重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备的亚单位疫苗专利检索-防腐剂食品添加剂调味料，色素和添加剂专利检索查询-专利查询网

重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备的亚单位疫苗

阅读：641发布：2024-01-07

专利汇可以提供重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备的亚单位疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白在制备预防副猪嗜血杆菌病的药物中的用途，以及由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白和药学上可接受的辅料或者载体制备而成的亚单位疫苗及其用途。本发明重组HbpA2蛋白良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，制备的亚单位疫苗保护率高，临床应用前景良好。，下面是重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备的亚单位疫苗专利的具体信息内容。

权利要求

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白在制备预防副猪嗜血杆菌病的药物中的用途；所述蛋白由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物包含致免疫有效量的重组HbpA2蛋白。
3.一种亚单位疫苗，其特征在于：它是由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗包含致免疫有效量的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白以及药学上可接受的辅料或者载体；所述蛋白由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的致免疫有效量为不低于0.1μg/ml。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的辅料或者载体为免疫佐剂和/或防腐剂。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述佐剂为完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。
8.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述防腐剂为硫柳汞。
9.权利要求3-8任意一项所述的疫苗在制备预防副猪嗜血杆菌病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的预防副猪嗜血杆菌病的药物是通过注射的方式给药。

说明书全文

重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备

的亚单位疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备的亚单位疫苗。

背景技术

[0002] 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)属于巴斯德菌(Pasteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)，为革兰阴性细小杆菌，具有多种形态，定植于健康猪上呼吸道，属于正常菌群，在免疫抑制等特定条件下会引起猪格氏病(Glasser’s dis-ease，以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎为主要特征。近些年来由于猪场规模化养殖的快速发展，尤其是工厂集约化养殖，猪格氏病已经呈世界性流行和暴发，表现出突然死亡率、发病率和病死率较高，严重危害养猪业发展，并造成巨大经济损失。

[0003] 我国近年来才开始逐渐重视对副猪嗜血杆菌病的研究。副猪嗜血杆菌的血清型众多，目前已鉴别十五种血清型，还有15％-41％的未鉴定血清型，其中1，5，10，12，13和14为强毒株，而我国流行的血清型为4型和5。不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大，我们对其毒力因子及致病机理知之甚少，至今尚无有效的通用商品苗和敏感的诊断方法，该病尚未得到有效控制，给全球养猪业带来巨大的经济损失。

[0004] 我国至今没有像猪瘟兔化弱毒疫苗、伪狂犬基因缺失疫苗那样的成熟疫苗来针对副猪嗜血杆菌病，目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，缺乏良好的保护力，导致临床病例多见。而灭活疫苗只能对同种血清型的菌株具有保护作用，缺乏交叉保护力。副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。亚单位疫苗同时具有活疫苗免疫效力高、交叉保护力强以及灭活苗的安全性好等优点，具有十分广阔的应用前景。大部分不能分型菌株副猪嗜血杆菌及其血清型的多样性影响了人们对于具有高效交叉保护力疫苗的研制。

[0005] 血红素结合蛋白(heme-binding protein，HbpA)是一种球蛋白，广泛存在于致病菌中。有研究发现HbpA蛋白分子中有一个或多个与血红素结合区域，具有结合、运输和传递血红素，参与机体代谢等生理功能，HbpA蛋白是一种重要的毒力因子，与细菌的致病性密不可分。在巴斯德菌科嗜血杆菌属的流感嗜血杆菌上的研究表明，HbpA蛋白是流感嗜血杆菌的一种重要的毒力因子，HbpA蛋白与血红素的利用有关。目前关于副猪嗜血杆菌HbpA蛋白的功能的研究报道较少，在已进行基因组测序的副猪嗜血杆菌SH0165中发现有两个HbpA基因，两个基因的大小均为1595bp。公开号为CN103288934A的专利申请公开了一种采用基因工程的方式重组表达HbpA基因(Gene ID:7276898)的方法，但是，其制备的重组HbpA蛋白作为亚单位疫苗，对感染副猪嗜血杆菌的保护力不佳，其免疫保护效果仅50％。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的由重组HbpA蛋制备而成的亚单位疫苗。

[0007] 本发明首先提供了氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白在制备预防副猪嗜血杆菌病的药物中的用途。

[0008] 优选地，所述药物包含致免疫有效量的重组HbpA2蛋白。

[0009] 本发明亚单位疫苗，它是由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。

[0010] 优选地，所述疫苗包含致免疫有效量的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组HbpA2蛋白以及药学上可接受的辅料或者载体。

