人参稀有皂苷组合物及其制备方法和应用
阅读：1030发布：2020-05-16
专利汇可以提供人参稀有皂苷组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种人参稀有皂苷组合物及其方法和应用，本发明的人参皂苷组合物含有人参稀有皂苷S-RG3 0.02～0.1mg/mL、R-Rg3 0.009～0.029mg/mL、Rg5 0.087～0.245mg/mL和CK 0.013～0.044mg/mL。本发明通过 发酵 法制备人参稀有皂苷，包括如下步骤：以 酵母 菌和乳酸菌进行分步发酵。通过本发明分布发酵方法，实现了人参固有皂苷向稀有皂苷的转化，得到了S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD 17种人参稀有皂苷，发酵后的人参 生物 活性更高，可以应用于食品、药品、保健食品及护肤品行业中。，下面是人参稀有皂苷组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种人参皂苷组合物，其特征在于，所述组合物含有人参稀有皂苷S-RG3 0.02～
0.1mg/mL、R-Rg3 0.009～0.029mg/mL、Rg5 0.087～0.245mg/mL和CK 0.013～0.044mg/mL。
2.根据权利要求1所述的人参皂苷组合物，其中，所述组合物含有人参稀有皂苷S-RG3
0.04～0.060mg/mL、R-Rg3 0.013～0.029mg/mL、Rg5 0.129～0.241mg/mL和CK 0.018～
0.044mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的人参皂苷组合物，其中，所述组合物含有人参稀有皂苷Rg2
0.14～0.45mg/mL、F2 0.028～0.032mg/mL、F4 0.066～0.085mg/mL、Rh2 0.007～0.015mg/mL、Rh4 0.042～0.055mg/mL、Rk2 0.002～0.004mg/mL、Rh3 0.001～0.002mg/mL和PPT
0.019～0.026mg/mL。
4.根据权利要求2或3所述的人参皂苷组合物，其中，所述Rg2为S-Rg2和/或R-Rg2；所述Rh2为S-Rh2和/或R-Rh2。
5.一种人参发酵物，其特征在于，所述人参发酵物含有权利要求1-4任一项所述的人参皂苷组合物。
6.根据权利要求5所述的人参发酵物，其中，所述人参发酵物来源于食用菌发酵，优选的是，所述食用菌选自酵母菌和/或乳酸菌。
7.一种权利要求5或6所述人参发酵物的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：混合待发酵原料；
步骤(2)：向步骤(1)得到的混合物中接入酵母菌或乳酸菌发酵；优选的是所述酵母菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(5～10)：100；所述乳杆菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(5～10)：100；
步骤(3)：灭菌；
步骤(4)：接入乳酸菌或酵母菌发酵，条件是步骤(4)所用菌种与步骤(2)所用菌种不同；优选的是所述酵母菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(0.5～5)：100；所述乳杆菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(0.5～5)：100；
步骤(5)：过滤得到发酵滤液；
和步骤(6)：灭菌；
优选的是，所述步骤(2)中，接入酵母菌发酵。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述待发酵原料包括人参、碳源和氮源。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述人参选自人参根、人参花、人参浆果、人参茎叶和/或人参提取物；所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖和/或麦芽糖，所述氮源选自硫酸铵、氯化铵、酪蛋白和/或奶粉。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述人参提取物通过水提人参后得到，优选的是，水提温度为80-100℃，进一步优选80～85℃。
11.根据权利要求7-10任一项所述的制备方法，其中，所述酵母菌选自酿酒酵母、毕赤酵母和/或假丝酵母；所述乳酸菌选自戊糖乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。
12.根据权利要求7-11任一项所述的制备方法，其中，酵母菌发酵采用摇床培养发酵，乳酸菌发酵采用厌氧或耗氧培养。
13.根据权利要求7-12任一项所述的制备方法，其中，酵母菌发酵温度为25～35℃，优选28～30℃，乳酸菌发酵温度为30～37℃，优选35～37℃。
14.根据权利要求7-13任一项所述的制备方法，其中，酵母菌发酵时间为48～240小时，优选96～192小时；乳酸菌发酵时间为48～240小时，优选96～240小时。
15.根据权利要求7-14任一项所述的制备方法，其中，步骤(3)包括调节pH为5.5～7.5，优选的是，乳酸菌发酵前调解pH为6～7.5；酵母菌发酵前调解pH为6.5～7。
16.根据权利要求7-15任一项所述的制备方法制备得到的人参发酵物。
17.一种食品、药品、保健食品或护肤品，其含有权利要求1-6和权利要求16任一项所述的人参发酵物。
18.权利要求1-6和权利要求16任一项所述的人参发酵物在制备提高免疫力的食品、药品、保健食品或护肤品中的应用。
人参稀有皂苷组合物及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 人参是我国传统的中草药，人参皂苷作为功效成分以其明确的功能药效而被广泛接受。人参中人参皂苷的含量占3-4％，皂苷种类较多，已经鉴定的种类有70余种。人参固有皂苷为三萜类化合物，按其结构类型，可分为四环三萜类达玛烷型和五环三萜类以及齐墩果酸型人参皂苷。五环三萜类齐墩果酸型人参皂苷在人参中含量极低。四环三萜类达玛烷型人参皂苷按四环母核上C-3、6、20位结构的不同，可分为原人参二醇型和原人参三醇型。根据手性C(C-20)取代位置的不同，将原人参二醇型和原人参三醇型人参皂苷分为20(S)和
20(R)型。根据C-3位和C-20位所含糖链的不同(糖链多为葡萄糖、阿拉伯糖和木糖)，人参中含有的原人参二醇型人参皂苷主要有：Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd等。原人参二醇型人参皂苷经水解失去C-3位和C-20位糖链，形成Rg3、F2、Rh2和CK等水解中产物，最终形成的苷元为原人参二醇(PPD)。根据C-6位和C-20位所含配体糖基不同(糖链多为葡萄糖、鼠李糖和木糖)，原人参三醇型人参皂苷主要有Re、Rf、Rg1等，水解失去C-6位和C-20位糖链后形成Rh1，F1稀有皂苷中间产物，最终形成苷元为原人参三醇(PPT)。
