狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法
阅读：678发布：2020-05-08
专利汇可以提供狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了狼疮抗凝物检测用 试剂 盒 及通过该试剂盒判断待测样品中狼疮抗凝物存在与否的方法，包括第1 凝固 时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、大豆磷脂，CaCl2和缓冲液；第2凝固时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、氢化磷脂，CaCl2和缓冲液；本发明在第2凝固时间测定试剂中加入氢化磷脂，以氢化磷脂结合LA，特异性好， 稳定性 高；本发明的试剂盒在检测LA时，不需要配套其他公知的检测试剂，无需将第1凝固时间测定试剂/第2凝固时间测定试剂和健康正常 血浆 混合来进行阳性样本的判断，并且在样本测试前也无需进行样本处理，简化了检测流程。，下面是狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法专利的具体信息内容。
1.狼疮抗凝物检测用试剂盒，其特征在于，包括
第1凝固时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、大豆磷脂，CaCl2和缓冲液；
第2凝固时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、氢化磷脂，CaCl2和缓冲液；
所述第1凝固时间测定试剂中包含2-10mg/L的凝血因子激活剂、5-20mg/L的大豆磷脂、
10-50mmol/L的CaCl2和20-80mmol/L pH＝7-8的缓冲液；所述第2凝固时间测定试剂中包含
2-10mg/L的凝血因子激活剂、10-40mg/L的氢化磷脂、10-50mmol/L的CaCl2和20-80mmol/L pH＝7-8的缓冲液；
所述试剂盒的用途为判断狼疮抗凝物存在与否通过包括下列步骤的方法实施：
S1，将≥30人健康正常血浆分别与第1凝固时间测定试剂、第2凝固时间测定试剂混合，获得正常血浆第1凝固时间范围T1、正常血浆第1凝固时间与第2凝固时间比值范围T2；
S2，将从受试者采集的待测血浆平均分成两份；
S3，将S2中分成两份的其中之一和第1凝固时间测定试剂混合来测定第1凝固时间；
S4，根据第1凝固时间与T1的关系，判断待测样品是否含狼疮抗凝物；
其中S4步骤后还包括：
S5，将S2中分成两份的另外一份和第2凝固时间测定试剂混合来测定第2凝固时间；
S6，以第1凝固时间和第2凝固时间的比值来判断上述待测血浆是否含狼疮抗凝物；
所述正常血浆第一凝固时间与第二凝固时间的比值参考范围为0.9-1.2。
2.如权利要求1所述的狼疮抗凝物检测用试剂盒，其特征在于，所述第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂中的凝血因子激活剂为RVV-X，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。
3.如权利要求1所述的狼疮抗凝物检测用试剂盒，其特征在于，所述第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂中还包含蛋白保护剂、防腐剂、离子强度调节剂和凝血因子保护剂。
4.如权利要求3所述的狼疮抗凝物检测用试剂盒，其特征在于，所述第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂中还分别包含22-70g/L蛋白保护剂、0.03-0.05％防腐剂、80-
300mmol/L离子强度调节剂和1-6g/L凝血因子保护剂，上述百分数为体积百分数。
5.如权利要求3或4任一项所述的狼疮抗凝物检测用试剂盒，其特征在于，所述蛋白保护剂为A组分和B组分的复配物，所述A组分为BSA、酪蛋白或脱脂奶粉，所述B组分为海藻糖、甘露醇或蔗糖；所述的防腐剂为Proclin300，所述的离子强度调节剂为NaCl、KCl或MgCl2，所述的凝血因子保护剂为甘氨酸、组氨酸或精氨酸。
6.下列试剂用于制备判断狼疮抗凝物存在与否的试剂盒的用途：
(i)第1凝固时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、大豆磷脂，CaCl2和缓冲液；
(ii)第2凝固时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、氢化磷脂，CaCl2和缓冲液；
其中判断狼疮抗凝物存在与否通过包括下列步骤的方法实施：
S1，将≥30人健康正常血浆分别与第1凝固时间测定试剂、第2凝固时间测定试剂混合，获得正常血浆第1凝固时间范围T1、正常血浆第1凝固时间与第2凝固时间比值范围T2；
S2，将从受试者采集的待测血浆平均分成两份；
S3，将S2中分成两份的其中之一和第1凝固时间测定试剂混合来测定第1凝固时间；
S4，根据第1凝固时间与T1的关系，判断待测样品是否含狼疮抗凝物”。
7.如权利要求6所述的用途，其中S4步骤后还包括：
S5，将S2中分成两份的另外一份和第2凝固时间测定试剂混合来测定第2凝固时间；
S6，以第1凝固时间和第2凝固时间的比值来判断上述待测血浆是否含狼疮抗凝物”。
狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法
技术领域
背景技术
[0002] 狼疮抗凝物质(lupus anticoagulation，LA)是一种针对带阴电荷磷脂的自身抗体，是抗磷脂抗体的一种，常见于系统性红斑狼疮等结缔组织性疾病患者。因其首先在红斑狼疮患者身上被研究，故命名为狼疮抗凝物质。现已发现它可存在于多种疾病中。狼疮抗凝物质的持续存在被认为是不明原因的习惯性流产、死胎、胎儿发育迟滞、动静脉栓塞、各种易栓性疾病以及某些自身免疫性疾病的危险信号。
[0003] LA可通过识别脂结合凝血酶原来影响凝血反应，阻断活化的凝血因子与凝血酶原作用，从而抑制纤维蛋白的形成，致使凝血时间延长，因此称之为抗凝血酶原抗体可能更为适宜，开展LA的实验检测对临床各科的疾病诊断具有很大的意义。
