动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025、其分离纯化方法及应用
专利汇可以提供动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025、其分离纯化方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025，其菌株于2019年8月20日保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18403；本发明还公开了上述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的分离纯化方法及应用。本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025能够调节肠道菌群平衡、改善 粪便 特性，具有更好的模拟消化液存活率；在37℃适于乳酸菌生长的 温度 较高的保存条件下能够良好的控制后酸。本发明属于 生物工程 技术领域，提供的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025具有调节肠道菌群平衡作用，可用于制作食品、药品或饮品的过程中。，下面是动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025、其分离纯化方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年8月20日，保藏编号为CGMCC NO.18403，拉丁文名称是Bifidobacterium animalis subsp lactis。
2.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025是从婴儿或幼儿肠道菌群中筛选出来的。
3.根据权利要求1或2所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025，其特征在于，其16SrRNA序列如下：
ACGGCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTGCATGTGTAAG。
4.根据权利要求1或2所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025，其特征在于，其tuf基因序列如下：
GGATCTCGATGAGAGCAGCGTGGTATCACCATCAACATTGCCCACATCGAGTACCAGACGGCCAAGCGTCACTACGCCCACGTCGACTGCCCGGGCCACGCCGACTTCGTGAAGAACATGATCACCGGCGCTGCCCAGATGGATGGCGCCATCCTCGTTGTGGCCGCCACCGACGGCCCGATGGCCCAGACCCGCGAGCACGTGCTGCTCGCCCGTCAGGTCGGCGTCCCGAAGATCCTCGTCGCTCTGAACAAGTGCGATATGGTCGATGACGAAGAGCTCATCGAGCTCGTCGAAGAAGAGGTCCGCGACCTCCTCGACGAGAACGGCTTCGACCGCGACTGCCCGGTCGTGCACACCTCCGCTTACGGCGCTCTGCATGACGACGCTCCCGGATCACGACAAGTGGGTTGCCACCATCAAGGAGCTCATGGACGACGTCGACGAGTACATCCCGACCCCGGTCCACGACCTCGACAAGCCGTTCCTGATGCCGATCGAGGACGTCTTCACCATCTCCGGCCGTGGCACCGTCGTCACCGGTCGTGTCGAGCGCGGCAAGCTGCCGATCAACACGAACGTCGAGATCGTCGGCATCCGCCCGACCCAGACCACCACCGTCACCTCCATCGAGACCTTCCACAAGCAGATGGATGAGTGCGAGGCCGGCGACAACACCGGTCTGCTGCTCCGCGGCATCAACCGCACCGACGTCGAGCGTGGCCAGGTCGTGGCTGCTCCGGGTTCGGTCACCCCGCACACCAAGTTCGAAGGCGAAGTCTACGTCCTTACCAAGGATGAGGGCGGCCGTCACTCGCCGTTCTTCTCGAACTACCGTCCGCAGTTCTACTTCCGCACCACCGACGTCACCGGCGTCATCACGCTGCCGGAAGGCGTCGAGATGGTTCAGCCTGGCGATCACGCGACCTTCACGGTTGAGCTGATCCAGCCGATCGCTATGGAAGAGGGCTTCACCTTCCCAGTGCTTGAAGGC。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的一种分离纯化方法，其特征在于，按照以下步骤顺序进行：
一、采集样品
取婴儿或幼儿肠道粪便，然后加入到生理盐水中并充分混匀，得到样品A；
二、样品富集
取样品A，加入到改良MRS液体培养基中， 于35～40℃条件下厌氧培养62～82h，得到培养液B；
所述改良MRS液体培养基是添加有0.5‰质量份数半胱氨酸的MRS液体培养基；
样品A与所述改良MRS液体培养基的体积比为1:10～100；
三、菌株分离筛选
取培养液B，用浓度为0.9%的无菌生理盐水以10倍梯度倍增稀释，依次为梯度稀释10-1、-2 -3 -4 -5
10 、10 、10 、10 倍，对应得到菌悬液C1～C5；
取改良MRS固体培养基，融化后，分别倒入第一～第五培养皿种，待冷却、完全凝固后，得培养基D1～ D5，分别吸取菌悬液C1～C5各0.1mL并一一对应涂布到培养基D1～D5上，然后倒置平板，置于35～40℃环境下厌氧培养62～82h，观察菌落生长情况；
所述改良MRS固体培养基为每1000mL改良MRS液体培养基中添加15%质量份数的琼脂所得固体培养基；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的单菌落E；
四、菌株纯化
挑取选中的单菌落E，将单菌落E培养物划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得单菌落F；
将单菌落F继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～
82h，得单菌落G；
再将单菌落G继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得纯培养物H，即为所述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的菌株。
6.根据权利要求5所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的分离纯化方法，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025菌株的保存方法如下：将纯培养物H与无菌的质量份数为50%的甘油按照1:1的比例混合，置于菌种保存管内，混匀后在-80～-70℃环境下保存，同时接种改良MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
7.根据权利要求4或5所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的分离纯化方法，其特征在于，所述改良MRS液体培养基的组成成分包括：酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水；
其中酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·
7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：