[0011] 优选地，所述的致免疫有效量为不低于0.1μg/ml。

[0012] 优选地，所述的辅料或者载体为免疫佐剂和/或防腐剂。

[0013] 所述佐剂为完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。

[0014] 所述防腐剂为硫柳汞。

[0015] 本发明还提供了前述的疫苗在制备副猪嗜血杆菌病的药物中的用途。其中，所述的预防副猪嗜血杆菌病的药物是通过注射的方式给药。

[0016] 本发明采用基因工程的方式重组表达得到的重组蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，制成疫苗后，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，保护率高达70％，可以有效预防副猪嗜血杆菌病，临床应用前景良好。

[0017] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明

[0018] 图1HbpA2基因的PCR扩增结果图。M:DNA maker；1、2、3：PCR扩增产物；

[0019] 图2 诱导时间优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：诱导时间为：0、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h；

[0020] 图3IPTG诱导浓度优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：IPTG:终浓度为：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L；

[0021] 图4 诱导温度优化。M：蛋白maker；1、3、5、7：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；2：诱导温度为25℃；4：诱导温度为30℃；6：诱导温度为37℃；7：诱导温度为42℃；

[0022] 图5HbpA2蛋白在pET-39b-HbpA2(BL21)中表达的形式检测。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2：pET-39b-HbpA2(BL21)超声波破碎后；3：上清；4：沉淀；

[0023] 图6 重组HbpA2表达的SDS-PAGE。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)诱导前；2：pET-39b(BL21)诱导后；3：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；4：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导后；5：
HbpA2蛋白纯化后(100mmol/L咪唑洗脱)；

[0024] 图7 重组蛋白Western blotting；

[0025] 图8 小鼠存活率与时间的关系。

具体实施方式

[0026] 实验材料和试剂：

[0027] 副猪嗜血杆菌CVCC3361，来源于国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC3361。大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。限制性内切酶、Ex-Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA Marker、pMD19-T simple载体等均购自宝生物(大连)工程有限公司。细菌基因组提取试剂盒为Omega公司产品。预染蛋白Ladder为NEB公司产品。小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。

[0028] LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.2-7.4，高压蒸汽灭菌
30min。

[0029] 上样缓冲液配方：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,5mM imidazole,pH8.0。

[0030] 100mM咪唑洗脱液：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,100mM imidazole,pH 8.0。

[0031] 实施例1本发明副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的制备

[0032] 1、重组表达

[0033] 1.1HbpA2基因的克隆及表达载体的构建

[0034] 1.1.1引物设计及合成

[0035] 根据副猪嗜血杆菌HbpA2基因序列(Gene ID：7278927)，用生物软件Premier Primer 5.0设计l对引物，扩增HbpA2基因。

[0036] 上游引物：5’-AGTACTCCGACAAATACATTGGTCAACTGT-3’；

[0037] 下游引物：5’-CTCGAGTTAAGGCTTCAGACTTACGCCATA-3’；

[0038] 1.1.2HbpA2基因的PCR扩增

[0039] 以副猪嗜血杆菌CVCC3361基因组DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增，扩增体系25μL，4个重复。扩增体系：

[0040]材料体积
基因组模板 1μL
引物(上、下游) 2μL
EX-Taq MasterMix 12.5μL
ddH2O 9.5μL
总体积 25μL

[0041] 循环参数：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA胶回收试剂盒对电泳后的PCR片段进行胶回收纯化(按照Omega胶回收试剂盒说明书进行操作)，将纯化后的PCR片段进行测序。

[0042] 纯化后的目的基因片段的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

[0043]

[0044]

[0045] 也可以采取合成的方式直接合成目的基因片段。

[0046] 1.1.3表达载体的构建

[0047] 将目的及基因片段(PCR回收产物)克隆到T载体上得到pMD19-T-HbpA2，T载体克隆连接体系：

[0048]材料试剂体积
PCR回收产物 3μL
pMD19-T载体 1μL
T4DNA Ligase 0.5μL
10×Buffer 1μL
ATP 1μL
ddH2O 3.5μL
总体积 10μL