20(R)型。根据C-3位和C-20位所含糖链的不同(糖链多为葡萄糖、阿拉伯糖和木糖)，人参中含有的原人参二醇型人参皂苷主要有：Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd等。原人参二醇型人参皂苷经水解失去C-3位和C-20位糖链，形成Rg3、F2、Rh2和CK等水解中产物，最终形成的苷元为原人参二醇(PPD)。根据C-6位和C-20位所含配体糖基不同(糖链多为葡萄糖、鼠李糖和木糖)，原人参三醇型人参皂苷主要有Re、Rf、Rg1等，水解失去C-6位和C-20位糖链后形成Rh1，F1稀有皂苷中间产物，最终形成苷元为原人参三醇(PPT)。
[0003] 人参皂苷Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1等为人参中固有皂苷，在人参中含量较高，占总皂苷95％以上。固有人参皂苷经水解后失去配位糖链，得到人参皂苷-Rh1、Rh2、F2、F1、CK、PPD和PPT等，其在人参中含量极少或几乎不含有，被称为人参稀有皂苷。
[0004] 人参固有皂苷在胃肠道中吸收率低，生物活性差，在胃肠道中在胃部酸性条件下和肠道菌作用下会发生降解脱糖基化作用转变为人参稀有皂苷，进而被人体吸收利用。脱糖基化的人参稀有皂苷更容易吸收进入血液并保持较高生物活性，大量药理研究表明，稀有人参皂苷在抗炎、抗肿瘤、抗氧化等方面能够表现出独特的疗效。陈玲《( 乳酸菌发酵对人参皂苷的影响及抗肿瘤活性研究》，吉林大学，2017年)研究了发酵制备人参皂苷，并对其体外抗肿瘤活性进行了初步研究，发酵样品比未发酵样品对HepG2细胞的抑制率高。
[0005] 现有人参皂苷发酵转化的专利较多，CN 106498018 A公开了采用Rb1或人参、西洋参、三七为原料，采用产β-葡萄糖苷酶的优选酵母菌和乳酸菌、双歧杆菌，30-37℃发酵5-14天，进行复合菌微生物转化，获得含稀有人参皂苷C-K。该方法虽然使用酵母菌乳酸菌进行发酵转化，但二者为同步发酵，发酵后仅关注了人参稀有皂苷CK的转化效果。CN1738905A公开了用乳酸菌发酵的人参、含有乳酸菌发酵人参的酸乳、及其制备过程中所用的乳酸菌。CN 103099832 B公开了假丝酵母对三七的生物转化方法，该方法以假丝酵母为发酵菌种转化三七皂苷，主要以人参稀有皂苷Rg3和Rh2两种稀有皂苷为对象进行发酵转化对比。CN
104894204 A公开了微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，以曲霉菌微生物发酵得到的酶液与人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷反应，制备人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K，该发明使用的是曲霉，而且转化后的稀有皂苷目标物不同。CN 105603036 A公开了人参皂苷Rh2的生产方法，以保加利亚乳杆菌为菌种发酵人参粉生产Rh2。CN105648021 A公开了人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法,该专利主要利用黑曲霉和米曲霉发酵产生的酶类进行处理得到。CN
105861381 A公开了一种植物乳杆菌发酵人参液方法，利用一种植物乳杆菌发酵人参液与普通植物乳杆菌相比，人参发酵液的抗氧化能力以及Rg3、F2含量都有很大的提高。
104894204 A公开了微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，以曲霉菌微生物发酵得到的酶液与人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷反应，制备人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K，该发明使用的是曲霉，而且转化后的稀有皂苷目标物不同。CN 105603036 A公开了人参皂苷Rh2的生产方法，以保加利亚乳杆菌为菌种发酵人参粉生产Rh2。CN105648021 A公开了人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法,该专利主要利用黑曲霉和米曲霉发酵产生的酶类进行处理得到。CN
105861381 A公开了一种植物乳杆菌发酵人参液方法，利用一种植物乳杆菌发酵人参液与普通植物乳杆菌相比，人参发酵液的抗氧化能力以及Rg3、F2含量都有很大的提高。
[0006] 综上可知，目前人参发酵的专利较多，利用的主要是乳酸菌、酵母菌、黑曲霉、米曲霉等进行发酵，而其中的酵母菌和乳酸菌作为可食用菌种，安全性更高。
发明内容
[0007] 目前现有技术中存在的技术问题是，现有技术以人参为原料或单体人参皂苷为原料，采用酵母菌、乳酸菌、米曲霉、黑曲霉等菌种进行发酵或者提取其中的酶之后用于转化，转化的稀有皂苷种类有限，仅限于几种常见的几种稀有皂苷。
[0008] 本发明人为解决上述技术问题发现，通过酵母菌和乳酸菌两种可食用菌的分步混合发酵可以实现多种人参固有皂苷向稀有皂苷的高效转化。
[0009] 具体来说，本发明提出了如下技术方案：
[0010] 一方面，本发明提供了一种人参皂苷组合物，所述组合物含有人参稀有皂苷0.02～0.1mg/mL、R-Rg30.009～0.029mg/mL、Rg50.087～0.245mg/mL和CK 0.013～0.044mg/mL。
[0011] 优选的是，上述的人参皂苷组合物，含有人参稀有皂苷S-RG30.04～0.060mg/mL、R-Rg30.013～0.029mg/mL、Rg50.129～0.241mg/mL和CK 0.018～0.044mg/mL。
[0012] 优选的是，上述的人参皂苷组合物含有人参稀有皂苷Rg20.14～0.45mg/mL、F2 0.028～0.032mg/mL、F4 0.066～0.085mg/mL、Rh2 0.007～0.015mg/mL、Rh40.042～
0.055mg/mL、Rk20.002～0.004mg/mL、Rh3 0.001～0.002mg/mL和PPT 0.019～0.026mg/mL。
0.055mg/mL、Rk20.002～0.004mg/mL、Rh3 0.001～0.002mg/mL和PPT 0.019～0.026mg/mL。
[0013] 优选的是，上述的人参皂苷组合物，其中，所述Rg2为S-Rg2和/或R-Rg2；所述Rh2为S-Rh2和/或R-Rh2。
[0014] 另一方面，本发明还提供了一种人参发酵物，所述人参发酵物含有以上任一段所述的人参皂苷组合物。
[0015] 优选的是，上述的人参发酵物，其中，所述人参发酵物来源于食用菌发酵，优选的是，所述食用菌选自酵母菌和/或乳酸菌。
[0016] 另一方面，本发明还提供了一种人参发酵物的制备方法，包括以下步骤：
[0017] 步骤(1)：混合待发酵原料；
[0018] 步骤(2)：向步骤(1)得到的混合物中接入酵母菌或乳酸菌发酵；优选的是所述酵母菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(5～10)：100；所述乳杆菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(5～10)：100；
[0019] 步骤(3)：灭菌；
[0020] 步骤(4)：接入乳酸菌或酵母菌发酵，条件是步骤(4)所用菌种与步骤(2)所用菌种不同；优选的是所述酵母菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(0.5～5)：100；所述乳杆菌和混合物的重量比例为(0.5～10):100，优选为(0.5～5)：100；
