一种冷冻干燥包囊细胞的方法、冻干的包囊细胞、含有冻干的包囊细胞的组合物及这种细胞和组合物的用途
阅读：1029发布：2020-10-15
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1.一种冷冻干燥包囊细胞的方法，所述方法包括至少两个连续温育步骤，其中在每个温育步骤中，所述包囊细胞在含有冷冻保护剂的温育溶液中温育合适的时间段，其中所述温育溶液中的冷冻保护剂的浓度随着每个随后温育步骤而增加。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括3、4、5、6、7、8、9或10个温育步骤，其中在每个温育步骤中，所述冷冻保护剂的浓度增加。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在每个温育步骤中采用相同的冷冻保护剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂选自脱脂乳、甘油、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甲酰胺和DMSO的混合物、N-甲基乙酰胺(MA)、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、丙烯二醇、血清白蛋白、血清白蛋白与甲醇的混合物、碳水化合物和藻酸盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述碳水化合物选自蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、果胶、羟乙基淀粉(HES)和硫酸纤维素。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述冷冻保护剂是脱脂乳和碳水化合物的混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述碳水化合物选自蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖和葡聚糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在所述至少两个连续温育步骤中的每一个中，脱脂乳的浓度增加。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述至少两个连续温育步骤中，碳水化合物的浓度保持不变。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述包囊细胞为真核细胞或原核细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞、真菌细胞或酵母细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酵母细胞选自酿酒酵母、德巴里酵母、假丝酵母、毕赤酵母和球拟酵母。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述真菌细胞选自曲霉、根霉、毛霉和青霉。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述原核细胞为细菌细胞。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述细菌细胞选自双歧杆菌、拟杆菌、梭菌、梭杆菌、蜜蜂球菌、丙酸杆菌、链球菌、肠球菌、乳球菌、葡萄球菌、消化链球菌、芽孢杆菌、小球菌、微球菌、明串珠菌、魏斯氏菌、气球菌、酒球菌、土芽孢杆菌和乳杆菌。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞为益生菌细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述益生菌细胞选自酿酒酵母、凝固芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双岐杆菌、婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、干酪乳杆菌代田株、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、发酵乳杆菌、香肠乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、类干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus GG)、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、耐热乳杆菌、粘膜乳杆菌、变异微球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、嗜盐片球菌、粪链球菌、嗜热链球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞被包囊时处于指数生长期。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞被具有多孔胶囊壁的微胶囊包囊。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多孔胶囊壁包含选自如下的材料：藻酸盐聚合物、胶原、明胶、壳聚糖、琼脂糖、聚赖氨酸聚合物、硫酸纤维素聚合物和它们的组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述藻酸盐聚合物选自纯的藻酸盐聚合物、改性的藻酸盐-淀粉聚合物、藻酸盐-菊粉-黄原胶、藻酸盐和聚L-赖氨酸聚合物、壳聚糖/藻酸盐聚合物和壳聚糖/黄原胶聚合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述硫酸纤维素聚合物包含由纤维素硫酸钠(NaCS)/聚[二烯丙基(二甲基)氯化铵](pDADMAC)形成的复合物。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中将所述包囊细胞转移至合适的冷冻干燥介质中，且无中间洗涤步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在最后的温育步骤之后，将所述包囊细菌细胞在合适的冷冻干燥介质中冷冻干燥。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述冷冻干燥介质含有冷冻保护剂。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述冷冻干燥介质含有与所述温育溶液相同的冷冻保护剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述冷冻保护剂选自脱脂乳、甘油、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甲酰胺和DMSO的混合物、N-甲基乙酰胺(MA)、血清白蛋白、血清白蛋白与甲醇的混合物、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、丙烯二醇、碳水化合物和藻酸盐。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述碳水化合物选自蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、果胶、羟乙基淀粉(HES)和硫酸纤维素。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述冷冻干燥介质为含有所述冷冻保护剂的水性溶液。
30.一种通过权利要求1至29中任一项所述的方法获得的冻干的包囊细胞。
31.一种包含权利要求30所定义的包囊细胞和合适载体的组合物。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述组合物为食品补充剂、肥皂制剂、化妆品组合物或药物组合物。
33.一种治疗或预防腹泻、抗生素引起的腹泻、关节炎、肥胖、肠易激综合征、胃灼热、慢性疲劳综合征和患有肠道不平衡菌群的其它形式的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求25所定义的包囊细胞或权利要求31或32所定义的组合物。