[0049] 16℃连接过夜，PCR快速鉴定连接产物，连接后的产物用CaCl2法转化进入感受态细胞大肠杆菌DH5a，其步骤如下：(1)用移液枪取-70℃冻存的感受态细胞DH5a 50μL于冰上溶解，加入pMD19-T-HbpA2质粒10μL混匀，-20℃冰浴30min,42℃水浴锅中热激90s，迅速在-20℃冰浴5min。(2)将经上述处理的样品加入600μL预热的LB培养基，37℃，180转/分钟培养
1.5h。(3)取出100μL菌液涂布于含Amp抗性的LB固体培养基上，于37℃恒温箱培养12～24h。
筛选阳性转化子，挑取疑似菌落进行PCR，鉴定出含有pMD19-T-HbpA2的重组子并扩大培养，提取质粒进行测序鉴定。

[0050] 测序正确的pMD19-T-HbpA2用XhoI和ScaI定向克隆到原核表达载体pET-39b中，构建重组表达载体pET-39b-HbpA2，其步骤如下：(1)用XhoI和ScaI对pMD19-T-HbpA2质粒和pET-39b质粒进行双酶切，37℃酶切3h。(2)酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后用DNA胶回收试剂盒对电泳后的目的片段进行胶回收纯化(按照Omega胶回收试剂盒说明书进行操作)，－20℃保存备用。(3)将酶切后的目的片段进行连接转化得到重组表达载体pET-39b-HbpA2(连接转化的方法同T载体克隆)，并进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定。

[0051] 1.1.4重组菌的构建

[0052] 最后将构建好的重组表达载体pET-39b-HbpA2转化进表达宿主菌BL21(DE3)，即得重组菌。

[0053] 1.2重组大肠杆菌的诱导表达

[0054] 1.2.1重组蛋白初表达及鉴定

[0055] 将含重组质粒pET-39b-HbpA2的大肠杆菌BL21(DE3)接种含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃摇振培养3～4h，至OD值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度1mmoL/mL，继续摇振培养3～4h，离心去上清，于沉淀中加SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5min，进行SDS-PAGE。凝胶经考马斯亮兰染色后脱色，利用凝胶成像系统照相分析。

[0056] 1.2.2重组蛋白表达条件的优化

[0057] 1.2.2.1诱导时间的优化

[0058] 将重组菌以1:100的比例接种于含Kan的LB液体培养基试管中，待培养至OD值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度1mmoL/mL，分别在诱导表达0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h后取
1ml菌液，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳。

[0059] 1.2.2.2IPTG浓度的优化

[0060] 将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan(即卡拉霉素)n的LB液体培养基试管中，37℃振荡培养至OD值为0.5～0.6时，分别加入IPTG至终浓度为：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L，诱导培养上述试验得出的最佳诱导时间，各取菌液1mL，对样品进行后处理，SDS-PAGE电泳。

[0061] 1.2.2.3诱导温度的优化

[0062] 将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，待培养至OD值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为上述试验得出的最佳IPTG浓度，分别在25℃、30℃、37℃、
42℃诱导培养上述试验得出的最佳诱导时间，各取菌液1mL，对样品进行后处理，SDS-PAGE电泳。

[0063] 1.2.3重组蛋白的大量表达

[0064] 将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，培养至OD值为0.5～0.6时，在菌液中加IPTG至终浓度为最佳诱导表达的浓度，而后在最佳温度下培养至最佳时间。

[0065] 1.3分离纯化

[0066] (1)将诱导表达后的菌液12000g/min离心5min，收集菌体，加入含有1mg/mL溶菌酶的菌体裂解液80mL，悬浮沉淀。置于4℃反应过夜。

[0067] (2)于-20℃与室温间反复冻融悬液3次。

[0068] (3)溶化后悬液置于冰上使用超声波细胞破碎仪40％强度破碎约10min。12000g/min离心10min，收集上清液，用1mmol/L NaOH调pH至8.0，使用0.45μm的滤膜过滤样品，进行后续纯化。

[0069] (4)将Ni离子填料装填入柱中过夜，待填料压实后备用，即镍离子螯合亲和层析填料层析柱。

[0070] (5)以流速为2ml/min的超纯水洗脱酒精，至层析柱平衡。再用上样缓冲液以lml/min的流速平衡层析柱，约30min。然后以0.5ml/min流速上样，样品上完后用上样缓冲液平衡层析柱至平衡。按顺序用含有30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液，以1ml/min的流速洗脱蛋白，当出现上升峰开始收集洗脱液至下降峰结束，待平衡后换下一浓度的咪唑洗脱缓冲继续洗脱。收集用含有
100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱纯化的洗脱液，即为含有本发明重组蛋白HbpA2的溶液，-
80℃储存备用，SDS-PAGE分析收集蛋白纯度。

