数据库程序如DB2、SYBAS或 ORACL中。另外，许多计算机程序和数据库都可用作序列比较算法、标识符、或 参考核苷酸序列或多肽序列的来源，所述参考核苷酸序列或多肽序列要与本发明 的核酸序列进行比较。用于实践本发明的程序和数据库包括，但不限于：MacPattern (EMBL)、DiscoveryBase(Molecular Applications Group)、GeneMine(Molecular Applications Group)、Look(Molecular Applications Group)、MacLook(Molecular Applications Group)、BLAST和BLAST2(NCBI)、BLASTN和BLASTX(Altschul 等，J.Mol.Biol.215：403，1990)、FASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，85：2444，1988)、FASTDB(Brutlag等，Comp.App.Biosci.6：237-245，1990)、 Catalyst(Molecular Simulations Inc.)、Catalyst/SHAPE(Molecular Simulations Inc.)、 Cerius2.DBAccess(Molecular Simulations Inc.)、HypoGen(Molecular Simulations Inc.)、Insight II(Molecular Simulations Inc.)、Discover(Molecular Simulations Inc.)、 CHARMm(Molecular Simulations Inc.)、Felix(Molecular Simulations Inc.)、DelPhi (Molecular Simulations Inc.)、QuanteMM(Molecular Simulations Inc.)，Homology (Molecular Simulations Inc.)、Modeler(Molecular Simulations Inc.)、ISIS(Molecular Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design(Molecular Simulations Inc.)、WebLab (Molecular Simulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer(Molecular Simulations Inc.)、Gene Explorer(Molecular Simulations Inc.)、SeqFold(Molecular Simulations Inc.)、MDL可用化学制品目录数据库(Available Chemicals Directory database)、 MDL药品数据报告数据库(Drug Data Report data base)、综合医药化学数据库 (Comprehensive Medicinal Chemistry database)、德温特世界药物索引数据库 (World Drug Index database)、BioByteMasterFile数据库、Genbank数据库和 Genseqn数据库。其它的程序和数据库对于本公开内容的所述技术领域内的技术人 员是显而易见的。
[236]应用以上的程序可能检测到的基序包括：编码亮氨酸拉链的序列、螺旋- 转角-螺旋基序、糖基化作用位点、泛素化位点、α螺旋、β折叠、编码引导被编码 蛋白的分泌的信号肽的信号序列、涉及转录调控的序列如同源框、酸性伸展(acidic stretches)、酶的活性位点、底物结合位点以及酶切割位点。
核酸的杂交
[237]本发明提供了可在严格条件下与本发明的示例性序列例如在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、 SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、 SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、 SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、 SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、 SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、 SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、 SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、 SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、 SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、 SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、 SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137 SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、 SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：173中 阐明的序列或者编码包括在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、 SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、 SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、 SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、 SEQ ID NO：172或SEQ ID NO：174中阐明的序列的多肽的核酸杂交的分离的或者 重组的核酸。严格条件可以是高度严格条件，中度严格条件，低度严格条件，包 括在此描述的高度的和降低的严格条件。在可选择的方面，本发明的核酸根据它 们在严格条件下杂交的能力来定义，它们可以在大约5个残基到某分子例如本发 明的示范性核酸的全长之间。例如，它们的长度可以是至少5、10、15、20、25、 30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、 400个或更多个残基。比全长核酸较短的核酸也包括在内。这些核酸可以用作如， 杂交探针、标记探针、PCR寡核苷酸探针、iRNA(单链或者双链)、编码抗体结 合肽(表位)的序列或反义序列、基序、活性位点、结合结构域、调控结构域以 及类似物。
[238]在一方面，本发明的核酸通过其在高的严格条件下杂交的能力定义，该高 严格性包括条件为大约37℃到42℃，大约50％的甲酰胺。在一方面，本发明的核 酸通过其在降低的严格条件下杂交的能力定义，该降低的严格性包括条件为大约 30℃到35℃，大约35％到25％的甲酰胺。可选择地，本发明的核酸通过其可以在 高严格条件下杂交的能力定义，该高严格性包括条件为42℃，50％的甲酰胺中， 5×SSPE，0.3％的SDS，封闭核酸重复序列，如cot-1或者鲑鱼精DNA(例如，200n/ml 剪切的和变性的鲑鱼精DNA)。在一方面，本发明的核酸通过其在降低的严格条 件下杂交的能力定义，该降低的严格性条件包括降低的温度35℃，35％的甲酰胺。
[239]杂交以后，滤膜可以在50℃，用6×SSC，0.5％的SDS洗涤。超过25％的 甲酰胺，这些条件认为是“中度”条件，低于25％的甲酰胺，这些条件认为是“低度” 条件。“中度”杂交条件的一个特定例子是上面的杂交在甲酰胺为30％时进行。“低 严格性”杂交条件的特定例子是上面的杂交在甲酰胺为10％时进行。
[240]与特定水平的严格性相对应的温度范围可以进一步通过计算感兴趣的核 酸中嘌呤与嘧啶的比例，并且相应地调节温度来缩小。本发明的核酸也通过其在 Ausubel和Sambrook中所述的高度、中度、低度严格条件下杂交的能力来定义。 对上面的范围和条件所作的变化可以用于实施本发明，并且是本领域技术人员所 熟知的。下面进一步描述了杂交条件。
寡核苷酸探针和应用方法
[241]本发明也提供了用于鉴定编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的核酸探针。 一方面，探针包括在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、 SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、 SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、 SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、 SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、 SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、 SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、 SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、 SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、 SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、 SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、 SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、 SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、 SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：161、 SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171 或SEQ ID NO：173中阐述的序列的至少10个连续的碱基。可选择地，本发明的探 针可以是本发明的序列中所阐明的序列的至少大约5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、 60、65、70、75、80、90、100或150，或更多，或大约10到50、大约20到60、 大约30到70个连续碱基。这些探针通过结合或者杂交来鉴定核酸。这些探针可 以用于本发明的阵列中，见下面的讨论，包括，例如，毛细管阵列。本发明的探 针也可以用于分离其它的核酸或多肽。
[242]本发明的探针可以用于确定是否生物样品，如土壤样品，含有具有本发明 的核酸序列的生物或者可以从其获得该核酸的生物。在这样的程序中，获得潜在 地隐藏了可从其分离得到核酸的生物体的生物样品，并且从该样品获得核酸。在 允许探针与样品中存在的任何互补序列特异性杂交的条件下，将核酸与探针接触。 在必要的情况下，为了确定允许探针特异地与互补序列杂交的条件，可以让探针 与来自已知含有互补序列的样品中的互补序列相接触，同时与不含有互补序列的 对照序列相接触。杂交条件，如杂交缓冲液中的盐浓度、杂交缓冲液中甲酰胺的 浓度或者杂交温度，可以进行被变化以确定允许所述探针特异地与互补的核酸杂 交的条件(参见有关特异性杂交条件的论述)。
[243]如果样品含有可以从其中分离出所述核酸的生物体，那么探针的特异性杂 交可以被检测到。杂交可以通过使用可检测试剂标记所述探针来检测，所述的可 检测试剂例如放射性同位素、荧光染料或者能够催化形成可检测产物的酶。使用 标记探针来检测在样品中存在的互补核酸的很多方法对于本领域技术人员是熟悉 的。这些方法包括Southern印迹、Northern印迹、菌落杂交方法以及点印迹。这 些程序中的每一个的方案在Ansubel和Sambrook中给出。
[244]作为选择，可以在一个扩增反应中使用一种以上的探针(其中的至少之一 可以特异地与存在于核酸样品的任何互补序列杂交)来检测样品中是否含有包括 本发明的核酸序列的生物体(如，从中分离出所述核酸的生物体)。在一方面， 所述探针包括寡核苷酸。一方面，所述扩增反应可以包括PCR反应。PCR的实验 方案见前面Ausubel和Sambrook的如上的所述(参见有关扩增反应的讨论)。在 这些程序中，所述样品中的核酸与所述探针相接触，进行所述扩增反应，检测任 何得到的扩增产物。扩增产物可以通过对反应产物进行凝胶电泳，并用嵌入剂如 溴化乙啶染胶来进行检测。可选择地，一种或者多种探针可以用放射性同位素标 记，并且在凝胶电泳后通过放射性自显影来检测放射性的扩增产物的存在。
[245]源自位于本发明序列的3’或者5’末端附近的序列的探针也可以用于染色 体移步(chromosome walking)程序中，以鉴定含有另外的序列如基因组序列的克 隆。这样的方法允许从宿主生物体中分离出编码其他感兴趣的蛋白的基因。
[246]在一方面，本发明的核酸被用作探针来鉴定和分离相关的核酸。在一些方 面，所述的相关的核酸可以是来自某些生物体的cDNA或者基因组DNA，但是这 些生物体不是本发明的核酸起初被分离出来的那些生物体。在这样的程序中，核 酸样品与所述探针在允许探针特异地与相关序列杂交的条件下接触。所述探针与 来自相关生物体的核酸的杂交然后采用以上描述的任何方法来检测。
[247]在核酸杂交反应中，用于达到特定严格水平的条件可以根据待杂交核酸的 性质来进行改变。例如，在选择杂交条件时要考虑核酸杂交区域的长度、互补程 度、核苷酸序列组成(如，GC对AT含量的比率)、以及核酸类型(如，RNA对 DNA)。另外考虑是否其中一个核酸固定于，如滤膜上。杂交可以在低严格性， 中度严格性或者高严格性的条件下进行。作为核酸杂交的例子，含有固定化变性 核酸的聚合物膜首先在45℃下，在由0.9M NaCl、50mM NaH2PO4，pH7.0、5.0mM Na2EDTA、0.5％SDS、10×Denhardt′s和0.5mg/ml多核腺苷酸组成的溶液中预杂 交30分钟。然后将大约2×107cpm(比活性4-9×108cpm/ug)的32P末端标记的寡 核苷酸探针加入到溶液中。在12-16小时的温育以后，膜在室温(RT)下于含有 0.5％SDS的1×SET(150mM NaCl、20mM Tris盐酸，pH7.8、1mM Na2EDTA) 中洗涤30分钟，然后在新鲜配制的1×SET，在Tm-10℃下，再洗涤寡核苷酸探针 30分钟。然后将膜暴露于自显影膜上来检测杂交信号。
[248]通过改变用于鉴定核酸，如与可检测探针杂交的cDNA或者基因组DNA 的杂交条件的严格性，可以鉴定和分离与探针具有不同同源性水平的核酸。可以 通过在低于探针的解链温度下改变温度进行杂交而使严格性变化。解链温度，Tm， 是指(在定义的离子强度和pH下)50％的靶序列与精确互补的探针杂交的温度。 非常严格的条件被选择为与特定的探针的Tm值相等或比其低大约5℃。探针的解 链温度可以通过应用以下的经验公式计算：对于在14到70个核苷酸长度的探针， 应用此公式计算解链温度：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(600/N)，其 中的N是探针的长度。如果杂交在含有甲酰胺的溶液中进行，解链温度可以通过 应用以下的公式来计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(0.63％甲酰 胺)-(600/N)，其中的N是探针的长度。预杂交可以在6×SSC、5×Denhardt′s试剂、 0.5％SDS、100μg变性的鲑鱼精DNA片段或者6×SSC、5×Denhardt′s试剂、0.5％ SDS、100μg变性的鲑鱼精DNA片段、50％甲酰胺中进行。SSC和Denhardt′s和 其他溶液的配方列于例如Sambrook中。
[249]通过在以上所列的预杂交溶液中加入可以检测到的探针来进行杂交。当所 述探针包括双链DNA时，它应在加入到杂交缓冲液前被变性。滤膜与杂交缓冲液 接触足够长的时间使得探针与含有其互补序列或者其同源序列的cDNA或者基因 组DNA杂交。对于超过200个核苷酸长度的探针，杂交的过程可以是在低于Tm 温度15-25℃进行。对于较短的探针，如寡核苷酸探针，杂交的过程可以是在低于 Tm温度5-10℃下进行。在一个方面，在6×SSC溶液中的杂交过程在大约68℃进 行。在一个方面，在含有50％甲酰胺的溶液中的杂交在大约42℃进行。考虑所有 前述的杂交在高严格条件下进行。
[250]杂交以后，洗涤滤膜以去除任何非特异结合的可检测探针。洗涤滤膜所用 的严格性也可以根据正被杂交的核酸的性质、正被杂交的核酸的长度、互补的程 度，核苷酸序列的组成(如，GC对AT的含量)，以及核酸类型(如，RNA对 DNA)来进行变化。逐渐增高的严格条件洗涤的例子如下：2×SSC，0.1％SDS，室 温下15分钟，(低严格性)；0.1×SSC，0.5％SDS，室温下30分钟到1小时(中 度严格性)；0.1×SSC，0.5％SDS，杂交温度和68℃之间，15到30分钟(高严格 性)；0.15M NaCl，在72℃下15分钟(极高严格性)。最后的低严格性洗涤可以 在0.1×SSC，室温下进行。以上的例子仅仅示出了可以用于实施本发明，例如洗涤 滤膜的一组条件。本领域技术人员将知道，对于不同严格性洗涤有无数方案，所 有这些方案都可以用于实施本发明。
[251]已经与探针杂交的核酸可以通过放射自显影或者其它传统的技术来确定。 可以改变以上的程序来鉴定具有与探针序列具有降低水平的同源性的核酸。例如 为了获得与可检测探针具有降低水平的同源性的核酸，可以应用不太严格的条件。 例如，在含有Na+浓度为大约1M的杂交缓冲液中，杂交温度可以以5℃的幅度从 68℃降低到42℃。杂交后，滤膜用2×SSC，0.5％SDS，在杂交温度下洗膜。超过 50℃，这些条件认为是“中度”条件，低于50℃，这些条件认为是“低度”条件。“中 度”杂交条件的例子是上面的杂交在55℃进行。“低严格性”杂交条件的特定例子是 上面的杂交在45℃进行。
[252]可选择地，杂交在缓冲液，如含有甲酰胺的6×SSC中，在42℃下进行。 在这种情况下，杂交缓冲液中甲酰胺的浓度可以以5％的幅度从50％降低到0％， 以鉴定与探针具有降低的同源性水平的克隆。杂交后，滤膜可以用6×SSC，0.5％ SDS在50℃下洗涤。认为当甲酰胺浓度大于25％时为“中度”条件，而低于25％时 为“低度”条件。“中度”杂交条件的特定例子是当以上的杂交在30％的甲酰胺中进 行时。“低严格性”杂交条件的特定例子是当以上的杂交在10％的甲酰胺中进行时。
[253]本发明的这些探针和方法可以用于分离具有与本发明的核酸序列有至少 大约99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85 ％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或者至 少50％同源性的序列的核酸，所述本发明的核酸序列包括它们的至少大约10、15、 20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400或者500个 连续的碱基，和与之互补的序列。同源性可以应用在此所述的比对算法测定。例 如，同源的多核苷酸可以具有在此描述的其中一个编码序列的天然发生的等位基 因突变体的编码序列。当与本发明的核酸比较时，这样的等位基因突变体可以具 有一个或者多个核苷酸的取代、缺失或者添加。
[254]此外，本发明的探针和方法可以用于分离编码与本发明多肽具有至少大约 99％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至 少65％，至少60％，至少55％或者至少50％序列同一性(同源性)的多肽的核 酸，正如应用序列比对算法(如，使用默认参数的FASTA版本3.0t78的算法，或 者具有在此阐明的示范性设置的BLAST 2.2.2程序)确定的，所述本发明多肽包括 它们的至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或者150个连续的氨 基酸。
抑制磷脂酶的表达
[255]本发明进一步提供与本发明的核酸序列如磷脂酶编码核酸互补的核酸 (如，本发明的核酸序列的反义序列)。反义序列可以抑制磷脂酶编码基因的转 运，剪接或者转录。抑制可以通过靶向基因组DNA或者信使RNA而起作用。例 如，通过杂交和/或切割，可以抑制被靶向的核酸的转录或者功能。本发明提供的 特别有效的一套抑制物包括能够结合磷脂酶基因或者信息的寡核苷酸，在每一种 情况下，都可阻止或者抑制磷脂酶的产生或者发挥功能。结合是通过序列特异性 的杂交实现的。另一类有用的抑制物包括引起磷脂酶信息失活或者切割的寡核苷 酸。该寡核苷酸可以具有引起此种切割的酶活性，如核酶。该寡核苷酸可以进行 化学修饰，或者偶联到能够切割互补核酸的酶或组分上。人们可以筛选具有许多 不同的此类寡核苷酸的文库，以获得那些具有期望的活性的寡核苷酸。
[256]磷脂酶表达的抑制可以具有多种不同的工业用途。例如，抑制磷脂酶的表 达可以减慢或者阻止酸败。当脂类或多肽，如，结构脂类或者多肽，被酶促降解 时，可能发生酸败。这可以导致水果和蔬菜的变质或者腐败。一方面，应用可以 抑制磷脂酶的表达和/或活性的本发明组合物，例如，抗体、反义寡核苷酸、核酶 和RNAi，可以用于减缓或者阻止酸败。因此，在一方面，本发明提供方法和组合 物，包括将本发明的抗体、反义寡核苷酸、核酶和RNAi应用于植物或者植物产品 (如，水果、种籽、根、叶等)，以阻止或者延缓酸败。这些组分也可以由植物 (如，转基因植物)或者其它生物(如，用本发明的磷脂酶基因转化的细菌或者 其它微生物)表达。
[257]用于抑制磷脂酶表达的本发明的组分(如反义物、iRNA、核酶、抗体)可 以用作药物组分。
反义寡核苷酸
[258]本发明提供能够结合磷脂酶信息的反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸可以通 过靶向mRNA来抑制磷脂酶活性。设计反义寡核苷酸的策略在科学和专利文献中 已经充分说明，并且技术人员可以应用本发明的新的试剂来设计这样的磷脂酶寡 核苷酸。例如，用于筛选有效的反义寡核苷酸的基因步行/RNA作图试验方案是本 领域所熟知的，参见，如，Ho(2000)Methods Enzymol.314：168-183，该文献描 述了RNA作图分析方法，该作图分析方法以标准的分子技术为基础，为有效的反 义序列选择提供了简单而可靠的方法。也参见Smith(2000)Eur.J.Pharm.Sci. 11：191-198。
[259]也可以应用天然存在的核酸作为反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是任何 长度；例如，在可选择的方面，反义寡核苷酸在大约5到100、大约10到80、大 约15到60、大约18到40之间。最佳长度可以通过常规的筛选方法来确定。反义 寡核苷酸可以以任何浓度存在。最佳浓度可以通过常规的筛选方法来确定。已经 知道有许多能够解决该潜在的问题的合成的，非天然存在的核苷和核酸类似物。 例如，可以应用含有非离子性骨架，如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位的肽核酸 (PNAs)。也可以应用具有硫代磷酸连接的反义寡核苷酸，如，WO 97/03211； WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol Appl Pharmacol 144：189-197；Antisense Therapeutics，ed.Agrawal(Humana Press，Totowa，N.J.，1996)所述。本发明提供 的具有合成的DNA骨架类似物的反义寡核苷酸也可以包括磷-二硫代、甲基磷酸 盐、磷阿米酮、烷基磷三酯、氨基磺酸盐、3’-硫代乙缩醛、甲叉(甲基亚胺)、 3′-N-氨基甲酸酯剂和吗啉代氨基甲酸酯核酸，如以上所述。
[260]可以应用组合化学的方法产生大量的寡核苷酸，可以对这些寡核苷酸快速 筛选，以获得对任何靶，如本发明的有义和反义磷脂酶序列，具有适当的结合亲 和性和特异性的特定的寡核苷酸(见，如，Gold(1995)J.of Biol.Chem.270： 13581-13584)。
抑制性核酶
[261]本发明提供可以结合磷脂酶信息的核酶，其可以通过靶向mRNA来抑制磷 脂酶的酶活性。设计核酶和选择用于靶向作用的对磷脂酶具特异性的反义序列在 科学和专利文献中已经充分说明，并且技术人员可以应用本发明的新型试剂来设 计这样的核酶。核酶通过核酶的靶RNA结合部分结合靶RNA起作用，该核酶的 靶RNA结合部分与切割靶RNA的RNA的酶活部分非常接近。因此，核酶通过互 补的碱基配对作用识别并且结合靶RNA，并且一旦结合于正确的位点，将酶法切 割靶RNA并且使靶RNA失活。如果切割发生在编码序列中，以这种方式进行的 靶RNA的切割将破坏其指导编码蛋白合成的能力。当核酶结合并且切割其靶RNA 后，一般情况下，将从RNA上释放，因此能够反复地结合和切割新的靶标。
[262]在一些情况下，核酶的酶本质决定了其比其它技术如反义技术(其中核酸 分子简单地结合于核酸靶来阻止其转录、翻译或者与其它分子的缔合)更优越， 这是因为导致有效治疗作用所必需的有效的核酶浓度低于反义寡核苷酸的浓度。 这一潜在的优点反映了核酶可以以酶的方式起作用的能力。由此，单个核酶分子 可以切割靶RNA的很多分子。此外，核酶是典型的高度特异性的抑制剂，其抑制 的特异性不仅仅依赖于结合的碱基配对机制，也依赖于分子抑制其结合的RNA表 达的机制。即，抑制是通过切割RNA靶来引起的，因此特异性是通过靶向的RNA 的切割速率与非-靶向的RNA的切割速率之比来定义。该切割机制取决于参与碱 基配对的因素以外的因素。因此，核酶的特异性作用高于结合于同一个RNA位点 的反义寡核苷酸的作用。
[263]具有酶活的核酶RNA分子可以以锤头基序(hammerhead motif)形成，但 也可以以发夹、肝炎δ病毒、I类内含子或者RNaseP样RNA(与RNA的引导序 列有关)基序形成。Rossi(1992)Aids Research and Human Retroviruses 8：183描 述了此类锤头基序的例子；Hampel(1989)Biochemistry 28：4929，和Hampel(1990) Nuc.Acids Res.18：299中描述了发夹基序；Perrotta(1992)Biochemistry 31：16中 描述了肝炎δ病毒基序；Guerrier-Takada(1983)Cell 35：849中描述了RNaseP基 序；Cech美国专利4,987,071中描述了I类内含子。描述这些特异基序的目的不是 限制性的；本领域技术人员将认识到，本发明的酶RNA分子具有与一个或者多个 靶基因RNA区域互补的特异性底物结合位点，并且具有在底物结合位点内或者周 围赋予该分子以RNA切割活性的核苷酸序列。
RNA干涉(RNAi)
[264]在一方面，本发明提供包括本发明的磷脂酶序列的RNA抑制分子，即所 谓的“RNAi”分子。RNAi分子包括双链RNA(dsRNA)分子。RNAi可以抑制磷脂 酶基因的表达。一方面，RNAi是长度为大约15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25或者更长的双螺旋核苷酸。虽然发明并不受限于任何特别的作用机理， 但是RNAi可以进入细胞，并且引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)，包 括内源性mRNA的降解。当细胞暴露于双链RNA(dsANA)时，来自同源基因的 mRNA被称为RNA干涉(RNAi)的过程选择性地降解。RNAi背后的可能的基本 机理是，将与特定的基因序列匹配的双链RNA(dsANA)断裂形成称之为短干扰 RNA的短片段，该短片段可以触发与其序列匹配的mRNA的降解。在一方面，本 发明的RNAi在基因沉默治疗中使用，参见，例如Shuey(2002)Drug Discov.Today 7：1040-1046。在一方面，本发明提供使用本发明的RNAi选择性降解RNA的方法。 该方法可以在体外、离体或在体内进行。一方面，本发明的RNAi分子可以用于在 细胞，器官或动物内产生功能丧失的突变。产生RNAi分子和使用RNAi分子选择 性降解RNA的方法在本领域是众所周知的，参见，例如美国专利6,506,559； 6,511,824；6,515,109；6,489,127。
核酸修饰
[265]本发明提供产生本发明的核酸例如那些编码磷脂酶的核酸的变体的方法。 在可选择的实施方案中，本发明提供了修饰本发明的酶的方法，例如通过随意或 随机方法，或非随机方法或定向进化方法，诸如基因位点饱和诱变TM(GSSMTM)对 其编码序列进行突变，以改变酶的活性pH范围或最佳活性pH范围，活性温度范 围或最佳活性温度范围、特异性、活性(动力学)；酶对糖基化、磷酸化或金属(例 如Ca、Mg、Zn、Fe、Na)的应用，例如以影响pH/温度稳定性。本发明提供了修 饰本发明的酶的方法，例如通过GSSMTM对其编码序列进行突变，以增加它对蛋 白酶活性的抗性。本发明提供了修饰本发明的酶的方法，例如通过GSSMTM对其 编码序列进行突变，以改变酶对Ca、Mg、Na具有特异性但不会螯合Zn的金属螯 合剂的应用。本发明提供了修饰本发明的酶的方法，例如通过GSSMTM对其编码 序列进行突变，其将具有期望的活性组合，例如PI、PA和PC/PE特异性PLCs。
[266]这些方法可以重复或者在不同的组合中使用，产生与模板核酸编码的磷脂 酶相比具有改变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的磷脂酶。这些方法 也可以重复或者在不同的组合中使用，例如，产生基因/信息表达、信息翻译或者 信息稳定性上的变化。另一方面，细胞的遗传组分可以通过，例如离体的同源基 因修饰，然后再插入细胞中而加以改变。
[267]本发明的核酸可以通过任何方法改变。例如，无规或随机方法，或者，非 随机方法，或者“定向进化”方法。
[268]基因的随机突变的方法在本领域是众所周知的，见，例如，美国专利 5,830,696。例如，诱变剂可以用于随机突变基因。诱变剂包括，例如，紫外光或 者γ-辐射，或者化学诱变剂，例如，丝裂霉素、亚硝酸、光致活性补骨脂素，它 们单独使用或组合使用，以诱导可以通过重组进行修复的DNA断裂。其他化学诱 变剂包括，例如，重亚硫酸钠、亚硝酸、羟胺、肼或者甲酸。其他诱变剂是核苷 酸前体的类似物，例如，亚硝基胍，5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤，或者吖啶。这些试 剂可以代替核苷酸前体加入到PCR反应中，从而使序列突变。也可以使用嵌入试 剂例如原黄素、吖啶黄、阿的平和类似物。
[269]可以应用分子生物学上的任何技术，如随机PCR诱变，参见，如，Rice (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5467-5471；或者组合式多重盒式诱变，参见 如，Crameri(1995)Biotechinques 18：194-196。可选择地，核酸，如基因，可以在 无规或“随机”片段化后重新装配，参见，如，美国专利6,291,242；6,287,862； 6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514，5,811,238；5,605,793.。在可选择的 方面，修饰、增加或者删除可以通过易错PCR、重排、寡核苷酸诱导的定点突变、 装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体突变、 位点专一性诱变、基因重装配、基因位点饱和诱变TM(GSSMTM)、合成连接重 装配(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶 模板的诱变、缺口二重诱变、点错配修复诱变、修复-缺陷型宿主株诱变、化学诱 变、放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、整体 诱变、嵌合核酸多聚体生成、和/或者这些方法和其它方法的组合产生。
[270]以下的出版物描述了各种递归重组程序和/或可以整入到本发明的方法中 的方法：Stemmer(1999)“Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties”Tumor Targeting 4：1-4；Ness(1999)Nature Biotechnology 17：893-896； Chang(1999)“Evolution of a cytokine using DNA family shuffling”Nature Biotechnology 17：793-797；Minshull(1999)“Protein evolution by molecular breeding”Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；Christians(1999)“Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling” Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri(1998)“DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution”Nature 391：288-291；Crameri (1997)“Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”Nature Biotechnology 15：436-438；Zhang(1997)“Directed-evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening”Proc.Natl. Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Patten等(1997)“Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri 等(1996)“Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling” Nature Medicine 2：100-103；Crameri等(1996)“Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”Nature Biotechnology 14：315-319；Gates 等(1996)“Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor′headpiece dimer′”Journal of Molecular Biology 255：373-386； Stemmer(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR”In：The Encyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers，New York.447-457页；Crameri和Stemmer(1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes”BioTechniques 18：194-195；Stemmer等(1995)“Single-step assembly of a gene and entire plasmid form largenumbers of oligodeoxyribonucleotides”Gene，164：49-53；Stemmer(1995)“The Evolution of Molecular Computation”Science 270：1510；Stemmer(1995)“Searching Sequence Space”Bio/Technology 13：549-553；Stemmer(1994)“Rapid evolution ofa protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370：389-391；和Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。
[271]产生多样性的突变方法包括，例如，定点诱变(Ling等.(1997)“Approaches to DNA mutagenesis：an overview”Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale等(1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol.Biol.57：369-374；Smith(1985)“In vitro mutagenesis”Ann.Rev.Genet. 19：423-462；Botstein & Shortle(1985)“Strategies and applications of in vitro mutagenesis”Science 229：1193-1201；Carter(1986)“Site-directed mutagenesis” Biochem.J.237：1-7；Kunkel(1987)“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis”在Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J. eds.，Springer Verlag，Berlin))；使用含有尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel(1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection”Proc.Natl. Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)“Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection”Methods in Enzymol.154，367-382；和Bass 等(1988)“Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities”Science 242： 240-245)；寡核苷酸诱导的定点诱变(Methods in Enzymol.100：468-500(1983)； Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller & Smith(1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment”Nucleic Acids Res.10：6487-6500；Zoller & Smith(1983)“Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors”Methods in Enzymol. 100：468-500和Zoller & Smith(1987)Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol.154：329-350)；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等(1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA”Nucl.Acids Res.13：8749-8764；Taylor等(1985)“The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations athigh frequency using phosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye (1986)“Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis”Nucl.Acids Res.14： 9679-9698；Sayers等(1988)“Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis”Nucl.Asids Res.16：791-802；和Sayers等 (1988)“Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide”Nucl.Acids Res. 16：803-814)；使用缺口双重DNA的诱变(Kramer等(1984)“The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction”Nucl.Acids Res.12： 9441-9456；Kramer & Fritz(1987)Methods in Enzymol.“Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA”154：350-367；Kramer等(1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations”Nucl.Acids Res.16：7207；和Fritz 等(1988)“Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro”Nucl.Acids Res.16：6987-6999)。
[272]可以用于实践本发明方法的另外的实验方案包括点错配修复(Kramer (1984)“Point Mismatch Repair”Cell 38：879-887)，应用修复缺陷型宿主株的诱 变(Carter等(1985)“Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors”Nucl.Acids Res.13：4431-4443；和Carter(1987)“Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors”Methods in Enzymol.154： 382-403)，缺失诱变(Eghtedarzadeh(1986)“Use of oligonucleotides to generate large deletions”Nucl.Acids Res.14：5115)，限制-选择和限制-纯化(Wells等(1986) “Importance of hydrogen-bondformation in stabilizing the transition state of subtilisin”Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423)，通过全基因合成的诱变 (Nambiar等(1984)“Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein”Science 223：1299-1301；Sakamar和Khorana(1988)“Total synthesis and expression of agene for the a-subunit of bovine rodo utersegment guanine nucleotide-binding protein(transducin)”Nucl.Acids Res.14：6361-6372；Wells等 (1985)“Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites”Gene 34：315-323；和Grundstrom等(1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale‘shot-gun’gene synthesis”Nucl. Acids Res.13：3305-3316)，双链断裂修复(Mandecki(1986)，Arnold(1993)“Protein engineering for unusual environments”Current Opinion in Biotechnology 4：450-455. “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-speciflc mutagenesis”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181)。很 多以上的方法的另外的细节在Methods in Enzymology的154卷中有说明，其中也 描述了用于解决各种诱变方法遇到的问题的有用的控制。
[273]也参见Stemmer的美国专利5,605,793(1997年2月25日)，“Methods for In Vitro Recombination；”Stemmer等人的美国专利5,811,238(1998年9月22日) “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination；”Stemmer等人的美国专利5,830,721(1998年11月3 日)，“DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly；”Stemmer等人 的美国专利5,834,252(1998年11月10日)“End-Complementary Polymerase Reaction；”Minshull等人的美国专利5,837,458(1998年11月17日)，“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering；”WO 95/22625，Stemmer和 Cramen，“Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly；”Stemmer和 Lipschutz的WO 96/33207“End Complementary Polymerase Chain Reaction；” Stemmer和Crameri的WO 97/20078“Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination；”Minshull和 Stemmer的WO 97/35966，“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering；”Punnonen等人的WO 99/41402“Targeting of Genetic Vaccine Vectors；”Punnonen等人的WO 99/41383“Antigen Library Immunization；”Punnonen 等人的WO 99/41369“Genetic Vaccine Vector Engineering；”Punnonen等人的WO 99/41368“Optimization of Immunomodulatory Properties of GeneticVaccines；” Stemmer和Crameri的EP 752008“DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly；”Stemmer的EP 0932670“Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination；”Stemmer等人的WO 99/23107，“Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling；”Apt等人的WO 99/21979， “Human Papillomavirus Vectors；”del Cardayre等人的WO 98/31837“Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination；”Patten和 Stemmer的WO 98/27230“Methods and Compositions for Polypeptide Engineering，” Stemmer等人的WO 98/27230，“Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection，”WO 00/00632，“Methods for Generating Highly Diverse Libraries，”WO 00/09679，“Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences，”Arnold等人 的WO 98/42832，“Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers，”Arnold等人的WO 99/29902，“Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences，”Vind的WO 98/41653，“An in Vitro Method for Construction of a DNA Library，”Borchert等人的WO 98/41622，“Method for constructing a Library Using DNA Shuffling，”和Pati和Zarling的WO 98/42727， “Sequence Alterations using Homologous Recombination.”。