34.权利要求30所定义的包囊细胞或权利要求31或32所定义的组合物在治疗或预防腹泻、抗生素引起的腹泻、关节炎、肥胖、肠易激综合征、胃灼热、慢性疲劳综合征、胃肠癌和患有肠道不平衡菌群的其它形式中的用途。
35.权利要求30所定义的包囊细胞或权利要求31或32所定义的组合物作为药物、食品添加剂或化妆品添加剂的用途。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述食品为乳基产品。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述乳基产品为酸奶、白干酪或酪乳。
38.根据权利要求36至37中任一项所述的用途，其中对于作为食品添加剂的用途，权利要求30所定义的包囊细胞或权利要求31或32所定义的组合物贮存在包含所述食品的食品包装中分开的隔室中。
39.根据权利要求35所述的用途，其中所述化妆品选自肥皂、乳液、化妆用品、霜剂、沐浴露、沐浴盐和洗发剂。
40.一种制备用于冷冻干燥的包囊细胞的方法，所述方法包括至少两个连续温育步骤，其中在每个温育步骤中，所述包囊细胞在包含冷冻保护剂的温育溶液中温育合适的时间段，其中所述温育溶液中的冷冻保护剂的浓度随着每个随后温育步骤而增加。
41.一种冻干的包囊细胞原核细胞或冻干的包囊酵母细胞。
42.根据权利要求41所述的细胞，其中所述原核细胞为细菌细胞。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中所述细菌细胞选自双歧杆菌、拟杆菌、梭菌、梭杆菌、蜜蜂球菌、丙酸杆菌、链球菌、肠球菌、乳球菌、葡萄球菌、消化链球菌、芽孢杆菌、小球菌、微球菌、明串珠菌、魏斯氏菌、气球菌、酒球菌、土芽孢杆菌和乳杆菌。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的细胞，其中所述细胞为益生菌细胞。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的细胞，其中所述益生菌细胞选自酿酒酵母、凝固芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双岐杆菌、婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、干酪乳杆菌代田株、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、发酵乳杆菌、香肠乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、类干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus GG)、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、变异微球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、嗜盐片球菌、粪链球菌、嗜热链球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌。
46.一种适于冷冻包囊细胞的组合物，所述组合物包含脱脂乳、甘油和碳水化合物。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述碳水化合物选自蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、果胶、羟乙基淀粉(HES)、硫酸纤维素和它们的混合物。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述碳水化合物为蔗糖、乳糖、棉子糖或海藻糖。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的组合物，其中所述脱脂乳以约1％(w/v)至约
10％(w/v)的浓度存在。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的组合物，其中所述甘油以约0.2％(w/v)至约
5％(w/v)的浓度存在。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的组合物，其中所述碳水化合物以约1％(w/v)至约15％(w/v)的浓度存在。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中脱脂乳以约3％(w/v)至约8％(w/v)的浓度存在，甘油以约0.5％(w/v)至约2％(w/v)的浓度存在，和碳水化合物以约5％(w/v)至约13％(w/v)的浓度存在。
53.权利要求46至52中任一项所定义的组合物在制备用于冷冻干燥的包囊细胞中的用途。
54.权利要求46至52中任一项所定义的组合物在冷冻包囊细胞中的用途。
55.一种制备用于冷冻干燥的包囊细胞的方法，所述方法包括在权利要求46至52中任一项所定义的组合物中温育所述包囊细胞。
一种冷冻干燥包囊细胞的方法、冻干的包囊细胞、含有冻干的
包囊细胞的组合物及这种细胞和组合物的用途
[0002] 本专利申请要求于2013年7月2日向欧洲专利局提交的欧洲专利第13174681.0号申请的优先权，该申请的全文并入本文用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明大体涉及一种冷冻干燥包囊细胞的方法。本发明还提供通过该方法获得的冻干的细胞以及含有该冻干的包囊细胞的组合物和这些细胞的多种用途，如作为药物、作为营养食品、作为食品添加剂或作为化妆品添加剂。本发明还提供一种新的组合物，该组合物含有脱脂乳、甘油和碳水化合物，且可例如用于细胞的冷冻干燥。
背景技术
[0004] 益生菌是活的微生物，根据世界卫生组织(WHO)，当以合适的量给予益生菌时，其能给宿主带来健康益处。特别地，嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)促进肠道健康，而肠道健康是宿主总体幸福感的主要方面。益生菌产品需要一些工艺步骤来确保它们的稳定性和存活力。益生菌产品可能因贮存及在消费后通过胃肠道的过程中而受到不利影响。
[0005] 许多益生菌产品是冻干的从而保存它们直至被使用。这就意味着首先将益生菌产品深冻，然后在真空中将其脱水。这种冷冻干燥过程对保持作为食品添加剂、食品补充剂或营养食品的益生菌的稳定性和存活力是关键的。
[0006] 从技术角度而言，冷冻干燥，也称为升华干燥(lyophilisation)、低压冻干(lyophilization)或冻干(cryodesiccation)，可被定义为冷却液体样品，从而使可冷冻的溶液向冰转变，可结晶溶质结晶，并且包含与未冷冻混合物相关的非结晶溶质的非晶基体形成，随后将水自非晶基体中蒸发(升华)。材料中冷冻水的蒸发(升华)通常通过以下方式实现：降低环境压力从而使材料中的冷冻水直接自固相升华为气相。冷冻干燥的最大优点是使材料稳定以便贮存。
[0007] 此外，冷冻干燥具有无解冻为包囊细胞的风险的优点(Santivarangkna,C.,Kulozik,U.和Foerst,P.(2007)Alternative drying processes for the industrial preservation of lactic acid starter cultures.Biotechnology Progress,23(2),302-315)。已报道在冷冻干燥后细菌细胞有显著的死亡率，这是由膜完整性的缺失和大分子的变性造成的。参见Franks,F.(1995)“Protein destabilization at low temperatures”.Advances in Protein Chemistry,46,105-139；Thammavongs等(1996)“Physiological response of Enterococcus faecalis JH2-2to cold shock:Growth at low temperatures and freezing/thawing challenge”Letter in Applied Microbiology,23(6),398-402；De Angelis,M.和Gobbetti,M.(2004)“Environmental stress responses in Lactobacillus:A review”Proteomics,4(1),106-122。
