权利要求

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はダイズモラセス（molass
es）からイソフラボンを回収する方法に関する。 更に、
本発明は、イソフラボンを含む得られた生成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】イソフラボンは、植物性タンパク質材料を含む種々のマメ科植物、例えばダイズに存在する。 これらの化合物は、ダイジン、６”−ＯＡｃダイジン、
６”−ＯＭａｌダイジン、ダイゼイン、ゲニスチン、
６”−ＯＡｃゲニスチン、６”−ＯＭａｌゲニスチン、
ゲニステイン、グリシチン（glycitin）、６”−ＯＡｃ
−グリシチン、６”−ＯＭａｌグリシチン、グリシテイン（glycitein ）、ビオカニンＡ、ホルムオノネンチン（formononentin ）及びクメストロール（coumestrol）
を含む。 これらの化合物は典型的に、ダイズに固有の苦みある風味と関係している。 ダイズ材料中のイソフラボンは、イソフラボングルコシド（グルコン（glucone
））、イソフラボン共役物（isoflavone conjugate）
及びアグルコンイソフラボンを含む。 イソフラボングルコシドはイソフラボン部分に付着したグルコース分子を有する。 イソフラボン共役物はイソフラボングルコシドのグルコース分子に付着する追加の部分を有し、例えば、６”−ＯＡｃゲニスチンは、ゲニスチンのグルコース分子の６番目の部位に付着したアセテート基（acetat
e group ）を含む。 アグルコンイソフラボンはイソフラボン部分のみからなる。

【０００３】ダイズは、対応するグルコシド、共役物及びアグルコンメンバーを有するイソフラボン化合物の３
つの「ファミリー」、すなわちゲニステインファミリー、ダイゼインファミリー及びグリシテインファミリーを含む。 ゲニステインファミリーはグルコシドゲニスチン、共役物６”−ＯＭａｌゲニスチン（ゲニスチンの６”−マロン酸エステル）及び６”−ＯＡｃゲニスチン（ゲニスチンの６”−酢酸エステル）並びにアグルコンゲニステインを含む。 ダイゼインファミリーはグルコシドダイジン、共役物６”−ＯＭａｌダイジン及び６”−
ＯＡｃ ダイジン並びにアグルコンダイゼインを含む。
グリシテインファミリーはグルコシドグリシチン、共役物６”−ＯＭａｌグリシチン及びアグルコングリシテインを含む。例えば植物性タンパク質濃縮物等の商業用の生成物の製造において、焦点はこれらの物質を除去することであった。例えば、ダイズタンパク質濃縮物の通常の製造方法においては、ダイズ薄片を水性の酸又は水性のアルコールを用いて抽出し、水溶性の物質をダイズ薄片から除去し、多量のイソフラボンを抽出物中に可溶化する。イソフラボンを含む水溶性物質の抽出物はダイズモラセスである。ダイズモラセスは、ダイズタンパク質濃縮物の製造における副産物物質で、典型的には廃棄される。それゆえ、イソフラボンをダイズモラセスから分離することができるならば、ダイズモラセスは安価かつ望ましいイソフラボンの原料になる。

【０００４】最近、植物性タンパク質材料、例えばダイズ等に含まれるイソフラボンは医薬的価値を有することが認識されてきている。 アグルコンイソフラボンは特に興味を持たれている。 ゲニステイン及びダイゼインは心血管の危険因子をかなり減少させるかもしれない。 ”Pl
ant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma Lipid
s of Female Monkeys ”、Circulation 、９０巻、１２
５９頁（１９９４年１０月）参照。 又、ゲニステイン及びダイゼインは、女性における内因性のエストロゲンの減少又は変化したレベルにより引き起こされる疾患の病状、例えば閉経又は月経前症候群の病状を減少させると考えれている。 更に、以下に示す論文に記載されているように、アグルコンイソフラボンはヒトの癌細胞、例えば乳癌細胞及び前立腺癌細胞等の増殖を阻害するかもしれないことが認識されてきている。 ”Genistein Inhibi
tion of the Growth of Human Breast Cancer Cells,In
dependence from Estrogen Receptors and the Multi-D
rug Resistance Gene ”、Peterson及びBarnes、Bioche
mical and Biophysical Reseach,Communications、１７
９巻、No.1、６６１〜６６７頁（１９９１年８月３０
日）、”Genistein and Biochanin A Inhibit the Grow
th of Human Prostrate Cancer Cells but notEpiderma
l Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylat
ion”、Peterson及びBarnes、The Prostate、２２巻、
３３５〜３４５頁（１９９３年）及び”Soybeans Inhib
it Mammary Tumors in Models of Breast Cancer”、Ba
rnesら、Mutagens and Carcinogens in the Diet、２３
９〜２５３頁（１９９０年）参照。

【０００５】アグルコンイソフラボンは以下に示す一般式を有する。

【０００６】

【化１】

式中、Ｒ

₁ 、Ｒ

₂ 、Ｒ

₃及びＲ

₄は、Ｈ、ＯＨ及びＯＣ

Ｈ

₃からなる群より選ばれてよい。 ゲニステインは前記の一般式において、Ｒ

₁ ＝ＯＨ、Ｒ

₂ ＝Ｈ、Ｒ

₃ ＝ＯＨ

かつＲ

₄ ＝ＯＨである。 ダイゼインは前記の一般式において、Ｒ

₁ ＝ＯＨ、Ｒ

₂ ＝Ｈ、Ｒ

₃ ＝ＨかつＲ

₄ ＝ＯＨ

である。 グリシテインはＲ

₁ ＝ＯＨ、Ｒ

₂ ＝ＯＣＨ

₃ 、

Ｒ

₃ ＝ＨかつＲ

₄ ＝ＯＨである。 本発明は、イソフラボン及びイソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの回収に向けられる。 更に本発明は、イソフラボングルコシド及びアグルコンイソフラボン、ダイズモラセスのイソフラボンのイソフラボングルコシド及びアグルコンイソフラボンへの転換並びにイソフラボングルコシドに富む物質及びアグルコンイソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの回収に向けられる。

