用于光免疫疗法的治疗组合物和相关方法
阅读：849发布：2020-05-15
专利汇可以提供用于光免疫疗法的治疗组合物和相关方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了用于光免疫疗法的偶联物(例如双重偶联物)、组合物和方法(例如通过活化双重偶联物中的酞菁染料诱导的光免疫疗法)。在一些实施方式中，双重偶联物包含靶向分子和 治疗 剂。在一些实施方式中，偶联物例如双重偶联物中的酞菁染料可通过用 近红外 光照射而活化。还提供了使用偶联物例如双重偶联物的治疗方法，以及用于治疗与包括 肿瘤 或癌症的 疾病 和病症相关的病灶的组合物。偶联物(例如双重偶联物)，组合物，组合和方法的特征，包括偶联物的剂量，提供了多种优点，例如高效递送和将治疗剂靶向至病灶部位。，下面是用于光免疫疗法的治疗组合物和相关方法专利的具体信息内容。
1.双重偶联物，其包含酞菁染料、靶向分子和治疗剂。
2.如权利要求1所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料和治疗剂各自独立地连接至所述靶向分子。
3.如权利要求1所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子和治疗剂各自独立地连接至所述酞菁染料。
4.如权利要求1所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料和靶向分子各自独立地连接至所述治疗剂。
5.如权利要求1所述的双重偶联物，其中，所述双重偶联物包含如下组分：
(酞菁染料)n，(靶向分子)q和(治疗剂)m，其中：
n、q和m独立选择，至少为1。
6.如权利要求5所述的双重偶联物，其中，独立选择的n和q为1-5。
7.如权利要求5所述的双重偶联物，其中，独立选择的n和m为1-5。
8.如权利要求5所述的双重偶联物，其中，q是1，n是1-100，且m是1-5。
9.如权利要求5所述的双重偶联物，其中，n与q的比率为或为约1-约1000，或约1-约10，或约2-约5。
10.如权利要求1-9中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子能够结合病灶微环境中细胞上的细胞表面分子。
11.如权利要求1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子与所述酞菁染料或治疗剂直接连接。
12.如权利要求1-11中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子和酞菁染料和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。
13.如权利要求1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料与所述靶向分子或治疗剂直接连接。
14.如权利要求1-10和13中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料与靶向分子和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。
15.如权利要求1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂与所述酞菁染料或靶向分子直接连接。
16.如权利要求1-10和15中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂和酞菁染料或靶向分子之间的连接是共价或非共价的。
17.如权利要求1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂通过接头与所述酞菁染料或靶向分子间接连接。
18.如权利要求1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子通过接头间接连接至所述酞菁染料或治疗剂。
19.如权利要求1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料通过接头间接连接至所述靶向分子或治疗剂。
20.如权利要求17-19中任一项所述的双重偶联物，其中，所述接头是肽或多肽或是化学接头。
21.如权利要求17-20中任一项所述的双重偶联物，其中，所述接头是可释放的接头或可裂解的接头。
22.如权利要求21所述的双重偶联物，其中，所述可释放的接头或所述可裂解的接头在病灶微环境中释放或裂解。
23.如权利要求22所述的双重偶联物，其中，所述病灶是肿瘤，并且所述可释放的接头或可裂解的接头在肿瘤微环境(TME)中释放或裂解。
24.如权利要求21-23中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可释放的接头或所述可裂解的接头由TME中存在的基质金属蛋白酶(MMP)释放或裂解。
25.如权利要求21-24中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头包含氨基酸PLGLWA序列。
26.如权利要求21-23中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可释放的接头或所述可裂解的接头在缺氧条件或酸性条件下释放或裂解。
27.如权利要求21-23和26中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头在酸性条件下可裂解，并且所述可裂解的接头包含一个或多个腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮或硫醚连接。
28.如权利要求21-23和26中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头在缺氧条件下可裂解，并且所述接头包含一个或多个二硫键。
29.如权利要求21-23中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头可被光照射裂解，并且所述接头包含一个或多个光不稳定的苯甲酰甲基酯，光不稳定的肼或光不稳定的邻硝基苄基连接或光不稳定的喹喔啉与硫醚。
30.如权利要求1-29中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂是免疫调节剂和/或抗癌剂。
31.如权利要求30所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是细胞因子或是在病灶的微环境中诱导细胞因子表达增加的试剂。
32.如权利要求31所述的双重偶联物，其中，所述细胞因子选自IL-1，IL-1α，IL-2，IL-
3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，肿瘤坏死因子(TNF)-α，TNF-β，人类生长激素，N-甲硫基人生长激素，甲状旁腺激素，甲状腺素，胰岛素，胰岛素原，松弛素，松弛素原，糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)，肝生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，催乳激素，胎盘乳原，肿瘤坏死因子-α和-β，缪勒抑制剂，小鼠促性腺激素相关肽，抑制素，激活素，血管内皮生长因子(VEGF)，整联蛋白，血小板生成素(TPO)，神经生长因子(NGF)-β，血小板生长因子，转化生长因子(TGF)-α，TGF-β，胰岛素样生长因子(IGF)-1，IGF-2，促红细胞生成素(EPO)，骨诱导因子，巨噬细胞-CSF(M-CSF)，粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)，粒细胞CSF(G-CSF)，白血病抑制因子(LIF)，kit配体(KL)和/或其部分和/或组合。
33.如权利要求30-32中任一项所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是细胞因子，并且所述细胞因子是IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、TNF-α或GM-CSF。
34.如权利要求30所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂或激动剂。
35.如权利要求30或权利要求34所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂特异性结合选自以下的分子：CD25、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28、VISTA、ICOS、ICOS-L、CD27、CD30、STING和A2A腺苷受体。
36.如权利要求30、34和35中任一项所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是抗体或其抗原结合片段、小分子或多肽。
37.如权利要求30和34-36中任一项所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂选自：尼莫单抗，派姆单抗，匹利珠单抗，MK-3475，BMS-936559，MPDL3280A，伊匹木单抗，特姆单抗，IMP31，BMS-986016，乌鲁单抗，TRX518，达昔妥珠单抗，鲁卡妥姆单抗，SEQ-CD40，CP-870，CP-893，MED16469，MED14736，MOXR0916，AMP-224和MSB001078C，或是其抗原结合片段。
38.如权利要求30所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂是烷基化剂，铂类药物，抗代谢物，抗肿瘤抗生素，拓扑异构酶抑制剂，有丝分裂抑制剂，皮质类固醇，蛋白酶体抑制剂，激酶抑制剂，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，抗肿瘤剂或其组合。
39.如权利要求30或权利要求38所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂是抗体或其抗原结合片段、小分子或多肽。
40.如权利要求30、38和39中任一项所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂选自5-氟尿嘧啶/亚叶酸，奥沙利铂，伊立替康，雷戈非尼，齐夫-阿非普西，卡培他滨，顺铂，紫杉醇，托普替康，卡铂，吉西他滨，多西他赛，5-FU，异环磷酰胺，丝裂霉素，培美曲塞，长春瑞滨，卡莫司汀韦格，替莫唑胺，甲氨蝶呤，卡巴他滨，拉帕替尼，依托泊苷，达布拉非尼，维拉非尼，脂质体阿糖胞苷，阿糖胞苷，干扰素α，厄洛替尼，长春新碱，环磷酰胺，洛美霉素，普罗卡巴嗪，舒尼替尼，索马他汀，阿霉素，聚乙二醇化脂质体包封的阿霉素，表柔比星，艾瑞布林，结合白蛋白的紫杉醇，伊沙匹隆，磺胺甲基异噁唑，紫杉烷，长春碱，替西罗莫司，替莫唑胺，苯达莫司汀，口服依托泊苷，依维莫司，奥曲肽，兰瑞肽，达卡巴嗪，梅斯纳，帕唑帕尼，艾瑞布林，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，他莫昔芬，托瑞米芬，放线菌素，西罗莫司，克唑替尼，赛替尼，恩杂鲁胺，醋酸阿比特龙，米托蒽醌，卡巴他赛，氟嘧啶，奥沙利铂，亚叶酸钙，阿法替尼，塞立替尼，吉非替尼，卡波替尼，奥沙利铂和金尿嘧啶。
41.如权利要求30、38和39中任一项所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂选自：贝伐单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，雷莫昔单抗，伊匹木单抗，利妥昔单抗，曲妥珠单抗，阿多曲妥珠单抗美坦，培妥珠单抗，尼莫单抗，拉帕替尼，达拉非尼，维拉非尼，厄洛替尼，舒尼替尼，帕唑帕尼，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，克唑替尼，赛替尼，阿法替尼，阿西替尼，贝伐单抗，博舒替尼，卡博替尼，阿法替尼，吉非替尼，替西罗莫司，依维莫司，西罗莫司，依鲁替尼，伊马替尼，乐伐替尼，奥拉帕尼，帕博西尼，鲁索替尼，曲美替尼，凡德他尼或维莫德吉或其抗原结合片段。
42.如权利要求1-41中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料具有约600nm-约
850nm的最大吸收波长。
43.如权利要求1-42中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料包含下式：
其中：
L是接头；
Q是使染料附连至靶向分子的反应性基团；
R2、R3、R7和R8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
R4、R5、R6、R9、R10和R11各自独立地选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烷酰基，任选取代的烷氧羰基，任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中R4、R5、R6、R9、R10和R11中至少一个包含水可溶性基团；
R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22和R23各自独立地选自氢，卤素，任选取代的烷硫基，任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基；且
2 3
X和X各自独立地是C1–C10亚烷基，其任选被杂原子中断。
44.如权利要求1-42中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料包含下式：
，其中：
X1和X4各自独立地是C1-C10亚烷基，其任选被杂原子中断；
R2、R3、R7和R8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
R4、R5、R6、R9、R10和R11各自独立地选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烷酰基，任选取代的烷氧羰基，任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中R4、R5、R6、R9、R10和R11中至少一个包含水可溶性基团；且
R16、R17、R18和R19各自独立地选自氢，卤素，任选取代的烷硫基，任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基。
45.如权利要求1-44中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料包含IRDye
700DX(IR700)。
46.如权利要求1-45中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子是抗体或其抗原结合片段。
47.如权利要求46所述的双重偶联物，其中，所述抗体是抗原结合片段，其为Fab，单VH结构域，单链可变片段(scFv)，多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。
48.如权利要求10-47中任一项所述的双重偶联物，其中，所述病灶是癌前异常结构，原位癌，赘生物，增生性肿瘤或与癌症相关的肿瘤。
49.一种组合物，其包含如权利要求1-48中任一项所述的双重偶联物。
50.如权利要求49所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
51.一种试剂盒，包括：
如权利要求1-48中任一项所述的双重偶联物，或如权利要求49或权利要求50所述的组合物；和
任选的使用说明。
52.一种治疗对象中病灶的方法，包括：
a)给予所述对象治疗有效量的如权利要求1-48中任一项所述的双重偶联物或如权利要求49或权利要求50所述的组合物或如权利要求51所述的试剂盒；和
b)在给予所述偶联物之后，在一定波长下照射所述病灶，以诱导所述偶联物的光毒性活性。
53.如权利要求52所述的方法，其中，对所述病灶的照射在500nm-900nm(含端值)的波长下以至少1J cm-2或1J/cm纤维长度的剂量进行。
54.如权利要求52或权利要求53所述的方法，其中，对所述病灶的照射在600nm-850nm的波长下进行。
55.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中，对所述病灶的照射在690±50nm的波长或在约690±20nm的波长下进行。
56.如权利要求52-55中任一项所述的方法，其中，对所述病灶的照射以从或从约2J cm-2至约400J cm-2或从或从约2J/cm纤维长度至约500J/cm纤维长度的剂量进行。
57.如权利要求52-56中任一项所述的方法，其中：
对所述病灶的照射以如下剂量进行：至少或至少约2J cm-2，5J cm-2，10J cm-2，25J cm-2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2
，50J cm ，75J cm ，100J cm ，150J cm ，200J cm ，300J cm ，400J cm ，或500J cm ；
或
对所述病灶的照射以如下剂量进行：至少或至少约2J/cm纤维长度，5J/cm纤维长度，
10J/cm纤维长度，25J/cm纤维长度，50J/cm纤维长度，75J/cm纤维长度，100J/cm纤维长度，
150J/cm纤维长度，200J/cm纤维长度，250J/cm纤维长度，300J/cm纤维长度，400J/cm纤维长度或500J/cm纤维长度。
58.如权利要求52-57中任一项所述的方法，其中，所述病灶是肿瘤或与癌症相关的肿瘤。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述肿瘤是肉瘤或癌。
60.如权利要求58或权利要求59所述的方法，其中，所述肿瘤是癌，其为鳞状细胞癌、基底细胞癌或腺癌。
61.如权利要求58-60中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤是癌，其是膀胱，胰腺，结肠，卵巢，肺，乳腺，胃，前列腺，子宫颈，食道或头颈的癌。
62.如权利要求58-61中任一项所述的方法，其中，所述癌是位于头颈部，乳腺，肝，结肠，卵巢，前列腺，胰腺，脑，子宫颈，骨，皮肤，眼，膀胱，胃，食道，腹膜或肺的癌。
63.如权利要求52-62中任一项所述的方法，其中，对所述病灶的照射在给予所述方法后约30分钟-约96小时进行。
64.如权利要求52-63中任一项所述的方法，其中，双重偶联物以如下剂量给予：从或从
2 2 2 2 2 2
约50mg/m至约5000mg/m ，从约250mg/m至约2500mg/m ，从约750mg/m至约1250mg/m ，或从约100mg/m2至约1000mg/m2。
65.如权利要求52-64中任一项所述的方法，其还包括给予其它治疗剂或抗癌治疗。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述其它抗癌治疗包括放射疗法。
67.如权利要求52-66中任一项所述的方法，其中，所述双重偶联物与用于治疗所述病灶、疾病或病症的其它治疗物联合。
68.如权利要求52-67中任一项所述的方法，其中：
靶向的病灶包括神经元，且所述疾病或病症是神经性疾病，其任选包括疼痛；
靶向的病灶包括脂肪细胞或脂细胞，且所述疾病或病症包括过量的脂肪；
靶向的病灶包括病原体感染的细胞，且所述疾病或病症包括感染；
靶向的病灶包括炎性细胞，且所述疾病或病症包括炎症。
用于光免疫疗法的治疗组合物和相关方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2017年2月23日提交的美国临时申请号62/462,898的优先权，其标题为“用于光免疫疗法的治疗组合物和相关方法(THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND RELATED
METHODS FOR PHOTOIMMUNOTHERAPY)”，其全部内容通过引用纳入本文。
METHODS FOR PHOTOIMMUNOTHERAPY)”，其全部内容通过引用纳入本文。
[0004] 电 子 格 式 的 序 列 表 随 本 申 请 一 同 提 交 。序 列 表 以 标 题 为751702000640SeqList.TXT的文件提供，其创建于2018年2月22日，大小为10,121字节。序列表的电子格式的信息通过引用其全文方式纳入本文。
技术领域
[0005] 本公开涉及用于光免疫疗法的偶联物(例如双重偶联物)、组合物和方法(例如通过活化双重偶联物中的酞菁染料诱导的光免疫疗法)。在一些实施方式中，双重偶联物包含靶向分子和治疗剂。在一些实施方式中，偶联物例如双重偶联物中的酞菁染料可通过用近
红外光照射而活化。本公开内容还提供了使用偶联物例如双重偶联物的治疗方法，以及用
于治疗与包括肿瘤或癌症的疾病和病症相关的病灶的组合物。偶联物(例如双重偶联物)，
组合物，组合和方法的特征，包括偶联物的剂量，提供了多种优点，例如将治疗剂高效递送和靶向至病灶部位。
红外光照射而活化。本公开内容还提供了使用偶联物例如双重偶联物的治疗方法，以及用
于治疗与包括肿瘤或癌症的疾病和病症相关的病灶的组合物。偶联物(例如双重偶联物)，
组合物，组合和方法的特征，包括偶联物的剂量，提供了多种优点，例如将治疗剂高效递送和靶向至病灶部位。
[0006] 背景
[0007] 多种疗法可用于治疗疾病，例如癌症。例如，光免疫疗法(PIT)是使用光敏剂的方法，所述光敏剂与抗体或其它靶向分子偶联以靶向细胞表面分子，以允许靶向杀伤特定细
胞。在一些情况下，PIT可选择性地靶向疾病细胞，例如肿瘤细胞，从而选择性地杀伤此类细胞而不会损害健康细胞。光免疫疗法方法需要改进的策略，例如，以提高治疗效果。提供满足这些需求的偶联物，组合物和方法。
发明内容
胞。在一些情况下，PIT可选择性地靶向疾病细胞，例如肿瘤细胞，从而选择性地杀伤此类细胞而不会损害健康细胞。光免疫疗法方法需要改进的策略，例如，以提高治疗效果。提供满足这些需求的偶联物，组合物和方法。
发明内容
[0008] 在一些实施方式中，本文提供了双重偶联物，其包括酞菁染料(phthalocyanine)，靶向分子和治疗剂。在一些实施方式中，酞菁染料和治疗剂各自独立地连接至靶向分子。在一些实施方式中，靶向分子和治疗剂各自独立地连接至酞菁染料(phythalocyanine)。在一些实施方式中，酞菁染料和靶向分子各自独立地连接至治疗剂。
[0009] 在一些实施方式中，双重偶联物包括以下组分：(酞菁染料)n，(靶向分子)q和(治疗剂)m，其中独立选择的n、q和m至少为1。在一些实施方式中，独立选择的n和q为1-5。在一些实施方式中，独立选择的n和m为1-5。在一些实施方式中，q为1，n为1-100，并且m为1-5。在一些实施方式中，n与q的比率为或约为1至约1000，为或约为1至约10，或为或约为2至约5。
[0010] 在一些实施方式中，靶向分子能够在病灶的微环境中结合细胞上的细胞表面分子。在一些实施方式中，靶向分子与酞菁染料或治疗剂直接连接。在一些实施方式中，靶向分子与酞菁染料和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。在一些实施方式中，酞菁染料与靶向分子或治疗剂直接连接。在一些实施方式中，酞菁染料与靶向分子和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。在一些实施方式中，治疗剂与酞菁染料或靶向分子直接连接。在一些实施方式中，治疗剂与酞菁染料或靶向分子之间的连接是共价或非共价的。
[0011] 在一些实施方式中，治疗剂通过接头间接连接至酞菁染料或靶向分子。在一些实施方式中，靶向分子通过接头间接连接至酞菁染料或治疗剂。在一些实施方式中，酞菁染料通过接头间接连接至靶向分子或治疗剂。
[0012] 在一些实施方式中，接头是肽或多肽或是化学接头。在一些实施方式中，接头是可释放的接头或可裂解的接头。在一些实施方式中，可释放的接头或可裂解的接头在病灶的微环境中被释放或裂解。在一些实施方式中，病灶是肿瘤，并且在肿瘤微环境(TME)中释放或裂解可释放的接头或可裂解的接头。在一些实施方式中，可释放的接头或可裂解的接头
被TME中存在的基质金属蛋白酶(MMP)释放或裂解。在一些实施方式中，可裂解的接头包含
示于PLGLWA的氨基酸序列。
被TME中存在的基质金属蛋白酶(MMP)释放或裂解。在一些实施方式中，可裂解的接头包含
示于PLGLWA的氨基酸序列。
[0013] 在一些实施方式中，可释放的接头或可裂解的接头在低氧条件或酸性条件下被释放或裂解。在一些实施方式中，所述可裂解的接头在酸性条件下是可裂解的，并且所述可裂解的接头包括一个或多个腙、半卡巴腙、硫代半卡巴腙、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic
amide)、原酸酯、缩醛、缩酮或硫醚连接。在一些实施方式中，所述可裂解的接头在缺氧条件下是可裂解的，并且所述接头包括一个或多个二硫键。在一些实施方式中，所述可裂解的接头可通过光照射而裂解，并且所述接头包括一个或多个光不稳定的苯甲酰甲基酯，光不稳
定的肼或光不稳定的邻硝基苄基连接或光不稳定的喹喔啉与硫醚。
amide)、原酸酯、缩醛、缩酮或硫醚连接。在一些实施方式中，所述可裂解的接头在缺氧条件下是可裂解的，并且所述接头包括一个或多个二硫键。在一些实施方式中，所述可裂解的接头可通过光照射而裂解，并且所述接头包括一个或多个光不稳定的苯甲酰甲基酯，光不稳
定的肼或光不稳定的邻硝基苄基连接或光不稳定的喹喔啉与硫醚。
[0014] 在一些实施方式中，治疗剂是免疫调节剂和/或抗癌剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是细胞因子或是在病灶的微环境中诱导细胞因子表达增加的试剂。在一些实施方式
中，细胞因子选自IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-
11，IL-12，IL-15，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，肿瘤坏死因子(TNF)-α，TNF-β，人类生长激素，N-甲硫基人生长激素，甲状旁腺激素，甲状腺素，胰岛素，胰岛素原，松弛素，松弛素原，糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)，肝生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，催乳激素，胎盘乳原，肿瘤坏死因子-α和-β，缪勒抑制剂，小鼠促性腺激素相关肽，抑制素，激活素，血管内皮生长因子(VEGF)，整联蛋白，血小板生成素(TPO)，神经生长因子(NGF)-β，血小板生长因子，转化生长因子(TGF)-α，TGF-β，胰岛素样生长因子(IGF)-1，IGF-2，促红细胞生成素(EPO)，骨诱导因子，巨噬细胞-CSF(M-CSF)，粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)，粒细胞CSF(G-CSF)，白血病抑制因子(LIF)，kit配体(KL)和/或其部分和/或组合。在一些实施方式中，免疫调节剂是细胞因子，且所述细胞因子是IL-2，IL-4，IL-12，IFN-γ，TNF-α或GM-CSF。
中，细胞因子选自IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-
11，IL-12，IL-15，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，肿瘤坏死因子(TNF)-α，TNF-β，人类生长激素，N-甲硫基人生长激素，甲状旁腺激素，甲状腺素，胰岛素，胰岛素原，松弛素，松弛素原，糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)，肝生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，催乳激素，胎盘乳原，肿瘤坏死因子-α和-β，缪勒抑制剂，小鼠促性腺激素相关肽，抑制素，激活素，血管内皮生长因子(VEGF)，整联蛋白，血小板生成素(TPO)，神经生长因子(NGF)-β，血小板生长因子，转化生长因子(TGF)-α，TGF-β，胰岛素样生长因子(IGF)-1，IGF-2，促红细胞生成素(EPO)，骨诱导因子，巨噬细胞-CSF(M-CSF)，粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)，粒细胞CSF(G-CSF)，白血病抑制因子(LIF)，kit配体(KL)和/或其部分和/或组合。在一些实施方式中，免疫调节剂是细胞因子，且所述细胞因子是IL-2，IL-4，IL-12，IFN-γ，TNF-α或GM-CSF。
[0015] 在一些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫调节剂特异性结合选自以下的分子：CD25、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28 VISTA、ICOS、ICOS-L、CD27、CD30、STING和A2A腺苷受体。在一些实施方式中，免疫调节剂是抗体或其抗原结合片段，小分子或多肽。在一些实施方式中，所述免疫调节剂选自：尼莫单抗(nivolumab)，派姆单抗(pembrolizumab)，匹利珠单抗(pidilizumab)，MK-3475，BMS-936559，MPDL3280A，伊匹木单抗(ipilimumab)，特姆单抗(tremelimumab)，IMP31，BMS-986016，乌鲁单抗(urelumab)，TRX518，达昔妥珠单抗(dacetuzumab)，鲁卡妥姆单抗(lucatumumab)，SEQ-
CD40，CP-870，CP-893，MED16469，MED14736，MOXR0916，AMP-224和MSB001078C，或是其抗原结合片段。
CD40，CP-870，CP-893，MED16469，MED14736，MOXR0916，AMP-224和MSB001078C，或是其抗原结合片段。
[0017] 在一些实施方式中，抗癌剂是抗体或其抗原结合片段，小分子或多肽。在一些实施方式中，抗癌剂选自5-氟尿嘧啶/亚叶酸(leukovorin)，奥沙利铂，伊立替康，雷戈非尼，齐夫-阿非普西，卡培他滨，顺铂，紫杉醇，托普替康，卡铂，吉西他滨，多西他赛，5-FU，异环磷酰胺，丝裂霉素，培美曲塞，长春瑞滨，卡莫司汀韦格(carmustine wager)，替莫唑胺，甲氨蝶呤，卡巴他滨，拉帕替尼，依托泊苷，达布拉非尼，维拉非尼，脂质体阿糖胞苷，阿糖胞苷，干扰素α，厄洛替尼，长春新碱，环磷酰胺，洛美霉素，普罗卡巴嗪，舒尼替尼，索马他汀，阿霉素，聚乙二醇化脂质体包封的阿霉素，表柔比星，艾瑞布林(eribulin)，结合白蛋白的紫杉醇，伊沙匹隆，磺胺甲基异噁唑(cotrimoxazole)，紫杉烷，长春碱，替西罗莫司，替莫唑胺，苯达莫司汀，口服依托泊苷，依维莫司，奥曲肽，兰瑞肽，达卡巴嗪，梅斯纳，帕唑帕尼，艾瑞布林，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，他莫昔芬，托瑞米芬，放线菌素，西罗莫司，克唑替尼，赛替尼，恩杂鲁胺，醋酸阿比特龙，米托蒽醌，卡巴他赛，氟嘧啶，奥沙利铂，亚叶酸钙，阿法替尼，塞立替尼，吉非替尼，卡波替尼，奥沙利铂和金尿嘧啶。
[0018] 在一些实施方式中，抗癌剂选自：贝伐单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，雷莫昔单抗，伊匹木单抗，利妥昔单抗，曲妥珠单抗，阿多曲妥珠单抗美坦，培妥珠单抗，尼古鲁单抗，拉帕替尼，达拉非尼，维拉非尼，厄洛替尼，舒尼替尼，帕唑帕尼，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，克唑替尼，赛替尼，阿法替尼，阿西替尼，贝伐单抗，博舒替尼，卡博替尼，阿法替尼，吉非替尼，替西罗莫司，依维莫司，西罗莫司，依鲁替尼，伊马替尼，乐伐替尼，奥拉帕尼，帕博西尼，鲁索替尼，曲美替尼，凡德他尼或维莫德吉或其抗原结合片段。
[0020] 其中：
[0021] L是接头；
[0022] Q是使染料附连至靶向分子的反应性基团；
[0023] R2、R3、R7和R8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0024] R4、R5、R6、R9、R10和R11各自独立地选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烷酰基，任选取代的烷氧羰基，任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中R4、R5、R6、R9、R10和R11中至少一个包含水可溶性基团；
[0025] R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22和R23各自独立地选自氢，卤素，任选取代的烷硫基，任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基；且
[0026] X2和X3各自独立地是C1–C10亚烷基，其任选被杂原子中断。
[0027] 在一些实施方式中，酞菁染料包含下式：
[0028]
[0029] ，其中：
[0030] X1和X4各自独立地是C1-C10亚烷基，其任选被杂原子中断；
[0031] R2、R3、R7和R8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0032] R4、R5、R6、R9、R10和R11各自独立地选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烷酰基，任选取代的烷氧羰基，任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中R4、R5、R6、R9、R10和R11中至少一个包含水可溶性基团；且
[0033] R16、R17、R18和R19各自独立地选自氢，卤素，任选取代的烷硫基，任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基。
[0034] 在一些实施方式中，酞菁染料包括IRDye 700DX(IR700)。
