一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用
阅读：597发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种产2‑苯 乙醇 的酿酒 酵母 工程菌及其制备方法与应用。本发明公开了一种制备产2‑苯乙醇的 酿酒酵母 工程菌的方法，包括向受体酿酒酵母中导入GATA转录因子Gln3p的编码基因，得到产2‑苯乙醇的酿酒酵母工程菌。本发明公开的产2‑苯乙醇的酿酒酵母工程菌与宿主菌相比，底物转化率，细胞的2‑苯乙醇合成能 力 均显著提高，且该工程菌 发酵 条件简单，发酵周期短，有利于该菌株工业化生产2‑苯乙醇。，下面是一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述酿酒酵母工程菌为保藏编号为CGMCC No.10048的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2.一种制备2-苯乙醇的方法，包括将权利要求1所述的酿酒酵母工程菌进行发酵培养，得到2-苯乙醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁和磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在所述发酵培养基中的浓度为4-6g/L，所述葡萄糖在所述发酵培养基中的浓度为20-40g/L，所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为0.3-0.8g/L，所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为0.3-0.8g/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为28-32℃。
5.权利要求1所述的酿酒酵母工程菌在制备2-苯乙醇中的应用。
一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 2-苯乙醇(2-phenylethanol)是一种具有玫瑰风味的芳香醇，存在于玫瑰、茉莉等多种植物精油中，也是葡萄酒、黄酒、啤酒、面包等多种发酵食品的自然风味物质，是决定发酵食品品质的一个关键因素。2-苯乙醇的香气颇受人们欢迎，是国际香精香料的主流风格，在食品和日化用品等领域中应用广泛，其使用量仅次于香兰素，是第二大香料成分。此外，2-苯乙醇作为杀菌剂和血管紧张素转化酶抑制剂，在医药行业也具有重要的应用。
[0003] 工业上生产2-苯乙醇有化学法和天然法。化学合成法是以苯或苯乙烯为原料通过化学反应合成2-苯乙醇，不但原料具有致癌风险，而且产物中常含有一些难以去除的副产物，严重影响了产品质量，极大限制了产品的使用范围。天然法生产2-苯乙醇包括采用物理方法从天然材料中直接提取和微生物发酵法生产两种途径，天然产品纯度高、无毒无害，具有很好的生物安全性，因此市场需求量越来越大。但是从玫瑰、茉莉等天然原料中提取2-苯乙醇成本高、产量低，难以满足市场需求。
[0004] 一些微生物具有合成2-苯乙醇的能力，为微生物发酵法生产2-苯乙醇奠定了基础。作为国际公认的食品级微生物，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有较高的2-苯乙醇合成能力，同时对多种环境胁迫具有很好的适应性，因此是微生物发酵法生产2-苯乙醇的理想菌种。已有研究主要集中在菌种的自然筛选、传统的微生物育种或发酵工艺改进上，存在2-苯乙醇合成能力有限，难于进行大规模工业化生产的问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用。
[0006] 本发明提供一种制备产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌的方法，包括向受体酿酒酵母中导入GATA转录因子Gln3p的编码基因，得到产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌；
[0007] 所述GATA转录因子Gln3p是如下a)或b)的蛋白质：
[0008] a)SEQ ID No.4所示的蛋白质；
[0009] b)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0010] 上述方法中，所述GATA转录因子Gln3p的编码基因序列如SEQ ID No.3中自5′末端起第16位至第2208位所示。
[0011] 上述方法中，所述GATA转录因子Gln3p的编码基因是通过重组表达载体导入所述受体酿酒酵母中的；
[0012] 所述重组表达载体含有所述GATA转录因子Gln3p的编码基因的表达盒；
[0013] 所述GATA转录因子Gln3p的编码基因的表达盒如SEQ ID No.9中自5′末端起第188位至第3013位所示。
[0014] 所述重组表达载体的序列具体如SEQ ID No.9所示。
[0015] 上述任一所述的方法中，所述受体酿酒酵母为酿酒酵母MT2；
[0016] 所述酿酒酵母MT2在文献“Lu Y，Cheng YF，He XP，Guo XN，Zhang BR.(2012). Improvement of robustness and ethanol product ion of ethanologenic Saccharomyces cerevisiae under co-stress of heat and inhibitors.J Ind Microbiol Biotechnol，39：73-80.”中公开过。