【０００７】植物性タンパク質イソフラボン共役物をアグルコンイソフラボンに転換する一般的な方法は既知であり、本出願の譲受人にが権利を有する、現在継続中の１９９５年６月７日出願の米国特許出願第０８／４７
７，１０２号にて提供される。 当該技術分野において既知の、イソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換するその他の方法としては、例えばObata らによる日本特許出願第２５８，６６９号がある。 これらの方法はイソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの回収については提供していない。 又、これらの方法はイソフラボン共役物のイソフラボングルコシド又はアグルコンイソフラボンへの転換については提供していない。
更に、これらの方法は単にイソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの中程度の転換を達成しているだけであり、この中程度の転換を果たすために実質的な時間を必要とする。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明はイソフラボンに富む物質及びダイズモラセスからのその製造方法を提供する。 更に本発明は、イソフラボングルコシドに富む物質及びダイズモラセスからのその製造方法を提供する。 更に本発明は、アグルコンイソフラボンに富む物質及びダイズモラセスからのその製造方法を提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、イソフラボンに富む物質及びそれをイソフラボンを含むダイズモラセスから回収する方法である。 方法は、イソフラボンを含むダイズモラセス材料を提供し、ケーキ（cake）を、ダイズモラセスから、イソフラボンの大部分がケーキ中に含まれることを引き起こすのに充分なｐＨかつ温度で分離することからなる。 好ましくは、分離の間、ｐＨは約３．０〜約６．５であり、温度は約０℃〜約３５℃である。 ケーキはイソフラボンに富む物質である。 １つの態様において、グルコシドに富むイソフラボン物質をイソフラボンに富む物質のケーキから形成する。 イソフラボンに富む物質の水性のスラリーを形成する。 スラリーを温度約２℃〜約１２０℃かつｐＨ約６〜約１３．５で、
イソフラボンに富む物質中のイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換するのに充分な時間処理する。 次いで、イソフラボングルコシドに富む物質のケーキをスラリーから分離してもよい。

【００１０】別の態様において、アグルコンイソフラボンに富む物質をイソフラボンに富む物質のケーキから形成する。 イソフラボンに富む物質の水性のスラリーを形成する。 スラリーを温度約２℃〜約１２０℃かつｐＨ約６〜約１３．５で、イソフラボンに富む物質中のイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換するのに充分な時間処理する。 １，４−グルコシド結合を開裂することができる酵素とスラリー中のイソフラボングルコシドとを、温度約５℃〜約７５℃かつｐＨ約３〜約９
で、イソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換するのに充分な時間接触させる。 アグルコンイソフラボンに富む物質のケーキをスラリーから分離してもよい。 別の面において、本発明は、イソフラボングルコシドに富む物質及びそれをダイズモラセスから回収する方法である。 ダイズモラセスを、約２℃〜約１２０℃かつｐＨ約６〜約１３．５の間の値で、ダイズモラセスに含まれるイソフラボン共役物イソフラボングルコシドに転換するのに充分な時間処理する。 イソフラボングルコシドに富む物質のケーキを、ダイズモラセス材料から、
イソフラボングルコシドの大部分がケーキ中に含まれることを引き起こすのに充分なｐＨかつ温度で分離する。

【００１１】別の面において、本発明は、アグルコンイソフラボンに富む物質及びそれをダイズモラセスから回収する方法である。 ダイズモラセスを温度約２℃〜約１
２０℃かつｐＨ約６〜約１３．５の間の値で、ダイズモラセスに含まれるイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換するのに充分な時間処理する。 １，４−
グルコシド結合を開裂することができる酵素とダイズモラセス材料中のイソフラボングルコシドとを、温度約５
℃〜約７５℃かつｐＨ約３〜約９で、イソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換するのに充分な時間接触させる。 アグルコンイソフラボンに富む物質のケーキを、ダイズモラセスから、アグルコンイソフラボンの大部分がケーキ中に含まれることを引き起こすのに充分なｐＨかつ温度で分離する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本明細書に記載する方法の出発材料物はダイズモラセスである。 ダイズモラセスは、ダイズ又はダイズ派生物を含む多くの商業的な方法、例えばタンパク質抽出物、タンパク質乳清（protein whey）及びタンパク質濃縮産物の製造方法等の副産物である。 したがって、ダイズモラセスは、それがかなり安価な物品になる程大量に生成する。 一般的にダイズモラセスは、
アルコール又は酸を用いた洗浄によりダイズの不溶物から取り除かれたダイズの可溶物であると考えられている。 ダイズモラセスは、典型的には、約６％（ダイズモラセスの総重量を基準とする）のタンパク質、約３％の灰分、約５％の脂肪及び約３６％の炭水化物からなる約５０％以上の固形分を含む水性の混合物である。 ダイズモラセスは当該技術分野においてダイズ可溶物としても知られている。 本明細書において使用される「ダイズモラセス材料」という用語は、ダイズモラセス及び／又はダイズモラセスの派生物、例えばイソフラボングルコシドに富むダイズモラセス材料及びアグルコンイソフラボンに富むダイズモラセス材料等を含む組成物のことをいう。 したがって、これらの用語は本明細書において交換して用いられる。

【００１３】好ましい態様においては、出発材料であるダイズモラセスは、通常の方法による溶媒抽出により油を取り除いた脱脂ダイズ薄片から生成する。 脱脂ダイズ薄片を、酸性ｐＨ、好ましくはｐＨ約４〜約５に調節した水を用いて抽出する。 ｐＨの調節は１種以上の適当な酸、例えば酢酸、硫酸、リン酸、塩酸等又はその他の適当なあらゆる試薬の添加により行う。 好ましくは、ダイズ薄片に対する酸性抽出溶媒の割合は、重量比で約１
６：１〜約２０：１である。 抽出の効率を高めるために、抽出溶媒の温度を室温より高い温度、好ましくは約３２℃〜約５５℃の間の温度に上昇させてもよい。 抽出後、ダイズモラセス抽出物をダイズ不溶物から取り除く。 別の態様においては、脱脂ダイズ薄片を水性アルコールを用いて抽出し、出発材料であるダイズモラセスを生成する。 好ましくは、薄片を、約８０％の水性エタノールを、ダイズ薄片に対する抽出溶媒の割合が重量比で約１６：１〜２０：１の割合で用いて抽出する。 アルコール抽出溶媒の温度を室温より高い温度、好ましくは約３２℃〜約５５℃の間の温度に上昇させ、抽出の効率を改善してもよい。 次いでダイズモラセス抽出物をダイズ不溶物から取り除き、ダイズモラセスである出発材料を提供する。