[274]某些美国申请提供了关于产生不同多样性的方法的细节，包括Patten等人 的“SHUFFLING OF CODON ALTEAED GENES”，1999年9月28日提交，(美 国系列号09/407,800)；del Cardayre等人的“EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”，提交于1998 年7月15日(美国系列号09/166,188)和1999年7月15日(美国系列号09/354,922)； Crameri等人的“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION”，提交于1999年9月28日(美国系列号09/408,392)和Crameri 等人的“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION”， 提交于2000年1月18日(PCT/US00/01203)；Welch等人的“USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING”，提交于1999年9月28日(美国系列号09/408,393)；Selifonov 等人的“METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDS & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”，提交于2000年1 月18日(PCT/US00/01202)和，例如，Selifonov等人的“METHODS FOR MAKING CHARACTERS TRINGS，POLYNUCLEOTIDS & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”，提交于2000年7月18日(美国系列号 09/618,579)，Selifonov和Stemmer的“METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS”，提交于2000年 1月18日(PCT/US00/01138)；和Affholter的“SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION”，提交于2000年9月6日(美国系列号09/656,549)。
[275]非随机的或者“定向进化”的方法包括例如，饱和诱变(例如GSSMTM)、 合成的连接重装配(SLR)，或者它们的组合，它们被用来修饰本发明的核酸，以 产生具有新的或者改变的性质(例如，在高的酸性或碱性条件，高温和类似条件 下具有活性)的磷脂酶。由修饰了的核酸编码的多肽可以在测定磷脂酶或者其它 活性之前对活性进行筛选。可以应用任何测试形式或者方案，如，用毛细管阵列 平台。参见，如，美国专利6,280,926；5,939,250。
饱和诱变，或GSSMTM
[276]在本发明的一个方面中，非随机的基因修饰，“定向进化过程”，被用于产 生具有新的或者改变的特性的磷脂酶。本方法的各种变化已经被称为“基因位点诱 变”、“位点饱和诱变”、“基因位点饱和诱变TM”或者简单地称为“GSSMTM”。饱和 诱变可以与别的诱变过程相结合。见，例如，美国专利6,171,820；6,238,884。一 方面，GSSMTM包括提供模板多核苷酸和众多的寡核苷酸，其中每种寡核苷酸包括 与模板多核苷酸同源的序列，因此靶向模板多核苷酸中的特异序列，以及为同源 基因的变异体的序列；通过使用寡核苷酸复制模板多核苷酸，产生包括非随机序 列变异的子代多核苷酸，从而产生包括同源基因序列变异体的多核苷酸。
[277]在一方面，将含有简并N，N，G/T序列的密码子引物用于往多核苷酸中引入 点突变，以便产生一组子代多肽，其中在每个氨基酸位置都是全范围的单氨基酸 取代，例如被靶向待修饰的酶活性位点或者配体结合位点中的氨基酸残基。这些 寡核苷酸可以包括连续的第一同源序列，简并N，N，G/T序列，和任选地，第二同 源序列。从使用这些寡核苷酸得到的下游的子代翻译产物包括多肽上的每个氨基 酸位点的所有可能的氨基酸变异，这是因为N，N，G/T序列的简并性包括所有20种 氨基酸的密码子。在一方面，一个这样的简并寡核苷酸(包括，例如，一个简并 N，N，G/T盒)用于使亲代多核苷酸模板中的每个最初密码子进行全范围的密码子取 代。在另一方面，使用至少两个简并盒——或者在相同的寡核苷酸中，或者在不 相同的寡核苷酸中，以使亲代多核苷酸模板中的至少两个最初密码子进行全范围 的密码子取代。例如，一个寡核苷酸中可以含有一个以上的N，N，G/T序列，以在 一个以上的位点上引入氨基酸突变。大量的这些N，N，G/T序列可以直接相邻，或 者被一个或多个另外的核苷酸序列隔开。在另一方面，适用于引入添加或者缺失 的寡核苷酸可以单独使用或者与含有N，N，G/T序列的密码子联合使用，以引入氨 基酸添加、缺失和/或取代的任何组合或者排列组合。
[278]在一方面，应用含有邻接的N，N，G/T三联体，即简并的(N，N，G/T)n序列的 寡核苷酸，可以在两个或者多个邻近的氨基酸位置同时进行诱变。另一方面，可 以应用简并度比N，N，G/T序列小的简并盒。例如，在一些例子中，(如，在一个 寡核苷酸中)应用包括仅仅一个N的简并三联体序列是理想的，其中所述的N可 以是在三联体的第一、第二或者第三的位置。在剩下的两个位置可以使用包括任 何组合和排列的任何其它的碱基。作为选择，在一些例子中，(如，在一个寡核 苷酸中)使用简并的N，N，N三联体序列是理想的。
[279]一方面，应用简并的三联体(如N，N，G/T三联体)，可以系统地而容易地 在多肽的每一和所有氨基酸位置中产生完整范围的可能的天然氨基酸(对应于所 有20个氨基酸)(在可供选择的方面，所述方法也包括在每一个氨基酸残基或者 密码子位置产生比所有可能的种类要少的替换)。例如，对于100个氨基酸的多 肽，可以产生2000个不同的种类(即，每个位置可能的20种氨基酸×100个氨基 酸位置)。通过应用含有简并N，N，G/T三联体的一段寡核苷酸或者一套寡核苷酸， 32个不同的序列可以编码所有20种可能的天然氨基酸。因此，在使用至少一种这 样的寡核苷酸进行亲本多核苷酸序列饱和诱变的反应容器中，产生了32种不同的 子代寡核苷酸，它们编码20种不同的多肽。相反地，在定点突变中，应用非简并 的寡核苷酸导致在每个反应容器中仅仅有一种子代多肽产物。非简并的寡核苷酸 可以选择性地与公开的简并引物组合使用；例如，在工作多肽中，可以应用非简 并的寡核苷酸来产生特异的点突变。这就提供了一种手段来获得特定的沉默点突 变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及引起终止密码子产生和多肽片段相应 的表达终止的点突变。
[280]一方面，每一个饱和诱变反应容器中含有编码至少20种子代多肽(如， 磷脂酶)分子的多核苷酸，因此所有的20种天然氨基酸都会出现在对应于亲本多 核苷酸中的被诱变的密码子位置的特定氨基酸位置(其它的例子使用了少于20个 天然的组合)。产生于每个饱和诱变反应容器的32倍简并的子代多肽可以进行克 隆扩增(例如，使用例如表达载体克隆至合适的宿主，如大肠杆菌宿主)，然后 进行表达的筛选。当通过筛选确定显示出有利的性质变化(例如与亲本多肽比较， 在碱性、酸性条件下磷脂酶活性增强)的单个子代多肽时，就可以用测序来确定 其中所含有的相应的有利的氨基酸取代。
[281]一方面，如在此所公开的，应用饱和诱变对亲本多肽的各个和所有的氨基 酸位置进行诱变，可以在超过一个的氨基酸位置确定出的有利的氨基酸变化。可 以产生含有所有或者部分这些有利的氨基酸替代的组合的一种或者多种新的子代 分子。例如，如果在多肽的三个氨基酸位置的每一个位置确定出2个特定的有利 的氨基酸变化，这样出现的排列就包括在每一个位置的3种可能性(与原来的氨 基酸没有变化，和两个有利变化中的每一个)和3个位置。这样，就有3×3×3或 者27种总的可能性，包括先前检查出的7种——6种单点突变(即，在三个位置 的每一个有2个)和在任何位置中都没有变化的1种。
[282]另一方面，为了改变序列，定点饱和诱变可以与任何随机的或非随机方法 一起使用，例如，合成的连接重装配(见下文)，重排，嵌合，重组和其他诱变 过程和诱变剂。本发明提供以重复方式使用任何诱变过程，包括饱和诱变。 合成的连接重组装(SLR)
[283]本发明提供称为“合成连接重装配”，或者简单地称为“SLR”的非随机基因 修饰系统，这是一种“定向进化方法”，以产生具有新的或者改变的特性的磷脂酶。 SLR是非随机地把寡核苷酸片段连接在一起的方法。此方法与随机的寡核苷酸重 排不同，因为核酸构件不被随机重排、串联或者随机地嵌合，而是非随机组装。 参见，例如，美国专利申请系列号(USSN)09/332,835，题目是”Synthetic Ligation Reassembty in Directed Evolution”，于1999年6月14日提交(“USSN 09/332,835”)。 一方面，SLR包括以下步骤：a)提供模板多核苷酸，其中该模板多核苷酸包括编 码同源基因的序列；(b)提供多个构建模块多核苷酸，其中所述的构建模块多核 苷酸被设计为可与模板多核苷酸在预定的序列处交叉装配(cross-over reassemble)， 而且所述的构建模块多核苷酸包括所述同源基因的变异体序列以及在变异序列两 侧与模板多核苷酸同源的序列；(c)将模板多核苷酸与构建模块多核苷酸结合， 以便构建模块多核苷酸与模板多核苷酸交叉装配，产生包含同源基因序列变异的 多核苷酸。
[284]SLR并不依赖于在待重新组装的多核苷酸之间存在高水平的同源性。这 样，这一方法可以用于非随机地产生包括超过10100个不同嵌合体的子代分子文库。 SLR可以用于产生包括超过101000个不同子代嵌合体的文库。这样，本发明的这些 方面包括用于产生一套最终的具有按设计选择的整个装配顺序的嵌合核酸分子的 非随机方法。这一方法包括按设计产生大量特定的核酸构建模块的步骤，这些核 酸构建模块具有可以应用的相互间相容的可以连接的末端，然后装配这些核酸构 建模块，这样就完成了按设计的全部装配顺序。
[285]将被装配的核酸构建模块的相互相容的可连接的末端对于这种类型的顺 序装配被认为是“适用的”，如果它们使得构建模块以预先制定的顺序联接的话。因 此，核酸构建模块被偶联的总体装配顺序是通过可连接末端的设计来特异化的。 如果不止一个装配步骤将要被应用，那么核酸构建模块被偶联的总体装配顺序也 通过装配步骤的先后次序来特异化。一方面，退火的构建模块用酶处理，如用连 接酶(如，T4DNA连接酶)处理，以完成构建模块间的共价键结合。
[286]一方面，寡核苷酸构建模块的设计通过分析一套祖先核酸序列模板而获 得，该模板作为产生子代一套最终的嵌合多核苷酸的基础。这些亲本寡核苷酸模 板作为序列信息源，辅助待诱变例如待嵌合或者重排的核酸构建模块的设计。
[287]在这一方法的一个方面，为了选择一个或者多个分界点(demarcation points)，对多个亲本核酸模板的序列进行联配。所述分界点可以位于同源的区域， 并且可以包括一个或者多个核苷酸。这些分界点在一个方面由至少两个祖先模板 中共有。所述分界点可以因此用于描绘将要产生的寡核苷酸构建模块的边界，以 便重新排列亲本寡核苷酸。在祖先分子中确定和选择的分界点用作装配最终的嵌 合子代分子的潜在的嵌合位点。分界点可以是至少两个亲本多核苷酸序列共同的 同源区域(包括至少一个同源核苷酸碱基)。可选择地，分界点可以是由至少半 数的亲本多核苷酸序列共同拥有的同源区域，或者，是由至少三分之二的亲本多 核苷酸序列共同拥有的同源区域。甚至更优选地，可应用的分界点是至少四分之 三的亲本多核苷酸序列共同拥有的同源区域，或者，是几乎所有的亲本多核苷酸 序列共同拥有的同源区域。一方面，分界点是由所有的亲本多核苷酸序列共同拥 有的同源区域。
[288]一方面，为了产生一个全面的子代嵌合多核苷酸文库，连接重装配过程被 尽可能充分地实施。换句话说，核酸构建模块的所有可能顺序的组合存在于一套 最终的嵌合核酸分子中。同时，另一方面，每个组合中的装配顺序(即，各个构 建模块的装配顺序，按各个最终的嵌合核酸序列的5’到3’的方向)是按照以上所 述设计的(或者是非随机的)。由于本发明的非随机性质，产生不需要的副产物 的可能性大大降低。
[289]在另一方面，系统地实施连接重装配的方法。例如，实施本方法来产生系 统区分化的子代分子文库，划分开的文库可以系统地进行筛选，例如逐个的筛选。 换句话说，通过选择性的和审慎的应用特定的核酸构建模块，再加上选择性的和 审慎的应用连续的分步骤的装配反应，本发明使得这样一种设计可以实现，即可 以在各个反应容器中制备出各自特定的一系列子代产物。这就允许进行系统的检 查和筛选步骤。因此，这些方法允许对很可能是很大数目的子代分子以较小的组 进行系统性检测。由于其具有以高度变通而又彻底和系统的方式进行嵌合化反应 的能力，尤其是当祖先分子之间具有低水平的同源性时，所以这些方法可以产生 包括很大数目的子代分子的文库(或者一套分子)。由于该连接重装配发明的非 随机性，产生的子代分子在一个方面包括具有依设计而选择的全部装配序列的最 终嵌合核酸分子的文库。饱和诱变和优化的定向进化方法也可以用于产生不同的 子代分子种类。可以理解，本发明在分界点的选择、核酸构建模块的大小和数目 以及偶联的大小和设计方面提供了选择和控制的自由度。更进一步理解的是，本 发明的操作对分子间同源性的要求被大大放松了。实际上，甚至可以在有较少分 子间同源性或者没有分子间同源性的区域选择区别点。例如，由于密码子的摆动 性，即，密码子的简并，核苷酸的替代可以被引入到核酸构建模块中而并不改变 在相应的祖先模板中起初编码的氨基酸。可选择地，密码子可以被改变以至于原 先的氨基酸的编码被改变。本发明提供了这样的替换，它们能够被引入到核酸构 建模块中，由此增加分子间同源的分界点的发生率，这样就允许在构建模块之间 实现更多数目的偶联，这又使得更多数目的子代嵌合分子产生。
[290]另一方面，构件产生的步骤的合成特性允许设计和引入核苷酸(例如，一 个或者多个核苷酸，其可以是，例如密码子或内含子或者调控序列)，其以后可 以任选地在体外过程(例如，通过诱变)或者体内过程(例如，通过利用宿主微 生物的基因剪切能力)中被除去。应该理解的是，在许多情况中，除了产生适用 的分界点的潜在好处之外，由于许多别的原因，这些核苷酸的引入也是理想的。 [291]一方面，核酸构件被用于引入内含子。因此，功能性的内含子被引入进根 据在此描述的方法产生的人造基因中。人工引入的内含子可以在宿主细胞中发挥 基因剪切的功能，作用方式如同天然产生的内含子发挥基因剪切的功能的方式。 优化的定向进化系统
[292]本发明提供了一种非随机的基因修改系统，命名为“优化的定向进化系统”， 其可以用来产生具有新的或者改变的特性的磷脂酶。优化的定向进化涉及还原性 重配(reductive reassortment)、重组和选择的重复循环应用，其使得可以通过重 组实现核酸的定向分子进化。优化的定向进化允许产生大量的进化出的嵌合序列， 其中产生的群体显著地富集了具有预定数目遗传交换事件(crossover events)的序 列。
[293]遗传交换事件是在嵌合序列中的一个点，在这里，发生从一个亲本变异体 到另一个亲本变异体的序列转换。这样的点一般在来自两个亲本的寡核苷酸连接 在一起形成单个序列的连接处。这一方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，这 样，序列的最终嵌合群体富集了所选择数目的遗传交换事件。这也提供了对选择 具有预定数目的遗传交换事件的嵌合突变体的更多控制。
[294]此外，这一方法与其他系统相比，提供了一种用于探究巨大数量的可能的 蛋白变异体的方便手段。以前，例如，如果在反应中产生了1013个嵌合分子，测 试这样大数目的嵌合突变体的特定活性将会非常困难。此外，子代群体的相当部 分将具有很高数目的遗传交换事件，其中得到的蛋白不大可能具有增高水平的特 定活性。通过应用这些方法，嵌合分子的群体可以富集那些含有特定数目的遗传 交换事件的变异体。因此，尽管在反应中可以仍然产生1013嵌合分子，但是所选 择的用于进一步分析的每一个分子很可能具有，例如，仅仅三个遗传学交换事件。 因为得到的子代群体可以偏向于具有预定数目的遗传交换事件，所以嵌合分子之 间的功能多样性的界线减少。当计算出来自最初的亲本多核苷酸中的哪一个可能 影响到特定的性质时，这时便提供了更加可控制的变量。
[295]产生嵌合子代多核苷酸序列的一个方法是产生对应于每一个亲本序列的 片段或者部分的寡核苷酸。每一个寡核苷酸优选地包括重叠的独特区域，这样把 所述寡核苷酸混合在一起，得到具有以正确顺序装配的每一寡核苷酸片段的新的 变异体。在USSN 09/332,835中可以发现另外的信息。对应于每一个亲本变异体产 生的寡核苷酸数目与在最终产生的嵌合分子中得到的遗传学交换的总的数目具有 一定的关系。例如，为了发现具有如在高温下的更高活性的嵌合变异体，可以提 供三个亲本核苷酸序列变异体来进行连接反应。作为一个例子，对应于每一个亲 本变异体的每一部分可以产生一套50个寡核苷酸序列。因此，在连接重装配过程 中，在每一个嵌合序列中有可能有超过50个交换事件。产生的每一个嵌合多核苷 酸都以交替的顺序含有来自各个亲本变异体的寡核苷酸的可能性很低。如果每一 个寡核苷酸片段以同样的摩尔数量存在于连接反应中，有可能在一些位置中来自 同一亲本多核苷酸的寡核苷酸将相互一个个连接，而不导致遗传交换事件。如果 在这一例子的任何连接步骤中，来自每一个亲本的每一个寡核苷酸的浓度保持不 变，那么将会有1/3的可能性(假定3个亲本)：来自同一个亲本变异体的寡核苷 酸将在嵌合序列内连接，而不产生遗传交换。
[296]相应的，可以确定概率密度函数(PDF)，以预测在一个连接反应的每一 步中可能发生的遗传交换事件的总数，其中给定了一套确定数目的亲本变异体、 对应于每种变体的寡核苷酸、以及在连接反应中的每个步骤中的每种变异体的浓 度。在确定PDF中应用到的统计学和数学在下面被描述。通过应用这些方法，可 以计算这样的概率密度函数，而且这样就富集了来源于特定连接反应的具有预定 数目的遗传交换事件的嵌合子代群体。此外，可以预先确定遗传交换事件的目标 数目，然后对该系统进行程序化，以计算在该连接反应的每一个步骤中，每种亲 本寡核苷酸的起始量，从而得到以遗传交换事件的预先确定的数目为中心的概率 密度函数。这些方法涉及还原性重配、重组和选择的重复循环应用，通过重组实 现编码多肽的核酸的定向分子进化。该系统允许产生大量的进化出的嵌合序列， 其中产生的群体显著地富集了具有预定数目遗传交换事件的序列。遗传交换事件 是在嵌合序列中的一个点，在这里，发生从一个亲本变异体到另一个亲本变异体 的序列转换。这样的点一般在来自两个亲本的寡核苷酸连接在一起形成单个序列 的连接处。这一方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，这样，序列的最终嵌合 群体富集了所选择数目的遗传交换事件。这也提供了对选择具有预定数目的遗传 交换事件的嵌合突变体的更多控制。
[297]此外，这些方法与其他系统相比，提供了一种用于探究大数量的可能蛋白 变异体空间的方便手段。通过应用在这里描述的方法，嵌合分子的群体可以富集 那些含有特定数目的遗传交换事件的变异体。因此，尽管在反应中可以仍然产生 1013个嵌合分子，但是所选择的用于进一步分析的每一个分子很可能具有，例如， 仅仅三个遗传学交换事件。因为得到的子代群体可以倾向于具有预定数目的遗传 交换事件，所以嵌合分子之间的功能多样性的界线减少。当计算出来自最初的亲 本多核苷酸中的哪一个可能影响到特定的性质时，这时便提供了更加可控制数量 的变量。
[298]一方面，该方法通过产生对应于每一个亲本序列的片段或者部分的寡核苷 酸，产生嵌合子代多核苷酸序列。每一个寡核苷酸优选地包括重叠的独特区域， 这样把所述寡核苷酸混合一起，得到具有以正确顺序装配的每一寡核苷酸片段的 新的变异体。也可参见USSN 09/332,835。
[299]对应于每一个亲本变异体产生的寡核苷酸数目与在最终产生的嵌合分子 中得到的遗传学交换的总的数目具有一定的关系。例如，为了发现具有如在高温 下的更高活性的嵌合变异体，可以提供三个亲本核苷酸序列变异体来进行连接反 应。作为一个例子，对应于每一个亲本变异体的每一部分可以产生一套50个寡核 苷酸序列。因此，在连接重装配过程中，在每一个嵌合序列中有可能有超过50个 交换事件。产生的每一个嵌合多核苷酸都以交替的顺序含有来自各个亲本变异体 的寡核苷酸的可能性很低。如果每一个寡核苷酸片段以同样的摩尔数量存在于连 接反应中，有可能在一些位置中来自同一亲本多核苷酸的寡核苷酸将相互一个个 连接，而不导致遗传交换事件。如果在这一例子的任何连接步骤中，来自每一个 亲本的每一个寡核苷酸的浓度保持不变，那么将会有1/3的可能性(假定3个亲本)： 来自同一个亲本变异体的寡核苷酸将在嵌合序列内连接，而不产生遗传交换。
[300]因此，可以确定概率密度函数(PDF)，以预测在一个连接反应的每一步 中可能发生的遗传交换事件的总数，其中给定了一套确定数目的亲本变异体、对 应于每种变体的寡核苷酸、以及在连接反应中的每个步骤中的每种变异体的浓度。 在确定PDF中应用到的统计学和数学在下面被描述。可以计算这样的概率密度函 数，而且这样就富集了来源于特定连接反应的具有预定数目的遗传交换事件的嵌 合子代群体。此外，可以预先确定遗传交换事件的目标数目，然后对该系统进行 程序化，以计算在该连接反应的每一个步骤中，每种亲本寡核苷酸的起始量，从 而得到以遗传交换事件的预先确定的数目为中心的概率密度函数。
确定遗传交换事件
[301]本发明的实施方案包括系统和软件，它们接受所需的遗传交换的概率密度 函数(PDF)、待重新装配的亲本基因的数目以及重新装配的片段数目作为输入量。 该程序输出“片段PDF”，它可以用于确定用于获得重新装配的基因和那些基因的 估计的遗传交换PDF的具体方法。于此说明的过程优选地在(The Mathworks，Natick，Massachusetts)中进行，是一种用于技术计算的程序 语言和开发环境。
迭代过程(iterative process)
[302]在实践本发明时，这些过程可以迭代反复。例如，对产生改变的磷脂酶表 型的核酸(或者，所述核酸)进行鉴定，重新分离，再修饰，再检测活性。此过 程可以反复重复，直到得到所需的表型。例如，整个生物化学的合成代谢或者分 解代谢途径可以在细胞中设计，包括磷脂酶活性。
[303]类似地，如果确定了特定的寡核苷酸对于所有所需的性质(如，新的磷脂 酶表型)没有影响，那么就可以合成包括这段序列在内的更大的亲本寡核苷酸， 从而将作为变量的这段序列去除。由于将这段序列合并到更大的序列中，可以避 免任何遗传交换事件，所以在子代多核苷酸中，这一序列不再有任何变异。确定 哪些寡核苷酸与所需的性质最有关系，以及哪些与所需的性质无关的重复实践， 可以更有效地探寻可能提供特定性质或者活性的所有蛋白变异体。
体内重排
[304]分子的体内重排用在本发明的提供本发明的多肽如抗体、磷脂酶和类似物 的变异体的方法中。体内重排可以利用细胞重组多聚体的天然特性来进行。尽管 体内的重组提供了实现分子多样性的主要的天然途径，遗传重组仍然是一种相对 复杂的过程，其涉及1)同源性识别；2)链切割，链侵入，和导致产生重组交叉 (recombination chiasma)的代谢步骤；和最后3)交叉消除至分离的重组分子。 交叉的形成需要同源序列的识别。
[305]一方面，本发明提供由至少第一个多核苷酸和第二个多核苷酸产生杂合多 核苷酸的方法。本发明可以用于通过将共有具部分序列同源性的至少一个区域的 至少第一多核苷酸和第二多核苷酸引入到合适的宿主细胞中而产生杂合多核苷 酸。该具部分序列同源性的区域促进导致产生杂合多核苷酸的序列识别的过程。 正如在此使用的，术语“杂合多核苷酸”是由本发明的方法产生的任何核苷酸序列， 含有从至少两个最初多核苷酸序列得到的序列。这样的杂合多核苷酸可以由促进 DNA分子间的序列整合的分子间重组事件产生。另外，这样的杂合多核苷酸可以 由利用重复序列以改变DNA分子中的核苷酸序列的分子内还原性重配过程产生。 产生序列变异体
[306]本发明也提供使用本发明的核酸和多肽产生本发明的核酸和磷脂酶序列 变异体，或者分离磷脂酶例如磷脂酶的序列变异体的方法。一方面，本发明提供 本发明的磷脂酶基因的变异体，所述基因可以使用任何方法改变，包括，例如随 机方法，或者非随机方法，或者“定向进化”方法，如上描述。
[307]分离的变异体可以是天然发生的。变异体也可以体外产生。变异体可以使 用遗传工程技术，例如定点诱变，随机化学诱变，核酸外切酶III缺失程序和标准 克隆技术产生。做为选择，这样的变异体，片段，类似物或衍生物可以使用化学 合成或者修饰程序产生。产生变异体的别的方法也为本领域技术人员所熟悉。这 些方法包括修饰从天然分离物得到的核酸序列，产生编码具有特性的多肽的核酸 的程序，所述特性增加它们在工业或实验室应用中的价值。在这些程序中，产生 并且表征大量与从天然分离物得到的序列相比具有一个或多个核苷酸差异的变异 体序列。这些核苷酸差异可以导致产生相对于由天然分离物的核酸编码的多肽而 言的氨基酸变化。
[308]例如，变异体可以使用易错PCR产生。在易错PCR中，PCR在DNA聚 合酶复制保真度低的情况下进行，这样在PCR产物的全长中获得高比率的点突变。 易错PCR在，例如Leung，D.W.，等，Technique，1：11-15，1989)和Caldwell，R.C.& Joyce G.F.，PCR Methods Applic.，2：28-33，1992中有描述。简要而言，在这些程序 中，为了在全长的PCR产物中得到高比率的变突变，将待诱变的核酸与PCR引物、 反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶和合适浓度的dNTP混合。例如，反应 使用20毫微微摩尔(fmoles)待诱变的核酸，每种PCR引物30皮摩尔，反应缓 冲液包括50mM KCl，10mM Tris HCl(PH8.3)和0.01％明胶，7mM MgCl2，0.5mM MnCl2，5单位的Taq聚合酶，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP和1mM dTTP。 PCR进行30个循环，每个循环为94℃ 1分钟，45℃ 1分钟，72℃ 1分钟。然而， 应该理解地是，这些参数可以适当的改变。将诱变的核酸克隆进入合适的载体中， 并评估诱变的核酸编码的多肽的活性。
[309]变异体也可以使用寡核苷酸定向诱变产生，在感兴趣的任何克隆DNA中 产生位点专一的变异。寡核苷酸诱变在，例如，Reidhaar-Olson(1988)Science 241：53-57中有描述。简要地，在这些程序中，合成待被引入到克隆的DNA中的 许多具有一个或多个突变的双链寡核苷酸，并且插入到待诱变的克隆DNA中。回 收含有经诱变的DNA的克隆，并评定经诱变的DNA编码的多肽的活性。
[310]另一个产生变异体的方法是装配PCR。装配PCR涉及由小的DNA片段的 混合物装配出PCR产物。在同一个容器中平行进行很多不同的PCR反应，其中， 一个反应的产物用作另外一个反应的引物。装配PCR在例如美国专利5,965,408 中有说明。
[311]还有一个产生变异体的方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中，由于 基于序列同源性的DNA分子的随机片段化，在不同的但是高度相关的DNA序列 的DNA分子之间，在体外强行发生同源重组，然后通过PCR反应的引物延伸， 遗传交换得到固定。有性PCR诱变在，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Asad.Sci. USA 91：10747-10751中描述。简要地说，在这样的程序中，多个待重组的核酸用 DNase消化，产生具有50到200个核苷酸的平均大小的片段。纯化具有所需的平 均大小的片段，重悬于PCR混合物中。在有利于核酸片段重组的条件下进行PCR 反应。例如，PCR可以这样进行：将纯化的片段重悬于含有0.2mM的各种dNTP、 2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM的Tris-HCl，pH9.0以及0.1％的Triton X-100 的溶液中，其浓度为10-30ng/μl，以100：1的比例在反应混合物中加入2.5Units 的Taq聚合酶，用以下的条件进行PCR：94℃ 60秒，94℃ 30秒，50-55℃ 30秒， 72℃ 30秒(30-45次)，然后72℃进行5分钟。然而，这些参数可以进行适当的 变化。在一些方面，寡核苷酸可以包括在该PCR反应中。在其它的一些方面，DNA 聚合酶I的Klenow片段可以用于第一轮PCR反应，而Taq聚合酶可以用于后续 的PCR反应。重组序列经过分离并评估它们编码的多肽的活性。
[312]变异体也可以通过体内诱变产生。在一些方面，感兴趣的序列中的随机突 变通过在细菌菌株中扩增该感兴趣的序列而产生，所述细菌菌株例如在一个或者 多个DNA修复途径中具有突变的大肠杆菌菌株。这样的“突变”菌株具有比野生型 亲本更高的随机突变率。在一种这样的菌株中进行DNA的繁殖将最终产生DNA 中的随机突变。适于在体内诱变中应用的突变菌株在，例如，PCT公开号WO 91/16427中有描述。
[313]变异体也可以通过应用盒式诱变产生。在盒式诱变中，双链DNA分子的 一个小的区域被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒子”替代。所述寡核苷酸一般 含有完全和/或部分随机的天然序列。
[314]递归整体诱变也可以用于产生变异体。递归整体诱变是一种用于蛋白质工 程(蛋白突变)的算法，它的开发是为了产生表型相关的突变体组成的多样性群 体，其成员在氨基酸序列上有所不同。该方法应用反馈机制来控制连续多轮的组 合式盒式诱变。递归整体诱变在如Aikin(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89： 7811-7815中有描述。
[315]在一些方面，用指数整体诱变产生变异体。指数整体诱变是一个用于产生 具有较高百分比的独特且具功能性的突变体的组合文库的过程，其中一小组的残 基被随机化，同时在每一个被改变的位置确认导致功能性蛋白的氨基酸。指数整 体诱变在如，Delegrave(1993)Biotechnology Res.11：1548-1552中有描述。随机和 定点诱变在如，Amold(1993)Current Opinion in Biotechnology 4：450-455中有描述。
[316]在一些方面，变异体利用重排方法产生，其中编码不同的多肽的多个核酸 的部分被融合在一起，产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列，其描述于美国专利 5,965,408；5,939,250中。
[317]本发明也提供本发明的多肽变异体，包括其中一个或多个氨基酸残基(例 如，本发明的示范性多肽的氨基酸残基)被保守的或不保守的氨基酸残基(例如， 保守的氨基酸残基)取代，这样的取代的氨基酸残基可以是或者不是由遗传密码 编码的氨基酸残基。保守的取代是多肽中给定的氨基酸被具有相似特征的另一个 氨基酸取代。因此，本发明的多肽包括本发明的序列的保守取代，包括但不局限 于以下取代：脂肪族氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸被另一个 脂肪族氨基酸取代；丝氨酸被苏氨酸取代，或者相反；酸性残基例如天冬氨酸和 谷氨酸被另一酸性残基取代；具有酰胺基团的残基，例如天冬酰胺和谷氨酰胺被 另一具有酰胺基团的残基取代；碱性残基例如赖氨酸和精氨酸与另一碱性残基互 换；芳香族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸被另一芳香族残基取代。其他变异体是本 发明的多肽的一个或多个氨基酸残基包括取代基团的那些变异体。
[318]包括在本发明范围中的其他变异体是多肽与另一化合物，例如可以增加多 肽半寿期的化合物，例如聚乙二醇缔合的那些变异体。
[319]在本发明范围内的另外的变异体中，另外的氨基酸融合到多肽上，如前导 序列、分泌序列、蛋白原序列(proprotein sequence)或者有利于纯化、富集或者使所 述多肽稳定的序列。
[320]在一些方面，发明的多肽变异体、片段、衍生物和类似物保持与示范性多 肽相同的生物功能或活性，例如在此描述的磷脂酶活性。另一些方面，变异体、 片段、衍生物或类似物包括原蛋白(proprotein)，这样，变异体，片段，衍生物或类 似物可以通过切割原蛋白部分产生活性多肽被而活化。
密码子优化，实现宿主细胞中高水平的蛋白表达
[321]本发明提供修饰编码磷脂酶的核酸，以便改变密码子使用(codon usage) 的方法。一方面，本发明提供修饰编码磷脂酶的核酸中的密码子，以增加或降低 其在宿主细胞中的表达的方法。本发明也提供了编码经修饰而增强其在宿主细胞 中的表达的磷脂酶的核酸、经过这样的修饰的磷脂酶，和制备经修饰的磷脂酶的 方法。该方法包括确定编码磷脂酶的核酸中“非-偏爱的”或者“较不偏爱的”密码子， 并且用编码同样氨基酸的“偏爱的密码子”作为替换密码子替换一个或者多个这样 的非-偏爱或者较不偏爱的密码子，并且在所述核酸中至少一个非-偏爱或者较不偏 爱的密码子被编码相同氨基酸的偏爱密码子替换。偏爱密码子是在宿主细胞基因 的编码序列中被优先使用的密码子，而不偏爱的或者较不偏爱的密码子是指在宿 主细胞基因的编码序列中较少使用的密码子。
[322]用于表达本发明的核酸、表达序列盒以及载体的宿主细胞包括细菌、酵母、 真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，本发明提供了在所有这些细 胞中优化密码子使用的方法、密码子被改变的核酸，以及由所述的密码子被改变 的核酸编码的多肽。示范性的宿主细胞包括革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌；革兰 氏阳性细菌，芽孢杆菌属(Bacillus)(蜡状芽孢杆菌(B.cereus))或链霉菌、加氏 乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球 菌(Lactococcus cremoris)、枯草芽孢杆菌。示范性的宿主细胞也包括真核生物体， 如，各种酵母，如酵母属的种(Saccharomyces sp.)，包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵 母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉森酵母 (Hansenula polymorpha)、黑曲霉(Aspergillus niger)和哺乳动物细胞和细胞系 以及昆虫细胞和细胞系。因此，本发明也包括在这些生物体和生物物种中的表达 被优化的核酸和多肽。
[323]例如，从细菌细胞中分离的编码磷脂酶的核酸密码子被修饰，以便该核酸 在不同于获得该磷脂酶的细菌的细菌细胞、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞或 者哺乳动物细胞中优化表达。优化密码子的方法在本领域是已知的，参见如，美 国专利5,795,737；Baca(2000)Int.J.Parasitol.30：113-118；Hale(1998)Protein Expr. Purif.12：185-188；Narum(2001)Inect.Immun.69：7250-7253。也参见Narum(2001) Infect.Immun.69：7250-7253，描述了在鼠系统中优化密码子；Outchkourov(2002) Protein Expr.Purif.24：18-24，描述了在酵母中优化密码子；Feng(2000)Biochemistry 39：15399-15409，描述了在大肠杆菌中优化密码子；Humphreys(2000)Protein Expr. Purif 20：252-264，描述了大肠杆菌中导致分泌的优化密码子使用。
转基因非-人类的动物
[324]本发明提供了包含本发明的核酸、多肽、表达序列盒或者载体或者被转染 的细胞或者被转化的细胞的转基因非人类动物。转基因非人动物可以是，例如， 包括本发明的核酸的山羊、兔、绵羊、猪、牛、大鼠和小鼠。这些动物可以作为， 例如体内研究磷脂酶活性的模型使用，或者体内筛选磷脂酶活性的调节物的模型 使用。欲在转基因非人动物中表达的多肽的编码序列可以设计为组成型的，或者 组织特异性、发育特异性或者诱导转录调控因子的控制之下。转基因非人动物可 以用本领域已知的任何方法设计和产生；参见，例如美国专利6,211,428；6,187,992； 6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；5,892,070； 5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，这些专利描 述了产生和使用转化的细胞和卵，以及转基因小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪和母牛。 也参见，例如Pollock(1999)J.Immunol.Methods 231：147-157，描述在转基因 产奶动物的奶中产生重组蛋白；Baguisi(1999)Nat.Biotechnol.17：456-461，描 述转基因山羊的产生。美国专利6,211,428，描述了制备和应用在其脑中表达含有 DNA序列的核酸构建物的转基因非人类哺乳动物。美国专利5,387,742，描述了把 克隆的重组子或者合成的DNA序列注射至鼠受精卵中，移植注射的卵至假孕的雌 鼠中，并且生长成为转基因鼠，它的细胞表达与阿尔茨海默氏病的病理相关的蛋 白。美国专利6,187,992，描述了制备和应用转基因鼠，它的基因组具有编码淀粉 样蛋白原(APP)的基因的断裂。
[325]“基因敲除动物(knockout animals)”也可以用于实践本发明的方法。例如， 在一方面，本发明的转基因动物或者修饰的动物包括“基因敲除动物”，如“基因敲 除鼠”，它被工程改造，不会表达或不能表达磷脂酶。
转基因植物和种子
[326]本发明提供了包含本发明的核酸、多肽(例如磷脂酶)、表达序列盒或者 载体或者被转染的细胞或者被转化的细胞的转基因植物和种子。本发明也提供了 包含本发明的核酸和/或多肽(例如磷脂酶)的植物产物，如油、种子、叶、提取 物以及类似物。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或者单子叶的(单子 叶植物)。本发明也提供了制备和应用这些转基因植物和种子的方法。表达本发 明的多肽的转基因植物或者植物细胞可以按照本领域任何已知的方法构建。参见 例如，美国专利6,309,872。
[327]本发明的核酸和表达构建物可以通过任何方式导入到植物细胞中。例如， 核酸或者表达构建物可以导入到所需的植物宿主的基因组中，或者，核酸或者表 达构建物可以是附加体。可以导入到所需植物的基因组中，这样宿主的磷脂酶的 产生被内源性的转录或者翻译控制元件调控。本发明也提供了“基因敲除植物”，其 中例如同源重组导致的基因序列的插入破坏了内源性基因的表达。产生“基因敲除” 植物的方法在本领域是已知的，参见，如，Strepp(1998)Proc Natl.Acad.Sci.USA 95：4368-4373；Miao(1995)Plant J 7：359-365。参见下面的转基因植物的讨论。
[328]本发明的核酸可以将所需的性质赋予基本上任何植物，例如，含油籽的植 物，如水稻，大豆，油菜籽，向日葵子，芝麻和花生。为了优化或改变宿主磷脂 酶的表达，本发明的核酸可以用于控制植物代谢途径。这可以改变植物中磷脂酶 的活性。作为选择，本发明的磷脂酶可以用于产生转基因植物，以产生天然情形 下不由此植物产生的化合物。这可以降低生产成本或产生新的产品。
[329]一方面，产生转基因植物的第一步骤涉及制备在植物细胞中表达的表达构 建物。这些技术是本领域熟知的。它们可以包括选择和克隆启动子、便于核糖体 有效结合mRNA的编码序列以及选择适当的基因终止序列。典型的组成型启动子 是来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S，它一般在植物中导致高水平的表达。其它的 启动子更具特异性，并且对植物的内部或者外部环境中的暗示有反应。典型的光 诱导的启动子是来自编码主要叶绿素a/b结合蛋白的cab基因的启动子。
[330]一方面，修饰核酸来实现在植物细胞中更强的表达。例如，本发明的序列 很可能具有比在植物中更高的A-T核苷酸对百分率，而一些植物优选G-C核苷酸 对。因此，编码序列中的A-T核苷酸可以用G-C核苷酸取代，而不显著改变氨基 酸序列，可以增强在植物细胞中基因产物的产生。
[331]为了鉴定已经成功整合了转移基因的植物细胞或者组织，可以将选择性标 记基因加入到基因构建物中。这可能是必要的，因为在植物细胞中完成基因的整 合和表达是一个小概率事件，仅仅在较少百分率的靶组织和细胞中发生。选择性 标记基因编码对试剂有抗性的蛋白，所述试剂一般对植物有毒性，如抗生素或者 除草剂。当在含有适当的抗生素或者除草剂的培养基上生长时，只有已经整合了 选择性标记基因的植物细胞可以成活。与其它的插入基因一样，为了有恰当的功 能，标记基因也需要启动子和终止序列。
[332]一方面，转基因植物或种子制备方法包括将发明的序列，和任选地，标记 基因整合到目标表达构建物(例如，质粒)中，同时定位启动子和终止子序列。 这可以包括将修饰的基因通过合适方法转入植物中。例如，构建物可以应用如电 穿孔和微注射植物细胞原生质体的技术直接引入到植物细胞的基因组DNA中，或 者构建物可以应用弹道方法(ballistic methods)，如，DNA微粒轰击(DNA particle bombardment)的方法直接引入到植物组织中。例如，参见如，Christou(1997) Plant Mol.Biol.35：197-203；Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6：17-30；Klein(1987) Nature 327：70-73；Talcumi(1997)Genes Genet.Syst.72：63-69，讨论了应用微粒 轰击引入转基因到小麦中；Adam(1997)如上，应用微粒轰击将YACs引入至植 物细胞中。例如，Rinehart(1997)如上，用微粒轰击来产生转基因棉花植物。用 于加速微粒的设备在美国专利5,015,580中有说明；而且，可以通过商业渠道获得 BioRad(Biolistics)PDS-2000微粒加速设备；也参见，John，美国专利5,608,148； 和Ellis，美国专利5,681,730，描述了微粒介导的裸子植物的转化。
[333]一方面，原生质体可以被固定，并用核酸例如表达构建物注射。尽管源自 原生质体的植物再生对于谷类并不容易，但是应用体细胞胚胎发生由原生质体来 源的愈伤组织进行植物再生在豆类中是有可能的。机化组织可以使用基因枪技术 用裸DNA转化，其中的DNA被包裹于钨微射弹(tungsten microprojectiles)上， 射出物的大小为细胞大小的1/100，它携带DNA深入到细胞和细胞器中。转化的 组织然后被诱导再生，一般通过体细胞胚胎发生技术。这一技术已经在包括玉米 和水稻的几个谷类物种中成功应用。
[334]核酸，例如表达构建物也可以应用重组病毒引入到植物细胞中。植物细胞 可以用病毒载体转化，如，烟草花叶病毒衍生的载体(Rouwendal(1997)Plant Mol. Biol.33：989-999)，参见Porta(1996)“Use of viral replicons for the expression of genes in plants”，Mol.Biotechnol.5：209-221。
[335]可选择地，核酸，如表达构建物，可以与合适的T-DNA旁侧区域组合， 并导入到传统的根癌农杆菌宿主载体中。根癌农杆菌宿主的毒力功能将在植物细 胞受该细菌感染时，引导构建物和邻近的标记插入至植物细胞DNA中。根癌农杆 菌介导的转化技术，包括disarming和二元载体的应用，在科学文献中有详细的说 明。参见，如，Horsch(1984)Science 233：496-498；Fraley(1983)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 80：4803(1983)；Gene Transfer to Plants，Potrykus，ed.(Springer-Verlag， Berlin 1995)。根癌农杆菌细胞的DNA被包含在细菌染色体中，也被包含在称为 Ti(肿瘤诱导)质粒的另一种结构中。Ti质粒含有一段命名为T-DNA的DNA(～20 kb长)和一系列毒力(virulence)基因，T-DNA在感染过程中被转移到植物细胞 中，毒力基因则引导所述感染过程。根癌农杆菌可以通过伤口感染植物：当植物 的根或者茎受伤，它释放某种化学信号，作为对这种信号的响应，根癌农杆菌的 毒力基因被激活，并引发一系列从Ti质粒转移T-DNA至植物染色体所必需的事 件。T-DNA然后通过伤口进入到植物细胞。一个推测是T-DNA一直等到植物DNA 复制或者转录，然后将自身插入到暴露的植物DNA中。为了应用根癌农杆菌作为 转基因载体，必须去除T-DNA的肿瘤诱导部分，而保留T-DNA的边界区域和毒 力基因。转基因然后插入到T-DNA的边界区域之间，从这里转移到植物细胞并且 整合到植物的染色体中。
[336]本发明提供了应用本发明的核酸进行包括重要的谷类植物在内的单子叶 植物的转化，参见Hiei(1997)Plant Mol.Biol.35：205-218。也参见如，Horsch，Science (1984)233：496；Fraley(1983)Proc.Natl Acad.Sci USA 80：4803；Thykjaer(1997) 如上；Park(1996)Plant Mol.Biol.32：1135-1148，讨论了将T-DNA整合到基因 组DNA中。也参见D′Halluin，美国专利5,712,135，描述了包含在谷类或者其它 单子叶植物的细胞中的具有功能性的基因的DNA的稳定整合过程。
[337]一方面，第三步可以包括能够将整合的靶基因传递至下一代的完整植物的 选择和再生。这样的再生技术依赖于对组织培养生长培养基中的某些植物激素的 操作，典型地，依赖于与所需的核苷酸序列一同引入的杀虫剂和/或除草剂标记。 源自培养的原生质体的植物再生在以下文献中有说明，Evans等，Protoplasts lsolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，124-176页，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，21-73页，CRC Press，Boca Raton，1985。再生也可以从植物愈伤组织、 外植体、器官或者其中的一部分得到。这样的再生技术在Klee(1987)Ann.Rev.of plant Phys.38：467-486中有概括性的说明。为了从转基因组织如未成熟的胚胎获得 整个植物，它们可以在一系列含有营养物和激素的培养基中在可控制的环境条件 下培养，即称为组织培养的过程。一旦整个植物再生并且产生种子，便开始评价 子代。