[0071] 2、测定

[0072] 2.1Western blotting

[0073] 将纯化后的HbpA2蛋白经12％的凝胶进行SDS-PAGE电泳后，进行Western blotting。其具体步骤如下：

[0074] (1)将SDS-PAGE电泳后的凝胶块经适当剪切，同时剪切六张与凝胶大小一致的滤纸和一张NC膜；浸泡入转移缓冲液中放置1h；

[0075] (2)打开转移盒，将经转移缓冲液浸泡过的滤纸、凝胶和NC膜，按“滤纸--凝胶--NC膜--滤纸”在转移盒负极上进行叠放，并用一干净小试管轻轻滚过，以消除气泡，关上转移盒并插入转移池；

[0076] (3)接通电源，25V转移30min；

[0077] (4)转移结束后，取出NC膜，加入适量封闭缓冲液封闭1h左右；倒掉封闭液，TBST洗膜3次，10min/次；

[0078] 将NC膜放入封口小塑料袋中，加入1：1000稀释的兔抗CVCC3361一抗，于37℃作用lh，弃一抗，用TBST洗膜3次，10min/次；

[0079] (5)将NC膜放入封口小塑料袋中，加入1：1000稀释的羊抗兔IgG二抗，于37℃作用1h；TBST洗膜3次，10min/次；

[0080] (6)加入适量显色液，显色20min～30min，待目的条带清晰可见，用去离子水洗膜终止显色，吸水纸吸干膜上水分，避光干燥。

[0081] (7)凝胶图象处理系统拍照分析。

[0082] 3、测定结果

[0083] 如图1所示，以菌株CVCC3361基因组DNA为模板，经PCR扩增，出现1条与预期片段(159bp)大小一致的条带(图1)。测序结果显示，扩增出的片段与Gen-Bank上公布的HbpA2基因序列的同源性为99.9％。构建的重组表达质粒pET-39b-HbpA2经XhoI和ScaI双酶切可见2条带，大小与预期的条带大小一致。说明HbpA2基因已成功插入到pET39b载体上。

[0084] 如图2～4所示，诱导表达时，IPTG最佳浓度为1.5mmol/L下，诱导温度最佳为30℃，最诱导时间最佳为5h。

[0085] 如图5～6所示，对本发明含有重组质粒pET-39b-HbpA2的大肠杆菌诱导表达后，SDS-PAGE分析在70kd处出现1条明显变粗的条带，其大小与预期融合蛋白理论分子量大小一致，说明获得了重组蛋白HbpA2，按照本发明方法分离纯化后，获得了纯品蛋白。

[0086] 重组蛋白-HbpA2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)为：

[0087]

[0088] 如图7所示，本发明重组蛋白HbpA2与免疫血清充分反应后，在重组蛋白的位置有特异性显色条带，证实了该蛋白具有良好的反应原性。

[0089] 实验结果说明，本发明通过基因工程的方式，重组表达得到了纯品的重组蛋白HbpA2。

[0090] 实施例2本发明亚单位疫苗的制备

[0091] 取实施例1制备的纯品重组蛋白HbpA2 50μg，制成135μlHbpA2蛋白溶液，加115μl生理盐水，与完全弗氏佐剂按照体积比1:1乳化，即得。

[0092] 实施例3本发明亚单位疫苗的制备

[0093] 取实施例1制备的纯品重组蛋白HbpA2 50μg，制成135μlHbpA2蛋白溶液，加115μl生理盐水，与不完全弗氏佐剂按照体积比1:1乳化，即得。

[0094] 实施例4本发明亚单位疫苗的制备

[0095] 取实施例1制备的纯品重组蛋白HbpA2 50μg，制成135μlHbpA2蛋白溶液，加115μl生理盐水，与不完全弗氏佐剂按照体积比1:1乳化，加入适量硫柳汞作为防腐剂，即得。

[0096] 以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

[0097] 实验例1本发明亚单位疫苗及亚单位疫苗的体内保护效果

[0098] 一、实验方法

[0099] 1.1副猪嗜血杆菌CVCC3361半数致死量(LD50)的测定

[0100] 1.1.1LD0和LD100的测定

[0101] 10只小鼠为一组，每只小鼠腹腔注射活菌液1×109CFU(预实验中估计的LD0)，7天后统计小鼠死亡情况，若死亡两只或两只以上，则攻毒剂量减少0.1×109CFU，若全部存活，则攻毒剂量增加0.1×109CFU，直至一组小鼠中只有一只死亡为止，则与此相临的低剂量即为LD0。同法求得LD100。