【００１４】イソフラボンに富む物質を、出発材料であるダイズモラセスから回収してもよい。 ダイズモラセス材料を、水を用いて、固形分約６％〜約１３％、特に好ましくは１３％に希釈してもよい。 ダイズモラセス材料の希釈は本発明の方法に要求されるものではないが、比較的厚いダイズモラセス材料を希釈することは、材料の加工を促進する。 ダイズモラセス材料、好ましくは希釈した材料を、分離手順を行うときにイソフラボンの大部分がダイズモラセスから分離するｐＨかつ温度で処理する。 好ましい態様においては、ダイズモラセス材料を、
ｐＨ約３．０〜約６．５かつ温度約０℃〜約３５℃で処理し、ダイズモラセス中のイソフラボンの不溶性を最大化する。 イソフラボンを、ダイズモラセスから、好ましいｐＨ範囲外のｐＨかつ温度３５℃より高い温度で分離してもよいが、これらの条件は、分離手順において、ダイズモラセスから少量のイソフラボンしか分離しないので好ましくない。 必要ならば、ダイズモラセスのｐＨ
を、適当な通常の酸性又は塩基性の試薬を用いて調節してもよい。 ダイズモラセスのｐＨは約４．５に調節することが特に好ましい。 ダイズモラセスを温度約０℃〜約１０℃に冷却（chill or cool ）することも好ましい。
特に好ましくは温度約４℃〜約７℃に冷却する。

【００１５】次いで、ダイズモラセス材料を分離手順に付し、イソフラボンに富む物質のケーキをダイズモラセス材料から分離する。 分離は、ダイズモラセス材料が前記のｐＨ及び温度条件に維持されている間に行う。 １つの態様においては、イソフラボンに富む物質のケーキを、ダイズモラセスを遠心分離し、次いでケーキから上清をデカントすることにより分離する。 遠心分離は好ましくは約３，０００〜約１０，０００ｒｐｍで、約３０
分間、温度約０℃〜約１０℃で行う。 別の態様においては、イソフラボンに富むケーキを、ダイズモラセス材料から、ろ過により分離してもよい。 好ましくは、ろ過は前記のｐＨ及び温度条件で行い、特に好ましくはｐＨ約４．５かつ温度約０℃〜約１０℃で行う。

【００１６】本発明の別の面においては、イソフラボングルコシドに富む物質のケーキをダイズモラセスから回収してもよい。 出発材料であるダイズモラセスを前記の方法に従い得る。 要求はされないけれども、ダイズモラセス材料を、好ましくは固形分含量約６％〜約１３％、
特に好ましくは約１３％に希釈して、材料の加工を促進する。 次いで転換操作をダイズモラセスに対して行い、
ダイズモラセス中のイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換する。 ダイズモラセス中のイソフラボンの実質的な部分はイソフラボン共役物であり、それゆえ、転換はダイズモラセス材料中のイソフラボングルコシドの量を実質的に増加させる。 転換はダイズモラセスのｐＨ及び温度に依存していることが見出された。

【００１７】ダイズモラセス中におけるイソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換のためのｐＨ範囲は、約６〜約１３．５である。 必要ならば、ダイズモラセスのｐＨを所望のｐＨに調節すべきである。 もしｐ
Ｈが上昇させるならば、適当な塩基、苛性アルカリ剤又は塩基性試薬を用いて調節し、ｐＨが低下させるならば、適当な酸又は酸性試薬を用いて調節する。 イソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換は、塩基により触媒されることが見出されている。 したがって、
高いｐＨを利用して迅速な転換を達成することが特に好ましい。 イソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換するための特に好ましいｐＨは、ｐＨ約９〜約１
１である。 ダイズモラセス中におけるイソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換のための温度範囲は、約２℃〜約１２０℃である。 転換を迅速に起こす温度範囲は、ダイズモラセス材料のｐＨに依存している。
本発明者らは、ｐＨが比較的高いとき、低温下でも転換が容易に起こることを見出した。 例えばｐＨ約１１では、約５℃〜約５０℃の温度範囲で、急速かつ効率的に転換が起こる。 ｐＨ約９では、約４５℃〜約７５℃の温度範囲で、効率的に転換が起こる。 ダイズモラセスのｐ
Ｈが比較的低いとき、転換は高い温度下で起こる。 例えば、ｐＨ約６では、約８０℃〜約１２０℃の温度範囲で転換が起こる。 好ましい態様においては、転換は約３５
℃かつｐＨ約１１で行われる。 別の好ましい態様においては、転換は約７３℃かつｐＨ約９で行われる。

【００１８】イソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換に必要な時間は、主にダイズモラセスにおいて用いられるｐＨ及び温度範囲に依存する。 典型的には転換時間は約１５分間〜数時間又はそれ以上の範囲にある。 ｐＨ約９では、転換は７３℃で約４時間〜約６時間で実質的に完了する。 特に好ましい態様においては、
イソフラボン共役物は、ｐＨ約１１かつ温度約３５℃
で、約３０分間〜約１時間、好ましくは約４５分間で、
イソフラボングルコシドに転換する。 イソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換は、著しく効率的であり、少なくとも大部分、好ましくは存在する実質的に全てのイソフラボン共役物がイソフラボングルコシドに転換する。 「大部分」という用語は少なくとも約５０
％の転換の程度を意味する。 「実質的に全て」という用語は、少なくとも約８０％の転換の程度、特に好ましくは少なくとも約９０％の転換の程度を意味する。 イソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換に続いて、イソフラボングルコシドに富む物質のケーキをダイズモラセス材料から分離してもよい。 ダイズモラセス材料を、分離手順においてイソフラボングルコシドの大部分がダイズモラセスから分離するｐＨ及び温度で処理する。 好ましい態様においては、ダイズモラセス材料を、ｐＨ約３〜約６．５、特に好ましくはｐＨ約４．
５、かつ温度約０℃〜約３５℃、好ましくは約０℃〜約１０℃、特に好ましくは温度約４℃〜約７℃に、分離過程の間維持する。 必要ならば、ダイズモラセス材料のｐ
Ｈを、適当な通常の酸性又は塩基性試薬を用いて調節してもよい。

【００１９】分離は、液体から固体を分離するための通常の手段により行う。 イソフラボンに富むケーキのダイズモラセス材料からの分離に関する前記記載と同様に、
イソフラボングルコシドに富むケーキを、好ましくは遠心分離又はろ過により分離する。 更に本発明の別の面において、アグルコンイソフラボンに富む物質をダイズモラセスから回収してもよい。 出発材料であるダイズモラセスを、前記と同様の方法により、好ましくは水を用いて固形分約６％〜約１３％に希釈したものを得る。 前記したように、出発材料であるダイズモラセスを処理し、
イソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換する。 次いで、適当な酵素とダイズモラセス中のイソフラボングルコシドとを、適当なｐＨかつ温度下で接触させることにより、酵素的転換操作をイソフラボングルコシドに富むダイズモラセスに対して行い、イソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換する。 ２段階の転換過程は、ダイズモラセス材料中の実質的に全てのイソフラボン共役物及びイソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに効率的に転換し、ダイズモラセス中のアグルコンイソフラボンの量を実質的に増加させる。