[0008] 已证实细菌在硫酸纤维素中包囊能够在冷冻干燥过程中对细菌发挥保护作用。一个关于藻酸盐-壳聚糖作为包囊材料的研究提到，当将胶囊(capsule)在人工肠液中温育(incubate)时，其开始溶胀(Paulraj Kanmani,R.Satish Kumar,N.Yuvaraj,K.A.Paari,V.Pattukumar和Venkatesan Arul(2011)Cryopreservation and Microencapsulation of a Probiotic in Alginate-chitosan Capsules Improves Survival in Simulated Gastrointestinal Conditions.Biotechnology and Bioprecess Engineering,(16)1106-1114)。在该研究中，Kanmani等还描述了当藻酸钠-壳聚糖包被的微胶囊(microcapsule)与人工肠液接触时，其收缩了10％。
[0009] 因此，冷冻干燥过程对细胞(如细菌细胞)的有害作用可通过采用纤维素硫酸钠的微包囊抵消，这是因为这种包囊材料可使胶囊的稳定性改善并使包囊细菌的存活力提高。然而，仍然有克服冷冻干燥过程对细胞(如细菌细胞)的有害作用的需求。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明通过提供新的冷冻干燥包囊细胞的方法、通过该方法获得的包囊细胞及这些包囊细胞和含有这些包囊细胞的组合物的多种用途来满足上述需求。
[0012] 第一个方面，本发明提供一种冷冻干燥包囊细胞的方法，该方法包括至少两个连续温育(incubation)步骤，其中在每个温育步骤中，所述包囊细胞在含有冷冻保护剂的温育溶液中温育合适的时间段，其中温育溶液中的冷冻保护剂的浓度随着每个随后温育步骤而增加。
[0013] 第二个方面，本发明提供一种通过本文所述的冷冻干燥包囊细胞的方法获得的冻干的包囊细胞。
[0014] 第三个方面，本发明提供一种包含适宜载体和通过本文所述的冷冻干燥包囊细胞的方法获得的包囊细胞的组合物。在示例性的实施方案中，该组合物可以是例如用于人或动物的食品补充剂、肥皂制剂、化妆品组合物或药物组合物。
[0015] 第四个方面，本发明提供一种治疗或预防腹泻、抗生素引起的腹泻、关节炎、肥胖、肠易激综合征、胃灼热、慢性疲劳综合征、胃肠癌和患有肠道不平衡菌群的其它形式的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的冻干的包囊细胞或含有冻干的包囊细胞的组合物。
[0016] 第五个方面，本发明提供本文所述的冻干的包囊细胞或含有冻干的包囊细胞的组合物在治疗或预防腹泻、抗生素引起的腹泻、关节炎、肥胖、肠易激综合征、胃灼热、慢性疲劳综合征、胃肠癌和患有肠道不平衡菌群的其它形式中的用途。
[0017] 第六个方面，本发明提供本文所述的冻干的包囊细胞或含有冻干的包囊细胞的组合物作为药物、食品添加剂或化妆品添加剂的用途。在本发明的示例性实施方案中，当用作食品添加剂时，该食品可以是乳基产品，如酸奶、白干酪或酪乳。在本发明的其它示例性实施方案中，当用作食品添加剂时，本文所述的冻干的包囊细胞或含有冻干的包囊细胞的组合物贮存在包含该食品的食品包装中分开的隔室中。
[0018] 第七个方面，本发明提供一种制备用于冷冻干燥的包囊细胞的方法，该方法包括至少两个连续温育步骤，其中在每个温育步骤中，所述包囊细胞在包含冷冻保护剂的温育溶液中温育合适的时间段，其中温育溶液中的冷冻保护剂的浓度随着每个随后温育步骤而增加。
[0019] 第八个方面，本发明提供一种冻干的包囊细胞原核细胞或一种冻干的包囊酵母细胞。
[0020] 第九个方面，本发明提供一种适于冷冻细胞的组合物，该组合物包含脱脂乳、甘油和碳水化合物。
[0021] 第十个方面，本发明提供一种制备用于冷冻干燥的包囊细胞的方法，该方法包括将包囊细胞在包含脱脂乳、甘油和碳水化合物的组合物中温育。
[0022] 第十一个方面，本发明提供包含脱脂乳、甘油和碳水化合物的组合物在制备用于冷冻干燥的包囊细胞中的用途。
[0024] 当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考发明详述可更好地理解本发明，其中：
[0025] 图1显示了采用本发明的方法，用5％脱脂奶粉和1％甘油作为冷冻保护剂处理后，冻干形式的包囊嗜酸乳杆菌细胞的明视场显微图像，其中在每个温育步骤中，细胞在含有浓度渐增的冷冻保护剂的温育溶液中温育。该冷冻保护剂的浓度渐增通过以下方式实现：在每个温育步骤中，用冷冻保护剂溶液(5％脱脂奶粉和1％甘油)将细菌生长液自100％连续稀释至50％、至25％、至12.5％、至6.25％、至3.125％、至0％；
[0026] 图2显示了在冷冻干燥过程中，采用含有脱脂乳和甘油(水中5％脱脂乳和1％甘油)作为冷冻保护剂，胶囊对嗜酸乳杆菌的保护作用。该保护作用通过冻干的细菌再水合之后的存活力测试进行检验。该存活力与作为参考的新鲜包囊细菌细胞相比并以“％存活力”表示；
[0027] 图3显示了针对冷冻干燥过程中嗜酸乳杆菌细菌的存活，两种不同冷冻介质(medium)/温育溶液(温育溶液1：含有DMSO作为冷冻保护剂的de Man,Rogosa and Sharpe(MRS)培养基；温育溶液2：水中5％脱脂乳和1％甘油)的比较；
[0028] 图4显示了冷冻干燥后再水合的空胶囊的明视场显微图像。所采用的冷冻介质是含1％甘油的脱脂乳。冷冻干燥前的冷冻步骤在液氮中进行；
[0030] 图6显示了在不含冷冻保护剂的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冷冻干燥的空胶囊的明视场显微图像，其中预冻步骤在乙醇/干冰浴中进行；
[0031] 图7显示了在含10％DMSO的PBS中冷冻干燥的空胶囊的明视场显微图像，其中预冻步骤在乙醇/干冰浴中进行；
[0032] 图8显示了在不含冷冻保护剂的MRS中冷冻干燥的空胶囊的明视场显微图像，其中预冻在液氮中进行；
[0033] 图9显示了在不含冷冻保护剂的MRS中冷冻干燥的空胶囊的明视场显微图像，其中冷冻在乙醇/干冰浴中进行；
[0034] 图10显示了本发明的冷冻干燥方法的一个实施方案的结果，其中采用5％脱脂乳、1％甘油和10％海藻糖的组合作为冷冻保护剂，同时作为具有浓度渐增的冷冻保护剂的用于连续温育的温育溶液和作为冷冻干燥溶液。在这一实验中应用了以下样品：1)游离(未包囊)乳杆菌样品(填充的菱形)，其采用脱脂乳/甘油/海藻糖冷冻干燥；2)游离乳杆菌样品(填充的方形)，其未采用脱脂乳/甘油/海藻糖冷冻干燥；3)包囊乳杆菌样品(十字形)，其采用本发明的方法冷冻干燥，其中在温育溶液中具有浓度渐增的脱脂乳、甘油和海藻糖作为冷冻保护剂(冷冻保护剂的浓度渐增通过以下方式实现：在每个温育步骤中，用冷冻保护剂溶液(5％脱脂奶粉、1％甘油和10％海藻糖)将细菌生长液自100％连续稀释至50％、至
25％、至12.5％、至6.25％、至3.125％、至0％)；4)包囊乳杆菌样品(填充的三角形)，其未使用海藻糖冷冻干燥。在冷冻干燥后的1、2、3、4、6、7和8周的时间点将样品再水合，以评估细菌在使用或未使用海藻糖低温保藏后经过冷冻干燥后2个月的时间在室温下的存活力。图
10中的每一数据点表示平行冻干样品的平均值(每一测试样品一式四份)，其中有两个例外：在第6周的采用10％海藻糖的游离细菌，以及在第8周的采用10％海藻糖的包囊细菌。
RFU＝相对荧光单位；
25％、至12.5％、至6.25％、至3.125％、至0％)；4)包囊乳杆菌样品(填充的三角形)，其未使用海藻糖冷冻干燥。在冷冻干燥后的1、2、3、4、6、7和8周的时间点将样品再水合，以评估细菌在使用或未使用海藻糖低温保藏后经过冷冻干燥后2个月的时间在室温下的存活力。图
10中的每一数据点表示平行冻干样品的平均值(每一测试样品一式四份)，其中有两个例外：在第6周的采用10％海藻糖的游离细菌，以及在第8周的采用10％海藻糖的包囊细菌。
RFU＝相对荧光单位；
[0035] 图11显示了在包囊和冷冻干燥之后，不同时间点的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胶囊，其中图11A显示了包囊后即刻的干酪乳杆菌胶囊；图11B显示了冷冻干燥前、包囊后一天的干酪乳杆菌胶囊；和图11C显示了再水合的冻干干酪乳杆菌胶囊；
[0036] 图12显示了冷冻干燥之前一天和之后一天的干酪乳杆菌胶囊的存活力比较；
[0037] 图13显示了在包囊和冷冻干燥之后，不同时间点的长婴儿双歧杆菌胶囊，其中图13A显示了冷冻干燥前、包囊后一天的婴儿双歧杆菌胶囊；和图13B显示了再水合的冻干长婴儿双歧杆菌胶囊；
[0038] 图14显示了冷冻干燥之前一天和之后一天的长婴儿双歧杆菌胶囊的存活力比较。
[0039] 发明详述