[0004] LA的检测包括筛查试验、混合试验和确认试验。由于LA的影响因素复杂，在筛查试验阶段，需要将凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原检测、稀释或改良后的Russell蛇毒时间（dRVVT或 MRVVT)、和Staclot-LA试验或白陶土凝固时间等结合使用，以避开各干扰因素，但是多种方法的组合导致操作过程繁琐。
[0005] 混合试验是通过用健康正常血浆与待测血浆采用1∶1的比例混合，来观察延长的活化部分凝血活酶时间（APTT）是否被纠正。若待测血浆缺少1种或多种凝血因子，则混合后延长的APTT 将得到纠正；反之若待测血浆中存在LA等抗凝物质，则无法被纠正。
[0006] 关于检测顺序，国际血栓形成与止血学会（ISTH）主张LA 筛查试验阳性时立刻进行混合试验，依据混合试验的结果来决定是否需要进一步做LA的确认试验。
[0007] LA的确认试验是分别以低浓度含凝脂的凝固时间测定试剂和高浓度含凝脂的凝固时间测定试剂来测定凝固时间，通过各试剂得到凝固时间的比值来确认待测样本中LA的存在。
[0008] 授权公告号CN102650643B公开了一种“狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法”，包括（i）第1凝固时间测定试剂，其含选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸中的至少1种磷脂；及（ii）第2凝固时间测定试剂，其含选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸中的至少1种磷脂；其中第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂之中至少一方含碱金属盐，且所述第2凝固时间测定试剂含相比所述第1凝固时间测定试剂更低浓度的碱金属盐，或者，不含碱金属盐。
[0009] 授权公告号CN102384979B公开了“狼疮抗凝物检测用试剂盒及其存在与否的判断方法”，包括第1凝固时间测定试剂，其含锰盐、磷脂、和选自鞣花酸、高岭土、硅藻土和氧化硅的用于在体外引起血液凝固的活化剂；第2凝固时间测定试剂，其含锰盐、磷脂、和选自鞣花酸、高岭土、硅藻土和氧化硅的用于在体外引起血液凝固的活化剂，其中，第2凝固时间测定试剂中的锰盐浓度比第1凝固时间测定试剂中的低、或第2凝固时间测定试剂不含锰盐；和第3凝固时间测定试剂，其含有钙盐。
[0010] 上述两种LA检测用试剂盒比以往的试剂盒，更明确地区分LA阳性待测样品和LA阴性待测样品。但是，该试剂盒需要同时检测待测样本和健康正常样本来获得狼疮比率，增加了测试的工作量。
发明内容
[0011] 为了解决现有技术中LA检测用试剂盒需要同时检测待测样本和健康正常样本来获得狼疮比率、导致工作量增加的问题，本发明的目的是提供一种狼疮抗凝物检测用试剂盒。为此，本发明还要提供一种通过该试剂盒判断待测血浆中狼疮抗凝物存在与否的方法。
[0012] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0013] 本发明的第一方面，提供一种狼疮抗凝物检测用试剂盒，包括
[0014] 第1凝固时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、大豆磷脂，CaCl2和缓冲液；
[0015] 第2凝固时间测定试剂，其包含凝血因子激活剂、氢化磷脂，CaCl2和缓冲液。
[0016] 优选的是，所述第1凝固时间测定试剂中包含2-10mg/L的凝血因子激活剂、5-20mg/L的大豆磷脂、10-50mmol/L的CaCl2和20-80mmol/L pH=7-8的缓冲液；所述第2凝固时间测定试剂中包含2-10mg/L的凝血因子激活剂、10-40mg/L的氢化磷脂、10-50mmol/L的CaCl2和20-80mmol/L pH=7-8的缓冲液。
[0017] 优选的是，所述第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂中的凝血因子激活剂为RVV-X，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（Tris-HCl）。
[0018] 更为优选的是，所述第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂中还包含蛋白保护剂、防腐剂、离子强度调节剂和凝血因子保护剂。
[0019] 优选的是，所述第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂中还分别包含22-70g/L蛋白保护剂、0.03-0.05%防腐剂、80-300mmol/L离子强度调节剂和1-6g/L凝血因子保护剂，上述百分数为体积百分数。
[0020] 优选的是，所述蛋白保护剂为A组分和B组分的复配物，所述A组分为BSA（牛血清白蛋白）、酪蛋白或脱脂奶粉，所述B组分为海藻糖、甘露醇或蔗糖； 所述的防腐剂为Proclin300，所述的离子强度调节剂为NaCl、KCl或MgCl2，所述的凝血因子保护剂为甘氨酸、组氨酸或精氨酸。
[0021] 优选的是，所述蛋白保护剂为10-30g/L的A组分和12-40g/L的B组分组成的复配物。
[0022] 本发明的第二方面，提供采用上述试剂盒进行狼疮抗凝物存在与否的判断方法，包括如下步骤：
[0023] S1，将≥30人健康正常血浆分别与第1凝固时间测定试剂、第2凝固时间测定试剂混合，获得正常血浆第1凝固时间范围T1、正常血浆第1凝固时间与第2凝固时间比值范围T2；
[0024] S2，将从受试者采集的待测血浆平均分成两份；
[0025] S3，将S2中分成两份的其中之一和第1凝固时间测定试剂混合来测定第1凝固时间；
[0026] S4，根据第1凝固时间与T1的关系，判断待测样品是否含狼疮抗凝物。
[0027] 当待测血浆测得的第1凝固时间落入T1范围时，表明待测血浆为健康正常血浆；当待测血浆测得的第1凝固时间超过T1的最大值时，表明待测血浆为可疑阳性血浆。