[0035] 在一些实施方式中，靶向分子是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体是抗原结合片段，其是Fab，单VH结构域，单链可变片段(scFv)，多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。
[0036] 在一些实施方式中，病灶是癌前异常结构，原位癌，赘生物，增生性肿瘤或与癌症相关的肿瘤。
[0037] 在一些实施方式中，本文还提供了包含本文所述的任何双重偶联物的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
[0039] 在一些实施方式中，本文还提供了一种治疗对象的病灶的方法，包括向该对象给予治疗有效量的权利要求1-43中任一项所述的双重偶联物或权利要求44或权利要求45所
述的组合物或权利要求46所述的试剂盒；和，在给予所述偶联物之后，以一定波长照射病灶以诱导偶联物的光毒性活性。
述的组合物或权利要求46所述的试剂盒；和，在给予所述偶联物之后，以一定波长照射病灶以诱导偶联物的光毒性活性。
[0040] 在一些实施方式中，病灶在500nm-900nm(含端值)的波长以至少1J cm-2或1J/cm纤维长度的剂量进行。在一些实施方式中，对病灶的照射在600nm-850nm的波长进行。在一些实施方式中，对病灶的照射在690±50nm的波长或在约690±20nm的波长进行。在一些实施
方式中，对病灶的照射以从或从约2J cm-2至约400J cm-2或从或从约2J/cm纤维长度至约
500J/cm纤维长度的剂量进行。
方式中，对病灶的照射以从或从约2J cm-2至约400J cm-2或从或从约2J/cm纤维长度至约
500J/cm纤维长度的剂量进行。
[0041] 在一些实施方式中，对病灶的照射以至少或至少约2J cm-2、5J cm-2、10J cm-2、25J cm-2、50J cm-2、75J cm-2、100J cm-2、150J cm-2、200J cm-2、300J cm-2、400J cm-2或500J cm-2的剂量进行；或，对病灶的照射以至少或至少约2J/cm纤维长度、5J/cm纤维长度、10J/cm纤维长度、25J/cm纤维长度、50J/cm纤维长度、75J/cm纤维长度、100J/cm纤维长度、150J/cm纤维长度、200J/cm纤维长度、250J/cm纤维长度、300J/cm纤维长度、400J/cm纤维长度或500J/cm纤维长度的剂量进行。
[0042] 在一些实施方式中，病灶是肿瘤或与癌症有关的肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤是肉瘤或癌。在一些实施方式中，所述肿瘤是鳞状细胞癌，基底细胞癌或腺癌的癌。在一些实施方式中，肿瘤是癌，其是膀胱，胰腺，结肠，卵巢，肺，乳腺，胃，前列腺，子宫颈，食道或头颈的癌。在一些实施方式中，所述癌是位于头颈部，乳腺，肝，结肠，卵巢，前列腺，胰腺，脑，子宫颈，骨，皮肤，眼，膀胱，胃，食道，腹膜或肺的癌。
[0043] 在一些实施方式中，对病灶的照射在给予所述方法之后约30分钟-约96小时进行。
[0044] 在一些实施方式中，双重偶联物以如下剂量给予：从或从约50mg/m2至约5000mg/2 2 2 2 2 2
m ，从约250mg/m 至约2500mg/m ，从约750mg/m 至约1250mg/m ，或从约100mg/m 至约
1000mg/m2。
m ，从约250mg/m 至约2500mg/m ，从约750mg/m 至约1250mg/m ，或从约100mg/m 至约
1000mg/m2。
[0046] 在一些实施方式中，靶向的病灶包括神经元，并且所述疾病、紊乱或病症是神经障碍，其任选地包括疼痛。在一些实施方式中，靶向的病灶包括脂肪细胞(fat cell)或脂细胞(adipocyte)，并且所述疾病、紊乱或病症包括过量的脂肪。在一些实施方式中，靶向的病灶包括病原体感染的细胞，并且所述疾病、紊乱或病症包括感染。在一些实施方式中，靶向的病灶包括炎性细胞，并且所述疾病、紊乱或病症包括炎症。附图说明
[0047] 图1A显示使用西妥昔单抗-IRDye 700DX在A431和FaDu细胞中进行PIT处理对细胞外溶液中检测到的HMGB1的量的作用。
[0048] 图1B显示了与通过西妥昔单抗-IRDye 700DX进行PIT的肿瘤共培养的未成熟树突细胞(iDC)上的树突细胞(DC)成熟标志物的上调。
[0049] 图1C显示通过与PIT处理的A431或FaDu细胞(用西妥昔单抗-IRDye 700DX处理并在光照射下)或与非PIT处理的A431或FaDu细胞(用西妥昔单抗-IRDye 700DX处理但没有光
照射)共培养活化抗原呈递细胞的作用，如通过对THP-1细胞上示例性活化标志物CD86的表
达所评估。
照射)共培养活化抗原呈递细胞的作用，如通过对THP-1细胞上示例性活化标志物CD86的表
达所评估。
[0050] 图2显示了对于通过用PIT处理的肿瘤细胞(用西妥昔单抗-IRDye 700DX处理)或非PIT处理的肿瘤细胞(用西妥昔单抗-IRDye 700DX处理但无光照射)引发树突细胞，然后
用免疫调节剂(多聚I:C)使其刺激而进行的树突细胞活化的作用，如示例性活化标志物
CD80和CD86的表达评估。
用免疫调节剂(多聚I:C)使其刺激而进行的树突细胞活化的作用，如示例性活化标志物
CD80和CD86的表达评估。
[0051] 图3A显示了IFNγ处理对BxPC3细胞死亡百分比的作用。
[0052] 图3B显示了IFNγ处理对BxPC3细胞中PD-L1表达的作用。
[0053] 图3C显示IFNγ处理对BxPC3细胞中抗PD-L1 IRDye 700DX PIT杀伤活性的作用。
具体实施方式
[0054] 本文提供了偶联物，例如双重偶联物，其包含光敏剂，例如酞菁染料，例如IR700，与细胞表面分子结合的靶向分子(例如，抗体或抗体的抗原结合片段)，以及治疗剂。还提供了使用本文提供的偶联物的组合物，制品，试剂盒和方法。
[0055] 光免疫疗法(PIT)是一种分子靶向疗法，利用基于酞菁染料(例如近红外(NIR)酞菁染料(例如IR700))的靶标特异性光敏剂，其与靶向蛋白质(例如疾病、紊乱或病症中的细胞(例如肿瘤中细胞)上的细胞表面分子)的靶向分子偶联。例如，在一些情况下，用于光免疫疗法的酞菁染料偶联物可包括与靶向细胞表面分子受体或疾病病灶环境中细胞上表达
的受体的单克隆抗体(mAb)的偶联，所述环境例如肿瘤微环境(TME)，其可包括肿瘤细胞和
其它细胞，例如免疫细胞。在一些实施方式中，通过用吸收光(例如NIR光)照射来活化染料偶联物，激发光敏剂并导致细胞杀伤，从而减少或消除病灶(例如肿瘤)并治疗疾病、紊乱或病症。在一些情况下，使用NIR范围内的光会导致更深的组织穿透，从而仅需单次外部NIR光照射即可成功根除肿瘤。
的受体的单克隆抗体(mAb)的偶联，所述环境例如肿瘤微环境(TME)，其可包括肿瘤细胞和
其它细胞，例如免疫细胞。在一些实施方式中，通过用吸收光(例如NIR光)照射来活化染料偶联物，激发光敏剂并导致细胞杀伤，从而减少或消除病灶(例如肿瘤)并治疗疾病、紊乱或病症。在一些情况下，使用NIR范围内的光会导致更深的组织穿透，从而仅需单次外部NIR光照射即可成功根除肿瘤。
[0056] 靶向的光毒性通常主要取决于染料偶联物通过特异性靶向分子(例如抗体)与细胞膜的结合。例如，使用示例性抗体-IR700分子进行的研究表明，偶联物必须结合到细胞膜上才具有活性，并且细胞杀伤不需要有效的细胞内定位(参见例如，美国专利号8,524,239
和已公开的申请号US20140120119)。偶联物结合的细胞的光活化会导致快速细胞死亡和坏
死。
和已公开的申请号US20140120119)。偶联物结合的细胞的光活化会导致快速细胞死亡和坏
死。
[0057] 通常，PIT会导致主要是用NIR照射后酞菁染料偶联物(例如IR700-抗体偶联物)与之结合的那些细胞的细胞死亡，而那些不表达被靶向分子(例如抗体)识别的细胞表面分子
的细胞不被显著杀伤。因此，因为该疗法特异性靶向疾病细胞，例如肿瘤细胞，所以相比对于健康组织或细胞而言，其作用对于疾病组织具有高度选择性。例如，尽管靶向光敏剂可以分布在全身，但其仅在施用强光处才有活性，从而降低了脱靶效应的可能性。这与非PIT型方法不同，在非PIT型方法中，无法定位未与光敏剂偶联的用作治疗剂(例如治疗性抗体)的类似靶向分子的活性，从而导致脱靶副作用的重大风险。因此，PIT是特异性靶向和杀伤疾病细胞或靶病灶但基本上不影响健康细胞的有效方法。
的细胞不被显著杀伤。因此，因为该疗法特异性靶向疾病细胞，例如肿瘤细胞，所以相比对于健康组织或细胞而言，其作用对于疾病组织具有高度选择性。例如，尽管靶向光敏剂可以分布在全身，但其仅在施用强光处才有活性，从而降低了脱靶效应的可能性。这与非PIT型方法不同，在非PIT型方法中，无法定位未与光敏剂偶联的用作治疗剂(例如治疗性抗体)的类似靶向分子的活性，从而导致脱靶副作用的重大风险。因此，PIT是特异性靶向和杀伤疾病细胞或靶病灶但基本上不影响健康细胞的有效方法。
[0058] 光免疫疗法方法需要改进的策略，例如，以提高治疗功效，以及其它治疗剂的高效递送和靶向。例如，PIT的功效可由病灶(例如肿瘤)的免疫抑制环境而降低。肿瘤微环境(TME)通常具有免疫抑制作用，并且可抑制或阻碍免疫细胞的抗肿瘤活性。通过将可协助克服此类环境的其它治疗剂靶向特定部位，例如病灶部位或与疾病、紊乱或病症相关的病灶
部位，本文提供的偶联物和方法可增强PIT的功效。
部位，本文提供的偶联物和方法可增强PIT的功效。
[0059] 癌细胞含有应被免疫系统识别的肿瘤特异性抗原。通常，在主动免疫系统中，免疫细胞(例如细胞毒性T细胞)可攻击、杀伤和/或根除这些癌细胞。在正常生理条件下，T细胞介导的免疫应答是由T细胞受体(TCR)的抗原识别引发的，并且由共刺激和抑制信号(例如免疫检查点蛋白)的平衡调节。具体地，表达TCR的CD4+和CD8+ T细胞可在分别识别主要组
织相容性复合物(MHC)I类或II类分子上的抗原呈递细胞上呈递的抗原性肽后被活化。在一
些方面中，活化的CD8+细胞或细胞毒性T细胞可杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，这可由CD4+ T细胞的存在而得到协助。在一些实施方式中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方式
中，免疫细胞是树突细胞。
织相容性复合物(MHC)I类或II类分子上的抗原呈递细胞上呈递的抗原性肽后被活化。在一
些方面中，活化的CD8+细胞或细胞毒性T细胞可杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，这可由CD4+ T细胞的存在而得到协助。在一些实施方式中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方式
中，免疫细胞是树突细胞。
[0060] 但是，在例如肿瘤的病灶的情况下，TME具有抑制免疫系统的机制，从而逃避了免疫识别并防止或减少了肿瘤细胞的杀伤。例如，在一些情况下，免疫检查点蛋白可能在肿瘤中失调，从而导致TME中的免疫反应受到抑制，作为逃避了免疫系统的机制。在一些情况下，其它机制可以起到抑制免疫细胞接近肿瘤抗原的作用，从而也有助于肿瘤逃避免疫系统的
能力。在一些情况下，现有的肿瘤疗法可能不足以解决TME的免疫抑制方面。
能力。在一些情况下，现有的肿瘤疗法可能不足以解决TME的免疫抑制方面。
[0061] 在一些情况下，可使用采用PIT试剂(例如酞菁染料-抗体偶联物)和其它疗法(例如免疫调节剂或抗癌剂)的联合疗法来解决TME的一些免疫抑制作用并提高PIT的功效。然
而，在一些情况下，其它治疗剂不靶向病灶部位或微环境。因此，联合疗法的功效可能会因在病灶部位缺乏其它治疗剂的可利用性而降低。例如，一般或全身性给予的抗癌剂可能在
肿瘤部位处缺乏利用度以供TME中的肿瘤细胞立即摄取。
而，在一些情况下，其它治疗剂不靶向病灶部位或微环境。因此，联合疗法的功效可能会因在病灶部位缺乏其它治疗剂的可利用性而降低。例如，一般或全身性给予的抗癌剂可能在
肿瘤部位处缺乏利用度以供TME中的肿瘤细胞立即摄取。
[0062] 在一些方面，所提供的双重偶联物利用由PIT诱导的细胞毒性杀伤和/或裂解作用来增强与肿瘤治疗有关的治疗结果，并且可以利用靶向分子与病灶的微环境中存在的细胞
表面分子(例如肿瘤抗原)的结合来特异性靶向递送其它治疗剂并最大化治疗剂和/或PIT
的治疗功效。在特定方面，双重偶联物包含可被靶向或递送至病灶部位或微环境的一种或
多种治疗剂。在一些实施方式中，此类治疗剂包括免疫调节剂，其可加强或增强TME中免疫细胞的活性。在其它实施方式中，此类治疗剂包括抗癌剂。因此，本文提供的双重偶联物可以有效且高效地激活疾病细胞的特异性杀伤，而且还提供与疾病相关的病灶部位的免疫活
性或抗癌活性的加强或增强。
表面分子(例如肿瘤抗原)的结合来特异性靶向递送其它治疗剂并最大化治疗剂和/或PIT
的治疗功效。在特定方面，双重偶联物包含可被靶向或递送至病灶部位或微环境的一种或
多种治疗剂。在一些实施方式中，此类治疗剂包括免疫调节剂，其可加强或增强TME中免疫细胞的活性。在其它实施方式中，此类治疗剂包括抗癌剂。因此，本文提供的双重偶联物可以有效且高效地激活疾病细胞的特异性杀伤，而且还提供与疾病相关的病灶部位的免疫活
性或抗癌活性的加强或增强。
[0063] 在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，治疗剂是抑制免疫抑制信号转导或增强免疫刺激信号转导的免疫调节剂。例如，抑制性检查点蛋白拮抗剂和/或共刺激受体激动剂可以通过放大抗原特异性T细胞应答来刺激宿主的内源性抗肿瘤免疫反应。在所提供
的双重偶联物和相关方法的方面，还可以进行光免疫疗法，其可以导致肿瘤细胞的杀伤，从而释放肿瘤抗原并增强抗肿瘤免疫应答。通过用包含免疫调节剂的双重偶联物进行光免疫
疗法，PIT诱导的抗原的释放可以为其应答已被免疫调节剂放大或刺激的T细胞提供抗原刺
激源。在一些方面，在使用免疫调节剂进行治疗后产生的增强的免疫应答被引发，且将对
PIT之后细胞裂解后暴露的肿瘤抗原产生应答。因此，在一些方面，本文提供的双重偶联物解决了可能存在于肿瘤微环境中的天然逃逸机制，以提供针对肿瘤的更强健的免疫应答，
同时还通过光解机制杀伤肿瘤细胞。
的双重偶联物和相关方法的方面，还可以进行光免疫疗法，其可以导致肿瘤细胞的杀伤，从而释放肿瘤抗原并增强抗肿瘤免疫应答。通过用包含免疫调节剂的双重偶联物进行光免疫
疗法，PIT诱导的抗原的释放可以为其应答已被免疫调节剂放大或刺激的T细胞提供抗原刺
激源。在一些方面，在使用免疫调节剂进行治疗后产生的增强的免疫应答被引发，且将对
PIT之后细胞裂解后暴露的肿瘤抗原产生应答。因此，在一些方面，本文提供的双重偶联物解决了可能存在于肿瘤微环境中的天然逃逸机制，以提供针对肿瘤的更强健的免疫应答，
同时还通过光解机制杀伤肿瘤细胞。
[0064] 本文提供的双重偶联物和使用双重偶联物的方法解决了肿瘤的免疫逃逸机制，以提供针对肿瘤的更强健的免疫应答，同时还通过光解机制特异性靶向肿瘤细胞，并且还允
许将任何其它治疗剂的特异性靶向以高效地递送到肿瘤部位。通过将肿瘤细胞的特异性光
毒性杀伤和治疗剂(例如免疫调节剂或抗癌剂)的高效递送结合到病灶部位或微环境，本文
提供的双重偶联物和相关方法可提高肿瘤治疗的功效和安全性，且在一些情况下，增加被
治疗对象的治疗效果或生存率。
许将任何其它治疗剂的特异性靶向以高效地递送到肿瘤部位。通过将肿瘤细胞的特异性光
毒性杀伤和治疗剂(例如免疫调节剂或抗癌剂)的高效递送结合到病灶部位或微环境，本文
提供的双重偶联物和相关方法可提高肿瘤治疗的功效和安全性，且在一些情况下，增加被
治疗对象的治疗效果或生存率。
[0065] 例如，与其中全身性递送治疗剂并需要分开给予治疗剂的联合治疗方法相反，本发明方法允许将其它治疗剂快速且有效地递送至病灶部位或微环境，并减少达到治疗效果
所需的任何迟滞时间。因为其它治疗剂，例如免疫调节剂或抗癌剂，可用于直接和立即摄取进入肿瘤空间中，所以对治疗剂的治疗反应可以最大化，特别是利用PIT的活化。在一些实施方式中，与涉及采用PIT的治疗或采用其它治疗剂的治疗的方法相比，双重偶联物疗法的增强的治疗结果可导致肿瘤大小(例如，肿瘤体积或重量)的减幅增加或对象的存活增加或
延长。因此，在一些实施方式中，与涉及采用酞菁染料-偶联物/PIT的治疗或涉及其它治疗剂的治疗(例如仅使用免疫调节剂或仅使用抗癌剂的治疗)的方法相比，双重偶联物的治疗
效果可以是协同的。
所需的任何迟滞时间。因为其它治疗剂，例如免疫调节剂或抗癌剂，可用于直接和立即摄取进入肿瘤空间中，所以对治疗剂的治疗反应可以最大化，特别是利用PIT的活化。在一些实施方式中，与涉及采用PIT的治疗或采用其它治疗剂的治疗的方法相比，双重偶联物疗法的增强的治疗结果可导致肿瘤大小(例如，肿瘤体积或重量)的减幅增加或对象的存活增加或
延长。因此，在一些实施方式中，与涉及采用酞菁染料-偶联物/PIT的治疗或涉及其它治疗剂的治疗(例如仅使用免疫调节剂或仅使用抗癌剂的治疗)的方法相比，双重偶联物的治疗
效果可以是协同的。
[0066] I.用于光免疫疗法的双重偶联物
[0067] 本文提供了偶联物，例如双重偶联物，其包含光敏剂(例如酞菁染料，例如IR700)，与细胞表面分子结合的靶向分子(例如，抗体或抗体的抗原结合片段)，以及治疗剂。在一些实施方式中，双重偶联物包含酞菁染料、靶向分子和治疗剂。
[0068] 在一些实施方式中，靶向分子能够在病灶的微环境中结合细胞上的细胞表面分子。在一些实施方式中，双重偶联物中靶分子与细胞表面分子的结合允许该双重偶联物靶
向疾病、紊乱或病症(例如肿瘤或癌症、感染、炎性疾病或病症、神经元疾病或病症，或其它疾病或病症)中涉及的细胞。在一些实施方式中，靶向细胞(例如，表达能够被靶向分子结合的细胞表面分子的细胞)存在于与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境中，例如，所述细胞存在于肿瘤微环境中。在一些实施方式中，细胞靶向提高了在以酞菁染料吸收的波长(例如，近红外(NIR)波长)对对象的病灶(例如，肿瘤)进行局部照射后诱导的光免疫疗法(PIT)的功效，因为细胞杀伤对与双重偶联物结合的细胞具有选择性。
向疾病、紊乱或病症(例如肿瘤或癌症、感染、炎性疾病或病症、神经元疾病或病症，或其它疾病或病症)中涉及的细胞。在一些实施方式中，靶向细胞(例如，表达能够被靶向分子结合的细胞表面分子的细胞)存在于与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境中，例如，所述细胞存在于肿瘤微环境中。在一些实施方式中，细胞靶向提高了在以酞菁染料吸收的波长(例如，近红外(NIR)波长)对对象的病灶(例如，肿瘤)进行局部照射后诱导的光免疫疗法(PIT)的功效，因为细胞杀伤对与双重偶联物结合的细胞具有选择性。
[0069] 在一些实施方式中，双重偶联物包含治疗剂，例如免疫调节剂或抗癌剂。在一些实施方式中，例如通过靶向分子与细胞表面分子的结合，将治疗剂靶向或递送至病灶部位。在一些实施方式中，治疗剂通过可释放或可裂解的接头与酞菁染料或靶向分子连接，并且所述接头的释放或裂解允许治疗剂从双重偶联物释放。因此，可将治疗剂靶向或直接递送至
涉及疾病、紊乱或病症的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境中。
涉及疾病、紊乱或病症的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境中。
[0070] 在一些实施方式中，双重偶联物包括以下组分：(酞菁染料)n，(靶向分子)q和(治疗剂)m，其中：n、q和m独立选择，至少为1。在实施例中，独立选择的n和q在1与10之间，例如在1与9之间，在1与8之间，在1与7之间，在1与6之间，在1与5之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方式中，独立选择的n和q为1-5。在实施例中，独立选择的n和m在1与10之间，例如在1与9之间，在1与8之间，在1与7之间，在1与6之间，在1与5之间，例如1、2、3、4、5、
6、7、8、9或10。在一些实施方式中，独立选择的n和m为1-5。在某些实施方式中，q为1，n为1-
100，并且m为1-5。在一些实施方式中，n与q的比率为或约为1至约1000，或为或约为1至约
10，或为或约为2至约5。在一些实施方式中，靶向分子与酞菁染料的接触以染料与靶向分子的如下摩尔比进行：1:1至100:1或1:1至10:1。在一些实施方式中，染料与靶向分子的摩尔比为至少或至少约4:1或至少或至少约10:1。在一些实施方式中，双重偶联物包含从或从约
1至约1000个酞菁染料分子/靶向分子，从或从约1至约10个酞菁染料分子/靶向分子，或从
或从约2至约5个酞菁染料分子/靶向分子。在一些实施方式中，m与q的比率为从或从约1至
约10或从或从约2至约5。
6、7、8、9或10。在一些实施方式中，独立选择的n和m为1-5。在某些实施方式中，q为1，n为1-
100，并且m为1-5。在一些实施方式中，n与q的比率为或约为1至约1000，或为或约为1至约
10，或为或约为2至约5。在一些实施方式中，靶向分子与酞菁染料的接触以染料与靶向分子的如下摩尔比进行：1:1至100:1或1:1至10:1。在一些实施方式中，染料与靶向分子的摩尔比为至少或至少约4:1或至少或至少约10:1。在一些实施方式中，双重偶联物包含从或从约
1至约1000个酞菁染料分子/靶向分子，从或从约1至约10个酞菁染料分子/靶向分子，或从
或从约2至约5个酞菁染料分子/靶向分子。在一些实施方式中，m与q的比率为从或从约1至
约10或从或从约2至约5。
[0071] 在一些实施方式中，双重偶联物包含多个染料残基/靶向分子，即，从或从约1至约1000，例如从或从约1至约100，从或从约1至约50，从或从约1至约25，从或从约1至约10，从或从约1至约5。在一些实施方式中，染料分子与靶向分子的比率是或约是2:1、3:1、4:1、5:
1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、
450:1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，靶向分子可包含多达2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、
800、850、900、950或1000个染料分子。在一些实施方式中，靶向分子可包含超过1000个染料分子或少于10个染料分子。
1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、
450:1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，靶向分子可包含多达2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、
800、850、900、950或1000个染料分子。在一些实施方式中，靶向分子可包含超过1000个染料分子或少于10个染料分子。
[0072] 在一些实施方式中，双重偶联物包含多个治疗剂/靶向分子，即，从或从约1至约100，例如从或从约1至约50，从或从约1至约25，从或从约1至约10，从或从约1至约5。在一些实施方式中，治疗剂与靶向分子的比率是或约是2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、
50:1、75:1或100:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，靶向分子可包含多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、75或100个治疗剂。在一些实施方式中，靶向分子可包含超过100个治疗剂或少于10个治疗剂。
50:1、75:1或100:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，靶向分子可包含多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、75或100个治疗剂。在一些实施方式中，靶向分子可包含超过100个治疗剂或少于10个治疗剂。
[0073] 在一些实施方式中，双重偶联物包含多个染料残基/治疗剂，即，从或从约1至约1000，例如从或从约1至约100，从或从约1至约50，从或从约1至约25，从或从约1至约10，从或从约1至约5。在一些实施方式中，染料分子与治疗剂的比率是或约是2:1、3:1、4:1、5:1、
10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:
1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，治疗剂可包含多达2、3、4、5、6、7、8、9、
10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、950或1000个染料分子。在一些实施方式中，治疗剂可包含超过1000个染料分子或少于10个染料分子。
10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:
1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，治疗剂可包含多达2、3、4、5、6、7、8、9、
10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、950或1000个染料分子。在一些实施方式中，治疗剂可包含超过1000个染料分子或少于10个染料分子。
[0074] 在一些实施方式中，双重偶联物包含多个治疗剂/染料分子，即，从或从约1至约1000，例如从或从约1至约100，从或从约1至约50，从或从约1至约25，从或从约1至约10，从或从约1至约5。在一些实施方式中，治疗剂与染料分子的比率是或约是2:1、3:1、4:1、5:1、
10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:
1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，染料分子可包含多达2、3、4、5、6、7、8、
9、10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、950或1000个染料治疗剂。在一些实施方式中，染料分子可包含超过1000个治疗剂或少于10个治疗剂。
10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:
1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1，或在或约在这些数值中任何两个之间。在一些实施方式中，染料分子可包含多达2、3、4、5、6、7、8、
9、10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、950或1000个染料治疗剂。在一些实施方式中，染料分子可包含超过1000个治疗剂或少于10个治疗剂。
[0075] 在一些实施方式中，本文提供的双重偶联物的组分，例如酞菁染料、靶向分子和治疗剂，可以以任何顺序连接，每个连接是直接或间接的。在一些实施方式中，酞菁染料、靶向分子和治疗剂可以通过共价或非共价连接方式连接。在一些实施方式中，连接是可裂解连接。
[0076] 在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，酞菁染料和治疗剂各自独立地与靶向分子连接。例如，在一些实施方式中，双重偶联物按照酞菁染料-靶向分子-治疗剂的顺序包含各组分。在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，靶向分子和治疗剂各自独立地
连接至酞菁染料。例如，在一些实施方式中，双重偶联物按靶向分子-酞菁染料-治疗剂的顺序包含各组分。在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，酞菁染料和靶向分子各自独
立地连接至治疗剂。例如，在一些实施方式中，双重偶联物按靶向分子-治疗剂-酞菁染料的顺序包含各组分。
连接至酞菁染料。例如，在一些实施方式中，双重偶联物按靶向分子-酞菁染料-治疗剂的顺序包含各组分。在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，酞菁染料和靶向分子各自独
立地连接至治疗剂。例如，在一些实施方式中，双重偶联物按靶向分子-治疗剂-酞菁染料的顺序包含各组分。
[0077] 在一些方面，取决于双重偶联物的情况和用途，一种类型的分子，例如能够特异性结合或靶向另一种分子并且还具有治疗性质的分子，可被认为是双重偶联物中的治疗剂组分或靶向分子组分。在一些实施方式中，分子例如抗体或其抗原结合片段或细胞因子可以
是双重偶联物中的靶向分子组分，此外还有不同分子作为双重偶联物中的治疗剂组分。在
一些实施方式中，分子例如抗体或其抗原结合片段或细胞因子可以是双重偶联物中的治疗
剂组分，此外还有不同分子作为双重偶联物中的靶向分子组分。
是双重偶联物中的靶向分子组分，此外还有不同分子作为双重偶联物中的治疗剂组分。在
一些实施方式中，分子例如抗体或其抗原结合片段或细胞因子可以是双重偶联物中的治疗
剂组分，此外还有不同分子作为双重偶联物中的靶向分子组分。
[0078] 在双重偶联物的一些实施方式中，靶向分子(例如，抗体或其抗原结合片段)独立地连接至酞菁染料(例如，IR700)和治疗剂(例如，细胞因子或抗癌剂)。在一些实施方式中，示例性双重偶联物包含抗HER1-IR700治疗剂，例如西妥昔单抗-IR700-IL-2。
[0079] A.偶联物的组分
[0080] 1.酞菁染料
[0081] 所提供的双重偶联物包含酞菁染料，其可以直接或间接连接至靶向分子或治疗剂中的一或两者。酞菁是具有酞菁环体系的一组光敏剂化合物。酞菁是氮杂卟啉，其包含四个苯并吲哚基团，它们通过氮原子桥连接在具有交替的碳和氮原子的16元环中(即C32H16N8)，其与金属和类金属阳离子形成稳定的螯合物。在这些化合物中，环中心被金属离子(反磁性或顺磁性离子)占据，其可根据该离子携带一个或两个配体。另外，环的外围可以是未取代或取代的。国际公开WO 2005/099689和美国专利号7,005,518中描述了多种酞菁在光动力
疗法中的合成和用途。在一些实施方式中，酞菁染料通过染料分子的反应性基团偶联至靶
向分子和/或治疗剂。
疗法中的合成和用途。在一些实施方式中，酞菁染料通过染料分子的反应性基团偶联至靶
向分子和/或治疗剂。
[0082] 在一些实施方式中，酞菁强烈吸收红色或近红外辐射，吸收峰在约600nm-810nm，这在一些情况下允许此光对组织的深层渗透。酞菁通常是光稳定的。这种光稳定性通常在
颜料和染料以及酞菁的许多其它应用中是有利的。
颜料和染料以及酞菁的许多其它应用中是有利的。
[0083] 在一些实施方式中，酞菁染料是水溶性的，并且包含具有至少一个水性增溶部分的发光荧光团部分。在一些实施方式中，水性增溶部分包含硅。在一些实施方式中，酞菁染料具有核心原子，例如Si、Ge、Sn或Al。在一些实施方式中，酞菁染料以单核异构体的形式存在，基本不含其它异构体。在一些实施方式中，酞菁染料包含具有反应性或可活化基团的接头，其能够在接头和靶向分子之间形成键。在一些实施方式中，酞菁染料可经调整以在特定波长下发荧光。
[0084] 在一些实施方式中，酞菁染料包含接头，即，是接头-酞菁染料部分(L-D)。在一些实施方式中，接头包含反应性基团。在一些实施方式中，酞菁染料具有式Ia：
[0085]
[0086] (Ia)
[0087] 其中：
[0088] L选自直接连接或共价连接；
[0089] Q是为反应性基团或可活化基团，其可为接头L的部分，且为可反应以在L与靶向分子A之间形成键的任何基团；
[0090] R2、R3、R7和R8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0091] R4、R5、R6、R9、R10和R11存在时各自独立地选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烷酰基，任选取代的烷氧羰基，任选取代的烷基氨基甲酰基或螯合配体，其中R4、R5、R6、R9、R10和R11中至少一个包含水可溶性基团；
[0092] R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22和R23各自是官能团，其可独立地选自氢，卤素，任选取代的烷硫基，任选取代的烷基氨基或任选取代的烷氧基；
[0093] 或者，在替代性实施方式中，i)R13和R14中至少一者和其连接的碳，或ii)R17和R18中至少一者和其连接的碳，或iii)R21和R22中至少一者和其连接的碳接合形成稠合环；和
[0094] X2和X3各自独立地是C1–C10亚烷基，其任选被杂原子中断。
[0095] 在一些实施方式中，L是共价连接。在一些实施方式中，共价连接是直链或支化的，环状或杂环的，饱和或不饱和的，具有1-60个原子，例如1-45个原子或1-25个原子。在一些情况下，这样的原子可选自C、N、P、O和S。在一些实施方式中，L可具有其它氢原子以补价(除了1-60个原子以外)。所述连接一般包含以下的任何组合：醚，硫醚，胺，酯，氨基甲酸酯，脲，硫脲，氧或酰胺键；或者，单，双，三或芳族碳-碳键；或磷-氧，磷-硫，氮-氮，氮-氧或氮-铂键；或芳族或杂芳族键。
[0096] 在一些实施方式中，L具有式–R1-Y-X1-Y1–，其中R1为二价基团或直接连接；Y和Y1各自独立地选自t直接连接，氧，任选取代的氮或硫；且X1选自t直接连接和C1-C10亚烷基(任选被原子中断)。二价基团包括但不限于，任选取代的亚烷基，任选取代的亚烷基氧羰基，任选取代的亚烷基氨基甲酰基，任选取代的亚烷基磺酰基，和任选取代的亚芳基。
[0097] 示例性的R1取代基包括但不限于，任选取代的亚烷基，任选取代的亚烷基氧羰基，任选取代的亚烷基氨基甲酰基，任选取代的亚烷基磺酰基，任选取代的亚烷基磺酰基氨基甲酰基，任选取代的亚芳基，任选取代的亚芳基磺酰基，任选取代的亚芳基氧羰基，任选取代的亚芳基氨基甲酰基，任选取代的亚芳基磺酰基氨基甲酰基，任选取代的羧基烷基，任选取代的氨基甲酰基，任选取代的羰基，任选取代的杂亚芳基，任选取代的杂亚芳基氧羰基，任选取代的杂亚芳基氨基甲酰基，任选取代的杂亚芳基磺酰基氨基甲酰基，任选取代的磺
酰基氨基甲酰基，任选取代的硫代羰基，任选取代的磺酰基和任选取代的亚磺酰基。
酰基氨基甲酰基，任选取代的硫代羰基，任选取代的磺酰基和任选取代的亚磺酰基。
