技术领域
[0001] 本
发明涉及一种阿拉伯低聚木糖粉的生产方法，属于
食品加工技术领域。
背景技术
[0002] 低聚糖是一种新型功能性糖源，是指含有2-10个糖苷键聚合而成的化合物，广泛应用于食品、保健品、饮料、医药、
饲料添加剂等领域。低聚糖都有难以被胃肠消化吸收，
甜度低，热量低，基本不增加血糖和血脂等特点。
[0003] 阿拉伯低聚木糖是指由2-7个木糖残基以β-1,4-糖苷键连接而成，并在C-2和/或C-3 取代有α-L-阿拉伯呋喃糖基
侧链的一类寡糖。阿拉伯低聚木糖为阿拉伯木聚糖的降解产物。阿拉伯木聚糖是
植物细胞壁的主要组成成分，它的基本结构包括由β-D-吡喃木糖经β -D-1,4-糖苷键链接而成的木聚糖主链和α-L-阿拉伯呋喃糖基侧链，β-D-吡喃木糖可在O2 或O3位被α-L-阿拉伯呋喃糖基取代，某些α-L-阿拉伯呋喃糖苷被阿魏酸在O5位上酯化。阿拉伯低聚木糖作为一种新型的
益生元，可以特异性地促进益生元的增殖，尤其是对双歧杆菌的增殖作用，其效果显著优于果寡糖。近年来的研究表明，阿拉伯低聚木糖对乳酸菌和芽孢杆菌的促生长作用同样优于果寡糖和
葡萄糖。阿拉伯低聚木糖是一种可以通过调节肠道菌群及
发酵产物改善肠道健康、调节免疫反应的功能性低聚糖，有研究发现
益生菌群或它们的代谢产物短链
脂肪酸与肠道相关淋巴组织是密切相关的，而肠道相关淋巴组织是肠道免疫功能的主要作用者。另外，阿拉伯低聚木糖还可以通过对肠道环境的改变直接或间接的影响
机体的其他代谢过程，如控制体重、葡萄糖、调节脂质平衡和代谢综合症中涉及的
炎症因子，从而起到改善代谢综合征的作用。此外，阿拉伯低聚木糖较果寡糖等低聚糖而言，更易进入肠道后段进行发酵，从而能更有效地调节后肠段的健康。阿拉伯低聚木糖的制备方法较少，一般是以小麦麸或者小麦面粉为原料通过酶法制备，酶法具有反应条件温和、阿拉伯低聚木糖转化量高，副产物低并且无污染等优点，是生产阿拉伯低聚木糖的理想方法。生产阿拉伯低聚木糖常用的
微生物木聚糖酶的酶系比较复杂，含有内切木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和β-木糖苷酶，导致产品成分比较复杂往往含有木糖。
[0004] 本发明提供了采用一种高纯度小麦源内切木聚糖酶降解小麦源阿拉伯木聚糖获得阿拉伯低聚木糖的方法，该方法获得的阿拉伯低聚木糖粉不但纯度高而且操作简便。
发明内容
[0005] 本发明提供了一种阿拉伯低聚木糖粉的生产方法，是以小麦绿麦芽为主要原料，经打浆、缓冲液提取、
硫酸铵沉淀、阳离子交换层析、分步阴离子交换层析(90μm和30μm)，获得纯化小麦芽内切-β-1,4-D-木聚糖内切酶；然后用纯化小麦芽内切-β-1,4-D-木聚糖内切酶对小麦阿拉伯木聚糖在特定降解条件下降解，醇沉，上清液冻干得到阿拉伯低聚木糖粉。
[0006] 一种阿拉伯低聚木糖粉的生产方法，步骤如下：
[0007] 1、小麦绿麦芽的制备：按下述制麦工艺参数进行发芽试验：用16℃的
水浸泡小麦，水量完全没过小麦，每浸泡2小时就断水(将水放掉)4小时，浸麦和断水期间均以15min/h 通
风，当浸麦度达到45％时浸麦结束，在13～15℃的
温度下避光发芽5天，得到绿麦芽；
[0008] 2、小麦芽内切-β-1,4-D-木聚糖内切酶的纯化：
[0009] 1)粗酶的提取：将步骤1制备得到的绿麦芽打浆，取绿麦芽浆m(单位：kg)，4℃条件下，与0.05M pH 7.0
磷酸盐缓冲液按照1：3的
质量比混合并且搅拌30min，5000rpm 离心，取全部上清液，用0.45μm的膜进行过滤上清液，收集滤液，得到粗酶液。
[0010] 2)硫酸铵沉淀：4℃搅拌条件下，取全部粗酶液，量取粗酶液体积为n(单位：L)，按照258g/L的比例向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，搅拌90min，5000rpm离心，取沉淀。用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液将沉淀复溶至体积为步骤1)中所述绿麦芽浆质量(m)的五分之一(即m/5kg)，用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液作为
透析液进行透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次
透析液，透析48h。收集透析的酶液，测定酶液体积为P1(单位：L)，
蛋白质含量为Q1(单位：g/L)。
[0011] 3)SP-Sepharose Fast Flow阳离子层析：首先确定阳离子层析柱填料体积V1(单位： ml)＝P1×Q1/填料蛋白载量(g/L)(填料体积V1不足200mL的填充200mL)。填好柱材后，用体积为4V1经0.45μm的
滤纸膜滤的0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液平衡阳离子交换层析柱，流速为0.01V1mL/min。将步骤2)中透析后的酶液离心，0.45μm的滤纸膜滤，上样。用体积为V1的0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集在280nm处紫外检测器有吸收峰的酶液。4℃条件下，分别用0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液和0.05M pH 8.3 Tris-HCl 缓冲液依次作为透析液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析48h。收集透析的酶液，测定酶液为P2(单位：L)，蛋白质含量为Q2(单位：g/L)。