【００２０】イソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの転換は、ダイズモラセス材料中に存在する酵素の種類、酵素濃度の分布、酵素の活性並びに転換の間のダイズモラセス材料のｐＨ及び温度を含む種々の因子に依存することが見出された。 転換を行うために必要な酵素は、イソフラボングルコシドのイソフラボン部分とグルコース部分との間のグルコシド結合（glucosidic
linkage）を開裂することができる酵素である。 好ましい態様においては、酵素はサッカライダーゼ（sacchari
dase）又は１，４−グルコシド結合を開裂することができるグルコ−アミラーゼ酵素（gluco-amylase enzyme）
である。 酵素はダイズモラセス中に固有に存在していているものでよく、ダイズモラセス材料への添加する商業的に入手できるものであってもよい。 固有に存在する酵素については、本明細書において「残留性」酵素と呼び、ダイズモラセスに添加する酵素については、本明細書において「追加の」酵素と呼ぶ。

【００２１】充分な酵素をダイズモラセス材料中に存在させ、イソフラボングルコシドの少なくとも大部分、好ましくは実質的に全てのイソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換すべきである。 一般的に、ダイズモラセス材料中の残留性酵素が転換を起こすには不十分であるときには、追加の酵素をダイズモラセス材料に添加すべきである。 好ましい態様においては、追加の酵素の添加はグルコシドのアグルコンへの転換を実質的に完了させるのに必要な時間を劇的に減少させるので、
充分な残留性酵素がダイズモラセス中に存在するかどうかに関わらず、追加の酵素をダイズモラセス材料に添加する。 もし追加の酵素を添加する場合には、存在する酵素の総濃度が、乾燥重量基準で、ダイズモラセス材料中に固形分の約０．１重量％〜約１０重量％になるように追加の酵素を添加する。

【００２２】追加の酵素は、選択したｐＨ及び温度条件並びに費用的な有効性を基礎として選択する。 追加の酵素は、イソフラボングルコシドのイソフラボン部分とグルコース分子との間の結合を開裂することができる酵素、例えばサッカライダーゼ及び１，４−グルコシド結合を開裂することができるグルコ−アミラーゼ等である。 好ましい追加の酵素は、商業的に入手できるα−及びβ−グルコシダーゼ酵素、β−ガラクトシダーゼ酵素、グルコ−アミラーゼ酵素及びペクチナーゼ酵素である。 特に好ましい酵素は、例えばBiopectinase 100L
（ｐＨ約３〜約６の範囲で好ましく用いられる）、Biop
ectinase 300L （最適ｐＨ範囲約３〜約６）、Biopecti
nase OK 70L(最適ｐＨ範囲約３〜約６) 、Biolactase 3
0,000 （最適ｐＨ範囲約３〜約６）、Nwutral Lactase
(最適ｐＨ範囲約６〜約８) （これらの全ての酵素は、Q
uest International,1833 57th Street,Post Office Bo
x 3917,Sarasota、Florida 34243 から入手できる）である。 又、特に好ましいのは、Lactase F （最適ｐＨ範囲約４〜約６）、Lactase 50,000（最適ｐＨ範囲約４〜
約６）（両者とも、Amano International Enzyme Co.,I
nc.,Post Office Box 1000,Troy,Virginia 22974から入手できる）である。 その他の特に好ましい追加の酵素は、G-Zyme G990 （最適ｐＨ範囲約４〜約６）、Enzeco
Fungal Lactase Concentrate （最適ｐＨ範囲約４〜約６）（Enzyme Development Corporation,2 Penn Plaza,
Suite 2439,New York,New York 10121から入手できる）、Lactozyme 3000L（ｐＨ約６〜約８の範囲で好ましく用いられる）、Alpha-Gal 600L（ｐＨ約４〜約６．
５の範囲で好ましく用いられる）（Novo Nordisk Bioin
dustrials,Inc.,33 Turner Road,Danbury,Connecticut
06813 から入手できる）、Maxilact L2000（ｐＨ約４〜
約６の範囲で好ましく用いられる）（Gist Brocades Fo
od Ingredients,Inc.,King of Prussia,Pennsylvania,1
9406から入手できる）、Neutral Lactase （ｐＨ約６〜
約８の範囲で好ましく用いられる）（Pfizer Food Scie
nceGroup,205 East 42nd Street,New York,New York 10
017から入手できる）を含む。 イソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換するためのｐＨ範囲は約３〜約９である。 用いるｐＨは主に用いる酵素の種類に依存し、したがって選択しなければならない。 ダイズモラセス材料のｐＨは転換過程の間低下すると信じられているけれども、ｐＨ約７〜約９の範囲内においては残留性酵素は活性である。 追加の酵素は、幾つかの特定の酵素に付いて前記に示したように、酵素の製造者により特定された最適ｐＨ範囲内では活性である。 典型的に、
追加の酵素は、ｐＨ約６〜約８の中性ｐＨ範囲又はｐＨ
約３〜約６の酸性ｐＨ範囲のいずれかにおいて活性である。

【００２３】ダイズモラセス材料のｐＨを、イソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの転換を行うための所望の値に調節してもよい。 ほとんどの例において、ｐＨは、１種以上の適当な酸、例えば酢酸、硫酸、
リン酸、塩酸又はあらゆるその他の適当な試薬等の添加により、イソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換するために必要な比較的高い又は塩基性ｐＨから低下させる。 グルコシドをアグルコンに転換するためのダイズモラセス材料の温度範囲は、約５℃〜約７５℃である。 温度は酵素の活性、したがって転換速度にかなり影響する。 追加の酵素は７０℃よりも高い温度で活性であってもよく、例えばAlpha-Gal 600Lは７５℃で活性であるが、低い温度で転換を行い酵素の非活性化を防ぐことが好ましい。 好ましい態様においては、転換を約３５
℃〜約４５℃の間で行う。