[0040] 本发明提供一种冷冻干燥包囊细胞的方法，其中该方法包括至少两个连续温育步骤。在每个温育步骤中，所述包囊细胞在含有冷冻保护剂的温育溶液中温育合适的时间段，其中温育溶液中的冷冻保护剂的浓度随着每个随后温育步骤而增加。本发明的发明人发现，该方法在冷冻干燥过程之前和过程中对胶囊(包囊材料)的(结构)完整性提供保护作用。此外，将细胞包囊于其中的胶囊的贮存寿命延长，并且包囊细胞的存活力显著增加(参见实施例部分)。在机械学水平上，尽管不希望受理论束缚，但认为，使包囊细胞经历本发明的方法的至少两个连续温育步骤避免了胶囊的“变皱”。
[0041] 在连续温育步骤中，温育溶液中的冷冻保护剂(需指出的是，本文所采用的术语“冷冻保护剂”是指单一冷冻保护剂和两种或更多种冷冻保护剂的混合物/组合)浓度的增加可以通过多种方式实现。例如，对于每个温育步骤，可以向包囊细胞的混悬液中添加冷冻保护剂的储液。例如，若采用冷冻保护剂如DMSO、甲酰胺、N-甲基乙酰胺(MA)或丙二醇，可使用纯冷冻保护剂的储液(100％储液)，在每个温育步骤中向细胞混悬液中加入一定量的储液从而增加冷冻保护剂的浓度(参见实施例部分的实施例1)。可选地，例如还可以采用包囊细胞将在其中经历冷冻干燥的溶液(即冷冻溶液或低温保藏介质)作为开始溶液/储液以实现冷冻保护剂浓度的渐增。采用最终冷冻溶液来实现这一目的的优点是：无需为连续温育步骤制备额外的储液。当在温育步骤中采用冷冻保护剂的混合物(例如，脱脂奶粉与甘油的混合物或脱脂奶粉、甘油和碳水化合物(如蔗糖或海藻糖)的混合物)时，上述方法简化了温育步骤的操作。在这种情况下，所制备的冷冻溶液(例如，水中5％(w/v)脱脂乳和1％(v/v)甘油或5％(w/v)脱脂乳、1％(v/v)甘油和10％(w/v)碳水化合物(如蔗糖或海藻糖)的水性溶液)用于在每个温育步骤中“连续稀释”在其中贮存包囊细胞的介质。例如，上述“连续稀释”可以如下实现。自相应小瓶中移除其中存在包囊细胞的细胞培养基体积的一半，并加入相同体积的冷冻溶液用于第一个温育步骤。随后，将包囊细胞温育所需时间段，然后再次移除温育混合物体积的50％，并用相同体积的冷冻溶液替换用于第二个温育步骤。上述过程可以根据需要的频率重复，由此在每个温育步骤中增加冷冻保护剂的浓度。如果想要，最后的温育步骤可以在冷冻溶液中进行。
[0042] 术语“冷冻干燥”也称为升华干燥、低压冻干或冻干，该术语以其常规含义使用，即冷却液体样品，从而使可冷冻的溶液向冰转变，可结晶溶质结晶，并且包含与未冷冻混合物相关的非结晶溶质的非晶基体形成，随后将水自非晶基体中蒸发(升华)。在这一过程中，材料中冷冻水的蒸发(升华)通常通过以下方式实现：降低环境压力从而使材料中的冷冻水直接自固相升华为气相。冷冻干燥通常包括预处理、冷冻、初次干燥及二次干燥的步骤。
[0043] 预处理包括在冷冻前处理所需产品(即，本文的包囊细胞)的任何方法。预处理可以包括例如，洗涤细胞、制剂修正(即，添加组分以增加稳定性和/或促进加工)或降低高蒸气压溶剂的量或增加表面积。
[0044] 冷冻步骤包括适于冷冻包囊细胞的任何方法。小规模地，例如在实验室，可以通过将材料放置于冷冻干燥烧瓶并在浴中(也称为壳冷冻器(shell freezer))旋转烧瓶来进行冷冻，所述浴通过例如机械冷冻、干冰与醇(如甲醇或乙醇)的混合物或液氮来冷却。当然也可以采用市售冷冻干燥设备如Thermo Fisher Scientific Inc.分销的ThermoModulyo冷冻干燥系统。在较大规模上，通常使用商售的、温度控制的冷冻干燥机来进行冷冻。在冷冻包囊细胞时，为了避免冰晶的形成，通常迅速进行冷冻。一般情况下，冷冻温度为-50℃至-80℃。
[0045] 下一步是初次干燥。在初次干燥阶段过程中，将压力降低(通常至几个毫巴的范围)，并将足够的热提供给材料用于水升华。所需热量可通过升华分子的升华潜热计算。材料中大约95％的水在这一初始干燥阶段升华。该阶段可为缓慢的(在工业上可以是数天)，因为如果添加过多的热量，可能会改变材料的结构。
[0046] 随后可以是二次干燥，作为冷冻干燥的最后一步。由于在初次干燥阶段已将冰移除，二次干燥阶段的目标是移除未冷冻的水分子(若存在)。在这一阶段，温度通常高于初次干燥阶段，甚至可以是0℃以上，以破坏水分子和冷冻材料之间已经形成的任何物理-化学相互作用。在该阶段中，通常还将压力降低，以促进解吸(通常在微巴范围内或在帕斯卡尔级分)。在冷冻干燥过程完成后，通常采用惰性气体(如氮气)破坏真空，然后将冻干的包囊细胞包装和/或贮存用于进一步使用。
[0047] 如上可明显看出，本发明的方法属于本领域技术人员所理解的“预处理”，并且该方法可与任何已知的冷冻和干燥材料(如，本文所述的游离或包囊细胞)的方法学一起使用。
[0048] 因此，由于进行的所述至少两个连续温育步骤可以伴随任何合适的随后的冷冻干燥步骤，本发明还涉及一种制备用于冷冻干燥的包囊细胞的方法，其中该方法包括至少两个连续温育步骤，其中在每个温育步骤中，所述包囊细胞在含有冷冻保护剂的温育溶液中温育合适的时间段，其中温育溶液中的冷冻保护剂的浓度随着每个随后温育步骤而增加。因此，尽管以下将参照冷冻干燥方法详细阐述本发明，但应当理解的是，所有这些实施方案等同地涉及本文所定义的制备用于冷冻干燥的包囊细胞的方法。
[0049] 在本发明所述的方法中，可以进行所述至少两个连续温育步骤的任意合适数量，只要该数量足以对例如冷冻干燥后包囊细胞的存活力提供所需效果即可。在示例性实施方案中，所述方法包括3、4、5、6、7、8、9或10个温育步骤，其中在每个温育步骤中，冷冻保护剂的浓度增加。每个温育步骤的温育可以进行任意合适的时间量，例如，发现能够实现胶囊的所需长期稳定性和/或包囊细胞的存活力的时间。温育步骤的合适温育时间以及合适数量可以根据经验确定，例如，通过在冷冻干燥后(某个时间段之后)进行细胞的再水合来评估包囊细胞的存活力来确定(参见此方面的实施例部分)。在一些实施方案中，每个温育步骤的温育时间通常为约数分钟至约数小时(同样参见此方面的实施例部分，其中在每个温育步骤中，细菌细胞温育约25分钟)。温育既可以在无搅拌下进行，也可以在搅拌(例如震荡或滚动)下进行，从而改善包囊材料和细胞对冷冻保护剂的吸收。
[0050] 在一些本发明所述方法的实施方案中，每个温育步骤中采用相同的冷冻保护剂或相同的冷冻保护剂的混合物。所述冷冻保护剂可以是能够在冷冻干燥过程中为所采用的包囊材料或包囊细胞提供抵抗破坏的保护的任何化合物。合适的冷冻保护剂的实例包括但不限于脱脂乳、甘油、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甲酰胺和DMSO的混合物、N-甲基乙酰胺(MA)、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇(1,2-丙二醇或1,3-丙二醇，或两者的混合物)、丙烯二醇(propylene glycol)、血清白蛋白、血清白蛋白与甲醇的混合物、碳水化合物和藻酸盐。可用作冷冻保护剂的藻酸盐的实例包括可从Cargill获得的 藻酸盐或藻酸盐(参见P.Capelaa等,“Effect of cryoprotectants,prebiotics and
microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried yoghurt”Food Research International，39卷，2期，2006年3月，203-211页)。
microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried yoghurt”Food Research International，39卷，2期，2006年3月，203-211页)。
[0051] 可用作冷冻保护剂的碳水化合物的实例包括但不限于蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、果胶(例如，也可从Cargill获得的UnipectineTM，上文的P.Capelaa等，Food Research International，39卷,已对其作为冷冻保护剂进行过讨论)、羟乙基淀粉(HES)和硫酸纤维素。
[0052] 在本发明中，还可以将两种或更多种冷冻保护剂的混合物用于温育溶液中，例如但不限于，脱脂乳与甘油的混合物或脱脂乳与碳水化合物的混合物(参见实施例部分)。在这样的实施方案中，在连续温育步骤中可以仅增加一种冷冻保护剂的浓度，而第二种(或者任何其它)冷冻保护剂的浓度在温育过程中保持不变(同样参见实施例部分)。在这样的一个实施方案中，浓度保持不变的冷冻保护剂可选自蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖或葡聚糖。在一个特定的实施方案中，在至少两个连续温育步骤的每一个中脱脂乳的浓度增加，而在至少两个连续温育步骤中碳水化合物(例如，蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖或葡聚糖)的浓度保持不变。