[338]在表达序列盒稳定地整入到转基因植物之后，其可以通过有性杂交(sexual crossing)引入到其它的植物中。可以应用任何的标准繁殖技术，这依赖于待杂交 的物种。因为本发明核酸的转基因表达导致表型变化，包含本发明的重组核酸的 植物可以和另一植物有性杂交而得到最终产物。因此，本发明的种子可以来自本 发明的两个转基因植物的杂交，或者来自本发明的植物和其它植物的杂交。当两 个亲本植物都表达本发明的多肽(如，磷脂酶)时，所需的效应(例如，表达本 发明的多肽来产生一种开花行为被改变的植物)可以被增强。所需的效应通过标 准的繁殖方法传到以后的植物世代中。
[339]本发明的核酸和多肽被表达于或者插入到任何植物或者种子中。本发明的 转基因植物可以是双子叶植物或者单子叶植物。本发明的单子叶转基因植物的例 子是草，如牧草(蓝草，早熟禾属Poa)，饲料草如羊茅属，黑麦草属，温带草， 如翦股颖属(Agrostis)，和谷类，如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、蜀黍和 玉米(corn)。本发明的双子叶转基因植物的例子是烟草、豆类，如羽扇豆、马铃 薯、甜菜、豌豆、蚕豆和大豆，以及十字花科植物(Brassicaceae属)，如花椰菜， 油菜籽，和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。这样，本发明的 转基因植物和种子包括很宽范围的植物，包括，但不限于，以下属的种：腰果属 (Anacardium)、落花生属(Arachis)、天冬属(Asparagus)、茄属(Atropa)、 燕麦属(Avena)、油菜属(Brassica)、柑桔属(Citrus)、Citrullus、辣椒属(Capsicum)、 Carthamus、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属 (Cucurbita)、Daucus、Elaeis、Fragaria、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、 向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、 莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、 番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜 蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、Olea、Oryza、Panieum、Pannisetum、 鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、Pistachia、Pisum、梨属(Pyrus)、李 属(Prunus)、萝卡属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、 千里光属(Senecio)、Sinapis、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、Theobromus、 Trigonella、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、Vitis、Vigna、和玉蜀黍属 (Zea)。
[340]在可供选择的实施方式中，本发明的核酸在植物(例如，转基因植物)， 如含油籽植物，例如水稻、大豆、油菜籽、向日葵子、芝麻和花生中表达。本发 明的核酸可以在含纤维细胞的植物，包括例如，棉花、丝棉树(木棉、吉贝木棉)、 沙漠柳、石炭酸灌木、winterfat、balsa、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、马尼 拉剑麻和亚麻中表达。在可供选择的实施方式中，本发明的转基因植物可以是棉 属(Gossypium)的成员，包括任何棉(Gossypium)种的成员，如，亚洲棉(G. arboreum)、草棉(G.herbaceum)、海岛棉(G.barbadense)和陆地棉(G.hirsutum)。 [341]本发明也提供用于大量生产本发明的多肽(例如磷脂酶或抗体)的转基因 植物。例如，参见Palingren(1997)Trends Genet.13：348；Chong(1997)Transgenic Res.6：289-296(利用植物生长素诱导的双向甘露氨酸合成酶(mas1′，2′)启动子， 应用根癌农杆菌介导的叶片圆盘(leaf disc)转化方法，在转基因马铃薯植物中生 产人乳汁蛋白β-酪蛋白)。
[342]应用已知的程序，技术人员可以通过检测在转基因植物中转基因mRNA 或者蛋白的增加或者减少来筛选本发明的植物。检测和定量mRNA或者蛋白的方 法是本领域熟知的。
多肽或肽
[343]本发明提供了与本发明的示范性序列例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、 SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、 SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、 SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、 SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172，or SEQ ID NO：174具有序列同一性(例 如，至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60 ％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性)的分离 的或重组的多肽。如以上讨论的，同一性可以在多肽的全长范围内，或者，同一 性可以在其子序列，例如，至少大约50、60、70、80、90、100、150、200、250、 300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多残基的范围内。本发明 的多肽也可以比示例性多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SBQ ID NO：6、 SEQ ID NO：8等)的全长要短。在可选择的实施方案中，本发明提供大小在大约5 到多肽全长范围的多肽(肽，片段)，所述多肽例如酶，如磷脂酶，例如，磷脂 酶；示例性大小为大约5、10、15、20、25、30、35，40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400或更多残 基，例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8等的示例性 磷脂酶的连续残基。本发明的肽可以用作，例如，标记探针、抗原、耐受原、基 序、磷脂酶活性位点、结合结构域、调控结构域和类似物。
[344]一方面，多肽具有磷脂酶活性，例如，切割甘油磷酸酯键，水解磷酸酯键 的能力，包括马铃薯块茎蛋白(patatin)，脂酰水解酶(LAH)，磷脂酶A，B，C 和/或磷脂酶D活性，或它们的任意组合。
[345]在可选择的方面，本发明的示例性多肽具有磷脂酶活性，信号序列位置、 最初来源，如在下表1中所阐述。为了帮助阅读此表，例如在第一排，其中SEQ ID NO：143、144指具有在SEQ ID NO：144中阐述的序列的多肽，和由SEQ ID NO：143 编码的多肽，它们具有PLA-特异性PLA活性，最初分离自未知来源；另一个例子 在SEQ ID NO：167，168行，其中167、168指具有在SEQ ID NO：168中阐述的序列 的多肽，和由SEQ ID NO：167编码的多肽，它们具有磷脂酸磷酸酶活性，信号序 列在位置1至30(“AA1-30”指氨基酸残基1至30，等等)，即 MARSWKWRPLLSSFLLVSLAPFSTSVPCFK，最初分离自未知来源。本发明提供 也包含信号序列的肽，和嵌合多肽，其中所述肽和嵌合多肽包含表1中所阐述的 信号序列，如下面所述。
表1
  SEQ ID NO： 酶类型 信号 序列 位置 (AA＝ 氨基 酸) 信号(AA) 来 源 143， 144 PA-特异 性PLA 未 知 25，26 Patatin 未 知 77，78 Patatin 未
  知 35，36 Patatin 未 知 125， 126 Patatin 未 知 135， 136 Patatin 未 知 99，100 Patatin 未 知 65，66 Patatin 未 知 87，88 Patatin 未 知 86，87 Patatin 未 知 45，46 Patatin 未 知 59，60 Patatin 未 知 13，14 Patatin 未 知 71，72 Patatin 未 知 55，56 Patatin 未 知 33，34 Patatin 未 知 91，92 Patatin 未 知 103， 104 Patatin 未 知 11，12 Patatin 未 知 17，18 Patatin 未 知
  95，96 Patatin 未 知 43，44 Patatin 未 知 27，28 Patatin 未 知 131， 132 Patatin 未 知 127， 128 Patatin 未 知 133， 134 Patatin 未 知 137， 138 Patatin 未 知 165， 166 Patatin 未 知 167， 168 磷脂酸磷 酸酶 AA1-30 MARSWKWRPLLSSFLLVSLAPFSTSVPCF K 未 知 169， 170 磷脂酸磷 酸酶 未 知 171， 172 磷脂酸磷 酸酶 未 知 173， 174 磷脂酸磷 酸酶 未 知 111， 112 磷脂酰肌 醇PLC AA1-16 MGAGAILLTGAPTASA 细 菌 107， 108 磷脂酰肌 醇PLC AA1-23 MSNKKFILKLFICSTILSTFVFA 未 知 109， 110 磷脂酰肌 醇PLC AA1-23 MSNKKFILKLFICSTILSTFVFA 未 知 113， 114 磷脂酰肌 醇PLC AA1-23 MSNKKFILKLFICSTILSTFVFA 未 知 117， 118 磷脂酰肌 醇PLC AA1-23 MNNKKFILKLFICSMVLSAFVFA 未 知 119， 120 磷脂酰肌 醇PLC AA1-23 MNNKKFILKLFICSMVLSAFVFA 未 知
  醇PLC 知 115， 116 磷脂酰肌 醇PLC AA1-23 MNNKKFILKLFICSMVLSAFVFA 未 知 121， 122 磷脂酰肌 醇PLC AA1-23 MRNKKFILKLLICSTVLSTFVFA 未 知 141， 142 磷脂酶 未 知 155， 156 磷脂酶 AA1-36 MRTTTTNWRQIVKSLKLFLMGLCLFISASF ASSAYA 未 知 159， 160 磷脂酶 未 知 145， 146 PLA 未 知 147， 148 PLA 未 知 149， 150 PLA 未 知 151， 152 PLA 未 知 153， 154 PLA 未 知 157， 158 PLA 未 知 163， 164 PLA 未 知 101， 102 PLC AA1-39 LSLVASLRRAPGAALALALAAATLAVTAQ GATAAPAAAAA 细 菌 1，2 PLC AA1-24 MKKKVLALAAMVALAAPVQSVVFAQ 未 知 3，4 PLC AA1-24 MKRKILAIASVIALTAPIQSVAFAH 未 知 5，6 PLC AA1-24 MKRKILAIASVIALTAPIQSVAFAH 未 知 97，98 PLC AA1-25 MKRKLCTWALVTAIASSTAVIPTAAE 未 知
  7，8 PLC AA1-29 MITLIKKCLLVLTMTLLLGVFVPLQPSHAT 未 知 31，32 PLC AA1-20 MKKKLCTWALVTAISSGWAI 未 知 81，82 PLC AA1-25 MKKKLCTMALVTAISSGVVTIPTEAQ 未 知 93，94 PLC AA1-29 MITLIKKCLLVLTMTLLSGVFVPLQPSYAT 未 知 89，90 PLC AA1-25 MKKKLCTLAFVTAISSIAITIPTEAQ 未 知 123， 124 PLC AA1-24 MKKKVLALAAMVALAAPVQSVVFA 未 知 129， 130 PLC AA1-27 MKKKICTLALVSAITSGVVTIPTVASA 未 知 139， 140 PLC AA1-20 MKIKPLTFSFGLAVTSSVQA 未 知 105， 106 PLC AA1-30 MNRCRNSLNLQLRAVTVAALVVVASSAA LAW 未 知 9，10 PLC AA1-20 MKLLRVFVCVFALLSAHSKAD 未 知 47，48 PLD 未 知 15，16 PLD 未 知 41，42 PLD 未 知 23，24 PLD 未 知 51，52 PLD 未 知 53，54 PLD 未 知 19，20 PLD AA1-19 MKKTTLVLALLMPFGAASAQ 未 知 75，76 PLD 未
  知 57，58 PLD 未 知 63，64 PLD AA1-18 MKNTLILAGCILAAPAVAD 未 知 79，80 PLD AA1-23 MRNFSKGLTSILLSIATSTSAMAF 未 知 37，38 PLD AA1-23 MRNFSKGLTSILLSIATSTSAMAF 未 知 61，62 PLD AA1-21 MTLKLSLLIASLSAVSPAVLAN 未 知 67，68 PLD 无 未 知 83，84 PLD AA1-21 MKKIVIYSFVAGVMTSGGVFAA 未 知 49，50 PLD AA1-23 MNFWSFLLSITLPMGVGVAHAQPD 未 知 39，40 PLD 未 知 73，74 PLD 未 知 29，30 PLD 未 知 21，22 PLD AA1-28 MQQHKLRNFNKGLTGVVLSVLTSTSAMA F 未 知 71，72 PLD 未 知 161，162 PLD AA1-24 MNRKLLSLCLGATSCIALSLPVHA 未 知
[346]在一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、 SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、 SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、 SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171和/或SEQ ID NO：173 中阐明的序列的多肽，和其子序列，例如它们的具有磷脂酶活性，例如磷脂酶 C(PLC)活性的活性位点(“催化结构域”)。在一个方面，多肽具有磷脂酶活性， 但是缺少中性油(甘油三酯)水解活性。例如，在一个方面，多肽具有磷脂酶活性， 但是缺少影响中性油(甘油三酯)组分的任何活性。在一个方面，本发明提供了脱胶 工艺，该工艺包括使用具有磷脂酶活性但是缺少脂酶活性的本发明多肽。 [347]本发明的多肽和肽可以从天然来源分离，可以合成，或者是重组产生的多 肽。肽和蛋白质可以体外或体内重组表达。本发明的肽和多肽可以使用本领域已 知的任何方法产生和分离。本发明的多肽和肽也可以使用本领域熟知的化学方法， 全部地或部分地合成，见，例如Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser. 215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.， Therapeutic Peptides and Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems (1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA。例如，肽合成可以使用各种固相 技术进行(见，例如，Roberge(1995)Science 269：202，Metrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)，并且可以例如使用ABI431A肽合成仪(Perkin Elmer)，根 据生产商提供的指导自动合成。
[348]本发明的肽和多肽也可以糖基化。糖基化可以通过化学方法或者利用细胞 生物合成机制在翻译后加上，其中后一种方式包括使用已知的糖基化基序，该糖 基化基序可以是序列本来所拥有的，或者可以作为肽加上，或者加在编码序列的 核酸中。糖基化可以是O-连接的或N-连接的。
[349]本发明的肽和多肽，如以上描述的，包括所有的“模拟的”和“肽模拟的”形 式。术语“模拟的”和“肽模拟的”指的是基本上具有与发明的多肽相同结构和/或功 能特征的合成化学化合物。模拟物可以是完全由合成的、非天然的氨基酸类似物 组成，或者是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物组成的嵌合分子。 模拟物也可以含有任何量的天然氨基酸保守取代，只要这样的取代基本上不改变 模拟物的结构和/或活性。如同作为保守变异体的本发明多肽的情况，常规实验可 以确定模拟物是否在发明的范围内，即，其结构和/或功能是否基本上没有被改变。 因此，一方面，假如模拟物具有磷脂酶活性，那么该模拟物在本发明的范围内。
[350]本发明的多肽模拟物组合物可以含有非天然结构组分的任何组合。在可选 择的方面，本发明的模拟物组合物包括以下三种结构基团的一种或所有：a)不是 天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团，b)取代天然发生的氨基酸残基的非 天然残基，或者c)诱导二级结构模拟，即诱导或稳定二级结构例如β-转角、γ-转 角、β-折叠、α-螺旋构象和类似结构的残基。例如，当所有残基或一些残基通过化 学方式，而不是天然肽键的方式连接时，本发明的多肽可以表征为模拟物。各个 肽模拟物残基可以通过肽键、别的化学键或者偶联方式，例如，戊二醛，N-羟基 琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或者N，N′- 二异丙基碳二亚胺(DIC)连接。可以作为常规的酰胺键(“肽键”)连接的替代连 接基团包括，例如，南五味子酮(例如，-C(＝O)-CH2-，针对-C(＝O)NH)、氨基亚 甲基(CH2-NH)、乙烯、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四 唑(CN4-)、噻唑、反向酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(见，例如，Spatola(1983)， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，VOl.7，pp 267-357，“Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY)。
[351]本发明的多肽也可以由于含有所有或一些取代天然发生的氨基酸残基的 非天然残基，而表征为模拟物。非天然残基在科学文献和专利文献中得到充分地 描述；一些用作天然氨基酸残基的模拟物的示例性的非天然组分和指导描述于下。 芳香族氨基酸的模拟物可以通过被下述氨基酸取代产生，例如，D-或L-萘丙氨酸 (naphylalanine)；D-或L-苯基甘氨酸，D-或L-2噻吩丙氨酸(thieneylalanine)； D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩丙氨酸(thieneylalanine)；D- 或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸； D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙 氨酸；D-p-氟-苯基丙氨酸；D-或L-p-二苯基苯基丙氨酸；K-或L-p-甲氧基二苯基 苯基丙氨酸；D-或L-2-吲哚-(烷基)丙氨酸；和D-或L-alkylainines，或非酸性氨基 酸，其中烷基可以是取代的或不取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、 异丙基、异丁基、sec-isotyl、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括， 例如，噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯和吡啶基芳 香环。
[352]酸性氨基酸的模拟物可以通过用以下的取代来产生，如，保持有负电荷的 非羧酸氨基酸；(膦酰基)丙氨酸；硫酸化的苏氨酸。羧基侧链(如，天冬氨酰基或 者谷氨酰基)也可以通过与碳二亚胺(R′-N-C-N-R′)反应进行选择性的修饰，所 述碳二亚胺如1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或者1-乙基-3(4-氮鎓-4，4-二 甲基戊基)碳二亚胺。天冬氨酰基或者谷氨酰基也可以通过与铵离子反应转化为天 冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。碱性氨基酸的模拟物可以通过用如，(除了赖氨酸 和精氨酸外)鸟氨酸、瓜氨酸、或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)烷基-乙酸的取代产 生，其中烷基如以上定义。腈衍生物(如，含有取代COOH的CN-部分)可以取 代天冬酰胺或者谷氨酰胺。天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基可以脱氨基成为相应的 天冬氨酰基或者谷氨酰基。精氨酸残基模拟物可以通过精氨酰基与例如一种或者 多种常规试剂在优选为碱性的条件下反应而产生，所述的常规试剂包括如苯乙二 醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或者茚三酮。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰基 与例如芳香重氮化合物或者四硝基甲烷反应而产生。N-acetylimidizol和四硝基甲 烷可以分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。半胱氨酸残基模拟物 可以通过半胱氨酰残基与例如α-卤素乙酸例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相应的胺 反应而产生；得到羧甲基或者羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟物也可以通 过半胱氨酰残基与例如溴代-三氟丙酮、α-溴-β-(5-imidozoyl)丙酸；氯乙酰磷酸、 N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；p-氯汞 苯甲酸盐；2-氯汞-4硝基苯酚，或者，氯-7-硝基苯并-氧杂-1，3-二唑反应而产生。 可以通过赖氨酰基与例如琥珀酸或者其它的羧酸酸酐反应而产生赖氨酸模拟物 (和改变氨基末端残基)。赖氨酸和其它的含有α-氨基的残基模拟物也可以通过 与亚氨酸酯例如methyl picolinimidate、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝 基-苯磺酸、O-甲基异脲、2，4，戊二酮的反应，和与乙醛酸的转酰胺基酶催化的反应 而产生。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例如甲硫氨酸亚砜反应而产生。脯氨酸的 模拟物包括，例如，2-哌啶酸、四氢噻唑羧酸、3-或4-羟脯氨酸、脱氢脯氨酸、3- 或4-甲基脯氨酸，或者3，3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰基 与例如二乙基原碳酸酯或者对溴苯甲酰甲基溴化物反应而产生。其它的模拟物包 括，例如，由脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用产生的模拟物；由丝氨酰或者苏氨酰 的羟基的磷酸化作用产生的模拟物；由赖氨酸、精氨酸和组氨酸的α氨基基团的 甲基化作用产生的模拟物；由N-末端胺的乙酰化作用而产生的模拟物；由主链酰 胺残基的甲基化或用N-甲基氨基酸取代而产生的模拟物；或者，由C-末端羧基的 酰胺化而产生的模拟物。
[353]本发明的多肽的残基例如氨基酸也可以用相反手性的氨基酸(或者肽模拟 物残基)替代。因此，任何天然发生的L-构型(也可以被称为R或者S，取决于 化学实体的结构)的氨基酸都可用相同化学结构类型但是具有相反手性的氨基酸 或者肽模拟物替代，相反手性的氨基酸称为D-氨基酸，但也可以称R-或者S-型。
[354]本发明也提供了通过天然过程，如，翻译后加工(如，磷酸化，酰化以及 类似作用)或者化学修饰技术修饰本发明的多肽的方法，以及得到的被修饰的多 肽。修饰可以发生在所述多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或 者羧基端。可以理解，相同类型的修饰可以在已知的多肽中以相同的或者不同的 水平在几个位点处发生。一个给定的多肽也可以具有很多类型的修饰。修饰包括 乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共价连接核黄素、共价连 接血红素组分、共价连接核苷酸或者核苷酸衍生物、共价连接脂质或者脂质衍生 物、共价连接磷脂酰肌醇、交联的环化作用、形成二硫键、去甲基作用、形成共 价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、 形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作 用、聚乙二醇化、蛋白水解过程、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化 作用、硫酸盐化作用，和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中，如精氨酰化。参 见，如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，W.H. Freeman和Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，11-12页(1983)。
[355]固相化学肽合成方法也可以用于合成本发明的多肽或者片段。这样的方法 自二十世纪六十年代早期起就是本领域已知的方法(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem. Soc.，85：2149-2154，1963)(也参见Stewart，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，III，11-12页)，并且这些 方法已经可以通过商业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(Cambridge Research Biochemicals)而被应用。这样的商业上可获得的实验室试剂盒一般是利 用H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的方法，它们让肽 合成在多个“杆(rods)”或者“钉(pins)”的顶端进行，而所有的“杆”或者“钉”都 被连接到一块板上。当使用这样的系统时，一个板的杆或者钉被倒转并插入到另 一个板的相应孔或者贮存器中，所述孔或者贮存器含有用于将一种适合的氨基酸 附着或固定在杆或钉的顶端的溶液。通过重复这样的处理步骤，即是，反转和插 入所述杆和钉的顶端至适当的溶液中，将氨基酸构建成所要的肽。此外，大量的 FMOC肽合成系统是可利用的。例如，应用Applied Biosystems，Inc.的Model 431ATM 自动肽合成仪可以在固体支持物上装配多肽或者片段。这些设备使得本发明的肽 容易获得，或者通过直接的合成或者通过用其它已知的技术将一系列片段偶联起 来的合成。
磷脂酶
[356]本发明提供新的磷脂酶，编码磷脂酶的核酸，结合磷脂酶的抗体，代表酶 的抗原位点(表位)和活性位点的肽，调控和结合结构域，和产生和使用它们的 方法。一方面，本发明的多肽具有磷脂酶活性，或者如以上描述的的磷脂酶活性 (例如，切割磷酸甘油酯键，缺少脂酶活性，等等)的任何组合。在可选择的方 面，本发明的磷脂酶具有由在此描述的示范性磷脂酶的活性修饰而得的活性。
[357]本发明包括具有或不具有信号序列的磷脂酶和信号序列本身。本发明包括 本发明的酶的片段或子序列，例如包含催化结构域(活性位点)、结合位点、调 控结构域、表位、信号序列、前原结构域(prepro domains)和类似物的肽或多肽，或 由它们组成的肽或多肽。本发明也包括固定化的磷脂酶、抗磷脂酶抗体和它们的 片段。本发明包括杂合物(heterocomplexes)，例如，包括本发明的磷脂酶的融合 蛋质、异二聚体等。代表酶的抗原位点(表位)、活性位点、结合位点、信号序 列和类似物的肽可以用常规的筛选方案测定。
[358]本发明的这些酶和过程可以用于取得对高磷含量的油，特别是大米、大豆、 玉米、油菜和向日葵油更彻底的脱胶。例如，在一个方面，一旦用PI-PLC切割， 磷脂酰肌醇被转化为二酰基甘油和磷酸肌醇(phosphoinositol)。在离心期间，二 酰基甘油与水相分开(从而提高油产量)，磷酸肌醇与水相分开，其中它作为重相的 组分被去除。本发明的酶，例如本发明的PI-PLC可以被掺入到化学或物理油精炼 过程中。
[359]在可选的实施方案中，本发明的酶具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (PI-PLC)活性、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性、磷脂酸磷酸酶活性、磷脂酶A 活性和/或patatin-相关磷脂酶活性。这些酶可以单独使用，或者相互之间或与本发 明的其他酶或其他酶组合使用。在一个方面，本发明提供了这样的方法，其中这 些酶(包括本发明的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PIPLC)、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶 C和/或磷脂酶D(与磷酸酶结合)、磷脂酸磷酸酶、磷脂酶A、patatin-相关磷脂酶) 被单独或组合使用，用于使油脱胶，所述油诸如诸如植物油，例如高磷油，诸如， 大豆油、玉米油、油菜油、米糠油和向日葵油。本发明的这些酶和过程可以用于 取得对高磷含量的油，特别是大豆、玉米、油菜、米糠和向日葵油更彻底的脱胶。 一旦用PI-PLC切割，磷脂酰肌醇被转化为二酰基甘油和磷酸肌醇。在离心期间， 二酰基甘油与水相分开(提高油产量)，磷酸肌醇与水相分开，其中它作为重相的组 分被去除。本发明的酶，例如本发明的PI-PLC可以被掺入到化学或物理油精炼过 程中。
[360]在一个方面，本发明提供了组合物，例如溶液，其包括在中性pH的柠檬 酸钠，以水合不可水合物。例如，本发明提供了pH范围在约4至9或约5至8或 约6至7的柠檬酸钠溶液，其可以用来水合在高磷油中的不可水合的磷脂(包括本 发明的酶)。在一个方面，非水合磷脂的水合是通过螯合与磷脂相关的钙和镁进行 的，从而使得之前不可溶的磷脂盐更容易地在水相中分开。在一个方面，一旦磷 脂向水/油介面移动或进入水相，本发明的磷脂酶(例如本发明的磷脂酶特异性磷 酸水解酶)或其他磷脂酶，将会把该磷脂转化为二酰基甘油和磷酸酯。在一个方 面，一旦加入酸和碱，钙和镁金属的含量将降低(参见有关碱过程的论述)
[361]本发明的酶是高度选择性的催化剂。与别的酶一样，它们催化常规的合成 化学术所不能比拟的具有精巧的立体选择性、区域选择性和化学选择性的反应。 而且，本发明的酶是非常多用的。它们可以经改变而在有机溶剂中具有功能，可 在极端pH(例如，高pH和低pH)、极端温度(例如，高温和低温)、极端盐度 水平(例如，高盐度和低盐度)下操作，并且催化结构上与它们的天然的、生理 学上的底物无关的化合物的反应。本发明的酶可以设计为与大范围的天然和非天 然底物具有反应活性，因此，使得能事实上修饰任何有机先导化合物。本发明的 酶也可以设计为具有高度的对映选择性和区域选择性。这些酶所展示出的高度的 官能基团选择性使得人们能明了产生新的活性化合物的合成顺序中的每一个反 应。本发明的酶也可以设计为催化许多与它们的天然生理功能无关的不同的反应。
[362]本发明开发了酶的独特催化特性。然而，在化学转化中，生物催化剂(即， 纯化的酶或粗酶，非活细胞或活细胞)的使用一般要求确定与特异的起始化合物 反应的特定生物催化剂。本发明使用经选择的生物催化剂，即，本发明的酶，和 对在许多起始化合物中都存在的功能基团具有特异性的反应条件。每种生物催化 剂对一种功能基团，或几种相关功能基团特异，可以与含有这种功能基团的多种 起始化合物反应。生物催化反应由单个的起始化合物产生一个衍生物群体。这些 衍生物可以经过另一轮生物催化途径，产生第二个群体衍生化合物。生物催化衍 生化作用的每次重复都可以产生数千种最初化合物的变异体。
[363]酶在起始化合物的特异位点反应，不影响该分子的其余部分，这个过程使 用常规的化学方法是难以达到的。此高度的生物催化特异性提供了确定文库中单 个活性酶的方法。文库是用一系列用于产生该文库的生物催化反应表征，是一个 所谓的“生物合成史”。筛选文库的生物学活性以及追踪生物合成史，可确定产生该 活性化合物的特异反应顺序。重复反应顺序，测定合成的化合物的结构。这种鉴 定方式，与别的合成和筛选方法不同，不要求固定化技术，化合物可以在溶液中 合成，并且实际上使用任何类型的筛选分析方法进行任意进行检测。需要注意的 是，酶反应对功能基团的高度特异性使得可以“追踪”形成生物催化产生的文库的 特异性酶反应。
[364]本发明也提供使用本发明的核酸、多肽和抗体，来发现新的磷脂酶的方法。 一方面，筛选λ-噬菌体文库以基于表达发现磷脂酶。在筛选中使用λ-噬菌体文库 可以允许如下事项：检测毒性克隆；改进与底物的接触；降低对工程改造宿主的 要求，绕开任何由文库的大量排除所致的潜在偏差；和，在低克隆密度下的快速 生长。λ-噬菌体文库的筛选可以在液相或在固相中进行。在液相中筛选赋予分析条 件的更大灵活性；额外的底物灵活性；对弱克隆更为灵敏；比固相筛选易于自动 化。
[365]许多程序步骤使用机器自动化进行，每天可以完成几千种生物催化反应和 筛选分析，同时确保高度准确和再现性(见以下的阵列讨论)。结果，衍生化合 物的文库可以在大概数周内获得。对分子，包括小分子修饰的进一步教导，见 PCT/US94/09174。
磷脂酶信号序列和催化结构域
[366]本发明提供磷脂酶的信号序列(例如，信号肽(SPs))，例如含有信号 序列的肽和/或嵌合多肽，其中所述肽或嵌合多肽具有表1中示出的信号序列，或 如下面示出的信号序列。本发明提供了编码这些信号序列(SPs，例如具有含有本 发明多肽的氨基末端残基的序列的肽，或具有由本发明多肽的氨基末端残基组成 的序列的肽)的核酸。一方面，本发明提供了信号序列，其包括这样的肽，该肽 包含本发明多肽的残基1到20、1到21、1到22、1到23、1到24、1到25、1 到26、1到27、1到28、1到29、1到30、1到31、1到32或1到33中所阐述 的序列，或该肽由所述序列组成，所述本发明的多肽例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、 SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、 SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、 SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、 SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、 SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、 SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、 SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ IDNO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、 SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138；SEQ ID NO：140；SEQ ID NO：142； SEQ ID NO：144；NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、 SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172 或SEQ ID NO：174。这些肽中的任何肽可以是嵌合蛋白例如重组蛋白的一部分。信 号序列肽可以与本发明的其他酶(例如本发明的磷脂酶，从中本得不到该信号序 列)，或与其他磷脂酶，或与任何多肽相配，如下进一步论述。
[367]示例性的信号序列列于表1和SEQ ID列表中，如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6的残基1到24；SEQ ID NO：8的残基1到29；SEQ ID NO： 10的残基1到20；SEQ ID NO：20的残基1到19；SEQ ID NO：22的残基1到28； SEQ ID NO：32的残基1到20；SEQ ID NO：38的残基1到23；对于本发明的其它 示例性信号序列，参见表1和SEQ ID列表。
[368]在一些方面，本发明的磷脂酶无信号序列。在一个方面，本发明提供了缺 少所有或部分信号序列的磷脂酶。在一个方面，本发明提供了编码来自一种磷脂 酶的信号序列的核酸序列，该核酸序列可操作性地连接到不同的磷脂酶的核酸序 列上，或者，任选地，来自非磷脂酶蛋白的信号序列也可以是期望的。
磷脂酶前原结构域(prepro domains)、结合结构域和催化结构域
[369]如上所述，除了信号序列(例如信号肽(SPs))，本发明提供了前原结构域、 结合结构域(例如底物结合结构域)和催化结构域(CDs)。本发明的SP结构域、结合 结构域、前原结构域和/或CDs可以是分离的或重组的肽，或可以是融合蛋白的一 部分，例如作为嵌合蛋白中的异源结构域。本发明提供了编码这些催化结构域(CDs) (例如＂活性位点＂)、前原结构域、结合结构域和信号序列(SPs，例如具有含有本发 明多肽的氨基末端残基的序列的肽，或具有由本发明多肽的氨基末端残基组成的 序列的肽)的核酸。
[370]本发明的磷脂酶的信号序列(SPs)、结合结构域、催化结构域(CDs)和/或前 原序列(prepro sequences)可以是分离的肽，或者连接于其他磷脂酶或者非磷脂酶 多肽的序列，如，作为融合(嵌合)蛋白。在一方面，包含本发明磷脂酶信号序 列SPs和/或前原序列的多肽含有与本发明磷脂酶异源的序列(例如，包含本发明的 SP和/或前原序列以及其他磷脂酶或非磷脂酶蛋白的序列的融合蛋白)。在一个方 面，本发明提供了具有异源CDs、SPs和/或前原序列，例如具有酵母信号序列的 序列的本发明磷脂酶。本发明的磷脂酶可以包括异源的CDs、SPs和/或前原序列， 它们在载体中，例如在pPIC系列载体(lnvitrogen，Carlsbad，CA)中。
[371]一方面，本发明的SPs、CDs和/或前原序列在鉴定了新型的磷脂酶多肽之 后来确定。分选蛋白质并且转运蛋白质至它们的细胞内合适位置的途径，一般被 称为蛋白质定向转运途径(protein targeting pathways)。在所有这些定向转运系统 中的最重要成员之一是在新合成多肽的氨基端的短氨基酸序列，叫做信号序列。 信号序列引导蛋白质至细胞的合适位置定位，并且在转运过程中或者当蛋白到达 其最终的目的地之后去除。大多数溶酶体蛋白，膜蛋白，或者分泌蛋白具有氨基 末端信号序列，该序列标记这些蛋白用于转移到内质网的腔中。信号序列的长度 可以在从13到45或更多个氨基酸残基内进行变化。本领域技术人员知道识别信 号序列的各种方法。例如，一方面，通过称为SignalP的方法来鉴定新型的水解酶 信号肽。SignalP应用识别信号肽和它们的切割位点的组合的神经网络。(Nielsen， et al.，“Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.”Protein Engineering，vol.10，no.1，p.1～6(1997)。
[372]在一个方面，本发明的磷脂酶不必具有SPs和/或前原序列，和/或催化结 构域(CDs)。在一个方面，本发明提供缺少所有或部分SP、CD和/或前原结构域的 磷脂酶。在一个方面，本发明提供了编码来自一种磷脂酶的信号序列(SP)、CD和/ 或前原序列的核酸序列，其可操作性地连接到不同的磷脂酶的核酸序列上，或任 选地，来自非磷脂酶蛋白的信号序列(SP)、CD和/或前原结构域也是可期待的。
[373]本发明也提供了分离的或者重组的多肽，含有本发明的信号序列(SPs)、 前区域和/或催化结构域(CDs)，以及异源序列。异源序列是与SP、前区域和/ 或CD非天然相关(如，对于磷脂酶)的序列。与SP、前区域和/或CD非天然相 关的序列可以在SP、前区域和/或CD的氨基末端，羧基末端，和/或在SP和/或 CD的末端。一方面，本发明提供了分离的或者重组的多肽，包括(或者由...组成) 这样的多肽，该多肽包括本发明的信号序列(SPs)、前区域和/或催化结构域(CDs)， 条件是其并不与和与其有天然联系的任何序列有联系(如磷脂酶序列)。相似地， 一方面，本发明提供了编码这些多肽的分离的或者重组的核酸。所以，在一个方 面，本发明的分离或者重组核酸包含有本发明的信号序列(SP)、前区域和/或催 化结构域(CD)以及异源序列(即是，与本发明的信号序列(SP)、前区域和/ 或催化结构域(CD)的编码序列并不天然关联的序列)的编码序列。异源序列可 以在3’末端、5’末端，和/或在SP、前区域和/或CD编码序列的末端。
[374]本发明的多肽包括活性形式的或无活性形式的磷脂酶。例如，本发明的多 肽包括成熟作用或对前序列加工之前的前蛋白，对前序列加工例如通过前蛋白-加 工酶，例如前蛋白转化酶对前蛋白加工产生“有活性的”成熟蛋白。本发明的多肽包 括因其他原因而失活的磷脂酶，这些原因例如翻译后加工事件而“激活”之前无活 性，例如内-或外肽酶或蛋白酶作用、磷酸化作用事件、酰胺化作用、糖基化作用、 去糖基化、硫酸化作用、二聚体化事件和/或类似作用。鉴定“前”区域序列、CDs、 结合结构域和信号序列的方法是常规的，并且是本领域熟知的，参见例如Van de Ven(1993)Crit.Rev.Oncog.4(2)：115-136；用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的酵母 双杂交筛选，由Miller(2004)Methods MoI.Biol.261：247-62；Heyninck(2004) Methods MoI.Biol.282：223-41，USPN 6,617,122；6,190,874描述。例如，为了鉴定前 区域，从胞外空间纯化蛋白质，测定N-端蛋白质序列，并与未加工的形式作比较。
[375]本发明的多肽可以作为蛋白质制剂配制成任何液体、固体、半固体或凝胶 形式。例如，本发明的蛋白质制品可以包括这样的制剂，其含有非水液体组合物、 铸造固体、粉末、冻干的粉末、粒状形式、颗粒形式、压缩的片剂、小球、丸、 凝胶形式、水凝胶、膏、气溶胶、雾剂、洗液或浆状制剂。
[376]本发明的多肽包括所有的活性形式，包括本发明酶的活性子序列，例如催 化结构域(CDs)或活性位点。在一个方面，本发明提供下面阐述的催化结构域或活 性位点。在一个方面，本发明提供了肽或多肽或等同物，其包括通过使用数据库 诸如Pfam(其收集了大量的多序列比对和覆盖了许多常见的蛋白质家族的隐藏的 Markov模型，The Pfam protein families database，A.Bateman，E.Birney，L.Cerruti，R. Durbin，L.Etwiller，S.R.Eddy，S.Griffiths-Jones，K.L.Howe，M.Marshall，and E.L.L. Sonnhammer，Nucleic Acids Research，30(1)：276-280，2002)而预测到的活性结构域， 或由这些预测到的活性结构域组成。
[377]本发明提供了本发明酶的N-端或C-端子序列(例如信号序列、前序列)与其 他多肽、活性蛋白质或蛋白质片段的融合物。本发明的酶(例如磷脂酶C酶)可以通 过将酶作为无活性的融合蛋白表达而产生，该无活性的融合蛋白随后通过蛋白质 水解切割事件激活(使用内源性或外源性蛋白酶活性，例如胰蛋白酶)，切割导致融 合蛋白伴侣和成熟的酶，例如磷脂酶C酶分离。在一个方面，本发明的融合蛋白 由杂合核苷酸构建物表达，该构建物编码单个开放阅读框，含有下述元件：融合 蛋白的核苷酸序列、接头序列(定义为编码连接两个柔性较小的蛋白区域的柔性氨 基酸序列的核苷酸序列)、蛋白酶切割识别位点、和成熟酶(例如本发明的任何酶， 例如磷脂酶)序列。在可选的方面，融合蛋白可以包含果胶裂解酶序列、木聚糖酶 序列、磷脂酸磷酸酶序列或另一序列，例如之前显示在感兴趣的宿主细胞中过量 表达的序列。
[378]可以使用任何宿主系统(参见上面论述)，例如任何细菌，例如革兰氏阳 性细菌，诸如杆菌属，或革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌，或任何酵母，例如巴 斯德毕赤酵母。嵌合核苷酸构建物中的核苷酸序列的排列可以基于用每一融合构 建物获得的蛋白质表达水平来测定。在一个方面，从核苷酸构建物的5′端至构建物 的3′端，核苷酸序列如下装配而成：信号序列/融合蛋白/接头序列/蛋白酶切割识别 位点/成熟酶(例如本发明的任何酶，例如磷脂酶)或信号序列/前序列/成熟酶/接 头序列/融合蛋白。酶(例如本发明的任何酶，例如磷脂酶)作为无活性融合蛋白 表达，可以提高酶序列的总表达水平，可以减少与活性酶过表达相关的任何潜在 的毒性，和/或可以增加使用之前的货架期，这是因为在融合蛋白，例如果胶裂解 酶与酶，例如磷脂酶蛋白分离之前是无活性的。
[379]在各个方面，本发明提供了激活作为融合蛋白表达的本发明的磷脂酶的具 体的制剂。在一个方面，使用蛋白质水解活性或潜的蛋白质水解活性结合氨基-末 端或羧基末端肽酶，来激活最初作为无活性的融合蛋白表达磷脂酶活性。该激活 事件可以用各种方法实现，并且是在应用于油脱胶之前的制备/储存过程的各种时 间点时进行。本发明的示例性工艺包括：在将融合构建物分泌到发酵介质中后由 生产性宿主表达的内源活性进行的切割；在宿主细胞破裂之后，由激活的内源性 蛋白酶活性进行的切割，或与胞内表达的融合构建物接触；使粗或纯化的融合构 建物通过具有固定化的蛋白酶活性的柱，以在制备酶制剂之前完成切割和酶(例如 本发明的磷脂酶，例如磷脂酶C)激活作用。用可溶性的蛋白质水解活性源处理粗 的或纯化的融合构建物；在油精炼中，使用可溶性的或不溶性的蛋白质水解活性 源，激活磷脂酶(例如本发明的磷脂酶，例如磷脂酶C)，之后立即用于各工艺中； 和/或在减低的温度(例如在约4℃至20℃之间的任何温度)，通过使融合构建物 制剂持续循环通过具有固定化的蛋白酶活性的柱，来激活(例如本发明的磷脂酶， 例如磷脂酶C)磷脂酶活性。该激活事件可以在传递到使用位置之前完成，或它可 以在油精炼中原位发生。
糖基化
[380]本发明的肽和多肽(例如水解酶，抗体)也可以进行糖基化，例如在一个方 面，含有至少一个糖基化位点，例如N-连接或O-连接的糖基化。在一个方面，多 肽可以在巴斯德毕赤酵母或粟酒裂殖酵母中表达后进行糖基化。糖基化可以在翻 译后以化学的方式或通过胞内生物合成机制加入，其中后者整合使用已知的糖基 化基序，其对于序列来说可以天然的，或可以作为肽加入，或加入到核酸编码序 列中。
[381]在一个方面，本发明提供了含有N-连接的糖基化的SEQ ID NO：2的多肽， 如下表中所述。