【００２４】グルコシドをアグルコンに転換するために必要な時間は、酵素に関係した因子、特に濃度並びに系の温度及びｐＨに依存する。 ほとんどの例において、２
４時間以内に実質的に完全な転換を達成することが可能であるが、追加の酵素を添加して反応速度を劇的に増加させることが好ましい。 選択した追加の酵素、酵素濃度、ｐＨ及び温度により、好ましくは約２時間、特に好ましくは約１時間以内に実質的に転換は完了する。 イソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの転換は著しく効率的であり、存在するグルコシドの少なくとも大部分、好ましくは実質的に全てがアグルコンに転換する。 「大部分」という用語は少なくとも約５０％の転換の程度を意味する。 「実質的に全て」という用語は少なくとも約８０％、特に好ましくは少なくとも約９０％
の転換の程度を意味する。

【００２５】イソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの転換に続いて、アグルコンイソフラボンに富む物質のケーキを、ダイズモラセス材料から分離してもよい。 ダイズモラセス材料を、分離手順においてアグルコンイソフラボンの大部分をダイズモラセス材料から分離するｐＨかつ温度で処理する。 好ましくは、ダイズモラセス材料を、分離過程の間、ｐＨ約３〜約６．５、
特に好ましくは約４．５かつ温度約０℃〜約３５℃、好ましくは約０℃〜約１０℃、特に好ましくは約４℃〜約７℃に維持する。 必要ならば、ダイズモラセス材料のｐ
Ｈを適当な通常の酸性又は塩基性試薬を用いて調節してもよい。 分離は、液体から固体を分離するための通常の手段により行う。 イソフラボンに富むケーキのダイズモラセス材料からの分離に関する前記記載と同様に、アグルコンイソフラボンに富むケーキを、好ましくは遠心分離又はろ過により分離する。

【００２６】アグルコンイソフラボンに富む物質を、ダイズモラセスから回収したイソフラボンに富む物質から生成してもよい。 この場合のイソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの回収方法は前記したとおりである。 水を、回収したイソフラボンに富む物質のケーキに添加し、イソフラボンに富む物質のスラリーを形成する。 高い固形分を用いてもよいけれども、好ましくは、
スラリーを固体分が約６％〜約１３％になるよう希釈する。 次いで、ダイズモラセス中におけるイソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換に関する前記の記載と同一の条件下でスラリーを処理し、スラリー中のイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換する。 特には、スラリーを、ｐＨ約６〜約１３．５、好ましくはｐＨ約９〜約１１かつ温度約２℃〜１２０℃で、
約１５分間〜数時間処理する。 特に好ましくは、スラリーを、ｐＨ約１１かつ温度約５℃〜約５０℃、好ましくは約３５℃で、約３０分間〜約１時間、又はｐＨ約９かつ温度約４５℃〜７５℃、好ましくは約７３℃で、約４
時間〜約６時間処理する。 所望により、前記したイソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの分離と同様の方法で、イソフラボングルコシドに富む物質をスラリーから分離してもよい。

【００２７】次いで、ダイズモラセス中におけるイソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの転換に関する前記の記載と同一の条件下で、スラリー中のイソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換する。 特には、スラリー中のイソフラボングルコシドとイソフラボングルコシドのイソフラボン部分とグルコース分子との間のグルコシド結合を開裂することができる酵素とを、適当なｐＨ及び温度条件下、イソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換するのに充分な時間接触させる。 好ましい酵素、ｐＨ条件、温度及び時間は前記したとおりである。 前記のイソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの分離と同様の手段によって、アグルコンイソフラボンに富む物質をスラリーから分離してもよい。

【００２８】アグルコンイソフラボンに富む物質を、ダイズモラセス材料から回収したイソフラボングルコシドに富む物質から生成してもよい。 この場合、イソフラボングルコシドに富む物質のダイズモラセス材料からの回収方法は前記したとおりである。 水を、回収したイソフラボングルコシドに富む物質のケーキに添加し、イソフラボングルコシドに富む物質のスラリーを形成する。 高い固形分を使用してもよいけれども、好ましくは、スラリーを約６％〜約１３％の固体分になるよう希釈する。
イソフラボンに富むスラリーから形成したイソフラボングルコシドに富むスラリーに関する前記記載と同様の手段により、スラリー中のイソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換する。 転換後、アグルコンイソフラボンに富む物質を、スラリーから、前記のイソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの分離に類似した手段で分離してもよい。

【００２９】

【実施例】本発明を以下に示す実施例により、より詳細に説明する。 実施例は説明を意図したものであって、ともかく本発明の範囲を制限するものでもなく、限定するものでもないものとして解釈されるべきである。 前記したように、ダイズモラセスを含むダイズ材料は、対応するグルコシド、共役物及びアグルコンメンバーを有するイソフラボンのゲニステイン「ファミリー」、ダイゼイン「ファミリー」及びグリシテイン「ファミリー」を含む。 ゲニステインファミリーは、共役物６”−ＯＭａｌ
ゲニスチン、６”−ＯＡｃゲニスチン、グルコシドゲニスチン及びアグルコンゲニスチンを含む。ダイゼインファミリーは、共役物６”−ＯＭａｌダイジン、６”−Ｏ
Ａｃダイジン、グルコシドダイジン及びアグルコンダイジンを含む。 グリシテインファミリーは、共役物６”−
ＯＭａｌグリシチン、グルコシドグリシチン及びアグルコングリシチンを含む。 以下に示す実施例においては、
イソフラボンの相対的な濃度を、イソフラボンファミリーの総濃度として又はイソフラボンファミリーにおける各イソフラボンの個々の百分率として測定した。 例えば、イソフラボンのゲニステインファミリーの総濃度は、６”−ＯＭａｌゲニスチン、６”−ＯＡｃゲニスチン、ゲニスチン及びゲニステイン濃度の和であり、ゲニステインファミリーにおける個々のイソフラボンの百分率は、その他のゲニステインファミリーのイソフラボンに対して相対的に決定した。 すなわち、ゲニスチン（％）＋６”ＯＭａｌゲニスチン（％）＋６”ＯＡｃゲニスチン（％）＋ゲニステイン（％）＝１００％である。 実施例１ 第一の実験においては、イソフラボンに富む物質のダイズモラセスからの回収について、種々のダイズモラセス濃度で試験した。 各イソフラボンファミリーの総濃度を、選択した濃度を有するダイズモラセスサンプル、本発明の方法に従いダイズモラセスサンプルから分離したケーキ及び分離手順によりケーキを取り除いた液状の乳清において測定した。