[0017] 由上述任一所述的方法得到的产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌也属于本发明的保护范围。
[0018] 上述酿酒酵母工程菌中，所述酿酒酵母工程菌为保藏编号为CGMCC No.10048 的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0019] 一种制备2-苯乙醇的方法也属于本发明的保护范围，包括将上述任一所述的酿酒酵母工程菌进行发酵培养，得到2-苯乙醇。
[0020] 上述方法中，所述发酵培养的培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L- 苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁和磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在所述发酵培养基中的浓度为4-6g/L，所述葡萄糖在所述发酵培养基中的浓度为20-40g/L，所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为0.3-0.8g/L，所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为0.3-0.8g/L；
[0021] 所述发酵培养的培养基中所述L-苯丙氨酸在所述发酵培养基中的浓度具体为4 g/L、5g/L或6g/L；
[0022] 所述发酵培养的培养基中所述葡萄糖在所述发酵培养基中的浓度具体为20g/L、 30g/L或40g/L；
[0023] 所述发酵培养的培养基中所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度具体为0.5 g/L；
[0024] 所述发酵培养的培养基中所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度具体为0.5 g/L。
[0025] 上述任一所述的方法中，所述发酵培养的温度为28-32℃，具体为30℃。
[0026] 上述任一所述的酿酒酵母工程菌在制备2-苯乙醇中的应用也属于本发明的保护范围。
[0028] 图1为重组质粒YEpKAG的物理图谱。
[0029] 图2为宿主菌MT2及相应转化子的G418抗性比较。
具体实施方式
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT2在文献“Lu Y，Cheng YF，He XP， Guo XN，Zhang BR.(2012).Improvement of robustness and ethanol production of ethanologenic Saccharomyces cerevisiae under co-stress of heat and inhibitors. J Ind Microbiol Biotechnol，39：73-80.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0033] pAUR123为宝生物工程(大连)有限公司产品，产品目录号为3602。
[0034] YEp352在文献“Hill JE，Meyers AM，Koerner TJ，et al.(1993).A yeast/E. coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，9：163-167”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0035] pUG6在文献“Güldener U，Heck S，Fielder T，Beinhauer J，and Hegemann J H.(1996).A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res.24(13)：2519-2524.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0036] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58在文献“Teunissen AW，Holub E， van den Hucht J，van der Berg J&Steensma HY.(1993).Sequence of the FL01 gene fromSaccharomyces cerevisiae.Yeast，9：423-427.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0037] 下述实施例的发酵培养基中，硫酸镁在发酵培养基中的浓度为0.3-0.8g/L均可，磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为0.3-0.8g/L均可。
[0038] 下述实施例的发酵培养的温度为28-32℃均可。
[0039] 下述实施例中的HPLC分析中，以2-苯乙醇(阿拉丁试剂(上海)有限公司产品，产品目录号为P108197)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析2-苯乙醇。
[0040] 实施例1、产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌的构建
[0041] 一、GATA转录因子Gln3p编码基因GLN3的获得
