技术领域
[0001] 本
发明属于体外免疫诊断检测技术领域，具体涉及一种用胶乳增强免疫比浊法检测α2-巨球蛋白（α2-MG）的试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术
[0002] α2-巨球蛋白是
血浆中分子量最大的
蛋白质。在
肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成，半寿期约5天，但当与蛋白
水解酶结合成为复合物后其清除率
加速。α2-MG的特性是能与多种分子和离子结合，特别是它有与不少蛋白水解酶结合而影响这些酶的活性，起到有选择地保持某些蛋白酶活性的作用，这在免疫应用中可能具有重要意义。此外，它与淋巴网状系统细胞的发育和功能有密切联系。
[0003] 测定α2-巨球蛋白含量，对诊断肝、肾
疾病等有重要意义。α2-巨球蛋白的正常人参考值为：男:1.50 3.50g/L (150 350mg/dl)，女:1.75 4.70g/L (175 470mg/dl)。α2-巨球~ ~ ~ ~蛋白升高常见于肾病综合征、肝硬化、糖尿病、急慢性
肝炎等。降低常见于
肺气肿、慢性肝炎、糖尿病、甲状腺功能亢进症、急性肾小球肾炎、急性胰腺炎、弥散性血管内凝血(DIC)、营养不良等。此外，婴幼儿及儿童血浆α2-巨球蛋白含量约为成人的2倍～3倍，这可能是一种保护机制。
[0004] 目前，测定α2-巨球蛋白（α2-MG）常用方法有ELISA法、免疫比浊法等。其中ELISA法，操作繁琐，灵敏度低，检测结果多为定性；免疫比浊法，操作简单、使用方便，但灵敏度和
稳定性较差。
发明内容
[0005] 为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种α2-巨球蛋白（α2-MG）检测试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法，克服了普通免疫比浊法的灵敏度低、稳定性差等缺点，可以有效检测α2-巨球蛋白（α2-MG）的含量，具有灵敏度高，稳定性好的优点；本发明的另一目的在于提供该检测试剂盒的制备和使用方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种α2-巨球蛋白（α2-MG）检测试剂盒，其包括试剂R1和试剂R2，
[0007] 所述试剂R1包括如下含量的组分：
[0008] 缓冲液 65mmol/L，[0009] NaCL 9g/L，
[0010] PEG-6000 15 20g/L，~
[0011] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉
醋酸盐 0.5g/L，[0012]
防腐剂 0.5g/L；
[0013] 所述试剂R2包括如下含量的组分：
[0014] 缓冲液 70mmol/L，[0015] 羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）
抗体包被胶乳颗粒 0.25% 0.40%（W/V），~
[0017] 明胶 0.1g/L，[0018] 甘油 10 20g/L，~
[0019] 海藻糖 15 25g/L，~
[0020] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.3g/L，[0021] 防腐剂 0.5/L。
[0022] 试剂R1中缓冲液为25℃，pH为7.2的ACES（N-
氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，pH为7.3的ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液。
[0023] 试剂R1、R2所述防腐剂为吡啶硫
酮钠。
[0024] 羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：按照3:1比例取粒径120nm和200nm表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入pH为6.5的N-氨基甲酰甲基乙磺酸(ACES)缓冲液20ml，使胶乳颗粒终浓度为1.2% ，然后加入适量羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体、EDC及NHS，室温下搅拌反应3小时左右，14000 rpm离心15分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体包被胶乳颗粒。
[0025] 上述的α2-巨球蛋白（α2-MG）检测试剂盒的使用方法为：使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主
波长为570nm，试剂R1、R2使用比例为4:1。
[0026] 本发明检测的基本原理为：样本中的
抗原α2-巨球蛋白（α2-MG）与试剂中超敏化的羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体胶乳颗粒形成不溶性免疫复合物，在波长570nm处检测其
浊度变化，其变化程度与样本中α2-巨球蛋白（α2-MG）浓度成正比。
[0027] 本发明的有益效果在于：
[0028] 1）本发明采用胶乳增强免疫比浊法，通过优化反应体系，试剂R1和试剂R2采用ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液，并添加海藻糖、PEG6000、甘油、酪蛋白等多种稳定剂，优化各稳定剂的配比，显著改善了试剂的稳定性。
[0029] 2）优选的新型
表面活性剂十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐，可以促进并维持抗体稳定，防止体系浑浊，进一步增强试剂的稳定性和抗干扰能
力。
[0030] 3）采用胶乳增强免疫比浊法，特别是运用120nm和200nm羧基微球制成的双颗粒胶乳增强试剂，大大增强了试剂的反应灵敏度和线性范围，并且试剂的重复性和抗干扰能力更强。
[0031] 4）该试剂操作简便快速，适用于自动化分析，是一种更加稳定、灵敏的α2-巨球蛋白（α2-MG）试剂，试剂的准确度和稳定性良好，抗干扰性强，使用方便，完全可以满足临床需要。
附图说明
[0033] 图2 精
密度试验中高值质控物精密度试验数据表；
[0034] 图3 精密度试验中低值质控物精密度试验数据表；
[0035] 图4 准确度对比试验中高值质控物准确度试验数据表；
[0036] 图5 准确度对比试验中低值质控物准确度试验数据表；
[0037] 图6 灵敏度对比试验数据表；
[0038] 图7 试剂稳定性对比曲线图。
具体实施方式
[0039] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