【００３０】ダイズモラセスを、存在する全ての形態のイソフラボンの総濃度について分析した。 ダイズモラセスのサンプルを、水を用いて、固形分２８％（１：２希釈）、固形分１３．７％（１：４希釈）及び固形分６．
６％（１：８希釈）に希釈した。 全てのサンプルをｐＨ
４．５に調節した。 次いで、処理したサンプルを３００
０ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより分離し、サンプルから液状の乳清及びケーキ部分を生成した。 １組のサンプルを温度０．６℃で遠心分離した。 ２８％及び１３．７％のダイズモラセス固形分を有するサンプルを温度６０℃で遠心分離し、０．６℃で分離した同一濃度のダイズモラセス固形分を有するサンプルと比較した。
得られたサンプルの液状及びケーキ部分を、存在する全ての形態のイソフラボンの総濃度について分析した。

【００３１】表１は、前記の試験より得た種々のケーキ及び液状画分中のイソフラボン濃度を示している。 示した総量は、ケーキ又は液状画分の固形物１ｇ当たりの、
特定のイソフラボンの共役物、グルコシド及びアグリコン形態を含む全ての形態の総量である。

【００３２】

【表１】 表１サンプル 総ゲニステイン 総ダイゼイン 総グリシテイン （ファミリー） （ファミリー） （ファミリー） ｍｇ／ｇ ｍｇ／ｇ ｍｇ／ｇ出発材料としてのダイズモラセス 未分離 ６．１ ４．８ １．０ １：２希釈 （２８％固形分） ２．８ ３．０ ０．６ ０．６℃で分離した乳清 １：２希釈 ０．６℃で分離 １６．９ １０．９ １．９ したケーキ １：２希釈 ６０℃で分離 ３．８ ４．０ ０．８ した乳清 １：２希釈 ６０℃で分離 １４．１ ８．２ １．５ したケーキ １：４希釈 （１３ ．７％固形分） ３．０ ３．４ ０．７ ０．６℃で分離した乳清 １：４希釈 ０．６℃で分離 １８．３ １１．０ ２．０ したケーキ １：４希釈 ６０℃で分離 ４．４ ４．３ ０．８ した乳清 １：４希釈 ６０℃で分離 １３．４ ７．２ １．５ したケーキ １：８希釈 （６． ６％固形分） ４．３ ４．５ ０．９ ０．６℃で分離した乳清 １：８希釈 ０．６℃で分離 ２０．１ １０．２ ２．１ したケーキ分離した全てのサンプルにおいて、ケーキ中のイソフラボン濃度は、出発材料であるダイズモラセス中の濃度よりも著しく高く、液状の乳清画分の固形物中のイソフラボン濃度よりも非常に高かった。 ０．６℃で分離したサンプルは、乳清画分の固形物中に高いイソフラボン濃度を有する、対応する６０℃で分離したサンプルよりも、
ケーキ中に高いイソフラボン濃度を含んでいた。

【００３３】実施例２ 別の態様においては、イソフラボングルコシドに富む物質のダイズモラセスからの回収について試験した。 ダイズモラセス中のイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換し、イソフラボングルコシドに富むケーキをダイズモラセス材料から分離した。 転換の程度を、対応する同一のイソフラボンファミリーのグルコシドの百分率の量的な増加と連関する、イソフラボンファミリーのマロン酸エステル及び酢酸エステルの百分率及び濃度の量的な減少により測定した。 出発材料であるダイズモラセスを、個々のイソフラボン化合物の濃度について分析した。 ダイズモラセスを、水を用いて、以下に示す割合、１：４（モラセス１００ｇ＋水３００ｇ）、１：８
（モラセス５０ｇ＋水３５０ｇ）に希釈することにより、ダイズモラセス材料の２つのサンプルを作成した。
サンプルのｐＨを１１に調節し、サンプルの温度を３５
℃で３０分間保った。 次いで、サンプルのｐＨを４．５
に調節し、温度を４℃に調節した。 サンプルを４℃下、
１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、モラセスサンプルをケーキ又は液状の乳清に分離した。 乳清及びケーキを、
個々のイソフラボン化合物について分析した。 表２Ａ〜
Ｃは、出発材料であるダイズモラセスと比較した、イソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換により得られたイソフラボンの種々の形態間の割合の変化を説明している。 イソフラボン濃度を、サンプル内の百万分率（ｐｐｍ）として及び液状又はケーキ部分内の特定のイソフラボンの総量（共役物、グルコシド及びアグルコン形態の総量）の百分率として示す。

【００３４】

【表２】 表２Ａサン ゲニスチ ６”− ６”− ゲニステ プル チン ＯＭＡＬ ＯＡＣ− イン −ゲニス ゲニスチチン ンダイズ モラセス ４６７８ １３２９ ０ ８８ （ｐｐｍ） イソフラ ７７ ２２ ０ １ ボン（％） １：４ 希釈乳清 ２２２１ １７ ０ ３０ （ｐｐｍ） イソフラ ９８ １ ０ １ ボン（％） １：４ 希釈ケーキ ２８６２１ ６８ ０ ２６１ （ｐｐｍ） イソフラ ９９ ０ ０ １ ボン（％） １：８ 希釈乳清 ２８５２ ２４ ０ ３６ （ｐｐｍ） イソフラ ９８ １ ０ １ ボン（％） １：８ 希釈ケーキ ２７５１７ １０１ ０ ２７２ （ｐｐｍ） イソフラ ９９ ０ ０ １ ボン（％）

【００３５】

【表３】 表２Ｂサン ダイジン ６”−ＯＭ ６”−ＯＡ ダイゼイン プル ＡＬ−ダイ Ｃ−ダイジジン ンダイズ モラセス ３５３３ ９２８ ２１０ ８４ （ｐｐｍ） イソフラ ７４ ２０ ４ ２ ボン（％） １：４ 希釈乳清 ２６５２ １７９ ２９ ２１ （ｐｐｍ） イソフラ ９２ ６ １ １ ボン（％） １：４ 希釈ケーキ １６１３３ １９２ ０ ２３２ （ｐｐｍ） イソフラ ９７ １ ０ １ ボン（％） １：８ 希釈乳清 ３３５６ １８７ ０ ２７ （ｐｐｍ） イソフラ ９４ ５ ０ １ ボン（％） １：８ 希釈ケーキ １２６１７ １３８ ０ ２４５ （ｐｐｍ） イソフラ ９７ １ ０ ２ ボン（％）