[382]全长SEQ ID NO：2(在一个方面其由SEQ ID NO：1编码)开放阅读框编码七 (7)个潜在的天冬酰胺-连接的(N-连接)糖基化位点。野生型SEQ ID NO：2开放阅 读框在能够进行糖基化的宿主(例如，巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母 或哺乳动物细胞)中的表达，导致产生糖基化的SEQ ID NO：2磷脂酶，其由于存在 N-连接的糖基化作用基本上没有活性。用PNGase F或内切糖苷酶H对野生型糖基 化的SEQ ID NO：2进行酶促去糖基化作用，导致激活SEQ ID NO：2活性。此外， 通过诱变对一个或多个N-连接的糖基化位点进行修饰(以便该位点不再被识别为 N-连接的糖基化位点，并且糖基化不再发生在那个位点)，导致产生具有不同程 度的活性增加的SEQ ID NO：2。
[383]相比在相同的宿主细胞中表达的野生型开放阅读框，对SEQ ID NO：2糖基 化位点4、5和/或6中编码天冬酰胺的核苷酸密码子进行诱变(例如将天冬酰胺转 化为天冬氨酸)，导致产生具有增加的PLC活性的酶(在巴斯德毕赤酵母中表达 的三联突变体具有与在非糖基化宿主如大肠杆菌中表达的野生型序列基本上相同 的比活性和功能活性)。在N-连接的糖基化共有序列(NXS/T)中通过诱变丝氨酸或 苏氨酸残基来废除N-连接的糖基化位点也是可能的，例如通过在这些位置改变这 些核苷酸密码子产生缬氨酸或异亮氨酸，以代替丝氨酸或苏氨酸。使用该策略来 除去N-连接的糖基化位点也导致在具有糖基化作用的宿主表达系统中产生活性 SEQ ID NO：2磷脂酶。
磷脂酶活性的分析
[384]本发明提供了具有磷脂酶活性或磷脂酶活性的任何组合的分离的、合成的 或者重组的多肽(例如酶、抗体)，以及编码它们的核酸。本领域已知的很多磷 脂酶分析方法中的任何方法都可以来用于确定是否多肽具有磷脂酶活性，并且是 否是属于本发明的范围。用于确定磷脂酶A、B、D和C，patatin和脂酰水解酶 活性或脂酶活性的常规方案是本领域已知的。
[385]示例性的活性分析包括混浊度分析、羟甲香豆素磷酸胆碱(荧光)分析、 Amplex red(荧光)磷脂酶分析、薄层色谱分析(TLC)、细胞裂解分析和p-硝基 苯基磷脂酰胆碱分析。应用这些分析方法，可以很快地筛查出具有磷脂酶活性的 多肽、肽或抗体。
[386]磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性，参见如，Jimenez(2001) Lipids 36：1169-1174，该文献描述了用于确定patatin的脂酰水解酶活性的以十八烷 基乙烯乙二醇单十二烷基醚为基础的混合微胶粒分析。Pinsirodom(2000)J.Agric. Food Chem.48：155-160，该文献描述了示例性的脂酰水解酶(LAH)patatin活性。
[387]在以下文献中说明了用于确定磷脂酶活性的混浊度分析，如，在Kauffmann (2001)“Conversion of Bacillus thermocatenulatus lipase into an efficient phospholipase with increased activity towards long-chain fatty acyl substrates by directed evolution and rational design”Protein Engineering 14：919-928；Ibrahim(1995) “Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of Candida albicans，”Infect. Immun.63：1993-1998。
[388]用于确定磷脂酶活性的羟甲香豆素(荧光)磷酸胆碱分析方法描述在下述 文献中，例如Goode(1997)”Evidence for cell surface and internal phospholipase activity in ascidian eggs，”Develop.Growth Differ.39：655-660；Diaz(1999)”Direct fluorescence-based lipase activity assay，”BioTechniques 27：696-700。
[389]用于确定磷脂酶活性的Amplex Red(荧光)磷脂酶分析可以作为试剂盒获 得，如，应用来自Molecular Probes Inc.(Eugene，OR)的Amplex Red磷脂酰胆 碱特异性磷脂酶分析试剂盒，按照制造商的说明，检测磷脂酰胆碱特异性磷脂酶。 在荧光微板读数器中，使用560±10nm的激发光和590±10nm的荧光检测，测量荧 光。该分析在极低酶浓度时也灵敏。
[390]确定磷脂酶活性的薄层色谱分析(TLC)描述在Reynolds(1991)Methods in Enzymol.197：3-13；Taguchi(1975)“Phospholipase from Clostridium novyi type A.I，”Biochim.Biophys.Acta 409：75-85中。薄层色谱分析(TLC)是用于检测磷脂 酶活性的广泛应用的技术。已经应用了该方法的不同的经改良的方法从液相分析 混合物提取磷脂酶。在一些PLC的分析中，通过浆氯仿/甲醇(2∶1)加入到反应 混合物中来终止水解。未反应的起始物以及二酰基甘油通过抽提进入有机相，并 且可以通过TLC分离，首基(head group)产物仍存在水相中。为了获得对磷脂消 化更精确的测定，可以使用放射性标记的底物(参见，如，Reynolds(1991)Methods in Enzymol.197：3-13)。产物和反应物的比率可以用于计算单位时间内的底物水解 的实际摩尔数。如果所有的成分相同提取，提取中的任何损失将相同地影响所有 的成分。磷脂消化产物的分离可以通过硅胶TCL来完成，用氯仿/甲醇/水(65： 25：4)作为溶剂系统(参见，如，Taguchi(1975)Biochim.Biophys.Acta409：75-85)。 [391]确定磷脂酶活性的p-硝基苯磷脂酰胆碱分析描述于例如Korbsrisate(1999) J.Clin.Microbiol.37：3742-3745；Berka(1981)Infect.Immun.34：1071-1074。该 分析方法基于酶法水解底物类似物p-硝基苯磷脂酰胆碱，释放黄色的生色化合物 p-硝基苯，可以在405nm检测到。该底物方便用于进行高通量筛选。
[392]基于红细胞裂解，细胞裂解分析可以检测具有细胞裂解活性的磷脂酶。毒 性磷脂酶可以与真核细胞膜作用，并水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂，引起细胞裂解， 参见，如，Titall(1993)Microbiol.Rev.57：347-366。
杂合(嵌合)磷脂酶和肽文库
[393]一方面，本发明提供了杂合磷脂酶和融合蛋白，包括肽文库，其含有本发 明的序列。本发明的肽文库可以用于分离靶标如磷脂酶底物、受体、酶的肽调节 物(如激活剂或者抑制剂)。本发明的肽文库可以用于鉴定靶的正常结合伴侣， 如配基，例如，细胞因子、激素和类似物。一方面，本发明提供了包括本发明的 信号序列(SP)和/或催化结构域(CD)以及异源序列的嵌合蛋白(参见以上)。
[394]本发明也提供了应用本发明核酸和多肽，来产生“改进的”和杂合的磷脂酶 的方法。例如，本发明提供了用于产生具有活性的酶的方法，所述活性如，在极 端碱性pH值和/或酸性pHs、高和低的温度、渗透压和类似条件下的磷脂酶活性 (如，磷脂酶A、B、C或者D活性、patatin酯酶活性、甘油磷酸酯键的切割、 植物油中磷脂的酯连接的切割)。本发明提供了用于产生杂合酶(如，杂合磷脂 酶)的方法。
[395]一方面，本发明的方法通过应用细胞内过程产生新的杂合多核苷酸，该过 程整合第一多核苷酸的序列，这样所得到的杂合多核苷酸编码表现出源于第一生 物活性多肽的活性的多肽。例如，第一多核苷酸可以是编码本发明示例性的磷脂 酶(如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8等)的示例性 核酸序列(如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SBQ ID NO：5、SEQ ID NO：7等)。 第一核酸可以编码来自一种生物的酶，其在特定的环境条件下，如高盐的条件下 有效地发挥作用。它可以与由源于不同生物体的第二多核苷酸所编码的酶“整合”， 该酶可以在不同的环境条件下如极端的高温条件下，有效地发挥作用。例如，两 个核酸可以通过例如重组和/或还原性重配产生杂合分子。含有来自第一和第二原 始多核苷酸的序列的杂合多核苷酸可以编码表现出由原始多核苷酸编码的两种酶 的特性的酶。因此，由杂合多核苷酸编码的酶可以在第一和第二多核苷酸编码的 酶共有的环境条件下，如高盐和极端温度下有效地发挥作用。
[396]可选择地，由本发明的方法得到的杂合多肽可以表现出原始酶所没有显示 出的特异化酶活性。例如，在编码磷脂酶活性的多核苷酸重组和/或还原性重配以 后，由杂合多核苷酸编码得到的杂合多肽可以通过被筛查来自每一种起始酶的特 异活性，即，磷脂酶对之起作用的键的类型以及磷脂酶发挥作用的温度。这样， 例如，可以筛查磷脂酶，来查明那些可以将杂种磷脂酶从起初的磷脂酶分辨出来 的化学功能，如：(a)酰胺(肽键)，即是，磷脂酶；(b)酯键，即是磷脂酶 和脂酶；(c)乙醛缩，即是糖苷酶，和，例如，杂合多肽起作用时的温度、pH或 者盐浓度。
[397]待与本发明的核酸“整合”的多核苷酸来源可以从下述情形中分离：个体生 物(“分离物”)，生长于成分确定培养基的生物群(“富集培养物”)，或者，未经 培养的生物(“环境样品”)。由于其使人们可以接近未开发的具生物多样性的资源， 应用培养物依赖性(culture-independent)方法来得到编码来自环境样品的新型生 物活性的多核苷酸是最优选的。“环境文库”是从环境样品中产生，并且代表了天然 发生生物体的全体基因组，环境文库保存在克隆载体中，载体可以在适合的原核 宿主中繁殖扩增。因为克隆DNA起初是从环境样品中直接提取，文库并不限于可 以生长于纯培养基中的小部分的原核生物。此外，存在于这些样品中的环境DNA 的标准化，可以允许其更加平等地代表在起始样品中存在的所有种的DNA。这就 可以显著增加从样品的次要组成中发现感兴趣基因的效率，该样品中的次要组成 与优势种相比，可能少了几个数量级。
[398]例如，从一个或者更多的未培养的微生物产生的基因文库中，筛查感兴趣 的活性。编码感兴趣的生物活性分子的潜在途径，首先在原核生物细胞中以基因 表达文库的方式被捕获。编码感兴趣活性的多核苷酸分离自这样的文库，并且引 入到宿主细胞中。将宿主细胞生长于促进重组和/或还原性重配的环境中，从而产 生具有新型的或者增强活性的潜在的生物活性分子。
[399]可以制备杂合多核苷酸的微生物包括原核微生物如真细菌和古细菌，低等 真核微生物如真菌、一些藻和原生动物。多核苷酸可以是分离自环境样品，在这 种情况下，核酸被回收而不需培养某一种生物体，或者是从一种或者多种培养的 生物中回收。在一方面，这样的微生物可以是适于极端环境的，如，嗜高温的、 嗜冷的、冷育的、嗜盐的、嗜压的和嗜酸的。编码从极端微生物中分离出来的磷 脂酶的多核苷酸可以用于制备杂合酶。这样的酶可以在地表温泉和深海的热火山 口超过100℃的温度有作用，在北极水域低于0℃的温度有作用，在死海的饱和的 盐环境下有作用，在pH值在0附近例如煤层沉积物和地热富硫矿泉中起作用，或 者在pH值超过11例如污水污泥中有作用。例如，来自极端条件下的生物体的几 种被克隆和被表达的磷脂酶在很宽的温度和pH范围内表现出高活性。
[400]在此描述的选择和分离的多核苷酸，包括至少一种本发明的核酸，被引入 到适当的宿主细胞中。适当的宿主细胞是可以促进重组和/或还原性重配的任何细 胞。选择的多核苷酸可以在包括合适控制序列的载体中。宿主细胞可以是较高等 的真核生物细胞，如哺乳动物细胞，或者较低等的真核生物细胞，如，酵母细胞， 或者优选地，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。将构建物导入宿主细胞可 通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis等人，1986)来实 现。
[401]示范性的适当的宿主包括：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门 氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞如CHO、 COS或者黑色素瘤细、胞腺病毒；和植物细胞(也可参见上面的论述)。选择适 合的宿主用于重组和/或还原性重配或者仅仅用于表达重组蛋白被认为是在本领域 技术人员已知的范围内。可以用于重组和/或还原性重配或者仅仅用于表达重组蛋 白的哺乳动物细胞培养系统包括：猴肾纤维原细胞的COS-7细胞系，其在 “SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants” (Gluzman，1981)中有说明，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动 物表达载体可以包括复制起点、合适的启动子和增强子，以及必要的核糖体结合 位点、多聚腺苷酸化的位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列，以及5’旁侧 的非转录序列。源于SV40剪接的DNA序列和多聚腺苷酸化的位点可以用于提供 所需的非转录的遗传学元件。
[402]含有感兴趣多核苷酸的宿主细胞(用于重组和/或还原性重配或者仅仅用于 表达重组蛋白)可以在传统的营养培养基中培养，对该培养基进行改变以适于激 活启动子，选择转化子或者扩增基因。培养的条件，如温度，pH和类似因素是那 些之前选择用于表达条件的宿主细胞所使用的，并且对于普通技术人员是显而易 见的。经鉴定具有特异酶活性的克隆可以随后进行测序，以鉴定编码具有增强活 性的酶的多核苷酸序列。
[403]另一方面，本发明的核酸和方法可以用于产生用于生物化学途径的新型多 核苷酸，所述生物化学途径如，来自一个或者多个操纵子或者基因簇或者其部分 的途径。例如，细菌和很多的真核生物具有调控基因的协调机制，其中所述基因 的产物参与相关的过程。基因成簇排列在单个染色体上，在结构上称“基因簇”，它 们在单个调控序列的控制下一起转录，所述调控序列包括起始整个簇的转录的单 个启动子。因此，基因簇是指一组或者相同或者相关的相邻基因，一般是指功能 上相关的邻近的基因。
[404]基因簇DNA可以从不同的生物体中分离出来并且连接到载体中，特别是 含有表达调控序列的载体，所述表达控制序列可以控制和调控可检测蛋白或者来 自连接在一起的基因簇的蛋白相关系列活性的产生。对于引入外源DNA使用具有 非常大的容量的载体，特别适合用于这样的基因簇，在这里通过括大肠杆菌的f- 因子(或者致育因子)的例子加以说明。大肠杆菌的f-因子是一种质粒，在接合过 程中它能实现自身的高频率转移，f-因子对于获得和稳定扩增大DNA片段，如来 自混合的微生物样品的基因簇是理想的。可以使用“Fosmids”、粘粒或者细菌人工 染色体(BAC)载体作为克隆载体。它们源于大肠杆菌f因子，可以稳定地整合 大的基因组DNA片段。当整合来自混合的未经过培养的环境样品的DNA时，这 就有可能得到以稳定的“环境DNA文库”形式存在的大的基因组片段。粘粒载体最 初是设计用来克隆和扩增基因组DNA的大片段。应用粘粒载体的克隆在Sambrook 等，Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中有详细说明。一旦连接到适当的载体，含有不同的聚酮 化合物合成酶基因簇的两个或者多个载体可以引入到适合的宿主细胞中。这些基 因簇所共有的具有部分序列同源性的区域将促进导致序列重新组织为杂合基因簇 的过程。然后可以对新的杂合基因簇进行筛选，以寻找在起初的基因簇没有发现 的增强的活性。
[405]因此，一方面，本发明涉及使用本发明的核酸序列产生具有生物活性的杂 合多肽以及筛选具有活性(例如，增强的活性)的多肽的方法，该方法通过：
[406]1)以可操作性连接的方式导入至少第一多核苷酸(例如本发明的核酸)， 和导入至少第二多核苷酸到合适的宿主细胞，所述的至少第一多核苷酸和第二多 核苷酸共有具有部分序列同源性的至少一个区域；
[407]2)在促进序列重新组织的条件下培养宿主细胞，得到可操作性连接的杂 合多核苷酸；
[408]3)表达由所述杂合多核苷酸编码的杂合多肽；
[409]4)在有利于鉴定期望的生物活性(例如增强的磷脂酶活性)的条件下筛 选所述的杂合多肽；和
[410]5)分离编码该杂合多肽的多核苷酸。
[411]用于筛选各种酶活性的方法对于本领域技术人员是已知的，关于它的讨论 贯穿于本说明书。当要分离本发明的多核苷酸和多肽时，可以应用这些方法。
[412]体内重配可以集中在“分子间”的过程上，统称为“重组”。在细菌中，它一 般被视为是“RecA-依赖”的现象。本发明可以依赖于宿主细胞的重组过程来重组和 重配序列，或者依赖于细胞介导还原过程的能力，通过缺失来减少细胞中的准-重 复序列的复杂性。该“还原性重配”过程通过分子内的、RecA-依赖过程而发生。因 此，在本发明的一方面，应用本发明的核酸，通过还原性重配过程，产生新型的 多核苷酸。该方法包括产生含有连续序列(起始的编码序列)的构建物，它们插 入到合适的载体中，并且然后将它们引入到合适的宿主细胞。单个分子同一性的 重配通过在构建物中具有同源性区域的连续序列间的组合过程，或者准-重复单位 间的组合过程而发生。重配过程重组和/或降低重复序列的复杂性和程度，并且导 致产生新型的分子种类。
[413]可以引用各种处理来提高重配效率。这些处理可以包括用紫外光，或者损 坏DNA的化学试剂处理，和/或使用表现增高水平的“遗传不稳定性”的宿主细胞 系。因此，这样的重配过程可以涉及同源重组或者准-重复序列指导它们自身进化 的天然特性。
[414]重复或者“准重复(quasi-repeated)”序列在遗传不稳定性中起作用。“准重 复”是并不限于它们起初的单元结构的重复。准重复单元可以在构建物中以序列的 排列出现；以相似序列的连续单元出现。一旦连接，在连续序列之间的连接处变 得本质上无形，并且得到的构建物的准重复性质在分子水平现在是连续的。细胞 在准重复序列之间进行的缺失过程降低了得到的构建物的复杂性。准重复单位提 供了一个实际上没有限制的模板内容，在模板上可以发生滑移事件。因此，含有 准重复的构建物有效地提供了足够的分子弹性，缺失(和潜在的插入)事件实际 上可以在准重复单元内的任何地方发生。当准重复序列全部以相同方向连接，例 如，头对尾或者反之亦然，细胞就不能区别各个单元。因此，还原过程可以在整 个序列中发生。相反地，当例如，所述单元以头对头存在，而不是头对尾，相邻 单元的头尾倒置，这样缺失的形成将有利于不连续单元的失去。因此，在本发明 的一个方面，待重配序列是处于相同的方向。准重复序列的随机定向将会导致重 配效率的损失，而序列的一致定向将会提供最高的效率。然而，虽然具有较少的 相同定向的连续序列会降低效率，但是仍然可以为新型分子的有效回收提供足够 的弹性。用定向相同以允许更高效率的准重复序列制备构建物。
[415]应用各种方法中的任何一种，可以将序列装配成头对尾的定向，包括以下 方法：a)可以使用包括poly-A头和poly-T尾的引物，当制成单链时，包括poly-A 头和poly-T尾的引物将提供定向。这通过具有由RNA制备引物的头几个碱基来完 成，而且随后用RNaseH可以很容易去除RNA。b)可以应用包括独特的限制酶切 割位点的引物。这需要多个位点、一组独特的序列、和重复的合成和连接步骤。c) 引物的内部几个碱基可以被硫醇化，并且用外切酶来产生合适的具有尾巴的分子。
[416]重配序列的回收依赖于具有下降的重复指数(RI)的克隆载体的确定。被 重配的编码序列可以随后通过扩增回收。产物被再克隆和表达。具有降低的RI的 克隆载体的回收可以这样被完成，即：1)应用仅仅当构建物的复杂性下降时才能 稳定地维持的载体。2)通过物理程序对缩短的载体进行物理回收。在这一情况下， 克隆载体将应用标准的质粒分离程序进行回收，或者在具有低分子量截留的琼脂 糖凝胶或者柱子上利用标准程序进行大小分离。3)插入物的大小下降时，对含有 可以选择的断裂基因的载体进行回收。4)应用表达载体以及适当的选择，使用定 向选择技术。
[417]相关的生物体的编码序列(例如，基因)可以表现出高度的同源性，并且 编码相当多样化的蛋白产物。这些类型的序列特别可作为准重复序列用在本发明 中。然而，这一过程并不限于这种几乎相同的重复。
[418]以下是本发明的示例性方法。编码性核酸序列(准-重复)来自三个(3) 种，包括本发明的核酸。每一序列编码具有一套不同特征的蛋白质，包括本发明 的酶。每一个序列在序列的唯一位置只有一个或者几个碱基对的不同。准-重复序 列分别地或者共同被扩增并且被连接到随机的组合中，以便所有可能的排列交换 和组合可以在连接的分子群体中获得。准-重复单位的数目可以通过装配条件来控 制。在构建物中，准-重复单位的平均数目通过重复指数(RI)来定义。一旦形成， 构建物可以，或不必按照出版的方法通过琼脂糖凝胶来按大小分离，插入到克隆 载体，并且转染到合适的宿主细胞中。然后细胞进行繁殖，并且进行“还原性重配”。 如果需要，还原性重配过程的速率可以通过引入DNA损伤来刺激。RI的降低是通 过一种“分子内”的机制在重复序列间形成缺失来介导，还是通过“分子间”的机制由 重组类似的事件来介导是不重要的。最终的结果是分子被重配，得到所有可能的 组合。在一个方面，本方法包括一个额外的步骤，即对重排的文库成员进行筛选， 以确定具有与一种预定的大分子如蛋白质受体、寡聚糖、病毒颗粒或者其它的预 定的化合物或者结构结合或者不同方式地相互作用，或者催化一个特定的反应 (如，酶的催化结构域)的能力的个别的重排文库成员。从这样的文库所鉴定得 到的多肽，如，磷脂酶可以用于各种目的，例如在此说明的工业过程和/或可以进 行改组和/或选择的一个或者多个另外的循环。
[419]在另一方面，可以预见，在重组或重配之前，或者在重组或重配的过程中， 通过本发明的方法产生的多核苷酸可以用试剂处理或进行加工，这些处理或加工 促进突变引入到原始的多核苷酸中。引入这样的突变将会增加得到的杂合多核苷 酸及由其编码的多肽的多样性。促进诱变的试剂和过程可以包括，但不限于： (+)-CC-1065，或者合成的类似物如(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)(参见Sun和Hurley， (1992)；能够抑制DNA合成的N-乙酰化或者脱乙酰基的4’-氟-4-氨基联苯加合 物(见，例如，van de Poll等(1992))，或者能够抑制DNA合成的N-乙酰化或 者脱乙酰基的4-氨基联苯加合物(也见，van de Poll等(1992)，751-758页)；三 价铬、三价铬的盐、可以抑制DNA复制的多环芳香烃(PAH)DNA加合物，如 7-溴甲基-苯[a]蒽(“BMA”)、三(2，3-二溴丙基)磷酸盐(“Tris-BP”)、1，2-二溴-3- 氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯并[a]芘-7，8-二氢二醇-9-10-环氧化物 (“BPDE”)、铂(II)卤素盐、N-羟基-2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]-喹啉(“N-羟基-IQ”)、 和N-羟基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4，5-f]-吡啶(“N-羟基-PhIP”)。用于减慢或 者停止PCR扩增的尤其优选的方法由紫外线(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-腺嘌 呤)组成。特别包含的方法是DNA加合物或者来自多核苷酸或者多核苷酸库的含 有DNA加合物的多核苷酸，在进一步的处理前，其可以通过包括加热含有所述多 核苷酸的溶液的过程进行释放或者去除。
筛选方法学和“在线”监视设备
[420]在实践本发明的方法中，可以应用各种设备和方法学，结合使用本发明的 多肽和核酸，例如，来筛选具有磷脂酶活性的多肽，来筛选作为潜在的活性调节 物的化合物(如，酶活性的增强或者抑制)，以获得结合于本发明多肽的抗体， 获得与本发明核酸杂交的核酸和类似物。
固定化的酶固体支持物
[421]磷脂酶，其片段以及编码该酶和片段的核酸可以附于固体支持物上。这对 于工业过程中磷脂酶的使用常常是经济的且有效的。例如，磷脂酶(或其活性片 段)的联合物或者混合物——其用于特定的化学反应——可以附于固体支持物， 并且浸于处理容器中。酶反应因此可以进行。随后，可以将固体支持物从容器中 取出，同时取出的是固定在支持物上的酶，用于重复使用。在本发明的一个实施 方案中，将分离的本发明核酸附着于固体支持物。在本发明的另一个实施方案中， 固体支持物是选自凝胶、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极以及它们的任意组 合。
[422]例如，用于本发明的固体支持物包括凝胶。凝胶的一些例子包括琼脂糖 (Sepharose)、明胶、戊二醛、壳聚糖处理的戊二醛、白蛋白-戊二醛、壳聚糖- 黄原胶、toyopearl胶(聚合胶)、藻酸盐、藻酸盐-聚赖氨酸、角叉菜胶、琼脂糖、 glyoxyl琼脂糖、磁性琼脂糖、葡聚糖-琼脂糖、聚(氨基甲酰磺酸盐)水凝胶、BSA-PEG 水凝胶、磷酸化的聚乙烯醇(PVA)、单氨基乙基-N-氨基乙基(MANA)氨基， 或者它们的任意组合。
[423]用于本发明的另一固体支持物是树脂或者聚合物。树脂或者聚合物的一些 例子包括纤维素、丙烯酰胺、尼龙、人造纤维、聚酯、阴离子交换树脂、 AMBERLITETMXAD-7、AMBERLITETMXAD-8、AMBERLITETMIRA-94、 AMBERLITETMIRC-50、聚乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯或者它们的任何组合。
[424]用于本发明的另一类型固体支持物是陶瓷。一些例子包括非多孔陶瓷、多 孔陶瓷、SiO2、Al2O3。用于本发明的另一类固体支持物是玻璃。一些例子包括非 多孔玻璃、多孔玻璃、氨基丙基玻璃或者它们的任何组合。可以应用的另一类型 固体支持物是微电极。一个例子是聚乙烯亚胺涂层磁铁。石墨颗粒可以用于固体 支持物。
[425]用于实施本发明的其他示例性固体支持物包括硅藻土产品和硅酸盐。一些 例子包括 硅藻土和 SILASORBTM和合成硅酸钙和硅酸镁。固 体支持物的其他例子是细胞，诸如血红细胞。
固定化方法
[426]有许多本领域技术人员已知的用于将酶或者其片段，或者核酸固定化在固 体支持物上的方法。这样的方法的一些例子包括：如，产生静电液滴的方法、电 化学方法、通过吸收、共价结合、交联、化学反应或者化学工艺、封装、捕集、 通过藻酸钙，或者通过聚(2-羟乙基甲基丙烯酸)进行固定化的方法。类似的方法在 下述文献中：Enzymology，Immobilized Enzymes and Cells，Part C.1987.Academic Press.S.P.Colowick和N.O.Kaplan编辑，Volume 136；和Immobilization of Enzymes and Cells.1997.Humana Press.Edited，G.F.Bickerstaff编辑.Series： Methods in Biotechnology，由J.M.Walker编辑。
毛细管阵列
[427]毛细管阵列，如GIGAMATRIXTM，Diversa Corporation，San Diego，CA，可 以用于本发明的方法。本发明的核酸或者多肽可以固定于或者施用于阵列，包括 毛细管阵列。阵列可以用于筛选或者监控能够结合或者调节本发明核酸或者多肽 活性的组分(如，小分子，抗体，核酸等)文库。毛细管阵列提供了另一个系统 用于固定和筛查样品。例如，样品筛选设备可以包括形成由相临的毛细管组成的 阵列的许多毛细管，其中每一个毛细管包括至少一个确定的保持样品的腔的壁。 该设备也可以进一步包括置于阵列中邻近毛细管之间的空隙物质，以及在空隙物 质内形成的一个或者多个参照的标记。用于筛选样品的毛细管，其中毛细管经修 改以适合结合在毛细管阵列中，可以包括限定保留样品的腔的第一壁，以及由过 滤材料形成的第二壁，用于过滤被提供给腔以激发样品的激发能。
[428]多肽或者核酸，如，配基，可以引入第一成分到毛细管阵列中的至少一部 分毛细管。毛细管阵列中的每一个毛细管可以包括至少一个确定保留第一组分的 腔的壁。在第一组分后，引入气泡至毛细管中。可以将第二组分引入到毛细管中， 其中第二组分是通过气泡与第一组分分开。令人感兴趣的样品可以作为用可检测 的颗粒标记的第一液体引入到毛细管阵列的毛细管中，其中毛细管阵列中的每一 个毛细管包括至少一个限定保留第一液体和可检测颗粒的腔的壁，并且其中至少 一个壁用将可检测颗粒结合到至少一个壁的结合材料包被。该方法可以进一步包 括从毛细管中去除第一液体，其中结合的可检测颗粒仍保留在毛细管中，然后将 第二液体引入到毛细管中。
[429]毛细管阵列可以包括很多的单个的毛细管，包括由至少一个限定腔的外 壁。毛细管的外壁可以是一个或者多个融合在一起的壁。相似地，壁限定的腔是 圆柱形、正方形、六角形或者任何其它的几何性状，只要壁形成保留液体或者样 品的腔即可。毛细管阵列中的毛细管可以非常接近地固定在一起，以形成平面结 构。毛细管可以通过融合(如，当毛细管由玻璃制成时)、胶粘、粘合或者通过 夹具并列结合在一起。毛细管阵列可以由任何数量的单个毛细管构成，例如，范 围从100到4,000,000个毛细管。毛细管阵列可以形成具有大约100,000或者更多 单个毛细管结合在一起的微滴定板。
阵列，或“生物芯片”
[430]本发明的核酸或者多肽可以固定于或者应用于阵列。可以应用阵列来筛选 或者监测化合物(例如，小分子、抗体、核酸等等)的结合或者调控本发明的核 酸或者多肽的活性的能力。例如，在本发明的一方面，一个被监测的参数是磷脂 酶基因的转录表达。细胞的一种或者多种或者所有的转录物可以通过阵列或者“生 物芯片”上的固定化核酸与包含细胞转录物的样品，或者与代表细胞转录物或和细 胞转录物互补的核酸的杂交来测定。通过应用微型芯片上的核酸“阵列”，细胞的一 些或者所有转录物可以同时被量化。可选择地，包含基因组核酸的阵列也可以用 于确定通过本发明的方法制造的新型的工程菌株的基因型。“多肽阵列”也可以用于 同时定量多种蛋白。
[431]本发明可以用任何已知的“阵列”进行实践，所述“阵列”也被指作“微阵列” 或者“核酸阵列”或者“多肽阵列”或者“抗体阵列”或者“生物芯片”，或者它们的变 体。阵列一般是多个“点”或者“靶元素”，每一个靶元素包括确定数量的一种或者多 种生物分子，例如，固定于基底表面的确定区域、用于特异结合一种样品分子如 mRNA转录物的寡核苷酸。
[432]在实践本发明的方法时，任何已知的阵列和/或制备和应用阵列的方法都可 以被全部或者部分地整入，或者也引入它们的变化，例如在下列文献中说明的： 美国专利6,277,628；6,277,489；6,261,776；6,258,606；6,054,270；6,048,695； 6,045,996；6,022,963；6,013,440；5,965,452；5,959,098；5,856,174；5,830,645； 5,770,456；5,632,957；5,556,752；5,143,854；5,807,522；5,800,992；5,744,305； 5,700,637；5,556,752；5,434,049；还例如，WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958；还例如，Johnston(1998)Curr.Biol.8：R171-R174； Schummer(1997)Biotechinques23：1087-1092；Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；Solinas-Toldo(1997)Genes，Chromosomes & Cancer 20:399-407；Bowtell (1999)Nature Genetics Supp.21：25-32。也参见出版的美国专利申请20010018642； 20010019827；20010016322；20010014449；20010014448；20010012537； 20010008765。
抗体和基于抗体的筛选方法
[433]本发明提供了可与本发明的磷脂酶特异结合的分离出的或重组的抗体。这 些抗体可用来分离、鉴定或定量本发明的磷脂酶或相关的多肽。这些抗体可以用 于抑制本发明酶的活性。这些抗体可以用于分离与本发明那些物质相关的多肽， 如，相关的磷脂酶。抗体可以用于免疫沉淀，染色(如FACS)、免疫亲和柱等等。 如果需要的话，编码特异抗原的核酸序列可以通过免疫方法获得，随后分离出多 肽或者核酸，进行扩增或者克隆，将多肽固定在本发明的阵列上。可供选择地， 本发明的方法可以用于修饰由细胞产生的待修饰的抗体的结构，如，抗体的亲和 性可以增加或者降低。而且，制备或者修饰抗体的能力可以是通过本发明的方法 改造入细胞的表型。
[434]免疫、产生或者分离抗体(多克隆的或者单克隆的)的方法是本领域技术 人员所了解的，并且在科学和专利文献中有描述，参见，如，Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第7版)Lange Medical Publications，Los Altos， CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York。除了使用动物的传统的体内方法外，抗体也可以在 体外产生，例如，应用表达重组抗体结合位点的噬菌体展示文库。参见如， Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys. Biomol.Struct.26：27-45。
[435]多肽可以用于产生可以特异性结合本发明多肽的抗体。得到的抗体可以用 于免疫亲和层析方法中，来分离或者纯化多肽或者确定是否多肽存在于生物样品 中。在这样的程序中，将蛋白制备物，如提取物，或者生物样品与能够特异性结 合本发明的其中一个多肽的抗体相接触。
[436]在免疫亲和程序中，将抗体附着于固体支持物，如珠或者其它的柱基质。 在抗体特异性结合本发明多肽中的一个多肽的条件下，将蛋白制备物置于与抗体 接触。洗涤去除非特异性结合的蛋白后，洗脱特异性结合的多肽。
[437]在生物样品中的蛋白结合抗体的能力可以通过应用本领域技术人员熟悉 的任何不同的方法来测定。例如，结合可以通过用可检测的标记如荧光试剂、酶 标或者放射性同位素标记抗体来测定结合。可选择地，抗体与样品的结合可以应 用其上具有这样的可检测标记的第二抗体来检测。特定的分析包ELISA分析、夹 心法分析、放射免疫分析以及Western印迹。
[438]产生的针对本发明多肽的多克隆抗体可以通过直接注射该多肽至动物中 而得到，或者将该多肽施用动物例如，非人类动物而得到。这样得到的抗体随后 结合于该多肽本身。以这样的方式，可以应用仅仅编码多肽片段的序列来产生可 以结合整个天然多肽的抗体。这样的抗体随后可以用于从表达多肽的细胞中分离 该多肽。
[439]为了制备单克隆抗体，可使用可通过连续细胞系培养来产生抗体的任何技 术。实例包括杂交瘤技术、trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术 (参见例如Cole(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.， pp.77-96)。
[440]可以对产生单链抗体的技术(参见，如，美国专利编号4,946,778)进行 调整，用于产生针对本发明多肽的单链抗体。可选择地，可以用转基因鼠来表达 针对这些多肽或者其片段的人源化的抗体。
[441]产生的针对本发明多肽的抗体可以用于从其它的生物体和样品中筛选类 似的多肽。在这样的技术中，将来自该生物体的多肽与该抗体接触，检测特异性 结合抗体的那些多肽。以上所述的任何程序可以用于检测抗体结合。
试剂盒
[442]本发明提供了包括以下成分的试剂盒，如，核酸，表达盒，载体，细胞， 多肽(如含有至少一种本发明的磷脂酶的试剂盒)和/或本发明的抗体(如含有至 少一种本发明的抗体的试剂盒)。该试剂盒也可以含有指导性材料，来指导本发 明的方法学和工业应用，正如在此所述。
本发明酶的工业和医学应用
[443]本发明提供了使用本发明的多肽，例如磷脂酶和本发明的其他酶，例如磷 脂酶A、B、C和D、patatins的许多工业应用和医学应用，包括转换不可水合的磷 脂至水合形式、油脱胶，处理来自植物、鱼、藻类和类似物的油，在此仅仅指出 了几种应用。在任何这些可选择的工业应用和医学应用中，酶可以以特定的顺序 加入，例如具有不同的特异性的磷脂酶以特定顺序加入，例如首先加入具有PC- 和PE-水解活性的酶(或加入两种酶，一种具有PC-水解活性，另一种具有PE-水解 活性)，然后加入具有PI-水解活性(例如PLC活性)的酶，或其任何组合。
[444]任何或所有本发明的方法可用于“加工级”，例如在约15,000；25,000； 50,000；75,000或100,0001 bs精炼油/天至约1、2、3、4、5或6百万或更多1bs 精炼油/天级别上进行的油加工或精炼。
[445]在工业应用中使用磷脂酶的方法是本领域所熟知的。例如，本发明的磷脂 酶和方法可以用于处理脂肪和油，如，在日本专利申请公布H6-306386中所述， 该申请描述了将存在于油和脂肪的磷脂转化为含有磷酸基团的水溶性物质。
[446]本发明的磷脂酶可以用于处理植物油和磷脂，如那些来源于或者分离自米 糠、大豆、油菜、棕榈、棉籽、玉米、棕榈仁、椰子、花生、芝麻、向日葵的植 物油和磷脂。本发明的磷脂酶可以用于处理提炼油，如，那些来自果籽的油，如 葡萄籽、杏仁、琉璃苣等。本发明的磷脂酶可以用于处理以不同形式存在的油和 磷脂，包括粗制品形式、脱胶的、胶、洗涤水、黏土、硅石、皂脚和类似物。本 发明的磷脂酶可以用于处理高磷含量的油、鱼油、动物油、植物油、藻类油和类 似物。在本发明的任何方面，任何时候可以应用磷脂酶C，一种选择包括应用本发 明的磷脂酶D和磷酸酶(如，应用PLD/磷酸酶的组合来提高高磷含量油如大豆豆 油的产量)。
[447]本发明的磷脂酶可以用于处理和制备食用油、生物柴油，用于药物学和化 妆品的脂质体、结构磷脂和结构脂类。本发明的磷脂酶可以用于油提取。本发明 的磷脂酶可以用于处理和制备各种肥皂。
加工食用油：产生1，3-二酰基甘油(1，3DAG)
[448]本发明提供了使用本发明的酶(或多种酶)来制备1，3-二酰基甘油(1，3DAG) 的工艺。在一个方面，磷脂酶C或磷脂酶D加磷酸酶产生1，2-二酰基甘油；这提 高了在食用油精炼期间的油产量。当用于包括碱中和步骤的工艺时，例如作为碱 精炼助剂，多达70％的1，2-二酰基甘油(1，2DAG)进行了酰基转移，被转化为 1，3-DAG。1，3-DAG具有增加的健康益处，因此使用PLC作为碱炼助剂产生具有 增加的营养价值的油。
[449]本发明提供了使用本发明的酶(或多种酶)制备和加工食用油的工艺，包 括产生具有增加数量的1，3-DAG的食用油。二酰基甘油是许多食用油中天然存在 的化合物。在本发明方法，例如油脱胶工艺的一个方面，碱(苛性碱)引起PLC 产生的1，2-DAG异构化成1，3-DAG，其提供超过1，2-DAG的营养健康价值，例如 1，3-DAG作为能量被燃烧掉，而不是作为脂肪被储存起来(1，2-DAG则是这样)。通 过在碱炼工艺开始时加入PLC(酸和碱随后)，本发明的方法产生提高水平的 1，3-DAG(减少1，2-DAG)。从营养角度看，1，3-DAG优于1，2-DAG。在可选择的方 面，本发明包括使用本发明的PLC的油脱胶工艺，从而产生含有不少于0.5％、1.0％、 2.0％或3.0％或更多1，3-DAG的最终脱胶的油产物。
[450]因此，本发明提供(通过酯交换作用)制备精炼油(例如二酰基甘油)——包括 食用油——的工艺，其含有增加水平的1，3-二酰基甘油(1，3-DAG)，如在实施例13 中所示，其中磷脂酶，诸如本发明的酶，是“前期加载型的(front-loaded)”，或在加 入酸或者碱之前加入。由甘油三酯的酶促水解产生DAG，通过异构化由1，2 DAG 产生1，3DAG。相比传统的食用油，含有1，3DAG的食用油显示出不同的代谢效 应。1，3DAG和1，2DAG或甘油三酯之间代谢途经的差异使得较大部分的来自1，3 二酰基甘油的脂肪酸作为能源被燃烧掉，而不是作为脂肪储存起来。临床研究已 经显示，经常食用DAG油作为明智膳食(sensible diet)的一部分，能帮助个体控制 他们的体重和体内脂肪。此外，1，3DAG的代谢减少血流中循环的餐后甘油三酯。 因为肥胖和增高的血脂是与慢性疾病包括心血管疾病和II型糖尿病相关的危险因 素，这些与生活方式相关的健康状况可以受到有规律的消耗DAG油这样的有益方 式的影响。
[451]可以通过各种方法食用含DAG的油。因此，在一个方面，本发明提供使 用本发明的酶制备食物的工艺，食物例如具有增加水平的1，3-DAG二酰基甘油的 焙烤食物，和含有二酰基甘油油的焙烤食物。在一个方面，焙烤食物是饼干、蛋 糕和类似的焙烤食物。
[452]在可选择的实施方案中，可以用于本发明方法，包括食用油加工方法的酶 的组合包括(其中在该组合中的一种、若干种或所有酶包含本发明的酶)：
PLC+PI-PLC+PLA(PLC反应完成后加入PLA)；
PLD+磷酸酶+PI-PLC，然后加入PLA；或
PLC或(PLC+PI-PLC)+PLA，对磷脂酸具有特异性(所有的酶同时或依 次加入)。
油脱胶和植物油的处理
[453]本发明的酶(例如具有脂酶、磷脂酶、酯酶和/或糖苷酶或等同活性的多肽) 可以用于各种植物油加工步骤中，诸如用于植物油提取，特别地，用于在称为“油 脱胶”的工艺中除去“磷脂胶”。
[454]本发明的这些工艺可用于“加工级”，例如在约15,000；25,000；50,000； 75,000或100,000 1bs精炼的油/天至约1、2、3、4、5或6百万或更多1bs精炼的 油/天的级别上。
[455]在一个方面，本发明提供了油脱胶的方法，该方法包括使用本发明的磷脂 酶，例如本发明的PLC。在一个方面，该方法还包括添加另一磷脂酶(其也可以 是本发明的磷脂酶)，例如本发明的其他PLC、PLA、PLB、PLB或patatin或具 有溶血磷脂酶-转酰基酶(LPTA)活性或溶血磷脂酶(LPL)活性和溶血磷脂酶-转酰基 酶(LPTA)或它们的组合的酶，和/或patatin样磷脂酶(其也可以是本发明的酶)。在 一个方面，所有酶一起加入，或可选择地，酶以特定的顺序加入，例如加入PLC 后加入PLA和/或patatin；或者首先加入具有PC和PE活性的酶或许多酶，然后 加入PI PLC。
[456]在一个方面，因磷脂酶(例如，本发明的PLC)处理的结果，该过程使得 产量提高。在一个方面，因磷脂酶(例如，本发明的PLA)处理的结果，该过程 使得油中的磷含量额外地减少。
[457]在一个方面，本发明提供了这样的工艺，包括使用本发明的磷脂酶，例如 本发明的PLC来减少胶的量并通过减少油被捕获的数量来增加中性油(甘油三酯) 产量。在一个方面，本发明提供这样的工艺，包括使用本发明的磷脂酶，例如本 发明的PLC来增加中性油和二酰甘油(DAG)的产量，以增加油相。在可选择的方 面，本发明的方法(例如脱胶方法)可以包含一种或多种其他的酶，诸如蛋白酶、 淀粉酶、角质酶、另一磷脂酶(包括例如本发明的酶)、糖酶、纤维素酶、果胶 酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如乳糖酶和/或 过氧化物酶或具有等同活性的多肽，或其组合。
[458]本发明的磷脂酶可以用于各种植物油处理步骤，如在植物油的提取中，特 别地，用于在上述称为“油脱胶”的过程中去除“磷脂胶”。本发明提供了用于处理不 同来源的植物油的方法，所述来源如米糠、大豆、油菜、花生和其它的果实、芝 麻、向日葵、棕榈和玉米。该方法可以与基于用如己烷提取的工艺联合，随后将 粗提取物精炼成食用油，其中包括使用本发明酶和方法。精炼顺序的第一步骤是 所谓的“脱胶”过程，其用于通过加入水来分离磷脂。分离通过脱胶沉淀的物质，并 且进一步处理成卵磷脂混合物。商业上应用的卵磷脂，如大豆卵磷脂和向日葵卵 磷脂，是半固体的或者是非常粘稠的物质。它们是由极性脂类和油的混合物组成， 其中，极性脂类主要是磷脂，油主要是甘油三酯。
[459]本发明的磷脂酶可以用于任何“脱胶”过程，包括水脱胶、ALCON油脱胶 (如，用于大豆)、safinco脱胶、“超脱胶”、UF脱胶、TOP脱胶、单脱胶 (uni-degumming)、干法脱胶和ENZYMAXTM脱胶。参见，美国专利6,355,693； 6,162,623；6,103,505；6,001,640；5,558,781；5,264,367。本发明方法整合的各种 脱胶过程描述于Bockisch，M.(1998)In Fats and Oils Handbook，The extraction of Vegetable Oils(Chapter5)，345～445，AOCS Press，Champaign，lllinois。本发明的磷 脂酶可以用于甘油三酸酯油的酶促脱胶的工业应用，如在EP 513 709中所述。
[460]在一个方面，本发明的磷脂酶用于处理植物油，例如粗油，诸如米糠、大 豆、油菜、花和类似物。在一个方面，这提高脱胶工艺的效率。在一个方面，本 发明提供了在低水条件下进行酶脱胶的方法，例如在约0.1％至20％水，或0.5％至 10％水的范围内。在一个方面，这提高了在离心期间，重相从油相的分离水平。对 这些相提高的分离水平能够导致磷脂更有效地从油中去除，包括可水合的和不可 水合的油。在一个方面，这能够产生含有较少捕获的中性油(甘油三酯)的胶组分， 从而提高脱胶工艺期间的总油产量。
[461]在一个方面，本发明的磷脂酶，例如具有PLC活性的多肽用于处理油(例 如植物油，例如粗油，诸如米糠、大豆、油菜、花和类似物)，例如用于脱胶工 艺，以减少胶量和通过减少油捕获而增加中性油含量。在一个方面，本发明的磷 脂酶，例如具有PLC活性的多肽，用于生产二酰甘油(DAG)和用于增加油相。
[462]本发明的磷脂酶可以用于酶促脱胶的工业应用，如，在CA1102795中所述， 其描述了通过加入至少50％重量百分比的水从谷物脂类中分离极性脂类的方法。 以其应用的原理是加入水到粗油混合物的角度来看，该方法是经过改良的脱胶过 程。
[463]一方面，本发明提供了酶促过程，包括应用本发明磷脂酶(如，PLC)， 包括水解在油中的水合磷脂，温度为约20℃到40℃，碱性pH，如pH为大约pH8 到pH10，反应时间为大约3到10分钟。这可以导致油中的最终磷水平少于10ppm。 本发明也提供了酶促过程，包括应用本发明磷脂酶(如，PLC)，包括水解油中可 水合的和不可水合的磷脂，温度大约50℃到60℃，pH值略低于中性，例如大约 pH5到pH6.5，反应时间为大约30到60分钟的条件下。这可以导致油中的最终磷 水平少于10ppm。
[464]在一方面，本发明提供了酶促过程，该过程利用磷脂酶C酶水解甘油磷酸 酯键，从而使得能将磷脂中的二酰甘油部分返回到油中，如植物油、鱼油或者藻 类的油(“磷脂酶C(PLC)苛性碱精炼助剂”)；和，在脱胶步骤中将磷脂含量减 少至对于待物理精炼的高磷油足够低的水平(磷脂酶C(PLC)脱胶助剂”)。这 两种方法能够产生不同价值并且具有不同的目标应用。
[465]在本发明各种示例性过程中，很多不同的步骤组成了核心的漂白和脱臭精 炼过程之前的脱胶过程。这些步骤包括，加热、混合、维持、分离和干燥。在加 热步骤以后，加入水，常常是酸，并且混合，以便使得不溶性的磷脂“胶”凝聚成可 以被分离的颗粒。虽然在脱胶过程中水分离很多磷脂，但是部分磷脂是以钙盐或 者镁盐的形式存在的不可水合的磷脂(NHPs)。脱胶过程通过加入酸处理这些 NHPs。在磷脂水合以后，油被混合，维持并且通过离心分离。最后，将油干燥并 且贮存、运输或者精炼，如图6所示。得到的胶既可以进一步处理以获得卵磷脂 产物，也可以加回到食物中。
[466]在本发明各种示例性工艺中，磷的水平被降到低至对于物理精炼足够低。 与苛性碱精炼相比，该分离过程可能导致潜在更高的产量损失。此外，脱胶过程 可能产生不能以商业卵磷脂出售的废物，参见，例如图7，图7是物理精炼油的示 例性的脱胶过程。因此，这些过程并没有取得显著的市场份额，碱精炼过程继续 统治着米糠、大豆、油菜和向日葵工业。然而，注意，用于特殊脱胶过程的磷脂 酶C酶将降低胶的形成，并且将磷脂中的甘油二酯部分返回到油中。
[467]在一个方面，本发明提供了在胶组分中使用本发明的PLC的方法。在该方 法的一个方面，将油加入到粗油中，以产生乳状液，这导致磷脂酰胆碱、磷脂酰 乙醇胺和磷脂酰肌醇移入水相(水脱胶)。离心之后，这些磷脂是含水胶组分的 主要组分。胶组分中的磷脂可以用磷脂酶C或磷脂酶D加磷酸酶(或其他组合， 参见下面描述)处理，以产生二酰甘油(DAG)和磷酸酯。在此时，DAG可以从其 他胶组分中提取出来，并在适合于对DAG进行转酯作用的条件下用脂酶处理，产 生期望的三酰甘油(结构性类脂)。
[468]在另一方面，利用在PLC反应后例如通过加入碱增加胶的pH，大部分的 1，2-DAG可以被转化为1，3-DAG。1，3-DAG然后可以从胶中提取出来，并在合适 的条件下与脂酶反应，以在sn2位置对1，3-DAG进行转酯作用，从而产生期望的 结构性三酰甘油。
[469]在可选择的方面，用于转酯反应的脂肪酸，可以来自各种来源，包括粗油 中发现的游离脂肪酸。
[470]在一个方面，来自水脱胶的磷脂与本发明的PLC组合使用，产生结构性类 脂。水脱胶的油可以暴露于PLC和/或PLD(其中之一或两者可以是本发明的酶) 加磷酸酶或这些组合中的其中一种，然后暴露于PLA(可以是本发明的酶)，以将 磷减少至适合于碱或物理精炼的水平。
[471]在可选择的实施方案中，可以用于本发明方法包括这些脱胶工艺的酶的组 合包括(其中该组合中的一种、若干种或所有酶包含本发明的酶)：
PLC+PI-PLC+PLA(PLC反应完成后加入PLA)；
PLD+磷酸酶+PI-PLC，然后加入PLA；或
PLC或(PLC+PI-PLC)+PLA，对磷脂酸具有特异性(所有的酶同时或依次 加入)。
碱法精炼(caustic refining)
[472]本发明提供了在碱炼中使用磷脂酶(包括本发明的酶)的过程，其中酶被 用作碱炼助剂。在可选择的方面，PLC或PLD和/或磷酸酶用于滴加的过程，既 可以在碱法中和精炼过程(既可以连续精炼也可以间歇精炼)之前，期间，或者 之后。加入的酶量可以根据工艺来变化。用于本工艺的水的水平可以是低水平的， 例如约0.5到5％。可选择地，通过多次，将苛性碱加入至该工艺中。此外，该过 程可以在不同的温度下(25℃到70℃)，不同的酸或碱条件下，并且在变化的pH 值(4到12)下进行。可以使用浓的碱溶液，例如比11％的工业标准浓度更大， 以减少胶的量。在可选的方面，浓的碱溶液浓度在约12％至50％之间，例如约20％、 30％、40％、50％或60％或更浓。
[473]在一方面，本发明的磷脂酶C在甘油磷酸酯键处水解磷脂，产生甘油二酯 和水溶性的磷酸化合物。水解的磷脂进入到水相，而甘油二酯留在油相中，如在 图8所说明的。PLC“碱炼助剂”的一个目的是将在中和过程中形成的磷脂胶转化 为二酰甘油，二酰甘油将又转移回到油相。相反地，“PLC脱胶助剂”的一个目 的是将粗油中的磷脂降低为少于百万分之十(10ppm)的磷当量。
[474]可以用于碱炼过程的酸，包括但是并不限于，磷酸、柠檬酸、抗坏血酸、 磺酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、盐酸和/或乙酸。酸被用于水合不可水合的磷脂。 可以应用的碱包括但不限于，KOH和NaOH。碱被用于中和游离脂肪酸。可选择 地，磷脂酶，或者更特别地，PLC或者PLD和磷酸酶，用于从胶/皂脚中纯化植 物固醇。
[475]在碱炼前加入磷脂酶的本发明的可选择的实施方案是在植物中表达磷脂 酶。在另一个实施方案中，在压碎植物、种籽或者其它的植物部分期间加入磷脂 酶。可选择地，在压碎后，但是在精炼前(即是在容器中)加入磷脂酶。此外， 在有酸或无酸的条件下，加入磷脂酶作为精炼预处理。
[476]已经描述过的本发明的另一个实施方案，是在碱炼过程期间加入磷脂酶。 在这一过程，酸和碱的水平依赖于磷的水平和游离脂肪酸的水平而变化。此外， 该过程使用宽的温度和pH范围，这依赖于所应用的酶的种类。
[477]在本发明的另一个实施方案中，磷脂酶在碱炼后加入(图9)。在一个例 子中，在分离前，磷脂酶加入到强力混合器(intense mixer)或者滞留混合器 (retention mixer)。可选择地，磷脂酶在加热步骤后加入。在另一个实施方案， 磷脂酶在离心步骤中加入。在额外的实施方案中，磷脂酶加入到皂脚中。可选择 地，磷脂酶加入到洗涤水中。在另一个例子中，磷脂酶在漂白和/或脱臭步骤中加 入。
[478]在一个方面，在漂白和脱臭之前，磷脂酶，例如磷脂酶C，本发明的酶将 水解中和过的粗的和脱胶的油中水合和非水合磷脂的磷脂。本发明的示例性的“碱 炼”工艺在图9和图13中示出。图9包括静态混合器(static mixer)的示例性时间、 温度和pH(30至60分钟、50至60℃，pH5至6.5)和滞留时间(3至10分钟，20-40℃)。 目标酶可以作为滴加物(drop-in product)应用于现有的碱法中和工艺中，如在图9 中所示。在该方面，如果酶在加入碱之后加入，酶将不必经受极端的pH水平。如 图13(酶“前载型”示例性工艺)所示，任何磷脂酶，包括本发明的磷脂酶，诸如PLC、 PLB、PLA和/或PLC都可以用于粗油脱胶工艺，如Bailey′s Industrial Oil & Fat Products v.4(ed.Y.H.Hui)中所述。图14和图15示出了本发明方法的变化，其中 两个或三个离心步骤分别用于所述工艺中，其可以用于加工任何油，例如植物油， 诸如粗的大豆油，如图中所示。图15的示例性方法在碱炼之前具有离心步骤(除了 碱炼之后和水洗之前，和水洗之后的离心步骤)，而图14的示例性方法在碱炼之前 并没有离心步骤。图16示出了该工艺的另一示例性变化，其使用酸处理并在脱胶 步骤之前有离心步骤；该示例性工艺用于处理任何油，例如植物油诸如粗的豆油， 如图所示。
[479]一方面，本发明的磷脂酶使得磷除至低到物理精炼可接受的水平。一方面， 本发明的PLC将在漂白和脱臭前，水解来自粗油中水合和非水合磷脂的磷脂。在 目前的脱胶操作中，靶酶可以作为点滴形式的产品应用，参见例如图10。假如在 商业设备中为亚最佳状态的混合，很可能需要酸来引起非水合的磷脂与酶在油/水 的界面上接触。因此，一方面，应用本发明的酸稳定性PLC。
[480]一方面，本发明的PLC脱胶助剂工艺可以减少表2中示出的一个或者所有 三个项目的损失。在PLC过程中相关的损失，以质量为基础计算，据估计可以为 大约0.8％，相对地，由于磷脂的去除，则为5.2％。
表2：由PLC产品所致的损失
  碱炼助剂 脱胶助剂 1)胶形成和分离中的油损失2.1％ X X 2)在加入苛性碱中皂化的油3.1％ X 3)在漂白中黏土中捕获的油*<1.0％ X X 总产量损失        ～5.2％ ～2.1％ ～5.2％
[481]本发明该过程的另外潜在的益处包括如下：
◆减少的吸附剂—对较低水平(<5ppm)的磷，需要较少的吸附剂
◆较低的化学剂用量—与非水合磷脂的水合作用相关的化学剂和工艺成本较 少
◆较低的废物产生—需要较少的水来从油中去除磷
[482]通过本发明的方法(如“脱胶”)处理的油包括植物油种籽，如，大豆油、 油菜籽油、米糠油和向日葵油。一方面，本发明的“PLC碱炼助剂”可以比目前 的碱炼工艺节约1.2％。精炼助剂应用用于豆油，该豆油已经针对卵磷脂进行脱胶， 并且这些也从值/加载计算中扣除。
[483]本发明工艺的执行目标可以根据应用而变化，并且更特异地，根据酶加入 的点而变化，参见表3。
表3 应用的执行目标

