一种彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法
专利汇可以提供一种彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提出了一种彩色 马 蹄 莲组织培养离体快繁体系的构建方法，该体系包括以下评估模 块 ：外植体的选择、外植体消毒与灭菌方法筛选、不同6-BA浓度对丛生芽诱导的影响、继代培养不定芽的增殖优化、继代培养植株再生优化、再生植株生根优化，本发明对多个因素分析调控，对彩色马蹄莲 无性繁殖 的体系的影响因子进行构建和优化，为彩色马蹄莲的高效种植提供了科学便捷的路径，应用价值高。，下面是一种彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法专利的具体信息内容。
1.一种彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法，其特征在于，包括以下评估模块：外植体的选择、外植体消毒与灭菌方法筛选、不同6-BA浓度对丛生芽诱导的影响、继代培养不定芽的增殖优化、继代培养植株再生优化、再生植株生根优化；
各个所述评估模块具体优化方法为：
1)外植体的选择
选取所需彩色马蹄莲的品种种球，切取若干球茎嫩芽、若干球茎上新生刚展开的幼嫩叶片分别作为外植体并编号，先进行清洗消毒，然后接种于初代诱导培养基上，每瓶接种2个外植体，每个处理接种15瓶，实验重复3次，培养观察；
2)外植体消毒与灭菌方法筛选
选取所需彩色马蹄莲的品种种球，切取若干球茎嫩芽、若干球茎上新生刚展开的幼嫩叶片分别作为外植体并编号，将外植体进行预消毒，然后放入无菌瓶中，依次用0.1%的Hgcl2、2%的NaClO溶液灭菌处理，无菌水冲洗5次，每次5min，最后接种于初代诱导培养基上，每瓶接种2个外植体，每个处理接种30瓶，实验重复3次，培养观察；
3)不同6-BA浓度对丛生芽诱导的影响
将灭菌后的外植体分别接种在不同6-BA浓度的诱导培养基上，每瓶接种2块，每个处理接种15瓶，先暗培养20d，然后进行光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养45d统计并计算丛生芽诱导率；
4)继代培养不定芽的增殖优化
将步骤3）增殖获得的不定芽分割为约0.5cm×0.5cm的小块，每块不定芽数为10个，接种于以MS为基本培养基，分别附加不同6-BA浓度的增殖培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶
6块，实验重复3次，先在25±1℃光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养
30d后统计不定芽增殖面积、不定芽增殖数以及大于1cm的植株数，并计算出不定芽增殖倍数及平均每增殖块大于1cm的植株数；
5)植株再生优化
将步骤4）中生长良好、长势一致的增殖获得的不定芽，切割为约0.5cm×0.5cm大小，每块不定芽数为10个，接种于以1/2MS+NAA0.2mg/L为基本培养基，分别附加不同6-BA浓度的植株再生培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶6块，实验重复3次，先在25±1℃光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养45d后统计不定芽增殖面积、不定芽增殖数以及大于1cm的植株数，并计算出不定芽增殖倍数及平均每增殖块大于1cm的植株数；
6)再生植株生根优化
在步骤5）中再生获得的试管苗中，挑选生长良好，植株高度3-5cm的试管苗，分别接种到添加不同基本离子浓度、不同蔗糖浓度、不同活性炭浓度、不同NAA浓度的生根培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶6株，实验重复3次，先在25±1℃光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养30d后统计每株试管苗的生根条数、植株高度及叶片数，并计算出生根率、每株试管苗平均株高及叶片数。
2.根据权利要求1所述的彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法，其特征在于：
步骤1）、2）中所述初代诱导培养基组成成分为MS+NAA0.2 mg/L+6-BA2.0mg/L+琼脂粉5.8g/L，pH值为5.8-6.0，培养温度为25±1℃，相对湿度为70-75%；具体培养观察为先在25±1℃黑暗培养20d，再转入光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，初培养15d后观察并统计污染率，30d统计外植体启动率及褐化率。
3.根据权利要求1所述的彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法，其特征在于：
步骤2）中预消毒具体为先在中性洗涤剂溶液中浸泡15min，流水冲洗1h，然后将材料用无菌滤纸吸干表面水分；或，先用浓度3g/L 50%的多菌灵可湿性粉剂浸泡24～36h，再在中性洗涤剂溶液中浸泡15min，流水冲洗1h，将材料用无菌滤纸吸干表面水分。