[0028] 优选的是，所述S4步骤后还包括：
[0029] S5，将S2中分成两份的另外一份和第2凝固时间测定试剂混合来测定第2凝固时间；
[0030] S6，以第1凝固时间和第2凝固时间的比值来判断上述待测血浆是否含狼疮抗凝物。
[0031] 将待测血浆进行S5、S6步骤，当S6中的比值在在0.9-1.2之间时，表明待测血浆为阴性，不含狼疮抗凝物；当比值大于1.2时，表明待测血浆为阳性，含有狼疮抗凝物。
[0032] 与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明在第2凝固时间测定试剂中加入氢化磷脂，以氢化磷脂结合LA，特异性好，稳定性高；本发明的试剂盒在检测LA时，不需要配套其他公知的检测试剂，无需将第1凝固时间测定试剂/第2凝固时间测定试剂和健康正常血浆混合来进行阳性样本的判断，并且在样本测试前也无需进行样本处理，简化了检测流程，减少了测试的工作量。
具体实施方式
[0033] 实施例1
[0034] 狼疮抗凝物检测用试剂盒包括第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂。
[0035] 第1凝固时间测定试剂的制备：
[0036] S1，称取0.605g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 20 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.1；
[0037] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，获得RVV-X储备液浓度为1g/L；
[0039] S4，称取0.222g CaCl2，0.467g NaCl，0.2g甘氨酸，1.0g BSA，1.5g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0040] S5，吸取0.2ml RVV-X 储备液，0.5ml大豆磷脂储备液分别加入S4的100ml容量瓶中；
[0041] S6，吸取30ul Proclin300 加入S5的容量瓶中，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0042] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0043] 第2凝固时间测定试剂的制备：
[0044] S1，称取0.605g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 20 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.1；
[0045] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，储备液浓度为1g/L；
[0046] S3，称取5mg氢化磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得氢化凝脂储备液浓度为1g/L；
[0047] S4，称取0.222g CaCl2，0.467g NaCl，0.2g甘氨酸，1.0g BSA，1.5g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0048] S5，吸取0.2ml RVV-X 储备液，1ml氢化凝脂储备液分别加入S4的100mL容量瓶中；S6，吸取30ul Proclin300 加入S5的容量瓶中，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0049] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0050] 实施例2
[0051] 狼疮抗凝物检测用试剂盒包括第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂。
[0052] 第1凝固时间测定试剂的制备：
[0053] S1，称取1.514g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 50 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.5；
[0054] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，获得RVV-X储备液浓度为1g/L；
[0055] S3，称取5mg大豆磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得大豆磷脂储备液浓度为1g/L；
[0056] S4，称取0.333g CaCl2，0.877g NaCl，0.4g甘氨酸，2.0g BSA，2.5g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0057] S5，吸取0.5ml RVV-X 储备液，1.5ml大豆磷脂储备液分别加入S4的100ml容量瓶中；
[0058] S6，吸取50ul Proclin300 加入S5的容量瓶，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0059] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0060] 第2凝固时间测定试剂的制备：
[0061] S1，称取1.514g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 50 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.5；
[0062] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，储备液浓度为1g/L；