[0053] 任何合适的(包囊)细胞均可用于本发明。包囊细胞可以是真核细胞或原核细胞，或者几种真核细胞或几种原核细胞的混合物。所述细胞还可以是真核细胞与原核细胞的混合物。真核细胞的实例包括但不限于，哺乳动物细胞、真菌细胞或酵母细胞。一个哺乳动物细胞的纯粹说明性实例是由 等“Viability of freeze dried microencapsulated human retinal pigment epithelial cells”Eur.J.Pharm.Sci.47卷，2期，2012年9月29日，520-526页描述的人视网膜色素上皮(RPE)细胞，或由Gordon等,
2001,“Recovery of human mesenchymal stem cells following dehydration and rehydration”Cryobiology 43,182.描述的间充质干细胞。合适的酵母细胞的实例包括酿酒酵母(saccharomyces)、德巴里酵母(Debaromyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)，仅列举几个说明性的例子。真菌细胞的实例包括但当然不限于，曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)或青霉(Penicillium)。用于本发明的原核细胞可以是细菌细胞。所述细菌细胞可以是需氧细胞或厌氧细胞。在本发明所述方法的说明性实例中，细菌细胞可选自：双歧杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、梭菌(Clostridium)、梭杆菌(Fusobacterium)、蜜蜂球菌
(Melissococcus)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、乳球菌(Lactococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、消化链球菌(Peptostrepococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、小球菌(Pediococcus)、微球菌(Micrococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weissella)、气球菌(Aerococcus)、酒球菌(Oenococcus)、土芽孢杆菌(Geobacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)以及这些细胞的混合物。
2001,“Recovery of human mesenchymal stem cells following dehydration and rehydration”Cryobiology 43,182.描述的间充质干细胞。合适的酵母细胞的实例包括酿酒酵母(saccharomyces)、德巴里酵母(Debaromyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)，仅列举几个说明性的例子。真菌细胞的实例包括但当然不限于，曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)或青霉(Penicillium)。用于本发明的原核细胞可以是细菌细胞。所述细菌细胞可以是需氧细胞或厌氧细胞。在本发明所述方法的说明性实例中，细菌细胞可选自：双歧杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、梭菌(Clostridium)、梭杆菌(Fusobacterium)、蜜蜂球菌
(Melissococcus)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、乳球菌(Lactococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、消化链球菌(Peptostrepococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、小球菌(Pediococcus)、微球菌(Micrococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weissella)、气球菌(Aerococcus)、酒球菌(Oenococcus)、土芽孢杆菌(Geobacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)以及这些细胞的混合物。
[0054] 在本发明方法的一些实施方案中，本文公开的经历温育的细胞为益生菌细胞。合适的益生菌细胞的实例包括但不限于：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌代田株(Lactobacillus casei Shirota)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lacti)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosaceus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus(Lactobacillus GG))、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、耐热乳杆菌(Lactobacillus thermotolerans)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、变异微球菌(Micrococcus varians)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)以及这些细胞的任意混合物。
[0055] 在本发明的一些实施方案中，特别是当采用细菌细胞或真核细胞(如酵母菌)时，细胞被包囊时处于指数生长期。然而，当然也可以在任何其它生长期包囊并随后冷冻干燥细胞，例如，生长至汇合的哺乳动物细胞(参见此方面上文的 等,Eur.J.Pharm.Sci.(2012))。
[0056] 在本发明典型的实施方案中，细胞被包囊在具有多孔胶囊壁的微胶囊中。该多孔胶囊壁(壳)可包含选自如下的材料：藻酸盐聚合物、胶原、明胶、壳聚糖、琼脂糖、聚赖氨酸聚合物、硫酸纤维素聚合物和它们的组合。
[0057] 在本文中，需要注意的是，本发明所采用的术语“包囊”根据其本领域的常规含义使用。本文所采用的包囊是指在内部基质或细胞周围形成连续涂层的过程，该内部基质或细胞作为包囊材料的核被完全包含在胶囊壁内。包囊区别于“固定化”，固定化是指材料(如细胞)在基质内或遍及基质的捕获。与包囊相比，固定化是一个随机的过程，该过程导致不明确的颗粒尺寸，其中一定百分比的固定的元素将暴露在表面。包囊或微包囊(两个术语在本文可互换使用)有助于将核材料从其环境中分离，由此改善核材料的稳定性并延长其保质期。在核物质周围由微包囊剂形成的结构称为壁或壳。通常将壁系统的特性设计成保护核材料，并当允许小分子进出该多孔胶囊壁(即作为膜)时，在特定的条件下能释放该核材料。任何胶囊和包囊材料均可经历本文所述的冷冻干燥方法。所述胶囊的尺寸可以例如从亚微米至几毫米，并且所述胶囊可以是不同的形状。
[0058] 根据上述公开内容，已测试了几种食品级生物聚合物，如藻酸盐、淀粉、黄原胶、瓜尔豆胶(guar gum)、刺槐豆胶(locust bean gum)和卡拉胶以及乳清蛋白，作为微包囊材料对例如酸敏感微生物细胞的保护，并取得了不同程度的成功。最近的一项研究参见Islam等，“Microencapsulation of Live Probiotic Bacteria”J.Microbiol.Biotechnol.(2010),20(10),1367–1377。所有这些包囊材料以及所有这些益生菌均可用于本发明。一个关于所有可用于本发明的包囊材料和例如微生物细胞的综述在国际专利申请WO 2012/101167“Protection Of Microbial Cells From Acidic Degradation”中给出。