[0102] 1.1.2实验组攻毒剂量的确定

[0103] 将小鼠随机平均分为7组，每组小鼠均为10只，其中7组为对照组，1-6组为试验组。按下列公式求出r值，其中G为组数，Dm/Dn为LD100与LD0之比。则试验组的攻毒剂量分别为D1＝Dn＝LD0，D2＝D1×r，D3＝D2×r，D4＝D3×r，D5＝D4×r，D6＝D5×r。按照上述剂量攻毒后，观察记录小鼠的死亡情况。

[0104] 1.1.3LD50的计算

[0105] 通过Bliss-LD50软件计算LD50，在程序中输入各组攻毒剂量、动物数、死亡数，不用输入对照组数据，单击“计算”即可显示CVCC3361对小鼠的LD50等参数。

[0106] 1.2小鼠的攻毒保护试验

[0107] 40只小鼠随机分成4组，每组10只。第l组背部皮下多点免疫50微克纯化的HbpA2+佐剂(首次免疫为弗氏完全佐剂，第二次免疫为弗氏不完全佐剂，制备方法：取135μlHbpA2蛋白溶液，加115μl生理盐水，与佐剂1:1乳化)；第2组免疫副猪嗜血杆菌CVCC3361灭活苗+佐剂作为阳性对照组；第3组用生理盐水作为阴性对照组；第4组用佐剂作为阴性对照组。首免后第14天加强免疫1次，免疫剂量和方式同首免。二免后的第14天所有小鼠用副猪嗜血杆菌CVCC3361通过腹腔攻毒。攻毒之前，采集小鼠血清，检测HbpA2特异性抗体效价。攻毒后每天观察并记录小鼠的临床表现和死亡情况，直到第5天。5d后对小鼠施行安乐死，并对所有死亡小鼠进行细菌的分离鉴定，以确认为副猪嗜血杆菌的感染。

[0108] 1.3特异性抗体的检测

[0109] 用于检测HbpA2特异性抗体的血清采自攻毒之前。小鼠断尾采血，采到的血清于-20℃保存备用。抗体的检测用间接ELISA法，具体方法如下：HbpA2纯化后，用pH 9.6的碳酸盐稀释，96孔ELISA板每孔加100μL于37℃孵育1h，4℃包被过夜。次日，用PBST洗涤3次后，用
5％脱脂牛奶于37℃封闭1.5h。弃封闭液，用PBST洗3次。将待测血清从l：100至l：12500稀释后每孔加100μL，37℃孵育1h。洗3次后，将羊抗小鼠IgG用PBST稀释，每孔加100μL，37℃作用
30min。洗3次，每孔加100μLTMB溶液于室温避光反应15min，加50μL 2.0mol/L硫酸溶液终止反应，用酶标仪于450nm处读数。值大于0.2的孔被认为是有HbpA2特异性抗体存在。

[0110] 二、实验结果

[0111] 1、鼠血清抗体检测

[0112] 结果如表1所示：

[0113] 表1 小鼠血清抗体检测结果

[0114]

[0115] HbpA2免疫组的抗体滴度明显高于阴性对照组和阳性对照组，说明表达的HbpA2及其制备的亚单位疫苗具有良好的免疫原性。

[0116] 2、攻毒保护试验

[0117] 为评价HbpA2免疫的保护效率，本研究以小鼠作为动物模型，经过2次免疫后，以6x109CFU(5×LD50)强毒菌株CVCC3361攻毒，观察并记录小鼠的临床症状和死亡情况，实验结果如表2和图8所示：

[0118] 表2 攻毒保护试验结果

[0119]

[0120] 由如表2和图8可以看出，阴性对照组小鼠均在攻毒后1天内全部死亡，解剖后发现多脏器病变，病变脏器能分离到攻毒用菌株；HbpA2免疫组攻毒后在2天内死亡3只，其余小鼠观察至5天仍然存活。阳性对照组小鼠攻毒后在2天内死亡2只。

[0121] 结果说明，本发明HbpA2免疫能显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌强毒菌株的攻击，其制备的亚单位疫苗免疫保护性较好，保护率高达70％，保护效果接近全菌灭活疫苗。

[0122] 综上，本发明采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白HbpA2。该重组蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保护原性，用其制备的亚单位疫苗免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，说明重组蛋白HbpA2是副猪嗜血杆菌的保护性抗原，可以制备成为疫苗，临床应用前景良好。

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