[0042] (一)PCR扩增GATA转录因子Gln3p的编码基因GLN3
[0043] 根据已报道的酿酒酵母的编码GATA转录因子Gln3p的GLN3基因序列(GenBank 号为M35267)，设计如下引物：
[0044] 上游引物P1：5′-ACGCGTCGACAACAAATGCAAGACGACC-3′(SEQ ID No.1)[0045] (下划线所示序列为SalI酶切识别位点)
[0046] 下游引物P2：5′-ACGCGAGCTCAATACGCGGTCATATACC-3′(SEQ ID No.2)[0047] (下划线所示序列为SacI酶切识别位点)
[0048] (二)以筛选到的2-苯乙醇产量高的野生型酿酒酵母MT2的基因组DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，序列如SEQ ID No.3所示，该PCR 扩增产物含有编码GATA转录因子Gln3p的基因GLN3。
[0049] 编码GATA转录因子Gln3p的GLN3基因序列如SEQ ID No.3中自5′末端起第16位至第2208位所示。
[0050] GATA转录因子Gln3p的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0051] PCR反应体系：基因组DNA 50ng，引物P1终浓度0.3μmol/L，引物P2终浓度 0.3μmol/L，KOD-Plus-Neo DNA聚合酶1uL，10×KOD buffers 5uL，2mM dNTPs 5uL，25mM Mg2+2uL，用去离子水将体系补至50uL，混匀。
[0052] PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸1 分15秒，共30个循环；68℃延伸10分钟使产物延伸完全。
[0053] 二、YEpA的构建
[0054] (一)设计如下引物：
[0055] 上游引物P3：5′-GGCCCAAGCTTTTATTCTTTCCTCTG-3′(SEQ ID No.5)
[0056] (下划线所示序列为HindIII酶切识别位点)
[0057] 下游引物P4：5′-GCCGGAATTC GCCACGACTGAAGGC-3′(SEQ ID No.6)
[0058] (下划线所示序列为EcoRI酶切识别位点)
[0059] (二)用质粒pAUR123作为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将该PCR扩增产物命名为PTADH1。PTADH1含有质粒pAUR123上ADH1p、ADH1t和它们之间的多克隆位点序列。
[0060] PCR反应体系：模板50ng，引物P3终浓度0.3μmol/L，引物P4终浓度0.3μ mol/L，KOD-Plus-Neo DNA聚合酶1uL，10×KOD buffers 5uL，2mM dNTPs 5uL， 25mM Mg2+2uL，用去离子水将体系补至50uL，混匀。
[0061] PCR反应条件：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸30秒，共30个循环；68℃延伸10分钟使产物延伸完全。
[0062] (三)HindIII和EcoRI双酶切PTADH1，得到基因片段；HindIII和EcoRI双酶切 YEp352，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为YEpA。将YEpA送测序，结果正确。
[0063] 三、YEpKA的构建
[0064] (一)根据质粒pUG6上KanMX基因序列设计如下引物：
[0065] 上游引物P5：5′-GAGATTAGGCGCCTTAGCTTGCCTCGTC-3′(SEQ ID No.7)[0066] (下划线所示序列为KasI酶切识别位点)
[0067] 下游引物P6：5′-GGAATTCCATATGGATGGCGGCGTTAGT-3′(SEQ ID No.8)[0068] (下划线所示序列为NdeI酶切识别位点)
[0069] (二)以质粒pUG6作为模板，以P5和P6为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该PCR扩增产物含有质粒pUG6上KanMX基因序列。
[0070] PCR反应体系：模板50ng，引物P5终浓度0.3μmol/L，引物P6终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-Neo DNA聚合酶1uL，10×KOD buffers 5uL，2mM dNTPs 5uL， 25mM Mg2+2uL，用去离子水将体系补至50uL，混匀。
[0071] PCR反应条件：先94℃变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸 45秒，共30个循环；最后68℃延伸10分钟使产物延伸完全。
[0072] (三)KasI和NdeI双酶切步骤(二)得到的PCR扩增产物，得到基因片段；KasI 和NdeI双酶切YEpA，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为YEpKA。将YEpKA送测序，结果正确。
[0073] 四、YEpKAG的构建
[0074] SalI和SacI双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；SalI和SacI 双酶切YEpKA，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为YEpKAG，将YEpKAG送测序，结果正确。