[0098] 在一些实施方式中，Q包含反应性基团，用于任选地连接至物质，例如靶向分子。如本文所用，术语“反应性基团”是指化合物上能够与不同物质(例如，靶向分子)上的官能团化学反应以形成连接，例如共价连接的部分。通常，反应性基团是亲电试剂或亲核试剂，其可以通过分别暴露于相应的官能团即亲核试剂或亲电试剂而形成共价连接。或者，反应性基团是可光活化的基团，并且仅在用合适波长的光照射后才变为化学反应性。反应性染料
与待偶联的靶向分子之间的偶联反应通常导致反应基团Q的一个或多个原子纳入新的连接
中，其将染料附连至偶联的靶向分子和/或治疗剂。
与待偶联的靶向分子之间的偶联反应通常导致反应基团Q的一个或多个原子纳入新的连接
中，其将染料附连至偶联的靶向分子和/或治疗剂。
[0099] 在一些实施方式中，Q包含与靶向分子上的羧基，胺或巯基具有反应性的反应性基团。合适的反应性基团包括但不限于，活化的酯，酰基卤，烷基卤，酸酐，羧酸，碳二亚胺，碳酸盐或酯，氨基甲酸盐或酯，卤乙酰胺(例如碘乙酰胺)，异氰酸酯，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，NHS酯，亚磷酰胺，铂络合物，磺酸酯和硫氰酸酯，供于与靶向分子的任选附连。在一些实施方式中，反应性基团与靶向分子上的羧基，胺或巯基有反应性。在一些实施方式中，反应性基团是硫氢基反应性的化学基团，例如马来酰亚胺，卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。在一些实施方式中，反应性基团是胺反应性的。在一些实施方式中，反应性基团是NHS酯。
[0100] 在一些实施方式中，R2、R3、R7和R8各自为任选取代的烷基，例如任选取代的甲基、乙基或异丙基。
[0101] 在一些实施方式中，R4、R5、R6、R9、R10和R11中的至少一个包含水可溶性基团。例如，R4、R5、R6、R9、R10和R11的烷基部分被水可溶性取代基取代。如本文所用，“水可溶性基团”是指包含一个或多个极性和/或离子取代基的基团，其改善了整个分子在水性介质中的溶解度。在一些情况中，R4、R5、R6、R9、R10和R11中的至少两个包含水可溶性基团。在其它实施方式中，三个或更多个包含水可溶性基团。水可溶性基团包括但不限于羧酸酯(—CO2-)基团，磺酸酯(—SO3-)基团，磺酰基(—SO2-)基团，硫酸酯(—SO4-2)基团，羟基(—OH)基团，磷酸酯(—OPO3-2)基团，膦酸酯(—PO3-2)基团，胺(—NH2)基团和任选取代的季铵化氮，各自具有任选的抗衡离子。
[0102] 合适的抗衡离子包括但不限于钠，钾，钙，铵，有机氨基盐或镁盐或类似的盐。优选地，抗衡离子是生物学上可接受的抗衡离子。
[0103] 在一些实施方式中，与R4、R5、R6、R9、R10和R11连接的氮原子可以是三价或四价的。
[0104] 在一些实施方式中，R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22和R23各自为氢。
[0105] 在一些实施方式中，X2和X3各自独立地选自C1-C10亚烷基，其任选地被原子中断。在2 3
一些实施方式中，附接到X和/或X的氮可任选地被季铵化。
一些实施方式中，附接到X和/或X的氮可任选地被季铵化。
[0106] 在一些实施方式中，酞菁染料具有式Ib：
[0107]
[0108] (Ib)
[0109] 其中，
[0110] X1和X4各自独立地是C1-C10亚烷基，其任选被杂原子中断；和
[0111] R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R16、R17、R18、R19、X2和X3如本文中定义。
[0112] 在一些实施方式中，反应性基团是NHS酯。在一些实施方式中，可以通过改变NHS酯和氨基甲酸酯官能度之间的X4的亚烷基长度来调节NHS酯的反应性。在一些实施方式中，NHS酯和氨基甲酸酯官能度之间的X4的亚烷基的长度与NHS酯反应性成反比。在一些实施方
式中，X4是C5-亚烷基。在其它实施方式中，X4是C3-亚烷基。在一些实施方式中，X1是C6-亚烷基。在其它实施方式中，X1是C3-亚烷基。
式中，X4是C5-亚烷基。在其它实施方式中，X4是C3-亚烷基。在一些实施方式中，X1是C6-亚烷基。在其它实施方式中，X1是C3-亚烷基。
[0113] 在一些实施方式中，酞菁染料的总电子电荷为零。在某些情况下，可以通过使用一个或多个任选抗衡离子或季铵化的氮获得电荷中性。
[0114] 在一些实施方式中，酞菁染料在水性溶液中具有足够的溶解度，从而一旦其附连至可溶性靶向分子，该靶向分子就保持其溶解度。在一些实施方式中，染料也可溶于有机介质(例如DMSO或DMF)。
[0115] 在一些实施方式中，酞菁染料在近红外(NIR范围)内具有最大的光吸收。在一些实施方式中，酞菁染料具有400nm与900nm之间，例如600nm与850nm之间，例如680nm与850nm之间，例如约690nm±50nm或690±20nm的最大光吸收波长。在一些实施方式中，酞菁染料可通
过以这些波长发射光的市售激光二极管而被高效激发。
过以这些波长发射光的市售激光二极管而被高效激发。
[0116] 在一些实施方式中，含有反应性基团的酞菁染料是IR700 NHS酯，例如IRDye 700DX NHS酯(Li-Cor 929-70010、929-70011)。因此，在一些实施方式中，染料是具有下式的化合物：
[0117]
[0118] 为了本文的目的，当染料通过其反应性基团与靶向分子偶联时，术语“IR700”，“IRDye 700DX”或其变体是指上式。通常，IR700具有几种有利的化学性质。氨基反应性
IR700是一种相对亲水的染料，可以使用IR700的NHS酯与抗体共价偶联。通常，IR700的消光系数(689nm的最大吸收处为2.1×105M-1cm-1)比传统的光敏剂高超过5倍，所述传统光敏剂
例如血卟啉衍生物 (630nm处为1.2×103M-1cm-1)，间四羟基苯二氢卟酚；
(652nm处为2.2×104M-1cm-1)和单L-天冬氨酰二氢卟酚e6；NPe6/
(654nm处为4.0×104M-1cm-1)。
IR700是一种相对亲水的染料，可以使用IR700的NHS酯与抗体共价偶联。通常，IR700的消光系数(689nm的最大吸收处为2.1×105M-1cm-1)比传统的光敏剂高超过5倍，所述传统光敏剂
例如血卟啉衍生物 (630nm处为1.2×103M-1cm-1)，间四羟基苯二氢卟酚；
(652nm处为2.2×104M-1cm-1)和单L-天冬氨酰二氢卟酚e6；NPe6/
(654nm处为4.0×104M-1cm-1)。
[0119] 本文所述的酞菁染料可用市售可得的起始原料制备。核心结构是通过两个或更多个不同的二亚氨基异吲哚啉的缩合合成的。使用不同的二腈或二亚氨基二氢吲哚的合成策
略可导致酞菁的取代程度和/或区域异构体的分布不同。产生染料的示例性合成方案在美
国专利号7,005,518中描述。
略可导致酞菁的取代程度和/或区域异构体的分布不同。产生染料的示例性合成方案在美
国专利号7,005,518中描述。
[0120] 在一些实施方式中，双重偶联物可包含一种或多种酞菁染料，并且一种或多种酞菁染料可以相同或不同。
[0121] 2.靶向分子
[0122] 所提供的双重偶联物包含靶向分子，其可以直接或间接连接至酞菁染料或治疗剂中的一或两者。在一些实施方式中，靶向分子是能够例如通过结合细胞或病原体上的细胞
表面分子(例如细胞表面受体)而将双重偶联物靶向细胞或病原体的分子。在一些实施方式
中，靶向分子是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，靶向分子，例如抗体或其抗原结合片段，可以选择性地与所需细胞类型，具有特定表型的细胞或显示一种或多种细胞表
面标志物或抗原的细胞结合。在一些情况下，靶向分子结合细胞，所述细胞是癌细胞，肿瘤细胞，炎性细胞，免疫细胞，神经元，干细胞，增殖细胞或增生细胞。在一些情况下，靶向分子与病原体或被病原体感染的细胞结合。在一些实施方式中，细胞是炎性细胞，例如白细胞，例如嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，例如T细胞，B细胞，天然杀伤(NK)细胞，树突细胞，巨噬细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方式中，细胞是神经元，其是周围神经系统神经元或中枢神经系统神经元，例如伤害感受器，例如热伤害感受器，机械伤害感受器，化学伤害感受器或多元伤害感受器。在一些情况下，靶向分子结合病原体或病原细胞，例如病毒，细菌，真菌，生物膜或其它原核细胞系统。在一些实施方式中，靶向分子结合为革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的病
原体。
表面分子(例如细胞表面受体)而将双重偶联物靶向细胞或病原体的分子。在一些实施方式
中，靶向分子是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，靶向分子，例如抗体或其抗原结合片段，可以选择性地与所需细胞类型，具有特定表型的细胞或显示一种或多种细胞表
面标志物或抗原的细胞结合。在一些情况下，靶向分子结合细胞，所述细胞是癌细胞，肿瘤细胞，炎性细胞，免疫细胞，神经元，干细胞，增殖细胞或增生细胞。在一些情况下，靶向分子与病原体或被病原体感染的细胞结合。在一些实施方式中，细胞是炎性细胞，例如白细胞，例如嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，例如T细胞，B细胞，天然杀伤(NK)细胞，树突细胞，巨噬细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方式中，细胞是神经元，其是周围神经系统神经元或中枢神经系统神经元，例如伤害感受器，例如热伤害感受器，机械伤害感受器，化学伤害感受器或多元伤害感受器。在一些情况下，靶向分子结合病原体或病原细胞，例如病毒，细菌，真菌，生物膜或其它原核细胞系统。在一些实施方式中，靶向分子结合为革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的病
原体。
[0123] 在一些实施方式中，双重偶联物的靶向分子(例如抗体)与存在于病灶的微环境中的一种或多种细胞的表面上的蛋白质结合，所述病灶与疾病、紊乱或病症相关或因其而存
在。例如，在一些实施方式中，双重偶联物结合与肿瘤相关或存在于肿瘤中的肿瘤微环境中的一种或多种细胞的表面上的蛋白质。在一些实施方式中，双重偶联物结合至肿瘤的微环
境中存在于细胞外基质中的蛋白质。
在。例如，在一些实施方式中，双重偶联物结合与肿瘤相关或存在于肿瘤中的肿瘤微环境中的一种或多种细胞的表面上的蛋白质。在一些实施方式中，双重偶联物结合至肿瘤的微环
境中存在于细胞外基质中的蛋白质。
[0124] 在一些实施方式中，靶向分子本身也可以是用于疾病、紊乱或病症的疗法或治疗中的试剂。在一些实施方式中，靶向分子也可以介导治疗作用。在一些实施方式中，靶向分子也是用于通过与病灶的微环境中存在的一种或多种细胞的表面上的蛋白质结合来进行
疾病、紊乱或病症的疗法或治疗中的试剂，所述病灶与疾病、紊乱或病症相关联或因其而存在。在一些实施方式中，靶向分子是与存在于病灶的微环境中的细胞表面蛋白结合的抗体
或其抗原结合片段。在一些实施方式中，靶向分子是与免疫学靶标结合的抗体或其抗原结
合片段，所述免疫学靶标例如是免疫细胞上表达的细胞表面受体或参与免疫调节的细胞表
面蛋白。在一些方面，靶向分子是免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂或细胞因子。在一些方面，靶向分子本身可以是选自下文I.A.3节中所述的试剂，例如免疫调节剂或抗癌剂。在一些方面，取决于双重偶联物的情况和用途，一种类型的分子，例如能够特异性结合或靶向另一种分子并且还具有治疗性质的分子，可被认为是双重偶联物中的治疗剂组分或靶向分
子组分。
疾病、紊乱或病症的疗法或治疗中的试剂，所述病灶与疾病、紊乱或病症相关联或因其而存在。在一些实施方式中，靶向分子是与存在于病灶的微环境中的细胞表面蛋白结合的抗体
或其抗原结合片段。在一些实施方式中，靶向分子是与免疫学靶标结合的抗体或其抗原结
合片段，所述免疫学靶标例如是免疫细胞上表达的细胞表面受体或参与免疫调节的细胞表
面蛋白。在一些方面，靶向分子是免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂或细胞因子。在一些方面，靶向分子本身可以是选自下文I.A.3节中所述的试剂，例如免疫调节剂或抗癌剂。在一些方面，取决于双重偶联物的情况和用途，一种类型的分子，例如能够特异性结合或靶向另一种分子并且还具有治疗性质的分子，可被认为是双重偶联物中的治疗剂组分或靶向分
子组分。
[0125] 如本文所用，“存在于病灶的微环境中的细胞”是指存在于与病灶、疾病、紊乱或病症相关的细胞环境中的任何细胞，例如存在于肿瘤中或紧邻肿瘤的任何细胞，例如肿瘤微环境(TME)中存在的细胞，或肿瘤微环境中的细胞外基质。
[0126] 如本文所用，“存在于肿瘤微环境中的细胞”或“存在于TME中的细胞”是指在存在肿瘤的细胞环境中存在的任何细胞，例如存在于肿瘤中或紧邻肿瘤的任何细胞，包括增殖的肿瘤细胞(例如癌细胞)，肿瘤基质，血管，浸润性炎性细胞(例如免疫细胞)和多种相关的组织细胞(例如成纤维细胞)。因此，应理解，提及肿瘤不仅指可能包括恶性或癌细胞的肿瘤细胞，而且指存在于肿瘤微环境中的调节肿瘤生长的其它细胞，包括免疫细胞。在一些情况下，肿瘤微环境中存在的免疫细胞可以包括T淋巴细胞，包括调节性T淋巴细胞(Treg)，树突细胞，自然杀伤(NK)细胞，B细胞，巨噬细胞和其它免疫细胞(Whiteside(2008)Oncogene,
27:5904-5912)。公认的是，在一些方面，存在于肿瘤中及其周围的许多非癌细胞可调节肿瘤细胞的增殖，血管生成，侵袭和/或转移，从而促进肿瘤的生长。因此，在一些情况下，靶向存在于肿瘤中的此类非癌细胞，例如免疫细胞(例如，T细胞，例如调节性T细胞)可以是通过PIT杀伤肿瘤的有效疗法。
27:5904-5912)。公认的是，在一些方面，存在于肿瘤中及其周围的许多非癌细胞可调节肿瘤细胞的增殖，血管生成，侵袭和/或转移，从而促进肿瘤的生长。因此，在一些情况下，靶向存在于肿瘤中的此类非癌细胞，例如免疫细胞(例如，T细胞，例如调节性T细胞)可以是通过PIT杀伤肿瘤的有效疗法。
[0127] 通常，癌细胞含有与肿瘤相关的抗原，该抗原应被免疫系统识别。通常，在主动免疫系统中，免疫细胞(例如细胞毒性T细胞)攻击并消灭这些癌细胞。在正常生理条件下，T细胞介导的免疫应答是由T细胞受体(TCR)的抗原识别引发的，并且由共刺激和抑制信号(例如免疫检查点蛋白)的平衡的调节。具体地，表达TCR的CD4+和CD8+ T细胞可在分别识别主
要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子上的抗原呈递细胞上呈递的抗原性肽后被活化。
在一些方面中，活化的CD8+细胞或细胞毒性T细胞可杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，这可由
CD4+ T细胞的存在而得到协助。
要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子上的抗原呈递细胞上呈递的抗原性肽后被活化。
在一些方面中，活化的CD8+细胞或细胞毒性T细胞可杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，这可由
CD4+ T细胞的存在而得到协助。
[0128] 然而，在肿瘤的情况下，肿瘤微环境(TME)具有抑制免疫系统的机制，从而逃避了免疫识别并防止或减少了肿瘤细胞的杀伤。例如，在一些情况下，免疫检查点蛋白可能在肿瘤中失调，从而导致肿瘤微环境中的免疫反应受到抑制，作为逃避了免疫系统的机制。在一些情况下，肿瘤浸润淋巴细胞可包括Treg(例如，CD4+ CD25+ T细胞)，其是能够抑制微环境中其它T细胞增殖的细胞(Whiteside,TL(2008)Oncogene,27:5904-5912)。在一些情况下，
其它机制可以起到抑制免疫细胞接近肿瘤抗原的作用，从而也有助于肿瘤逃避免疫系统的
能力。
其它机制可以起到抑制免疫细胞接近肿瘤抗原的作用，从而也有助于肿瘤逃避免疫系统的
能力。
[0129] 在一些实施方式中，靶向分子是与肿瘤或癌细胞上的细胞表面分子结合的靶向分子。在一些实施方式中，靶向分子与肿瘤微环境中存在的免疫细胞或其它非癌细胞上的细
胞表面分子结合。在一些实施方式中，靶向分子结合T淋巴细胞表面上的细胞表面分子，例如Treg，树突细胞，自然杀伤(NK)细胞，B细胞，巨噬细胞或存在于肿瘤微环境中的其它免疫细胞。在一些情况下，肿瘤或癌症位于头颈部，乳腺，肝脏，结肠，卵巢，前列腺，胰腺，脑，子宫颈，骨骼，皮肤，眼睛，膀胱，胃，食道，腹膜或肺。
胞表面分子结合。在一些实施方式中，靶向分子结合T淋巴细胞表面上的细胞表面分子，例如Treg，树突细胞，自然杀伤(NK)细胞，B细胞，巨噬细胞或存在于肿瘤微环境中的其它免疫细胞。在一些情况下，肿瘤或癌症位于头颈部，乳腺，肝脏，结肠，卵巢，前列腺，胰腺，脑，子宫颈，骨骼，皮肤，眼睛，膀胱，胃，食道，腹膜或肺。
[0130] 靶向分子的实例，例如靶向肿瘤或癌症或与癌症相关的肿瘤的靶向分子，包括但不限于公开于以下的任何分子：国际PCT申请号WO2014120974、WO2014176284、
WO2015042325、美国专利号8,524,239或美国专利公开号US20140120119。
WO2015042325、美国专利号8,524,239或美国专利公开号US20140120119。
[0131] 示例性的靶向分子包括但不限于：蛋白质，糖蛋白，抗体，抗体片段，抗原，抗原结合片段，肽，多肽，组织导向肽，小分子，聚合物合成的分子，聚合物纳米颗粒，脂质体，酶底物，激素，神经递质，细胞代谢产物，病毒颗粒，病毒衣壳，病毒纳米颗粒，细菌颗粒，标志物，细胞，半抗原，抗生物素蛋白，链霉亲和素，单体链霉亲和素，生物素，碳水化合物，寡糖，多糖，核酸，脱氧核酸，DNA片段，RNA片段，适体，核苷酸三磷酸酯，无环终止子三磷酸酯，PNA或其组合。
[0132] 在一些实施方式中，靶向分子是氨基酸，肽，蛋白质，酪胺，多糖，小分子，离子络合部分，核苷，核苷酸，寡核苷酸，补骨脂素，药物，激素，脂质，脂质装配体，聚合物，聚合物微粒，生物细胞或病毒或其任何组合。在一些实施方式中，靶向分子是抗原，类固醇，维生素，药物，代谢产物，毒素，环境污染物，核酸聚合物，碳水化合物，脂质或玻璃，塑料或其它非生物聚合物或其任何组合。在一些实施方式中，靶向分子是细胞，细胞系统，细胞片段或亚细胞颗粒，例如病毒颗粒，细菌颗粒，病毒组分，生物细胞(例如动物细胞，植物细胞，细菌，酵母或原生质))或细胞组分或其任何组合。在一些实施方式中，反应性染料可以在细胞表面，细胞膜，细胞器或细胞质或其任何组合中标记官能团。
[0133] 在一些实施方式中，靶向分子靶向或结合抗原，例如作为能够被靶向分子结合的靶的任何结构性物质。在一些实施方式中，抗原是在细胞表面表达的细胞表面分子，例如蛋白质，例如受体，或作为其一部分。在一些实施方式中，例如，抗原是在肿瘤中存在的细胞(包括在肿瘤微环境中存在的任何细胞)的表面上表达的分子的部分或被包含在其中。细胞
表面分子的实例包括但不限于抗原，肽，脂质，多糖，碳水化合物或含抗原决定簇的核酸或其任何组合，例如被免疫细胞识别的那些。在一些实例中，抗原包括肿瘤特异性肽(例如癌细胞表面上存在的肽)或其免疫原性片段。在一些实施方式中，靶向分子是抗体或其抗原结合抗体片段。
表面分子的实例包括但不限于抗原，肽，脂质，多糖，碳水化合物或含抗原决定簇的核酸或其任何组合，例如被免疫细胞识别的那些。在一些实例中，抗原包括肿瘤特异性肽(例如癌细胞表面上存在的肽)或其免疫原性片段。在一些实施方式中，靶向分子是抗体或其抗原结合抗体片段。
[0134] 在一些实施方式中，细胞表面分子可以是：ACTHR，内皮细胞Anxa-1，氨肽酶N，抗IL-6R，α-4-整联蛋白，α-5-β-3整联蛋白，α-5-β-5整联蛋白，α甲胎蛋白(AFP)，ANPA，ANPB，APA，APN，APP，1AR，2AR，AT1，B1，B2，BAGE1，BAGE2，B细胞受体BB1，BB2，BB4，降钙素受体，癌抗原125(CA 125)，CCK1，CCK2，CD5，CD10，CD11a，CD13，CD14，CD19，CD20，CD22，CD25，CD30，CD33，CD38，CD45，CD52，CD56，CD68，CD90，CD133，CD7，CD15，CD34，CD44，CD206，CD271，CEA(癌胚抗原)，CGRP，趋化因子受体，细胞表面膜联蛋白-1，细胞表面凝集素-1，Cripto-1，CRLR，CXCR2，CXCR4，DCC，DLL3，E2糖蛋白，EGFR，EGFRvIII，EMR1，内皮唾酸蛋白，EP2，EP4，EpCAM，EphA2，ET受体，纤连蛋白，纤连蛋白ED-B，FGFR，卷曲型受体，GAGE1，GAGE2，GAGE3，GAGE4，GAGE5，GAGE6，GLP-1受体，A家族的G蛋白偶联受体(视紫红质样)，B家族的G蛋白偶联受体(分泌素受体样)，C家族的G蛋白偶联受体(代谢型谷氨酸受体样)，GD2，GP100，GP120，磷脂酰肌醇聚糖-3，血凝素，硫酸肝素，HER1，HER2，HER3，HER4，HMFG，HPV 16/18和E6/E7抗原，hTERT，IL11-R，IL-13R，ITGAM，激肽释放酶-9，Lewis Y，LH受体，LHRH-R，LPA1，MAC-1，MAGE 1，MAGE 2，MAGE 3，MAGE 4，MART1，MC1R，间皮素，MUC1，MUC16，Neu(细胞表面核仁素)，脑啡肽酶，神经毡蛋白-1，神经毡蛋白-2，NG2，NK1，NK2，NK3，NMB-R，Notch-1，NY-ESO-1，OT-R，突变体p53，p97黑素瘤抗原，NTR2，NTR3，p32(p32/gC1q-R/HABP1)，p75，PAC1，PAR1，修复的(PTCH)，PDGFR，PDFG受体，PDT，蛋白酶裂解的胶原蛋白IV，蛋白酶3，抑制素，蛋白酪氨酸激酶7，PSA，PSMA，嘌呤P2X家族(例如，P2X1-5)，突变体Ras，RAMP1，RAMP2，RAMP3修复型，RET受体，神经丛素(plexins)，平滑型，sst1，sst2A，sst2B，sst3，sst4，sst5，物质P，TEMs，T细胞CD3受体，TAG72，TGFBR1，TGFBR2，Tie-1，Tie-2，Trk-A，Trk-B，Trk-C，TR1，TRPA，TRPC，TRPV，TRPM，TRPML，TRPP(例如，TRPV1-6，TRPA1，TRPC1-7，TRPM1-8，TRPP1-5，TRPML1-3)，TSH受体，VEGF受体(VEGFR1或Flt-1，VEGFR2或FLK-1/KDR，和VEGF-3或FLT-4)，电压-门控离子通道，VPAC1，VPAC2，Wilms肿瘤1，Y1，Y2，Y4或Y5。
[0135] 在一些实施方式中，靶向分子是能够与细胞表面分子例如细胞表面分子例如细胞表面受体结合的结合伴侣，例如配体。在一些实施方式中，靶向分子选自：促肾上腺皮质激素(ACTH)，血管紧张素II，心房利钠因子(ANF)，蛙皮素，缓激肽，脑源性神经营养因子
(BDNF)，骨形态发生蛋白2(BMP-2)，骨形态发生蛋白6(BMP-6)，骨形态发生蛋白7(BMP-7)，降钙素，心肌营养蛋白1(BMP-2)，CD22，CD40，胆囊收缩素(CCK)，睫状神经营养因子(CNTF)，CCL1-CCL28，CXCL1-CXCL17，XCL1，XCL2，CX3CL1，Cripto 1结合肽，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，表皮生长因子(EGF)，内皮素1，内皮素1/3，FAS配体，成纤维细胞生长因子1(FGF-
1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，成纤维细胞生长因子4(FGF-4)，成纤维细胞生长因子5(FGF-5)，成纤维细胞生长因子6(FGF-6)，成纤维细胞生长因子1(FGF-7)，成纤维细胞生长因子1(FGF-10)Flt-3，胃泌素，胃泌素释放肽(GRP)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)，胰高血糖素样肽(GLP-1)，肝细胞生长因子(HGF)，干扰素α
(IFN-a)，干扰素β(IFN-b)，干扰素γ(IFNg)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，胰岛素样生长因子2(IGF-2)，白介素1(IL-1)，白介素2(IL-2)，白介素3(IL-3)，白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)，白介素7(IL-7)，白介素8(IL-8)，白介素9(IL-9)，白介素10(IL-
10)，白介素11(IL-11)，白介素12(IL-12)，白介素13(IL-13)，白介素15(IL-15)，白介素17(IL-17)，白介素19(IL-19)，黄体生成激素(LH)，黄体生成释放激素(LHRH)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，巨噬细胞炎性蛋白3a(MIP-3a)，巨噬细胞炎性蛋白3b(MIP-3b)，神经生长因子(NGF)，神经调节肽B，神经营养蛋白3(NT-3)，神经营养蛋白4(NT-4)，神经降压素，神经肽Y，催产素，垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)，血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)，血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)，血小板衍生生长因子BB
(PDGF-BB)，血小板衍生生长因子CC(PDGF-CC)，血小板衍生生长因子DD(PDGF-DD)轴突导向因子-1(NTN1)，轴突导向因子-2(NTN2)，轴突导向因子-4(NTN4)，轴突导向因子-G1(NTNG1)和轴突导向因子-G2(NTNG2)，肝配蛋白A1(EFNA1)，肝配蛋白A2(EFNA2)，肝配蛋白A3
(EFNA3)，肝配蛋白A4(EFNA4)，肝配蛋白A5(EFNA5)，脑信号蛋白3A(SEMA3A)，脑信号蛋白3B(SEMA3B)，脑信号蛋白3C(SEMA3C)，脑信号蛋白3D(SEMA3D)，脑信号蛋白3F(SEMA3F)，脑信号蛋白3G(SEMA3G)，脑信号蛋白4A(SEMA4A)，脑信号蛋白4B(SEMA4B)，脑信号蛋白4C
(SEMA4C)，脑信号蛋白4D(SEMA4D)，脑信号蛋白4F(SEMA4F)，脑信号蛋白4G(SEMA4G)，脑信号蛋白5A(SEMA5A)，脑信号蛋白5B(SEMA5B)，脑信号蛋白6A(SEMA6A)，脑信号蛋白6B
(SEMA6B)，脑信号蛋白6D(SEMA6D)，脑信号蛋白7A(SEMA7A)，SLIT1，SLIT2，SLIT3，SLIT和NTRK样家族，成员1(SLITRK1)，SLIT和NTRK样家族，成员2(SLITRK2)，SLIT和NTRK样家族，成员3(SLITRK3)，SLIT和NTRK样家族，成员4(SLITRK4)，SLIT和NTRK样家族，成员5(SLITRK5)，SLIT和NTRK样家族，成员6(SLITRK6)，前列腺素E2(PGE2)，RANTES，生长激素抑制素-14，生长激素抑制素-28，干细胞因子(SCF)，基质细胞源性因子1(SDF-1)，物质P，促甲状腺激素(TSH)，转化生长因子α(TGF-α)，转化生长因子β(TGF-b)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，凝血酶，血管活性肠肽(VIP)，Wntl，Wnt2，Wnt2b/13，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wntl0a，Wntl0b，Wnt11，Wnt14，Wnt15，或Wnt16，Shh蛋白(Sonic hedgehog)，Dhh蛋白(Desert hedgehog)和Ihh蛋白(Indian hedgehog)，或是其能够与其同类细胞表面分子(例如细胞表面分子，例如细胞表面受体)结合的结合片
段。
(BDNF)，骨形态发生蛋白2(BMP-2)，骨形态发生蛋白6(BMP-6)，骨形态发生蛋白7(BMP-7)，降钙素，心肌营养蛋白1(BMP-2)，CD22，CD40，胆囊收缩素(CCK)，睫状神经营养因子(CNTF)，CCL1-CCL28，CXCL1-CXCL17，XCL1，XCL2，CX3CL1，Cripto 1结合肽，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，表皮生长因子(EGF)，内皮素1，内皮素1/3，FAS配体，成纤维细胞生长因子1(FGF-
1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，成纤维细胞生长因子4(FGF-4)，成纤维细胞生长因子5(FGF-5)，成纤维细胞生长因子6(FGF-6)，成纤维细胞生长因子1(FGF-7)，成纤维细胞生长因子1(FGF-10)Flt-3，胃泌素，胃泌素释放肽(GRP)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)，胰高血糖素样肽(GLP-1)，肝细胞生长因子(HGF)，干扰素α
(IFN-a)，干扰素β(IFN-b)，干扰素γ(IFNg)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，胰岛素样生长因子2(IGF-2)，白介素1(IL-1)，白介素2(IL-2)，白介素3(IL-3)，白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)，白介素7(IL-7)，白介素8(IL-8)，白介素9(IL-9)，白介素10(IL-
10)，白介素11(IL-11)，白介素12(IL-12)，白介素13(IL-13)，白介素15(IL-15)，白介素17(IL-17)，白介素19(IL-19)，黄体生成激素(LH)，黄体生成释放激素(LHRH)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，巨噬细胞炎性蛋白3a(MIP-3a)，巨噬细胞炎性蛋白3b(MIP-3b)，神经生长因子(NGF)，神经调节肽B，神经营养蛋白3(NT-3)，神经营养蛋白4(NT-4)，神经降压素，神经肽Y，催产素，垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)，血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)，血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)，血小板衍生生长因子BB
(PDGF-BB)，血小板衍生生长因子CC(PDGF-CC)，血小板衍生生长因子DD(PDGF-DD)轴突导向因子-1(NTN1)，轴突导向因子-2(NTN2)，轴突导向因子-4(NTN4)，轴突导向因子-G1(NTNG1)和轴突导向因子-G2(NTNG2)，肝配蛋白A1(EFNA1)，肝配蛋白A2(EFNA2)，肝配蛋白A3
(EFNA3)，肝配蛋白A4(EFNA4)，肝配蛋白A5(EFNA5)，脑信号蛋白3A(SEMA3A)，脑信号蛋白3B(SEMA3B)，脑信号蛋白3C(SEMA3C)，脑信号蛋白3D(SEMA3D)，脑信号蛋白3F(SEMA3F)，脑信号蛋白3G(SEMA3G)，脑信号蛋白4A(SEMA4A)，脑信号蛋白4B(SEMA4B)，脑信号蛋白4C
(SEMA4C)，脑信号蛋白4D(SEMA4D)，脑信号蛋白4F(SEMA4F)，脑信号蛋白4G(SEMA4G)，脑信号蛋白5A(SEMA5A)，脑信号蛋白5B(SEMA5B)，脑信号蛋白6A(SEMA6A)，脑信号蛋白6B
(SEMA6B)，脑信号蛋白6D(SEMA6D)，脑信号蛋白7A(SEMA7A)，SLIT1，SLIT2，SLIT3，SLIT和NTRK样家族，成员1(SLITRK1)，SLIT和NTRK样家族，成员2(SLITRK2)，SLIT和NTRK样家族，成员3(SLITRK3)，SLIT和NTRK样家族，成员4(SLITRK4)，SLIT和NTRK样家族，成员5(SLITRK5)，SLIT和NTRK样家族，成员6(SLITRK6)，前列腺素E2(PGE2)，RANTES，生长激素抑制素-14，生长激素抑制素-28，干细胞因子(SCF)，基质细胞源性因子1(SDF-1)，物质P，促甲状腺激素(TSH)，转化生长因子α(TGF-α)，转化生长因子β(TGF-b)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，凝血酶，血管活性肠肽(VIP)，Wntl，Wnt2，Wnt2b/13，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wntl0a，Wntl0b，Wnt11，Wnt14，Wnt15，或Wnt16，Shh蛋白(Sonic hedgehog)，Dhh蛋白(Desert hedgehog)和Ihh蛋白(Indian hedgehog)，或是其能够与其同类细胞表面分子(例如细胞表面分子，例如细胞表面受体)结合的结合片
段。
[0136] 在一些实施方式中，靶向分子可以是免疫调节剂，其可以与免疫细胞上的细胞表面分子或蛋白质结合，从而抑制或激活人体的免疫反应。在一些实施方式中，免疫调节剂与细胞表面分子或蛋白质的结合可刺激对肿瘤和/或病原体的免疫应答，例如通过抑制免疫
抑制或通过增强免疫刺激。在一些实施方式中，细胞表面分子或蛋白可以是：CD25，PD-1
(CD279)，PD-L1(CD274，B7-H1)，PD-L2(CD273，B7-DC)，CTLA-4，LAG3(CD223)，TIM3
(HAVCR2)，4-1BB(CD137，TNFRSF9)，CXCR2，CXCR4(CD184)，CD27，CEACAM1，半乳凝素9，BTLA，CD160，VISTA(PD1同源物)，B7-H4(VCTN1)，CD80(B7-1)，CD86(B7-2)，CD28，HHLA2(B7-H7)，CD28H，CD155，CD226，TIGIT，CD96，半乳凝素3，CD40，CD40L，CD70，LIGHT(TNFSF14)，HVEM(TNFRSF14)，B7-H3(CD276)，Ox40L(TNFSF4)，CD137L(TNFSF9，GITRL)，B7RP1，ICOS(CD278)，ICOSL，KIR，GAL9，NKG2A(CD94)，GARP，TL1A，TNFRSF25，TMIGD2，BTNL2，嗜乳脂蛋白家族，CD48，CD244，Siglec家族，CD30，CSF1R，MICA(MHC I类多肽相关序列A)，MICB(MHC I类多肽相关序列B)，NKG2D，KIR家族(杀伤细胞免疫球蛋白样受体，LILR家族(白细胞免疫球蛋白样受体，CD85，ILT，LIR)，SIRPA(信号调节蛋白α)，CD47(IAP)，神经毡蛋白1(NRP-1)，VEGFR或VEGF。在一些示例中，靶向分子是作为免疫调节剂的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