[0012] 4)Q-Sepharose Fast Flow阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V2(单位： ml)＝P2×Q2/填料蛋白载量(g/L)(填料体积V2不足200mL的填充200mL)。填好柱材后，用体积为4V2的经0.45μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为0.01V2mL/min。将步骤3)中收集的透析后的酶液用0.45μm的滤纸膜滤，上样。分别用体积均为V2的含有0mol/L和0.1mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl 缓冲液洗脱，然后继续用含有0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液洗脱，并收集在280nm处0.2mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液。4℃条件下，用0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液作为透析液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析24h。收集透析的酶液，测定酶液体积为P3(单位：L)，蛋白质含量为Q3(单位：g/L)。
[0013] 5)Source 30Q阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V3(单位：ml)＝P3×Q3/ 填料蛋白载量(g/L)(填料体积V3不足200mL的填充200mL)。填好柱材后，用体积为 2V3的经0.22μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为0.01V3mL/min。将步骤4)中透析后的酶液用0.22μm的滤纸膜滤，上样。分别用体积为2V3的含有0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl 缓冲液洗脱，然后继续用含有0.3mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液洗脱，并收集在280nm处0.3mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液。4℃条件下，分别用0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液和
0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析12h。得到纯化的小麦芽内切-β-1,4-D-木聚糖内切酶即为降解酶液。
[0014] 3、阿拉伯低聚木糖粉的制备：
[0015] 1)用降解酶液降解小麦源阿拉伯木聚糖：将水配的阿拉伯木聚糖溶液，与步骤2制备的降解酶液以6：1的比例(体积比)混合，混合溶液的阿拉伯木聚糖浓度为0.5mg/mL。在40℃反应6h，煮沸15min终止反应，然后8000rpm离心10min，收集上清液并用 0.45μm的滤纸膜滤，得到酶解液；酶解液体积记作V4(单位：L)。
[0016] 2)制取阿拉伯低聚木糖粉：向酶解液中缓慢加入体积为4V4的无水
乙醇，使酶解液中乙醇浓度达到80％，涡旋混合，4℃放置过夜，8000rpm离心10min，收集上清液a。将沉淀用去V4体积的离子水复溶，再次醇沉，静置，离心并且收集上清液b，将上清液b和上清液a合并。40℃条件下，将合并后的上清液干燥3小时以去除乙醇，然后冻干得到阿拉伯低聚木糖粉。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明获得的阿拉伯低聚木糖粉不但纯度高而且操作简便。
附图说明
具体实施方式
[0020] 本发明中所用到的相关测定方法：
[0021] 1、内切-β-(1,4)-D-木聚糖酶活
力测定方法：
[0022] 将0.5ml酶液与0.5ml 1mg/mL的4-O-Methyl-D-glucurono-D-xylan dyed with Remazol Brilliant Blue R溶液在4mL的离心管中混合，涡旋，在40℃反应90min。然后用2mL乙醇终止反应，剧烈震荡。在4℃
冰箱放置30min来
加速乙醇沉淀，再次混匀后5000rpm离心10min，在590nm处测吸光值。对照组是在离心管中先加入RBB-Xylan 溶液与乙醇，反应完毕后加入酶液。通过查标准曲线来测得酶活。酶活力定义为每g绝干麦芽每min产生1μmol木糖等价物为一个酶活力单位。
[0023] 2、蛋白质含量测定方法：双缩脲测蛋白，标准品为
牛血清
白蛋白。
[0024] 3、比活力(u/mg)＝总酶活/总蛋白
[0025] 4、本实施例中所用到的相关设备：
[0026] (1)紫外检测器：8823B-紫外检测仪，北京宾达英创科技有限公司；
[0027] (2)层析图谱采集分析仪：HD-4A层析图谱采集分析仪，北京宾达英创科技有限公司；
[0028] (3)
冷冻干燥：TF-FD-18
冷冻干燥机，上海田枫实业有限公司。
[0029] 实施例1
[0030] 小麦绿麦芽的制备：取1kg的小麦(普通小麦)，按下述制麦工艺参数进行发芽试验：用16℃的水浸泡小麦，水量以完全没过小麦为宜，每浸泡2小时就断水(将水放掉)4小时，浸麦和断水期间以15min/h
通风，当浸麦度达到45％时浸麦结束，在13～15℃的温度下避光发芽5天，得到绿麦芽。
[0031] 小麦芽内切-β-1,4-D-木聚糖内切酶的纯化：
[0032] 1、粗酶的提取：将制备的绿麦芽打浆，取绿麦芽浆500g，4℃条件下，与1500mL 0.05 M pH 7.0磷酸盐缓冲液混合并且搅拌30min，5000rpm离心，取全部上清液，用0.45μ m的膜进行过滤上清液，收集滤液，得到1500mL粗酶液。