[0075] 重组表达质粒YEpKAG的物理图谱如图1所示。
[0076] YEpKAG的序列如SEQ ID No.9所示。
[0077] SEQ ID No.9中自5′末端起第188位至第3013位为GLN3基因的表达盒，该表达盒含有ADH1p、GLN3基因和ADH1t。
[0078] 五、GLN3在酿酒酵母中的高效表达及其对2-苯乙醇合成的影响
[0079] (一)将表达质粒YEpKAG、质粒YEpKA分别转化酿酒酵母YS58，在含600μg/mL G418的YEPD平板上筛选酵母转化子，因质粒中含有KanMX基因，所以含有质粒YEpKAG 和YEpKA的转化菌株在含600μg/mL G418的YEPD平板上能生长，而宿主菌YS58不能生长。提取转化子质粒，以转化子质粒DNA为模板，利用引物对P3和P4进行PCR扩增， PCR扩增产物经测序表明与插入片段序列的一致性为100％，证明质粒YEpKAG和YEpKA 成功导入宿主菌YS58，将含有质粒YEpKAG的转化菌株命名为重组菌株YS58(YEpKAG)，将含空载体质粒YEpKA的转化菌株命名为YS58(YEpKA)。
[0080] (二)将YS58(YEpKAG)和YS58(YEpKA)分别接入5mL YEPD培养基(含300μg/mL G418)，将YS58接入5mL YEPD培养基，30℃活化12小时。再以10％的接种量，分别将 YS58(YEpKAG)和YS58(YEpKA)接种于50mL YEPD培养基(含300μg/mL G418)，将 YS58接种于50mL YEPD培养基，30℃、220rpm在摇床上培养96小时。
[0081] (三)培养结束后，分别取YS58(YEpKAG)、YS58(YEpKA)和YS58的培养液，10000 转/分钟离心5分钟，取上清液，弃菌体，上清液经0.45μm滤膜过滤后，使用HPLC法测定各个样品上清液中的2-苯乙醇含量。
[0082] 测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent C-18柱(4.6mm×100mm)；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为甲醇∶水＝1∶1(体积比)等梯度洗脱。
[0083] 各个培养液中2-苯乙醇产量检测结果如表1所示。
[0084] 表1 GLN3在YS58中高效表达对2-苯乙醇产量的影响
[0085]
[0086] 表1中的2-苯乙醇产率为2-苯乙醇产量/干菌体重量。
[0087] 表1表明，YS58(YEpKAG)的2-苯乙醇产量分别比YS58(YEpKA)和YS58高21％和21％， 2-苯乙醇产率分别比YS58(YEpKA)和YS58高50％和50％。YS58(YEpKA)和YS58的2-苯乙醇产量和产率没有显著差异，证明GLN3在酿酒酵母YS58中的高效表达明显提高了2- 苯乙醇的产量和产率。
[0088] 六、构建高产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌
[0089] (一)将表达质粒YEpKAG、质粒YEpKA分别转化酿酒酵母MT2，在含600μg/mL G418 的YEPD平板上筛选酵母转化子，因质粒中含有KanMX基因，所以含有质粒YEpKAG和 YEpKA的转化菌株在含600μg/mL G418的YEPD平板上能生长，而宿主菌MT2不能生长。
[0090] 宿主菌MT2及相应转化子的G418抗性比较如图2所示。
[0091] 图2A和图2B中，第1行10个菌落为YEpKAG转化子，第2行10个菌落为载体YEpKA 转化子，第3行1个菌落为宿主菌MT2。
[0092] 提取YEpKAG转化子和YEpKA转化子的质粒，分别以转化子质粒DNA为模板，利用引物对P3和P4进行PCR扩增，PCR扩增产物经测序表明与插入片段序列的一致性为 100％，证明质粒YEpKAG和YEpKA分别成功导入宿主菌MT2，将含有质粒YEpKAG的转化菌株命名为重组菌株MT2(YEpKAG)，将含空载体质粒YEpKA的转化菌株命名为 MT2(YEpKA)。
[0093] 菌株MT2(YEpKAG)鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。该菌株已于2014 年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10048。
[0094] (二)工程菌MT2(YEpKAG)的稳定性检测
[0095] 将工程菌MT2(YEpKAG)分别在有选择压力(YEPD+300μg/mLG418)及无选择压力 (YEPD)的液体培养基连续传代培养120h(24h传一次代)，每天取样检测插入的质粒丢失情况，结果表明，在有选择压力条件下，120h后100％的工程菌种带有表达质粒YEpKAG，而在无选择压力条件下，120h后仍有85％的工程菌种带有表达质粒YEpKAG。
[0096] (三)不同酵母菌株2-苯乙醇产量比较
[0097] 将工程菌MT2(YEpKAG)和空载体转化菌株MT2(YEpKA)分别接入5mL YEPD培养基 (含300μg/mL G418)，MT2接入5mL YEPD培养基，30℃活化12小时。再以10％接种量，分别将MT2(YEpKAG)和MT2(YEpKA)接种于50mL YEPD培养基(含300μg/mL G418)， MT2接种于50mL YEPD培养基，30℃、220转/分钟在摇床上培养96小时。
