一种马克斯克鲁维酵母菌的增殖培养基及其制备方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种马克斯克鲁维酵母菌增殖培养基产品及其生产方法，属于食品
微生物技术领域。
背景技术
[0002] 奶啤，是利用专用的乳酸菌和酵母菌
发酵的一种新型的酸味爽口、营养丰富的含有酒精的乳饮料。它的酒
精度低于0.5％，酒体呈乳白色，具有馥郁的麦芽清香，略带
碳酸气，
泡沫丰富洁白，质感细腻润滑；同时，奶啤又具有乳饮料酸甜适口、营养丰富的特征。
[0003] 酵母菌的二次发酵在奶啤生产中至关重要。目前，奶啤生产企业大多采用市售
啤酒酵母或
酿酒酵母进行奶啤生产，导致奶啤产品种类单一、口味相似；发酵过程中需要添加大量的
麦芽汁，啤酒花等辅料，致使发酵工艺繁琐，生产周期长，成本显著提高，大大影响了奶啤产品在饮料市场的竞争
力。
[0004] 本实验室采用自行分离、筛选的马克斯克鲁维酵母菌(SXJ2)发酵生产奶啤，直接以
牛乳为原料，缩减了生产原料，简化了生产工艺，降低了生产成本；提高了奶啤的品质，增加了饮用的嗜好性，酒精含量较低，符合现代人营养、健康的生活方式。
[0005] 但是，马克斯克鲁维酵母菌株SXJ2采用传统的方法来制备菌种，培养时间长，菌体浓度低，菌种生产成本高。
[0006] 菌体的增殖培养是获得较高活菌体浓度的有效途径。现阶段酵母菌相应的增殖培养基多以
葡萄糖、麦芽糖、
蔗糖等糖类物质作为碳源；酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏等含氮有机物及
硝酸钾、硝酸铵、
氯化铵等铵盐或者硝酸盐作为氮源。这些原料大多价格昂贵，菌种的工业化生产成本较高，不利于工业化大规模生产。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种成本低、安全、且适于马克斯克鲁维酵母菌快速增殖的培养基及制备方法。
[0008] 本发明一种马克斯克鲁维酵母菌增殖培养基，所述增殖培养基由麦芽汁、糖蜜、麸皮、CaCO3和
水组成，所述增殖培养是用蒸馏水将麦芽汁稀释至10Brix作为
基础培养基。在基础培养基中按重量比添加糖蜜2.5％～3.5％、麸皮1％～2％、CaCO3 0.1％～0.2％。经过灭菌、冷却后备用。
[0009] 本发明还提供了一种制备上述的马克斯克鲁维酵母菌增殖培养基的方法，按照下述步骤进行：用无菌蒸馏水将市售麦芽汁稀释至10Brix，制成麦芽汁基础培养基，然后加入按照上述重量比称量的麸皮，煮沸后，继续小火煮30min，冷却后8层纱布过滤，得滤液，定容。按照上述重量比称量的糖蜜与上述滤液均匀混合，分装于盛有按上述重量比称量的CaCO3的锥形瓶中。灭菌，冷却后备用。
[0010] 本发明中，所述灭菌条件为：115℃、15min。
[0011] 上述冷却为降温至50-35℃以下。
[0012] 本发明的基础培养基采用麦芽汁培养基，分别选用糖蜜作为碳源、麸皮作为氮源、CaCO3作为无机盐，使得增殖培养基的营养更加均衡、全面，为马克斯克鲁维酵母菌酵母菌提供生长繁殖必需的营养成分，可以更好的促进马克斯克鲁维酵母菌的增殖培养。
[0013] 本发明所述的一种马克斯克鲁维酵母菌，已于2017年6月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC NO.14274，菌株编号：SXJ2，建议的分类命名为：马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromyces marxianus。
[0014] 一般的培养基培养马克斯克鲁维酵母菌体SXJ2的浓度只能达到1×108cfu/mL～2×108cfu/mL，而采用本发明的培养基来培养菌株SXJ2，培养16h后菌体浓度达到6.8×108cfu/mL左右。本发明的培养基为一种低成本、安全且适于马克斯克鲁维酵母菌快速增殖的培养基，进而能够满足马克斯克鲁维酵母菌工业化的大量应用，同时也降低其菌株大规模生产的成本。此外，本发明的培养基培养马克斯克鲁维酵母菌，在菌体浓度和培养时间方面均优于现有培养基，而且增殖培养基的原料来源于农产品加工副产物，价格低，因此其更利于该菌株的工业化生产。
附图说明
[0015] 图1为马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromyces marxianus的生物进化树。
具体实施方式
[0016] 下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述