[0040] 实施例1
[0041] 本实施例所提供的α2-巨球蛋白（α2-MG）的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2：
[0042] 试剂R1的组分包括：
[0043] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.2，25℃) 65mmol/L，[0044] NaCL 9g/L，
[0045] PEG-6000 15g/L，
[0046] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.5g/L，
[0047] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L；
[0048] 试剂R2的组分包括：
[0049] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.3，25℃) 70mmol/L，[0050] 羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体包被胶乳颗粒 0.25%（W/V），[0051] 酪蛋白 0.5g/L，
[0052] 明胶 0.1g/L，
[0053] 甘油 10g/L，
[0054] 海藻糖 15g/L，
[0055] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.3g/L，
[0056] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L。
[0057] 本实施例试剂的使用方法：
[0058] 本实施例描述的α2-巨球蛋白（α2-MG）检测试剂盒，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将R1和R2按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应
位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如图1。
[0059] 实施例2
[0060] 本实施例所描述的α2-巨球蛋白（α2-MG）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
[0061] 试剂R1的组分包括：
[0062] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.2，25℃) 65mmol/L，[0063] NaCL 9g/L
[0064] PEG-6000 18g/L，
[0065] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.5g/L，[0066] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L；
[0067] 试剂R2的组分包括：
[0068] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.3，25℃) 70mmol/L，[0069] 羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体包被胶乳颗粒 0.30%（W/V），[0070] 酪蛋白 0.5g/L，[0071] 明胶 0.1g/L，[0072] 甘油 15g/L，
[0073] 海藻糖 20g/L，
[0074] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.3g/L，[0075] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L。
[0076] 实施例3
[0077] 本实施例所描述的α2巨球蛋白（α2-MG）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
[0078] 试剂R1的组分包括：
[0079] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.2，25℃) 65mmol/L，[0080] NaCL 9g/L
[0081] PEG-6000 20g/L，
[0082] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.5g/L，[0083] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L；
[0084] 试剂R2的组分包括：
[0085] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.3，25℃) 70mmol/L，[0086] 羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体包被胶乳颗粒 0.40%（W/V）[0087] 酪蛋白 0.5g/L
[0088] 明胶 0.1g/L，[0089] 甘油 20g/L，
[0090] 海藻糖 25g/L，
[0091] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.3g/L，[0092] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L。
[0093] 对比例1
[0094] 本对比例所描述的α2-巨球蛋白（α2-MG）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
[0095] 试剂R1的组分包括：
[0096] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.2，25℃) 65mmol/L，[0097] NaCL 9g/L，
[0098] PEG-6000 5g/L，
[0099] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.5g/L，[0100] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L；
[0101] 试剂R2的组分包括：
[0102] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.3，25℃) 70mmol/L，[0103] 羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体包被胶乳颗粒 0.05%（W/V），[0104] 酪蛋白 0.5g/L，[0105] 明胶 0.1g/L，[0106] 甘油 5g/L，