[0021] 步骤(5)：过滤得到发酵滤液；
[0022] 和步骤(6)：灭菌；
[0023] 优选的是，所述步骤(2)中，接入酵母菌发酵。
[0025] 优选的是，上述的制备方法，其中，所述人参选自人参根、人参花、人参浆果、人参茎叶和/或人参提取物；所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖和/或麦芽糖，所述氮源选自硫酸铵、氯化铵、酪蛋白和/或奶粉。
[0026] 优选的是，上述的制备方法，其中，所述人参提取物通过水提人参后得到；优选的是，水提温度为80-100℃，进一步优选80～85℃。
[0027] 优选的是，上述的制备方法，其中，所述酵母菌选自酿酒酵母、毕赤酵母和/或假丝酵母；所述乳酸菌选自戊糖乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。
[0028] 优选的是，上述的制备方法，其中，酵母菌发酵采用摇床培养发酵，乳酸菌发酵采用厌氧或耗氧培养。
[0029] 优选的是，上述的制备方法，其中，酵母菌发酵温度为25～35℃，优选28～30℃，乳酸菌发酵温度为30～37℃，优选35～37℃。
[0030] 优选的是，上述的制备方法，其中，酵母菌发酵时间为48～240小时，优选96～192小时；乳酸菌发酵时间为48～240小时，优选96～240小时。
[0031] 优选的是，上述的制备方法，其中，步骤(3)包括调节pH为5.5～7.5，优选的是，乳酸菌发酵前调解pH为6～7.5；酵母菌发酵前调解pH为6.5～7。
[0032] 另一方面，本发明还提供了上述的制备方法制备得到的人参发酵物。
[0033] 另一方面，本发明还提供了一种食品、药品、保健食品或护肤品，其含有本发明的人参发酵物。
[0034] 另一方面，本发明还提供了本发明的人参发酵物在制备提高免疫力的食品、药品、保健食品或护肤品中的应用。
[0035] 本发明的有益效果包括：
[0036] 本发明使用人参及其生长副产品为原料，天然安全。
[0037] 本方法通过酵母菌和乳酸菌两种可食用菌的分步混合发酵实现了人参固有皂苷向稀有皂苷的转化，17种稀有皂苷得到高效的转化，稀有皂苷总量较发酵前提高200％-300％。
[0038] 本发明的方法工艺简单，周期较短，该方法可以实现人参及其副产品的高效转化，提高了人参及其生长副产品中人参皂苷的生物利用度，有助于提高人参的综合利用开发。该产品可以应用到食品、药品、保健食品、护肤品诸多行业中，实现了人参皂苷价值的提升。
[0039] 菌株保藏信息
[0040] 本发明所用的菌种酿酒酵母A3.12(Saccharomyces cerevisiae A3.12)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017781，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0041] 本发明所用的菌种假丝酵母C1.7(Wickerhamomyces anomalus C1.7)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017782，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0042] 本发明所用的菌种毕赤酵母C1.8(Cyberlindnerafabianii C1.8)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017780，保藏地址：
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0043] 本发明所用的菌种短双歧杆菌001(Bifidobacterium breve 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017626，保藏地址：
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0044] 本发明所用的菌种戊糖乳杆菌001(Pediococcuspentosaceus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017625，保藏地址：
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0045] 本发明所用的菌种植物乳杆菌001(Lactobacillus plantarum 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017629，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0046] 本发明所用的菌种鼠李糖乳杆菌001(Lactobacillus rhamnosus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017630，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0047] 本发明所用的菌种嗜酸乳杆菌001(Lactobacillus acidophilus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017628，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0048] 本发明所用的菌种干酪乳杆菌001(Lactobacillus casei 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017631，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0049] 本发明所用的菌种长双歧杆菌001(Bifidobacterium longum 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017627，保藏地址：
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
[0050] 下面结合各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明。
具体实施方式
[0051] 对于本发明所用术语“人参皂苷”、“稀有皂苷”：人参皂苷Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1等为人参中固有皂苷，在人参中含量较高，占总皂苷95％以上。固有人参皂苷经水解后失去配位糖链，得到人参皂苷-Rh1、Rh2、F2、F1、CK、PPD和PPT等，其在人参中含量极少或几乎不含有，被称为人参稀有皂苷。
[0052] 本发明的目的是为了提供一种人参固有皂苷转化成为稀有皂苷的分步复合发酵的工艺方法及高含量稀有皂苷人参发酵液产品，包括：(1)人参制粉或人参提取物的制备；(2)菌种活化、纯化、扩大培养；(2)原材料混合；(3)接种；(4)酵母发酵(乳酸菌发酵)；(5)培养基补充；(6)乳酸菌发酵(酵母发酵)；(7)澄清处理；(8)灭菌；(9)检测。该发酵后的产品中人参稀有皂苷含量较发酵前增加200-300％。