抑制或通过增强免疫刺激。在一些实施方式中，细胞表面分子或蛋白可以是：CD25，PD-1
(CD279)，PD-L1(CD274，B7-H1)，PD-L2(CD273，B7-DC)，CTLA-4，LAG3(CD223)，TIM3
(HAVCR2)，4-1BB(CD137，TNFRSF9)，CXCR2，CXCR4(CD184)，CD27，CEACAM1，半乳凝素9，BTLA，CD160，VISTA(PD1同源物)，B7-H4(VCTN1)，CD80(B7-1)，CD86(B7-2)，CD28，HHLA2(B7-H7)，CD28H，CD155，CD226，TIGIT，CD96，半乳凝素3，CD40，CD40L，CD70，LIGHT(TNFSF14)，HVEM(TNFRSF14)，B7-H3(CD276)，Ox40L(TNFSF4)，CD137L(TNFSF9，GITRL)，B7RP1，ICOS(CD278)，ICOSL，KIR，GAL9，NKG2A(CD94)，GARP，TL1A，TNFRSF25，TMIGD2，BTNL2，嗜乳脂蛋白家族，CD48，CD244，Siglec家族，CD30，CSF1R，MICA(MHC I类多肽相关序列A)，MICB(MHC I类多肽相关序列B)，NKG2D，KIR家族(杀伤细胞免疫球蛋白样受体，LILR家族(白细胞免疫球蛋白样受体，CD85，ILT，LIR)，SIRPA(信号调节蛋白α)，CD47(IAP)，神经毡蛋白1(NRP-1)，VEGFR或VEGF。在一些示例中，靶向分子是作为免疫调节剂的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
[0137] 在一些实施方式中，细胞表面分子可以是：HER1/EGFR，HER2/ERBB2，CD20，CD25(IL-2Rα受体)，CD33，CD52，CD133，CD206，CEA，CEACAM1，CEACAM3，CEACAM5，CEACAM6，癌抗原
125(CA125)，甲胎蛋白(AFP)，Lewis Y，TAG72，Caprin-1，间皮素，PDGF受体，PD-1，PD-L1，CTLA-4，IL-2受体，血管内皮生长因子(VEGF)，CD30，EpCAM，EphA2，磷脂酰肌醇聚糖-3，gpA33，粘蛋白，CAIX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂(例如GD2，GD3，GM1和GM2)，VEGF受体(VEGFR)，整合素αVβ3，整合素α5β1，ERBB3，MET，IGF1R，EPHA3，TRAILR1，TRAILR2，RANKL，FAP，腱生蛋白，AFP，BCR复合物，CD3，CD18，CD44，CTLA-4，gp72，HLA-DR 10β，HLA-DR抗原，IgE，MUC-1，nuC242，PEM抗原，金属蛋白酶，肝配蛋白受体，肝配蛋白配体，HGF受体，CXCR4，CXCR4，蛙皮素受体或SK-1抗原。
125(CA125)，甲胎蛋白(AFP)，Lewis Y，TAG72，Caprin-1，间皮素，PDGF受体，PD-1，PD-L1，CTLA-4，IL-2受体，血管内皮生长因子(VEGF)，CD30，EpCAM，EphA2，磷脂酰肌醇聚糖-3，gpA33，粘蛋白，CAIX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂(例如GD2，GD3，GM1和GM2)，VEGF受体(VEGFR)，整合素αVβ3，整合素α5β1，ERBB3，MET，IGF1R，EPHA3，TRAILR1，TRAILR2，RANKL，FAP，腱生蛋白，AFP，BCR复合物，CD3，CD18，CD44，CTLA-4，gp72，HLA-DR 10β，HLA-DR抗原，IgE，MUC-1，nuC242，PEM抗原，金属蛋白酶，肝配蛋白受体，肝配蛋白配体，HGF受体，CXCR4，CXCR4，蛙皮素受体或SK-1抗原。
[0138] 在一些实施方式中，靶向分子是特异性结合抗原的抗体或抗原结合抗体片段，所述抗原是在细胞表面表达的细胞表面分子或是其部分。此类抗体包括能够结合本文所述的
细胞表面分子(例如细胞表面分子，例如细胞表面受体)的抗体或抗原结合抗体片段。在一
些情况下，抗体可以结合在肿瘤细胞中表达的蛋白质的抗原，包括肿瘤特异性蛋白质。在一些实施方式中，抗体是抗原结合片段，其是Fab，单VH结构域，单链可变片段(scFv)，多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。
细胞表面分子(例如细胞表面分子，例如细胞表面受体)的抗体或抗原结合抗体片段。在一
些情况下，抗体可以结合在肿瘤细胞中表达的蛋白质的抗原，包括肿瘤特异性蛋白质。在一些实施方式中，抗体是抗原结合片段，其是Fab，单VH结构域，单链可变片段(scFv)，多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。
[0139] 在一些实施方式中，靶向分子直接或间接结合抗原或蛋白质。例如，在一些实施方式中，靶向分子是与能够结合抗原或蛋白质的第一结合分子结合的第二结合分子。例如，靶向分子是第二抗体，其与能够结合蛋白质或抗原例如细胞表面分子或细胞表面受体的第一结合分子例如第一抗体结合。因此，在一些实施方式中，染料与第二抗体偶联。
[0140] “抗体”是至少包含特异性识别并结合抗原表位的轻链和/或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体通常由重链和轻链组成，它们各自具有可变区，称为可变重(VH)区和可变轻(VL)区。VH区和VL区共同负责结合抗体识别的抗原。术语抗体包括表现出抗原结合的完整抗体和抗原结合抗体片段，例如Fab片段，Fab'片段，F(ab)'2片段，单链Fv蛋白(“scFv”)，单结构域抗体(“sdAb”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区被一个接头结合，而在dsFv中，该链
已突变以引入二硫键以稳定链的联合。该术语还包括基因工程形式，例如免疫球蛋白的修
饰形式，嵌合抗体，例如人源化鼠抗体和异源偶联物抗体，例如双特异性抗体。还参见，《皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook)》，1994-1995(皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)，伊利诺伊州罗克福德)；Kuby,J.《, 免疫学(Immunology)》，第3版，WHF公司(W.H.Freeman&Co.)，纽约，1997。
已突变以引入二硫键以稳定链的联合。该术语还包括基因工程形式，例如免疫球蛋白的修
饰形式，嵌合抗体，例如人源化鼠抗体和异源偶联物抗体，例如双特异性抗体。还参见，《皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook)》，1994-1995(皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)，伊利诺伊州罗克福德)；Kuby,J.《, 免疫学(Immunology)》，第3版，WHF公司(W.H.Freeman&Co.)，纽约，1997。
[0141] 通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。轻链有两种类型，λ(lambda)和k(kappa)。有五个主要的重链类别或同种型，它们决定了抗体分子的功能活性：IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。
[0142] 每条重链和轻链包含恒定区和可变区，也称为“结构域”。结合起来，重链和轻链可变区通常特异性结合抗原。轻链和重链可变区可能包含被三个高变区打断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR的范围已定义(参见Kabat等《，免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，美国卫生与公共服务部，1991年，其通过引用纳入本文)。Kabat数据库现可在线维护。不同的轻链或重链的框架区序列在物种(例如人类)内是相对保守的。抗体的框架区即组成轻链和重链的组合的框架区，
其用作在三维空间中定位和对齐CDR。
其用作在三维空间中定位和对齐CDR。
[0143] CDR通常负责与抗原表位的结合。每条链的CDR一般被称为CDR1、CDR2和CDR3，依次从N末端开始编号，并且也一般由特定CDR位于的链来鉴定。因此，VH CDR3位于发现VH CDR3的抗体的重链可变区上，而VL CDR1是来自发现VL CDR1的抗体的轻链可变区的CDR1。具有不同特异性的抗体(例如，针对不同抗原的不同结合位点)具有不同的CDR。尽管抗体之间的差别是不同的CDR，但CDR中仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
[0144] 提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv，scFv，dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv，scFv，dsFv或Fab的可变区。
[0145] 提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”指除完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的部分，该部分结合与所述完整抗体结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于，Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。由抗体片段形成的其它抗体片段或多特异性抗体包括多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。可通过各种技术制备抗体片段，包括但不限于对完整抗
体的蛋白酶水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方式中，靶向分子是抗体或
抗原结合片段，其是Fab，单个VH结构域，单链可变片段(scFv)，多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。
体的蛋白酶水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方式中，靶向分子是抗体或
抗原结合片段，其是Fab，单个VH结构域，单链可变片段(scFv)，多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。
[0146] “单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由已经转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨
髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗
体。
髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗
体。
[0147] “嵌合抗体”具有来自一种物种(例如人)的框架残基和通常赋予抗原结合的来自另一物种(例如特异性结合间皮素的鼠抗体)的CDR。
[0148] “人源化”免疫球蛋白是包括人构架区和来自非人(例如小鼠，大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一些实施方式中，CDR来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不必存在，但如果存在，则它们可以与人免疫球蛋白恒定区基本相同，例如至少约85-90％，例如约95％或更高相同。因此，除CDR之外，人源化免疫球蛋白的部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有有限数目的被来自供体框架的氨基酸取代的取代。人源化抗体或其它单克隆抗体可具有其它保守氨基酸取代，这些取代对抗原结合或其它免疫球蛋白功
能基本没有影响。可以通过基因工程构建人源化免疫球蛋白(参见例如，美国专利号5,585,
089)。
能基本没有影响。可以通过基因工程构建人源化免疫球蛋白(参见例如，美国专利号5,585,
089)。
[0149] “人”抗体(也称为“完全人”抗体)是包括人框架区和来自人免疫球蛋白的CDR的抗体。在一些实施方式中，框架和CDR来自相同来源的人重链和/或轻链氨基酸序列。然而，来自一种人抗体的框架可以被工程化以包括来自不同人抗体的CDR。人免疫球蛋白的部分可与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。
[0150] “特异性结合”指相对于结合无关蛋白(例如非肿瘤蛋白，例如β-肌动蛋白)，分子(例如抗体或抗原结合片段)的特异性结合抗原(例如肿瘤特异性抗原)的能力。在一些实施方式中，分子，例如抗体或片段，包括连接至酞菁染料分子和治疗剂分子的分子，例如抗体或片段，特异性地结合靶标，例如细胞表面分子，其结合常数比样品或对象中其它分子的结合常数大至少103M-1，104M-1或105M-1。在一些实施方式中，分子，例如抗体或其片段，具有大于或等于约106M-1，大于或等于约107M-1，大于或等于约108M-1，或大于或等于约109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1的平衡缔合常数(KA)。抗体的特征还可在于具有10-6M、10-7M、10-8M、10-
10M、10-11M或10-12M或更低的平衡解离常数(KD)。在一些实施方式中，平衡解离常数(KD)可以为1nM或更小。亲和常数，例如KD或KA，可以根据经验估算，或者亲和性可相对地确定，例如通过比较一种抗体和另一种抗体对特定抗原的亲和性。例如，可以使用本领域已知的技术来
容易地确定这种亲和性，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)或使用表面等离振子
共振装置，例如Biacore T100(可获自新泽西州皮斯卡塔韦的Biacore公司)，使用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定，或通过本领域技术人员已知的其它方法。
10M、10-11M或10-12M或更低的平衡解离常数(KD)。在一些实施方式中，平衡解离常数(KD)可以为1nM或更小。亲和常数，例如KD或KA，可以根据经验估算，或者亲和性可相对地确定，例如通过比较一种抗体和另一种抗体对特定抗原的亲和性。例如，可以使用本领域已知的技术来
容易地确定这种亲和性，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)或使用表面等离振子
共振装置，例如Biacore T100(可获自新泽西州皮斯卡塔韦的Biacore公司)，使用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定，或通过本领域技术人员已知的其它方法。
[0151] 在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，将酞菁染料(例如IR700)和/或治疗剂偶联至抗体或抗原结合抗体片段。能偶联至酞菁染料(例如，IR700)和/或治疗剂的示例
性抗体包括但不限于，西妥昔单抗，帕尼单抗，扎鲁单抗，尼莫妥珠单抗，曲妥珠单抗，阿多曲妥珠单抗美坦，托西单抗 利妥昔单抗(Rituxan，Mabthera)，替伊莫单抗
(Zevalin)，达珠单抗(Daclizumab)(Zenapax)，吉妥单抗(Mylotarg)，阿仑单抗，CEA-Scan Fab片段，OC125单克隆抗体，ab75705，B72.3，贝伐单抗 阿法替尼，阿昔替尼，
博舒替尼，卡波替尼，西替尼，克唑替尼，达布拉非尼，达沙替尼，厄洛替尼，依维莫司，依鲁替尼，伊马替尼，拉帕替尼，乐伐替尼，尼洛替尼，奥拉巴利，帕博西利卜，帕唑帕尼，帕妥珠单抗，雷米库单抗，瑞戈非尼，鲁索替尼，索拉非尼，舒尼替尼，替西罗莫司，曲美替尼，凡德他尼，维莫非尼，维莫德吉，巴利昔单抗，伊匹木单抗，尼莫单抗，派姆单抗，MPDL3280A，匹立珠单抗(CT-011)，MK-3475，BMS-936559，MPDL3280A，特姆单抗，IMP321，BMS-986016，
LAG525，乌鲁单抗，PF-05082566，TRX518，MK-4166，达昔妥珠单抗，鲁卡妥姆单抗，SEQ-CD40，CP-870，CP-893，MEDI6469，MEDI6383，MOXR0916，AMP-224，MSB0010718C，MEDI4736，PDR001，rHIgM12B7，乌克普鲁单抗(Ulocuplumab)，BKT140，伐立鲁单抗(Varlilumab)(CDX-
1127)，ARGX-110，MGA271，利瑞单抗(lirilumab)(BMS-986015，IPH2101)，IPH2201，AGX-
115，尹玛克妥珠单抗(Emactuzumab)，CC-90002和MNRP1685A，或其抗体结合性片段。
性抗体包括但不限于，西妥昔单抗，帕尼单抗，扎鲁单抗，尼莫妥珠单抗，曲妥珠单抗，阿多曲妥珠单抗美坦，托西单抗 利妥昔单抗(Rituxan，Mabthera)，替伊莫单抗
(Zevalin)，达珠单抗(Daclizumab)(Zenapax)，吉妥单抗(Mylotarg)，阿仑单抗，CEA-Scan Fab片段，OC125单克隆抗体，ab75705，B72.3，贝伐单抗 阿法替尼，阿昔替尼，
博舒替尼，卡波替尼，西替尼，克唑替尼，达布拉非尼，达沙替尼，厄洛替尼，依维莫司，依鲁替尼，伊马替尼，拉帕替尼，乐伐替尼，尼洛替尼，奥拉巴利，帕博西利卜，帕唑帕尼，帕妥珠单抗，雷米库单抗，瑞戈非尼，鲁索替尼，索拉非尼，舒尼替尼，替西罗莫司，曲美替尼，凡德他尼，维莫非尼，维莫德吉，巴利昔单抗，伊匹木单抗，尼莫单抗，派姆单抗，MPDL3280A，匹立珠单抗(CT-011)，MK-3475，BMS-936559，MPDL3280A，特姆单抗，IMP321，BMS-986016，
LAG525，乌鲁单抗，PF-05082566，TRX518，MK-4166，达昔妥珠单抗，鲁卡妥姆单抗，SEQ-CD40，CP-870，CP-893，MEDI6469，MEDI6383，MOXR0916，AMP-224，MSB0010718C，MEDI4736，PDR001，rHIgM12B7，乌克普鲁单抗(Ulocuplumab)，BKT140，伐立鲁单抗(Varlilumab)(CDX-
1127)，ARGX-110，MGA271，利瑞单抗(lirilumab)(BMS-986015，IPH2101)，IPH2201，AGX-
115，尹玛克妥珠单抗(Emactuzumab)，CC-90002和MNRP1685A，或其抗体结合性片段。
[0152] 在一些实施方式中，靶向分子是组织特异性导向肽(homing peptide)。例如，在一些实施方式中，导向多肽可包含SEQ ID NO:1-52中任一所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向分子是RGD多肽，例如iRGD多肽，Lyp-1多肽，Cripto-1结合多肽，生长抑素受体结合多肽或禁止素结合多肽，NGR多肽或iNGR多肽。
[0153] 在一些实施方式中，靶向分子是病毒颗粒，例如病毒样颗粒，病毒样纳米颗粒或病毒衣壳。在一些实施方式中，靶向分子是病毒样纳米颗粒。在一些实施方式中，病毒样纳米颗粒由L1衣壳蛋白组装而成。在一些实施方式中，病毒样纳米颗粒由L1和L2衣壳蛋白的组合组装而成。在一些实施方式中，靶向分子可以结合并感染细胞。在一些实施方式中，靶向分子是WO2015042325中描述的任何一种。
[0154] 在一些实施方式中，病毒样颗粒(VLP)是指有组织的衣壳样结构，例如大致球形或圆柱形，其包含L1或L1和L2衣壳蛋白的自组装有序阵列，并且不包括病毒基因组。在一些实施方式中，病毒样颗粒在形态和抗原学上类似于真实的病毒体，但是它们缺乏病毒遗传物
质，例如病毒核酸，从而使颗粒无感染性。VLP可用于将例如预防剂，治疗剂或诊断剂之类的试剂或封闭的环状或线性DNA或RNA分子递送至受体细胞。
质，例如病毒核酸，从而使颗粒无感染性。VLP可用于将例如预防剂，治疗剂或诊断剂之类的试剂或封闭的环状或线性DNA或RNA分子递送至受体细胞。
[0155] 在一些实施方式中，相对于野生型VLP，VLP可以具有修饰的免疫原性和/或抗原性。VLP可以例如由具有变体衣壳蛋白的衣壳体(capsomer)组装而成，所述变体衣壳蛋白具有修饰的免疫原性和/或抗原性。在一些实施方式中，具有修饰的免疫原性和/或抗原性的
变体衣壳蛋白是天然或合成修饰的，例如突变的、取代的、缺失的、聚乙二醇化的或插入的氨基酸，以减少或防止衣壳蛋白被预先存在的(例如内源的)病毒血清型特异性抗体识别。
变体衣壳蛋白可以是人乳头瘤病毒(HPV)L1变体，非人乳头瘤病毒L1变体或基于来自不同
HPV血清型的氨基酸的组合的乳头瘤病毒L1变体。
变体衣壳蛋白是天然或合成修饰的，例如突变的、取代的、缺失的、聚乙二醇化的或插入的氨基酸，以减少或防止衣壳蛋白被预先存在的(例如内源的)病毒血清型特异性抗体识别。
变体衣壳蛋白可以是人乳头瘤病毒(HPV)L1变体，非人乳头瘤病毒L1变体或基于来自不同
HPV血清型的氨基酸的组合的乳头瘤病毒L1变体。
[0156] 在一些实施方式中，VLP是乳头瘤病毒VLP。VLP可以是人乳头瘤病毒VLP，例如衍生自可感染人的病毒，而在其它实施方式中，VLP可以是非人乳头瘤病毒VLP。非人VLP的实例包括但不限于衍生自以下的那些：牛乳头瘤病毒，鼠乳头瘤病毒，棉兔乳头瘤病毒和猕猴或恒河乳头瘤病毒颗粒。在一些实施方式中，VLP是牛乳头瘤病毒病毒样纳米颗粒，例如1型病毒样纳米颗粒，例如由BPV L1衣壳蛋白或BPV L1和BPV L2衣壳蛋白的组合组装而成。
[0157] 在一些实施方式中，衣壳蛋白是指蛋白质单体，其中一些形成衣壳体寡聚物。在一些实施方式中，衣壳体是指病毒衣壳的基本寡聚结构单元，其是保护病毒遗传物质的蛋白质的外壳。在一些实施方式中，衣壳蛋白可包括乳头瘤病毒L1主要衣壳蛋白和乳头瘤病毒
L2次要衣壳蛋白。在一些实施方式中，VLP仅包含L1衣壳蛋白，而在其它实施方式中，VLP包含L1和L2衣壳蛋白的混合物或组合。
L2次要衣壳蛋白。在一些实施方式中，VLP仅包含L1衣壳蛋白，而在其它实施方式中，VLP包含L1和L2衣壳蛋白的混合物或组合。
[0158] 在一些实施方式中，病毒样颗粒中的L1衣壳蛋白的百分比大于病毒样颗粒中的L2衣壳蛋白的百分比。例如，在一些实施方式中，病毒样颗粒中的L1衣壳蛋白的百分比为病毒样颗粒中的衣壳蛋白总数的80％至100％。在一些实施方式中，病毒样颗粒中的L1衣壳蛋白的百分比是至少或是约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，
99％或100％。在一些实施方式中，病毒样颗粒中的L2衣壳蛋白的百分比为病毒样颗粒中的衣壳蛋白总数的1％至25％。例如，在一些实施方式中，病毒样颗粒中的L2衣壳蛋白的百分比是至少或约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，
15％，16％，17％，18％，19％或20％。
99％或100％。在一些实施方式中，病毒样颗粒中的L2衣壳蛋白的百分比为病毒样颗粒中的衣壳蛋白总数的1％至25％。例如，在一些实施方式中，病毒样颗粒中的L2衣壳蛋白的百分比是至少或约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，
15％，16％，17％，18％，19％或20％。
[0159] 在一些实施方式中，病毒样颗粒包含12至72个L2蛋白。在一些实施方式中，病毒样颗粒包含360个L1蛋白和12至72个L2蛋白。在一些实施方式中，衣壳蛋白组装成直径为20至60nm的病毒样纳米颗粒。例如，衣壳蛋白可以组装成直径是至少或约20、25、30、35、40、45、
50、55或60nm的病毒样纳米颗粒。
50、55或60nm的病毒样纳米颗粒。
[0160] 在一些实施方式中，靶向分子不是或不包括纳米载体。在一些实施方式中，靶向分子不是或不包括病毒样颗粒，纳米颗粒，脂质体，量子点或其组合。
[0161] 在一些实施方式中，靶向分子是DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)。DARPin通常衍生自天然锚蛋白重复蛋白，并与包括例如人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白的蛋白质结合(分子伴侣公司(Molecular Partners AG)，瑞士苏黎世；参见第5章“.设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)：从研究到治疗((Designed Ankyrin Repeat Proteins
(DARPins):From Research to Therapy)”,Methods in Enzymology,第503卷:101～134
(2012)；和“使用SRP噬菌体展示技术高效筛选具有亚纳摩尔亲和性的DARPin(Efficient
Selection of DARPins with Sub-nanomolar Affinities using SRP Phage Display)”,
J.Mol.Biol.(2008)382,1211-1227，其全文通过引用纳入本文。在一些实施方式中，DARPin是对靶蛋白具有高特异性和高结合亲和性的抗体模拟蛋白，其通过基因工程制备。在一些
实施方式中，DARPin具有包含至少2个锚蛋白重复基序的结构，例如，包含至少3、4或5个锚蛋白重复基序。DARPin可具有任何合适的分子量，这取决于重复基序的数量。例如，包括3、4或5个锚蛋白重复基序的DARPin可分别具有约10kDa，约14kDa或约18kDa的分子量。
(DARPins):From Research to Therapy)”,Methods in Enzymology,第503卷:101～134
(2012)；和“使用SRP噬菌体展示技术高效筛选具有亚纳摩尔亲和性的DARPin(Efficient
Selection of DARPins with Sub-nanomolar Affinities using SRP Phage Display)”,
J.Mol.Biol.(2008)382,1211-1227，其全文通过引用纳入本文。在一些实施方式中，DARPin是对靶蛋白具有高特异性和高结合亲和性的抗体模拟蛋白，其通过基因工程制备。在一些
实施方式中，DARPin具有包含至少2个锚蛋白重复基序的结构，例如，包含至少3、4或5个锚蛋白重复基序。DARPin可具有任何合适的分子量，这取决于重复基序的数量。例如，包括3、4或5个锚蛋白重复基序的DARPin可分别具有约10kDa，约14kDa或约18kDa的分子量。
[0162] 在一些实施方式中，DARPin包括提供结构的核心部分和位于核心外部并结合至靶标的靶标结合部分。在一些实施方式中，结构核心包括保守的氨基酸序列，而靶标结合部分包括根据靶标而不同的氨基酸序列。
[0163] 在一些实施方式中，例如当靶向分子是多肽，例如抗体或抗原结合抗体片段时，每个靶向分子的染料分子的数目可为或约为2至约5，例如为或约为2至约4，例如约3或3。在一些实施方式中，例如当靶向分子是纳米颗粒，例如病毒样颗粒(VLP)时，染料分子相对靶向分子的数目可以是或是约10至约1000、10至约500、50至约500或50至约1000。因此，在一些实施方式中，靶向分子可包含约10至约1000个染料分子。
[0164] 在一些实施方式中，例如在靶向分子是VLP的情况下，可以将不止一个染料分子偶联至单个衣壳蛋白。例如，单个衣壳蛋白，例如L1或L2衣壳蛋白，可以与1至5，例如1、2、3、4或5个染料分子偶联。因此，衣壳蛋白的多于一个氨基酸可以与染料分子偶联。在一些实施方式中，单个衣壳蛋白可偶联至1-2、1-3或2-3个染料分子。因此，染料分子可偶联至单个衣壳蛋白的1、2、3、4或5个不同的氨基酸，例如赖氨酸，精氨酸和/或组氨酸或其它氨基酸。
[0165] 3.治疗剂
[0166] 所提供的双重偶联物包含治疗剂，其可以直接或间接连接至酞菁染料或靶向分子中的一或两者。在一些实施方式中，治疗剂是用于与疾病、紊乱或病症(例如肿瘤)的治疗的试剂，与使用酞菁靶向分子的PIT相联合，随后进行照射。在一些实施方式中，治疗剂可强化或增强靶向酞菁的分子(例如IR700抗体)对PIT疗法的治疗作用。在一些实施方式中，双重
偶联物既将靶向酞菁的分子又将治疗剂靶向至病灶部位，例如肿瘤。在一些实施方式中，治疗剂可通过可释放或可裂解的部分的裂解而释放或递送到病灶的微环境中。在一些实施方
式中，治疗剂是免疫调节剂或抗癌剂。
偶联物既将靶向酞菁的分子又将治疗剂靶向至病灶部位，例如肿瘤。在一些实施方式中，治疗剂可通过可释放或可裂解的部分的裂解而释放或递送到病灶的微环境中。在一些实施方
式中，治疗剂是免疫调节剂或抗癌剂。
[0167] 在一些实施方式中，治疗剂是用于治疗或治疗疾病、紊乱或病症的治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂本身也可以通过结合或靶向与疾病、紊乱或病症(例如肿瘤)相关或由其导致的病灶的微环境中存在的一个或多个细胞表面上的蛋白质来起作用。在一些实施方
式中，治疗剂是与免疫学靶标结合的抗体或其抗原结合片段，所述免疫学靶标例如是免疫
细胞上表达的细胞表面受体或参与免疫调节的细胞表面蛋白。在一些方面，治疗剂是免疫
调节剂，例如免疫检查点抑制剂或细胞因子。在一些方面，治疗剂本身可以是选自以上
I.A.2节中所述的那些。在一些方面，取决于双重偶联物的情况和用途，一种类型的分子，例如能够特异性结合或靶向另一种分子并且还具有治疗性质的分子，可被认为是双重偶联物
中的靶向分子组分或治疗剂组分。
式中，治疗剂是与免疫学靶标结合的抗体或其抗原结合片段，所述免疫学靶标例如是免疫
细胞上表达的细胞表面受体或参与免疫调节的细胞表面蛋白。在一些方面，治疗剂是免疫
调节剂，例如免疫检查点抑制剂或细胞因子。在一些方面，治疗剂本身可以是选自以上
I.A.2节中所述的那些。在一些方面，取决于双重偶联物的情况和用途，一种类型的分子，例如能够特异性结合或靶向另一种分子并且还具有治疗性质的分子，可被认为是双重偶联物
中的靶向分子组分或治疗剂组分。
[0168] a.免疫调节剂
[0169] 在一些实施方式中，治疗剂是免疫调节剂(本文也称为“免疫调节物”)。在一些方面，免疫调节剂是直接或间接抑制或激活人体免疫反应的物质。例如，可以将刺激对肿瘤和/或病原体的免疫应答的免疫调节剂与光免疫疗法组合使用。在本文提供的双重偶联物
的一些实施方式中，治疗剂例如免疫调节剂通过可释放的或可裂解的接头与酞菁染料或靶
向分子连接。在一些实施方式中，接头的裂解允许治疗剂从双重偶联物释放，从而在双重偶联物定位或靶向病灶部位或微环境后，将治疗剂例如免疫调节剂直接靶向疾病、紊乱或病
症中涉及的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境。因此，双重偶联物可允许在病灶部位或微环境处进行特异性免疫调节，并允许治疗剂例如免疫调节剂的局部
释放和递送。
的一些实施方式中，治疗剂例如免疫调节剂通过可释放的或可裂解的接头与酞菁染料或靶
向分子连接。在一些实施方式中，接头的裂解允许治疗剂从双重偶联物释放，从而在双重偶联物定位或靶向病灶部位或微环境后，将治疗剂例如免疫调节剂直接靶向疾病、紊乱或病
症中涉及的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境。因此，双重偶联物可允许在病灶部位或微环境处进行特异性免疫调节，并允许治疗剂例如免疫调节剂的局部
释放和递送。
[0170] 在一些实施方式中，治疗剂可以是可(例如通过抑制免疫抑制信号转导或增强免疫刺激信号转导)刺激，放大和/或增强抗肿瘤免疫应答的任何免疫调节剂。在一些实施方
式中，免疫调节剂是肽，蛋白质或小分子。在一些实施方式中，该蛋白可以是融合蛋白或重组蛋白。在一些实施方式中，免疫调节剂结合免疫靶标，例如在免疫细胞如T细胞，B细胞或抗原呈递细胞上表达的细胞表面受体。例如，在一些实施方式中，免疫调节剂是抗体或抗原结合抗体片段，融合蛋白，小分子或多肽。
式中，免疫调节剂是肽，蛋白质或小分子。在一些实施方式中，该蛋白可以是融合蛋白或重组蛋白。在一些实施方式中，免疫调节剂结合免疫靶标，例如在免疫细胞如T细胞，B细胞或抗原呈递细胞上表达的细胞表面受体。例如，在一些实施方式中，免疫调节剂是抗体或抗原结合抗体片段，融合蛋白，小分子或多肽。
[0171] 在一些实施方式中，免疫调节剂抑制免疫检查点途径。免疫系统具有多种抑制途径，这些抑制途径与维持自我耐受和调节免疫反应有关。已知肿瘤可利用一些免疫检查点
途径作为免疫抵抗的主要机制，尤其是抵抗针对肿瘤抗原特异的T细胞(Pardoll,2012,
Nature Reviews Cancer 12:252-264)。因为许多这样的免疫检查点由配体-受体相互作用
引发，所以它们很容易被针对配体和/或其受体的抗体所阻断。
途径作为免疫抵抗的主要机制，尤其是抵抗针对肿瘤抗原特异的T细胞(Pardoll,2012,
Nature Reviews Cancer 12:252-264)。因为许多这样的免疫检查点由配体-受体相互作用
引发，所以它们很容易被针对配体和/或其受体的抗体所阻断。
[0172] 因此，采用阻断免疫检查点途径的拮抗性分子例如小分子，核酸抑制剂(例如RNAi)或抗体分子的治疗正成为针对癌症和其它疾病的免疫治疗的具有前景的途径。与大
多数抗癌药相反，检查点抑制剂不一定直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配
体以增强免疫系统的内源性抗肿瘤活性。(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:
252-264)。
多数抗癌药相反，检查点抑制剂不一定直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配