[0107] 海藻糖 5g/L，
[0108] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.3g/L，[0109] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L。
[0110] 对比例2
[0111] 本对比例所描述的α2-巨球蛋白（α2-MG）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
[0112] 试剂R1的组分包括：
[0113] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.2，25℃) 65mmol/L，[0114] NaCL 9g/L，
[0115] PEG-6000 30g/L，[0116] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.5g/L，[0117] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L；
[0118] 试剂R2的组分包括：
[0119] ACES（N-氨基甲酰甲基乙磺酸）缓冲液(pH=7.3，25℃) 70mmol/L，[0120] 羊抗人α2-巨球蛋白（α2-MG）抗体包被胶乳颗粒 0.55%（W/V）[0121] 酪蛋白 0.5g/L
[0122] 明胶 0.1g/L，[0123] 甘油 35g/L，[0124] 海藻糖 40g/L，[0125] 十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐 0.3g/L，[0126] 防腐剂吡啶硫酮钠 0.5g/L。
[0127] 对比例3
[0128] 本对比例采用市场常见的国家食品药品监督管理局认可的α2-巨球蛋白（α2-MG）检测试剂盒。该试剂盒未采用双胶乳颗粒，也未添加新型表面活性剂十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐。
[0129] 试验一
[0130] 精密度试验：取具有溯源性的高值质控物（靶值85mg/L）、低值质控物（靶值15mg/L）各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，进行对照检测，对每份质控物进行 20 次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见图2、图3。
[0131] 由图2、图3中变异系数可知，与对比例1-3相比，实施例1-3试剂检测数值更接近靶值，标准偏差和变异系数均较小，具有更高的批内精密度，这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法（双纳米胶乳颗粒联用），并且采用新型表面活性剂十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐，科学配比海藻糖、甘油和PEG6000等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的批内精密度。
[0132] 试验二
[0133] 准确度对比试验：取具有溯源性的血清高值质控物（靶值85mg/L）、低值质控物（靶值15mg/L）各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得α2-巨球蛋白（α2-MG）检测试剂盒进行对照检测，各检测5次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见图4、图5。
[0134] 由图4、图5检测结果可知，与对比例1-3相比，实施例1-3试剂检测数值更接近靶值，平均值与靶值的差值在0.3以内，具有更高的准确度，这说明本发明通过采用双纳米胶乳颗粒联用和新型表面活性剂十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐，科学配比甘油、PEG6000和海藻糖等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的准确度。
[0135] 试验三
[0136] 试剂灵敏度的对比试验 ：取具有溯源性的校准品由低到高稀释出6个浓度样本，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得α2-巨球蛋白（α2-MG）检测试剂进行对照检测，将检测结果与理论浓度相比较。结果见图6。
[0137] 由图6检测结果可知，在样本浓度低至0.5mg/L时，对比例1-3检测值为0或0.1，而实施例1-3试剂仍可以检测出样本的准确值；并且与对比例1-3相比，实施例1-3试剂检测接近线性下限的低值样本（2-5mg/L）时的准确度更高。另外，在样本浓度在线性上限150mg/L时，对比列检测值在124.24 128.25之间，测试值明显偏低，而实施例1-3试剂仍可以检测出~样本的准确值，这表明实施例1-3试剂拥有更高的分析灵敏度、准确度及更宽的线性范围。
因此可以说明本发明通过采用双纳米胶乳颗粒的胶乳增强免疫比浊法和新型表面活性剂十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐，科学配比甘油、PEG6000和海藻糖等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的分析灵敏度、准确度和线性范围。
[0138] 试验四
[0139] 试剂的稳定性对比试验：对实施例1-3和对比例1-3中的试剂，分别均匀分装13组，每组的试剂量为R1为20mL，R2为5mL。放置到2-8℃
冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测α2-MG质控品（靶值为85mg/L），检测结果如图7所示，实施例1-3试剂在2-8℃储存条件下比对比例更加稳定。
[0140] 由检测结果可知，在保存13个月时，对比例1-3检测数值为66-71，与靶值相差14-19，并且检测值呈现明显的随储存时间延长而降低趋势；而实施例1-3试剂检测数值为84-
87，与靶值相差1-2；这表明实施例1-3试剂拥有更高的稳定性。说明本发明通过采用双纳米胶乳颗粒的胶乳增强免疫比浊法和新型表面活性剂十一烷基羧甲基钠型咪唑啉醋酸盐，科学配比甘油、PEG6000和海藻糖等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的稳定性。
[0141] 综上所述，通过验证，本发明提供的试剂比对比例灵敏度高、重复性好、线性范围宽，能够达到市场对产品的应用要求，并且准确度高，是一种更加稳定、良好的α2-球蛋白（α2-MG）检测试剂盒。