[0059] 在本文中，若藻酸盐聚合物用作细胞所需的包囊材料，则该藻酸盐聚合物可以是纯的藻酸盐聚合物、改性的藻酸盐-淀粉聚合物、藻酸盐-菊粉-黄原胶(alginate-inulin-xanthan gum)、藻酸盐和聚L-赖氨酸聚合物、壳聚糖/藻酸盐聚合物和壳聚糖/黄原胶聚合物。许多这种藻酸盐包囊材料的实例公开在上文的 等中或国际专利申请WO 2012/101167及这一国际申请中所引用的参考文献中。
[0060] 在本发明的其它实施方案中，包囊材料可以是硫酸纤维素聚合物。该聚合物可以是任何已知的硫酸纤维素聚合物，包括但不限于，包含由纤维素硫酸钠(NaCS)/聚[二烯丙基(二甲基)氯化铵](pDADMAC)形成的复合物的硫酸纤维素聚合物。许多这种藻酸盐包囊材料的实例公开在国际专利申请WO 2012/101167及这一国际申请中所引用的参考文献中。
[0061] 在本发明冷冻干燥包囊细胞的方法(或制备用于冷冻干燥的包囊细胞的方法)的实施方案中，在连续至少两个温育步骤后，将包囊细胞转移至合适的冷冻干燥介质中，且无中间洗涤步骤。“洗涤步骤”特指其中温育的细胞与不含冷冻保护剂的洗涤缓冲液/介质接触的步骤。
[0062] 在其它的实施方案中，在最后的温育步骤之后，将包囊细胞(如细菌细胞)在合适的冷冻干燥介质中冷冻干燥。在这些实施方案中，所述冷冻干燥介质还可包含冷冻保护剂。在这些实施方案中，所述冷冻干燥介质含有与温育溶液相同的冷冻保护剂。
[0063] 合适的可用于冷冻步骤(该步骤可在本发明的方法之后进行)的冷冻保护剂的实例包括但不限于：脱脂乳、甘油、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甲酰胺和DMSO的混合物、N-甲基乙酰胺(MA)、血清白蛋白、血清白蛋白与甲醇的混合物、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、丙烯二醇、碳水化合物和藻酸盐，再次仅列举几个说明性的例子。
[0064] 基于碳水化合物的合适的冷冻保护剂的实例包括但不限于：蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、果胶、羟乙基淀粉(HES)和硫酸纤维素。
[0065] 在上述冷冻步骤的典型的实施方案中，冷冻干燥介质是含有一种或多种为该冷冻步骤所选的冷冻保护剂的水性溶液。
[0066] 根据上述公开内容，本发明还涉及一种通过本文公开的方法获得的冻干的包囊细胞。本发明还包括一种组合物，该组合物包含本文公开的包囊细胞和合适的载体。该载体可以是任何用于例如药品、化妆品或食品的常规载体。相应地，本发明的组合物可以是食品补充剂、化妆品组合物或药物组合物。
[0067] 其中可包含本发明的包囊细胞的化妆品组合物的实例是局部组合物，如肥皂(液体或固体)、乳液(lotion)、化妆用品(make-up)、霜剂、沐浴露、沐浴盐或洗发剂。这种组合物的说明性实例包括益生菌细胞，如乳杆菌、双歧杆菌或凝固芽孢杆菌(例如菌株(Ganeden Biotec,Cleveland,Ohio,USA的Bacillus coagulans GBI-30,6086))。这种化妆品组合物可用于例如改善人类皮肤含水量、弹力、眼下浮肿或减少细纹和皱纹。
[0068] 若本发明得到的包囊细胞或含有该包囊细胞的组合物用作食品补充剂，该食品可以是例如谷类产品或乳基产品如酸奶、凝乳、布丁、白干酪或酪乳。若用作食品(如酸奶或布丁)的添加剂，本发明的包囊细胞或含有本发明包囊细胞的组合物可贮存在含有该食品的食品包装中分开的隔室中。例如，该分开的隔室可以是可弯曲的从而允许将其内容物(即本发明的包囊细胞或相应的组合物)清空至充满例如酸奶或布丁的食品包装的另一隔室中。采用这种分开的隔室允许仅在食品消耗前才将例如包囊的益生菌细胞添加至其中。
[0069] 与这一公开内容一致，本发明还涉及多种药品或营养食品用途。所述用途包括但不限于，治疗或预防腹泻、抗生素引起的腹泻、关节炎、肥胖、肠易激综合征、胃灼热、慢性疲劳综合征和患有肠道不平衡菌群的其它形式。对于上述用途，本发明的包囊细胞或包含该包囊细胞的组合物被施用于受试者，所述受试者通常为哺乳动物，如人或家养动物或农场动物，如猫、狗、羊、牛、猪、家禽或鱼，仅列举几个说明性的例子。
[0070] 本发明进一步涉及一种适于冷冻细胞的组合物，其中所述细胞既可以是包囊细胞，也可以是游离(未包囊)细胞。这种组合物包含脱脂乳、甘油和碳水化合物。因此，该组合物可以是可用于本文所述的以及本领域已知的任何冷冻干燥方法学的冷冻溶液(或低温保藏溶液)。因此，所述组合物包含冷冻保护剂(即脱脂乳、甘油和碳水化合物)的载体。所述载体通常为例如(纯)水或包含盐的水性溶液。
[0071] 在该种组合物的实施方案中，所述碳水化合物可以是但不限于，蔗糖、混有甲醇的葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、果胶、羟乙基淀粉(HES)、硫酸纤维素和这种这些碳水化合物的混合物。在一些实施方案中，所述碳水化合物为蔗糖、乳糖、棉子糖或海藻糖。
[0072] 脱脂乳可以以在冷冻过程中为细胞或包囊细胞提供足够保护的任何合适的浓度存在。在说明性的实施方案中，脱脂乳可以以约1％(w/v)至约10％(w/v)的浓度存在于本发明的组合物(冷冻溶液)中。在本文中，需要注意脱脂乳(也称为脱脂奶(skimmed milk))以其常规含义使用，是指将所有奶油(也称为乳脂)自全乳中移除时得到的乳。任何可获得的脱脂乳/脱脂奶均可用于本发明的冷冻溶液/组合物。通常将脱脂奶粉用于本发明的冷冻组合物的制备。因此，本文所给出的脱脂乳的浓度是指基于冷冻溶液体积的脱脂乳的重量-％。
[0073] 甘油也可以以在冷冻过程中为细胞或包囊细胞提供足够保护的任何合适的浓度存在于本发明的组合物中。在说明性的实施方案中，甘油可以以约0.2％(w/v)至约5％(w/v)的浓度存在于本发明的冷冻溶液中。
[0074] 碳水化合物也可以以在冷冻过程中为细胞或包囊细胞提供足够保护的任何合适的浓度存在于本发明的组合物中。在说明性的实施方案中，碳水化合物可以以约1％(w/v)至约15％(w/v)的浓度存在于本发明的冷冻溶液中。
[0075] 在上述组合物的说明性的实施方案中，脱脂乳以约3％(w/v)至约8％(w/v)的浓度存在，甘油以约0.5％(w/v)至约2％(w/v)的浓度存在，和碳水化合物以约5％(w/v)至约13％(w/v)的浓度存在。在一个进一步的说明性实施方案中，本发明的冷冻组合物含有约
5％(w/v)的脱脂乳、约1％(w/v)的甘油和约10％(w/v)的碳水化合物。为了便于说明，在此指出，所述溶液可通过称取1g甘油、5g脱脂奶粉和10g海藻糖置于100ml的刻度测量装置中进行制备。然后用双蒸无菌水将溶液体积定容至100ml。
5％(w/v)的脱脂乳、约1％(w/v)的甘油和约10％(w/v)的碳水化合物。为了便于说明，在此指出，所述溶液可通过称取1g甘油、5g脱脂奶粉和10g海藻糖置于100ml的刻度测量装置中进行制备。然后用双蒸无菌水将溶液体积定容至100ml。
[0076] 根据上述公开内容，含有脱脂乳、甘油和碳水化合物的本发明的组合物可用于本文所公开的包囊细胞的冷冻。然而，这种含有脱脂乳、甘油和碳水化合物的本发明的组合物还可用于制备用于冷冻的包囊细胞，即用于本文公开的用浓度渐增的冷冻保护剂连续温育包囊细胞。因此，本发明还涉及一种制备用于冷冻的包囊细胞的方法，其中所述方法包括在含有脱脂乳、甘油和碳水化合物的本发明的组合物中温育包囊细胞。
[0077] 现在将通过以下非限制性的实验例进一步阐释本发明。实施例
[0078] 实施例1：通过向温育溶液中逐步添加冷冻保护剂的冷冻干燥
[0079] 实验数据：
[0080] 将嗜酸乳杆菌益生菌包囊、冻干、再水合并测定代谢活性来衡量存活力。在冷冻干燥和再水合之后分析胶囊的结构完整性。
[0081] 细菌的包囊
[0082] 在600nm波长下1OD光密度时收获嗜酸乳杆菌的细菌培养液，并在纤维素硫酸钠和聚-二烯丙基二甲基氯化铵(pDADMAC-也被称为其在国际化妆品原料命名(INCI)中的名称Gel8)中包囊。在37℃、50rpm震荡下于de Man,Rogosa和Sharpe(MRS)培养基中培养包囊细菌。
[0083] 冷冻干燥(升华干燥)
[0084] 通过在双蒸无菌水中逐步添加5％脱脂乳、1％甘油或DMSO作为冷冻保护剂，在乙醇/干冰浴中冷冻包囊细菌和游离细菌，然后在-80℃下贮存。用于游离细菌的冷冻介质与用于包囊细菌的相同，但是用于游离细菌的冷冻介质不以逐步的方式添加。
[0085] 对于包囊细菌细胞，冷冻保护剂以如下的逐步方式添加：
[0086] 一般步骤(针对培养基的“连续稀释”)：