[0053] 生产过程中通过酵母和乳酸菌两种可食用菌种不同组合的分步发酵，优化发酵工艺后实现S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷的转化。该工艺实现了17种人参稀有总皂苷高含量的转化。
[0054] 本发明的原料为人参及人参提取物(包括但不限于人参根、人参花、人参果实、人参茎叶)、氮源(包括但不限于硫酸铵、氯化铵、硫酸铵、酪蛋白、奶粉)、碳源(包括但不限于葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等)及酵母菌(包括但不限于葡萄酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母)乳酸菌(包括但不限于戊糖乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌)，原料可以从市场购买得到。
[0055] 本发明优选的分布发酵方法包括以下步骤：
[0056] 1)酵母菌菌种活化：挑取假丝酵母(或上述其他酵母菌种)菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0057] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0058] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)。
[0059] 4)乳酸菌菌种培养：挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)菌落一环放入MRS液体培养基中，放入菌种活化。参照上述酵母菌扩大培养方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧或耗氧培养，当OD值＝1.0时，得到乳酸菌发酵菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)。
[0060] 5)人参提取物制备：取干燥人参(包括但不限于人参根、人参花、人参果实、人参茎叶，粉碎过60-100目筛，加入10倍体积去离子水，80-100℃水浴加热2-4h，离心过滤得滤液，重复上述提取步骤1-2次，合并滤液，滤液冷冻干燥。
[0061] 6)原材料混合：按重量份计，在100份去离子水中，加入上述人参提取物0.5-5份或人参粉(60-100目筛)1-10份，再加入0.5-10份葡萄糖和/或麦芽糖，0.5-10份酪蛋白和/或0.5-10份硫酸铵，60℃-121℃灭菌5s-240min。
[0062] 7)酵母接种发酵：将0.5-10份扩大培养后的菌液加入至100份上步冷却后的原材料混合液中，25℃-35℃摇床培养48-240h(摇床转速160-200rpm/min)
[0063] 8)灭菌调节：酵母菌发酵结束后，加入0.5-10份的葡萄糖、蔗糖和/或麦芽糖，0.5-10份酪蛋白、硫酸铵和/或硫酸铵等，后调节ph＝5.5-7.5之间，60℃-121℃灭菌5s-240min。
[0064] 9)乳酸菌接种发酵：将0.5-10份扩大培养后的乳酸菌菌液加入100份上步冷却后的酵母发酵混合液中，30-37℃厌氧或耗氧培养48-240h。
[0065] 其中，步骤6)至步骤9)的另一优选的分步发酵方式为：先按照乳酸菌发酵工艺进行乳酸菌发酵，发酵结束后灭菌调节，再按照酵母发酵工艺进行酵母菌发酵。
[0067] 11)灭菌：上述人参发酵液于60℃-115℃灭菌5s-240min。
[0068] 13)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷。
[0069] 其中，利用HPLC分析检测的具体检测分析步骤如下：
[0070] 采用Agilent 1200型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动性为乙腈(ACN)-0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，如表1所示，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm。
[0071] 表1梯度洗脱表
[0072]Time ACN 0.1％磷酸水
0 19.5 80.5
25 19.5 80.5
40 32 68
60 33.5 66.5
65 38 62
70 62 38
75 62 38
90 65 35
95 95 5
100 95 5
100.1 19.5 80.5
105 19.5 80.5
0 19.5 80.5
25 19.5 80.5
40 32 68
60 33.5 66.5
65 38 62
70 62 38
75 62 38
90 65 35
95 95 5
100 95 5
100.1 19.5 80.5
105 19.5 80.5
[0073] 以人参皂苷标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的人参皂苷进行分析。
[0074] 下面通过具体实施例来说明本发明发酵方法以及通过发酵得到的高含量稀有皂苷人参发酵液产品。
[0075] 以下实施例中所用到各试剂和仪器来源如下，本文未记载的试剂或仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容：
[0076] 表2实施例所用试剂和仪器
[0077]
[0078]
[0079] 试验组一发酵制备人参发酵液
[0080] 实施例1
[0081] 1)菌种活化：挑取毕赤酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0082] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0083] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，30℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到毕赤酵母发酵菌菌液。
[0084] 4)乳酸菌活化培养：挑取植物乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入耗氧罐中活化培养。参照上述酵母菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃耗氧培养，当OD值＝1.0时，得到植物乳杆菌发酵菌菌液。
[0085] 5)原材料混合：取人参根粉10份，5份蔗糖和5份葡萄糖，10份硫酸铵加入到100份去离子水中，60℃高压灭菌2h。
[0086] 6)酵母菌发酵：取10份扩大培养后的毕赤酵母菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，28℃摇床培养96h(摇床转速180rpm/min)。
[0087] 7)灭菌调节：酵母菌发酵结束后，加入5份的蔗糖后调节ph＝7.5，120℃灭菌15s。
[0088] 8)乳酸菌接种发酵：将5份扩大培养后的植物乳杆菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，37℃耗氧培养144h。