[0063] S3，称取5mg氢化磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得氢化凝脂储备液浓度为1g/L；
[0064] S4，称取0.333g CaCl2，0.877g NaCl，0.4g甘氨酸，2.0g BSA，2.5g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0065] S5，吸取0.5ml RVV-X 储备液，2.5ml氢化凝脂储备液加入容量瓶；
[0066] S6，吸取50ul Proclin300 加入S5的容量瓶，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0067] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0068] 实施例3
[0069] 狼疮抗凝物检测用试剂盒包括第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂。
[0070] 第1凝固时间测定试剂的制备：
[0071] S1，称取2.118g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 70 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.9；
[0072] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，获得RVV-X储备液浓度为1g/L；
[0073] S3，称取5mg大豆磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得大豆磷脂储备液浓度为1g/L；
[0074] S4，称取0.5549g CaCl2，1.695g NaCl，0.6g甘氨酸，3.0g BSA，3.8g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0075] S5，吸取1ml RVV-X 储备液，2ml大豆磷脂储备液分别加入S4的100ml容量瓶中；
[0076] S6，吸取35ul Proclin300 加入S5的容量瓶，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0077] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0078] 第2凝固时间测定试剂的制备：
[0079] S1，称取2.421g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 80 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.9；
[0080] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，储备液浓度为1g/L；
[0081] S3，称取5mg氢化磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得氢化凝脂储备液浓度为1g/L；
[0082] S4，称取0.5549g CaCl2，1.695g NaCl，0.6g甘氨酸，3.0g BSA，3.8g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0083] S5，吸取1ml RVV-X 储备液，4ml氢化凝脂储备液加入容量瓶；
[0084] S6，吸取35ul Proclin300 加入S5的容量瓶，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0085] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0086] 实施例4
[0087] 狼疮抗凝物检测用试剂盒包括第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂。
[0088] 第1凝固时间测定试剂的制备：
[0089] S1，称取2.421g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 80 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.6；
[0090] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，获得RVV-X储备液浓度为1g/L；
[0091] S3，称取5mg大豆磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得大豆磷脂储备液浓度为1g/L；
[0092] S4，称取0.111g CaCl2， 1.753g NaCl， 0.1g甘氨酸， 1.5g BSA， 4g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0093] S5，吸取0.8ml RVV-X 储备液， 1.8ml大豆磷脂储备液分别加入S4的100ml容量瓶中；
[0094] S6，吸取40ul Proclin300 加入S5的容量瓶，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0095] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0096] 第2凝固时间测定试剂的制备：
[0097] S1，称取2.421g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制80 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.6；
[0098] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，储备液浓度为1g/L；