【００３６】

【表４】

イソフラボン共役物のイソフラボングルコシドへの転換のための条件に付した全てのサンプルにおいて、ケーキ及び液状部分の両者におけるイソフラボングルコシドの百分率は、対応する転換していないダイズモラセスサンプルにおける百分率よりも著しく高く、サンプルにおける対応するイソフラボン共役物の百分率は著しく低かった。 これは、イソフラボン共役物の大部分がグルコシド形態に転換したことを証明している。 更に、出発材料であるダイズモラセス並びに各サンプルの乳清及びケーキ部分の相対濃度から理解できるように、分離時において、グルコシドイソフラボンの大部分がケーキ中に分離され、イソフラボングルコシドに富む物質を形成した。

【００３７】実施例３ 別の態様においては、ダイズモラセス中のイソフラボンのアグルコンイソフラボンへの転換を試験した。 ダイズモラセス中のイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換し、次いでイソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換した。 イソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの転換の程度を、対応する同一のイソフラボンファミリーのアグルコンの百分率の量的な増加と連関する、イソフラボンファミリーのグルコシド濃度の量的な減少により測定した。 出発材料であるダイズモラセスを、水を用いて、１：４に希釈し、個々のイソフラボン化合物の濃度について分析した。 モラセスのｐＨを１１に調節した。 ダイズモラセスを室温下で１時間保ち、グルコシドに富むダイズモラセス材料を生成した。 グルコシドに富むダイズモラセス材料を個々のイソフラボン化合物の濃度について分析した。 材料のｐＨを４．５に調節した後、グルコシドに富むダイズモラセス材料から、４つのサンプルを調製した。 各サンプルに、以下に示す酵素をそれぞれ各サンプルのモラセスの固体分の１０重量％添加することにより、接種した。
G-Zyme 990、Biopectinase 100L 、Lactase 50,000及び
Alpha-Gal 600L。 次いで、サンプルを５０℃で６時間処理し、アグルコンイソフラボンに富むダイズモラセス材料を形成した。 アグルコンイソフラボンに富むダイズモラセスをイソフラボン含量について分析した。

【００３８】表３Ａ〜Ｃは、前記の試験より得られたイソフラボンの種々の形態間の分布を説明している。 イソフラボン濃度を、サンプル内の百万分率（ｐｐｍ）として及び特定のイソフラボンの総量（共役物、グルコシド及びアグルコン形態）の百分率として示す。

【００３９】

【表５】 表３Ａゲニスチン ６”−ＯＭ ６”−ＯＡ ゲニステイン ＡＬ−ゲニ Ｃ−ゲニスチン スチン ダイズモラセス （ｐｐｍ） ４６７８ １３２９ ０ ８８ イソフラボン（％）７７ ２２ ０ １ グルコシドに富む ダイズモラセス ６７６３ ０ ０ １０４ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）９８ ０ ０ ２ Ｇ−Ｚｙｍｅ ９９０，１０％ （ｐｐｍ） ３９０３ ０ ０ １９９３ イソフラボン（％）６６ ０ ０ ４４ Ｂｉｏｐｅｃｔｉ ｎａｓｅ １００ Ｌ，１０％ （ｐｐｍ） ２８６５ ０ ０ ２９１９ イソフラボン（％）５０ ０ ０ ５０ Ｌａｃｔａｓｅ ５０，０００ １０％ （ｐｐｍ） ０ ０ ０ ４６０１ イソフラボン（％）０ ０ ０ １００ Ａｌｐｈａ−Ｇａｌ ６００Ｌ，１０％ （ｐｐｍ） ２８ ０ ０ ４５６６ イソフラボン（％）１ ０ ０ ９９

【００４０】

【表６】 表３Ｂダイジン ６”−ＯＭ ６”−ＯＡ ダイゼイン ＡＬ−ダイ Ｃ−ダイジジン ン ダイズモラセス （ｐｐｍ） ３５３３ ９２８ ２１０ ８４ イソフラボン（％）７４ ２０ ４ ２ グルコシドに富む ダイズモラセス ４３７７ ０ ０ ４３ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）９９ ０ ０ １ Ｇ−Ｚｙｍｅ ９９０，１０％ ８４０ ０ ８２ ２３３１ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）２７ ０ ２ ７１ Ｂｉｏｐｅｃｔｉ ｎａｓｅ １００ Ｌ，１０％ （ｐｐｍ） ５４１ ０ ９４ ２７０１ イソフラボン（％）１６ ３ ８１ Ｌａｃｔａｓｅ ５０，０００ １０％ （ｐｐｍ） ０ ０ ９２ ２８７５ イソフラボン（％）０ ０ ３ ９７ Ａｌｐｈａ−Ｇａｌ ６００Ｌ，１０％ （ｐｐｍ） ０ ０ ８９ ２８２２ イソフラボン（％）０ ０ ３ ９７

【００４１】

【表７】 表３Ｃグリシチン ６”−ＯＭ グリシテイン ＡＬ−グリシチン ダイズモラセス （ｐｐｍ） ５００ １０５ ３６０ イソフラボン（％）５２ １１ ３７ グルコシドに富む ダイズモラセス ４３３ ０ ０ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）１００ ０ ０ Ｇ−Ｚｙｍｅ ９９０，１０％ ３４６ ０ １１４ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）７５ ０ ２５ Ｂｉｏｐｅｃｔｉ ｎａｓｅ １００ Ｌ，１０％ １９５ ０ ２３７ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）４５ ０ ５５ Ｌａｃｔａｓｅ ５０，０００ ０ ０ ３６６ １０％ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）０ ０ １００ Ａｌｐｈａ−Ｇａｌ ６００Ｌ，１０％ ０ ０ ３５６ （ｐｐｍ） イソフラボン（％）０ ０ １００酵素的に処理したサンプルのアグルコンイソフラボン含量は、ダイズモラセス及びグルコシドに富むダイズモラセス材料よりも著しく高かった。これは、酵素的処理がグルコシドイソフラボンの実質的な量をアグルコンイソフラボンに転換したことを示している。Lactase 50,000
及びAlpha-Gal 600Lサンプルにおけるイソフラボン分布により証明されるように、転換のための適当な酵素、酵素濃度、ｐＨ及び温度の選択は、実質的に全てのイソフラボングルコシドのアグルコンイソフラボンへの転換を可能にする。