[0089] 9)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0090] 10)灭菌：上述人参发酵液100℃灭菌30min。
[0091] 11)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，检测结果如表3中所示，本实施例制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加338％。
[0092] 表3实施例1发酵前后人参皂苷含量及转化率
[0093]
[0094]
[0095] 其中，由于Rh3发酵前未被测到，而发酵后达到0.002，其转化率为正无穷大，为了便于比较，未被计入总稀有皂苷转化率。
[0096] 实施例2
[0097] 1)乳酸菌菌种活化：挑取戊糖乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。
[0098] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0099] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0100] 4)酵母菌活化培养：挑取假丝酵母菌菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。参照上述乳酸菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0101] 5)原材料混合：取人参果粉5份，5份葡萄糖，5份硫酸铵加入到100份去离子水中，121℃高压灭菌15min。
[0102] 6)乳酸菌接种发酵：将10份扩大培养后的戊糖乳杆菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，37℃厌氧培养96h。
[0103] 7)灭菌调节：乳酸菌发酵结束后，加入5份的葡萄糖，10份硫酸铵，2份奶粉后调节ph＝7.0，60℃灭菌60min。
[0104] 8)酵母菌发酵：取10份扩大培养后的假丝酵母菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，30℃摇床培养144h(摇床转速180rpm/min)。
[0105] 9)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0106] 10)灭菌：上述人参发酵液120℃灭菌15s。
[0107] 11)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.128mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.410mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加220％，发酵后S-Rg3含量为0.04mg/ml，R-Rg3含量为0.013mg/ml，Rg5含量为0.129mg/ml，CK含量为0.018mg/ml。
[0108] 实施例3
[0109] 1)菌种活化：挑取酿酒酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0110] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0111] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0112] 4)乳酸菌活化培养：挑取短双歧杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。参照上述酵母菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0113] 5)人参提取物：将10份人参根粉与100份去离子水混合,80℃水浴加热4h，离心过滤得滤液，重复上述提取步骤2次，合并滤液，滤液冷冻干燥，得到人参提取物冻干粉。
[0114] 6)原材料混合：取上述冻干粉1份，5份蔗糖，10份奶粉及5份硫酸铵加入到100份去离子水中，115℃高压灭菌15min。
[0115] 7)酵母菌发酵：取5份扩大培养后的酵母菌液加入至步骤6)冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养96h(摇床转速160rpm/min)。
[0116] 8)灭菌调节：酵母菌发酵结束后，加入5份的蔗糖后调节ph＝6.5，100℃灭菌30min。
[0117] 9)乳酸菌接种发酵：将5份扩大培养后的乳酸菌菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，37℃厌氧或耗氧培养144h。
[0118] 10)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0119] 11)灭菌：上述人参发酵液60℃灭菌1h。
[0120] 12)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.18mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.62mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加244％，发酵后S-Rg3含量为0.057mg/ml，R-Rg3含量为0.025mg/ml，Rg5含量为0.206mg/ml，CK含量为0.034mg/ml。
[0121] 实施例4
[0122] 1)乳酸菌菌种活化：挑取戊糖乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。
[0123] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0124] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0125] 4)酵母菌活化培养：挑取假丝酵母菌菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。参照上述乳酸菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0126] 5)原材料混合：取人参果粉5份，5份葡萄糖，5份硫酸铵加入到100份去离子水中，121℃高压灭菌15min。
[0127] 6)乳酸菌接种发酵：将10份扩大培养后的戊糖乳杆菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，30℃厌氧培养240h。
[0128] 7)灭菌调节：乳酸菌发酵结束后，加入5份的葡萄糖，10份硫酸铵，2份奶粉后调节ph＝7.0，60℃灭菌60min。
[0129] 8)酵母菌发酵：取10份扩大培养后的假丝酵母菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，35℃摇床培养48h(摇床转速180rpm/min)。