体以增强免疫系统的内源性抗肿瘤活性。(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:
252-264)。
[0173] 如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分减少，抑制，干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调节T细胞的激活或功能。这些蛋白质负责T细胞反应的共刺激性或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调节并维持自我耐受性以及生理免疫
应答的持续时间和幅度。
应答的持续时间和幅度。
[0174] 免疫检查点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制性通路的任何试剂。这样的抑制剂可以包括小分子抑制剂，或者可以包括结合或阻断或抑制免疫
检查点受体配体的抗体或其抗原结合片段。可被靶向从而被阻断或抑制的示例性的免疫检
查点分子包括但不限于，CD25，PD-1(CD279)，PD-L1(CD274，B7-H1)，PD-L2(CD273，B7-DC)，CTLA-4，LAG3(CD223)，TIM3，4-1BB(CD137)，4-1BBL(CD137L)，GITR(TNFRSF18，AITR)，CD40，CD40L，ICOS，ICOS-L，OX40(CD134，TNFRSF4)，OX40L，CXCR2，肿瘤相关抗原(TAA)，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，GAL9，B7H3，B7H4，CD28，VISTA，CD27，CD30，STING，A2A腺苷受体，KIR，2B4(属于CD2分子家族且表达于所有NK，γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上)，CD160(也称作BY55)，CGEN-
15049。免疫检查点抑制剂包括结合以阻断或抑制以下一种或多种的活性的抗体或其抗原
结合片段，或其它结合性蛋白：CD25，PD-1，PD-L1，PD-L2，CTLA-4，LAG3，TIM3，4-1BB，4-
1BBL，GITR，CD40，CD40L，ICOS，ICOS-L，OX40，OX40L，CXCR2，TAA，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，GAL9，CD28，VISTA，CD27，CD30，STING，A2A腺苷受体，KIR，2B4，CD160和CGEN-15049。说明性的免疫检查点抑制剂包括特姆单抗(CTLA-4阻断抗体)，抗OX40，PD-L1单克隆抗体(抗B7-
H1；MEDI4736)，MK-3475(PD-1阻断剂)，尼弗单抗(抗-PD-1抗体)，CT-011(抗-PD-1抗体)，BY55单克隆抗体，AMP224(抗-PD-L1抗体)，BMS-936559(抗-PD-L1抗体)，MPLDL3280A(抗-
PD-L1抗体)，MSB0010718C(抗-PD-L1抗体)和Yervoy/伊匹木单抗(抗-CTLA-4检查点抑制
剂)。
检查点受体配体的抗体或其抗原结合片段。可被靶向从而被阻断或抑制的示例性的免疫检
查点分子包括但不限于，CD25，PD-1(CD279)，PD-L1(CD274，B7-H1)，PD-L2(CD273，B7-DC)，CTLA-4，LAG3(CD223)，TIM3，4-1BB(CD137)，4-1BBL(CD137L)，GITR(TNFRSF18，AITR)，CD40，CD40L，ICOS，ICOS-L，OX40(CD134，TNFRSF4)，OX40L，CXCR2，肿瘤相关抗原(TAA)，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，GAL9，B7H3，B7H4，CD28，VISTA，CD27，CD30，STING，A2A腺苷受体，KIR，2B4(属于CD2分子家族且表达于所有NK，γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上)，CD160(也称作BY55)，CGEN-
15049。免疫检查点抑制剂包括结合以阻断或抑制以下一种或多种的活性的抗体或其抗原
结合片段，或其它结合性蛋白：CD25，PD-1，PD-L1，PD-L2，CTLA-4，LAG3，TIM3，4-1BB，4-
1BBL，GITR，CD40，CD40L，ICOS，ICOS-L，OX40，OX40L，CXCR2，TAA，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，GAL9，CD28，VISTA，CD27，CD30，STING，A2A腺苷受体，KIR，2B4，CD160和CGEN-15049。说明性的免疫检查点抑制剂包括特姆单抗(CTLA-4阻断抗体)，抗OX40，PD-L1单克隆抗体(抗B7-
H1；MEDI4736)，MK-3475(PD-1阻断剂)，尼弗单抗(抗-PD-1抗体)，CT-011(抗-PD-1抗体)，BY55单克隆抗体，AMP224(抗-PD-L1抗体)，BMS-936559(抗-PD-L1抗体)，MPLDL3280A(抗-
PD-L1抗体)，MSB0010718C(抗-PD-L1抗体)和Yervoy/伊匹木单抗(抗-CTLA-4检查点抑制
剂)。
[0175] 程序性细胞死亡1(PD1)是一种免疫检查点蛋白，可在B细胞，NK细胞和T细胞中表达(Shinohara等,1995,Genomics 23:704-6；Blank等,2007,Cancer Immunol Immunother
56:739-45；Finger等,1997,Gene 197:177-87；Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer
12:252-264)。PD1的主要作用是在响应感染的炎症期间限制外周组织中T细胞的活性，以及限制自身免疫性(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。PD1表达在活化的
T细胞中被诱导，PD1与其内源性配体之一的结合通过抑制刺激性激酶来抑制T细胞活化
(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。PD1还起到抑制TCR“终止信号”的作用(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。PD1在Treg细胞上高度表达，
并可在配体存在下增加其增殖(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗
PD 1抗体已用于治疗黑素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，前列腺癌，结肠直肠癌，头颈癌，三阴性乳腺癌，白血病，淋巴瘤和肾细胞癌(Topalian等,2012,N Engl J Med 366:2443-54；
Lipson等,2013,Clin Cancer Res 19:462-8；Berger等,2008,Clin Cancer Res 14:3044-
51；Gildener-Leapman等,2013,Oral Oncol 49:1089-96；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85)。示例性抗PD1抗体包括尼莫单抗(BMS的Opdivo)，派姆单抗(Merck的Keytruda)，匹利珠单抗(Cure Tech的CT-011)，兰博利珠单抗(Merck的MK-3475)和AMP-224(Merck)。
56:739-45；Finger等,1997,Gene 197:177-87；Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer
12:252-264)。PD1的主要作用是在响应感染的炎症期间限制外周组织中T细胞的活性，以及限制自身免疫性(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。PD1表达在活化的
T细胞中被诱导，PD1与其内源性配体之一的结合通过抑制刺激性激酶来抑制T细胞活化
(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。PD1还起到抑制TCR“终止信号”的作用(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。PD1在Treg细胞上高度表达，
并可在配体存在下增加其增殖(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗
PD 1抗体已用于治疗黑素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，前列腺癌，结肠直肠癌，头颈癌，三阴性乳腺癌，白血病，淋巴瘤和肾细胞癌(Topalian等,2012,N Engl J Med 366:2443-54；
Lipson等,2013,Clin Cancer Res 19:462-8；Berger等,2008,Clin Cancer Res 14:3044-
51；Gildener-Leapman等,2013,Oral Oncol 49:1089-96；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85)。示例性抗PD1抗体包括尼莫单抗(BMS的Opdivo)，派姆单抗(Merck的Keytruda)，匹利珠单抗(Cure Tech的CT-011)，兰博利珠单抗(Merck的MK-3475)和AMP-224(Merck)。
[0176] PD-L1(也称为CD274和B7-H1)和PD-L2(也称为CD273和B7-DC)是PD1的配体，存在于活化的T细胞，B细胞，骨髓细胞，巨噬细胞和一些类型的肿瘤细胞。抗肿瘤疗法聚焦于抗PD-L1抗体。PD1和PD-L1的复合物抑制CD8+ T细胞的增殖并降低免疫反应(Topalian等,
2012,N Engl J Med 366:2443-54；Brahmer等,2012,N Eng J Med 366:2455-65)。抗PD-L1抗体已用于治疗非小细胞肺癌，黑素瘤，结肠直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，乳腺癌和血液系统恶性肿瘤(Brahmer等,N Eng J Med 366:2455-65；Ott等,2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等,2013,Clin Cancer Res 19:5541；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Berger等,2008,Clin Cancer Res 14:13044-51)。示例性的抗
PD-L1抗体包括MDX-1105(Medarex)，MEDI4736(Medimmune)MPDL3280A(Genentech)，BMS-
935559(Bristol-Myers Squibb)和MSB0010718C。
2012,N Engl J Med 366:2443-54；Brahmer等,2012,N Eng J Med 366:2455-65)。抗PD-L1抗体已用于治疗非小细胞肺癌，黑素瘤，结肠直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，乳腺癌和血液系统恶性肿瘤(Brahmer等,N Eng J Med 366:2455-65；Ott等,2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等,2013,Clin Cancer Res 19:5541；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Berger等,2008,Clin Cancer Res 14:13044-51)。示例性的抗
PD-L1抗体包括MDX-1105(Medarex)，MEDI4736(Medimmune)MPDL3280A(Genentech)，BMS-
935559(Bristol-Myers Squibb)和MSB0010718C。
[0177] 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)，也称为CD152，是一种共抑制分子，其功能是调节T细胞活化。CTLA-4是免疫球蛋白超家族的成员，仅在T细胞上表达。CTLA-4起抑制T细胞活化的作用，据报道其抑制辅助T细胞活性并增强调节性T细胞免疫抑制活性(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。尽管CTLA-4的确切作用机制仍在
研究中，但有人提出它通过与CD28竞争与CD80和CD86的结合来抑制T细胞活化，并主动向T
细胞传递抑制剂信号(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗CTLA-4抗
体已用于治疗黑素瘤，前列腺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌的临床试验中(Robert和
Ghiringhelli,2009,Oncologist 14:848-61；Ott等,2013,Clin Cancer Res 19:5300；
Weber,2007,Oncologist 12:864-72；Wada等,2013,J Transl Med 11:89)。抗CTLA-4的显
著特征是抗肿瘤作用的动力学，其生理反应所需的初始治疗后的滞后期长达6个月
(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。在一些情况中，肿瘤尺寸实际上在治疗起始后、观察到减少之前，会增加(Pardoll，2012，Nature Reviews Cancer 12:252-
264)。示例性的抗CTLA-4抗体包括伊匹木单抗(Bristol-Myers Squibb)和特姆单抗
(Pfizer)。伊匹木单抗最近已获得FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤(Wada等,2013,J
Transl Med 11:89)。在一些实施方式中，免疫调节剂不是抗CTLA-4抗体。
研究中，但有人提出它通过与CD28竞争与CD80和CD86的结合来抑制T细胞活化，并主动向T
细胞传递抑制剂信号(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗CTLA-4抗
体已用于治疗黑素瘤，前列腺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌的临床试验中(Robert和
Ghiringhelli,2009,Oncologist 14:848-61；Ott等,2013,Clin Cancer Res 19:5300；
Weber,2007,Oncologist 12:864-72；Wada等,2013,J Transl Med 11:89)。抗CTLA-4的显
著特征是抗肿瘤作用的动力学，其生理反应所需的初始治疗后的滞后期长达6个月
(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。在一些情况中，肿瘤尺寸实际上在治疗起始后、观察到减少之前，会增加(Pardoll，2012，Nature Reviews Cancer 12:252-
264)。示例性的抗CTLA-4抗体包括伊匹木单抗(Bristol-Myers Squibb)和特姆单抗
(Pfizer)。伊匹木单抗最近已获得FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤(Wada等,2013,J
Transl Med 11:89)。在一些实施方式中，免疫调节剂不是抗CTLA-4抗体。
[0178] 淋巴细胞活化基因3(LAG-3)，也称为CD223，是另一种免疫检查点蛋白。LAG-3与淋巴细胞活性的抑制有关，在一些情况下还与淋巴细胞失能诱导有关。LAG-3在免疫系统的各种细胞上表达，包括B细胞，NK细胞和树突细胞。LAG-3是II类MHC受体的天然配体，它在浸润黑素瘤的T细胞(包括具有强大免疫抑制活性的T细胞)上充分表达。示例性的抗LAG-3抗体是BMS-986016。IMP321是免疫检查点分子LAG-3的可溶形式，其活化树突细胞，增加抗原呈递。
[0179] 最初在活化的Th1细胞上鉴定的T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)已被证明是免疫反应的负调节剂。TIM-3的阻断促进T细胞介导的抗肿瘤免疫力，并在一
系列小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。TIM-3阻断剂与其它免疫治疗剂(例如TSR-042，抗
CD137抗体等)的组合在增加抗肿瘤作用方面可具有加成或协同作用。TIM-3的表达与多种
不同的肿瘤类型有关，包括黑素瘤，NSCLC和肾癌，此外，肿瘤内TIM-3的表达已显示与多种肿瘤类型(包括NSCLC，宫颈癌，和胃癌)的不良预后有关。TIM-3的阻断也有助于提高对多种慢性病毒性疾病的免疫力。TIM-3也已显示与许多配体相互作用，包括半乳凝素9，磷脂酰丝氨酸和HMGB1，尽管目前尚不清楚其中哪些与抗肿瘤反应的调节有关。
系列小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。TIM-3阻断剂与其它免疫治疗剂(例如TSR-042，抗
CD137抗体等)的组合在增加抗肿瘤作用方面可具有加成或协同作用。TIM-3的表达与多种
不同的肿瘤类型有关，包括黑素瘤，NSCLC和肾癌，此外，肿瘤内TIM-3的表达已显示与多种肿瘤类型(包括NSCLC，宫颈癌，和胃癌)的不良预后有关。TIM-3的阻断也有助于提高对多种慢性病毒性疾病的免疫力。TIM-3也已显示与许多配体相互作用，包括半乳凝素9，磷脂酰丝氨酸和HMGB1，尽管目前尚不清楚其中哪些与抗肿瘤反应的调节有关。
[0180] 4-1BB，也称为CD137，是属于TNFR超家族的跨膜糖蛋白。4-1BB受体存在于活化的T细胞、B细胞和单核细胞上。示例性的抗4-1BB抗体是乌鲁单抗(BMS-663513)，其具有潜在的免疫刺激和抗肿瘤活性。
[0181] 糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)也是TNFR超家族的成员。GITR在活化的T细胞上调，从而增强了免疫系统。示例性的抗GITR抗体是TRX518。
[0182] 分化簇40(CD40)也是TNFR超家族的成员。CD40是一种在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白，可介导多种免疫和炎症反应。CD40在一些恶性肿瘤中也有表达，可促进增殖。示例性的抗CD40抗体是达昔妥珠单抗(SGN-40)，鲁卡妥姆单抗(lucatumumab)(Novartis，拮
抗剂)，SEA-CD40(Seattle Genetics)和CP-870,893。
抗剂)，SEA-CD40(Seattle Genetics)和CP-870,893。
[0183] 肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)，也称为OX40和CD134，是TNFR超家族的另一个成员。OX40不在静息原初T细胞上组成型表达，且起到次级共刺激免疫检查点分子的作用。示例性的抗OX40抗体是MEDI6469和MOXR0916(RG7888，Genentech)。
[0184] CXCR2是一种趋化因子受体，在骨髓来源的抑制细胞(MDSC)上表达。CXCR2有助于肿瘤免疫逃逸。已经显示抗CXCR2单克隆抗体疗法增强了抗PD1抗体诱导的抗肿瘤免疫应答
和抗肿瘤功效。
和抗肿瘤功效。
[0185] 在一些实施方式中，免疫调节剂是细胞因子。在一些实施方式中，免疫调节剂是细胞因子或是在肿瘤微环境中诱导细胞因子表达增加的试剂。“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质的统称，其作用于另一细胞作为细胞间介导物。这类细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制剂；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CgP(GM-CSP)；粒细胞-巨噬细胞-CSF
(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-
6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。例如，免疫调节剂是细胞因子，而细胞因子是IL-4，TNF-α，GM-CSF或IL-2。在一些实施方式中，细胞因子可以是促炎细胞因子，例如PDGF，TGF-β，VEGF，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内皮素-1。在一些实施方式中，细胞因子可以是抗炎细胞因子，例如IL-10。在一些实施方式中，细胞因子是IL-12或IL-2。
(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-
6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。例如，免疫调节剂是细胞因子，而细胞因子是IL-4，TNF-α，GM-CSF或IL-2。在一些实施方式中，细胞因子可以是促炎细胞因子，例如PDGF，TGF-β，VEGF，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内皮素-1。在一些实施方式中，细胞因子可以是抗炎细胞因子，例如IL-10。在一些实施方式中，细胞因子是IL-12或IL-2。
[0186] 在一些实施方式中，免疫调节剂选自GM-CSF，CpG-ODN(CpG寡脱氧核苷酸)，脂多糖(LPS)，单磷酰脂质A(MPL)，明矾，重组利什曼原虫多蛋白，咪喹莫特，MF59，多聚I:C，多聚A:U，1型IFN，Pam3Cys，Pam2Cys，完全弗氏佐剂(CFA)，α-半乳糖苷神经酰胺，RC-529，MDF2β，洛索比滨，抗CD40激动剂，SIRPA拮抗剂，AS04，AS03，鞭毛蛋白，雷西奎莫特，DAP(二氨基庚二酸)，MDP(村酰胺二肽)和CAF01(阳离子佐剂制剂-01)。在一些实施方式中，免疫调节剂是
Toll样受体(TLR)激动剂，佐剂或细胞因子。在一些实施方式中，免疫调节剂是TLR激动剂，并且TLR激动剂是TLR激动剂是TLR4激动剂，TLR7激动剂，TLR8激动剂或TLR9激动剂。在一些实施方式中，TLR激动剂选自三酰化脂蛋白，二酰化脂肽，脂磷壁酸，肽聚糖，酵母聚糖，Pam3CSK4，dsRNA，多聚I:C，多聚G10，多聚G3，CpG，3M003，鞭毛蛋白，脂多糖(LPS)利什曼原体同源物核糖体延伸和起始因子4a(LeIF)，MEDI9197，SD-101和咪唑并喹啉TLR激动剂。
Toll样受体(TLR)激动剂，佐剂或细胞因子。在一些实施方式中，免疫调节剂是TLR激动剂，并且TLR激动剂是TLR激动剂是TLR4激动剂，TLR7激动剂，TLR8激动剂或TLR9激动剂。在一些实施方式中，TLR激动剂选自三酰化脂蛋白，二酰化脂肽，脂磷壁酸，肽聚糖，酵母聚糖，Pam3CSK4，dsRNA，多聚I:C，多聚G10，多聚G3，CpG，3M003，鞭毛蛋白，脂多糖(LPS)利什曼原体同源物核糖体延伸和起始因子4a(LeIF)，MEDI9197，SD-101和咪唑并喹啉TLR激动剂。
[0187] 在一些实施方式中，免疫调节剂可包含一种或多种白介素或其它细胞因子。例如，白介素可以包括白细胞白介素注射液(Multikine)，其是天然细胞因子的组合。
[0188] 在一些实施方式中，免疫调节剂是Toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施方式中，此类激动剂可包括TLR4激动剂，TLR8激动剂或TLR9激动剂。这类激动剂可选自肽聚糖，多聚I:C，CpG，3M003，鞭毛蛋白和真核细胞核糖体延长和起始因子4a的利什曼原虫同源物
(LeIF)。
(LeIF)。
[0189] 在一些实施方式中，免疫调节剂可以是增强肿瘤细胞的免疫原性的试剂，例如帕特匹龙(埃博霉素B)，靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体7A7.27，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(例如伏立诺他，罗咪酯肽，帕比司他，贝林诺特和恩替诺特)，n3-多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，紫草素(紫草紫苏根的主要成分)和溶
瘤病毒，例如TVec(塔利兰帕))。在一些实施方式中，免疫调节剂活化癌症或肿瘤的免疫原性细胞死亡，例如抗环蛋白(阿霉素，米托蒽醌)，BK通道激动剂，硼替佐米，硼替佐米加丝裂霉素C加hTert-Ad，心苷加非ICD诱导剂，环磷酰胺，GADD34/PP1抑制剂加丝裂霉素，LV-
tSMAC和奥沙利铂。在一些实施方式中，免疫调节剂可以是表观遗传疗法，例如DNA甲基转移酶抑制剂(例如地西他滨，5-氮杂-2'-脱氧胞苷)。
瘤病毒，例如TVec(塔利兰帕))。在一些实施方式中，免疫调节剂活化癌症或肿瘤的免疫原性细胞死亡，例如抗环蛋白(阿霉素，米托蒽醌)，BK通道激动剂，硼替佐米，硼替佐米加丝裂霉素C加hTert-Ad，心苷加非ICD诱导剂，环磷酰胺，GADD34/PP1抑制剂加丝裂霉素，LV-
tSMAC和奥沙利铂。在一些实施方式中，免疫调节剂可以是表观遗传疗法，例如DNA甲基转移酶抑制剂(例如地西他滨，5-氮杂-2'-脱氧胞苷)。
[0190] 例如，在一些实施方式中，免疫调节剂可以是DNA甲基转移酶抑制剂，其可以调节肿瘤相关抗原(TAA)的表达。TAA是在肿瘤细胞中产生的抗原物质，可触发免疫应答。TAA通常在肿瘤中被DNA甲基化下调以逃避免疫系统。DNA甲基化的逆转可恢复TAA的表达，增加肿瘤细胞的免疫原性。例如，去甲基化剂如地西他滨(5-氮杂2'-脱氧胞苷)可以上调肿瘤细胞中TAA的表达，并增强癌细胞的免疫识别能力。光免疫疗法将通过破坏细胞而进一步将TAA
暴露于免疫系统。
暴露于免疫系统。
[0191] 在一些实施方式中，本文提供的双重偶联物可包含一种或多种免疫调节剂。在一些实施方式中，一种或多种免疫调节剂是相同或不同的。在一些实施方式中，双重偶联物可包含两种或更多种不同的免疫调节剂。
[0192] 示例性的免疫调节剂可包括但不限于贝伐单抗(bevacizumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，帕尼单抗(panitumumab)，扎鲁妥珠单抗，尼莫妥珠单抗，托西妥单抗
利妥昔单抗(Rituxan，Mabthera)，替伊莫单抗(Zevalin)，达珠单抗
(Zenapax)，吉妥单抗(Mylotarg)，阿仑单抗，CEA-Scan Fab片段，OC125单克隆抗体，
ab75705，B72.3，贝伐单抗 巴利昔单抗(Basiliximab)，尼莫单抗
(nivolumab)，派姆单抗(pembrolizumab)，匹利珠单抗(pidilizumab)，MK-3475，BMS-
936559，MPDL3280A，伊匹木单抗，特姆单抗，IMP321，BMS-986016，LAG525，乌鲁单抗，PF-
05082566，TRX518，MK-4166，达昔妥珠单抗，鲁卡妥姆单抗，SEA-CD40，CP-870，CP-893，MED16469，MEDI6383，MEDI4736，MOXR0916，AMP-224，PDR001，MSB0010718C，rHIgM12B7，乌克普鲁单抗，BKT140，伐立鲁单抗(CDX-1127)，ARGX-110，MGA271，利瑞单抗(BMS-986015，IPH2101)，IPH2201，AGX-115，尹玛克妥珠单抗，CC-90002和MNRP1685A，或是其抗体结合性片段。在一些实施方式中，免疫调节剂是抗体或其抗原结合抗体片段。示例性的此类抗体包括但不限于，达珠单抗(Zenapax)，贝伐单抗 巴利昔单抗，伊匹木单抗，尼莫单
抗，派姆单抗，MPDL3280A，匹利珠单抗(CT-011)，MK-3475，BMS-936559，MPDL3280A(阿特珠单抗)，特姆单抗，IMP321，BMS-986016，LAG525，乌鲁单抗，PF-05082566，TRX518，MK-4166，达昔妥珠单抗(SGN-40)，鲁卡妥姆单抗(HCD122)，SEA-CD40，CP-870，CP-893，MEDI6469，MEDI6383，MOXR0916，AMP-224，MSB0010718C(阿维鲁单抗)，MEDI4736，PDR001，rHIgM12B7，乌克普鲁单抗，BKT140，伐立鲁单抗(CDX-1127)，ARGX-110，MGA271，利瑞单抗(BMS-986015，IPH2101)，IPH2201，ARGX-115，尹玛克妥珠单抗，CC-90002和MNRP1685A，或其抗体结合性片段。
利妥昔单抗(Rituxan，Mabthera)，替伊莫单抗(Zevalin)，达珠单抗
(Zenapax)，吉妥单抗(Mylotarg)，阿仑单抗，CEA-Scan Fab片段，OC125单克隆抗体，
ab75705，B72.3，贝伐单抗 巴利昔单抗(Basiliximab)，尼莫单抗
(nivolumab)，派姆单抗(pembrolizumab)，匹利珠单抗(pidilizumab)，MK-3475，BMS-
936559，MPDL3280A，伊匹木单抗，特姆单抗，IMP321，BMS-986016，LAG525，乌鲁单抗，PF-
05082566，TRX518，MK-4166，达昔妥珠单抗，鲁卡妥姆单抗，SEA-CD40，CP-870，CP-893，MED16469，MEDI6383，MEDI4736，MOXR0916，AMP-224，PDR001，MSB0010718C，rHIgM12B7，乌克普鲁单抗，BKT140，伐立鲁单抗(CDX-1127)，ARGX-110，MGA271，利瑞单抗(BMS-986015，IPH2101)，IPH2201，AGX-115，尹玛克妥珠单抗，CC-90002和MNRP1685A，或是其抗体结合性片段。在一些实施方式中，免疫调节剂是抗体或其抗原结合抗体片段。示例性的此类抗体包括但不限于，达珠单抗(Zenapax)，贝伐单抗 巴利昔单抗，伊匹木单抗，尼莫单
抗，派姆单抗，MPDL3280A，匹利珠单抗(CT-011)，MK-3475，BMS-936559，MPDL3280A(阿特珠单抗)，特姆单抗，IMP321，BMS-986016，LAG525，乌鲁单抗，PF-05082566，TRX518，MK-4166，达昔妥珠单抗(SGN-40)，鲁卡妥姆单抗(HCD122)，SEA-CD40，CP-870，CP-893，MEDI6469，MEDI6383，MOXR0916，AMP-224，MSB0010718C(阿维鲁单抗)，MEDI4736，PDR001，rHIgM12B7，乌克普鲁单抗，BKT140，伐立鲁单抗(CDX-1127)，ARGX-110，MGA271，利瑞单抗(BMS-986015，IPH2101)，IPH2201，ARGX-115，尹玛克妥珠单抗，CC-90002和MNRP1685A，或其抗体结合性片段。
[0193] 在一些实施方式中，例如，如果用双重偶联物随后光照射处理肿瘤增加了肿瘤中免疫抑制细胞的存在或增加了肿瘤上免疫抑制标志物的表达，则双重偶联物中的治疗剂可
包括治疗有效量的免疫调节剂，其能够减少肿瘤中免疫抑制细胞的数量或活性，或者能够
阻断免疫抑制标志物的活性，或者能够降低肿瘤中肿瘤促进性细胞的活性，或者能够阻断
肿瘤促进性标志物的活性，可被给予。
包括治疗有效量的免疫调节剂，其能够减少肿瘤中免疫抑制细胞的数量或活性，或者能够
阻断免疫抑制标志物的活性，或者能够降低肿瘤中肿瘤促进性细胞的活性，或者能够阻断
肿瘤促进性标志物的活性，可被给予。
[0194] b.抗癌剂
[0195] 在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，治疗剂是抗癌剂。在一些实施方式中，抗癌剂可以包括其应用可减少、阻止或预防对象的癌症的任何药剂。任选地，可以将其它抗癌剂与本文提供的双重偶联物(例如，包含免疫调节剂的双重偶联物)一起用于联合治
疗，例如以治疗各种癌症。
疗，例如以治疗各种癌症。
[0196] 如本文所述，通过将一种或多种双重偶联物给予患有肿瘤的对象并联合照射所致的肿瘤细胞的PIT诱导的细胞杀伤能导致肿瘤透过性增加，例如肿瘤空间周围的血管透过
性增加。本文认为透过性的增加可导致全身可利用的分子迅速渗漏到肿瘤空间中，从而使
肿瘤对此类分子的暴露最大化。在这样的实施方式中，在照射和PIT诱导的肿瘤细胞杀伤之后，借助于靶向分子结合到肿瘤微环境(TME)中存在的细胞表面分子，抗癌剂在肿瘤的局部微环境中可获得，所述抗癌剂可被立即摄取进入肿瘤空间并在此处发挥治疗作用。
性增加。本文认为透过性的增加可导致全身可利用的分子迅速渗漏到肿瘤空间中，从而使
肿瘤对此类分子的暴露最大化。在这样的实施方式中，在照射和PIT诱导的肿瘤细胞杀伤之后，借助于靶向分子结合到肿瘤微环境(TME)中存在的细胞表面分子，抗癌剂在肿瘤的局部微环境中可获得，所述抗癌剂可被立即摄取进入肿瘤空间并在此处发挥治疗作用。
[0197] 在本文提供的双重偶联物的一些实施方式中，治疗剂例如抗癌剂通过可释放的或可裂解的接头与酞菁染料或靶向分子连接。在一些实施方式中，接头的裂解允许治疗剂从
双重偶联物释放，从而在双重偶联物定位或靶向病灶部位或微环境后，将治疗剂例如抗癌
剂直接靶向涉及疾病、紊乱或病症中涉及的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境。因此，双重偶联物可允许抗癌剂在肿瘤微环境中靶向递送和/或释放。
双重偶联物释放，从而在双重偶联物定位或靶向病灶部位或微环境后，将治疗剂例如抗癌
剂直接靶向涉及疾病、紊乱或病症中涉及的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境。因此，双重偶联物可允许抗癌剂在肿瘤微环境中靶向递送和/或释放。