0.2g：0.05g：0.5g：1000mL。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的应用，其特征在于，用于制备饮品、食品或药品中的用途。
9.根据权利要求8所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的应用，其特征在于，所述饮品是饮料或发酵乳制饮品；
所述食品是谷类食物、谷类食物衍生物、发酵肉制品、益生菌或奶制食品；
所述药品的剂型是胶囊、片剂、丸剂或粉末。
10.根据权利要求9所述的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的应用，其特征在于，所述益生菌是复合益生菌。
动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025、其分离纯化方法及应用
技术领域
背景技术
发明内容
本发明还有一个目的，是要提供上述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的应用。
取婴儿或幼儿肠道粪便，然后加入到生理盐水中并充分混匀，得到样品A；
二、样品富集
取样品A，加入到改良MRS液体培养基中， 于35～40℃条件下厌氧培养62～82h，得到培养液B；
所述改良MRS液体培养基是添加有0.5‰质量份数半胱氨酸的MRS液体培养基；
样品A与所述改良MRS液体培养基的体积比为1:10～100；
三、菌株分离筛选
取培养液B，用浓度为0.9%的无菌生理盐水以10倍梯度倍增稀释，依次为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，对应得到菌悬液C1～C5；
取改良MRS固体培养基，融化后，分别倒入第一～第五培养皿种，待冷却、完全凝固后，得培养基D1～ D5，分别吸取菌悬液C1～C5各0.1mL并一一对应涂布到培养基D1～D5上，然后倒置平板，置于35～40℃环境下厌氧培养62～82h，观察菌落生长情况；
所述改良MRS固体培养基为每1000mL改良MRS液体培养基中添加15%质量份数的琼脂所得固体培养基；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的单菌落E；
四、菌株纯化
挑取选中的单菌落E，将单菌落E培养物划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得单菌落F；
将单菌落F继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～
82h，得单菌落G；
再将单菌落G继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得纯培养物H，即为所述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的菌株。
7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：
0.2g：0.05g：0.5g：1000mL。
（2）实验表明，本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025 与双歧杆菌BB-12相比具有更好的模拟消化液存活率，存活率达到7.4%，明显优于BB-12，，因此可以更好地发挥其益生作用；
（3）本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025在37℃适于乳酸菌生长的温度较高的保存条件下能够良好的控制后酸；
（4）本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025应用范围广，不仅可以用于制备发酵乳制品，还可以用于其它益生菌制品。
具体实施方式
一、采集样品
取1g婴儿或幼儿肠道粪便，然后加入到9ml生理盐水中并充分混匀，得到样品A；
二、样品富集
取V1=2ml样品A，加入到V2=100mL改良MRS液体培养基中，于T1=37℃条件下厌氧培养t1=
72h，得到培养液B；
三、菌株分离筛选
取1ml培养液B1，用浓度为0.9%的无菌生理盐水以10倍梯度倍增稀释，依次为梯度稀释
10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，对应得到菌悬液C11～C15；
取改良MRS固体培养基，融化后，分别倒入第一～第五培养皿种，待冷却、完全凝固后，得培养基D1～ D5，分别吸取菌悬液C1～C5各0.1mL并一一对应涂布到培养基D1～D5上，然后倒置平板，置于T2=37℃环境下厌氧培养t2=72h，观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准双歧杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落E；
四、菌株纯化
挑取选中的单菌落E，将单菌落E培养物划线接种到改良MRS固体培养基上，T3=37℃环境下厌氧环境培养t3=72h，得单菌落F；
将单菌落F继续划线接种到改良MRS固体培养基上，T4=37℃环境下厌氧环境培养t4=
72h，得单菌落G；
再将单菌落G继续划线接种到改良MRS固体培养基上，T5=37℃环境下厌氧环境培养t5=
72h，得纯培养物H，即为所述动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的菌株；
五、保存
将纯培养物H与无菌的质量份数为50%的甘油按照1:1比例混合，置于菌种保存管内，混匀后在T6=-70℃环境下保存，同时接种改良MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
0.5g：1000mL；改良MRS固体培养基为每1000mL改良MRS液体培养基中添加15%质量份数的琼脂。
表1 实施例3-6分离纯化过程及参数
实施例7 动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025菌种的细菌学基本特征
本实施例为实施例1中动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的细菌学基本特征，其基本特征如表2所示：
表2 动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025的基本特征
实施例8 动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025菌种的糖发酵特性
本实施例为实施例1中动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025菌种的糖发酵特性。其糖发酵特性的实验方法为：将实施例3的分离纯化方法得到的动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025菌株挑取单菌落接种至灭菌的改良MRS液体培养基内，于37℃条件下培养24h，取菌悬液接种至糖发酵管中，于37℃条件下厌氧培养48h，观察颜色变化。其糖发酵特性的鉴定结果如表3所示：
表3 动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025糖发酵特性的鉴定结果
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
6h时测定活菌数。
经过实验发现，BB-12胃酸耐受能力较强，对肠液耐受较差，而动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025对胃酸耐受较差、对肠液耐受能力较强。综合比较动物双歧杆菌乳亚种JMCC0025具有更好的模拟消化液存活率，达到7.4%优于BB-12。
备注：显著性变化（有统计意义P<0.05）即为有差异。
（2）通过饮用者的交谈发现，饮用后粪便的次数增多、粪便颜色变黄、粪便变软指标变化明显。
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