[484]可以应用本发明磷脂酶，如，磷脂酶A1的其它工艺可以将非水合的天然 磷脂转化为至水合的形式。一方面，该酶对热敏感。因为对油加热可以破坏酶， 这可能是需要的。然而，脱胶反应必须调节为pH4-5以及60℃来适应该酶。在300 个单位/kg的油饱和剂量时，该示例性工艺的成功之处在于将以前的水脱胶油的磷 含量降至<10ppm P。优点可以是减少的H2O含量，而且在应用、处理和废物中所 导致的节约。表4列出了本发明酶的示例性的工业应用：
表4：示例性应用
  碱炼助剂 脱胶助剂 豆油/卵磷脂产生 X 化学精炼的豆油、向日葵油、油菜油 X X 低磷脂油(如，棕榈) X
[485]除了这些不同的“脱胶“工艺，本发明的磷脂酶可以用于任何的植物油处理 步骤。例如，在任何植物油的处理步骤中，本发明的磷脂酶可以用于替代PLA， 如磷脂酶A2。用本发明的方法“处理”或者“脱胶”的油包括大豆油、油菜籽油、玉 米油、来自棕榈仁的油、油菜油、向日葵油、芝麻油、花生油、米糠油和类似油。 该工艺的主要产物包括甘油三酯。
[486]在一种示例性工艺中，当酶加入到粗制油，并且与粗制油反应时，每1kg 的粗制油所应用的磷脂酶的量为约10-10,000单位，或者，可选择地，约100-2,000 单位。酶处理进行5分钟到10个小时，温度为30℃到90℃，或者，可选择地， 约40℃到70℃。条件可以依赖于酶的最适温度而变化。加入用于溶解酶的水的量 为，每100重量份的粗制油使用5-1,000重量份的水，或者可选择地，大约每100 重量份的粗制油使用大约10到200重量份的水。
[487]一旦这样的酶处理过程完成后，用合适的方式，如离心分离器分离酶液体， 并得到经处理的油。以这样的工艺对胶状物进行酶分解所产生的含磷化合物实际 上全部被转移到水相，并且从油相中去除。一旦酶处理完成后，如果需要，处理 的油可以另外用水或者有机或者无机酸洗涤，如乙酸、柠檬酸、磷酸、琥珀酸和 等同的酸，或用盐溶液洗涤。
[488]在超滤脱胶的一个示例性过程中，在过滤前，将酶结合于过滤器，或者将 酶加入到油中，或定时用酶清洗过滤器。
[489]在磷脂酶介导的物理精炼助剂的示例性工艺中，将水和酶加入到粗制油中 (例如粗植物油)。一方面，本发明的PLC或者PLD以及磷酸酶用于该工艺中。 在磷脂酶介导的物理精炼中，水可以是低水平的，即0.5-5％，处理时间应当短(少 于2小时，或者少于60分钟，或者少于30分钟，或者少于15分钟，或者少于5 分钟)。该工艺可以在不同的pH(如，3-10)，不同的温度(25℃到70℃)下， 应用不同的酸和/或碱进行。
[490]在可选择的方面，水脱胶首先进行，通过离心收集卵磷脂，然后加入本发 明的PLC或PLC和PLA以去除非水合的磷脂(该工艺应当在低的水浓度下进行)。 另一方面，对粗制油进行水脱胶至低于10ppm(食用油)，随后进行物理精炼(对 于生物柴油低于50ppm)。一方面，加入乳化剂，和/或将粗制油置于强力混合器 中促进混合。可选择地，加入破乳剂，和/或对粗制油加热来促进水相的分离。另 一方面，加入酸来促进非水合磷脂的水合。另外地，磷脂酶可以用于介导从胶/皂 脚中纯化植物固醇。
[491]在一个方面，本发明提供了用于油脱胶的组合物和方法(其可以包括使用本 发明的磷脂酶)，包括使用变化数量的酸和碱，而不制备皂脚。使用本发明油脱胶 的这一方面，酸(包括磷酸和/或柠檬酸)可以用于水合高磷含量油(包括大豆、 油菜和向日葵)中的非水合的磷脂。一旦磷脂被水合，加入碱，可以提高水相的 pH：加入的碱的量可以为酶活性产生有利的pH，但不会导致在油中形成显著的皂 脚组分。因为不形成皂脚，油中的游离脂肪酸可以在下游除去，这发生在脱胶步 骤之后，漂白和脱臭期间。
[492]本发明的酶可用于改进油提取和油脱胶效果(例如植物油)。在一个方面， 本发明的PLC和至少一种植物细胞壁降解剂(例如纤维素酶、半纤维素酶或类似物， 以使细胞壁柔软并增加提取时的产量)被用于本发明的工艺中。在该使用本发明的 酶以改进油提取和油脱胶的示例性方法中，本发明的磷脂酶C以及其他水解酶(例 如纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶和/或磷酸酶)用于与油生产(包括但是不 限于大豆、油菜、向日葵、米糠油)相关的破碎步骤期间。通过在溶剂提取之前使 用酶，或代替溶剂提取，有可能增加油产量和减少粗油中水合和非水合的磷脂的 数量。非水合磷脂的减少可以归因于在与钙或镁络合之前，潜在的非水合磷脂转 化为二酰甘油和相应的磷酸酯。粗油中磷脂总的减少量将提高精炼期间的产量， 并有可能无需在漂白和脱臭之前独立的脱胶步骤。
[493]在一个方面，本发明提供了将本发明的磷脂酶(例如本发明的磷脂酶-特异 性磷酸水解酶)或另一磷脂酶用于修改的“有机精炼过程”的工艺，其可以包括将酶 (例如PLC)加入盛有柠檬酸的桶中。
[494]本发明的酶可以用于任何油处理方法，如，脱胶或等同的工艺。例如，本 发明的酶可以用于美国专利5,558,781；5,264,367；6,001,640所描述的工艺中。USPN 5,558,781所描述的工艺应用磷脂酶A1，A2或B，实质上降解了油中的卵磷脂， 其作为乳化剂发挥作用。
[495]通过应用本发明的磷脂酶，如具有磷脂酶A和/或B活性的多肽，本发明 的酶和方法可以用于旨在减少包含高含量非水合磷的食用油中的含磷组分的过程 中，如在EP专利号：EP 0869167中所述。一方面，食用油是粗制油，所谓的“非- 脱胶油”。一方面，该方法处理非脱胶油，包括压榨油或者提取油，或者其混合物， 它们来自，例如油菜籽、大豆、芝麻、花生、玉米、米糠或向日葵。在粗制油中， 磷脂含量可以从0.5到3％w/w之间变化，对应于磷含量的范围为200到1200ppm， 或者在250到1200ppm范围内。除了磷脂，粗制油也可以含有低浓度的碳水化合 物、糖化合物，和Ca、Mg和Fe的金属/磷脂酸复合物。一方面，工艺包括用本发 明的磷脂酶处理磷脂或者溶血磷脂，以便水解脂肪酰基基团。一方面，磷脂或者 溶血磷脂包括卵磷脂或者溶血卵磷脂。本工艺的一方面，食用油具有的磷含量为 在大约50到250ppm之间，而且该工艺包括用本发明的磷脂酶处理油，以便水解 大部分的磷脂，并且从油中分离含有水解的磷脂的水相。一方面，酶法脱胶过程 之前，对油进行水脱胶。一方面，该方法生产动物饲料，所述生产包括将本发明 磷脂酶与饲料物质以及至少一种磷脂混合。
[496]本发明的酶和方法可以用于油脱胶过程，正如在WO 98/18912所描述的。 本发明的磷脂酶可以降低食用油中的磷脂含量。该工艺可以包括用本发明的磷脂 酶处理油，来水解大部分的磷脂，并且从油中分离含有水解的磷脂的水相。该工 艺可以用于纯化含有磷脂的任何食用油，如，植物油，例如大豆油、米糠油、油 菜籽油和向日葵油、鱼油，藻类油和动物油和类似油。在用酶处理以前，植物油 优选地进行预处理，例如通过湿法精炼去除粘质(黏液)。在开始用磷脂酶处理 之时，该油可能含有约50-250ppm的磷，或约50至约1500ppm的磷，或更多的 磷，如磷脂，并且本发明的工艺可以将该值降低到约5-10ppm以下。
[497]本发明的酶可以用于如1993年4月25日提交的日本申请H5-132283所述 的工艺，该日本申请包括纯化油和脂肪的工艺，该工艺包括步骤：将油和脂肪中 的磷脂转化为含磷酸基团的水溶性物质，并且作为水溶性物质去除它们。酶的作 用是用于转化成水溶性物质。优选使用的酶是具有磷脂酶C活性的酶。
[498]本发明的酶可以用于如“Organic Refining Process，”(ORP)(IPH，Omaha， NE)所述的工艺，其是精炼种子油的一种方法。ORP可能具有优于传统化学精炼 的优点，包括提高的精油产量、增值的副产品、较低的资金成本和更低的环境成 本。
[499]本发明的酶可以用于处理油或脂肪，动物或者植物的，未加工的、半加工 的或者精炼的油或脂肪的工艺，包括将本发明的至少一种酶加入到这样的油或者 脂肪中，该酶能够水解和/或解聚在油中含有的非甘油酯化合物，例如EP申请号： 82870032.8所述。本发明用于水解和/或解聚在油中含有的非甘油酯化合物的示例 性方法为：
1)在油和脂肪中，加入之前溶解于少量合适溶剂(例如，水)中的本发明的 酶或者酶复合物，并混合。大量的溶剂是可能的，但是选择对该酶无毒性的和适 合的溶剂。这一加入可以在逐次加载的工艺中进行，也可以在连续的工艺中进行。 按照该工艺，加入到油和脂肪中所必需的酶量的范围可以依赖于酶以及待处理的 产物，范围从约5到400ppm，或约约20到400ppm；例如，对于1000kg的油或 者脂肪0.005kg至0.4kg的酶，并且优选地5到100ppm，即，对于1000kg的油 从0.005kg到0.1kg的酶，这些值应该理解为对于浓缩的酶而言，即没有稀释剂 或者溶剂。
2)使油或者脂肪通过固体或者半固体支持物上的本发明酶组成的固定的或 者不溶性过滤床，支持物优选呈现多孔的或者纤维性结构。在这一技术中，酶被 捕获于支持物的多孔或者纤维结构的微孔中。这些由例如，树脂或合成的多聚物， 纤维素碳酸盐，凝胶如琼脂糖，具有多孔结构的多聚物或共聚物的丝构成，从而 将处于溶液中的酶的小液滴捕获在它们的微孔中。关于酶的浓度，有可能达到支 持物的饱和水平。
3)以微小的液滴形式，将油和脂肪分散在稀释的酶溶液中，在可选择的方面， 含有约0.05到4％，或含有约0.2到4％体积的本发明的酶。这一技术描述在例如 比利时专利595,219中。具有圆锥形的盖子的几米高的圆柱形柱子充满了稀释的酶 溶液。对于这一目的，选择在待处理的油或者脂肪中无毒和不可溶混的溶剂，优 选水。柱子的底部装配了分配系统，在其中，油或者脂肪以极端分割的形式(每 m2大约10,000流量)连续注入。这样形成无数的油或者脂肪的液滴，液滴在酶溶 液中缓慢地升高并且碰到表面，从而在反应器的圆锥形盖子的顶部被连续排出。
[500]棕榈油可以在用本发明酶处理前进行预处理。例如，将大约30kg的未处 理的棕榈油加热到+50℃。在蒸馏水中制备具有纤维素酶和果胶酶的1％溶液。在 强烈搅拌几分钟下，将这些中的每一个以600g加入到油的水相溶液中。然后，在 中度搅拌的条件下，将油保持在+50℃，总反应时间是两个小时。然后，将温度 升高到+90℃，以使酶失活，并制备用于过滤和进一步处理的混合物。将油在真 空中干燥，并使用过滤助剂进行过滤。
[501]本发明的酶可以用在如EP专利EP 0 513 709 B2所述的工艺中。例如，本 发明提供了通过使用本发明的磷脂酶的酶促分解作用，减少动物和植物油中的含 磷成分的含量的工艺。在可选择的方面，将磷含量为约50至1500ppm，或约50 至250ppm的预先除去粘液的动物和植物油与有机羧酸混合搅拌，并将所得到的 混合物的pH值设定为约pH4至pH6，将含有本发明的磷脂酶A1、A2或者B的 酶溶液被加入到该混合物中，在混合容器中，通过强力搅拌，形成微小的液滴， 在其中，形成相对于油的重量百分比为0.5到5％的乳状液，所述的乳化作用的进 行通过至少一个后续的反应容器，在涡旋运动下，在反应时间为从0.1到10个小 时下，在温度的范围为20℃到80℃下进行，当从含水溶液中分离后，处理的油具 有的磷含量在5ppm以下。
[502]有机精炼工艺可以用于粗制油和脱胶油。该工艺在控制的工艺条件下，应 用在线方式加入有机酸，并与传统的离心分离相结合。从植物油磷脂(“VOP”)自 然分离的水被再循环，并再次使用。有机精炼工艺的结果为，总的水用量可以大 大降低。
[503]本发明的磷脂酶和方法也可以用于酶法处理食用油，如在美国专利 6,162,623中所述。在这一示例性的方法中，本发明提供了两亲性的酶。该酶可以 固定化，如，通过制备含有连续疏水相以及含有酶以及酶载剂的分散水相的乳状 液，并且从分散相中去除水，直到该相变成固体酶包被的颗粒。该酶可以是脂酶。 固定的脂酶可以用于由脂酶催化的反应，如甘油一酯、甘油二酯或者甘油三酯的 分子内酯化作用，或者当脂酶是磷脂酶时，从甘油三酯油去除磷脂。水相可以含 有发酵液，可食用的甘油三酯油可以是疏水相，载剂包括糖类、淀粉、葡聚糖、 水溶性纤维素衍生物和发酵残余物。这一示例性的方法可以用于处理甘油三酯、 甘油二酯、甘油单酯、甘油、磷脂、糖脂或脂肪酸，它们可以存在于疏水相中。 在一方面，用于去除甘油三酯油中的磷脂的工艺包括，混合含有磷脂的甘油三酯 油与含有本发明磷脂酶的制备物；将磷脂水解为溶血磷脂；从油中分离水解的磷 脂，其中磷脂酶是固定化的磷脂酶。
[504]本发明的磷脂酶和方法也可以应用于用酶法处理食用油，如在美国专利号 6,127,137中所述。这一示例性方法水解完整磷脂的两个脂酰基团。用于该示例性 方法的本发明的磷脂酶没有脂酶活性，并且其在很低的pH下具有活性。这些特征 使其非常适于油脱胶，这是因为油的酶法和碱法水解(皂化作用)可能均受到抑 制。在一方面，本发明提供水解磷脂或者溶血磷脂中的脂酰基团的工艺，包括用 磷脂酶处理磷脂或者溶血磷脂，所述磷脂酶水解磷脂中的两个脂酰基团并且基本 上无脂酶活性的。一方面，本发明的磷脂酶的最佳作用温度为约50℃，测定的条 件是在pH3到pH4下进行10分钟，并且最佳pH为大约pH3，测定的条件是在 40℃下进行10分钟。一方面，磷脂或者溶血磷脂包括卵磷脂，或者溶血卵磷脂。 一方面，在大部分的磷脂水解后，从油中分离含有水解的磷脂的水相。一方面， 本发明提供了工艺，用于从食用油中去除磷脂，包括用本发明磷脂酶的水溶液的 分散体，在pH1.5至pH3下处理油，并从油中分离含有水解的磷脂的水相。一方 面，在用磷脂酶处理前，处理油以除去粘质。一方面，在用磷脂酶处理前，该油 含有磷脂，其量相当于50到250ppm的磷。一方面，在存在0.5到5％的水的条 件下，在30℃到45℃，用磷脂酶处理1到12个小时，磷脂酶的剂量为0.1到10mg/l。
[505]本发明的磷脂酶和方法也可以用于用酶解处理食用油，如在美国专利号 6,025,171中所述。在这一示例性的方法中，本发明的酶是固定化的，通过制备含 有连续疏水相的乳状液，如甘油三酯油，和含有两亲性酶的分散水相，如本发明 的脂酶或者磷脂酶，和在水相中部分溶解和部分不溶解的载剂物质，并且从水相 中去除水，一直到该相变为固体酶包被的载剂颗粒。因为水相已经用水溶性物质 饱和了，载剂物质的非溶解部分可以是在水和油中不溶的物质，或者一种以未溶 解形式存在的水溶性物质。水相可以用含有发酵残留物和生物物质的粗制脂酶发 酵液形成，它们可以作为载剂物质。固定的脂酶可以用于油中的酯重排和脱酸化。 反应后，固定的酶可以通过加入水再生，用于以后的反应，并且得到载剂的部分 溶解，且所形成的含有酶和载剂的水相分散到疏水相中，通过该疏水相蒸发除水， 又一次形成酶包被的载剂颗粒。
[506]本发明的磷脂酶和方法也可以用酶解处理食用油，如在美国专利号 6,143,545中所述。该示例性方法应用本发明的磷脂酶来降低在食用油中含磷组分 的含量，该食用油中包括高含量的非水合磷。一方面，该方法用于降低食用油中 的含磷组分的含量，油中含有非水合磷的含量为至少50ppm，通过预处理食用油， 在60℃测定，通过加入含有柠檬酸单水合物的水溶液(加入的水对油为4.8％w/w； 在水相中的(柠檬酸)＝106mM，在水/油乳剂中的＝4.6mM)维持30分钟；转移 10ml的在油乳状液中的预处理水至试管中；在沸水浴中加热乳状液30分钟；在 5000rpm离心10分钟，转移大约8ml的上层(油)相至新的试管中，并且放置 24小时；从上清相中取2克，用于测定在食用油中的非水合磷的含量(ppm)。 该方法也可以包括在从大约pH5到8的pH条件下，让油接触本发明的磷脂酶A 或者B的水溶液(如，PLA1、PLA2或PLB)，该溶液在油中进行乳化，直到油 的含磷量下降到小于11ppm，然后从处理的油中分离含水相。
[507]本发明的磷脂酶和方法也可以用于酶法处理食用油，如在美国专利 5,532,163中所述。本发明提供精炼油和脂肪的工艺，通过该工艺，待处理的油和 脂肪中的磷脂可以被有效地分解和去除。一方面，本发明提供精炼油和脂肪的工 艺，包括，在乳状液中，使油和脂肪与本发明的酶反应，例如，与具有分解甘油 磷脂中甘油-脂肪酸酯键的活性的酶(如，本发明的PLA2)反应；也提供了另一 个工艺，其中用酶处理的油和脂肪用水或者酸性水溶液洗涤。一方面，用于洗涤 步骤的酸性水溶液是至少一种酸的溶液，如，柠檬酸、乙酸、磷酸以及它们的盐。 一方面，乳化条件为每100重量份数的油和脂肪应用30重量份数或者更多的水。 因为油和脂肪可以不用传统的碱法精炼步骤来纯化，所以可以减少洗涤废水和工 业废物的产生。此外，由于归因于它们被包括在这些废物中所致的天然油和脂肪 的损失并不在本发明的工艺中发生，所以油的回收产量增加。一方面，本发明提 供了用于精炼含有大约100到10,000ppm的磷脂的油和脂肪的工艺，包括：在乳 化的条件下，将所述的油和脂肪与具有分解甘油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键活性的 本发明的酶进行反应。一方面，本发明提供了用于精炼含有大约100到10,000ppm 的磷脂的油和脂肪的工艺，包括：在乳化的条件下，将所述的油和脂肪与具有分 解甘油磷脂中的甘油-脂肪酸酯键活性的本发明的酶反应；并且随后用洗涤水清洗 处理的油和脂肪。
[508]本发明的磷脂酶和方法也可以用于酶法处理食用油，例如，在美国专利号 5,264,367中所述。可食用植物油或动物油，如油，例如大豆油——其已经通过湿 法精炼去除了粘质——的含磷成分的含量以及铁含量，通过下述方法降低：通过 将所述油与本发明的酶，如磷脂酶A1、A2或者B的水溶液接触，进行酶促降解， 然后从处理的油中分离水相。一方面，本发明提供了酶促方法，用于降低油中的 含磷组分以及含铁组分的含量，该油已经进行了精炼，去除了粘质。已经进行精 炼去除了粘质的油，可以用本发明的酶处理，如用磷脂酶C、A1、A2或者B处理。 可以实现低于5ppm的磷含量，低于1ppm的铁含量。低的铁含量可以有助于油 的稳定性。
[509]本发明的磷脂酶和方法也可以用于制备酯交换的油，如在美国专利中 5,288,619所描述的。本发明提供了酶促酯交换的方法，用于制备具有低的反式酸 (tran-acid)和低中间物链脂肪酸(low intermediate chain fatty acid)含量的人造黄 油。该方法包括以下步骤：提供含有硬脂酸来源材料和可食用的液体植物油的酯 交换反应混合物；应用1-，3-位置特异性脂酶对硬脂酸来源材料和植物油进行酯交 换；然后，最后氢化脂肪酸混合物，来提供再循环的硬脂酸来源材料，用于与植 物油进行再循环反应。本发明也提供了制备酯交换油的逆流方法(counter-current method)。该方法包括下述步骤：提供含有1-，3-位置特异性脂酶的酯交换反应区域； 将植物油引入酯交换区域；引入硬脂酸来源物质；传输超临界气体或者亚临界液 化气体逆流流体；在反应区域中进行甘油三酯流与硬脂酸或者硬脂酸单酯流的酯 交换反应；撤掉酯交换的甘油三酯人造黄油流；撤掉逆流流体相；对酯交换的硬 脂酸或者硬脂酸单酯进行氢化作用，来提供氢化的再循环硬脂酸来源物质；并将 氢化的再循环硬脂酸源物质引入到反应区域。
[510]一方面，高度不饱和的磷脂化合物可以通过适当地应用本发明的磷脂酶C， 以去除sn-3位置的磷酸基团，随后进行1，3脂酶酰基酯的合成，而转变为甘油三 酯。2-取代的磷脂可以直接用作功能性食物成分，或者随后可以应用本发明的固定 化的磷脂酶C，选择性地在反应器160中进行水解，以便产生1-甘油二酯，随后 进行在此描述的酶促酯化反应，来产生具有2-取代的多不饱和脂肪酸组分的甘油 三酯产物。
[511]本发明的磷脂酶和方法也可以用于植物油酶促脱胶过程，如在美国专利 6,001,640中所描述的。该发明方法包括，在食用油的生产中的脱胶步骤。来自植 物油的可水合磷脂通过之前的水相脱胶过程已经被去除，用本发明的磷脂酶进行 酶促处理使植物油不含有非水合磷脂。该工艺可以是温和的、经济的并且对环境 无不良影响。仅仅水解溶血卵磷脂而不水解卵磷脂的磷脂酶用于该脱胶过程。
[512]一方面，为了使得本发明的酶能起作用，两相，含有酶的油相和水相，必 须充分混合。仅仅搅拌它们可能是不够的。如果其溶解于少量的水中，如0.5-5％ 重量百分比(相对于油)，并且以这一形式在油中进行乳化，从而形成直径少于 10微米的液滴(重均)，则有助于酶在油中很好地分散开。液滴可以小于1微米。 可以以径向速率超过100cm/秒进行剧烈的搅拌。应用外部旋转泵，油也可以在反 应器中循环。含有酶的水相也可以通过超声作用充分分散。可以应用分散仪器。
[513]酶反应可能发生在油相和水相之间的边界面上。所有这些混合措施的目标 在于，为含有酶的水相产生最大可能的表面积。表面活性剂的加入增加了水相的 微分散。所以，在一些情况下，将HLB值高于9的表面活性剂，如十二烷基硫酸 钠加入到酶溶液中，如在EP-A 0 513 709中所描述的。增加乳化作用的类似有效 的方法是加入溶血卵磷脂。加入量的范围相对于油在0.001％到1％之间，相对于油 而言。酶处理期间的温度不是至关重要的。可以应用的温度在20℃到80℃之间， 但是后者只能应用很短的时间。在该方面，应用具有良好的温度和/或低pH值耐 受性的本发明磷脂酶。最佳的应用温度在30℃到50℃之间。处理的时间取决于温 度，并且在增高温度时，处理时间可以变短。时间从0.1到10小时，或者从1到 5小时一般就足够了。反应发生在脱胶反应器中，其可以划分为几个阶段，如在 DE-A 43 39 556中所描述的。因此，可以进行连续操作，也可以进行间歇性操作。 反应可以在不同的温度阶段中进行。例如，温育可以在40℃下进行3小时，然后 在60℃下进行1小时。如果反应阶段式进行，也可能在各个阶段调节不同的pH 值。例如，在第一阶段，溶液pH值可以调节到7，例如，通过加入柠檬酸溶液， 在第二阶段，将pH值调节到2.5。然而，在至少一个阶段，酶溶液的pH值必须 低于4或者低于3。如果pH值被后续调节到低于这一水平，可能会损害效果。因 此，柠檬酸可以在酶被混合到油中之前被加入至酶溶液中。
[514]在酶处理完成以后，酶溶液以及包含在酶溶液中的NHP的分解产物，可 以例如通过离心的方式，从油相中分批或连续地分离出来。由于酶具有高水平的 稳定性，并且包含在溶液中的分解产物的量较少(它们可能沉淀为污泥)，同一 含水酶相可以重复应用几次。也有可能从污泥中释放出酶，参见，如，DE-A 43 39 556，因此基本上没有污泥的酶溶液可以被再次使用。在这一脱胶工艺的一个方面 中，得到含有少于15ppm磷的油。一个目标是磷含量少于10ppm；或者少于5ppm。 在磷含量低于10ppm的情况下，按照蒸馏脱酸工艺进一步处理油是十分可能的。 许多其它的离子，如镁、钙、锌以及铁，可以从油中去除，如低于0.1ppm。这样， 该产品为在进一步的处理和储存中具有好的耐氧化性具有理想的前提条件。
[515]本发明的磷脂酶和方法也可以用于降低植物油和动物油中含磷组分的量， 如在EP专利的EP 05 13709中所述。在这一方法中，之前已经经过了脱泥处理的 植物和动物油例如大豆油中的含磷组分尤其是磷脂如卵磷脂的含量，以及铁的含 量，通过应用本发明的磷脂酶A1、A2或者B的酶促降解作用而被降低。
[516]本发明的磷脂酶和方法也可以用于精炼脂肪或者油，如在JP06306386所 述。本发明提供了用于精炼脂肪或者油的工艺，该工艺包括将在脂肪或者油中的 磷脂转化成水溶性的含磷基团物质的步骤，并且除去该物质的步骤。本发明酶(如， PLC)的作用被用于将磷脂转化成这种物质。因此，有可能在无需进行碱炼步骤的 情况下，精炼脂肪或者油，碱炼步骤产生含有碱性废水和大量油的工业废物。由 于中性脂肪或者油逃逸到废物中的损失可以降低到零，所以可以实现产量的增加。 在一方面，胶状物质被转化成水溶性物质，通过加入本发明的具有磷脂酶C活性 的酶，作为水溶性物质而被去除，这在粗制油的脱胶过程和进行酶处理的阶段中 进行。一方面，本发明的磷脂酶C具有切割存在于磷脂中的甘油和磷酸的酯键的 活性。如果需要，该方法可以包括用水或者酸性水溶液洗涤经过酶处理的油。一 方面，加入本发明的酶，并且与粗制油反应。所用的磷脂酶C的量可以是每公斤 粗制油，10到10,000单位，或大约100到2,000单位。
[517]本发明的磷脂酶和方法也可以用于水脱胶过程，如，在Dijkstra，Albert J.， et al.，，Oleagineux，Corps Gras，Lipides(1998)，5(5)，367-370中。在该示例性的方法 中，水脱胶过程被用于产生卵磷脂，并且用于使用脱胶酸和漂白土的干法脱胶过 程。这一方法可能仅仅对于低磷脂含量的油是经济可行的，如，棕榈油、月桂油 等。对于具有高NHP含量的种子油，应用酸精炼过程，其中该过程在榨油机中进 行，以便允许经由粗粉(meal)的胶清除。一方面，该酸精炼油是在物理精炼之 前进行的一个可能的“精炼(polishing)”操作。
[518]本发明的磷脂酶和方法也可以用于脱胶过程，如在Dijkstra，et al.，Res.Dev. Dep.，N.V.Vandemoortele Coord.Cent.，Izegem，Belg.JAOCS，J.Am.Oil Chem.Soc. (1989)，66：1002-1009中所述。在该示例性的方法中，总的脱胶过程包括将酸，如 磷酸或者柠檬酸分散至大豆油中，允许接触一定的时间，随后将碱，如苛性钠或 者硅酸钠混合到油包酸(acid-in-oil)乳状液中。这可以将中和度低保持在足够低的水 平，以避免形成肥皂，这是因为那会导致油损失的增加。随后，油通过离心分离 器，在这种情况下，大多数胶状物从油流中去除，产生具有最少油含量的胶相(gum phase)。油流随后通过第二离心分离器中，以去除所有残留的胶，得到稀释的胶相， 其进行再循环。洗涤和干燥或者在线碱法精炼完成该工艺。在采用全部的脱胶工 艺以后，与经典的碱法精炼工艺相比，实现了总产量增加大约0.5％。完全脱胶的 油然后可以进行碱精炼，漂白和脱臭，或者被漂白和物理精炼。
[519]本发明的磷脂酶和方法也可以用于去除植物油如大豆油中的不可水合磷 脂，如在Hvolby，et al.，Sojakagefabr.，Copenhagen，Den.，J.Amer.Oil Chem.Soc. (1971)48：503-509中所描述。在这一示例性的方法中，水脱胶的油，在不同的固定 pH值下，与含有和不含有Ca++、Mg/Ca结合试剂的缓冲液，以及表面活性剂混合。 不可水合的磷脂可以作为微胶粒或者混合乳化剂组分在未转化的状态下去除。更 进一步地，不可水合磷脂可以通过转化为解离形式而去除，例如通过从磷脂中去 除Mg和Ca，该过程可以通过酸化或者通过用Mg/Ca络合或者Mg/Ca沉淀试剂处 理来完成。不可水合磷脂的去除或者化学转化可能导致乳状液形成减少，和来自 乳状液层和皂脚中的脱酸化油的分离有所改善。
[520]本发明的磷脂酶和方法也可以用于植物油的脱胶，如在Buchold，et al.， Frankfurt/Main，Germany.Fett Wissenschaft Technologie(1993)，95(8)，300-304中所 述。在本发明的用于食用植物油脱胶的这一示例性工艺中，用本发明酶如，磷脂 酶A2的水悬浮液，来水解结合在磷脂sn2位上的脂肪酸，得到不溶于油的1-酰基 -溶血磷脂，并且因此更适用于物理分离。甚至加入少量的相当于大约700lecitase 单位/公斤油，得到的残留磷浓度少于10ppm，这样化学精炼是可以用物理精炼替 代的，省略了中和、皂脚破裂和废水处理的必要。
[521]本发明的磷脂酶和方法也可以用于植物油的脱胶，如EnzyMax.Dahlke， Klaus.Dept.G-PDO，Lurgi O1-Gas，Chemie，GmbH，Frankfurt，Germany.Oleagineux， Corps Gras，Lipides(1997)，4(1)，55-57中所述。该示例性过程是一个用于物理 精炼几乎任何种类油的脱胶过程。通过酶催化的水解，磷脂转化为水溶性的溶血 磷脂，其可以通过离心从油中分离得到。在酶法脱胶的油中，残留的磷含量可以 低至2ppm P。
[522]本发明的磷脂酶和方法也可以用于植物油的脱胶，如在Cleenewerck，et al.， N.V.Vamo Mills，Izegem，Belg.Fett Wissenschaft Technologie(1992)，94：317-22，和 Clausen，Kim；Nielsen，Munk.Novozymes A/S，Den.Dansk Kemi(2002)83(2)：24-27 所述。本发明的磷脂酶和方法可以整合酸对植物油进行的预精炼工艺，如在下述 文献中所述：Nilsson-Johansson，et al.，Fats Oils Div.，Alfa-Laval Food Eng.AB， Tumba，Swed.Fett Wissenschaft Technologie(1988)，90(11)，447-51；以及，Munch， Ernst W.Cereol Deutschland GmbH，Mannheim，Germany.Editor(s)：Wilson，Richard F.Proceedings of the World Conference on Oilseed Processing Utilization，Cancun， Mexico，Nov.12-17，2000(2001)，Meeting Date2000，17-20。
[523]本发明的磷脂酶和方法也可以用于植物油中的脱胶，如在Jerzewska，et al.， Inst.Przemyslu Miesnego i Tluszczowego，Warsaw，Pol.，Tluszcze Jadalne(2001)， 36(3/4)，97-110中所述。在本发明的这一工艺中，通过应用本发明的磷脂酶A2对 水合的低-芥酸油菜籽油进行酶法脱胶。该酶可以催化磷脂中甘油部分的中心碳原 子连接的脂肪酸酯键的水解。它也可以水解不可水合的磷脂为它们相对应的可水 合的溶血化合物。对于非纯化的酶制备物，加入2％的制备物4小时，可以得到更 好的结果(87％P去除率)。
[524]在本发明的油脱胶(或使用本发明酶的油脱胶工艺)的另一示例性工艺中， 加入酸性聚合物，例如藻酸盐或果胶。在本发明的该油脱胶工艺中，将酸性聚合 物(例如藻酸或果胶或更加可溶性的盐形式)加入到含有少量水(例如在约0.5至5％ 范围内)的粗油中。在该方面中，通过结合粗油中的钙和/或镁，酸性聚合物可以 减少和/或分裂磷脂-金属络合物，从而提高不可水合的磷脂的溶解性。在可选择的 方面，这些磷脂将移动到油/水介面或进入水相，并且转化为二酰甘油和相应的侧 链，或者完整的磷脂将作为重相的组分被随后的离心除去。在水相中酸性聚合物 的存在也可以增加水相的密度，并提高从油(轻)相分离重相的效果。
[525]本发明的油脱胶(或使用本发明酶的油脱胶工艺)的一个示例性工艺改变脱 臭程序，以获得二酰甘油(DAG)组分。在可选择的方面，如果必要或需要，在酶助 脱胶之后，可以修改脱臭条件(温度、压力、蒸馏设备的构造)，以达到提高游 离脂肪酸(FFA)从二酰甘油/三酰甘油组分分离的结果，或进一步修饰以从三酰甘油 组分分离出二酰甘油。这些修饰的结果是，使用本发明的方法，有可能获得更好 级别的FFA和二酰甘油，如果本发明的酶(例如磷脂酶，或PLC或PLC和磷酸酶 的组合)被用于在物理精炼工艺中对食用油脱胶的话。
[526]在各个方面，实施在此描述的本发明方法(或使用本发明的酶)，具有许多 优点诸如：减少或消除溶剂和溶剂回收步骤；降低资金成本；减少下游精炼成本； 减少化学品使用，设备，工艺时间，能源(热能)和水使用/废水产生；产生更高 质量的油；在一些烹饪和煎炒应用中可以使用无需精炼的压榨机压出的油(该压出 的油可以具有优异的稳定性，色泽和气味特征和高维生素E含量)；产生更高质量 的膳食；产生更低脂肪含量的膳食(目前，出自机械压榨的膳食引起反刍动物的消 化问题)；产生提高的营养特性——降低水平的芥子油苷、鞣酸、芥子碱、植酸(如 在Technology and Solvents for Extracting Oilseeds and Nonpetroleum Oils，AOCS 1997中所述)。
[527]在一个方面，本发明提供了精炼植物油(例如大豆油、玉米油、棉籽油、棕 榈油、花生油、油菜籽油、红花油、向日葵油、芝麻籽油、米糠油、椰子油或油 菜油)和它们的副产物的工艺，和对卵磷脂脱臭的工艺，例如在美国专利6,172,248 或6,172,247中所述，其中的方法包括使用至少一种本发明的酶，例如本发明的磷 脂酶C。因此，本发明提供了包含至少一种本发明的酶的卵磷脂和植物油。在示例 性有机酸精炼工艺中，将植物油与稀释的含水有机酸溶液组合，并进行高度剪切， 以将酸溶液充分分散在油中。将所得的酸和油混合物在低剪切下混合一段足够的 时间，以将污染物整合到水合的杂质相中，从而产生纯化的植物油相。在该示例 性工艺中，可以使用混合器或循环系统(例如循环水桶)和/或磷脂或卵磷脂储存 桶，如在美国专利4,240,972、4,049,686、6,172,247或6,172,248中所述。这些工 艺可以作为间歇或连续工艺操作。粗或脱胶的植物油可以由储存桶供应(例如通过 泵)并可以加热。待纯化的植物油可以是粗的或“脱胶的”油。
[528]在一个方面，本发明的磷脂酰肌醇-PLC(PI-PLC)酶用于植物油脱胶。本发 明的PI-PLC酶可以单独使用，或与其他的酶(例如，本发明的PLC、PLD、磷酸 酶)组合使用，以提高植物油(包括大豆油、油菜油和向日葵油)脱胶期间的油 产量。PI-PLC可以优选地将磷脂酰肌醇转化为1，2-二酰甘油(DAG)和磷酸肌醇 (phosphoinositol)，但是它也可以对其他磷脂表现出活性，包括磷脂酰胆碱、磷脂 酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸或磷脂酸或其组合。对植物油进行酶处理导致捕获在较 小的胶组分中的油的数量减少，这增加了酶处理的植物油中的DAG的数量并增加 了中性油，从而实现产量增加。
含油种子的酶法加工
[529]本发明提供了酶法加工含油种子，包括大豆、油菜、椰子、鳄梨和橄榄糊 的组合物(例如酶)和方法。在一个方面，本发明的这些工艺可以增加油产量，并提 高获得的膳食的营养质量。在一些方面，使用本发明的酶和方法来酶法加工含油 种子，将具有经济和环境利益，并为油萃取和加工人类和动物食物提供了可供选 择的技术。在可选择的方面，本发明的工艺包括使用本发明的磷脂酶、其他磷脂 酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶)、葡聚糖酶 (例如β-葡聚糖酶)、聚半乳糖醛酸酶、半乳糖脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、 果胶酶和其他降解植物细胞壁的酶、以及混合酶制剂和细胞裂解剂。
[530]在可选择的方面，本发明的工艺可以与其他工艺联合实施，例如酶处理， 例如用碳水化合物酶处理，包括纤维素酶、半纤维素酶和其他副降解活性，或与 化学工艺联合，例如己烷提取大豆油工艺。当在溶剂萃取之前进行酶法处理时， 酶法处理可以增加油萃取率达8-10％。
[531]在可选择的方面，本发明的工艺可以用水萃取工艺实施。水萃取方法对于 油萃取来说可能是环境上更清洁的可选择的技术。水工艺的低萃取产量可以通过 使用这样的酶克服，即该酶水解形成含油种子细胞壁的结构多糖，或水解形成细 胞和类脂体膜的蛋白质，例如，利用包括纤维素酶、半纤维素酶和/或原果胶酶在 内的酶进行消化，用于从大豆细胞提取油。在一个方面，根据Kasai(2003)J.Agric. Food Chem.51：6217-6222的描述，用本发明的酶实施本方法，该文献报道了消化 细胞壁最有效的酶是纤维素酶。
[532]在一个方面，蛋白酶与本发明的方法一起使用。已经评价了蛋白酶和纤维 素酶对油和蛋白质提取产量的操作变量和酶活性以及其他工艺参数，诸如酶浓度、 水解时间、颗粒大小和固液比的联合效应。在一个方面，根据Rosenthal(2001) Enzyme and Microb.Tech.28：499-509的描述，用本发明的酶实施本方法，该文献 报道了使用蛋白酶能比使用热处理面粉时的对照产生明显较高的油和蛋白质产 量。
[533]在一个方面，全蛋白、果胶和半纤维素提取与本发明方法一起使用。植物 细胞由一系列的多糖组成，其常常与蛋白质和酚类化合物缔合或被蛋白质和酚类 化合物替代。这些碳水化合物中的大部分只是被消化酶部分消化或低效利用。通 过加工或降解性酶处理来破裂这些结构，可以提高它们的营养可利用率。在一个 方面，根据Ouhida(2002)J.Agric.Food Chem.50：1933-1938的描述，用本发明的 酶实施本方法，该文献报道了全蛋白、果胶和半纤维素提取之后大大降解了大豆 细胞壁纤维素(高达20％)。
[534]在一个方面，本发明的方法进一步包括在处理种子例如油菜籽中结合各种 酶处理，这些处理包括使用蛋白酶、纤维素酶和半纤维素酶(相互之间和与本发明 的一种或多种酶的各种联合)。例如，所述方法可以包括在传统工艺之前，在用酶 温育期间，在20至40水份中酶法处理油菜种子，如Sosulski(1990)Proc.Can.Inst. Food Sci.Technol.3：656所述。本发明的方法可以进一步结合蛋白酶、α-淀粉酶、 聚半乳糖醛酸酶(相互之间和与本发明的一种或多种酶的各种联合)，以水解椰子粉 中的细胞物质和释放椰子油，该椰子油可以通过离心回收，如McGlone(1986)J.of Food Sci.51：695-697所述。本发明的方法可以进一步以不同的组合方式结合果胶 酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶(相互之间和与本发明的一种或多种酶的各种联 合)，以在酶法提取鳄梨油期间明显提高产量(在最好的情况下～70％)，如Buenrostro (1986)Biotech.Letters8(7)：505-506所述。在本发明的橄榄油提取工艺中，用纤维 素酶、半纤维素酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶-转甲基酶、蛋白酶和它们的组合(相互 之间和与本发明的一种或多种酶的组合)处理橄榄糊，如，例如Montedoro(1976) Acta Vitamin.Enzymol.(Milano)30：13所述。
从植物油中纯化植物固醇
[535]本发明提供了方法，用于从植物油中纯化植物固醇和三萜，或者植物甾醇。 应用本发明的磷脂酶和方法可以纯化的植物固醇，包括β-谷固醇、菜油甾醇 (campesterol)、豆甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾烷醇、谷甾烷醇、24-脱氢胆甾醇、 chalinasterol、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇(clionasterol)和菜子甾醇(brassicasterol)。植 物固醇是用于健康和营养工业的重要农产品。因此，本发明的磷脂酶和方法可用 于制备用于化妆品制造的乳化剂以及用于生产激素药物的甾体中间物和前体。本 发明的磷脂酶和方法用于制备(如，纯化)植物固醇和它们的酯的类似物，用作 具有心血管健康价值的降低胆固醇的试剂。本发明的磷脂酶和方法用于纯化植物 甾醇，植物甾醇通过抑制在消化道中的胆固醇吸收，来降低血清中的胆固醇水平。 本发明的磷脂酶和方法用于纯化具有在极低的浓度下具有免疫调节特征的植物甾 醇，包括增强的T淋巴细胞的细胞应答和天然杀伤细胞对癌细胞系的细胞毒性活 性。本发明的磷脂酶和方法用于纯化植物甾醇，用于治疗肺结核、类风湿性关节 炎、HIV感染病人的处理和免疫应力的抑制，例如，在马拉松选手中。
[536]本发明的磷脂酶和方法用于纯化存在于日用植物油(如，椰子、油菜、可 可豆脂油、玉米、棉籽、亚麻、橄榄、棕榈、花生、米糠、红花、芝麻、大豆、 向日葵油)的甾醇部分中的甾醇成分，如，谷固醇(40.2-92.3％)、菜油甾醇 (2.6-38.6％)、豆甾醇(0-31％)和5-燕麦固醇(1.5-29％)。
[537]本发明的方法可以结合油籽中植物来源固醇的分离，该分离通过下述方法 完成：用氯仿-甲醇、己烷、二氯甲烷或者丙酮进行抽提，然后进行皂化作用和层 析法纯化，以获得富集的总甾醇。可选择地，植物样品可以通过应用超临界二氧 化碳的超临界流体提取，以得到总脂类提取物，从中可以富集和分离甾醇。对于 甾醇化合物的随后表征和定量，粗分离物可以通过很多不同的色谱技术纯化和分 离，包括柱层析(CC)、气相色谱、薄层色谱(TLC)、正相高效液相色谱(HPLC)、 反相高效液相色谱和毛细管电色谱。在所有的色谱分离和分离技术中，对于样品 清理、纯化、定性分析和测试样品中固醇的初步估计而言，CC和TCL程序的应 用是最容易进行的，成本上承受得起的并且是适当的。
[538]在可食用油的精炼过程中，植物油中的植物固醇作为副产物而丧失。本发 明的磷脂酶和方法应用从这样的副产物中分离的植物固醇，来制备从这样的副产 物中分离得到的富集植物固醇的产物。本发明的植物固醇分离和纯化方法可以合 并油处理工艺中的工业副产物，并且可以包括如分子蒸馏、液-液提取和结晶的操 作。
[539]本发明的方法可以结合液体抽提来提取植物固醇的工艺。例如，本发明的 方法可以应用非极性溶剂如己烷(一般用于提取大部分种类的植物油)，定量地 提取游离的植物固醇和植物固酰脂肪酸酯。固醇糖苷和脂肪酰化固醇糖苷仅仅被 己烷部分提取，增强的溶剂极性产生更高百分比的抽提率。可以应用的一个程序 是Bligh和Dyer的氯仿-甲醇方法，用于提取所有的固醇脂类，包括磷脂。一个定 性分离和定量分析的植物固醇脂类的示例性方法包括将脂类提取物注入HPLC系 统。
[540]本发明的磷脂酶和方法可以用于从脂肪和油中去除甾醇，如在美国专利号 6,303,803中所描述的。这是降低含有固醇的脂肪和油中的固醇含量的方法。其是 基于胆固醇和其它甾醇对于形成疏水流体双层如磷脂双层的两性分子的亲和性， 是一个高效和具有成本效率的过程。磷脂的聚集体与，例如含有甾醇的脂肪或者 油在含水环境下接触，随后进行混合。聚集的磷脂混合物的分子结构对胆固醇和 其它甾醇具有高亲和性，可以从脂肪和油中选择性地去除这样的分子。水相分离 混合物被混合足够长的时间，以便通过分配甾醇到磷脂聚集体部分中，从而选择 性地降低脂肪/油产物中的甾醇含量。甾醇含量降低的脂肪或者油被从水相分离混 合物中分离。可选择地，相应的富集甾醇的组分也可以被从水相分离混合物中分 离。这些步骤可以在环境温度下进行，涉及加热的成本被最小化，同样地，产物 因为热而降解的可能性也被最小化。另外，需要最少量的设备，并且因为所有需 要的材料都是食品级的，该方法不需要在操作、废物处理或者最终产物的污染方 面有特别预防措施。
[541]本发明的磷脂酶和方法可以用于从脂肪和油中去除甾醇，如，在美国专利 号5,880,300所描述。将磷脂聚集体与，如含有甾醇的脂肪或者油在含水环境中接 触，然后进行混合。在充分混合后，甾醇含量降低的脂肪或者油从含水分离混合 物中分离出来。可选择地，相应的甾醇富集的磷脂也可以从含水分离混合物中分 离。植物(如蔬菜)油含有植物甾醇(植物固醇)，它们也可以应用本发明的方 法去除。该方法可以用于商业处理循环的任何阶段的脂肪/油产品。例如，本发明 的工艺可以用于精炼、漂白和脱臭的油(“RBD油”)，或者在达到RBD状态之前 的加工过程的任何阶段。与RBD之前的油(pre-RBD oil)相比，尽管RBD油可 能具有改变的密度，本过程易于改变而适合于RBD也适合于RBD之前的油，或 者适于各种其它的脂肪/油产品，这是是通过改变磷脂含量、磷脂组成、磷脂：水的 比例、温度、压力、混合条件和分离条件而进行的，如下所述。
[542]可选择地，本发明的酶和方法可以用于在油加工的中间步骤中分离植物甾 醇或者其它甾醇。例如，已知在植物油的脱臭中植物甾醇丧失。含有甾醇的蒸馏 部分——例如来自处理的中间阶段，可以进行以上所述的甾醇抽提程序。这提供 了富含甾醇的卵磷脂或者其它磷脂物质，其可以进一步处理以便回收抽提的甾醇。
去污剂组合物
[543]本发明提供了包括一种或者多种本发明磷脂酶的去污剂组合物，和制备和 使用这些组合物的方法。本发明并入了所有制备和使用去污剂组合物的方法，参 见例如美国专利6,413,928；6,399,561；6,365,561；6,380,147。去污剂组合物可以 是一个和两个部分的含水组合物、非含水液体组合物、铸塑固体、粒形形式、微 粒形式、压缩片剂、凝胶和/或膏状物以及浆状物形式。本发明也提供能够应用这 些去污剂组合物快速去除各种食物污迹、食物残留物膜和其它微小的食物组合物 的方法。本发明的磷脂酶可以通过磷脂的催化水解来帮助去除污染。本发明的磷 脂酶可以用在洗盘去污剂和纺织品洗涤去污剂中。
[544]实际的活性酶含量依赖于去污剂组合物的制造方法，并且并不是决定性 的，只要去污剂溶液具有所需的酶促活性。一方面，存在于最终溶液中的磷脂酶 的量的范围为，在每克去污剂组合物中，大约0.001mg到0.5mg。选择用于本发 明的工艺和产品的特定酶，依赖于最终用途的条件，包括产品物理形式、应用pH、 应用温度和待降解或者改变的污物类型。对于任何给定的一套应用条件，可以选 择酶以提供最佳的活性和稳定性。在一个方面，本发明的多肽在大约4到大约12 的pH范围，大约20℃到大约95℃的温度范围内有活性。本发明的去污剂可以包 括阳离子、半极性非离子的或者兼性离子表面活性剂；或者其混合物。
[545]本发明的磷脂酶可以配制成粉末去污剂和液体去污剂，其pH值在4.0到 12.0之间，以重量百分比计算，含量水平为约0.01％到大约5％(优选地0.1％到 0.5％)。这些去污剂组合物也可以包括其它的酶如已知的蛋白酶、纤维素酶、脂 酶或内切糖苷酶，以及助洗剂和稳定剂。本发明磷脂酶的加入到传统的清洗组合 物中，并不产生任何特定的应用限制。换句话说，只要pH在以上的范围内，温度 低于所述酶的变性温度，适于去污剂的任何温度和pH也适于本组合物。此外，本 发明的多肽可以用于不含去污剂的洗涤组合物中，此外，或者可以单独应用，或 者可以与助洗剂和稳定剂组合应用。
[546]本发明提供了包括去污剂的洗涤或消毒组合物，和/或用于洗涤和/或消毒 硬表面的消毒组合物，适用于洗涤和/或消毒织品的去污剂组合物，洗盘组合物， 口腔清洗组合物，牙齿清洗组合物，和/或隐形眼镜清洗溶液。
[547]一方面，本发明提供了洗涤对象的方法，该方法包括在足以洗涤的条件下， 使该对象与本发明的磷脂酶接触。可以包括本发明的磷脂酶，作为去污剂添加剂。 本发明的去污剂组合物可以，例如，配制成包括本发明磷脂酶的手洗或机洗去污 剂组合物。适用于对染色织物进行预处理的洗涤添加剂可以包括本发明的磷脂酶。 织物柔软剂组合物可以包括本发明的磷脂酶。可选择地，本发明的磷脂酶可以被 配制为去污剂组合物，用于一般家用硬表面的清洗操作。在可选择的方面，本发 明的去污剂添加剂和去污剂组合物可以包括一种或者多种其它的酶，如蛋白酶、 脂酶、角质酶、另一种磷脂酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯 糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，如乳糖酶和/或过氧化物酶。选择本发明 酶的特性以与选定的去污剂相容(即，最适pH，与其它酶和非酶成分相容等等)， 并且所述酶以有效量存在。在一方面，本发明的磷脂酶用于从织物中去除恶臭物 质。可以用于实践本发明的各种去污剂组合物和用于制备它们的方法描述在下述 专利中，例如美国专利6,333,301；6,329,333；6,326,341；6,297,038；6,309,871； 6,204,232；6,197,070；5,856,164。
废物处理
[548]本发明的磷脂酶可以用于废物处理。一方面，本发明提供了应用本发明磷 脂酶的固体废物消化过程。该方法可以包括减少基本上未处理的固体废物的量和 体积。固体废物可以用酶消化过程处理，这是在酶溶液(包括本发明的磷脂酶) 存在的条件下，在控制的温度下进行的。固体废物可以转化为液化废物和任何残 留固体废物。所得到的液化废物可以与所述的任何残留固体废物分离。参见如美 国专利5,709,796。
解毒