[0198] 与其中全身性给予治疗剂并需要分开给予治疗剂的联合治疗方法不同，本文提供的双重偶联物允许将其它治疗剂例如抗癌剂快速有效地递送至病灶位点或微环境，并减少
实现治疗作用所需的任何滞后时间，因为抗癌剂可直接且立即被摄入肿瘤空间。这可以使
对抗癌药的治疗反应最大化。
实现治疗作用所需的任何滞后时间，因为抗癌剂可直接且立即被摄入肿瘤空间。这可以使
对抗癌药的治疗反应最大化。
[0199] 在一些实施方式中，包含在本文提供的双重偶联物中的治疗剂是抗癌剂，可指用于抗癌治疗的任何试剂或化合物。这些包括单独或与其它化合物组合使用时可减轻，减少，改善，预防或设置或维持与肿瘤和癌症相关的临床症状缓解或诊断标志物的状态的任何物
质，并可用于本文提供的组合和组合物。在一些实施方式中，抗癌剂是这样一种物质，其治疗效果通常与抗癌剂渗透或递送至肿瘤微环境或肿瘤空间有关。
质，并可用于本文提供的组合和组合物。在一些实施方式中，抗癌剂是这样一种物质，其治疗效果通常与抗癌剂渗透或递送至肿瘤微环境或肿瘤空间有关。
[0200] 在一些实施方式中，抗癌剂是抗癌剂是烷化剂，铂类药物，抗代谢物，抗肿瘤抗生素，拓扑异构酶抑制剂，有丝分裂抑制剂，皮质类固醇，蛋白酶体抑制剂，激酶抑制剂，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，抗肿瘤剂或其抗体或抗原结合抗体片段或其组合。在一些实施方式中，抗癌剂是肽，蛋白质或小分子药物。
[0201] 在一些实施方式中，抗癌剂是5-氟尿嘧啶/亚叶酸(leukovorin)，奥沙利铂，伊立替康，雷戈非尼，齐夫-阿非普西，卡培他滨，顺铂，紫杉醇，托普替康，卡铂，吉西他滨，多西他赛，5-FU，异环磷酰胺，丝裂霉素，培美曲塞，长春瑞滨，卡莫司汀韦格(carmustine
wager)，替莫唑胺，甲氨蝶呤，卡巴他滨，拉帕替尼，依托泊苷，达布拉非尼，维拉非尼，脂质体阿糖胞苷，阿糖胞苷，干扰素α，厄洛替尼，长春新碱，环磷酰胺，洛美霉素，普罗卡巴嗪，舒尼替尼，索马他汀，阿霉素，聚乙二醇化脂质体包封的阿霉素，表柔比星，艾瑞布林
(eribulin)，结合白蛋白的紫杉醇，伊沙匹隆，磺胺甲基异噁唑(cotrimoxazole)，紫杉烷，长春碱，替西罗莫司，替莫唑胺，苯达莫司汀，口服依托泊苷，依维莫司，奥曲肽，兰瑞肽，达卡巴嗪，梅斯纳，帕唑帕尼，艾瑞布林，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，他莫昔芬，托瑞米芬，放线菌素，西罗莫司，克唑替尼，赛替尼，恩杂鲁胺，醋酸阿比特龙，米托蒽醌，卡巴他赛，氟嘧啶，奥沙利铂，亚叶酸钙，阿法替尼，塞立替尼，吉非替尼，卡波替尼，奥沙利铂或金尿嘧啶。
wager)，替莫唑胺，甲氨蝶呤，卡巴他滨，拉帕替尼，依托泊苷，达布拉非尼，维拉非尼，脂质体阿糖胞苷，阿糖胞苷，干扰素α，厄洛替尼，长春新碱，环磷酰胺，洛美霉素，普罗卡巴嗪，舒尼替尼，索马他汀，阿霉素，聚乙二醇化脂质体包封的阿霉素，表柔比星，艾瑞布林
(eribulin)，结合白蛋白的紫杉醇，伊沙匹隆，磺胺甲基异噁唑(cotrimoxazole)，紫杉烷，长春碱，替西罗莫司，替莫唑胺，苯达莫司汀，口服依托泊苷，依维莫司，奥曲肽，兰瑞肽，达卡巴嗪，梅斯纳，帕唑帕尼，艾瑞布林，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，他莫昔芬，托瑞米芬，放线菌素，西罗莫司，克唑替尼，赛替尼，恩杂鲁胺，醋酸阿比特龙，米托蒽醌，卡巴他赛，氟嘧啶，奥沙利铂，亚叶酸钙，阿法替尼，塞立替尼，吉非替尼，卡波替尼，奥沙利铂或金尿嘧啶。
[0202] 在一些实施方式中，抗癌剂是抗体或抗原结合抗体片段。在一些实施方式中，抗癌剂可以是以下任何一种或多种：贝伐单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，雷莫昔单抗，伊匹木单抗，利妥昔单抗，曲妥珠单抗，阿多曲妥珠单抗美坦，培妥珠单抗，尼古鲁单抗，拉帕替尼，达拉非尼，维拉非尼，厄洛替尼，舒尼替尼，帕唑帕尼，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，克唑替尼，赛替尼，阿法替尼，阿西替尼，贝伐单抗，博舒替尼，卡博替尼，阿法替尼，吉非替尼，替西罗莫司，依维莫司，西罗莫司，依鲁替尼，伊马替尼，乐伐替尼，奥拉帕尼，帕博西尼，鲁索替尼，曲美替尼，凡德他尼或维莫德吉或其抗原结合抗体片段。
[0203] 在一些实施方式中，抗癌剂是烷基化剂。烷基化剂是通过与核酸形成共价键并抑制DNA合成而直接破坏DNA的化合物。示例性的烷基化剂包括但不限于甲乙胺，环磷酰胺，异环磷酰胺，美法仑，苯丁酸氮芥，白消安和噻替帕，以及亚硝基脲烷基化剂，例如卡莫司汀和洛莫斯汀。
[0204] 在一些实施方式中，抗癌剂是铂类药物。铂类药物与DNA结合并引起DNA交联，最终引发细胞凋亡。示例性的铂类药物包括但不限于顺铂，卡铂，奥沙利铂，沙特铂，吡铂，奈达铂，三叶铂和脂铂。
[0205] 在一些实施方式中，抗癌剂是抗代谢物。抗代谢物通过替代正常的RNA和DNA构成成分来干扰DNA和RNA的生长。这些物质会在细胞的染色体被复制的S期破坏细胞。在一些情况下，抗代谢物可用于治疗白血病，乳腺癌，卵巢癌和肠癌以及其它类型的癌症。示例性抗代谢物包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)，6-巯基嘌呤(6-MP)，卡培他滨 阿糖胞
苷 氟尿苷，氟达拉滨，吉西他滨 羟基脲，甲氨蝶呤和培美曲塞
苷 氟尿苷，氟达拉滨，吉西他滨 羟基脲，甲氨蝶呤和培美曲塞
[0206] 在一些实施方式中，抗癌剂是抗肿瘤抗生素。抗肿瘤抗生素通过改变癌细胞内的DNA来阻止其生长和扩增。蒽环类抗生素是抗肿瘤抗生素，可干扰涉及DNA复制的酶。这些药物通常在细胞周期的所有阶段起作用。它们可以广泛用于多种癌症。示例性蒽环类药物包
括但不限于柔红霉素，阿霉素，表柔比星和伊达比星。其它抗肿瘤抗生素包括放线菌素D，博来霉素，丝裂霉素C和米托蒽醌。
括但不限于柔红霉素，阿霉素，表柔比星和伊达比星。其它抗肿瘤抗生素包括放线菌素D，博来霉素，丝裂霉素C和米托蒽醌。
[0207] 在一些实施方式中，该抗癌剂是拓扑异构酶抑制剂。这些药物干扰称为拓扑异构酶的酶，该酶有助于分离DNA链，因此可以在S期复制。拓扑异构酶抑制剂可用于治疗一些白血病，以及肺癌，卵巢癌，胃肠道癌和其它癌症。示例性的拓扑异构酶抑制剂包括但不限于阿霉素，托泊替康，伊立替康(CPT-11)，依托泊苷(VP-16)，替尼泊苷和米托蒽醌。
[0208] 在一些实施方式中，抗癌剂是有丝分裂抑制剂。有丝分裂抑制剂通常是植物生物碱和衍生自天然植物产品的其它化合物。它们通过在细胞周期的M阶段停止有丝分裂而起
作用，但是在一些情况下，可以通过阻止酶产生细胞繁殖所需的蛋白质来破坏所有阶段的
细胞。示例性的有丝分裂抑制剂包括但不限于紫杉醇 多西他赛 依
沙贝比 隆 长 春碱 长春 新碱 长 春瑞 滨
和雌莫司汀
作用，但是在一些情况下，可以通过阻止酶产生细胞繁殖所需的蛋白质来破坏所有阶段的
细胞。示例性的有丝分裂抑制剂包括但不限于紫杉醇 多西他赛 依
沙贝比 隆 长 春碱 长春 新碱 长 春瑞 滨
和雌莫司汀
[0209] 在一些实施方式中，抗癌剂是皮质类固醇。皮质类固醇，通常简称为类固醇，是天然激素和类激素药物，可用于治疗多种类型的癌症。皮质类固醇也可在化疗之前用于帮助预防过敏反应，以及在化疗期间和之后用于预防恶心和呕吐。示例性的皮质类固醇包括但
不限于泼尼松，甲基强的松龙 和地塞米松
不限于泼尼松，甲基强的松龙 和地塞米松
[0210] 在一些实施方式中，抗癌剂是另一种化学疗法药物，例如蛋白酶体抑制剂，激酶抑制剂或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。在其它实施方式中，抗癌剂是生物制剂，例如用于癌症治疗的抗体。
[0211] 在一些实施方式中，抗癌剂靶向与各种癌症有关的肿瘤。癌症可以是位于对象体内的任何癌症，例如但不限于位于头和颈部，乳腺，肝，结肠，卵巢，前列腺，胰腺，脑，子宫颈，骨，皮肤，眼睛，膀胱，胃，食道，腹膜或肺的癌症。例如，抗癌剂可用于治疗结肠癌，子宫颈癌，中枢神经系统癌，乳腺癌，膀胱癌，肛门癌，头颈癌，卵巢癌，子宫内膜癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，神经内分泌癌，软组织癌，阴茎癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，胆囊癌或食管癌。在一些情况下，癌症可以是血液癌症。
[0212] B.组分的连接
[0213] 在一些实施方式中，本文提供的双重偶联物的组分，酞菁染料(例如IR700)，靶向分子(例如抗体或其抗原结合片段)和治疗剂(例如免疫调节剂或抗癌剂)直接或间接连接
到其它组分。在一些实施方式中，本文提供的双重偶联物包含各组分中的一种或多种，例如一种或多种酞菁染料，一种或多种靶向分子和一种或多种治疗剂，并且各连接独立地可以
是直接或间接的，例如，通过接头。在一些实施方式中，酞菁染料与靶向分子和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。在一些实施方式中，该连接是间接的，例如通过接头，例如可裂解的接头。
到其它组分。在一些实施方式中，本文提供的双重偶联物包含各组分中的一种或多种，例如一种或多种酞菁染料，一种或多种靶向分子和一种或多种治疗剂，并且各连接独立地可以
是直接或间接的，例如，通过接头。在一些实施方式中，酞菁染料与靶向分子和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。在一些实施方式中，该连接是间接的，例如通过接头，例如可裂解的接头。
[0214] 在一些实施方式中，酞菁染料与靶向分子或治疗剂直接或间接连接。在一些实施方式中，酞菁染料与靶向分子和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。在一些实施方式中，酞菁染料与靶向分子或治疗剂直接连接。
[0215] 在一些实施方式中，治疗剂与酞菁染料或靶向分子直接或间接连接。在一些实施方式中，治疗剂与酞菁染料或靶向分子之间的连接是共价或非共价的。在一些实施方式中，治疗剂与酞菁染料或靶向分子直接连接。
[0216] 在一些实施方式中，靶向分子与酞菁染料或治疗剂直接或间接连接。在一些实施方式中，治疗剂与酞菁染料或靶向分子之间的连接是共价或非共价的。在一些实施方式中，靶向分子与酞菁染料或治疗剂直接连接。例如，在一些实施方式中，靶向分子直接或间接与酞菁染料和/或治疗剂连接。在一些实施方式中，靶向分子直接或间接连接至一种或多种酞菁染料分子和一种或多种治疗剂分子。在一些实施方式中，各连接独立地是直接或间接的。
[0217] 在一些实施方式中，靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂通过共价键或非共价相互作用直接或间接连接至其它组分。在一些实施方式中，共价或非共价相互作用或连接是直接
或间接的。在一些实施方式中，连接包括间接连接，例如通过接头，结合部分或结构域或反应性基团。在一些实施方式中，连接包括靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂之间的直接相互作用。在其它实施方式中，靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂中的一个或两个或全部与一个或多个接头连接，并且相互作用是间接的，例如在连接至分子之一的接头与另一分子之间，或者在各自连接至靶向分子和/或酞菁染料的两个接头之间。
或间接的。在一些实施方式中，连接包括间接连接，例如通过接头，结合部分或结构域或反应性基团。在一些实施方式中，连接包括靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂之间的直接相互作用。在其它实施方式中，靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂中的一个或两个或全部与一个或多个接头连接，并且相互作用是间接的，例如在连接至分子之一的接头与另一分子之间，或者在各自连接至靶向分子和/或酞菁染料的两个接头之间。
[0218] 在一些实施方式中，靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂与其它组分非共价连接或关联。例如，酞菁染料通过非共价相互作用与靶向分子和/或治疗剂形成复合物。在一些实施方式中，酞菁染料包含能够与靶向分子的附连基团(attachment group)非共价相互作用的
部分或结构域。
部分或结构域。
[0219] 在一些实施方式中，在产生本文提供的双重偶联物中，可将所述组分例如靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂与其它组分孵育或结合，以在染料和其它组分之间形成非共价相互作用。在一些实例中，靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂之间的非共价相互作用包括，例如，静电相互作用，范德华力，疏水相互作用，π效应，离子相互作用，氢键，卤素结合和/或它们的组合，或取决于一种或多种力的任何相互作用。在一些实施方式中，靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂通过利用模拟非共价分子相互作用的相互作用而连接，所述相互作用例如，配体-受体相互作用，抗体-抗原相互作用，亲和素-生物素相互作用，链霉亲和素-生物素相互作用，组氨酸-二价金属离子相互作用(例如，Ni，Co，Cu，Fe)，多聚化(例如，二聚化)结构域之间的相互作用，谷胱甘肽S-转移酶(GST)-谷胱甘肽相互作用和/或其任意组合。
[0220] 在一些实施方式中，非共价相互作用部分或结构域附连至或是靶向分子，酞菁染料和/或治疗剂的部分，并且与所述双重偶联物的其它组分形成非共价相互作用，例如复合物。例如，在一些实施方式中，非共价相互作用分子或结构域附连至或是酞菁染料分子的部分，并且与靶向分子和/或治疗剂形成非共价相互作用，例如，复合物。在其它实施方式中，非共价相互作用分子或结构域附连至或是靶向剂的部分，并且与酞菁染料分子和/或治疗
剂形成非共价相互作用，例如复合物。在其它实施方式中，非共价相互作用分子或结构域附连至或是治疗剂的部分，并且与靶向分子和/或酞菁染料分子形成非共价相互作用，例如复合物。在一些实施方式中，偶联至生物素或其类似物(例如抗体-生物素，例如西妥昔单抗-生物素)的靶向分子和偶联至亲和素或其类似物或链霉亲和素或其类似物的酞菁染料和/
或治疗剂，包括其单体形式(例如单体亲和素-IR700或单体链酶亲和素-IR700；或单体亲和素治疗剂或单体链酶亲和素-治疗剂，例如单体亲和素-IL-12或单体链酶亲和素-IL-12)经
孵育或接触，用于产生双重偶联物。由于亲和素，链霉亲和素或其类似物与生物素或其类似物之间的非共价相互作用，在一些实施方式中，酞菁染料和/或治疗剂与靶向分子形成非共价复合物。
剂形成非共价相互作用，例如复合物。在其它实施方式中，非共价相互作用分子或结构域附连至或是治疗剂的部分，并且与靶向分子和/或酞菁染料分子形成非共价相互作用，例如复合物。在一些实施方式中，偶联至生物素或其类似物(例如抗体-生物素，例如西妥昔单抗-生物素)的靶向分子和偶联至亲和素或其类似物或链霉亲和素或其类似物的酞菁染料和/
或治疗剂，包括其单体形式(例如单体亲和素-IR700或单体链酶亲和素-IR700；或单体亲和素治疗剂或单体链酶亲和素-治疗剂，例如单体亲和素-IL-12或单体链酶亲和素-IL-12)经
孵育或接触，用于产生双重偶联物。由于亲和素，链霉亲和素或其类似物与生物素或其类似物之间的非共价相互作用，在一些实施方式中，酞菁染料和/或治疗剂与靶向分子形成非共价复合物。
[0221] 在一些实施方式中，治疗剂通过接头间接连接至酞菁染料或靶向分子。例如，接头可以是肽，多肽或化学接头。本领域已知的任何肽接头，多肽接头和化学接头可用于本文提供的双重偶联物中。例如，接头是肽接头或可裂解的肽接头。在一些实施方式中，该接头是共价接头，其中该共价连接是直链或支化的，环状或杂环的，饱和或不饱和的，具有1-60个原子，例如选自C，N，P，O和S。在一些实施方式中，该连接，例如化学连接，可包括醚，硫醚，胺，酯，氨基甲酸酯，脲，硫脲，氧基或酰胺键的任何组合。在一些实施方式中，该连接，例如化学连接，可包括单，双，三或芳族碳-碳键，磷-氧，磷-硫，氮-氮，氮-氧，氮-铂键或芳族或杂芳键。
[0222] 例如，在一些实施方式中，接头可以是具有反应性或可活化基团的接头，其能够在接头和与之连接的组分之间形成键。在一些实施方式中，酞菁染料包含接头，即，是接头-酞菁染料部分。在一些实施方式中，接头包含反应性基团。
[0223] 在一些实施方式中，治疗剂通过可释放或可裂解的接头与酞菁染料和/或靶向分子连接。在一些实施方式中，接头是不可裂解的。在一些实施方式中，接头的释放或裂解允许治疗剂从双重偶联物释放。因此，通过结合病灶微环境中细胞上的细胞表面分子的靶向
分子，可将治疗剂靶向或直接递送至疾病、紊乱或病症中涉及的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境中。
分子，可将治疗剂靶向或直接递送至疾病、紊乱或病症中涉及的细胞和/或释放到与疾病、紊乱或病症相关的病灶的微环境中。
[0224] 如本文所用，术语“可释放的接头”或“可裂解的接头”是指包括在生理条件下可断裂的至少一个键的接头(例如，pH不稳定，酸不稳定，氧化不稳定或酶-不稳定键)。导致化学键断裂的生理条件可以包括标准的化学水解反应，其发生在例如生理pH下，或者因特定微环境(例如，病灶的微环境，例如肿瘤微环境(TME))中存在的特定条件而发生。
[0225] 在一些实施方式中，可释放的接头或可裂解的接头在病灶的微环境中被释放或裂解。在一些实施方式中，病灶与特定的微环境或生理状况相关。例如，在一些实施方式中，病灶是肿瘤，并且例如在酸性或低氧条件下，可释放的接头或可裂解的接头在肿瘤微环境
(TME)中被释放或裂解。
(TME)中被释放或裂解。
[0226] 可用于本文提供的双重偶联物、组合物和方法中的多种示例性接头包括WO2004-010957，美国公开号20060074008、20050238649和20060024317中描述的那些。
[0227] 在一些实施方式中，该接头可被存在于病灶的微环境中的裂解剂裂解。接头可以是例如被肽酶或蛋白酶裂解的肽基接头。例如，可释放的接头或可裂解的接头被TME中存在的基质金属蛋白酶(MMP)释放或裂解。在一些实施方式中，可裂解的接头包含氨基酸Pro-
Leu-Gly-Leu-Trp-Ala的序列(如SEQ ID NO:53所示)。在一些实施方式中，该接头可被在病灶的微环境中过表达的裂解剂裂解。在一些实施方式中，示例性的接头包括至少两个氨基
酸长或至少三个氨基酸长的肽基接头。示例性的接头包括Phe-Leu接头，Gly-Phe-Leu-Gly
接头(SEQ ID NO:54)，Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见例如美国专利6,214,345)。此类接头的其它示例描述于，例如，美国专利号6,214,345和Lu等,(2016)Int.J.Mol.Sci.17(4):
561。在一些实施方式中，接头是可被在肿瘤间质中过表达的酶如β-葡糖醛酸糖苷酶裂解的接头。在一些实施方式中，接头是β-葡糖苷酸接头。
Leu-Gly-Leu-Trp-Ala的序列(如SEQ ID NO:53所示)。在一些实施方式中，该接头可被在病灶的微环境中过表达的裂解剂裂解。在一些实施方式中，示例性的接头包括至少两个氨基
酸长或至少三个氨基酸长的肽基接头。示例性的接头包括Phe-Leu接头，Gly-Phe-Leu-Gly
接头(SEQ ID NO:54)，Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见例如美国专利6,214,345)。此类接头的其它示例描述于，例如，美国专利号6,214,345和Lu等,(2016)Int.J.Mol.Sci.17(4):
561。在一些实施方式中，接头是可被在肿瘤间质中过表达的酶如β-葡糖醛酸糖苷酶裂解的接头。在一些实施方式中，接头是β-葡糖苷酸接头。
[0228] 在一些实施方式中，可释放的接头或可裂解的接头在低氧条件或酸性条件下被释放或裂解。在一些实施方式中，TME中的条件是酸性或低氧的。在一些实施方式中，接头在缺氧条件下是酸不稳定的或可裂解的。在一些实施方式中，所述可裂解的接头在酸性条件下
是可裂解的，并且所述可裂解的接头包括一个或多个腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic amide)、原酸酯、缩醛、缩酮、4-(4′-乙酰苯氧基)丁酸或硫醚连接。在一些实施方式中，所述可裂解的接头在缺氧条件下是可裂解的，并且所述接头包括一个或
多个二硫键。
是可裂解的，并且所述可裂解的接头包括一个或多个腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic amide)、原酸酯、缩醛、缩酮、4-(4′-乙酰苯氧基)丁酸或硫醚连接。在一些实施方式中，所述可裂解的接头在缺氧条件下是可裂解的，并且所述接头包括一个或
多个二硫键。
[0229] 在其它实施方式中，可切割接头具有pH敏感性，即某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感性接头可在酸性条件下，例如病灶的微环境下水解。例如，可使用能在酸性微环境中水解的酸不稳定性接头(如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、缩醛或缩酮连接)。在一些实施方式中，示例性的接头包括例如以下描述的那些，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；
Neville等,1989,Biol.Chem.264:14653-14661。这样的接头在中性pH条件(例如血液中那
些)下相对稳定，但是在酸性条件下不稳定。
Neville等,1989,Biol.Chem.264:14653-14661。这样的接头在中性pH条件(例如血液中那
些)下相对稳定，但是在酸性条件下不稳定。
[0230] 在某些实施方式中，可水解接头是硫醚接头(如通过酰腙键连接治疗剂的硫醚(参见例如，美国专利号5,622,929))。
[0231] 在其它实施方式中，该接头在还原条件下可裂解(如二硫化物接头)。本领域已知多种二硫化物接头，包括例如，可用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸
酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些(参见例如，Thorpe等,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等,刊于《免疫偶联物：癌症的放射成像和治疗中的抗体偶联物(Immunoconjugates:Antibody
Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer)》(C.W.Vogel编,牛津大学出版社
(Oxford U.Press),1987。还参见美国专利号4,880,935)。
酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些(参见例如，Thorpe等,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等,刊于《免疫偶联物：癌症的放射成像和治疗中的抗体偶联物(Immunoconjugates:Antibody
Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer)》(C.W.Vogel编,牛津大学出版社
(Oxford U.Press),1987。还参见美国专利号4,880,935)。
[0232] 在其它具体实施方式中，接头是丙二酸接头(Johnson等，1995，Anticancer Res.15:1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-
1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
[0233] 在一些实施方式中，可裂解的接头可通过光照射裂解。在一些实施方式中，接头是光不稳定的。在一些实施方式中，接头包含一个或多个光不稳定的苯甲酸酯，光不稳定的肼或光不稳定的邻硝基苄基连接或光不稳定的喹喔啉与硫醚。
[0234] II.治疗方法
[0235] 在一些实施方式中，提供了使用和用于使用包含双重偶联物的组合物的方法，所述双重偶联物包含酞菁染料(例如IR-700)，靶向分子(例如抗体或其抗原结合片段)和治疗
剂(例如，免疫调节剂或抗癌剂)。在一些实施方式中，双重偶联物被靶向至或靶向与疾病、紊乱或病症相关的细胞或病原体，例如通过结合至细胞上表达的细胞表面分子或细胞表面
受体。此类方法和应用包括治疗方法和应用，例如，涉及将双重偶联物给予患有疾病、病症或紊乱的对象，然后进行照射以实现光免疫疗法(PIT)，从而导致此类细胞或病原体的光解作用，以有效治疗所述疾病、紊乱或病症。
剂(例如，免疫调节剂或抗癌剂)。在一些实施方式中，双重偶联物被靶向至或靶向与疾病、紊乱或病症相关的细胞或病原体，例如通过结合至细胞上表达的细胞表面分子或细胞表面
受体。此类方法和应用包括治疗方法和应用，例如，涉及将双重偶联物给予患有疾病、病症或紊乱的对象，然后进行照射以实现光免疫疗法(PIT)，从而导致此类细胞或病原体的光解作用，以有效治疗所述疾病、紊乱或病症。
[0236] 本文还提供了治疗方法，例如，包括给予本文所述的双重偶联物或含有双重偶联物的组合物中的任何一种，和进行照射以实现PIT。在一些方面，还提供了将任何本文所述的双重偶联物或含有双重偶联物的组合物给予于对象，例如患有疾病、紊乱或病症的对象
的方法。在一些方面，还提供了本文所述的双重偶联物或包含双重偶联物的组合物中的任
一种用于治疗疾病、紊乱或病症的用途。在一些方面，还提供了本文所述的双重偶联物或包含双重偶联物的组合物中的任一种在制备用于治疗疾病、紊乱或病症的药物中的用途。在
一些方面，还提供了本文所述的双重偶联物或含有双重偶联物的组合物中的任一种，用于
治疗疾病、紊乱或病症或向患有疾病、紊乱或病症的对象给药。在一些方面，在本文中提供的双重偶联物或组合物的方法或用途中，包括在给予双重偶联物或组合物之后进行照射以
实现PIT。
的方法。在一些方面，还提供了本文所述的双重偶联物或包含双重偶联物的组合物中的任
一种用于治疗疾病、紊乱或病症的用途。在一些方面，还提供了本文所述的双重偶联物或包含双重偶联物的组合物中的任一种在制备用于治疗疾病、紊乱或病症的药物中的用途。在
一些方面，还提供了本文所述的双重偶联物或含有双重偶联物的组合物中的任一种，用于
治疗疾病、紊乱或病症或向患有疾病、紊乱或病症的对象给药。在一些方面，在本文中提供的双重偶联物或组合物的方法或用途中，包括在给予双重偶联物或组合物之后进行照射以
实现PIT。
[0237] 在一些实施方式中，提供了用于治疗对象的病灶的方法，该方法包括：a)向对象给予治疗有效量的本文提供的任何双重偶联物，或包含本文提供的任何双重偶联物的任何组合物或试剂盒，和b)在给予偶联物之后，以一定波长照射病灶以诱导偶联物的光毒性活性。
[0238] 在一些实施方式中，所述方法可用于治疗病灶，例如肿瘤或癌症，由此将给予的双重偶联物靶向与肿瘤相关的细胞，从而导致该细胞的光解，并且在一些情况下，导致肿瘤的治疗，以及治疗剂向肿瘤部位的递送或释放。在一些实施方式中，治疗剂可以通过可释放的或可裂解的接头的裂解而在病灶部位释放。用途包括组合物在此类方法和治疗中的用途，以及此类组合物在药物制备中的用途，以进行此类治疗方法。在一些实施方式中，所述方法和用途由此治疗对象的疾病或病状或病症，例如肿瘤或癌症。
[0239] 在一些实施方式中，所述方法包括给予对象所述双重偶联物，在该给予条件下，针对杀伤靶向的细胞通常与所述双重偶联物接触。在一些实施方式中，该方法导致双重偶联物的靶向分子(例如抗体)部分与与肿瘤或癌症相关的细胞表面分子结合。在接触或给予双
重偶联物之后，使含有靶向的细胞(例如与肿瘤相关的一种或多种细胞)的对象局部区域暴
露于用被染料吸收的光(通常为NIR光)或用该光照射，从而活化双重偶联物以发挥特异性
-2
细胞杀伤作用。在一些实施方式中，照射以至少1J cm 或至少1J/cm的纤维长度的剂量在
600nm-850nm的波长下进行。在一些实施方式中，给予含有酞菁染料的双重偶联物的方法包括与在美国专利号8,524,239或美国公开号US2014/0120119中描述的用于给予抗体-IR700
偶联物的方法相似的方法。
重偶联物之后，使含有靶向的细胞(例如与肿瘤相关的一种或多种细胞)的对象局部区域暴
露于用被染料吸收的光(通常为NIR光)或用该光照射，从而活化双重偶联物以发挥特异性
-2
细胞杀伤作用。在一些实施方式中，照射以至少1J cm 或至少1J/cm的纤维长度的剂量在
600nm-850nm的波长下进行。在一些实施方式中，给予含有酞菁染料的双重偶联物的方法包括与在美国专利号8,524,239或美国公开号US2014/0120119中描述的用于给予抗体-IR700
偶联物的方法相似的方法。
[0240] A.待治疗的疾病与对象
[0241] 在一些实施方式中，将双重偶联物或包含双重偶联物的组合物给予于患有疾病、病症或紊乱的对象。在一些方面，所述疾病，病症或紊乱与病灶相关。在一些实施方式中，病灶是肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤是癌症或与癌症相关的肿瘤。在一些实施方式中，所述癌症是头颈癌，乳腺癌，肝癌，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，脑癌，子宫颈癌，骨癌，皮肤癌，肺癌或血癌。在一些实施方式中，癌症可包括特征为异常或不受控制的细胞生长的恶性肿瘤。可能与癌症有关的其它特征包括转移，干扰邻近细胞的正常功能，以异常水平释放细胞因子或其它分泌产物以及抑制或加剧炎症或免疫反应，侵袭周围或远端的组织或器
官，例如淋巴结等。转移性疾病可指已经离开原始肿瘤部位并例如通过血流或淋巴系统迁
移到身体其它部位的癌细胞。在一些实施方式中，所公开的方法靶向的细胞是癌细胞或免
疫细胞。在一些实施方式中，癌细胞是癌干细胞。在一些实施方式中，所公开的方法靶向的细胞是癌细胞，肿瘤细胞，炎性细胞，免疫细胞，神经元，干细胞，增殖细胞或增生细胞。在一些实施方式中，病灶是癌前异常结构，原位癌，赘生物，增生性肿瘤或与癌症相关的肿瘤。
官，例如淋巴结等。转移性疾病可指已经离开原始肿瘤部位并例如通过血流或淋巴系统迁
移到身体其它部位的癌细胞。在一些实施方式中，所公开的方法靶向的细胞是癌细胞或免
疫细胞。在一些实施方式中，癌细胞是癌干细胞。在一些实施方式中，所公开的方法靶向的细胞是癌细胞，肿瘤细胞，炎性细胞，免疫细胞，神经元，干细胞，增殖细胞或增生细胞。在一些实施方式中，病灶是癌前异常结构，原位癌，赘生物，增生性肿瘤或与癌症相关的肿瘤。
[0242] 在一些方面，靶细胞可以是不期望的或不期望其生长的细胞，例如肿瘤或癌细胞。在一些实施方式中，细胞可以在培养物中生长或存在于待治疗的哺乳动物例如患有癌症的
对象中。任何靶细胞都可以用请求保护的方法处理。在一些实施方式中，靶细胞表达在其它正常细胞的表面上基本上不存在的细胞表面分子。在一些实施方式中，可以选择特异性结
合此类蛋白质的抗体，并且可以为该蛋白质产生双重偶联物，例如本文提供的任何双重偶
联物。在一些实施方式中，细胞表面分子是肿瘤特异性蛋白。在一些实施方式中，细胞表面分子是CD25，其可用于靶向与不期望的移植排斥相关的细胞。
对象中。任何靶细胞都可以用请求保护的方法处理。在一些实施方式中，靶细胞表达在其它正常细胞的表面上基本上不存在的细胞表面分子。在一些实施方式中，可以选择特异性结
合此类蛋白质的抗体，并且可以为该蛋白质产生双重偶联物，例如本文提供的任何双重偶
联物。在一些实施方式中，细胞表面分子是肿瘤特异性蛋白。在一些实施方式中，细胞表面分子是CD25，其可用于靶向与不期望的移植排斥相关的细胞。
[0243] 在一些实施方式中，肿瘤细胞是癌细胞，例如患有癌症的对象中的细胞。在所公开的方法中可以被靶向的示例性细胞包括以下肿瘤的细胞：液体瘤，例如白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病，急性粒细胞白血病和粒细胞，早幼粒细胞，骨髓单核细胞，单核细胞和红白血病)，慢性白血病(例如慢性粒细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，沃尔登斯特罗姆巨球蛋白血症，重链疾病)。在一些实施方式中，细胞是实体瘤细胞，例如肉瘤或癌，纤维肉瘤，粘肉肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤和其它肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，肺癌，结肠直肠癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，例如胰腺腺癌，结肠，卵巢，肺，乳腺，胃，前列腺，宫颈，食道，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，威尔姆氏肿瘤，宫颈癌，睾丸癌，膀胱癌，CNS肿瘤如神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少戈氏神经胶质瘤，血管瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。在一些实施方式中，所述癌症是头颈部的鳞状细胞癌。
[0244] 可以用请求保护的方法治疗的示例性肿瘤，例如癌症包括：实体瘤，例如乳腺癌，例如小叶和导管癌，肉瘤，肺部癌，例如非小细胞癌，大细胞癌，鳞状癌和腺癌，肺间皮瘤，结直肠腺癌，胃癌，前列腺腺癌，卵巢癌(如浆液性囊腺癌和粘液性囊腺癌)，卵巢生殖细胞瘤，睾丸癌和生殖细胞瘤，胰腺腺癌，胰腺腺癌，胰腺癌癌，膀胱癌，包括例如移行细胞癌，腺癌和鳞状癌，肾细胞腺癌，子宫内膜癌，例如包括腺癌和混合穆勒氏肿瘤(癌肉瘤)，子宫颈内膜癌，子宫颈癌和阴道癌，例如相同的腺癌和鳞状上皮癌皮肤，如鳞状细胞癌，基底细胞癌，恶性黑色素瘤，皮肤附件肿瘤，卡波济肉瘤，皮肤淋巴瘤，皮肤附件瘤和各种类型的肉瘤以及默克尔细胞癌，食道癌，鼻咽癌和口咽癌包括鳞状上皮癌和相同腺癌，唾液腺癌，脑和中枢神经系统肿瘤，包括例如神经胶质，神经元和脑膜来源的肿瘤，周围神经瘤，软组织肉瘤以及骨骼和软骨肉瘤，和淋巴瘤，包括B细胞和T细胞恶性淋巴瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是腺癌。