[0098] 培养结束后，分别取MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2的培养液，10000转/分钟离心5分钟，取上清液，弃菌体，上清液经0.45μm滤膜过滤后，使用HPLC法测定各个样品上清液中的2-苯乙醇含量。
[0099] 测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent C-18柱(4.6mm×100mm)；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为甲醇∶水＝1∶1(体积比)等梯度洗脱。
[0100] 各个培养液中2-苯乙醇产量检测结果如表2所示。
[0101] 表2 GLN3在MT2中高效表达对2-苯乙醇产量的影响
[0102]
[0103]
[0104] 表2中的2-苯乙醇产率为2-苯乙醇产量/干菌体重量。
[0105] 表2表明，MT2(YEpKAG)的2-苯乙醇产量分别比MT2(YEpKA)和MT2高41％和46％，2- 苯乙醇产率分别比MT2(YEpKA)和MT2高33％和33％。MT2(YEpKA)和MT2的产量没有显著差异，证明GLN3在酿酒酵母MT2中的高效表达明显提高了2-苯乙醇的产量和产率。
[0106] 七、酵母菌发酵法生产2-苯乙醇
[0107] (一)将MT2(YEpKAG)和MT2(YEpKA)分别接入5mL YEPD培养基(含300μg/mL G418)，MT2接入5mL YEPD培养基，30℃活化12小时。再以10％接种量，分别将MT2(YEpKAG) 和MT2(YEpKA)接种于50mL YEPD培养基(含300μg/mL G418)，MT2接种于50mL YEPD 培养基，30℃培养24h，收集菌体，无菌水洗涤，得到MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和 MT2。
[0108] (二)分别将MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2转接于装有50mL发酵培养基的 250mL三角瓶中，于30℃、220转/分钟在摇床上培养36小时。
[0109] 上述发酵培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在发酵培养基中的浓度为5g/L，所述葡萄糖在发酵培养基中的浓度为20g/L，所述硫酸镁在发酵培养基中的浓度为0.5g/L，所述磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为0.5g/L。
[0110] (三)发酵结束后，取MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2发酵液，离心取上清，HPLC 测定发酵液中2-苯乙醇产量。
[0111] 测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent C-18柱(4.6mm×100mm)；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为甲醇∶水＝1∶1(体积比)等梯度洗脱。
[0112] 各个发酵液中2-苯乙醇产量检测结果如表3所示。
[0113] 表3酵母菌发酵液中的2-苯乙醇产量、干菌体重量及2-苯乙醇产率
[0114]
[0115] 表3中的2-苯乙醇产率为2-苯乙醇产量/干菌体重量。
[0116] 表3表明，MT2(YEpKAG)的2-苯乙醇产量达到2.96g/L，2-苯乙醇产率达到0.22g/g， 2-苯乙醇产量和2-苯乙醇产率分别比宿主菌株MT2提高17％和16％，比MT2(YEpKA)提高
17％和16％。
17％和16％。
[0117] 实施例2、酵母菌发酵法生产2-苯乙醇
[0118] 一、将活化的MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2转接于装有50mL发酵培养基的 250mL三角瓶中，于30℃、220转/分钟在摇床上培养36小时。
[0119] 上述发酵培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在发酵培养基中的浓度为5g/L，所述葡萄糖在发酵培养基中的浓度为30g/L，所述硫酸镁在发酵培养基中的浓度为0.5g/L，所述磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为0.5g/L。
[0120] 二、发酵结束后，取MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2发酵液，离心取上清，HPLC 测定发酵液中2-苯乙醇产量。
[0121] 测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent C-18柱(4.6mm×100mm)；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为甲醇∶水＝1∶1(体积比)等梯度洗脱。
[0122] 各个发酵液中2-苯乙醇产量检测结果如表4所示。
[0123] 表4酵母菌发酵液中的2-苯乙醇产量、干菌体重量及2-苯乙醇产率
[0124]
[0125] 表4中的2-苯乙醇产率为2-苯乙醇产量/干菌体重量。
[0126] 表4表明，MT2(YEpKAG)的2-苯乙醇产量达到3.29g/L，2-苯乙醇产率达到0.24g/g， 2-苯乙醇产量和2-苯乙醇产率分别比宿主菌株MT2提高17％和20％，比MT2(YEpKA)提高
15％和20％。
15％和20％。
[0127] 实施例3、酵母菌发酵法生产2-苯乙醇