[0130] 9)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0131] 10)灭菌：上述人参发酵液120℃灭菌15s。
[0132] 11)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.132mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.489mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加270％，发酵后S-Rg3含量为0.10mg/ml，R-Rg3含量为0.012mg/ml，Rg5含量为0.140mg/ml，CK含量为0.025mg/ml。
[0133] 实施例5
[0134] 1)乳酸菌菌种活化：挑取鼠李糖乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。
[0135] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0136] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0137] 4)酵母菌活化培养：挑取假丝酵母菌菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。参照上述乳酸菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0138] 5)原材料混合：取人参果粉5份，5份葡萄糖，5份硫酸铵加入到100份去离子水中，121℃高压灭菌15min。
[0139] 6)乳酸菌接种发酵：将10份扩大培养后的鼠李糖乳杆菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，34℃厌氧培养48h。
[0140] 7)灭菌调节：乳酸菌发酵结束后，加入5份的葡萄糖，10份硫酸铵，2份奶粉后调节ph＝7.0，60℃灭菌60min。
[0141] 8)酵母菌发酵：取10份扩大培养后的假丝酵母菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，30℃摇床培养96h(摇床转速180rpm/min)。
[0142] 9)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0143] 10)灭菌：上述人参发酵液120℃灭菌15s。
[0144] 11)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.098mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.420mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加329％，发酵后S-Rg3含量为0.06mg/ml，R-Rg3含量为0.023mg/ml，Rg5含量为0.152mg/ml，CK含量为0.028mg/ml。
[0145] 实施例6
[0146] 1)乳酸菌菌种活化：挑取嗜酸乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。
[0147] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0148] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0149] 4)酵母菌活化培养：挑取假丝酵母菌菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。参照上述乳酸菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0150] 5)原材料混合：取人参果粉5份，5份葡萄糖，5份硫酸铵加入到100份去离子水中，121℃高压灭菌15min。
[0151] 6)乳酸菌接种发酵：将5份扩大培养后的嗜酸乳杆菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，37℃厌氧培养96h。
[0152] 7)灭菌调节：乳酸菌发酵结束后，加入5份的葡萄糖，10份硫酸铵，2份奶粉后调节ph＝7.0，60℃灭菌60min。
[0153] 8)酵母菌发酵：取0.5份扩大培养后的假丝酵母菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，30℃摇床培养144h(摇床转速180rpm/min)。
[0154] 9)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0155] 10)灭菌：上述人参发酵液120℃灭菌15s。
[0156] 11)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.110mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.409mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加272％，发酵后S-Rg3含量为0.05mg/ml，R-Rg3含量为0.017mg/ml，Rg5含量为0.112mg/ml，CK含量为0.016mg/ml。
[0157] 实施例7
[0158] 1)菌种活化：挑取酿酒酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0159] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0160] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0161] 4)乳酸菌活化培养：挑取干酪乳杆菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。参照上述酵母菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0162] 5)人参提取物：将10份人参根粉与100份去离子水混合,80℃水浴加热4h，离心过滤得滤液，重复上述提取步骤2次，合并滤液，滤液冷冻干燥，得到人参提取物冻干粉。
[0163] 6)原材料混合：取上述冻干粉1份，5份蔗糖，10份奶粉及5份硫酸铵加入到100份去离子水中，115℃高压灭菌15min。
[0164] 7)酵母菌发酵：取5份扩大培养后的酵母菌液加入至步骤6)冷却后的原材料混合液中，30℃摇床培养192h(摇床转速160rpm/min)。
[0165] 8)灭菌调节：酵母菌发酵结束后，加入5份的蔗糖后调节ph＝6.0，100℃灭菌30min。
[0166] 9)乳酸菌接种发酵：将5份扩大培养后的乳酸菌菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，30℃厌氧或耗氧培养144h。
[0167] 10)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0168] 11)灭菌：上述人参发酵液60℃灭菌1h。