4.根据权利要求1所述的彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法，其特征在于：
步骤3）中所述不同6-BA浓度的诱导培养基组成成分为MS+6-BA xmg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂粉5.8g/L+蔗糖30g/L+肌醇、酪蛋白各100mg/L，pH值为5.8-6.0，培养温度为25±1℃，相对湿度为70-75%；其中，x表示不同6-BA浓度取值，分别为1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L。
5.根据权利要求1所述的彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法，其特征在于：
步骤4）中分别附加不同6-BA浓度分别为1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L；步骤5）中分别附加不同6-BA浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L。
6.根据权利要求1所述的彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法，其特征在于：
步骤5）中所述植株再生培养基还添加有2g/L活性炭。
7.根据权利要求1所述的彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法，其特征在于：
步骤6）中不同基本离子浓度分别为MS、1/2MS、1/3MS、1/5MS；不同蔗糖浓度分别为10、15、
20、25、30g/L；不同活性炭浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0mg/L；不同NAA浓度分别为0、0.2、
0.4、0.6、0.8mg/L。
一种彩色马蹄莲组织培养离体快繁体系的构建方法
技术领域
背景技术
发明内容
各个所述评估模块具体优化方法为：
1）外植体的选择
选取所需彩色马蹄莲的品种种球，切取若干含幼嫩小芽的种球块茎、若干球茎上新生刚展开的幼嫩叶片分别作为外植体并编号，先进行清洗消毒，然后接种于初代诱导培养基上，每瓶接种2个外植体，每个处理接种15瓶，实验重复3次，培养观察；
2）外植体消毒与灭菌方法筛选
选取所需彩色马蹄莲的品种种球，切取若干含幼嫩小芽的种球块茎、若干球茎上新生刚展开的幼嫩叶片分别作为外植体并编号，将外植体进行预消毒，然后放入无菌瓶中，依次用0.1%的Hgcl2、2%的NaClO溶液灭菌处理，无菌水冲洗5次，每次5min，最后接种于初代诱导培养基上，每瓶接种2个外植体，每个处理接种30瓶，实验重复3次，培养观察；
3）不同6-BA浓度对丛生芽诱导的影响
将灭菌后的外植体分别接种在不同6-BA浓度的诱导培养基上，每瓶接种2块，每个处理接种15瓶，先暗培养20d，然后进行光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养45d统计并计算丛生芽诱导率；
4）继代培养不定芽的增殖优化
将步骤3）增殖获得的不定芽分割为约0.5cm×0.5cm的小块，每块不定芽数为10个，接种于以MS为基本培养基，分别附加不同6-BA浓度的增殖培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶
6块，实验重复3次，先在25±1℃光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养
30d后统计不定芽增殖面积、不定芽增殖数以及大于1cm的植株数，并计算出不定芽增殖倍数及平均每增殖块大于1cm的植株数；
5）植株再生优化
将步骤4）中生长良好、长势一致的增殖获得的不定芽，切割为约0.5cm×0.5cm大小，每块不定芽数为10个，接种于以1/2MS+NAA0.2mg/L为基本培养基，分别附加不同6-BA浓度的植株再生培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶6块，实验重复3次，先在25±1℃光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养45d后统计不定芽增殖面积、不定芽增殖数以及大于1cm的植株数，并计算出不定芽增殖倍数及平均每增殖块大于1cm的植株数；
6）再生植株生根优化
在步骤5）中再生获得的试管苗中，挑选生长良好，植株高度3-5cm的试管苗，分别接种到添加不同基本离子浓度、不同蔗糖浓度、不同活性炭浓度、不同NAA浓度的生根培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶6株，实验重复3次，先在25±1℃光照培养，光照周期为14 h/d，光照强度2000-3000lx，培养30d后统计每株试管苗的生根条数、植株高度及叶片数，并计算出生根率、每株试管苗平均株高及叶片数。
图3：不同6-BA浓度不定芽再生植株的影响（未添加活性炭）；
图4：不同6-BA浓度不定芽再生植株的影响（添加2g/L活性炭）。
具体实施方式