[549]磷脂酶(例如本发明的PLCs、patatins)可以用于解毒方法，例如对内毒素， 如包含脂多糖(LPS)的组合物进行解毒，并且，本发明提供了使用至少一种本发明 酶的解毒方法，所述酶例如patatin，具有如SEQ ID NO：12(由SEQ ID NO：11编码)、 SEQ ID NO：14(由SEQ ID NO：13编码)、SEQ ID NO：18(由SEQ ID NO：17编码)、 SEQ ID NO：26(由SEQ ID NO：25编码)、SEQ ID NO：28(由SEQ ID NO：27编码)、 SEQ ID NO：34(由SEQ ID NO：33编码)、SEQ ID NO：36(由SEQ ID NO：35编码)、 SEQ ID NO：44(由SEQ ID NO：43编码)、SEQ ID NO：46(由SEQ ID NO：45编码)、 SEQ ID NO：56(由SEQ ID NO：55编码)、SEQ ID NO：60(由SEQ ID NO：59编码)、 SEQ ID NO：66(由SEQ ID NO：65编码)、SEQ ID NO：72(由SEQ ID NO：71编码)、 SEQ ID NO：78(由SEQ ID NO：77编码)、SEQ ID NO：87(由SEQ ID NO：86编码)、 SEQ ID NO：88(由SEQ ID NO：87编码)、SEQ ID NO：92(由SEQ ID NO：91编码)、 SEQ ID NO：96(由SEQ ID NO：95编码)、SEQ ID NO：100(由SEQ ID NO：99编码)、 SEQ ID NO：104(由SEQ ID NO：103编码)、SEQ ID NO：126(由SEQ ID NO：125编 码)、SEQ ID NO：128(由SEQ ID NO：127编码)、SEQ ID NO：132(由SEQ ID NO：131 编码)、SEQ ID NO：134(由by SEQ ID NO：133编码)、SEQ ID NO：136(由SEQ ID NO：135)或SEQ ID NO：138(由SEQ ID NO：137)阐述的序列。在一个方面，本发明 的磷脂酶用于对脂多糖(LPS)解毒。在一个方面，该解毒作用是通过对来自类脂A 的2′和/或3′脂肪酸链进行脱酰作用。在一个方面，本发明的磷脂酶(例如PLC、patatin) 用于水解来自类脂例如类脂A(例如来自细菌内毒素)的2′-月桂酰和/或3′-肉豆蔻酰 链。在一个方面，本发明的方法用于破坏内毒素，例如来自革兰氏阴性细菌，如 来自大肠杆菌的毒素。在一个方面，本发明的磷脂酶(例如PLC、patatin)被用于改 善毒素中毒(例如来自进行性革兰氏阴性感染)的效应，或预防性地防止感染(例如 动物或人的感染)期间的内毒素效应。因此，本发明提供包含本发明的磷脂酶(例 如PLC、patatin)的药物组合物，和使用本发明的水解酶来改善或预防脂多糖(LPS) 毒性作用的方法，例如在脓血症期间。
加工食物
[550]本发明的磷脂酶可以用于加工食物，例如以改变它们的稳定性、贮存期、 风味、质地，提高它们的营养价值和类似情况。例如，在一个方面，本发明的磷 脂酶用于产生酸性磷脂，用于控制食物的苦味。
[551]在一个方面，本发明提供了使用本发明的磷脂酶制备奶酪的工艺(因此， 本发明也提供了包含本发明磷脂酶的奶酪)。在一个方面，本发明的酶(例如磷脂 酶A、溶血磷脂酶或其组合)被用于加工奶酪，以增强风味、增加产量和/或“稳定” 奶酪，例如通过降低“(去油(oil-off))”的趋势来进行，或在一个方面，本发明的 酶用于从酪乳加工奶酪。本发明的这些工艺可以结合任何方法或方案，例如在美 国专利6,551,635和6,399,121、WO 03/070013、WO 00/054601中所述。例如，在 一个方面，本发明的磷脂酶被用于稳定乳或含乳组合物例如奶油中的脂肪乳状物， 以及用于稳定乳制组合物，例如用于制备奶油或液体奶油。在一个方面，本发明 提供了使用至少一种本发明酶来增强奶酪的风味的工艺，该工艺包括在含水介质 中，在产生增强的奶酪风味的条件下(例如减少的苦味)，温育蛋白、脂肪和蛋 白酶和脂肪酶，如WO 99/66805所述。在一个方面，本发明的磷脂酶用于增强奶 酪(例如凝乳)的风味，这通过在升高的温度，例如在约75℃至95℃之间，用水、 蛋白酶和脂酶(本发明的酶)混合来进行，如在美国专利4,752,483中所述。在一 个方面，本发明的磷脂酶用于通过在将凝结剂加入到牛奶之前将本发明的酶(例如 脂酶或磷脂酶)加入到奶酪(例如酪乳)中，或在挤压之前将本发明的酶加入到含盐 凝乳中来促进奶酪老化，如美国专利4,707,364中所述。在一个方面，本发明的脂 酶用于降解牛奶脂肪中的甘油三酯来释放游离脂肪酸，从而增强风味。蛋白酶也 可以用于本发明的这些工艺的任何工艺中，参见例如Brindisi(2001)J.of Food Sci. 66：1100-1107。在另一个方面，酯酶、脂酶、磷脂酶和/或蛋白酶的组合可以用于本 发明的这些工艺或任何工艺。
[552]在一个方面，本发明的磷脂酶用于减少食物中例如油诸如具有高含量的不 可水合磷组分的植物油中的磷组分含量，如WO 98/26057所述。
本发明的磷脂酶的其它用途
[553]本发明的磷脂酶也可以用于研究磷酸肌醇(PI)信号系统；用于诊断、预 后和双极性紊乱治疗的开发(参见如，Pandey(2002)Neuropsychopharmacology 26：216-228)；作为抗氧化剂；作为修饰的磷脂；作为发泡剂和胶凝剂；产生用于 血管形成组织的血管生成性类脂；用于鉴定磷脂酶，如PLA、PLB、PLC、PLD 和/或patatin调节剂(激动剂或者拮抗剂)，如作为抑制剂而用作抗瘤剂、消炎剂 以及作为止痛剂。它们可以用于产生酸性磷脂，用于控制食品和药物中的苦味。 它们可以用于脂肪纯化。它们可以用于鉴定用于治疗病毒性、炎症性、过敏性和 心血管疾病的肽抑制剂。它们可以用于制备疫苗。它们可以用于制备多不饱和脂 肪酸甘油酯和磷脂酰甘油。
[554]本发明的磷脂酶，例如，PLA和PLC酶，用于产生免疫毒素和各种治疗 剂，用于抗癌治疗。
[555]本发明的磷脂酶可以与其它用于脱色(即，去除叶绿素)的酶和去污剂(参 见以上)联合使用，如，与其它的酶(如，脂酶、蛋白酶、酯酶、磷酸酶)联合 使用。例如，在应用PLC的任何场合中，都可以组合应用PLD和磷酸酶，以产生 与PLC单独使用相同的结果。
[556]下表概述了本发明的若干示例性工艺和制剂：
本发明的示例性工艺              目的
PLC油脱胶中的化学品使用
不用酸                              省去化学品
不用碱                              省去化学品
酸和碱的使用范围(不过量至过量)      减少化学品/脱胶工艺
                                    可选择的实施方案
其它类型的酸和碱                    脱胶工艺可选择的实施方案
水在PLC油脱胶中的影响
硅胶的使用                          替代水洗步骤
水干燥剂的使用                      消除最终产品中的水
碱处理期间较低含量水的影响          消除最终产品中的水
最低水含量(<5％)                    消除最终产品中的水
最大水含量(>5％)                    工艺选择
PLC脱胶的湿度特征                   脱胶工艺可选择的实施方案
对于PLC脱胶，油依赖于水含量         脱胶工艺可选择的实施方案
原位去除游离脂肪酸，FFA
加入FFA螯合剂                       脱胶工艺可选择的实施方案；改善来自败坏的
                                    豆的油中的状况
混合方案对PLC油脱胶的影响
具有最小混合的PLC脱胶               保护酶不受混合诱导变性的破坏，节约能量
先剪切混合，再搅拌混合进行
PLC脱胶                          脱胶工艺可选择的实施方案
加入化学品的顺序
加入顺序：酶-水，酸，然后碱      使PLC发挥功效，然后暴露于酸或碱，
                                 导致潜在的pH或金属螯合PLC失活
针对温度和时间，PLC油脱胶工艺
可选择的实施方案
酶处理步骤(时间)：<60min，
优选<30min                       脱胶工艺可选择的实施方案
酶处理步骤(温度)：50-70℃，
优选<50℃(例如室温)              脱胶工艺可选择的实施方案
PLC油脱胶的益处
产生具有最小的PL含量和丰富的
水溶性磷酸酯的皂脚               脱胶工艺可选择的实施方案
通过使用PLC，胶中中性油减少      脱胶工艺可选择的实施方案
植物油中DAG(例如1，3-DAG)
增加的工艺                       脱胶工艺可选择的实施方案
使用增加的DAG植物油和其他对
健康有益处的油的益处             示例性的产物益处
研究在油中不留下PLC活性的
脱胶工艺                         脱胶工艺可选择的实施方案/控制型提高
研究在油中不留下可检测PLC
蛋白的脱胶工艺                   脱胶工艺可选择的实施方案/控制型提高
使用酶从卵磷脂胶物质产生DAG            示例性产物益处
PLC用于专用油(富集的PA、PI)            示例性产物益处
使用PA/PI特异性酶
(例如596ES2/PI特异性的)                脱胶工艺可选择的实施方案
使用PA/PI特异性酶
(例如596ES2/PI特异性的)
+PC/PE特异性酶；加入顺序的影响         脱胶工艺可选择的实施方案
间歇或连续工艺                         脱胶工艺可选择的实施方案
使用重悬浮的PLC处理的胶，
用于进一步的油脱胶操作                 脱胶工艺可选择的实施方案
胶中DAG、FFA、P、金属、中性油
的物质平衡脱                            胶工艺可选择的实施方案
多种工艺(miscellaneous)
在挤出之前，将PLC加入到剥落
的含油种子仁                            工艺可选择的实施方案
小规模脱胶分析                          脱胶工艺可选择的实施方案
使用其他酶来减少胶量(例如
PYROLASETM酶、叶绿素酶、
过氧化物酶、脂酶、漆酶、甘露聚糖酶、
蛋白酶、乳糖酶、淀粉酶等，或其组合)     脱胶工艺可选择的实施方案
使用化合物以更好地帮助油/胶分离         脱胶工艺可选择的实施方案
硬化PLC处理的油中的胶                   脱胶工艺可选择的实施方案
糖基化的/去糖基化的磷脂酶变体           脱胶工艺可选择的实施方案
本发明示例性的制剂                      目的
用于稳定的示例性液体制剂
使用化合物以增加不同pH和温度范围中      稳定酶以获得最大的DAG产量，可
的PLC的稳定性(多羟基化合物、盐、        能改变底物特异性，或引导产物形成
金属...)                                1，3-DAG类型
对PLC使用疏水型传递系统(脂质体，        稳定酶以获得最大的DAG产量，可
在精炼的油滴中水合的酶)                 能改变底物特异性，或引导产物形成
                                        1，3-DAG类型
用于稳定的固体制剂
使用不同的PLC、磷脂酶载体系统(固        稳定酶，并使得在脱胶之后容易从
定化树脂、多孔物质、凝胶、颗粒、粉      油或胶相分离酶；酶制剂的可再利用
末、片剂、囊/胶束、胶囊、结构性液体     性；油加工期间物理分离酶相；由
等)来稳定磷脂酶和辅酶                   PLC攻击PI/PA
使用脱胶废物(胶组分、种子壳)用于        减少制剂原料的成本，酶与油更好的
PLC制剂                                 可混和性，酶的热稳定性。
促进活性提高的示例性制剂和方法
使用化学品或酶帮助酶更好地分散在油        更快的反应时间/脱胶工艺/
中(例如发泡基质等)                        化学品使用减少
再次使用胶/酶，用于进一步的脱胶反应        酶的可再利用性
使用制剂，其增强分离或PL的酶捕获          更快的反应时间/脱胶工艺/
用于水解                                  化学品使用减少
使用多种制剂以适应具有不同PL特异          工艺具有多功能性；不同的酶可能需
性的酶                                    要不同的制剂或可以在工艺的不同阶
                                          段加入
使用多种酶制剂以防止在制备具有不同        在多酶形式的实施方案中，保护
底物特异性的另一PLC中某组分使一种           PLC活性
PLC失活
使用多种酶制剂以防止在制备另一酶           在多酶形式的实施方案中，保护
(水解酶、氧化酶)中某组分使一种             PLC活性
PLC失活
间歇加入碱，如在时间释放型                 保护酶免遭混合诱导变性，节省能量
碱加入制剂中
通过糖基化作用使酶的活性失活和调节酶的活性
[557]本发明提供这样的方法，包括使用重组技术制备和表达具有生物活性的酶 或其他蛋白，例如有害的或有毒的酶，(其中所述酶或其他蛋白正常情况下未糖基 化)它们为无活性或活性较低但是可再活化的形式。该方法包括将一个或多个糖基 化位点(例如N-连接的或O-连接的糖基化作用)加入到具有生物活性的酶或其他 蛋白(例如本发明的酶)中，这是通过下述步骤进行的：对编码序列进行工程化 以整合入新的糖基化位点(多个位点)；在真核细胞或工程化的等同物中或在能 够进行翻译后糖基化的体外系统中表达变体编码序列。例如，3个氨基酸的序列 NXS/T是真核细胞中的糖基化位点，而原核细胞不是这样的。因此，本发明包括 将至少一个三氨基酸序列NXS/T加入到蛋白中，以便它的活性因翻译后糖基化的 缘故而减少或失活。
[558]糖基化作用可以导致产生加入到N残基的2个N-乙酰葡萄糖胺(NGlucNac) 分子。随后的加入可以生物种特异性的。在大部分的种中，甘露糖(Mann)然后被 加入到NGlucNa上，Mann残基的数目从10至100。唾液酸在一些物种中也可以 被加入。在毕赤酵母中，在加入NglucNac之后，10至25个Mann残基可以被添 加。
[559]这些方法包括使用任何去糖基化酶或一组酶，它们中的许多酶可能已被鉴 定和/或可以通过商业渠道获得。例如，内切糖苷酶H在最后一个NGIucNac处进 行切割，留下一个NClucNac依然连接在N残基上。PNGaseF酶切割掉所有的糖， 并将N残基的氨基侧链转化成羟基，从而使酶中的N氨基酸变成天冬氨酸(D)氨基 酸。因此，所述方法包括体内或体外使用内切糖苷酶H和/或PNGaseF或等价的酶， 从而部分或完全地再激活工程化的“临时失活的”蛋白。
[560]该方法包括将酶或其他多肽靶向至宿主分泌途径，以便所述酶被糖基化。 设计新的糖基化位点，这样，糖基化作用使酶失活，或修饰它的活性，例如减少 它的活性，或者以另外的方式修饰活性，诸如阻止底物结合位点。因为酶是失活 的或是活性较低，这些酶的活性的负面影响不再限制蛋白在宿主细胞中的积聚， 所以有害的或有毒的酶可以以更高的水平表达。通过移去糖，例如使用商业上可 获得的去糖基化酶，例如通过使用全细胞工程化方法体外除去糖，或体内除去糖， 失活的、糖基化的酶可以被重新活化(部分或完全)。
[561]在一个方面，将真核糖基化靶位点诸如NXS/T加入到任何蛋白，例如本发 明的酶。这使本领域技术人员能够将糖基化位点加入到感兴趣的蛋白，并期望当 通过将那个蛋白表达在真核宿主细胞中并将该蛋白靶向宿主细胞的分泌途径使得 那个蛋白被糖基化时，将那个蛋白转化为临时失活的蛋白。
[562]因此，本发明提供了产生在正常情况下数量巨大时由于害处或毒性太大而 不能被宿主细胞耐受的酶。该效果可以是临时性的，因为它可以重新产生活性酶 (通过去糖基化作用，例如通过翻译后修饰/去糖基化作用)，以用于需要活性酶 的进一步的工作。
[563]在一个方面，本发明提供了制备和表达具有生物活性的蛋白的方法，该蛋 白的活性通过糖基化作用而临时失活，该方法包括：(a)提供编码具有生物活性的 蛋白的核酸，其中所述蛋白在天然情况下是非糖基化的；(b)将至少一个糖基化基 序编码序列插入到编码蛋白的核酸中，其中糖基化形式的蛋白是无活性的；(c)将 靶向序列插入蛋白，这样该蛋白被导向宿主细胞的分泌途径，其中所述宿主细胞 能够识别糖基化基序并糖基化该蛋白；和(d)在宿主细胞中表达修饰的核酸。在一 个方面，该方法进一步包括对表达的蛋白去糖基化，从而再次激活蛋白例如酶诸 如本发明的酶的活性。在一个方面，宿主细胞是真核细胞。在一个方面，通过去 糖基化作用，或者化学的方法或者酶促的方法，体外再次激活失活的表达的重组 蛋白。
[564]确定一个或多个糖基化基序的设置以临时性地失活蛋白，仅仅涉及制备变 体蛋白编码核酸的常规方法，例如通过GSSMTM，和常规筛选方案，例如活性或 结合分析方法。
[565]由于糖基化作用的缘故，其活性对宿主细胞有害的酶被致失活。因为它是 无活性的，所以它可以以高得多的水平积聚在真核宿主细胞中。因为它不再具有 活性，所以它不再能够发挥其负面作用。有毒的酶的失活作用是临时性的，这是 因为使用EndoH或PNGase F对该酶进行去糖基化作用能完全恢复酶的正常活性。 大量糖基化的、失活的酶积聚在培养基中，这表明，宿主细胞完全耐受无活性形 式的酶。
[566]本发明参照以下的实施例来进一步说明；然而，应当理解地是，本发明并 不限于这些实施例。
实施例1：用于序列同一性作图的BLAST程序
[567]本实施例描述了示例性的序列同一性程序，用以确定核酸是否在本发明的 范围内。应用NCBI BLAST 2.2.2程序，默认选择为blastp。除了默认过滤设置外， 应用所有默认值(即，除了过滤设置为OFF(关)外，所有参数设置为默认)； 在该位置应用“-F F”设置，其使得不能进行过滤。由于序列长度短，应用默认过滤 常常导致Karlin-Altschul歪曲(violation)。用于本实施例的默认值为：
“低复杂度过滤(Filter for low complexity)：开
>字长(Word Size)：3
>矩阵(Matrix)：Blosum 62
>空位成本(Gap Costs)：存在(Existence)：11
>延伸(Extension)：1”
[568]其它的默认设置为：低复杂度过滤关闭，对于蛋白字长为3，BLOSUM62 矩阵，空位存在罚分-11和空位延伸罚分-1。“-W”选项设定为默认值0。这意味着， 如果不设定，字长默认值对于蛋白为3，对于核苷酸为11。设置读入：
<>
>------------------------------------------------------------------------------
>blastall arguments：
>
>-p Program Name[String]
>-d Database[String]
>default＝nr
>-i Query File[File In]
>default＝stdin
>-e Expectation value(E)[Real]
>default＝10.0
>-m alignment view options：
>0＝pairwise，
>1＝query-anchored showing identities，
>2＝query-anchored no identities，
>3＝flat query-anchored，show identities，
>4＝flat query-anchored，no identities，
>5＝query-anchored no identities and blunt ends，
>6＝flat query-anchored，no identilies and blunt ends，
>7＝XML Blast output，
>8＝tabular，
>9 tabular with comment lines[lnteger]
>default＝0
>-o BLAST report Outout File[File Out]Optional
>default＝stdout
>-F Filter query sequence(DUST with blastn，SEG with others)[String]
>default＝T
>-G Cost to open a gap(zero invokes default behavior)[Integer]
>default＝0
>-E Cost to extend a gap(zero invokes default behavior)[Integer]
>default＝0
>-X X dropoff value for gapped alignment(in bits)(zero invokes default
>behavior)[Integer]
>default＝0
>-I Show GI′s in deflines[T/F]
>default＝F
>-q Penalty for a nucleotide mismatch(blastn only)[Integer]
>default＝-3
>-r Rewardfor a nucleotide match(blastu only)[Integer]
>default＝1
>-v Number of database sequences to show one-line descriptions for(V)
>[Integer]
>default＝500
>-b Number of database sequence to show alignments for(B)[Integer]
>default＝250
>-f Threshold for extending hits，default if zero[Integer]
>default＝0
>-g Perform gapped alignment(not available with tblastx)[T/F]
>default＝T
>-Q Query Genetic code to use[Integer]
>default＝1
>-D DB Genetic code(for tblast[nx]only)[Integer]
>default＝1
>-a Number of processors to use[Integer]
>default＝1
>-O SeqAlign file[File Out]Optional
>-J Believe the query defline[T/F]
>default＝F
>-M Matrix[String]
>default＝BLOSUM62
>-W Word size，default if zero[Integer]
>default＝0
>-z Effective length of the database(use zero for the real size)
>[String]
>default＝0
>-K Number of best hits from a region to keep(off by default，if used a
>value of 100 is recommended)[Integer]
>default＝0
>-P 0 for multiple hits1-pass，1 for single hit1-pass，2 for 2-pass
>[Integer]
>default＝0
>-Y Effective length of the search space(use zero for the real size)
>[Real]
>default＝0
>-S Query strands to search against database(for blast[nx]，and
>tblastx).3 is both，1 is top，2 is bottom[Integer]
>default＝3
>-T Produce HTML output[T/F]
>default＝F
>-1 Restrict search of database to list of GI′s[String]Optional
>-U Use lower case filtering of FASTA sequence[T/F]Optional
>default＝F
>-y Dropoff(X)for blast extensions in bits(0.0invokes default
>behavior)[Real]
>default＝0.0
>-Z X dropoff value for final gapped aligmnent(in bits)[Integer]
>default＝0
>-R PSI-TBLASTN checkpoint file[File In]Optional
>n MegaBlast search[T/F]
>default＝F
>-L Location on query sequence[String]Optional
>-A Multiple Hits window size(zero for single hit algorithm)[Integer]
>default＝40
实施例2：PLC介导的脱胶的模拟
[569]该实施例描述了磷脂酶C(PLC)介导脱胶的模拟。
[570]由于在水中磷脂酰胆碱(PC)的溶解性差，起初将磷脂酰胆碱溶解于乙醇 中(100mg/ml)。对于初步测试，制备了PC的储存溶液，是在pH6的50mM的 3-吗啉基丙磺酸或60mM柠檬酸/NaOH中。，将PC储液(10μl，1μg/μl)加入 到Eppendorf管中的500μl精炼的大豆油(含2％的水)中。为了产生乳状液，将 管中的内容物通过涡流振荡混合3分钟(参见图5A)。油和水相通过在13,000rpm 离心1分钟来分离(图5B)。反应管在所需的温度下(37℃、50℃或60℃)进行 预温育，并且加入3μl来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的PLC(0.9U/μl)至水 相(图5C)。通过用氯仿/甲醇/水(65：25：4)作为溶剂系统的TLC对PC的消 失进行分析(参见如Taguchi(1975)，见上文)，并且在暴露于碘蒸汽后可以被 观察到。
[571]图5示意性地说明了用于模拟PLC-介导的脱胶的两相系统模型。图5A： 通过混合粗制油与2％的水，来水合污染的磷脂(P)，产生乳状液。图5B：离心 后分离水相和油相，并将PLC加入到水相中，其含有沉淀的磷脂(“胶”)。在水 相中发生了PLC的水解。图5C：通过从水相中抽取等分试样并用TLC对它们进 行分析，监控反应的时间进程。
实施例3：磷脂酶的表达
[572]该实施例描述了构建可以表达多种磷脂酶(包括本发明的酶)的本发明的商 业生产菌株。为了产生适合用于对食品级植物油(包括大豆、芥花和向日葵)脱 胶的多酶制剂，可以产生在同一表达宿主中表达两种不同磷脂酶序列的重组表达 菌株。例如，可以构建该菌株以含有一个或多个拷贝的PLC基因，和一个或多个 拷贝的磷脂酰肌醇-PLC基因。这些基因可以存在于一个质粒、多个质粒上，或者 这些基因可以通过同源重组被插入到表达宿主的基因组中。当这些基因通过同源 重组导入时，它们可以作为DNA表达盒导入宿主基因组中的单个位点中，所述表 达盒含有一个或多个拷贝的两个基因。可选择地，每个基因的一个或多个拷贝可 以导入宿主染色体中的不同位点。这两个基因序列的表达可以由一种类型的启动 子驱动，或者每一基因序列可以由独立的启动子驱动。根据每一基因的拷贝数和 启动子的类型，最终的菌株将表达变化比例的每一活性酶类型。表达菌株可以用 任何的杆菌(例如蜡状芽孢杆菌)或链霉菌、大肠杆菌、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤 酵母或者其它革兰氏阴性、革兰氏阳性或酵母表达系统来构建。
[573]在一个方面，本发明提供了对大豆油进行脱胶的双酶系统，其中至少一种 酶是本发明的酶。PLC加上PI-PLC比单独使用其中一种酶产生更多的DAG。然 而，两种酶都比无酶对照样品产生更多的DAG。在一个方面，反应条件包括1毫 升大豆油、在任何添加之前油中初始水分含量～0.4％、50℃、用2.75M NaOH中和 的0.2％柠檬酸、10U PLC、15μL PI-PLC(0.45mg总蛋白)，1小时总反应时间。图 12所示的表概述了从本发明的该双酶脱胶系统获得的数据。
[574]在另一方面，本发明的PI-PLC酶可以在与PLC中所述相同的条件下使用。 这些条件包括植物油的化学精炼和植物油的水脱胶。
实施例4：具有提高的表达水平和改变的蛋白酶抗性的磷脂酶
[575]本发明提供了挑选磷脂酶C变体(突变体)的方法，该磷脂酶C在糖基化宿 主中具有提高的表达水平并对其所分泌的蛋白酶具有改变的抗性。
在糖基化宿主中提高的表达水平
[576]潜在的天冬酰胺-连接的糖基化位点具有氨基酸共有序列—天冬酰胺-任何 氨基酸-丝氨酸或苏氨酸(在单字母氨基酸代码中为NXS/T)，用诱变方法将其敲 除，以便将糖基化识别基序中的天冬酰胺或丝氨酸或苏氨酸改变成不同的氨基酸， 因此序列不再编码潜在的糖基化位点。糖基化位点的去除在下述位置实现：本发 明的磷脂酶C的氨基酸位置氨基酸63，氨基酸131，和氨基酸134，该磷脂酶C 具有如SEQ ID NO：2中所阐述的序列，例如由SEQ ID NO：1来编码。当该蛋白在 酵母—巴斯德毕赤酵母中异源表达时，其糖基化位点的消除提高这种变体—活性 磷脂酶C(PLC，SEQ ID NO：2)的表达水平。这种减少或消除PLC酶中的潜在糖基 化位点的策略可以提高活性PLC在任何糖基化宿主中的表达水平。因此，本发明 提供了具有任何本发明的示例性磷脂酶的序列的磷脂酶(和编码它们的核酸)， 其中一个或多个或所有糖基化位点已被改变，如上所述。因此，本发明提供了制 备在宿主细胞中具有增加的表达水平的变体磷脂酶编码序列的方法，其中该方法 包括修饰本发明的磷脂酶编码序列，以便一个、若干个或所有N-连接糖基化位点 编码基序被修饰成非糖基化基序。本发明也提供了由该方法制备的磷脂酶编码序 列，和它们所编码的酶。
改变的蛋白酶抗性
[577]本发明提供了制备变体磷脂酶编码序列的方法，该序列编码对蛋白酶具有 增加的抗性的磷脂酶，该方法包括将等同于SEQ ID NO：2的位置131上的氨基酸 修改成下述的一个、若干个或所有残基：赖氨酸(K)；丝氨酸(S)；甘氨酸(G)；精氨 酸(R)；谷氨酰胺(Q)；丙氨酸(A)；异亮氨酸(I)；组氨酸(H)；苯丙氨酸(F)；苏氨酸(T)； 甲硫氨酸(M)；亮氨酸(L)，包括具有这些示例性修改的SEQ ID NO：2的变体(和编 码它们的核酸)。本发明也提供了由该方法制备的序列所编码的分离的、合成的或 重组的磷脂酶。本发明也提供了制备变体磷脂酶编码序列的方法，该序列编码对 蛋白酶具有减少的抗性的磷脂酶，该方法包括将等同于SEQ ID NO：2的位置131 上的氨基酸修改成下述的一个、若干个或所有残基：色氨酸(W)；谷氨酸(E)；酪氨 酸(Y)，包括具有这些示例性修改的SEQ ID NO：2的变体(和编码它们的核酸)。本 发明也提供了由该方法制备的序列所编码的分离的、合成的或重组的磷脂酶。
[578]将含有天然分泌的巴斯德毕赤酵母蛋白酶的混合物的上清液与野生型和 突变型PLC酶制剂混合并温育。终止反应，与无蛋白酶阴性对照相比，通过 SDS-PAGE，显现降解结果。通过测量残留PLC活性也可以测定降解结果。通过 观察发现了新奇现象，即某些敲除糖基化作用的突变显著改变该表达的磷脂酶在 发酵期间对降解的敏感性。该方法的优势是在生产期间直接选择对宿主生物分泌 的蛋白酶具有增加的或减少的抗性的突变体。
[579]本发明的这种方法可以使用定点诱变(例如GSSMTM)来改变本发明的磷脂 酶C的氨基酸序列，例如如下所示，SEQ ID NO：1编码的SEQ ID NO：2的子序列。 将红色标出的每一氨基酸(下面)由天冬酰胺(单字母代码中为N)改变为天冬氨酸 (D)、丝氨酸(S)或另一氨基酸，如下所述。这些氨基酸被命名为下面序列中的氨基 酸63、氨基酸131和氨基酸134，其中色氨酸(W)命名为氨基酸1。进行这些突变， 以通过减少在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达的蛋白的糖基化作用来增加活性磷 脂酶C蛋白的表达水平。这些相同的突变可以增加本发明的任何活性磷脂酶C在 任何其他表达系统中的表达水平，所述表达系统根据NXS/T系统对天冬酰胺进行 糖基化(N-连接的糖基化)，其中N是天冬酰胺，X是任何氨基酸，S/T是丝氨 酸或苏氨酸。因此，本发明也提供了通过改变位置131处的氨基酸来改变表达的 磷脂酶C的敏感性的方法。
[580]SEQ ID NO：2的氨基酸39-286
注意：为了计算变化的位置，将第一个氨基酸(W)计为位置1。
WSAEDKHNEGINSHLWIVNRAIDIMSRNTTIVNPNETALLNEWRADLENGIYSA DYENPYYDDSTYASHFYDPDTGTTYIPFAKHAKETGAKYFNLAGQAYQNQDM QQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAASFTDLSYPMGFHSKYENFVDTIKNNYIVS DSNGYWNWKGANPEDWIEGAAVAAKQDYPGVVNDTTKDWFVKAAVSQEYA DKWRAEVTPVTGKRLMEAQRVTAGYIHLWFDTYVNR-
如下面所述，将表达的磷脂酶C变体在存在巴斯德毕赤酵母蛋白酶的情况下温育， 获得以下结果：
[581]在SEQ ID NO：2的氨基酸位置131的以下氨基酸增加了表达的磷脂酶C对 巴斯德毕赤酵母蛋白酶降解作用的抗性：赖氨酸(K)；丝氨酸(S)；甘氨酸(G)；精 氨酸(R)；谷氨酰胺(Q)；丙氨酸(A)；异亮氨酸(I)；组氨酸(H)；苯丙氨酸(F)；苏氨 酸(T)；甲硫氨酸(M)；亮氨酸(L)。在SEQ ID NO：2的氨基酸位置131的以下氨基 酸减少了表达的磷脂酶C对巴斯德毕赤酵母蛋白酶降解作用的抗性：色氨酸(W)； 谷氨酸(E)；酪氨酸(Y)。因此，本发明提供了变体磷脂酶，其具有任何其中之一或 若干或所有这些修饰，这取决于是否需要增加或减少表达的磷脂酶C对蛋白酶降 解作用的抗性。本发明提供了在等同于SEQ ID NO：2的位置131上具有任何其中 之一或若干或所有这些修饰的变体磷脂酶。该残基等同于SEQ ID NO：2的位置 131，并且对任何特定氨基酸残基的修饰是否可以增加或减少该酶对蛋白酶降解作 用的抗性，可以通过本领域熟知的方案常规地和预测性地确定，例如用于评价磷 脂酶C(SEQ ID NO：2，由SEQ ID NO：1编码)的蛋白酶敏感性的示例性分析方法， 如下所述：
缓冲液：
1.0 M MES，pH6.2
0.7 M 醋酸钠(“NaAc”)，pH5.2
测试：
使用独立的1.5mL微量离心管
向25μL PLC酶样品，加入5μL NaAc或7μL MES缓冲液，并混合
加入25μL含蛋白酶的巴斯德毕赤酵母上清液，并混合
加入2μL 5％叠氮化钠，并混合
在加湿温育器中，将管置于盛有水的预热烧杯中的悬浮架上
对照包括PLC+缓冲液+dH2O，和毕赤酵母SN+缓冲液+dH2O
温育0-24小时，如果需要，在多个时间点取样。
检测
将样品按1:2与含5mM EDTA的样品缓冲液混合，100℃加热4分钟，冷 却，离心，混合，每泳道加载5μL样品，考马斯(Coomassie)染色，在SDS-PAGE 上显现结果。
也可以直接采取样品和时间点进行标准PLC活性分析。
结果：
SDS-PAGE跑胶，结果显示在图17中；其显示了体外消化试验的结果，其中 磷脂酶C变体在粗蛋白酶提取物中37℃温育最高达22小时。根据序列“DXD”(氨 基酸位置63的天冬氨酸-氨基酸位置131的任何氨基酸-氨基酸位置134的天冬氨 酸)的“X”位置发现的氨基酸，命名每一PLC突变体。这些凝胶显示了用粗蛋白酶 温育后，表达的PLC变体蛋白的稳定性或敏感性。稳定的变体在＂-＂(无蛋白酶反应 的对照)和＂+＂(反应含有蛋白酶)泳道中显示出具有相似染色强度的PLC带。与＂-＂ 泳道相比，在＂＝＂泳道中，对蛋白酶更敏感的变体将显示出PLC蛋白带染色强度的 减少。
实施例5：获得稳定的高水平表达PLC的方法
[582]本发明提供了在酵母培养物例如巴斯德毕赤酵母培养物中获得具有稳定 的高水平表达和高比活性的磷脂酶例如PLC的发酵工艺。由该方法生产的酶可以 用于例如植物油精炼，诸如大豆、芥花、向日葵或其他油。
[583]本发明提供了生产工艺，该工艺具有这样的特征，即能够在酵母细胞培养 物，例如巴斯德毕赤酵母，如在分批喂料培养物中以g/l水平，生产活性磷脂酶， 例如PLC。在微生物培养物中活性PLC蛋白的异源表达仅以mg/l的水平在文献 中偶有描述。此外，本发明的工艺是基于这样的发现，在毕赤酵母培养物中PLC 蛋白的表达削弱了对MeOH的吸收能力，但是无其它研究过的生理生长特征。与 毕赤酵母培养物中常规的异源蛋白表达相反，需要高水平的共-喂料比率(high co-feed rates)(葡萄糖/或甘油)。除提高酶的生产特征外，较高水平的共-喂料比 率也消除了普通蛋白酶活性的表达，该蛋白酶活性与PLC降解相关。此外，通过 在具有Mut+表型的毕赤酵母菌株中产生PLC而不损害与Mut+表型相关(并且因此， 不以工业级使用)的可测量测试，可以克服较差的MeOH利用率特征，从而进一 步提高产生特征。因此，相比于通常用于工业规模的毕赤酵母系统的条件，本发 明的该工艺将活性PLC的生产率提高>50-倍(从使用常规方法的100U/ml提高至 >5000U/ml全肉汤；>5g/l蛋白)。此外，因为PLC是需要结合锌以获得正确的 折叠和活性的金属酶，在一个方面，本发明包括补充锌。对本发明的培养物而言， 该锌补充策略使得PLC活性如同全肉汤培养物中一样，几乎完全稳定(<5％的活 性丧失)，例如在4℃下，>5天。这明显有助于回收工艺，因为1)不稳定蛋白活 性的产生在回收工艺期间继续恶化，和2)其赋予了更大的工艺灵活性，特别是以 大规模水平。
色氨酰基氨肽酶微量培养板分析
[584]本发明提供了色氨酰基氨肽酶微量培养板分析方法，其被开发用于测定毕 赤酵母发酵各时间点样品中的相对色氨酰基氨肽酶活性。该分析的通量能力足以 满足从大量发酵反应中的多个时间点进行取样。
材料与方法
缓冲液：
·15mM NaPO4，2mM MnCl2，pH7.5，aq.
底物
·HTrp-AMC(Bachem，I1670)
底物溶液：
·将底物溶于10mM甲醇中
·将100μL 10mM底物加入6mL缓冲液中
样品：
·毕赤酵母发酵各时间点的样品
·离心除去细胞。
微量培养板制备：
·就每一份样品复制品、空白和参考，给空96孔板(black 96-well)每孔等分加入90 μl的底物溶液，
·将微量培养板置于荧光微量培养板阅读台上(例如SpectraMax，Molecular Dynamics)
样品的添加和反应动力学：
·设置荧光微量培养板阅读器：
Ex.350nrn/Em.460nm；自动切断(455nm)；PMT中等；每孔3次阅读； 自动校准“开”
RT(室温)
0-30分钟时程；每30秒阅读一次
在第一次阅读之前，初始化设备板的混合功能，混合5秒
·将样品按96-孔形式等分，并用多通道移液器以每孔10μL转移样品
·取下盖子，重新将微量培养板放置在微量培养板阅读器中
·开始读数
[585]根据未知样品的固有活性，可以改变样品稀释度，分析持续时间和动力学 取样，以及可以用常规筛选方法测定的所有变量。
[586]底物已经显示出在这些条件下非常稳定，阴性对照空白显示出其吸光率没 有随时间变化而增加。
Bodipy BSA蛋白酶微量培养板分析
[587]本发明提供了Bodipy BSA蛋白酶微量培养板分析方法，以帮助测定毕赤 酵母发酵各时间点样品中的总蛋白酶活性。该分析的通量能力足以满足从大量发 酵反应中进行多时间点取样。
材料与方法
底物：
·DQ BSA green(Molecular Probes，D 12050)
底物溶液：
·将一瓶底物(1mg)中的内含物溶于1mL含有0.1％叠氮化钠的水中
样品：
·毕赤酵母发酵各时间点的样品
·离心除去细胞。
阳性对照：
·0.2mg/mL枯草杆菌蛋白酶(Sigma，P5380)，于50mM NaPO4，pH7.5中
·在水中连续稀释
微量培养板制备：
·就每一样品复制品、空白和参考，等分地给空96-孔板(black 96-well)的每孔中 加入90μl的底物溶液
样品的添加和反应
·按96-孔的形式等分样品，并使用多通道移液器以每孔10μL转移样品
·替换微量培养板的盖子，用箔包裹，在37℃置于加湿温育器中，温育3-4小时 或过夜
荧光测量：
·设置荧光微量培养板阅读器：
Ex.495nm/Em.525nm；自动切断(515nm)；PMT低；每孔3次阅读；自 动校准“开”
RT
[588]选择Bodipy BSA作为通用蛋白酶底物。缺少对bodipy BSA的水解并不表 明不存在蛋白酶，但是已经显示其与PLC酶的水解和PLC活性的丧失相关。已经 证明，BSA可以用bodipy卵清蛋白或酪蛋白替代。
[589]在一个方面，在整个发酵时程内表征蛋白酶活性是有用的，这是因为该活 性可以是临时性的和瞬时的。
[590]底物已经显示出在这些条件下非常稳定，阴性对照空白显示出其吸光率没 有随时间变化而增加。
在全培养肉汤或上清液中PLC活性的测量：
[591]本发明提供了在全培养肉汤或上清液中进行的PLC活性测量分析方法；该 分析方法是对Edward A.Dennis(1973)Kinetic dependence of phospholipase A2 activity on the detergent Triton X-100.J.Lipid Res.14：152-159，USP 24/NF19， Pancrealipase-Assay for lipase activity.第1256-1257页中描述的方法的修改。本发 明的PLC活性测量分析方法包括：
溶液：
100mM硫酸锌溶液
100mM氯化钙溶液
底物溶液(20mM磷脂酰胆碱，40mM Triton X-100，5mM氯化钙)
稀释缓冲液(0.1％Triton X-100，1mM硫酸锌，1％阿拉伯树胶)
分析程序：
-用稀释缓冲液(1.0％阿拉伯树胶，1.0％Triton X-100，1mM硫酸锌)制备待分析 样品的稀释液。在分析前用冰冷的缓冲液现制备稀释液，并保藏在冰浴中，直到 使用。
-将20mL的底物溶液转移入约50mL容量的带夹套的玻璃管，该玻璃管的外室 与恒温控制的水浴相连。覆盖混合物，并用机械搅拌装置持续搅拌。将混合物的 温度维持在37±0.1℃，从通过盖子上的孔插入的微量滴定管，用0.01 N KOH VS 预滴定底物，将pH调节至7.3。加入50μL的酶稀释液，然后自动持续添加0.01N KOH VS6分钟，将pH维持在7。
[592]此外，对发酵罐培养物进行标准的PAGE凝胶电泳，Western和Northern 印迹分析以及以在线/离线获得发酵参数(生物量水平、气体分析等)的标准分析技 术。
产生Mut+表型毕赤酵母菌株
[593]本发明提供了细胞，细胞系统，和表达磷脂酶C的方法，该方法包括使用 具有Mut+表型的毕赤酵母菌株。该方法包括将编码异源PLC的核酸插入毕赤酵母 菌株中。然后在表达PLC的条件下培养该细胞。该方法可以进一步为所述培养条 件补充锌。
[594]在一个方面，这些方法，细胞和细胞系统使用SEQ ID NO：2，其是需要锌 的金属酶。在一个方面，它以3摩尔(复数)/摩尔的量使用。它的MW近似28kDa， pI近似5.2，并具有宽的底物耐受性：PC>PE>PS>>PI。未加工的酶具有24个氨 基酸的信号序列，13个氨基酸的前序列，和245个氨基酸残基的“成熟”酶。
[595]在一个方面，本发明的Mut+毕赤酵母菌株具有两个拷贝的醇氧化酶(AOX) 基因，AOX1和AOX2，在转化期间受到影响(“Mut”代表“甲醇利用率(Methanol Utilization)”)，如下所述：
·Mut+
 ·单交换事件，AOX1和AOX2基因完整
 ·单独依靠甲醇生长和表达。可能共喂料
·Muts
 ·双交换事件，破坏AOX1基因
 ·共喂料提高生长和表达
·Mut-
 ·重组事件破坏AOX1和AOX2基因
 ·不能代谢甲醇，需要共喂料
总之：Mut-[596]在Mut+和Muts之间存在发酵差异，包括：
·甲醇的最佳诱导浓度
·氧消耗率
·由于更快的吸收能力，依靠甲醇，Mut+生长比Muts快
·诱导之后，容易度过过渡期
·Mut+不用于大规模表达
 ·通风/冷却能力，MeOH敏感性
[597]巴斯德毕赤酵母的甲醇利用途经是本领域所熟知的。醇氧化酶(AOX)将甲 醇催化转变为甲醛；因此，如果AOX被过量表达，导致“腌渍的”酵母细胞。
在本发明的一个方面，使用巴斯德毕赤酵母的示例性发酵方案，包括：
·种子培养(瓶或桶)
   ·在丰富培养基中进行分批发酵，以增加生物量
·分批发酵罐培养
   ·分批阶段(甘油)
      ·随着初始碳源被消耗，生物量增长
   ·葡萄糖或甘油喂料阶段
      ·由D.O.含量引发喂料添加，或线性/指数喂料
      ·增长至足够的生物量，以进行诱导和表达(无乙醇，C-受限的)
   ·甲醇诱导
      ·喂料是受调控的(D.O.％，MeOH传感器，RQ)，或者预先设置的喂料方 案
      ·与葡萄糖或甘油共喂料，取决于表型和表达参数
      ·Mut+诱导，以1-3g/L MeOH
    ·Muts诱导，以4-7g/L MeOH
[598]图18示出了分批发酵罐培养的结果，如上所述，仅使用甘油。蛋白酶活 性来自毕赤酵母中的内源性蛋白酶。分批发酵可以是丰富培养基，以增加生物量。 如在图18中所示，在约69小时开始的蛋白酶活性的逐步增加对应于PLC活性的 逐步减少。较高的甘油(glyc)共喂料速率提高了活性PLC的表达，减少(消除)了 蛋白酶的产生，如下面数据概括表所示：
  共喂料 速度 (ml/min) 诱导之前 /之后的 碳源 诱导 OD PLC活性 (U/ml sup) 消耗的 MeOH(L) Bodipy蛋 白酶 最终OD 0.5 1.5 2 2.5 3 Glyc/Glyc Glyc/Glyc Glyc/Glyc Glyc/Glyc Glyc/Glyc 250-300 100 1100 1550 1550 1715 1 1.7 1.3 1.4 1.4 是 否 否 否 否 450 680 860 900 820
[599]这些研究在30-L BB发酵罐中、以DSD-PLC进行。测量OUR或Vol.氧 吸收率(Vol.Oxygen Uptake Rate“OUR”)，作为良好表达的‘总培养物健康’指标， 或‘生物标记(Boomarker)’。图19示出了该研究的结果，产生DSD-PLC的巴斯 德毕赤酵母MutS 30L培养物的OUR曲线比较结果，使用1700U/ml、1100U/ml 和100U/ml的PLC，温度为30℃，甘油共喂料，如上所述。
[600]图20示出了产生DSD-PLC，pH6.2(1100U/ml和100U/ml PLC)，或异源 蛋白的巴斯德毕赤酵母Muts 30L培养物的甲醇消耗曲线比较结果，以甘油共喂料， 如上所述。这是需求-驱动型(demand-driven)MeOH喂料，残余MeOH水平控制在 4g/l。
[601]此外，Mut+表型提高活性PLC表达水平，并增强MeOH吸收，如该数据 表格所概括的：
  Mut 共喂料 速度 (ml/min) 诱导 OD PLC活性 (U/mlsup) 消耗的 MeOH (L) Bodipy 蛋白酶 最终OD S 0.5 1.5 2 2.5 3 250-300 100 1100 1550 1550 1715 1 1.7 1.3 1.4 1.4 是 否 否 否 否 450 680 860 900 820
  + 0.5 0.5 1 1 1 1.5 1.5 1.5 2 250-300 1001 1200 1786 2010 1768 2669 2693 2597 2154 5.6 7 5.9 6.8 7.9 10 7.1 8.1 8.3 是 否 否 否 否 否 否 否 否 871 908 988 930 700 701 818 804 752
[602]PLC似乎不影响该Mut+表型菌株的生理生长特征，该菌株以6×拷贝数表 达重组PLC SEQ ID NO：2，数据在图21中示出，OUR图如附图说明中所阐述。只 是供应-驱动型(supply-driven)MeOH喂料，在Mut+培养物中无残留的葡萄糖或 MeOH。
[603]此外，产生的PLC蛋白的质量是可变的，具有不可预测性，例如<<或>>50％ 的总PLC蛋白具有活性，如图22中的SDS-PAGE结果所代表性示出。该OUR图 (如上所论述)数据图解概述被插入到SDS-PAGE示图的上面部分。对照命名为 JG＝0.5μl 1.6mg ml-1。与蛋白酶或氨肽酶活性没有相关性。显著数量的活性PLC 位于细胞内，如图23所示(也显示了研究的方案)，其中在细胞内检测到>700U/ml PLC(在图23中，PLC(SEQ ID NO：2)+α信号肽(来自酿酒酵母属)+糖基化作用)。 形态学变化与活性PLC的浓度相关，如图24中所示。形态学变化的大小依赖于菌 株和碳源。
[604]增加的Zn并没有促进具有2×拷贝数的Mut+SEQ ID NO：2的毕赤酵母的表 达，所述Mut+SEQ ID NO：2具有DSD突变，如在下面数据表格中所概述的(超过 1×的是通过共喂料来供应)(首先，上面一行是空载体对照)。增加的Zn确实提高了 作为全肉汤的保藏稳定性(在4℃，>100h后，具有相类的活性水平)，和总工艺的 稳健性。