[0033] 2、硫酸铵沉淀：4℃，在搅拌条件下，取全部粗酶液，向粗酶液中缓慢加入387g的硫酸铵，搅拌90min，5000rpm离心，得到沉淀。用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液将沉淀复溶至100mL，用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液进行透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析48h。收集透析的酶液，测定酶液体积为150mL，蛋白质含量为22mg/mL。
[0034] 3、SP-Sepharose Fast Flow阳离子层析：首先确定阳离子层析柱填料体积V1＝66mL (实际填充200mL)。填好柱材后，用体积为800mL经0.45μm的滤纸膜滤的0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液平衡阳离子交换层析柱，流速为2mL/min。将上一步透析的样品离心， 0.45μm的滤纸膜滤，上样。用体积为200mL的0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集在280nm处紫外检测器有吸收峰的酶液。4℃条件下，依次用0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液和0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析48h。收集透析的酶液，测定酶液体积为300mL，蛋白质含量为4.3mg/mL。
[0035] 4、Q-Sepharose Fast Flow阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V2＝25.8mL (实际填充200mL)。填好柱材后，用800mL的经0.45μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为2mL/min。将步骤3中透析后的酶液用0.45 μm的滤纸膜滤，上样。分别用体积为200mL的含有0mol/L、0.1mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液洗脱，然后继续用含有0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl 缓冲液洗脱，并收集在280nm处0.2mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液。4℃条件下，用
0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析24h。收集透析的酶液，测定酶液体积为480mL，蛋白质含量为2.4mg/mL。
[0036] 5、Source 30Q阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V3＝23mL(实际填充200 mL)。填好柱材后，用400mL的经0.22μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为2.0mL/min。将步骤4透析后的酶液用0.22μm的滤纸膜滤，上样。分别用400mL的含有0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液洗脱，然后继续用含有0.3mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液洗脱，并收集在
280nm处0.3mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液，25mL。 4℃条件下，分别用
0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液和0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析12h。收集透析的酶液，测定酶液体积为45mL，蛋白质含量为0.6mg/mL。得到降解酶液。经测定，酶液的比活力为3.94u/mg。
[0037] 6、用降解酶液降解小麦源阿拉伯木聚糖：将150mL水配的阿拉伯木聚糖溶液与25mL 酶液混合，混合溶液的阿拉伯木聚糖浓度为0.5mg/mL，在40℃的水浴锅中反应12h后取出，煮沸15min来终止反应。然后8000rpm离心10min，收集上清液并且0.45μm的滤纸膜滤，得到170ml酶解液。
[0038] 7、制取阿拉伯低聚木糖粉：搅拌条件下，向酶解液中缓慢加入680mL无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，涡旋，4℃冰箱放置过夜，8000rpm离心10min，得到850mL上清液。将沉淀用去离子水复溶至5mL，再次醇沉，静置，离心并且得到25mL上清液，与第一次的上清液合并。40℃条件下，将上清液旋蒸，以去除乙醇和对上清液进行浓缩，得到 150mL浓缩液并进行冻干，获得8.66mg阿拉伯低聚木糖粉。配成1mg/mL溶液，使用 Hi-Plex Na柱(300mm×7.7mm i.d.)(Agilent,California,USA)利用高效液相色谱检测阿拉伯低聚木糖含量(其中标品以低聚木糖计)。
[0039] 表1阿拉伯低聚木糖(AXOS)含量
[0040]
[0041] 注：AXOS2代表聚合度为2的阿拉伯低聚木糖，AXOS3代表聚合度为3的阿拉伯低聚木糖，AXOS4代表聚合度为4的阿拉伯低聚木糖，AXOS5代表聚合度为5的阿拉伯低聚木糖， AXOS6代表聚合度为6的阿拉伯低聚木糖。
[0042] 实施例2
[0043] 1、绿麦芽的制备同实施例1；
[0044] 2、粗酶的提取：将绿麦芽打浆，取绿麦芽浆250g，4℃条件下，与750mL 0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液混合并且搅拌30min，5000rpm离心，取全部上清，用0.45μm的膜进行过滤，收集滤液，得到750mL粗酶液。