[0245] 该方法还可以用于治疗液体瘤，例如淋巴性，白细胞或其它类型的白血病。在一些实施方式中，所治疗的肿瘤是血液瘤，例如白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病(CML)，多毛细胞白血病(HCL)，T细胞淋巴细胞性白血病(T-PLL)，大颗粒淋巴细胞性白血病和成人T细胞白血病，淋巴瘤(如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)和骨髓瘤。
[0246] 在一些实施方式中，双重偶联物靶向于在病灶的表面或存在于病灶的微环境中的细胞的表面上表达的蛋白质。例如，在一些实施方式中，双重偶联物靶向在肿瘤中的细胞表面上或在肿瘤的微环境中的细胞表面上表达的蛋白质。这种细胞表面分子的示例是如本文
所述的任何分子，包括上述那些。
所述的任何分子，包括上述那些。
[0247] 在一些实施方式中，待靶向的靶细胞的细胞表面上的蛋白质在其它细胞上不大量存在。例如，细胞表面分子可以是仅在靶细胞类型上存在的受体。在一些实施方式中，在肿瘤中表达的蛋白，例如肿瘤特异性蛋白，可以是HER1/EGFR，HER2/ERBB2，CD20，CD25(IL-2Rα受体)，CD33，CD52，CD133，CD206，CEA，癌抗原125(CA125)，甲胎蛋白(AFP)，刘易斯Y，TAG72，血管内皮生长因子(VEGF)，CD30，EpCAM，EphA2，磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)，
gpA33，粘蛋白，CAIX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂(如GD2，GD3，GM1和GM2)，VEGF受体(VEGFR)，整联蛋白αVβ3，整联蛋白α5β1，ERBB3，MET，IGF1R，EPHA3，TRAILR1，TRAILR2，RANKL，FAP，腱糖蛋白，AFP，BCR复合物，CD3 CD18 CD44，CTLA-4，gp72，HLA-DR 10β，HLA-DR抗原，IgE，MUC-1，nuC242，PEM抗原，SK-1抗原或PD-L1。在一些实施方式中，肿瘤特异性蛋白是PD-L1，HER1/EGFR，HER2，CD20，CD25，CD33，CD52，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，EpCAM，EphA2，CD206，CD44，CD133，间皮素，磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)，或癌胚抗原(CEA)。其它细胞表面分子包括如上所述的任何一种。
gpA33，粘蛋白，CAIX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂(如GD2，GD3，GM1和GM2)，VEGF受体(VEGFR)，整联蛋白αVβ3，整联蛋白α5β1，ERBB3，MET，IGF1R，EPHA3，TRAILR1，TRAILR2，RANKL，FAP，腱糖蛋白，AFP，BCR复合物，CD3 CD18 CD44，CTLA-4，gp72，HLA-DR 10β，HLA-DR抗原，IgE，MUC-1，nuC242，PEM抗原，SK-1抗原或PD-L1。在一些实施方式中，肿瘤特异性蛋白是PD-L1，HER1/EGFR，HER2，CD20，CD25，CD33，CD52，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，EpCAM，EphA2，CD206，CD44，CD133，间皮素，磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)，或癌胚抗原(CEA)。其它细胞表面分子包括如上所述的任何一种。
[0248] 在一些实施方式中，细胞表面分子与肿瘤相关，例如肿瘤特异性蛋白或肿瘤特异性抗原，例如EGF受体家族的成员(例如，HER1、2、3和4)和细胞因子受体(例如，CD20，CD25，IL-13R，CD5，CD52等)。在一些实施方式中，肿瘤特异性蛋白是癌细胞特有的那些蛋白质，或者与其它细胞，例如正常细胞相比，在癌细胞上丰富得多的蛋白。例如，HER2通常存在于乳腺癌中，而HER1通常存在于腺癌中，腺癌可存在于许多器官中，例如胰腺，乳腺，前列腺和结肠。
[0249] 可存在于靶细胞上并且可对其使用对于该蛋白质具有特异性的靶向分子(例如抗体或抗体片段)以配制含有酞菁染料的双重偶联物的与肿瘤相关的示例性蛋白质包括但不
限于：各种MAGE(黑素瘤相关抗原E)中的任何一种，包括MAGE 1，MAGE 2，MAGE 3和MAGE 4，各种酪氨酸酶中的任何一种，突变型ras，突变型p53，p97黑色素瘤抗原，人乳脂球(HMFG)(可能与乳腺肿瘤相关)，各种BAGE(人类B黑色素瘤相关抗原E)中的任何一种，包括BAGE1和BAGE2，各种GAGE(G抗原)中的任何一种，包括GAGE1，GAGE2-6，各种神经节苷脂和CD25。
限于：各种MAGE(黑素瘤相关抗原E)中的任何一种，包括MAGE 1，MAGE 2，MAGE 3和MAGE 4，各种酪氨酸酶中的任何一种，突变型ras，突变型p53，p97黑色素瘤抗原，人乳脂球(HMFG)(可能与乳腺肿瘤相关)，各种BAGE(人类B黑色素瘤相关抗原E)中的任何一种，包括BAGE1和BAGE2，各种GAGE(G抗原)中的任何一种，包括GAGE1，GAGE2-6，各种神经节苷脂和CD25。
[0250] 与肿瘤有关的其它蛋白质包括：与宫颈癌有关的HPV 16/18和E6/E7抗原，可能与乳腺癌有关的粘蛋白(MUC 1)-KLH抗原，与结肠直肠癌有关的CEA(癌胚抗原)，可能与例如
黑色素瘤有关的gp100，与黑色素瘤有关的MARTI抗原，与卵巢癌和其它癌症有关的癌症抗
原125(CA125，也称为粘蛋白16或MUC16)，可能与肝癌有关的甲胎蛋白(AFP)，可能与结肠直肠癌，胆汁癌，乳腺癌，小细胞肺癌和其它癌症有关的Lewis Y抗原，可能与腺癌有关的肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)和可能与前列腺癌有关的PSA抗原。
黑色素瘤有关的gp100，与黑色素瘤有关的MARTI抗原，与卵巢癌和其它癌症有关的癌症抗
原125(CA125，也称为粘蛋白16或MUC16)，可能与肝癌有关的甲胎蛋白(AFP)，可能与结肠直肠癌，胆汁癌，乳腺癌，小细胞肺癌和其它癌症有关的Lewis Y抗原，可能与腺癌有关的肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)和可能与前列腺癌有关的PSA抗原。
[0251] 与肿瘤有关的其它示例性蛋白质还包括但不限于：PMSA(前列腺膜特异性抗原)，其可能与实体肿瘤新脉管系统有关，还有前列腺癌HER-2(人表皮生长因子受体2)，其可能
与乳腺癌，卵巢癌，胃癌和子宫癌有关；HER-1，其与肺癌，肛门癌，胶质母细胞瘤以及腺癌有关；NY-ESO-1，其可能与黑素瘤，肉瘤，睾丸癌和其它癌症有关，hTERT(又名端粒酶)，蛋白酶
3和Wilms肿瘤1(WT-1)。
与乳腺癌，卵巢癌，胃癌和子宫癌有关；HER-1，其与肺癌，肛门癌，胶质母细胞瘤以及腺癌有关；NY-ESO-1，其可能与黑素瘤，肉瘤，睾丸癌和其它癌症有关，hTERT(又名端粒酶)，蛋白酶
3和Wilms肿瘤1(WT-1)。
[0252] 在一些实施方式中，与肿瘤有关的蛋白质是：CD52并且可以与慢性淋巴细胞性白血病有关，CD33并且可以与急性骨髓性白血病有关，或CD20并且可以与非霍奇金淋巴瘤有
关。
关。
[0253] 在一些实施方式中，病灶包括神经元，并且所述疾病、紊乱或病症是神经性病症，其任选地是疼痛。在一些实施方式中，病灶包括脂肪细胞或脂细胞，并且疾病、紊乱或病症涉及过量的脂肪。在一些实施方式中，病灶包括病原体感染的细胞，并且所述疾病、紊乱或病症是感染。在一些实施方式中，病灶包括炎性细胞，并且所述疾病、紊乱或病症是炎症。
[0254] 因此，所公开的方法可以用于治疗任何表达肿瘤特异性蛋白的癌症。在一些实施方式中，肿瘤治疗剂是抗体，抗原结合片段，蛋白质，糖蛋白，肽，多肽，病毒，病毒衣壳或病毒颗粒。在一些实施方式中，肿瘤治疗剂是抗体或抗原结合片段。
[0255] 在一些实施方式中，对象是人类或非人类哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人类或兽医学对象，例如小鼠。在一些实施方式中，对象是患有癌症或正被治疗癌症的哺乳动物，例如人。在一些实施方式中，所公开的方法用于治疗患有肿瘤，例如本文所述的肿瘤的对象。在一些实施方式中，肿瘤已经被预先治疗，例如通过外科手术或化学方法切除，并且随后使用所公开的方法杀伤可能残留在对象中的任何剩余的不希望的肿瘤细胞。
[0256] 所公开的双重偶联物和方法可用于治疗患有肿瘤如癌症或先前已被切除或治疗过的任何哺乳动物对象，例如人。需要公开的疗法的对象可以包括患有癌症的人类对象，其中癌细胞在其表面上表达可以特异性结合双重偶联物的肿瘤特异性蛋白。例如，所公开的
双重偶联物和方法可以单独或与放疗或其它化学疗法组合用作癌症的初始治疗。所公开的
方法也可以用于先前的放疗或化疗失败的患者中。因此，在一些实施方式中，对象是已经接受其它疗法的对象，但是那些其它疗法没有提供期望的治疗反应。所公开的双重偶联物和
方法也可以用于患有局部和/或转移性癌症的患者。
双重偶联物和方法可以单独或与放疗或其它化学疗法组合用作癌症的初始治疗。所公开的
方法也可以用于先前的放疗或化疗失败的患者中。因此，在一些实施方式中，对象是已经接受其它疗法的对象，但是那些其它疗法没有提供期望的治疗反应。所公开的双重偶联物和
方法也可以用于患有局部和/或转移性癌症的患者。
[0257] 在一些实施方式中，该方法包括选择将从公开的疗法中受益的对象，例如选择患有表达可特异性结合本文提供的双重偶联物的细胞表面分子(例如肿瘤特异性蛋白)的肿
瘤的对象。例如，如果确定对象患有表达HER1的乳腺癌，则可以选择该对象用包含抗HER1-IR700治疗剂例如西妥昔单抗-IR700-IL-2的双重偶联物进行治疗。
瘤的对象。例如，如果确定对象患有表达HER1的乳腺癌，则可以选择该对象用包含抗HER1-IR700治疗剂例如西妥昔单抗-IR700-IL-2的双重偶联物进行治疗。
[0258] B.剂量和给药
[0259] 在一些方面，所提供的双重偶联物或本文所提供的包含含有酞菁染料，靶向分子和治疗剂的双重偶联物的组合物以足以发挥治疗有用作用的量给予。与用上述试剂之一进
行单次治疗所需的剂量和量相比，通常以不会导致所治疗患者的不良副作用或使观察到的
副作用最小化或降低的量给予活性剂。
行单次治疗所需的剂量和量相比，通常以不会导致所治疗患者的不良副作用或使观察到的
副作用最小化或降低的量给予活性剂。
[0260] 可以通过本领域公知的标准剂量反应和毒性研究来确定对有此需要的患者确定单独或与一种或多种其它药剂组合的双重偶联物的最佳剂量的方法。
[0261] 给予人或兽医学对象的治疗剂(例如双重偶联物)的量将取决于与该对象相关的许多因素，例如视该对象的整体健康状况而定。在一些实施方式中，可以通过改变产品的剂量并测量所产生的治疗反应，例如肿瘤消退，来确定药物的有效量。在一些实施方式中，有效量可以通过各种体外，体内或原位免疫测定来确定。在一些实施方式中，根据需要，可以单一剂量或数个剂量给予所公开的试剂，以获得所需的应答。在一些实施方式中，有效量取决于所应用的来源，所治疗的对象，所治疗病症的严重性和类型以及给药方式。
[0262] 在一些实施方式中，治疗有效量是单独或与其它治疗剂一起足以在用所述组合物处理的对象或细胞中实现所需效果的双重偶联物或包含双重偶联物的组合物的量。治疗
剂，例如双重偶联物的有效量可取决于几个因素，包括但不限于，被处理的对象或细胞，特定的治疗剂和治疗组合物的给予方式。在一些实施方式中，治疗有效量或浓度是足以预防
进展例如转移，延迟进展或引起疾病消退或能够减轻由疾病(例如癌症)引起的症状的量或
浓度。在一些实施方式中，治疗有效量或浓度是足以延长患有肿瘤的患者的存活时间的量
或浓度。
剂，例如双重偶联物的有效量可取决于几个因素，包括但不限于，被处理的对象或细胞，特定的治疗剂和治疗组合物的给予方式。在一些实施方式中，治疗有效量或浓度是足以预防
进展例如转移，延迟进展或引起疾病消退或能够减轻由疾病(例如癌症)引起的症状的量或
浓度。在一些实施方式中，治疗有效量或浓度是足以延长患有肿瘤的患者的存活时间的量
或浓度。
[0263] 在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是10mg/m2-5000mg/m2，例如是或约是10mg/m2-3000mg/m2，10mg/m2-1500mg/m2，10mg/m2-750mg/m2，10mg/m2-500mg/m2，
10mg/m2-250mg/m2，10mg/m2-200mg/m2，10mg/m2-100mg/m2，10mg/m2-75mg/m2，10mg/m2-50mg/
2 2 2 2 2 2 2 2 2
m ，10mg/m -25mg/m ，25mg/m -5000mg/m ，25mg/m-3000mg/m ，25mg/m -1500mg/m ，25mg/m2-750mg/m2，25mg/m2-500mg/m2，25mg/m2-250mg/m2，25mg/m2-200mg/m2，25mg/m2-100mg/m2，
25mg/m2-75mg/m2，25mg/m2-50mg/m2，50mg/m2-5000mg/m2，50mg/m2-3000mg/m2，50mg/m2-
1500mg/m2，50mg/m2-750mg/m2，50mg/m2-500mg/m2，50mg/m2-250mg/m2，50mg/m2-200mg/m2，
2 2 2 2 2 2 2 2 2
50mg/m -100mg/m ，50mg/m-75mg/m ，75mg/m -5000mg/m ，75mg/m -3000mg/m ，75mg/m -
1500mg/m2，75mg/m2-1000mg/m2，75mg/m2-750mg/m2，75mg/m2-500mg/m2，75mg/m2-250mg/m2，
75mg/m2-225mg/m2，75mg/m2-200mg/m2，75mg/m2-100mg/m2，100mg/m2-5000mg/m2，100mg/m2-
3000mg/m2，100mg/m2-1500mg/m2，100mg/m2-750mg/m2，100mg/m2-500mg/m2，100mg/m2-250mg/m2，100mg/m2-200mg/m2，100mg/m2-150mg/m2，150mg/m2-5000mg/m2，150mg/m2-3000mg/m2，
150mg/m2-1500mg/m2，150mg/m2-750mg/m2，150mg/m2-500mg/m2，150mg/m2-250mg/m2，150mg/m2-200mg/m2，200mg/m2-5000mg/m2，200mg/m2-3000mg/m2，200mg/m2-1500mg/m2，200mg/m2-
750mg/m2，200mg/m2-500mg/m2，200mg/m2-250mg/m2，250mg/m2-5000mg/m2，250mg/m2-3000mg/m2，250mg/m2-1500mg/m2，250mg/m2-750mg/m2，250mg/m2-500mg/m2，500mg/m2-5000mg/m2，
500mg/m2-3000mg/m2，500mg/m2-1500mg/m2，500mg/m2-750mg/m2，750mg/m2-5000mg/m2，
2 2 2 2 2 2 2 2
750mg/m-3000mg/m ，750mg/m-1500mg/m ，1500mg/m-5000mg/m ，1500mg/m-3000mg/m，和
3000mg/m2-5000mg/m2。在一些实施方式中，所述双重偶联物的治疗有效剂量是不多于10mg/m2，50mg/m2，75mg/m2，100mg/m2，150mg/m2，200mg/m2，225mg/m2，250mg/m2，300mg/m2，400mg/m2，500mg/m2，600mg/m2，700mg/m2，800mg/m2，900mg/m2，1000mg/m2，1250mg/m2，1500mg/m2，
2 2 2 2 2 2 2
2000mg/m ，2500mg/m ，3000mg/m ，3500mg/m ，4000mg/m ，4500mg/m ，或5000mg/m。在一些实施方式中，所述剂量是或是约50mg/m2-约5000mg/m2，约250mg/m2-约2500mg/m2，约750mg/m2-约1250mg/m2，或约100mg/m2-约1000mg/m2。在一个实施方式中，所述剂量是或是约
160mg/m2，320mg/m2，640mg/m2或1280mg/m2。
10mg/m2-250mg/m2，10mg/m2-200mg/m2，10mg/m2-100mg/m2，10mg/m2-75mg/m2，10mg/m2-50mg/
2 2 2 2 2 2 2 2 2
m ，10mg/m -25mg/m ，25mg/m -5000mg/m ，25mg/m-3000mg/m ，25mg/m -1500mg/m ，25mg/m2-750mg/m2，25mg/m2-500mg/m2，25mg/m2-250mg/m2，25mg/m2-200mg/m2，25mg/m2-100mg/m2，
25mg/m2-75mg/m2，25mg/m2-50mg/m2，50mg/m2-5000mg/m2，50mg/m2-3000mg/m2，50mg/m2-
1500mg/m2，50mg/m2-750mg/m2，50mg/m2-500mg/m2，50mg/m2-250mg/m2，50mg/m2-200mg/m2，
2 2 2 2 2 2 2 2 2
50mg/m -100mg/m ，50mg/m-75mg/m ，75mg/m -5000mg/m ，75mg/m -3000mg/m ，75mg/m -
1500mg/m2，75mg/m2-1000mg/m2，75mg/m2-750mg/m2，75mg/m2-500mg/m2，75mg/m2-250mg/m2，
75mg/m2-225mg/m2，75mg/m2-200mg/m2，75mg/m2-100mg/m2，100mg/m2-5000mg/m2，100mg/m2-
3000mg/m2，100mg/m2-1500mg/m2，100mg/m2-750mg/m2，100mg/m2-500mg/m2，100mg/m2-250mg/m2，100mg/m2-200mg/m2，100mg/m2-150mg/m2，150mg/m2-5000mg/m2，150mg/m2-3000mg/m2，
150mg/m2-1500mg/m2，150mg/m2-750mg/m2，150mg/m2-500mg/m2，150mg/m2-250mg/m2，150mg/m2-200mg/m2，200mg/m2-5000mg/m2，200mg/m2-3000mg/m2，200mg/m2-1500mg/m2，200mg/m2-
750mg/m2，200mg/m2-500mg/m2，200mg/m2-250mg/m2，250mg/m2-5000mg/m2，250mg/m2-3000mg/m2，250mg/m2-1500mg/m2，250mg/m2-750mg/m2，250mg/m2-500mg/m2，500mg/m2-5000mg/m2，
500mg/m2-3000mg/m2，500mg/m2-1500mg/m2，500mg/m2-750mg/m2，750mg/m2-5000mg/m2，
2 2 2 2 2 2 2 2
750mg/m-3000mg/m ，750mg/m-1500mg/m ，1500mg/m-5000mg/m ，1500mg/m-3000mg/m，和
3000mg/m2-5000mg/m2。在一些实施方式中，所述双重偶联物的治疗有效剂量是不多于10mg/m2，50mg/m2，75mg/m2，100mg/m2，150mg/m2，200mg/m2，225mg/m2，250mg/m2，300mg/m2，400mg/m2，500mg/m2，600mg/m2，700mg/m2，800mg/m2，900mg/m2，1000mg/m2，1250mg/m2，1500mg/m2，
2 2 2 2 2 2 2
2000mg/m ，2500mg/m ，3000mg/m ，3500mg/m ，4000mg/m ，4500mg/m ，或5000mg/m。在一些实施方式中，所述剂量是或是约50mg/m2-约5000mg/m2，约250mg/m2-约2500mg/m2，约750mg/m2-约1250mg/m2，或约100mg/m2-约1000mg/m2。在一个实施方式中，所述剂量是或是约
160mg/m2，320mg/m2，640mg/m2或1280mg/m2。
[0264] 在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是0.25mg/kg-150mg/kg，0.25mg/kg-100mg/kg，0.25mg/kg-75mg/kg，0.25mg/kg-60mg/kg，0.25mg/kg-50mg/kg，
0.25mg/kg-25mg/kg，0.25mg/kg-10mg/kg，0.25mg/kg-7.5mg/kg，0.25mg/kg-5.0mg/kg，
0.25mg/kg-2.5mg/kg，0.25mg/kg-1.0mg/kg，0.25mg/kg-0.5mg/kg，0.50mg/kg-150mg/kg，
0.50mg/kg-100mg/kg，0.50mg/kg-75mg/kg，0.50mg/kg-60mg/kg，0.50mg/kg-50mg/kg，
0.50mg/kg-25mg/kg，0.50mg/kg-10mg/kg，0.50mg/kg-7.5mg/kg，0.50mg/kg-5.0mg/kg，
0.50mg/kg-2.5mg/kg，0.50mg/kg-1.0mg/kg，1.0mg/kg-150mg/kg，1.0mg/kg-100mg/kg，
1.0mg/kg-75mg/kg，1.0mg/kg-60mg/kg，1.0mg/kg-50mg/kg，1.0mg/kg-25mg/kg，1.0mg/kg-
10mg/kg，1.0mg/kg-7.5mg/kg，1.0mg/kg-5.0mg/kg，1.0mg/kg-2.5mg/kg，2.5mg/kg-150mg/kg，2.5mg/kg-100mg/kg，2.5mg/kg-75mg/kg，2.5mg/kg-60mg/kg，2.5mg/kg-50mg/kg，
2.5mg/kg-25mg/kg，2.5mg/kg-10mg/kg，2.5mg/kg-7.5mg/kg，2.5mg/kg-5.0mg/kg，5.0mg/kg-150mg/kg，5.0mg/kg-100mg/kg，5.0mg/kg-75mg/kg，5.0mg/kg-60mg/kg，5.0mg/kg-
50mg/kg，5.0mg/kg-25mg/kg，5.0mg/kg-10mg/kg，5.0mg/kg-7.5mg/kg，7.5mg/kg-150mg/kg，7.5mg/kg-100mg/kg，7.5mg/kg-75mg/kg，7.5mg/kg-60mg/kg，7.5mg/kg-50mg/kg，
7.5mg/kg-25mg/kg，7.5mg/kg-10mg/kg，10mg/kg-150mg/kg，10mg/kg-100mg/kg，10mg/kg-
75mg/kg，10mg/kg-60mg/kg，10mg/kg-50mg/kg，10mg/kg-25mg/kg，25mg/kg-150mg/kg，
25mg/kg-100mg/kg，25mg/kg-75mg/kg，25mg/kg-60mg/kg，25mg/kg-50mg/kg，50mg/kg-
150mg/kg，50mg/kg-100mg/kg，50mg/kg-75mg/kg，50mg/kg-60mg/kg，60mg/kg-150mg/kg，
60mg/kg-100mg/kg，60mg/kg-75mg/kg，75mg/kg-150mg/kg，75mg/kg-100mg/kg，和100mg/kg-150mg/kg。在一些实施方式中，所述双重偶联物的治疗有效剂量不多于0.25mg/kg，
0.5mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，3.0mg/kg，4.0mg/kg，5.0mg/kg，6.0mg/kg，7.0mg/kg，
8.0mg/kg，9.0mg/kg，10.0mg/kg，15mg/kg，20mg/kg，25mg/kg，30mg/kg，40mg/kg，50mg/kg，
60mg/kg，70mg/kg，75mg/kg，80mg/kg，90mg/kg，100mg/kg，125mg/kg或150mg/kg。
0.25mg/kg-25mg/kg，0.25mg/kg-10mg/kg，0.25mg/kg-7.5mg/kg，0.25mg/kg-5.0mg/kg，
0.25mg/kg-2.5mg/kg，0.25mg/kg-1.0mg/kg，0.25mg/kg-0.5mg/kg，0.50mg/kg-150mg/kg，
0.50mg/kg-100mg/kg，0.50mg/kg-75mg/kg，0.50mg/kg-60mg/kg，0.50mg/kg-50mg/kg，
0.50mg/kg-25mg/kg，0.50mg/kg-10mg/kg，0.50mg/kg-7.5mg/kg，0.50mg/kg-5.0mg/kg，
0.50mg/kg-2.5mg/kg，0.50mg/kg-1.0mg/kg，1.0mg/kg-150mg/kg，1.0mg/kg-100mg/kg，
1.0mg/kg-75mg/kg，1.0mg/kg-60mg/kg，1.0mg/kg-50mg/kg，1.0mg/kg-25mg/kg，1.0mg/kg-
10mg/kg，1.0mg/kg-7.5mg/kg，1.0mg/kg-5.0mg/kg，1.0mg/kg-2.5mg/kg，2.5mg/kg-150mg/kg，2.5mg/kg-100mg/kg，2.5mg/kg-75mg/kg，2.5mg/kg-60mg/kg，2.5mg/kg-50mg/kg，
2.5mg/kg-25mg/kg，2.5mg/kg-10mg/kg，2.5mg/kg-7.5mg/kg，2.5mg/kg-5.0mg/kg，5.0mg/kg-150mg/kg，5.0mg/kg-100mg/kg，5.0mg/kg-75mg/kg，5.0mg/kg-60mg/kg，5.0mg/kg-
50mg/kg，5.0mg/kg-25mg/kg，5.0mg/kg-10mg/kg，5.0mg/kg-7.5mg/kg，7.5mg/kg-150mg/kg，7.5mg/kg-100mg/kg，7.5mg/kg-75mg/kg，7.5mg/kg-60mg/kg，7.5mg/kg-50mg/kg，
7.5mg/kg-25mg/kg，7.5mg/kg-10mg/kg，10mg/kg-150mg/kg，10mg/kg-100mg/kg，10mg/kg-
75mg/kg，10mg/kg-60mg/kg，10mg/kg-50mg/kg，10mg/kg-25mg/kg，25mg/kg-150mg/kg，
25mg/kg-100mg/kg，25mg/kg-75mg/kg，25mg/kg-60mg/kg，25mg/kg-50mg/kg，50mg/kg-
150mg/kg，50mg/kg-100mg/kg，50mg/kg-75mg/kg，50mg/kg-60mg/kg，60mg/kg-150mg/kg，
60mg/kg-100mg/kg，60mg/kg-75mg/kg，75mg/kg-150mg/kg，75mg/kg-100mg/kg，和100mg/kg-150mg/kg。在一些实施方式中，所述双重偶联物的治疗有效剂量不多于0.25mg/kg，
0.5mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，3.0mg/kg，4.0mg/kg，5.0mg/kg，6.0mg/kg，7.0mg/kg，
8.0mg/kg，9.0mg/kg，10.0mg/kg，15mg/kg，20mg/kg，25mg/kg，30mg/kg，40mg/kg，50mg/kg，
60mg/kg，70mg/kg，75mg/kg，80mg/kg，90mg/kg，100mg/kg，125mg/kg或150mg/kg。
[0265] 在一些实施方式中，所述治疗有效量是至少或至少约0.01mg，0.1mg，0.5mg，1mg，5mg，10mg，50mg，100mg，200mg，500mg，600mg，700mg，800mg，900mg，1000mg，2000mg，3000mg或更多。
[0266] 在一些实施方式中，所述方法包括向患有疾病、紊乱或病症的对象给予治疗有效量的双重偶联物。在一些实施方式中，双重偶联物靶向存在于肿瘤，病灶或增生的微环境中的细胞。在一些实施方式中，治疗有效剂量的双重偶联物静脉内给予。在一些实施方式中，治疗有效剂量的双重偶联物肿瘤内给予。
[0267] 在一些实施方式中，双重偶联物的剂量是至少10μg/kg，例如至少100μg/kg，至少500μg/kg，或至少500μg/kg，例如10μg/kg-1000μg/kg，例如约100μg/kg，约250μg/kg，约500μg/kg，约750μg/kg，或约1000μg/kg的剂量，例如肿瘤内或腹膜内(IP)给药时。在一些实施方式中，所述剂量是至少1μg/ml，例如至少500μg/ml，例如20μg/ml-100μg/ml，例如至少10μg/ml，至少20μg/ml，至少30μg/ml，至少40μg/ml，至少50μg/ml，至少60μg/ml，至少70μg/ml，至少80μg/ml，至少90μg/ml或至少100μg/ml，例如在局部溶液中给予时。
[0268] 在一些实施方式中，治疗有效剂量是给予人的剂量。在一些实施方式中，普通人的体重是60至85kg，例如约或大约75kg。
[0269] 在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是少于400mg/m2，少于300mg/m2，2 2 2 2 2 2
少于250mg/m ，少于225mg/m ，少于200mg/m ，少于180mg/m ，少于100mg/m或少于50mg/m 。
在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是50mg/m2-400mg/m2，100mg/m2-
300mg/m2，100mg/m2-250mg/m2，或100mg/m2-160mg/m2。在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是80mg/m2-240mg/m2，80mg/m2-220mg/m2，80mg/m2-200mg/m2，80mg/m2-
180mg/m2，80mg/m2-160mg/m2，80mg/m2-140mg/m2，80mg/m2-120mg/m2，80mg/m2-100mg/m2，
100mg/m2-240mg/m2，100mg/m2-220mg/m2，100mg/m2-200mg/m2，100mg/m2-180mg/m2，100mg/m2-160mg/m2，100mg/m2-140mg/m2，100mg/m2-120mg/m2，120mg/m2-240mg/m2，120mg/m2-
220mg/m2，120mg/m2-200mg/m2，120mg/m2-180mg/m2，120mg/m2-160mg/m2,120mg/m2-140mg/m2，140mg/m2-240mg/m2，140mg/m2-220mg/m2，140mg/m2-200mg/m2，140mg/m2-180mg/m2，
140mg/m2-160mg/m2，160mg/m2-240mg/m2，160mg/m2-220mg/m2，160mg/m2-200mg/m2，160mg/m2-180mg/m2，180mg/m2-240mg/m2，180mg/m2-220mg/m2，180mg/m2-200mg/m2，200mg/m2-
220mg/m2或200mg/m2-240mg/m2。
少于250mg/m ，少于225mg/m ，少于200mg/m ，少于180mg/m ，少于100mg/m或少于50mg/m 。
在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是50mg/m2-400mg/m2，100mg/m2-
300mg/m2，100mg/m2-250mg/m2，或100mg/m2-160mg/m2。在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是80mg/m2-240mg/m2，80mg/m2-220mg/m2，80mg/m2-200mg/m2，80mg/m2-
180mg/m2，80mg/m2-160mg/m2，80mg/m2-140mg/m2，80mg/m2-120mg/m2，80mg/m2-100mg/m2，
100mg/m2-240mg/m2，100mg/m2-220mg/m2，100mg/m2-200mg/m2，100mg/m2-180mg/m2，100mg/m2-160mg/m2，100mg/m2-140mg/m2，100mg/m2-120mg/m2，120mg/m2-240mg/m2，120mg/m2-
220mg/m2，120mg/m2-200mg/m2，120mg/m2-180mg/m2，120mg/m2-160mg/m2,120mg/m2-140mg/m2，140mg/m2-240mg/m2，140mg/m2-220mg/m2，140mg/m2-200mg/m2，140mg/m2-180mg/m2，
140mg/m2-160mg/m2，160mg/m2-240mg/m2，160mg/m2-220mg/m2，160mg/m2-200mg/m2，160mg/m2-180mg/m2，180mg/m2-240mg/m2，180mg/m2-220mg/m2，180mg/m2-200mg/m2，200mg/m2-
220mg/m2或200mg/m2-240mg/m2。
[0270] 在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量少于12mg/kg，少于10mg/kg，少于8mg/kg，少于6mg/kg，少于4mg/kg，少于2mg/kg或少于1mg/kg。在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是1mg/kg-12mg/kg，2mg/kg-10mg/kg，2mg/kg-6mg/kg或2mg/kg-
4mg/kg。在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是2.0mg/kg-6.5mg/kg，