[605]图25用图表概述的数据显示了在95h TFT(total fermentation time(总发酵 时间))时，毕赤酵母中PLC生产性能的状态。在图表右边的5条柱显示了从“Zeo 菌株”得到的结果，或生产PLC的巴斯德毕赤酵母菌株的Zeocin适应性。该菌株 是抗生素-抗性的、无标记菌株，在巴斯德毕赤酵母中表达作为异源基因的本发明 PLC(SEQ ID NO：2)。已经证明，通过用抗生素zeocin来使菌株适应，人们可以获 得新的稳定菌株，该菌株具有极大提高的感兴趣蛋白的表达水平。
[606]将原始的抗生素-抗性无标记菌株，菌株#1(含有SEQ ID NO：2)按照一系列 稀释步骤进行培养，每一次增加抗生素zeocin的浓度。在每一步骤，将前面步骤 的一部分培养物用新鲜培养基稀释至在600nm的光密度(OD600)为1.0，并将增加 数量的zeocin加入到新的培养基中，再生长24小时。在最后阶段，使用200ug/ml 的zeocin浓度，将最终培养物划线接种到MD/YPD板上，以使单菌落生长。结果 发现，来自最终阶段培养物的菌落显示出对zeocin高度耐受性，而亲代菌株则显 示出非常低的耐受性。其中一个菌落，菌株#2(含有SEQ ID NO：2)相比起原始PLC 菌株，菌株#1，显示出显著提高的(约70％以上)PLC表达水平。同样证明了，在 传代40代之后，菌株#2在zeocin耐受性和PLC表达上都是稳定的，这表明新菌 株获得“永久性的”高PLC表达和zeocin耐受性的性状。
[607]通过使用本发明的“Zeo菌株”(Zeocin毕赤酵母适应型)获得高水平的PLC 活性：4100u/ml，在小罐(mini-tanks)中。该结果来自包含6×DSD SEQ ID NO：2的 毕赤酵母菌株。简而言之，该SEQ ID NO：2表达菌株通过在一系列的步骤中进行 培养而“适应”，每一步骤都使用增加的zeocin浓度。明显地，该适应方法迫使菌 株/构建物发生一些变化(在分子或遗传水平上)，并使PLC活性水平显著提高。 示例性的结果是：
·罐1、2和4(每一个代表不同的菌落)的表现都超出原始预适应的SEQ ID NO：2- 表达菌株，罐1和4都达到4100u/ml，罐2达到3500u/ml。
·罐1和4早在75hrs时就达到3000u/ml以上，这表示：比原始预适应的SEQ ID NO：2-表达菌株(其在此时通常远低于2000u/ml)具有更快的活性积聚水平。
实验设计和结果的详细内容是：
zeocin适应的基本原理：
[608]有关PLC表达的早期工作是在毕赤酵母pPICZa载体中完成的，该载体含 有zeocin-抗性标记。zeocin因此被用于转化选择。后来，我们转换到AMR-较少形 式的构建物(AMR-less version construct)以开发商业候选产品。当进行小罐发酵 时，我们观察到使用AMR-less构建物获得PLC活性水平显著下降：在pPICZa-DSD 构建物中，上清液活性达到4000u/ml，而在2×DSD中仅获得ca.2000u/ml。使用 AMR-less构建物，也观察到明显的生理差异，例如较低的甲醇消耗率和更多的细 胞裂解，特别是当使用同样的发酵方案测试较高拷贝数的(5×、6×)构建物时。
[609]pPIZa构建物和AMR-less构建物之间的明显差异之一是在转化过程中 zeocin的使用，问题是细胞有可能依靠什么来度过zeocin选择。本发明提供了在 zeocin存在下培养AMR-less构建物的方法，然后使细胞经受某些有利于PLC表达 的变化。
2×DSD的Zeocin适应实验：
[610]实验首先用2×DSD(因为此时它是转移分子)进行。该研究以1ug/ml的 zeocin浓度(＂zeo 1＂)开始，使培养物生长～24hrs。从那时起，进行各步骤，将zeocin 浓度增加至zeo 5、zeo 10、zeo 15、zeo 20、zeo 40、zeo 60、zeo 80、zeo 100，最 后增加至zeo 200(zeo 100通常用于转化选择)。每一步骤都使用新鲜的培养基，并 将前一阶段的培养物用于接种下一阶段的培养物，OD值为1.0，生长～24hrs。将 每一阶段的培养物划线接种于YPD板，用于保藏以及获得单菌落。
zeo-适应菌落的小罐发酵结果：
[611]为了检测zeocin适应的效果，从zeo 200和zeo 100培养物(其被划线接种 于YPD板)挑选12个菌落，并用小罐筛选。结果总结在幻灯片(slide)6中。我们能 够发现若干菌落的表现明显超出原始构建物(含SEQ ID NO：2的毕赤酵母菌株)。其 中，来自zeo 200培养物的菌落#5显示PLC活性水平提高约50％。对筛选的观察 如下：
·zeo-适应的培养物和原始的SEQ ID NO：2-表达菌株之间的生长曲线没有明显的 差异。
·尽管已适应的培养物的稳定性没有被广泛测试，它们还是在无zeocin存在的 YPD和/或MD板上被重新划线接种了若干次。所有发酵过程也是在无zeocin存在 下进行的。
·菌落与菌落之间有明显的变化，无论是生长上的还是PLC表达上的。
·有关发酵的一些技术问题可能部分地是这些变化所致。
在6×DSD上进行Zeocin适应试验
[612]受来自zeo-适应2×DSD的结果的鼓舞，我们随后对6×DSD(此时测定得 知其优于2×DSD)进行了同样的试验。我们以zeocin浓度5ug/ml(＂zeo5＂)开始， 并使培养物生长～24小时。从那时起，进行各个步骤，将zeocin浓度增加至zeo 15、 zeo 30、zeo 50、zeo 100，最终至zeo 200。与2×DSD相同，每一步骤都使用新鲜 的培养基，并将前一阶段的培养物用于接种下一阶段的培养物，OD值为1.0，生 长～24hrs。将每一阶段的培养物划线接种于YPD板，用于保藏以及获得单菌落。
zeo-适应的6×DSD菌落的小罐发酵结果
[613]挑选来自zeo 200培养物(其被划线接种于MD板)的六个菌落，并与小 罐中的原始SEQ ID NO：2-表达菌株一起测试。关键的观察结果如下：
·所有三个菌落(罐1、2和4)的表现都超出原始SEQ ID NO：2-表达菌株，罐 1和4都达到4100u/ml，罐2达到3500u/ml。
·罐1和4早在75hrs时就达到3000u/ml以上，这表示与SEQ ID NO：2-表达菌 株(其在此时通常远低于2000u/ml)相比，具有更快的活性积聚水平。
·相比起在10-L罐中进行的3000u/ml，在罐1、2和4中的PLC表达水平也似 乎是较高(参见幻灯片4)。因此不清楚是否表观比活性在罐1、2和4中较高，即， 是否所产生的PLC不同于原始SEQ ID NO：2-表达菌株。
·对照，罐7和8此时未达到3000u/ml。不清楚是否罐1、2和4能达到更高的 水平。应注意，百分比的增加(35％，4100u/ml对3000u/ml)是小于2×适应的培养 物。
·图26给出了对来自6×DSD zeocin-适应的菌落表达筛选的概述。原始菌株最高 的活性水平为～3000u/ml(小罐和10-L)；zeocin-适应的6×DSD的活性水平为4100 u/ml(增加～35％)。图27的数据显示，相比起在10-L罐(和罐条件)中的3000u/ml， 罐1、2和4中的PLC蛋白水平较高，如上所述(凝胶载量是1.0ul的5×稀释肉 汤，0.2ul的全肉汤)。图28显示了zeo-适应的菌落与对照的生长比较。相比起 原始SEQ ID NO：2-表达菌株，Zeocin-适应的6×DSD菌落(6×DSD)具有相似的生长 曲线。
[614]在C-限制的好氧酵母培养物中，分泌蛋白的Qp，在μ＝0.10h-1下，一般为 0.5-2.5mg/g.h-1。基于400mg/g DW的蛋白含量，“代谢载荷(metabolic burden)”小 于总蛋白生产率的10％。在整个发酵期间，PLC mRNA水平保持在高水平上，这 与表达并不相关。基于5g/l(150g)PLC蛋白，少于总5mol C/h的0.1mol C/h(总 C的～2％被消耗)成为PLC中的碳，～25％成为生物量。在这些生产条件下，PLC 活性似乎没有影响一般的生长生理特征(除MeOH利用能力受影响外)。
[615]总之，本发明提供了zeocin-抗性酵母细胞系统，诸如酵母细胞，细胞系和 /或单细胞，用于表达由下述方法制备的异源蛋白(例如酶，诸如PLC)，该方法 包括下述步骤：提供包含能够表达异源蛋白的异源核酸(例如，包含酶编码序列的 载体；可操作性连接到启动子的ORF)的毕赤酵母某种(例如巴斯德毕赤酵母)的细 胞；将细胞(许多细胞)培养在包含起始浓度(该浓度足够低以便一些细胞存活， 而足够高以选择抗生素抗性细胞)的zeocin的条件下；选择对起始浓度的zeocin具 有抗性的细胞，并重新培养在包含较高浓度的zeocin的条件下；选择对较高浓度 的zeocin具有抗性的细胞。本发明也提供了该方法制备的酵母细胞，细胞系和/或 单细胞。常规的筛选方法能够确定使用什么起始浓度的抗生素，需要或期望多少 轮的选择，和如何快速增加各轮选择之间的抗生素浓度。
实施例6：热稳定性PLC
[616]本发明提供了热稳定性磷脂酶。具有SEQ ID NO：2中所阐明的序列的示例 性酶的热稳定性得到了证明。使用SEQ ID NO：2证明了本发明可比较的磷脂的热 稳定性。在两个不同的系统中测试了SEQ ID NO：2的活性：水中和在油中。在含 水系统中，替代底物(p-nppc)用于测量活性；该酶在86℃开始丧失活性。然而，在 油分析中，在85℃，水解大豆油中存在的PC和PE底物时，该酶显示出良好的活 性。检测相同的酶的Tm，发现它在15mg/mL时为86℃，并且是不可逆的。
[617]图29示出了使用10U的SEQ ID NO：2时的85℃加热试验的结果，条件如 图中所示。图30示出了总结该加热试验的NMR数据。图31、32和33所示出的 数据概述了使用p-NPPC时的SEQ ID NO：2的热稳定性，在图中所示的条件下。 图34示出了来自DSC分析的数据，显示了SEQ ID NO：2的热稳定性，酶浓度为 15mg/mL，Tm为86℃。
序列表
<110>戴弗萨公司
     GRAMATIKOVA，Svetlana
     HAZLEWOOD，Geoff
     BARTON，Nelson
     LAM，David
<120>磷脂酶，编码磷脂酶的核酸以及制备和应用磷脂酶的方法
<130>56446-20042.49
<150>10/796,907
<151>2004-03-08
<160>176
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>849
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>1