[0099] S3，称取5mg氢化磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得氢化凝脂储备液浓度为1g/L；
[0100] S4，称取0.111g CaCl2， 1.753g NaCl， 0.1g甘氨酸， 1.5g BSA， 4g海藻糖，加入100ml容量瓶；
[0101] S5，吸取0.8ml RVV-X 储备液，3.5ml氢化凝脂储备液加入容量瓶；
[0102] S6，吸取40ul Proclin300 加入S5的容量瓶，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0103] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0104] 实施例5
[0105] 狼疮抗凝物检测用试剂盒包括第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂。
[0106] 第1凝固时间测定试剂的制备：
[0107] S1，称取0.605g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 20 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.1；
[0108] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，获得RVV-X储备液浓度为1g/L；
[0109] S3，称取5mg大豆磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得大豆磷脂储备液浓度为1g/L；
[0110] S4，称取0.222g CaCl2，加入100ml容量瓶；
[0111] S5，吸取0.2ml RVV-X 储备液，0.5ml大豆磷脂储备液分别加入S4的100ml容量瓶中，加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0112] S6，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0113] 第2凝固时间测定试剂的制备：
[0114] S1，称取0.605g三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，加入浓HCl调节pH值，加水至刻度线，混合均匀，配制 20 mmol/L Tris-HCl 溶液，用pH计测得pH为7.1；
[0115] S2，吸取1ml 蒸馏水复溶RVV-X冻干粉，储备液浓度为1g/L；
[0116] S3，称取5mg氢化磷脂加入5ml Tris-HCl溶液，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得氢化凝脂储备液浓度为1g/L；
[0117] S4，称取0.222g CaCl2，加入100ml容量瓶；
[0118] S5，吸取0.2ml RVV-X 储备液，1ml氢化凝脂储备液分别加入S4的100mL容量瓶中，[0119] 加入Tris-HCl 溶液至刻度线，混合均匀；
[0120] S7，每瓶4ml 分装，2～8℃保存。
[0121] 实施例6
[0122] 以实施例2制备的试剂盒为例，采用日本SYSMEX CA1500全自动血凝仪检测待测样品，过程如下：
[0123] 1、将第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂放入仪器中设置的试剂位；
[0124] 2、将待测血浆放置于样本架；
[0125] 3、取100ul待测血浆于37℃预温4min，预温后加入100ul第1凝固时间测定试剂，测定第1凝固时间，当第1凝固时间落入正常血浆凝固时间参考范围时，表明待测血浆不含狼疮抗凝物；当第1凝固时间超出正常血浆凝固时间参考范围时，需用第2凝固时间测定试剂进行确认；
[0126] 4、取100ul相同的待测血浆于37℃预温4min，预温后加入100ul第2凝固时间测定试剂，测定第2凝固时间；
[0127] 5、计算第1凝固时间与第2凝固时间的比值，与正常血浆凝固时间比值参考范围进行比较，判断是否狼疮抗凝物阳性。
[0128] 正常血浆凝固时间参考范围的确定：收集40例年龄18-55岁的健康个体血浆，根据上述检测方法，用本发明的第1凝固时间测定试剂测定各样本的血浆凝固时间，测得的正常血浆凝固时间参考范围为：34-45s。
[0129] 正常血浆凝固时间比值参考范围的确定：用本发明的第2凝固时间测定试剂测定上述40例健康正常血浆的第2凝固时间，以健康正常血浆的第1凝固时间与第2凝固时间相比，获得正常血浆凝固时间比值参考范围为0.9-1.2。
[0130] 本发明试剂盒及采用该试剂盒判断待测血浆是否狼疮抗凝物阳性的过程，不仅适用于SYSMEX CA1500血凝仪，而且还适用于其它品牌、型号的血凝仪，如SYSMEX其他型号的血凝仪，美国贝克曼库尔特ACL Advance全自动血凝仪、法国思达高STA Compact 全自动血凝仪等。
[0131] 实施例7
[0132] 以实施例2制备的试剂盒与进口沃芬（IL）LA检测试剂分别对临床200例血浆样本进行LA的筛选测定，统计血浆凝固时间延长的发生率，以考察试剂的临床特异性，结果如表1所示。
[0133] 表1
[0134]
[0135] 由表1可以看出，本发明试剂盒的临床特异性达到进口试剂标准。
[0136] 实施例8
[0137] 将实施例2制备的试剂盒置于37℃保存，使用时取出，于不同时间测定同一LA正常血浆、LA异常血浆的凝固时间，结果如表2所示。
[0138] 表2
[0139]
[0140] 如表2，本发明试剂盒连续测定15天，结果一直保持稳定，说明本发明试剂盒具有较好的稳定性。
[0141] 上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。
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