[0087] 将最多1,000个胶囊/ml或其任意倍数的胶囊(含细菌)置于含有新鲜MRS培养基的50ml falcon管中。向上述细胞混悬液(温育溶液)中加入0.5ml/ml的冷冻介质作为冷冻保护剂，从而得到具有50％浓度的冷冻保护剂(v/v)的冷冻介质。作为示例性术语，若细胞混悬液的总体积为1ml，则移除0.5ml的培养基，然后添加0.5ml的冷冻介质，从而实现两者的
50％稀释。温育包囊细胞25分钟后，进一步将50％(v/v)的温育溶液换成冷冻保护介质(即若总体积为1ml，则移除0.5ml，然后添加0.5ml的冷冻介质，从而得到冷冻介质的75％(v/v)浓度)。再次进行25分钟的温育，然后在后续步骤中再次将50％的温育介质用冷冻介质替换。在最后的温育步骤中，胶囊的介质为100％的冷冻介质。
50％稀释。温育包囊细胞25分钟后，进一步将50％(v/v)的温育溶液换成冷冻保护介质(即若总体积为1ml，则移除0.5ml，然后添加0.5ml的冷冻介质，从而得到冷冻介质的75％(v/v)浓度)。再次进行25分钟的温育，然后在后续步骤中再次将50％的温育介质用冷冻介质替换。在最后的温育步骤中，胶囊的介质为100％的冷冻介质。
[0088] (A)DMSO冷冻保护剂的逐步添加
[0089] 将16个胶囊置于含有9ml新鲜MRS培养基的50ml falcon管中。向该细胞混悬液(温育溶液)中加入200μl的DMSO作为冷冻保护剂，从而得到DMSO的初始浓度为约2％(v/v)。将包囊细胞温育25分钟，然后进一步添加200μl的DMSO，从而得到DMSO的浓度为约4.2％(v/v)。再次进行25分钟的温育，然后在3个后续步骤中另外添加200μl的DMSO，从而使DMSO的最终浓度为10％(10ml温育溶液中1ml的DMSO)。
[0090] (B)脱脂乳/甘油的混合物作为冷冻保护剂(水中5％脱脂乳和1％甘油)的逐步添加
[0091] 在这一实施例中，将100个大型手工胶囊置于含有9ml新鲜MRS培养基的50ml falcon管中。在后续的连续温育步骤中，自falcon管中取出5ml的MRS培养基，并加入5ml的含有脱脂乳作为冷冻保护剂的温育溶液(水中5％脱脂乳(w/v)和1％甘油(w/v))。在这一实验中，进行6个温育步骤，其中冷冻保护剂的浓度以50％、75％、87.5％、93.75％、97％和100％的顺序增加，即在最后的温育步骤中，包囊细胞处于冷冻介质中。每个步骤中添加脱脂乳冷冻保护剂后的温育时间为约25分钟。在每个温育步骤的最后，胶囊通过重力作用沉降，由此允许通过移液将温育介质移除。在采用水中5％脱脂乳(w/v)和1％甘油(w/v)的最后温育步骤后，将冷冻的包囊细菌和游离细菌在该冷冻溶液中直接(即无任何洗涤步骤)进行升华干燥过夜。对于冷冻干燥，首先将胶囊和100％冷冻介质用96％乙醇/干冰浴快速冷冻。然后可将快速冷冻的颗粒贮存在-80℃下或立即进行冷冻干燥。任何冷冻干燥设备都可根据制造商的说明用于该冻干过程。对于本发明的实验，采用Thermo Scientific ModulyoD-230设备。这些实验的结果示于图1至图9。从图1的胶囊的明视场显微图像中可以看出，采用本发明的方法连续温育的胶囊在再水合后具有完整的包囊，从而增加了该包囊的结构完整性。在这方面另见图4和图5所示的图像，这两幅图表明采用本发明的方法的实施方案(在温育步骤中采用浓度渐增的脱脂乳)处理、然后在液氮或乙醇/干冰中冷冻干燥的硫酸纤维素胶囊在再水合后，保持了其具有光滑表面的原始球形；然而，自图6至图9所示的图像中可明显地看出，在不含冷冻保护剂的多种缓冲液中冷冻干燥的胶囊很大程度被损坏或破坏。
[0092] 除了保持将细胞包含在其中的胶囊的结构完整性，本发明的冷冻干燥方法还提供包囊细胞的显著更高的存活率。图2显示了，当在冷冻的制备中采用包含量渐增的脱脂乳和甘油作为冷冻保护剂的温育溶液时，(完整)胶囊在冷冻干燥过程中对受试细菌的保护作用。该保护作用通过存活力测试进行检验，该存活力测试是在冷冻干燥一天、然后将冻干细菌再水合而进行的。该存活力与作为参考的新鲜包囊细菌细胞相比并以“％存活力”表示。如图2所示，在经历本发明的冷冻干燥方法后，胶囊保护细菌免受冷冻干燥损害(包囊细菌的存活力为98％，与之比较，游离细胞的存活力为25％)，即包囊细菌的存活力显著高于游离细菌的存活力。
[0093] 图3显示了针对冷冻干燥过程中细菌的存活，本实施例中采用的两种不同温育溶液(温育溶液1：含有量渐增的DMSO作为冷冻保护剂的MRS培养基；温育溶液2：含有量渐增的脱脂乳)的比较。如图3所示，与未经历冷冻干燥的新鲜的包囊细菌细胞相比，使用浓度渐增的脱脂乳(还具有甘油，其是另外的冷冻保护剂)的温育提供无改变的存活率，而DMSO处理虽起作用，但效率较低，只有9％的存活率。
[0094] 实施例2：海藻糖和脱脂乳作为冷冻保护剂对纤维素硫酸钠包囊的乳杆菌的存活的影响
[0095] 在本实施例中，在含有或不含10％海藻糖作为补充冷冻保护剂的情况下贮存在环境条件下时，测试冻干的包囊嗜酸乳杆菌的存活。冷冻干燥溶液是含有5％脱脂乳(w/v)、1％甘油(w/v)和10％海藻糖(w/v)的水溶液，该溶液也用于连续温育步骤。
[0096] 实验细节：
[0097] 将预先冷冻的益生菌嗜酸乳杆菌的小瓶自-80℃解冻，并将20μl添加至50ml的MRS培养基中。随后在37℃、震荡速度为50rpm下，培养细菌过夜。第二天，采用Tecan Infinite M200在600nm(OD600)下测定细菌培养液的光密度。通常，OD600读数为1对应着细菌处于指数生长期时。细菌被包囊时应当处于指数生长期。
[0098] 对于细菌的包囊，100ul的OD600读数为1的细菌培养液与2ml含有0.9％氯化钠的1.8％纤维素硫酸钠混合。包囊过程采用5ml注射器和23G针。将细菌培养液与纤维素硫酸钠混合，然后滴入含150ml的1.3％pDADMAC(24kDa)、0.9％氯化钠的凝胶浴中。使胶囊在pDADMAC中凝胶化4分钟。随后，加入300ml的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)，洗涤胶囊8分钟。然后将300ml洗涤溶液移除，并另外加入400ml的PBS，再洗涤胶囊4分钟。然后将洗涤溶液排出，之后用PBS实施3×100ml的洗涤，然后用新鲜MRS实施3×30ml的洗涤。然后将胶囊转移至具有100ml的新鲜MRS培养基的250ml锥形瓶中。随后在37℃、震荡速度为50rpm下，培养这些胶囊过夜。
[0099] 对于游离细菌，将5ml的OD600＝1的乳杆菌细胞的过夜培养液转移至15ml falcon管中，然后3000g离心5分钟。将细菌颗粒重新悬浮于5ml的含有或不含10％(w/v)海藻糖的低温保藏介质(水中5％脱脂乳(w/v)和1％甘油(w/v))中。然后将重新悬浮的细菌等分为10×0.5ml份于15ml falcon管中。在96孔板的4个孔的每一个中放置5ul重新悬浮的细胞，然后进行Alamar Blue分析从而测定细菌细胞的代谢活性。Alamar 是一个经证实的细胞存活力指标，其利用活细胞将刃天青(resazurin)转化为荧光分子即9-羟基-3-异吩噁唑酮(resorufin)的天然还原力。刃天青，一种非荧光指示染料，通过代谢活跃的细胞的还原反应转化为亮红色荧光的9-羟基-3-异吩噁唑酮。所产生的荧光量与活细胞数成正比。将100ul的新鲜MRS培养基和10ul的Alamar Blue试剂添加至5ul的细菌样品中，然后在37℃、震荡速度为50rpm下温育样品1小时。将Alamar Blue分析板在Tecan Infinite M200上读数。将剩余的低温保藏介质中的游离细菌细胞在乙醇/干冰浴中冷冻，然后在-80℃下贮存。
[0100] 过夜培养后，首先将含有细菌的胶囊在250ml烧瓶中用3×50ml新鲜MRS培养基洗涤，然后将胶囊置于含10ml新鲜MRS培养基的15ml falcon管中。取出5ml的MRS培养基并加入5ml的含有或不含10％(w/v)海藻糖的低温保藏介质(如同用于游离细菌)。将胶囊在这一混悬液中温育25分钟，然后移除5ml的介质，替换为5ml的新鲜低温保藏介质(相应地含有或不含10％(w/v)海藻糖)。另外重复上述过程4次，从而使低温保藏介质的比例从第一次添加低温保藏介质后的50％升高至最终的98.5％。随后，在96孔板的4个孔的每一个中放置1个源自上述介质的胶囊，然后进行Alamar Blue分析从而测定胶囊中的细菌细胞的代谢活性水平。向含有胶囊的每一孔中加入10ul的Alamar Blue试剂和100ul的新鲜MRS培养基，然后在37℃、震荡速度为50rpm下温育样品1小时。将Alamar Blue分析板在Tecan InfiniteM200上读数。将4个源自低温保藏介质的胶囊置于含500ul冷冻干燥水性溶液的15ml falcon管中，所述水性溶液含有5％脱脂乳、1％甘油和含或不含10％海藻糖(相应地)。然后将这些胶囊在乙醇/干冰浴中冷冻，然后在-80℃下贮存。