<210>2
<211>282
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(24)
<223>从环境样品中获得
<400>2


<210>3
<211>852
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>3

<210>4
<211>283
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(24)
<223>从环境样品中获得
<400>4


<210>5
<211>843
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>5

<210>6
<211>280
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(24)
<223>从环境样品中获得
<400>6


<210>7
<211>963
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>7

<210>8
<211>320
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(29)
<223>从环境样品中获得
<400>8


<210>9
<211>999
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>9

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<223>从环境样品中获得
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<220>
<223>从环境样品中获得
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<221>信号
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<223>从环境样品中获得
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<220>
<223>从环境样品中获得
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<213>细菌
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<221>信号
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<400>102

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<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>103

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<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>104


<210>105
<211>756
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>105

<210>106
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<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(30)
<223>从环境样品中获得
<400>106

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<211>990
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>107


<210>108
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<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(23)
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(56)...(195)
<223>磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C，X结构域
<400>108

<210>109
<211>990
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>109

<210>110
<211>329
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(23)
<220>
<221>结构域
<222>(56)...(195)
<223>从环境样品中获得
<400>110


<210>111
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<212>DNA
<213>细菌
<400>111

<210>112
<211>275
<212>PRT
<213>细菌
<220>
<221>信号
<222>(1)...(16)
<220>
<221>结构域
<222>(34)...(168)
<223>磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C，X结构域
<400>112


<210>113
<211>981
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>113

<210>114
<211>326
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(23)
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(56)...(195)
<223>磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C，X结构域
<400>114


<210>115
<211>987
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>115

<210>116
<211>328
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(23)
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(56)...(195)
<223>磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C，X结构域
<400>116


<210>117
<211>987
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>117

<210>118
<211>328
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(23)
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(56)...(195)
<223>磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C，X结构域
<400>118


<210>119
<211>987
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>119

<210>120
<211>328
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(23)
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(56)...(195)
<223>磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C，X结构域
<400>120

<210>121
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<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>121

<210>122
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<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(23)
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(56)...(195)
<223>磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C，X结构域
<400>122

<210>123
<211>849
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>123


<210>124
<211>282
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(24)
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(1)...(281)
<223>锌依赖型磷脂酶C
<400>124

<210>125
<211>1710
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>125


<210>126
<211>569
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>126


<210>127
<211>1038
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>127

<210>128
<211>345
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(8)...(195)
<223>马铃薯块茎储藏蛋白(Patatins)-样磷脂酶
<400>128


<210>129
<211>1434
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>129

<210>130
<211>477
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>信号
<222>(1)...(27)
<220>
<221>结构域
<222>(1)...(307)
<223>锌依赖型磷脂酶C
<400>130


<210>131
<211>927
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>131

<210>132
<211>308
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(11)...(194)
<223>马铃薯块茎储藏蛋白(Patatins)-样磷脂酶
<400>132


<210>133
<211>1053
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>133

<210>134
<211>350
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(8)...(195)
<223>马铃薯块茎储藏蛋白(Patatins)-样磷脂酶
<400>134


<210>135
<211>1710
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>135

<210>136
<211>569
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>136


<210>137
<211>1038
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>137


<210>138
<211>345
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(8)...(195)
<223>马铃薯块茎储藏蛋白(Patatins)-样磷脂酶
<400>138

<210>139
<211>1692
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>139

<210>140
<211>563
<212>PRT
<213>未知
<220>
<221>信号
<222>(1)...(20)
<223>从环境样品中获得
<400>140


<210>141
<211>471
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>141

<210>142
<211>157
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(14)...(157)
<223>haloacid dehalogenase-like hydrolase
<400>142

<210>143
<211>603
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>143


<210>144
<211>200
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>144

<210>145
<211>1197
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>145


<210>146
<211>398
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>146


<210>147
<211>1104
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>147

<210>148
<211>367
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>148


<210>149
<211>975
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>149

<210>150
<211>324
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>150


<210>151
<211>1341
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>151

<210>152
<211>446
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>152



<210>153
<211>384
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>153

<210>154
<211>127
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>154


<210>155
<211>1263
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>155

<210>156
<211>420
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>信号
<222>(1)...(36)
<220>
<221>结构域
<222>(149)...(406)
<223>GDSL-样脂酶/酰基水解酶
<400>156


<210>157
<211>1329
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>157


<210>158
<211>442
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>158


<210>159
<211>1428
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>159

<210>160
<211>475
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>160



<210>161
<211>1740
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>161


<210>162
<211>579
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>信号
<222>(1)...(24)
<400>162



<210>163
<211>1104
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>163

<210>164
<211>367
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(174)...(296)
<223>脂酶(类3)
<400>164


<210>165
<211>927
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>165

<210>166
<211>308
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(7)...(191)
<223>马铃薯块茎储藏蛋白(Patatins)-样磷脂酶
<400>166


<210>167
<211>522
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>167

<210>168
<211>173
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>信号
<222>(1)...(30)
<220>
<221>结构域
<222>(48)...(167)
<223>PAP2超家族
<400>168


<210>169
<211>579
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>169

<210>170
<211>193
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(3)...(187)
<223>卤酸(haloacid)脱卤素酶-样水解酶
<400>170


<210>171
<211>834
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>171


<210>172
<211>277
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>172

<210>173
<211>642
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<400>173


<210>174
<211>213
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>从环境样品中获得
<220>
<221>结构域
<222>(4)...(195)
<223>卤酸脱卤素酶样水解酶
<400>174