[0169] 12)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.15mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.68mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加353％，发酵后S-Rg3含量为0.067mg/ml，R-Rg3含量为0.028mg/ml，Rg5含量为0.222mg/ml，CK含量为0.038mg/ml。
[0170] 实施例8
[0171] 1)菌种活化：挑取酿酒酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0172] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0173] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0174] 4)乳酸菌活化培养：挑取长双歧杆菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。参照上述酵母菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0175] 5)人参提取物：将10份人参根粉与100份去离子水混合,80℃水浴加热4h，离心过滤得滤液，重复上述提取步骤2次，合并滤液，滤液冷冻干燥，得到人参提取物冻干粉。
[0176] 6)原材料混合：取上述冻干粉1份，5份蔗糖，10份奶粉及5份硫酸铵加入到100份去离子水中，115℃高压灭菌15min。
[0177] 7)酵母菌发酵：取5份扩大培养后的酵母菌液加入至步骤6)冷却后的原材料混合液中，35℃摇床培养48h(摇床转速160rpm/min)。
[0178] 8)灭菌调节：酵母菌发酵结束后，加入5份的蔗糖后调节ph＝6.0，100℃灭菌30min。
[0179] 9)乳酸菌接种发酵：将5份扩大培养后的乳酸菌菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，32℃厌氧或耗氧培养192h。
[0180] 10)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0181] 11)灭菌：上述人参发酵液60℃灭菌1h。
[0182] 12)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.17mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.58mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加296％，发酵后S-Rg3含量为0.052mg/ml，R-Rg3含量为0.032mg/ml，Rg5含量为0.211mg/ml，CK含量为0.039mg/ml。
[0183] 实施例9
[0184] 1)菌种活化：挑取酿酒酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0185] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0186] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0187] 4)乳酸菌活化培养：挑取短双歧杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。参照上述酵母菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0188] 5)人参提取物：将10份人参根粉与100份去离子水混合,80℃水浴加热4h，离心过滤得滤液，重复上述提取步骤2次，合并滤液，滤液冷冻干燥，得到人参提取物冻干粉。
[0189] 6)原材料混合：取上述冻干粉1份，5份蔗糖，10份奶粉及5份硫酸铵加入到100份去离子水中，115℃高压灭菌15min。
[0190] 7)酵母菌发酵：取10份扩大培养后的酵母菌液加入至步骤6)冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养96h(摇床转速160rpm/min)。
[0191] 8)灭菌调节：酵母菌发酵结束后，加入5份的蔗糖后调节ph＝6.0，100℃灭菌30min。
[0192] 9)乳酸菌接种发酵：将0.5份扩大培养后的乳酸菌菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，37℃厌氧或耗氧培养144h。
[0193] 10)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0194] 11)灭菌：上述人参发酵液60℃灭菌1h。
[0195] 12)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.15mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.67mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加347％，发酵后S-Rg3含量为0.052mg/ml，R-Rg3含量为0.029mg/ml，Rg5含量为0.241mg/ml，CK含量为0.044mg/ml。
[0196] 对比例1
[0197] 采用混合发酵方法进行发酵：
[0198] 1)菌种活化：挑取假丝酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0199] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0200] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，30℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到毕赤酵母发酵菌菌液。
[0201] 4)乳酸菌活化培养：挑取植物乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入耗氧罐中活化培养。参照上述酵母菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃耗氧培养，当OD值＝1.0时，得到植物乳杆菌发酵菌菌液。
[0202] 5)原材料混合：取人参根粉10份，5份蔗糖和5份葡萄糖，10份硫酸铵加入到100份去离子水中，60℃加热灭菌2h。
[0203] 6)混合发酵：取10份扩大培养后的毕赤酵母菌液，10份植物乳杆菌发酵菌菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，30℃摇床培养120h(摇床转速100rpm/min)。
[0204] 9)澄清处理：发酵结束后过膜精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0205] 10)灭菌：上述人参发酵液100℃灭菌30min。