【００４２】実施例４ 最終の実験において、イソフラボンに富む物質及びイソフラボングルコシドに富む物質及びアグルコンイソフラボンに富む物質のイソフラボン含量を試験し、物質中のイソフラボンの分布を比較した。 ダイズモラセスを、水を用いて、１：４の割合で希釈した。 希釈したダイズモラセスのサンプルをｐＨ４．５に調節し、氷浴中０．６
℃で３０分間冷却し、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、イソフラボンに富む物質のケーキを分離した。 次いで、残りの希釈したダイズモラセスを、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１１に調節し、５０℃で１時間処理し、モラセス中のイソフラボン共役物をイソフラボングルコシドに転換した。 グルコシドに富むモラセスのサンプルをｐＨ４．５に調節し、氷浴中０．６℃で３０分間冷却し、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、イソフラボングルコシドに富む物質のケーキを分離した。 残りのイソフラボングルコシドに富むダイズモラセス材料をｐＨ４．５に調節し、酵素G-Zyme 990を、２．６ｇ（酵素／モラセス材料１００ｇ）の濃度で材料に添加した。
次いで、酵素及びイソフラボングルコシドに富むダイズモラセス材料を５０℃で１８〜２０時間処理し、イソフラボングルコシドをアグルコンイソフラボンに転換した。 アグルコンイソフラボンに富むダイズモラセス材料のサンプルを、氷浴中、温度０．６℃で３０分間冷却し、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、アグルコンイソフラボンに富む物質のケーキを分離した。 次いで、
イソフラボンに富む物質、イソフラボングルコシドに富む物質及びアグルコンイソフラボンに富む物質の回収したケーキをイソフラボン含量について分析した。

【００４３】以下に示す表４Ａ〜Ｃは、イソフラボンに富む物質、イソフラボングルコシドに富む物質及びアグルコンイソフラボンに富む物質のケーキ中のイソフラボンの分布を示している。 イソフラボンの分布を、特定のイソフラボンの総量（共役物、グルコシド及びアグルコン形態の総量）の百分率として示す。

【００４４】

【表８】 表４Ａゲニスチ ６”−ＯＭ ６”−ＯＡ ゲニステイン ン ＡＬ−ゲニ Ｃ−ゲニススチン チン イソフラボンに 富む物質 イソフラボン（％）８３ １６ ０ １ グルコシドに富む 物質 イソフラボン（％）９９ ０ ０ １ アグルコンに富む 物質 イソフラボン（％）３ ０ ０ ９７

【００４５】

【表９】 表４Ｂダイジン ６”−ＯＭ ６”−ＯＡ ダイゼイン ＡＬ−ダイ Ｃ−ダイジジン ン イソフラボンに 富む物質 イソフラボン（％）８１ １２ ５ １ グルコシドに富む 物質 イソフラボン（％）９９ ０ ０ １ アグルコンに富む 物質 イソフラボン（％）０ ０ ０ １００

【００４６】

【表１０】 表４Ｃグリシチ ６”−ＯＭ グリシテイン ン ＡＬ−グリシチン イソフラボンに 富む物質 イソフラボン（％）４０ ８ ５２ グルコシドに富む 物質 イソフラボン（％）９５ ０ ５ アグルコンに富む 物質 イソフラボン（％）５４ １８ ２８転換ステップの有効性を、材料中のイソフラボン分布により見ることができる。イソフラボングルコシドに富む物質は、イソフラボンに富む物質及びアグルコンイソフラボン材料よりもかなり高い量のイソフラボングルコシドを含み、ほぼ全体のイソフラボングルコシドからなるイソフラボン含量を有していた。

【００４７】前記の実施例において、６”−ＯＭａｌ−
ゲニスチン、６”−ＯＡｃ−ゲニスチン、６”−ＯＭａ
ｌ−ダイジン、グリシチン、６”−ＯＭａｌ−グリシチン及びグリシテインについて示した全ての百分率は計算値である。以下に示すのは、ダイズ生成物中のイソフラボンの定量方法に関する記載である。サンプル０．７５
ｇ（噴霧乾燥又は微細に粉砕した粉末）と８０／２０の割合のメタノール／水溶媒と混合することにより、イソフラボンを、ダイズ生成物から抽出した。 混合物を、オービタルシェイカー（orbital shaker）を用いて、室温下で２時間振盪した。 ２時間後、残りの未溶解の物質を、Whatman No.42 filter paperを用いたろ過により取り除いた。 濾液５ｍｌを、水４ｍｌ及びメタノール１ｍ
ｌを用いて希釈した。

【００４８】抽出したイソフラボンを、Hewlett Packar
d C18 Hypersil reverse phase column を用いたＨＰＬ
Ｃ（高速液体クロマトグラフィー）により分離した。 イソフラボンをカラムに注入し、８８％メタノール、１０
％水及び２％氷酢酸から始まり、最終的には９８％メタノール及び２％氷酢酸の溶媒勾配（solvent gradient）
を用いて溶出した。 流速は０．４ｍｌ／分で、全てのイソフラボン、すなわちゲニスチン、６”−Ｏ−アセチルゲニスチン、６”−Ｏ−マロニルゲニスチン、ゲニステイン、ダイジン、６”−Ｏ−アセチルダイジン、６”−
Ｏ−マロニルダイジン、ダイジン、グリシチン及びその誘導体並びにグリシテインが明瞭に分離した。 ピークの検出を２６０ｍｍにおけるＵＶ吸光度で行った。 ピークの同定をＨＰＬＣ−質量分析計により行った。

【００４９】純粋な標準（ゲニスチン、ゲニステイン、
ダイジン及びダイゼイン）（Indofine Chemical Compan
y,Sommerville,NJより入手）を用いて定量化を行った。
反応因子（積分面積／濃度）を前記の各化合物について計算し、未知のサンプルの定量化に使用した。 純粋な標準が入手できない共役形態については、応答因子を、親化合物の応答因子として推定したが、分子量の差異については補正しなかった。 グリシチンに対する応答因子を分子量の差異について補正したゲニスチンの応答因子として推定した。 この方法は個々のイソフラボンの定量化を提供した。 便宜のために、全ゲニステイン、全ダイゼイン及び全グリシテインを計算することができ、全ての共役形態がそれぞれの非共役形態に転換するするならば、これはこれらの化合物の凝集した重量を表している。 酸加水分解を用いて共役形態に転換することにより、総量を直接測定することもできる。

【００５０】前記の記載は単に本発明の好ましい態様である。 種々の変化及び改変を、添付した請求の範囲に示した精神及びその広い面から離れることなく行うことができ、これは均等論を含む特許法の主物に従い解釈される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バーバラ エイ ブライアン アメリカ合衆国 ミズーリー州 63130 ユニヴァーシティー シティー パーシン グ アベニュー 7039