[0045] 3、硫酸铵沉淀：4℃，在搅拌条件下，取全部粗酶液，向粗酶液中缓慢加入193.5g 的硫酸铵，搅拌90min，5000rpm离心，得到沉淀。用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液将沉淀复溶至50mL，用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液进行透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析48h。收集透析的酶液，测定酶液体积为80mL，蛋白质含量为20.32mg/mL。
[0046] 4、SP-Sepharose Fast Flow阳离子层析：首先确定阳离子层析柱填料体积V1＝32.51mL (实际填充200mL)。填好柱材后，用体积为800mL经0.45μm的滤纸膜滤的0.05M pH
5.5磷酸盐缓冲液平衡阳离子交换层析柱，流速为2mL/min。将步骤3中透析后的酶液离心，
0.45μm的滤纸膜滤，上样。用体积为200mL的0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集在280nm处紫外检测器有吸收峰的酶液。4℃条件下，分别用0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液和0.05M pH
8.3 Tris-HCl缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析48h。收集透析液，测定透析的酶液，测定酶液的体积为150mL，测定透析液蛋白质含量为4.7 mg/mL。
[0047] 5、Q-Sepharose Fast Flow阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V2＝14.10mL (实际填充200mL)。填好柱材后，用800mL的经0.45μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为2mL/min。将步骤4中透析后的酶液用0.45 μm的滤纸膜滤，上样。分别用体积为200mL的含有0mol/L、0.1mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液洗脱，然后继续用含有0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl 缓冲液洗脱，并收集在280nm处0.2mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液。4℃条件下，用
0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析24h。收集透析的酶液，测定酶液体积为233mL，蛋白质含量为2.5mg/mL。
[0048] 6、Source 30Q阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V3＝11.65mL(实际填充200 mL)。填好柱材后，用400mL的经0.22μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为2.0mL/min。将步骤5中透析后的酶液用0.22μm的滤纸膜滤，上样。分别用400mL的含有0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl缓冲液洗脱，然后继续用含有0.3mol/L NaCl的0.05M pH 8.3 Tris-HCl 缓冲液洗脱，并收集在280nm处0.3mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液，25mL。 4℃条件下，分别用0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液和0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析12h。收集透析的酶液，测定酶液体积为25mL，蛋白质含量为0.67mg/mL。得到降解酶液。经测定，酶液的比活力为4.17u/mg。
[0049] 7、用降解酶液降解小麦源阿拉伯木聚糖：将120mL水配的阿拉伯木聚糖溶液与20mL 酶液混合，混合溶液的阿拉伯木聚糖浓度为0.5mg/mL，在40℃的水浴锅中反应12h后取出，煮沸15min来终止反应。然后8000rpm离心10min，收集上清液并且0.45μm的滤纸膜滤，得到135ml酶解液。
[0050] 8、制取阿拉伯低聚木糖粉：搅拌条件下，向酶解液中缓慢加入540mL无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，涡旋，4℃冰箱放置过夜，8000rpm离心10min，得到675mL上清液。将沉淀用去离子水复溶至5mL，再次醇沉，静置，离心并且得到25mL上清液，与第一次的上清液合并。40℃条件下，将上清液旋蒸，以去除乙醇和对上清液进行浓缩，得到 120mL浓缩液并进行冻干，获得7.35mg阿拉伯低聚木糖粉。配成1mg/mL溶液，使用Hi-Plex Na柱(300mm×7.7mm i.d.)(Agilent,California,USA)利用高效液相色谱检测阿拉伯低聚木糖含量(其中标品以低聚木糖计)。
[0051] 表2阿拉伯低聚木糖(AXOS)含量
[0052]
[0053] 注：AXOS2代表聚合度为2的阿拉伯低聚木糖，AXOS3代表聚合度为3的阿拉伯低聚木糖，AXOS4代表聚合度为4的阿拉伯低聚木糖，AXOS5代表聚合度为5的阿拉伯低聚木糖， AXOS6代表聚合度为6的阿拉伯低聚木糖。