启动率=诱导启动的外植体数/接种外植体数×100%
丛生芽诱导率=形成丛生不定芽的外植体数/接种外植体数×100%
丛生芽增殖倍数=继代增殖后的不定芽数/初始接种时的不定芽数
实施例1：
外植体的选择、消毒与灭菌方法筛选
①球茎嫩芽：选取带有萌生芽的球茎，先用自来水冲洗掉泥土，之后去除最外层的褐色表皮，加入中性洗涤剂浸泡15min后，流水冲洗1h（灭菌方法A）；或，选取带有萌生芽的球茎，先用自来水冲洗掉泥土，用3g/L 50%的多菌灵可湿性粉剂浸泡24～36h，之后去除最外层的褐色表皮，加入中性洗涤剂浸泡15min后，流水冲洗1h（灭菌方法B）；
再选取块茎上幼嫩的小芽，切成长度约1cm左右的小块，芽底部要带有少量的块茎，并保证嫩芽的完整性；
在超净工作台上进行表面消毒，用0.1%的Hgcl2溶液浸泡7min后，再用2%的NaClO溶液浸泡10min，消毒后用无菌水冲洗5次，接种时去除少量块茎边缘组织，将其接种于预实验筛选获得的初代诱导培养基上MS+NAA0.2 mg/L+6-BA2.0mg/L上，每瓶接种2个嫩芽，平行接种
15瓶，实验重复3次。
外植体 污染率（%） 褐化率（%） 启动率（%）
叶片 3.5 ±0.9Bb 19.2±3.2Aa 15.2±7.1Bb
块茎芽 18.7 ±0.6Aa 3.0±0.7Bb 77.4±11.4Aa
表2：不同灭菌方式对外植体（块茎芽）诱导的影响
灭菌方法 污染率（%） 褐化率（%） 萌动率（%）
A 31.7±3.4b 30.6±1.0d 53.3±3.4b
B 13.3±1.7d 38.3±3.4c 64.5±2.5a
在培养过程中，嫩芽或叶片外植体在初代诱导培养基上，3d左右少量外植体周围开始出现细菌污染，7d左右陆续观察到霉菌污染。15d统计外植体污染结果并进行方差分析，结果显示，不同类型外植体污染率有极显著性差异（P＜0.01），叶片外植体的污染率显著低于球茎嫩芽外植。叶片外植体的污染率均低于4%，而球茎嫩芽外植体的污染率均在18.5%左右（表1）。嫩芽外植体污染率明显高于叶片外植体的原因可能是因为其表面粗糙，褶皱较多，极易藏菌且不易杀灭。
球茎嫩芽外植体（采用方式B灭菌）在添加不同6-BA浓度（1.0-4.0mg/L)的培养基中经
45d初代培养，均可诱导形成丛生芽，且丛生芽诱导率均存在显著性差异，见图1、表3：
表3：不同6-BA浓度对初代丛生芽诱导的影响
6-BA浓度（mg/l） 丛生芽诱导率(%)
1.0 14.1±1.1c
2.0 28.9±0.8a
3.0 20.2±0.6b
4.0 15.6±1.8c
丛生芽诱导率在添加2.0mg/L 6-BA培养基中最高，为28.9%，且丛生小植株生长状况最好，因此，最适诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2 mg/L；6-BA低浓度时，表现为外植体切口处体积的膨大及诱导出少量愈伤组织。
将不定芽继代培养30d，以不定芽增殖面积、不定芽增殖倍数及大于1cm的植株数三个指标考察不同6-BA浓度（1.0-4.0mg/L)对不定芽继代增殖的影响，结果见图2、表4：
表4：不同6-BA浓度对不定芽增殖的影响
不定芽增殖面积在2.0 mg/L 6-BA下效果最佳，在1.0 mg/L浓度下的效果最差；而不定芽增殖倍数在2.0、4.0 mg/L 6-BA浓度下最佳，增殖倍数可达7倍以上；其次为3.0mg/L，其增殖倍数与4.0 mg/L 6-BA浓度下无显著性差异，最适培养基均为1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA0.2mg/L。
1）再生培养基中不含2g/L活性炭
将不定芽继代培养45d，以不定芽增殖面积、不定芽增殖倍数及大于1cm的植株数三个指标考察不同6-BA浓度（0-0.8mg/L)对不定芽再生植株的影响；
2）再生培养基中不含2g/L活性炭
将不定芽继代培养45d，以不定芽增殖面积、不定芽增殖倍数及大于1cm的植株数三个指标考察不同6-BA浓度（0-0.8mg/L)对不定芽再生植株的影响；
结果见图3、图4、表5：
表5：在不同浓度6-BA下植株再生的影响
不定芽增殖面积和增殖倍数在0.2-0.8mg/L 6-BA浓度下无显著差异，明显优于没有添加6-BA的对照组；而在大于1cm的植株数上有显著性差异，不添加或加入0.2mg/L 6-BA再生植株数最多；之后随着 6-BA浓度的增高而呈显著下降趋势（不含活性炭）；
添加 (0-0.8mg/L）6-BA 对增殖面积和增殖倍数均无显著性差异，而在大于1cm的植株数上存在显著性差异；无论是否添加活性炭，均以未添加6-BA的对照组再生植株数最多，平均每块再生植株数可达6株左右，二者间无显著性差异；而添加0.2-0.8mg/L 6-BA的实验组，2g/L的活性炭的添加明显可以促进植株再生。
采用单一变量，依次对不同基本离子浓度、不同蔗糖浓度、不同活性炭浓度、不同NAA浓度进行培育生根实验，记录数据，并以生根、株高、叶片数为考擦指标，获取最佳变量浓度值（生根率=生根的植株数/接种试管苗植株数×100%）：
最适生根培养基为：1/2MS+0.8mg/L NAA+15g/L蔗糖+2.0g/L活性炭。
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