[0101] 采用ThermoScientific Modulyo D-230冷冻干燥器，将具有脱脂乳冷冻保护剂(含有或不含10％海藻糖)的含游离细菌或胶囊的falcon管冷冻干燥过夜。为了测试冻干的细菌的存活，在每一个时间点上，用500ul Millipore水或5-10ml的MRS培养基分别再水合冻干的游离乳杆菌和包囊乳杆菌的平行样品5分钟。然后对游离乳杆菌和乳杆菌胶囊进行Alamar Blue分析。对于每一平行样品，该分析由如下条件中每一个的一式四份组成：
[0102] 1.空白样品(100ul MRS培养基+10ul Alamar blue)
[0103] 2.采用海藻糖冷冻干燥的游离乳杆菌样品(5ul的再水合培养液+100ul MRS培养基+10ul Alamar blue)
[0104] 3.不采用海藻糖冷冻干燥的游离乳杆菌样品(5ul的再水合培养液+100ul MRS培养基+10ul Alamar blue)
[0105] 4.采用海藻糖冷冻干燥的包囊细菌样品(1个胶囊/孔+100ul MRS培养基+10ul Alamar blue)
[0106] 5.不采用海藻糖冷冻干燥的包囊细菌样品(1个胶囊/孔+100ul MRS培养基+10ul Alamar blue)
[0107] 在37℃、震荡速度为50rpm下温育样品1小时。Alamar Blue分析板在Tecan Infinite M200上读数。在冷冻干燥后的1、2、3、4、6、7和8周的时间点将样品再水合，以评估细菌在用5％脱脂乳、1％甘油和含或不含10％海藻糖低温保藏后经过冷冻干燥后2个月的时间在室温下的存活力。
[0108] 上述实验的结果示于图10。图10中的每一个数据点代表平行冻干样品的平均值(每一测试样品一式四份)，其中有两个例外：在第6周的采用10％海藻糖的游离细菌，以及在第8周的采用10％海藻糖的包囊细菌，在两种情况下平行样品中均有一个完全降解(原因不明)，因此并未被包括在内。以相对荧光单位(RFU)测定存活率。从图10中可以看出，本发明的冷冻干燥方法，即其中在含有浓度渐增的冷冻介质(含5％脱脂乳、1％甘油和10％海藻糖)作为冷冻保护剂的溶液中连续温育包囊细菌细胞，提供大于60％的细胞存活率，从而相对于游离细胞的存活率提供了显著改善。然而，对于用浓度渐增的脱脂乳处理的细胞仅在两周的贮存期内达到了上述大于60％的存活率，而以10％(w/v)的浓度添加海藻糖则在整个8周的测试期内都保持了这种显著增加的存活率，即延长了胶囊/包囊细胞的保质期。这一结果还表明，本发明的方法以及可通过该方法获得的冻干的包囊细胞在细胞(如益生菌细胞(也可以是其它细胞))商业应用方面具有良好前景，因所述细胞在使用前需要贮存一段时间。
[0109] 实施例3：采用包含脱脂乳、海藻糖和甘油作为冷冻保护剂的组合物冷冻干燥包囊干酪乳杆菌
[0110] 将预先冷冻的益生菌干酪乳杆菌的小瓶自-80℃解冻，并将20μl添加至50ml的MRS培养基中。随后在37℃、震荡速度为50rpm下，培养细菌过夜。第二天，采用Tecan Infinite M200在600nm(OD600)下测定细菌培养液的光密度。通常，OD600读数为1对应着细菌处于指数生长期时。细菌被包囊时应当处于指数生长期。
[0111] 对于细菌的包囊，100ul的OD600读数为1的细菌培养液与2ml含有0.9％氯化钠的1.8％纤维素硫酸钠混合。包囊过程采用5ml注射器和23G针。将细菌培养液与纤维素硫酸钠混合，然后滴入含有150ml的1.3％pDADMAC(24kDa)、0.9％氯化钠的凝胶浴中。使胶囊在pDADMAC中凝胶化4分钟。随后，加入300ml的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)，洗涤胶囊8分钟。然后将300ml洗涤溶液移除，并另外加入400ml的PBS，再洗涤胶囊4分钟。然后将洗涤溶液排出，之后用PBS实施3×100ml的洗涤，然后用新鲜MRS实施3×30ml的洗涤。然后将胶囊转移至具有100ml的新鲜MRS培养基的250ml锥形瓶中。随后在37℃、震荡速度为50rpm下，培养这些胶囊过夜。
[0112] 过夜培养后，首先将含有细菌的胶囊在250ml烧瓶中用3×50ml新鲜MRS培养基洗涤，然后将胶囊置于含10ml新鲜MRS培养基的15ml falcon管中。取出5ml的MRS培养基并加入5ml的低温保藏介质(水中5％脱脂乳(w/v)、1％(w/v)甘油和10％(w/v)海藻糖)。将胶囊在这一混悬液中温育25分钟，然后移除5ml的介质，替换为5ml的新鲜低温保藏介质。另外重复上述过程4次，从而使低温保藏介质的比例从第一次添加低温保藏介质后的50％升高至最终的98.5％。
[0113] 最后，将源自低温保藏介质的胶囊置于含500ul冷冻干燥水性溶液的15ml falcon管中，所述水性溶液含有5％脱脂乳、1％甘油和10％海藻糖。然后将这些胶囊在乙醇/干冰浴中冷冻，然后在-80℃下贮存。
[0114] 图11A至图11C显示了包囊之前和之后的包囊细胞(图11A显示了包囊后即刻的干酪乳杆菌胶囊；图11B显示了冷冻干燥前、包囊后一天的干酪乳杆菌胶囊；和图11C显示了再水合的冻干干酪乳杆菌胶囊)，从中可以看出，干酪乳杆菌胶囊在冷冻干燥后看起来是完整的，即未受冷冻干燥的影响。
[0115] 除了表观检查，按照上述实施例2中所述，检查冷冻干燥之前和冷冻干燥之后的包囊干酪乳杆菌的存活力。从图12中可以看出，该实验的结果显示，干酪乳杆菌的存活力受到冷冻干燥的影响，即在冷冻干燥后，总的(full)存活力回升。因此，实施例3证明了本发明的冷冻干燥方法及相应的组合物的有效性和适宜性。
[0116] 实施例4：采用包含脱脂乳、海藻糖和甘油作为冷冻保护剂的组合物冷冻干燥包囊长婴儿双歧杆菌
[0117] 长婴儿双歧杆菌是严格厌氧菌的实例。因此，在厌氧条件下，在37℃和50rpm下于MRS培养基中培养该细胞过夜。在培养过程中，采用Gaspak(BD)来建立严格厌氧的环境。
[0118] 培养后，按照实施例2和实施例3所述、但在厌氧条件下，采用纤维素硫酸钠包囊双歧杆菌。过夜培养后，首先将含细菌的胶囊在250ml烧瓶中用3×50ml新鲜MRS培养基洗涤，然后将胶囊置于含10ml新鲜MRS培养基的15ml falcon管中。取出5ml的MRS培养基并加入5ml的低温保藏介质(水中5％脱脂乳(w/v)、1％(w/v)甘油和10％(w/v)海藻糖)。将胶囊在这一混悬液中温育25分钟，然后移除5ml的介质，替换为5ml的新鲜低温保藏介质。另外重复上述过程4次，从而使低温保藏介质的比例从第一次添加低温保藏介质后的50％升高至最终的98.5％。
[0119] 最后，将源自低温保藏介质的胶囊置于含500ul冷冻干燥水性溶液的15ml falcon管中，所述水性溶液含有5％脱脂乳、1％甘油和10％海藻糖。然后将这些胶囊在乙醇/干冰浴中冷冻，然后在-80℃下贮存。
[0120] 图13显示了包囊之前和之后的包囊细胞(图13A显示了冷冻干燥前、包囊后一天的胶囊；和图13B显示了再水合的冻干长婴儿双歧杆菌胶囊)，从中可以看出，长婴儿双歧杆菌胶囊在冷冻干燥后出现轻微不完整。
[0121] 除了表观检查，按照上述实施例2中所述，检查冷冻干燥之前和冷冻干燥之后的包囊婴儿双歧杆菌的存活力。从图14中可以看出，长婴儿双歧杆菌的存活力在一定程度上受冷冻干燥的影响，如图14示出了在冷冻干燥后，约50％的细菌是有活力的。然而可以确信的是，游离(未包囊)婴儿双歧杆菌细菌的存活力将会更低。此外可以预期，在冷冻干燥过程中完全干燥的胶囊具有更高的存活力。因此，实施例4也证明了本发明的冷冻干燥方法及相应的组合物的有效性和适宜性。
[0122] 本文示例性描述的发明可以在不存在任何未在本文具体公开的一种或多种元素、一种或多种限制的情况下适当地进行实施。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应该广泛理解而无限制。并且，本文采用的术语和表达方式用作描述的而非限制的术语，并且无意使用排除所示和所描述特征的任何等同方式或其部分的术语和表达方式，而是应理解，在本发明要求保护的范围内，多种修饰方式是可行的。因此应该理解，尽管本发明已经通过示例性实施方案和可选特征予以具体公开，但是本领域技术人员可以获得本文在此公开的其中所实施发明的修饰方式和改变，并且认为此类修饰方式和改变在本发明的范围内。
[0123] 本文已经广泛和通用地描述了本发明。落在通用公开内容之内的每个较窄种类和亚集也形成本发明的部分。这包括具有从该通类去除任何主题的前提或负面限制的本发明的通用描述，无论该排除的物质是否在本文具体描述。
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