实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。
[0017] 实施例1
[0018] 开菲尔粒的活化：将采集的开菲尔粒滤去培养液，无菌生理盐水冲洗干净后以3％(w/v)的接种比例接种于经过95℃，30min灭菌过的
脱脂乳中，140rpm，28℃培养24h。循环培养6次至pH稳定。
[0019] 稀释液的制备：将上述pH稳定的开菲尔培养液1mL注入9mL无菌生理盐水中，用
振荡器充分振荡混匀，制成初步稀释液。取初次稀释液0.1mL注入0.9mL无菌生理盐水中，用吸管反复吹打，并用振荡器将其充分振荡混匀，使菌体均匀分布。充分上述操作，使稀释倍数达到105，作为菌种接种液备用。
[0020] 菌株的分离：将上述接种液涂布于YGC培养基(酵母提取物葡萄糖氯霉素培养基)，28℃培养72h。
[0021] 菌株形态学鉴定：挑取白色、菌落大、过
氧化氢呈阳性、革兰氏
染色菌体大的菌落。初步认定为酵母菌。
[0022] 酵母菌分子生物学鉴定：将目标菌落扩大培养，用Ezup柱式
真菌基因组抽提
试剂盒提取器总DNA。对提取的DNA进行5.8S rDNAPCR扩增。引物为真菌通用引物：ITS1(tccgtaggtgaacctgcgg)与ITS4(tcctccgcttattgatatgc)
[0023] PCR反应体系如表1所示：
[0024] 表1PCR反应体系
[0025] 体系 用量/μL模板DNA 2
上游引物 0.5
下游引物 0.5
Mix酶 12.5
ddH2O 9.5
[0026] PCR反应程序，见表2：
[0027] 表2PCR反应程序
[0028]
[0029] 取2.5μL PCR扩增产物与0.5μL 10×Loading buffer均匀混合，进行1.5％的琼脂糖凝胶
电泳，用EB染色5min，紫外灯下观察后拍照保存，根据凝胶成像系统记录PCR扩增结果。将扩增产物送去生物公司测序，所得序列用NCBI的BLAST检索系统对比分析，并用
软件MEG5.1构建生物进化树，如图1所示。上述分离得到的马克斯克鲁维酵母菌，已于2017年6月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC NO.14274，菌株编号：SXJ2，建议的分类命名为：马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromyces marxianus。
[0030] 实施例2
[0031] 马克斯克鲁维酵母菌增殖培养基的配方，见表1：
[0032] 表1培养基配方
[0033]
[0034] 制备1000mL酵母菌增殖培养基，采用以下步骤：
[0035] 1)按照上述的重量比例，称取增殖培养基的各组分，将增殖培养基配制而成；
[0036] 2)将上述增殖培养基灭菌：115℃、15min；
[0037] 3)将增殖培养基冷却至50-35℃以下；
[0038] 实施例3
[0039] 采用表1中的组分重量比1的配方制备培养基，培养马克斯克鲁维酵母菌，用于增殖培养。
[0040] 培养方法：初始培养基为自然pH，接菌量3％，220rpm，30℃条件下培养。
[0041] 发酵16h后，结束发酵，马克斯克鲁维酵母菌的菌体浓度为6.6×108cfu/mL。
[0042] 实施例4
[0043] 采用表1中的组分重量比2的配方制备增殖培养基，培养马克斯克鲁维酵母菌，用于增殖培养。
[0044] 培养方法：初始培养基为自然pH，接菌量3％，220rpm，30℃条件下培养。
[0045] 发酵16h后，结束发酵，马克斯克鲁维酵母菌的菌体浓度为6.8×108cfu/mL。
[0046] 实施例5
[0047] 采用表1中的组分重量比3的配方制备增殖培养基，培养马克斯克鲁维酵母菌，用于增殖培养。
[0048] 培养方法：初始培养基为自然pH，接菌量3％，220rpm，30℃条件下培养。
[0049] 发酵16h后，结束发酵，马克斯克鲁维酵母菌的菌体浓度为6.5×108cfu/mL。
[0050] 一般的培养基培养马克斯克鲁维酵母菌体SXJ2的浓度只能达到1×108cfu/mL～2×108cfu/mL，而采用本发明的培养基来培养菌株SXJ2，培养16h后菌体浓度达到6.8×8
10cfu/mL左右。本发明的培养基培养马克斯克鲁维酵母菌，在菌体浓度和培养时间方面均优于现有培养基，而且增殖培养基的原料来自于农产品加工副产物，价格较低，因此其更利于该菌株的工业化生产。
[0051] 以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、
修改与结合，均应属于本发明保护的范围。