[0206] 11)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.15mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.166mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加104％。
[0207] 对比例2
[0208] 采用酵母菌发酵
[0209] 1)菌种活化：挑取酿酒酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
[0210] 2)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
[0211] 3)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0212] 5)人参提取物：将10份人参根粉与100份去离子水混合,80℃水浴加热4h，离心过滤得滤液，重复上述提取步骤2次，合并滤液，滤液冷冻干燥。
[0213] 6)原材料混合：取上述冻干粉1份，5份蔗糖，10份奶粉及5份硫酸铵加入到100份去离子水中，115℃高压灭菌15min。
[0214] 7)酵母菌发酵：取5份扩大培养后的酵母菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养96h(摇床转速160rpm/min)。
[0215] 8)澄清处理：发酵结束后板框精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0216] 9)灭菌：上述人参发酵液60℃灭菌1h。
[0217] 10)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.145mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.252mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加74％。
[0218] 对比例3
[0219] 采用短双歧杆菌发酵
[0220] 1)乳酸菌活化培养：挑取短双歧杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，放入厌氧罐中活化培养。参照上述酵母菌扩大培养操作方法，进行纯化扩大培养，挑取单个菌落接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
[0221] 2)人参提取物：将10份人参根粉与100份去离子水混合,80℃水浴加热4h，离心过滤得滤液，重复上述提取步骤2次，合并滤液，滤液冷冻干燥。
[0222] 3)原材料混合：取上述冻干粉1份，5份蔗糖，10份奶粉及5份硫酸铵加入到100份去离子水中，115℃高压灭菌15min。
[0223] 4)乳酸菌接种发酵：将5份扩大培养后的乳酸菌菌液加入到上步冷却后的原材料混合液中，37℃厌氧或耗氧培养144h。
[0224] 5)澄清处理：发酵结束后精滤得到上清液即为人参发酵滤液。
[0225] 6)灭菌：上述人参发酵液60℃灭菌1h。
[0226] 7)检测：通过HPLC分析检测分析其中的S-Rg2、R-Rg2、F1、F4、Rk3、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3、PPD等17种人参稀有皂苷，经检测本实施例发酵前总稀有皂苷含量为0.16mg/ml，发酵后总稀有皂苷含量为0.365mg/ml，制得的稀有皂苷较发酵前人参稀有皂苷总量增加128％.
[0227] 试验组二小鼠自然杀伤(NK)细胞活力对比实验
[0228] 小鼠处理：
[0229] 小鼠18只随机分为3组，每组6只，分别以实施例3中的人参提取物及制得的人参发酵液按照10g/kg体重进行灌胃处理，空白对照组按照同剂量每日灌胃无菌水。连续灌胃给药20d后给药1h，取脾制备脾细胞悬液(效应细胞)，脾细胞浓度为3.0×106个/ml。
[0230] 实验步骤：
[0231] 取经传代培养的细胞浓度为4×105/ml的靶细胞(YAC-1细胞)和上述效应细胞各100μl(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中，样品反应孔加靶细胞和效应细胞各100ul，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞、1％NP40和2.5％Triton各100μl。置37℃、5％CO2培养箱中培养4h，离心，每孔吸取上清液100μl置另一96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应5min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，于酶标仪
490nm波长处测定OD值。每孔设三个平行样，如表4所示。
490nm波长处测定OD值。每孔设三个平行样，如表4所示。
[0232] 表4
[0233] 样品反应孔 自然释放孔 最大释放孔
靶细胞(μL) 100 100 100
效应细胞(μL) 100
培养液(μL) 100
2.5％Triton(μL) 100
1％NP40(μL) 100
上清液(μL) 100 100 100
LDH基质液(μL) 100 100 100
1mol/LHCL(μL) 30 30 30
靶细胞(μL) 100 100 100
效应细胞(μL) 100
培养液(μL) 100
2.5％Triton(μL) 100
1％NP40(μL) 100
上清液(μL) 100 100 100
LDH基质液(μL) 100 100 100
1mol/LHCL(μL) 30 30 30
[0234] NK细胞活性按下列公式计算：
[0235] NK细胞活性(％)＝(样品反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
[0236] 经检测，人参对NK细胞活力影响如下表所示：
[0237] 人参对NK细胞活力影响(n＝6)
[0238]组别 NK细胞活性(％)
空白对照组 28.9±9.11
人参提取液组 60.2±10.13
人参发酵液组 78.9±10.99
空白对照组 28.9±9.11
人参提取液组 60.2±10.13
人参发酵液组 78.9±10.99
[0239] 其中：n＝6代表的是每组6只小鼠的实验平均值。
[0240] 通过上表可以看出，人参发酵样组细胞活性明显髙于人参组以及空白对照组，这是由于人参发酵样组中稀有皂苷含量更多，S-Rg2、R-Rg2、F4、F2、Rh4、S-Rg3、R-Rg3、PPT、Rg5、CK、S-Rh2、R-Rh2、Rk2、Rh3等稀有皂苷的含量均较发酵前明显增多，进而明显提高了人参发酵样组细胞活性。
[0241] 通过以上具体实施例可以看出，本发明的分步发酵方法比混合发酵法或者单一菌种发酵法有明显的转化皂苷作用，通过本发明分步发酵方法得到的稀有皂苷种类丰富，高达17种，且总稀有皂苷比发酵前提高了200～300％，发酵物对于NK细胞活性有明显提高作用，因此本发明的发酵物具有更好的生物利用度，有助于人参的综合利用。
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