[0128] 一、将活化的MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2转接于装有50mL发酵培养基的 250mL三角瓶中，于30℃、220转/分钟在摇床上培养36小时。
[0129] 上述发酵培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在发酵培养基中的浓度为5g/L，所述葡萄糖在发酵培养基中的浓度为40g/L，所述硫酸镁在发酵培养基中的浓度为0.5g/L，所述磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为0.5g/L。
[0130] 二、发酵结束后，取MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2发酵液，离心取上清，HPLC 测定发酵液中2-苯乙醇产量。
[0131] 测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent C-18柱(4.6mm×100mm)；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为甲醇∶水＝1∶1(体积比)等梯度洗脱。
[0132] 各个发酵液中2-苯乙醇产量检测结果如表5所示。
[0133] 表5酵母菌发酵液中的2-苯乙醇产量、干菌体重量及2-苯乙醇产率
[0134]
[0135] 表5中的2-苯乙醇产率为2-苯乙醇产量/干菌体重量。
[0136] 表5表明，MT2(YEpKAG)的2-苯乙醇产量达到3.59g/L，2-苯乙醇产率达到0.26g/g， 2-苯乙醇产量和2-苯乙醇产率分别比宿主菌株MT2提高18％和18％，比MT2(YEpKA)提高
15％和18％。
15％和18％。
[0137] 实施例4、酵母菌发酵法生产2-苯乙醇
[0138] 一、将活化的MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2转接于装有50mL发酵培养基的 250mL三角瓶中，于30℃、220转/分钟在摇床上培养36小时。
[0139] 上述发酵培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在发酵培养基中的浓度为4g/L，所述葡萄糖在发酵培养基中的浓度为30g/L，所述硫酸镁在发酵培养基中的浓度为0.5g/L，所述磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为0.5g/L。
[0140] 二、发酵结束后，取MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2发酵液，离心取上清，HPLC 测定发酵液中2-苯乙醇产量。
[0141] 测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent C-18柱(4.6mm×100mm)；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为甲醇∶水＝1∶1(体积比)等梯度洗脱。
[0142] 各个发酵液中2-苯乙醇产量检测结果如表6所示。
[0143] 表6酵母菌发酵液中的2-苯乙醇产量、干菌体重量及2-苯乙醇产率
[0144]
[0145] 表6中的2-苯乙醇产率为2-苯乙醇产量/干菌体重量。
[0146] 表6表明，MT2(YEpKAG)的2-苯乙醇产量达到2.76g/L，2-苯乙醇产率达到0.19g/g， 2-苯乙醇产量和2-苯乙醇产率分别比宿主菌株MT2提高17％和19％，比MT2(YEpKA)提高
16％和19％。
16％和19％。
[0147] 实施例5、酵母菌发酵法生产2-苯乙醇
[0148] 一、将活化的MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2转接于装有50mL发酵培养基的 250mL三角瓶中，于30℃、220转/分钟在摇床上培养36小时。
[0149] 上述发酵培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在发酵培养基中的浓度为6g/L，所述葡萄糖在发酵培养基中的浓度为30g/L，所述硫酸镁在发酵培养基中的浓度为0.5g/L，所述磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为0.5g/L。
[0150] 二、发酵结束后，取MT2(YEpKAG)、MT2(YEpKA)和MT2发酵液，离心取上清，HPLC 测定发酵液中2-苯乙醇产量。
[0151] 测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent C-18柱(4.6mm×100mm)；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为甲醇∶水＝1∶1(体积比)等梯度洗脱。
[0152] 各个发酵液中2-苯乙醇产量检测结果如表7所示。
[0153] 表7酵母菌发酵液中的2-苯乙醇产量、干菌体重量及2-苯乙醇产率
[0154]
[0155] 表7中的2-苯乙醇产率为2-苯乙醇产量/干菌体重量。
[0156] 表7表明，MT2(YEpKAG)的2-苯乙醇产量达到3.39g/L，2-苯乙醇产率达到0.24g/g， 2-苯乙醇产量和2-苯乙醇产率分别比宿主菌株MT2提高17％和20％，比MT2(YEpKA)提高
15％和14％。
15％和14％。
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