2.0mg/kg-6.0mg/kg，2.0mg/kg-5.0mg/kg，2.0mg/kg-4.0mg/kg，2.0mg/kg-3.0mg/kg，
3.0mg/kg-6.5mg/kg，3.0mg/kg-6.0mg/kg，3.0mg/kg-5.0mg.kg，3.0mg/kg-4.0mg/kg，
4.0mg/kg-6.5mg/kg，4.0mg/kg-6.0mg/kg，4.0mg/kg-5.0mg/kg，5.0mg/kg-6.5mg/kg，
5.0mg/kg-6.0mg/kg和6.0mg/kg-6.5mg/kg。
4mg/kg。在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是或约是2.0mg/kg-6.5mg/kg，
2.0mg/kg-6.0mg/kg，2.0mg/kg-5.0mg/kg，2.0mg/kg-4.0mg/kg，2.0mg/kg-3.0mg/kg，
3.0mg/kg-6.5mg/kg，3.0mg/kg-6.0mg/kg，3.0mg/kg-5.0mg.kg，3.0mg/kg-4.0mg/kg，
4.0mg/kg-6.5mg/kg，4.0mg/kg-6.0mg/kg，4.0mg/kg-5.0mg/kg，5.0mg/kg-6.5mg/kg，
5.0mg/kg-6.0mg/kg和6.0mg/kg-6.5mg/kg。
[0271] 在一些实施方式中，治疗有效量约为75mg-500mg，75mg-400mg，75mg-400mg，75mg-300mg，75mg-200mg，75mg-150mg，150mg-500mg，150mg-400mg，150mg-300mg，150mg-200mg，
200mg-500mg，200mg-400mg，200mg-300mg，300mg-500mg，300mg-400mg或400mg-500mg。
200mg-500mg，200mg-400mg，200mg-300mg，300mg-500mg，300mg-400mg或400mg-500mg。
[0272] 在一些实施方式中，双重偶联物的治疗有效剂量是对于单剂量给予而言。在一些实施方式中，治疗有效剂量以剂量方案或周期的形式仅以单次注射或单次输注的形式被给
予，例如，以剂量方案或周期的形式仅被给予一次。例如，在给药方案或周期中，不给予双重偶联物的后续剂量。在一些实施方式中，可以重复给药方案。在一些实施方式中，在已经从对象清除第一剂量的时间给予重复剂量，例如重复的单剂量，在一些情况下，这是没有可检测的双重偶联物的全身性暴露的时间。因此，在一些实施方式中，不给予双重偶联物的剂量以实现双重偶联物的连续全身暴露，这不同于许多现有疗法，包括抗体疗法，其中需要按给药方案或周期重复给药以保持持续的全身暴露。在一些实施方式中，每周一次，每两周一
次，每月一次，每年两次，每年一次，或按需以更小的频率重复给药方案或周期。
予，例如，以剂量方案或周期的形式仅被给予一次。例如，在给药方案或周期中，不给予双重偶联物的后续剂量。在一些实施方式中，可以重复给药方案。在一些实施方式中，在已经从对象清除第一剂量的时间给予重复剂量，例如重复的单剂量，在一些情况下，这是没有可检测的双重偶联物的全身性暴露的时间。因此，在一些实施方式中，不给予双重偶联物的剂量以实现双重偶联物的连续全身暴露，这不同于许多现有疗法，包括抗体疗法，其中需要按给药方案或周期重复给药以保持持续的全身暴露。在一些实施方式中，每周一次，每两周一
次，每月一次，每年两次，每年一次，或按需以更小的频率重复给药方案或周期。
[0273] 在一些实施方式中，在使用本文提供的双重偶联物或组合物的任何方法中，如果在用双重偶联物的先前治疗后仍残留残余病灶，则重复给药方案。在一些实施方式中，该方法还包括评估对象是否存在残留病灶，以及重复给药方案是否仍有残留病灶。在一些实施
方式中，如果在双重偶联物的先前给予起始后大于或大约1周，2周，3周，4周，2个月，6个月或1年的时间仍有残留病灶，则重复给药方案。在一些实施方式中，如果在双重偶联物的先前给予起始后4周或大约4周仍有残留病灶，则重复给药方案。
方式中，如果在双重偶联物的先前给予起始后大于或大约1周，2周，3周，4周，2个月，6个月或1年的时间仍有残留病灶，则重复给药方案。在一些实施方式中，如果在双重偶联物的先前给予起始后4周或大约4周仍有残留病灶，则重复给药方案。
[0274] 本领域技术人员将认识到，也可以使用更高或更低剂量的双重偶联物(例如取决于具体试剂)。在一些实施方式中，剂量(例如日剂量)以一个或多个分开的剂量，例如2、3或
4个剂量，或以单一制剂给予。双重偶联物可以单独，在药学上可接受的运载体存在下或在其它治疗剂例如免疫调节剂，抗癌剂或其它抗肿瘤剂的存在下给予。
4个剂量，或以单一制剂给予。双重偶联物可以单独，在药学上可接受的运载体存在下或在其它治疗剂例如免疫调节剂，抗癌剂或其它抗肿瘤剂的存在下给予。
[0275] 在一些实施方式中，双重偶联物可以全身或局部给予待治疗的器官或组织。示例性的给药途径包括但不限于，局部，注射(例如皮下，肌内，真皮内，腹膜内，肿瘤内和静脉内)，口服，舌下，直肠，透皮，鼻内，阴道和吸入途径。在一些实施方式中，双重偶联物静脉内给予。在一些实施方式中，双重偶联物肠胃外给予。在一些实施方式中，双重偶联物经肠内给予。在一些实施方式中，双重偶联物通过局部注射给予。在一些实施方式中，双重偶联物作为局部应用给予。
[0276] 在一些方面，所提供的双重偶联物或包含双重偶联物的组合物可以使用本领域中已知的任何方法局部或全身地给予，例如，给予于患有肿瘤(例如癌症)的对象或先前已切
除(例如通过手术)肿瘤的对象。尽管提供了具体的例子，但是本领域技术人员将理解，可以使用公开的试剂的替代给药方法。此类方法可包括例如使用导管或可植入的泵以在数小时
至数天的时间内向需要治疗的对象提供连续输注。
除(例如通过手术)肿瘤的对象。尽管提供了具体的例子，但是本领域技术人员将理解，可以使用公开的试剂的替代给药方法。此类方法可包括例如使用导管或可植入的泵以在数小时
至数天的时间内向需要治疗的对象提供连续输注。
[0277] 在一些实施方式中，双重偶联物通过肠胃外方式给予，包括直接注射或输注到肿瘤中，例如肿瘤内输注。在一些实施方式中，通过将试剂给予于肿瘤，例如通过将肿瘤浸入含有试剂(例如双重偶联物)的溶液中，或通过将试剂倒在肿瘤上，来将双重偶联物给予肿
瘤。
瘤。
[0278] 另外地或可替代地，所公开的组合物可以全身性地，例如，静脉内，肌肉内，皮下，皮内，皮内，腹膜内，皮下或口服给予患有肿瘤例如癌症的对象。
[0279] 待向对象给予的双重偶联物或包含双重偶联物的组合物的剂量不受绝对限制，但是将取决于组合物及其活性成分的性质及其不希望的副作用，例如针对该试剂、所治疗的
对象、所治疗病症的类型和给药方式的免疫应答。剂量通常是治疗有效量，例如足以实现所需生物学效果的量，例如有效减小肿瘤的大小(例如体积和/或重量)或减弱肿瘤进一步生
长或减轻肿瘤的不良症状的量。
对象、所治疗病症的类型和给药方式的免疫应答。剂量通常是治疗有效量，例如足以实现所需生物学效果的量，例如有效减小肿瘤的大小(例如体积和/或重量)或减弱肿瘤进一步生
长或减轻肿瘤的不良症状的量。
[0280] 在一些实施方式中，用于给予所述试剂(例如双重偶联物)的组合物，包含有效量的所述试剂以及适合于所设想的给药类型的常规药物运载体和赋形剂。例如，在一些实施
方式中，肠胃外制剂可包含双重偶联物的无菌水溶液或悬浮液。在一些实施方式中，用于肠内给予的组合物可以在水溶液或悬浮液中包含有效量的双重偶联物，其可以任选地包括缓
冲剂，表面活性剂，触变剂和调味剂。
方式中，肠胃外制剂可包含双重偶联物的无菌水溶液或悬浮液。在一些实施方式中，用于肠内给予的组合物可以在水溶液或悬浮液中包含有效量的双重偶联物，其可以任选地包括缓
冲剂，表面活性剂，触变剂和调味剂。
[0281] 在进行照射以确保治疗剂的足够的全身性利用度之前，确定包含特定治疗剂(例如免疫调节剂或抗癌剂)的双重偶联物的合适剂量在技术人员的水平内。例如，在一些实施方式中，可以确定本文提供的双重偶联物中的组分的适当比例和相应的剂量。在许多情况
下，特定治疗剂，例如免疫调节剂或抗癌剂的药代动力学在本领域是已知的，并且可以在确定用于给予的双重偶联物的合适剂量时考虑。在一些情况下，在给予之后，可以通过测量例如最大(峰值)血浆浓度(Cmax)，峰值时间(即最大血浆浓度发生时；Tmax)，最小血浆浓度(即两次给药之间的最小血浆浓度；Cmin)，清除半衰期(T1/2)和曲线下面积(即通过绘制时间对比试剂的血浆浓度产生的曲线下面积；AUC)的参数来评估药代动力学。给予例如皮下给予
后，血浆中特定试剂例如双重偶联物和/或治疗剂的浓度可以使用本领域已知的适合评估
血液样品中试剂浓度的任何方法来测量。例如，可以使用免疫测定法，例如ELISA，或基于色谱/质谱的测定法。
下，特定治疗剂，例如免疫调节剂或抗癌剂的药代动力学在本领域是已知的，并且可以在确定用于给予的双重偶联物的合适剂量时考虑。在一些情况下，在给予之后，可以通过测量例如最大(峰值)血浆浓度(Cmax)，峰值时间(即最大血浆浓度发生时；Tmax)，最小血浆浓度(即两次给药之间的最小血浆浓度；Cmin)，清除半衰期(T1/2)和曲线下面积(即通过绘制时间对比试剂的血浆浓度产生的曲线下面积；AUC)的参数来评估药代动力学。给予例如皮下给予
后，血浆中特定试剂例如双重偶联物和/或治疗剂的浓度可以使用本领域已知的适合评估
血液样品中试剂浓度的任何方法来测量。例如，可以使用免疫测定法，例如ELISA，或基于色谱/质谱的测定法。
[0282] C.光免疫疗法
[0283] 在一些实施方式中，提供了治疗病灶的方法，包括给予治疗有效量的本文提供的任何双重偶联物，或包含本文提供的双重偶联物的组合物或试剂盒，并照射该病灶以进行
光免疫疗法(PIT)。还提供了双重偶联物的治疗方法，给予方法和用途，例如用于治疗或治疗或制造药物，或包含双重偶联物的组合物或试剂盒，包括在给予双重偶联物或组合物后
照射以达到PIT。PIT包括给予包含双重偶联物的组合物，然后进行照射。在一些实施方式
中，本文提供的方法包括照射肿瘤。
光免疫疗法(PIT)。还提供了双重偶联物的治疗方法，给予方法和用途，例如用于治疗或治疗或制造药物，或包含双重偶联物的组合物或试剂盒，包括在给予双重偶联物或组合物后
照射以达到PIT。PIT包括给予包含双重偶联物的组合物，然后进行照射。在一些实施方式
中，本文提供的方法包括照射肿瘤。
[0284] 在一些实施方式中，在细胞与双重偶联物接触之后，照射细胞。照射方法是本领域已知的。由于只有表达细胞表面分子的细胞通常会被靶向分子识别，因此通常只有那些细胞具有与之结合的足够量的双重偶联物。这可以减少不希望有的副作用(例如正常细胞的
杀伤)的可能性，因为照射只能杀伤与双重偶联物结合的细胞，通常不会杀伤其它细胞。
杀伤)的可能性，因为照射只能杀伤与双重偶联物结合的细胞，通常不会杀伤其它细胞。
[0285] 在一些实施方式中，对细胞进行体内照射，例如照射先前已给予双重偶联物或含有双重偶联物的组合物的对象。在一些实施方式中，对对象进行照射，例如，可以对对象中的肿瘤进行照射。
[0286] 在一些实施方式中，在给予双重偶联物或含有双重偶联物的组合物之后进行照射。在一些实施方式中，照射或辐照在给予双重偶联物之后约30分钟-96小时进行或起效，例如，给予双重偶联物之后30分钟-48小时，30分钟-24小时或12小时-48小时，例如一般至少30分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时，
12小时，13小时，14小时，15小时，16小时，17小时，18小时，19小时，20小时，21小时，22小时，
23小时，24小时或更多。例如，可以在给予双重偶联物后约24小时内进行照射。在一些实施方式中，在给予双重偶联物或含有双重偶联物的组合物的同时或接近同时进行照射。在一
些实施方式中，在照射或辐照肿瘤之前大于6小时，已向对象给予包含靶向分子的双重偶联物，其中双重偶联物与肿瘤联合。在一些实施方式中，在照射或辐照肿瘤之前，双重偶联物先前已被给予对象大于或大于约12小时，24小时，26小时，48小时，72小时或96小时。
12小时，13小时，14小时，15小时，16小时，17小时，18小时，19小时，20小时，21小时，22小时，
23小时，24小时或更多。例如，可以在给予双重偶联物后约24小时内进行照射。在一些实施方式中，在给予双重偶联物或含有双重偶联物的组合物的同时或接近同时进行照射。在一
些实施方式中，在照射或辐照肿瘤之前大于6小时，已向对象给予包含靶向分子的双重偶联物，其中双重偶联物与肿瘤联合。在一些实施方式中，在照射或辐照肿瘤之前，双重偶联物先前已被给予对象大于或大于约12小时，24小时，26小时，48小时，72小时或96小时。
[0287] 在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)用治疗剂量的辐照照射，所述辐照的波长在约400nm-约900nm范围内，例如约500nm-约900nm，例如约600nm-约850nm，例如约600nm-约
740nm，例如约660nm-约740nm，约660nm-约710nm，约660nm-约700nm，约670nm-约690nm，约
680nm-约740nm或约690nm-约710nm。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)用治疗剂量的波
长为600nm-850nm，例如660nm-740nm的辐照照射。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)在至少或至少约600nm，620nm，640nm，660nm，680nm，700nm，720nm或740nm，例如690±50nm，例如约680nm的波长下照射。
740nm，例如约660nm-约740nm，约660nm-约710nm，约660nm-约700nm，约670nm-约690nm，约
680nm-约740nm或约690nm-约710nm。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)用治疗剂量的波
长为600nm-850nm，例如660nm-740nm的辐照照射。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)在至少或至少约600nm，620nm，640nm，660nm，680nm，700nm，720nm或740nm，例如690±50nm，例如约680nm的波长下照射。
[0288] 在一些实施方式中，所述细胞(例如肿瘤)以如下剂量照射：至少1J cm-2，例如至少10J cm-2，至少30J cm-2，至少50J cm-2，至少100J cm-2，或至少500J cm-2。在一些实施方式-2 -2 -2
中，照射的剂量是或是约1-约1000J cm ，约1-约500J cm ，约5-约200J cm ，约10-约100J cm-2，或约10-约50J cm-2。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)以如下剂量照射：至少或至少约2J cm-2，5J cm-2，10J cm-2，25J cm-2，50J cm-2，75J cm-2，100J cm-2，150J cm-2，200J cm-2，300J cm-2，400J cm-2，或500J cm-2。
中，照射的剂量是或是约1-约1000J cm ，约1-约500J cm ，约5-约200J cm ，约10-约100J cm-2，或约10-约50J cm-2。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)以如下剂量照射：至少或至少约2J cm-2，5J cm-2，10J cm-2，25J cm-2，50J cm-2，75J cm-2，100J cm-2，150J cm-2，200J cm-2，300J cm-2，400J cm-2，或500J cm-2。
[0289] 在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)以如下剂量照射或辐照：至少1J/cm纤维长度，例如至少10J/cm纤维长度，至少50J/cm纤维长度，至少100J/cm纤维长度，至少250J/cm纤维长度，或至少500J/cm纤维长度。在一些实施方式中，照射的剂量是或是约1-约1000J/cm纤维长度，约1-约500J/cm纤维长度，约2-约500J/cm纤维长度，约50-约300J/cm纤维长
度，约10-约100J/cm纤维长度，或约10-约50J/cm纤维长度。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)以如下剂量照射：至少或至少约2J/cm纤维长度，5J/cm纤维长度，10J/cm纤维长度，
25J/cm纤维长度，50J/cm纤维长度，75J/cm纤维长度，100J/cm纤维长度，150J/cm纤维长度，
200J/cm纤维长度，250J/cm纤维长度，300J/cm纤维长度，400J/cm纤维长度或500J/cm纤维长度。
度，约10-约100J/cm纤维长度，或约10-约50J/cm纤维长度。在一些实施方式中，细胞(例如肿瘤)以如下剂量照射：至少或至少约2J/cm纤维长度，5J/cm纤维长度，10J/cm纤维长度，
25J/cm纤维长度，50J/cm纤维长度，75J/cm纤维长度，100J/cm纤维长度，150J/cm纤维长度，
200J/cm纤维长度，250J/cm纤维长度，300J/cm纤维长度，400J/cm纤维长度或500J/cm纤维长度。
[0290] 在一些实施方式中，对于人对象的照射或辐照的剂量是或是约1-约400J cm-2，约2-约400J cm-2，约1-约300J cm-2，约10-约100J cm-2或约10-约50J cm-2，例如是至少或至少约或是或低于或低于约或是或是约10J cm-2，至少30J cm-2，至少50J cm-2，至少100J cm-2。
在一些实施方式中，在人对象中的照射的剂量是或是约1-300J/cm纤维长度，10-100J/cm纤维长度或10-50J/cm纤维长度，例如是至少或至少约或是或低于或低于约或是或是约10J/
cm纤维长度，至少30J/cm纤维长度，至少50J/cm纤维长度，至少100J/cm纤维长度。在一些情况中，发现在人对象中用以实现PIT的照射剂量可低于在小鼠中PIT所需的剂量。例如，在一些情况下，体内肿瘤小鼠模型中的50J/cm2(50J cm-2)光剂量对PIT无效，这与我们在人类患者的临床中所观察到的不同。
在一些实施方式中，在人对象中的照射的剂量是或是约1-300J/cm纤维长度，10-100J/cm纤维长度或10-50J/cm纤维长度，例如是至少或至少约或是或低于或低于约或是或是约10J/
cm纤维长度，至少30J/cm纤维长度，至少50J/cm纤维长度，至少100J/cm纤维长度。在一些情况中，发现在人对象中用以实现PIT的照射剂量可低于在小鼠中PIT所需的剂量。例如，在一些情况下，体内肿瘤小鼠模型中的50J/cm2(50J cm-2)光剂量对PIT无效，这与我们在人类患者的临床中所观察到的不同。
[0291] 在一些实施方式中，在给予包含所述双重偶联物的组合物之后，照射剂量是660-740nm波长下至少1J cm-2或1J/cm纤维长度，例如，660-740nm波长下至少10J cm-2或10J/cm纤维长度，660-740nm波长下至少50J cm-2或50J/cm纤维长度，或660-740nm波长下至少100J -2 -2
cm 或100J/cm纤维长度，例如660-740nm波长下1.0-500J cm 或1.0-500J/cm纤维长度。在
一些实施方式中，波长是660-710nm。在一些实施方式中，在给予包含双重偶联物的组合物之后的照射剂量是：680nm波长下至少1.0J cm-2或1J/cm纤维长度，例如，680nm波长下至少
10J cm-2或10J/cm纤维长度，680nm波长下至少50J cm-2或50J/cm纤维长度，或680nm波长下至少100J cm-2或100J/cm纤维长度，例如，680nm波长下1.0-500J cm-2或1.0-500J/cm纤维长度。在一些实施方式中，进行多重照射，例如至少2，至少3，或至少4次照射，例如2，3，4，5，
6，7，8，9或10次分开施予。给予本文提供的双重偶联物或组合物之后的示例性照射包括以
660nm-740nm的波长以至少1J cm-2或1J/cm纤维长度的剂量照射肿瘤。
cm 或100J/cm纤维长度，例如660-740nm波长下1.0-500J cm 或1.0-500J/cm纤维长度。在
一些实施方式中，波长是660-710nm。在一些实施方式中，在给予包含双重偶联物的组合物之后的照射剂量是：680nm波长下至少1.0J cm-2或1J/cm纤维长度，例如，680nm波长下至少
10J cm-2或10J/cm纤维长度，680nm波长下至少50J cm-2或50J/cm纤维长度，或680nm波长下至少100J cm-2或100J/cm纤维长度，例如，680nm波长下1.0-500J cm-2或1.0-500J/cm纤维长度。在一些实施方式中，进行多重照射，例如至少2，至少3，或至少4次照射，例如2，3，4，5，
6，7，8，9或10次分开施予。给予本文提供的双重偶联物或组合物之后的示例性照射包括以
660nm-740nm的波长以至少1J cm-2或1J/cm纤维长度的剂量照射肿瘤。
[0292] 在一些实施方式中，可以将光或激光施加至染料分子，例如含有双重偶联物的细胞，持续约5秒至约5分钟。例如，在一些实施方式中，将光或激光施加约5秒，10秒，15秒，15秒，20秒，25秒，30秒，35秒，40秒，45秒或50秒或55秒，或在两个所述值之间的范围内，以激活染料分子。在一些实施方式中，将光或激光施加约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5分钟或更长时间，或在此类值中的任何两个之间的范围内。在一些实施方式中，施加光或激光的时间长度可以例如根据光或激光的能量(例如瓦数)而变化。例如，具有较低瓦数的光或激光
可以被施加更长的时间以激活染料分子。
可以被施加更长的时间以激活染料分子。
[0293] 在一些实施方式中，可以在给予双重偶联物后约30分钟至约48小时施加光或激光。例如，在一些实施方式中，在或约在给予双重偶联物之后30、35、40、45、50或55分钟或这些值中的任何两个之间的范围内施加光或激光。在一些实施方式中，光或激光在或约在给
予双重偶联物之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或
24小时施加，或在这些值中的任何两个之间的范围或大致范围内给予。在一些实施方式中，光或激光在给予双重偶联物之后约1-24小时，例如约1-12小时，12-24小时，6-12小时施加，或在给予双重偶联物之后超过24小时给予。在一些实施方式中，光或激光在给予双重偶联
物后36或48小时施加。
予双重偶联物之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或
24小时施加，或在这些值中的任何两个之间的范围或大致范围内给予。在一些实施方式中，光或激光在给予双重偶联物之后约1-24小时，例如约1-12小时，12-24小时，6-12小时施加，或在给予双重偶联物之后超过24小时给予。在一些实施方式中，光或激光在给予双重偶联
物后36或48小时施加。
[0294] 在一些实施方式中，可以对细胞或对象进行一次或多次照射。因此，照射可以在一天之内完成，也可以以相同或不同的剂量在多天内重复进行，例如照射至少2次，3次，4次，5次或10次。在一些实施方式中，重复照射可在同一天，连续天或每1-3天，每3-7天，每1-2周，每2-4周，每1-2个月或每隔更长的时间进行。
[0295] 在一些实施方式中，照射的剂量或方法视肿瘤的类型或形态而不同。
[0296] 在一些实施方式中，病灶是肿瘤，其为浅表肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤小于10mm厚。在一些实施方式中，照射使用微透镜尖端的纤维进行，以用于表面照射。在一些实施方式中，光照射剂量是或是约5J/cm2-约200J/cm2。
[0297] 在一些实施方式中，所提供的方法包括用微透镜尖端的纤维照射对象中的浅表肿瘤，以约5J/cm2-约200J/cm2的光剂量进行表面照射，其中所述肿瘤与一种光毒性剂缔合，所述光毒性剂包括与肿瘤的细胞表面分子结合的靶向分子。在一些实施方式中，光照射剂量
为或为约50J/cm2。
为或为约50J/cm2。
[0298] 在一些实施方式中，病灶是肿瘤，其为间质肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤深度大于10mm或为皮下肿瘤。在一些实施方式中，照射使用圆柱形扩散纤维来进行，所述圆柱形扩散纤维的扩散器长度为0.5cm至10cm，并且间隔为1.8±0.2cm。在一些实施方式中，光照射剂量为或为约20J/cm纤维长度至约500J/cm纤维长度。
[0299] 在一些实施方式中，所提供的方法包括用圆柱形扩散纤维照射对象的间质肿瘤，所述圆柱形扩散纤维包括0.5cm至10cm的扩散器长度并且以1.8±0.2cm间隔开，采用是或
约是100J/cm纤维长度的光剂量，或采用是或约是400mW/cm的通量率，其中所述肿瘤与光毒性剂相缔合，所述光毒性剂包括结合至所述肿瘤的细胞表面分子的靶向分子。在一些实施
方式中，肿瘤深度大于10mm或为皮下肿瘤。在一些实施方式中，将圆柱形扩散纤维设置在肿瘤中以1.8±0.2cm隔开的导管中。在一些实施方式中，导管是光学透明的。
约是100J/cm纤维长度的光剂量，或采用是或约是400mW/cm的通量率，其中所述肿瘤与光毒性剂相缔合，所述光毒性剂包括结合至所述肿瘤的细胞表面分子的靶向分子。在一些实施
方式中，肿瘤深度大于10mm或为皮下肿瘤。在一些实施方式中，将圆柱形扩散纤维设置在肿瘤中以1.8±0.2cm隔开的导管中。在一些实施方式中，导管是光学透明的。
[0300] D.其他疗法
[0301] 在一些实施方式中，可以给予对象其它疗法。在一些实施方式中，其它疗法是其它治疗剂或抗癌治疗。在一些实施方式中，抗癌治疗包括放射疗法。在一些实施方式中，其它疗法是本文提供的双重偶联物中靶向分子的未偶联形式，和/或本文提供的双重偶联物中治疗剂的未偶联形式。在一些实施方式中，其它疗法是与双重偶联物的组分不同的疗法，例如放射疗法或手术，或给予不同的治疗剂(therapeutic)。
[0302] 在一些实施方式中，在照射之前，对象可以接受本文所述的一种或多种其它疗法。在一些情况下，可以在双重偶联物给予之前，期间或之后给予一种或多种其它疗法。在一些实施方式中，可以在双重偶联物的给予期间或同时给予其它治疗剂。在一些实施方式中，其它治疗剂可以在双重偶联物的给予之后或随后给予。例如，在一些实施方式中，双重偶联物在一种或多种其它疗法之前给予，并且双重偶联物和一种或多种其它疗法各自在照射肿瘤
之前给予。在一些实施方式中，双重偶联物在一种或多种其它疗法之后给予，并且双重偶联物和一种或多种其它疗法各自在照射肿瘤之前给予。在一些实施方式中，在给予其它治疗
剂和双重偶联物之后进行照射。
之前给予。在一些实施方式中，双重偶联物在一种或多种其它疗法之后给予，并且双重偶联物和一种或多种其它疗法各自在照射肿瘤之前给予。在一些实施方式中，在给予其它治疗
剂和双重偶联物之后进行照射。
[0303] 在一些实施方式中，双重偶联物在其它疗法的给予之前，同时或之后给予。在一些实施方式中，双重偶联物在给予其它疗法之后但在照射肿瘤以进行光免疫疗法(PIT)之前被给予。在一些实施方式中，其它疗法在照射肿瘤之前大于或大于约30分钟，1小时，2小时，
6小时，12小时，24小时，48小时，96小时，一周，两周，三周或一个月给予。在一些实施方式中，在照射时或之后，对象可以接受一种或多种其它疗法。因此，在一些情况下，在给予双重偶联物后也给予一种或多种其它疗法。在一些实施方式中，在照射的约0至24小时之内，例如在照射的约5分钟，10分钟，30分钟，1小时，2小时，6小时，12小时或24小时之内，给予其它疗法。
6小时，12小时，24小时，48小时，96小时，一周，两周，三周或一个月给予。在一些实施方式中，在照射时或之后，对象可以接受一种或多种其它疗法。因此，在一些情况下，在给予双重偶联物后也给予一种或多种其它疗法。在一些实施方式中，在照射的约0至24小时之内，例如在照射的约5分钟，10分钟，30分钟，1小时，2小时，6小时，12小时或24小时之内，给予其它疗法。
[0304] 在一些实施方式中，所给予的其它或额外药剂是未偶联的靶向分子或未偶联的治疗剂。在一些实施方式中，未偶联的靶向分子是与双重偶联物的靶向分子或治疗剂相同或
基本相同的靶向分子。例如，在一些实施方式中，在给予双重偶联物之前，将靶向分子，例如靶向蛋白质或抗原的未偶联抗体，给予对象。在一些实施方式中，在给予双重偶联物之前至多96小时给予靶向分子。在一些实施方式中，以约10mg/m2-约500mg/m2的范围内的剂量给予靶向分子。例如，靶向分子是西妥昔单抗，并且在给予双重偶联物之前至多96小时向对象给予西妥昔单抗。
基本相同的靶向分子。例如，在一些实施方式中，在给予双重偶联物之前，将靶向分子，例如靶向蛋白质或抗原的未偶联抗体，给予对象。在一些实施方式中，在给予双重偶联物之前至多96小时给予靶向分子。在一些实施方式中，以约10mg/m2-约500mg/m2的范围内的剂量给予靶向分子。例如，靶向分子是西妥昔单抗，并且在给予双重偶联物之前至多96小时向对象给予西妥昔单抗。
[0305] E.示例性的特征
[0306] 在一些实施方式中，根据使用双重偶联物的提供的治疗方法的期望的治疗反应是减轻或抑制与病灶(例如肿瘤或癌症)相关的一种或多种症状。在一些实施方式中，组合物
不必完全消除一种或多种症状才是有效的。
不必完全消除一种或多种症状才是有效的。
[0307] 例如，给予包含双重偶联物的组合物，随后进行照射可以减少肿瘤的大小，例如肿瘤的体积或重量，或肿瘤的转移，例如与没有双重偶联物的情况下的肿瘤大小，体积，重量或转移相比，减少至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或至少100％。在一些实施方式中，在治疗后至少7天，至少10天，至少14天，至少30天，至少60天，至少90天或至少120天，肿瘤大小，体积，重量或转移的差异是明显的。在一些实施方式中，可以通过放射线照相术，超声成像，尸检，通过使用卡尺，通过microCT或通过18F-FDG-PET来监测肿瘤的大小和体积。肿瘤大小也可以通过视觉评估。在特定的例子中，可以使用卡尺直接测量肿瘤大小(直径)。
[0308] 在一些实施方式中，根据本文的方法，使用提供的双重偶联物和PIT(例如抗体-IR700-治疗剂/PIT)进行的治疗可导致肿瘤尺寸，体积，重量或转移小于如果仅用靶向分
子、仅用酞菁染料-靶向分子偶联物/PIT或仅用治疗剂进行处理的肿瘤尺寸，体积，重量或转移，也即，存在协同效应。例如，相比于在涉及采用靶向分子的单一治疗的治疗方法中，在涉及采用PIT和含有相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物后跟照射的单一治疗的治疗
方法中，或涉及采用治疗剂(例如，免疫调节剂或抗癌剂)的单一治疗的治疗方法中实现的
肿瘤尺寸，体积，重量或转移，采用本文提供的双重偶联物的疗法可将肿瘤尺寸，例如肿瘤的体积或重量，或肿瘤的转移减少例如至少1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，
9倍，10倍或更多。
子、仅用酞菁染料-靶向分子偶联物/PIT或仅用治疗剂进行处理的肿瘤尺寸，体积，重量或转移，也即，存在协同效应。例如，相比于在涉及采用靶向分子的单一治疗的治疗方法中，在涉及采用PIT和含有相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物后跟照射的单一治疗的治疗
方法中，或涉及采用治疗剂(例如，免疫调节剂或抗癌剂)的单一治疗的治疗方法中实现的
肿瘤尺寸，体积，重量或转移，采用本文提供的双重偶联物的疗法可将肿瘤尺寸，例如肿瘤的体积或重量，或肿瘤的转移减少例如至少1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，
9倍，10倍或更多。
[0309] 在一些实施方式中，根据提供的方法的期望的治疗反应是杀伤期望量的细胞群，例如通过与在不存在双重偶联物和辐照的情况下的细胞杀伤相比，杀伤至少20％，至少
50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或至少100％的细胞。
在一些实施方式中，在治疗后的至少1小时，至少2小时，至少6小时，至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少7天，至少10天，至少14天或至少30天后，在肿瘤细胞杀伤方面的差异是明显的。在一些实施方式中，细胞杀伤活性可以通过本领域已知的多种技术来评估，包括但不限于，可用于测量细胞坏死和/或凋亡的细胞毒性/细
胞活力测定，例如来自活检样品，在处理后，例如MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)分析和其它相关的基于四唑盐的分析(例如XTT，MTS或WST)，ATP分析，凋亡分析(例如，使用标记的膜联蛋白V)，例如受感染细胞的TUNEL染色，DNA片段化分析，DNA阶梯化分析和细胞色素C释放分析。在一些情况下，可以使用成像方法，例如正电子发射断层扫描(PET)，包括FDG-PET，单光子发射CT(SPECT)，扩散加权成像(DWI)，动态磁化率加权对比增强(DSC)MR成像或动态对比增强(DCE)MR成像，CT灌注方法，磁共振波谱(MRS)。此类测定和方法是本领域技术人员所熟知的。
50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或至少100％的细胞。
在一些实施方式中，在治疗后的至少1小时，至少2小时，至少6小时，至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少7天，至少10天，至少14天或至少30天后，在肿瘤细胞杀伤方面的差异是明显的。在一些实施方式中，细胞杀伤活性可以通过本领域已知的多种技术来评估，包括但不限于，可用于测量细胞坏死和/或凋亡的细胞毒性/细
胞活力测定，例如来自活检样品，在处理后，例如MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)分析和其它相关的基于四唑盐的分析(例如XTT，MTS或WST)，ATP分析，凋亡分析(例如，使用标记的膜联蛋白V)，例如受感染细胞的TUNEL染色，DNA片段化分析，DNA阶梯化分析和细胞色素C释放分析。在一些情况下，可以使用成像方法，例如正电子发射断层扫描(PET)，包括FDG-PET，单光子发射CT(SPECT)，扩散加权成像(DWI)，动态磁化率加权对比增强(DSC)MR成像或动态对比增强(DCE)MR成像，CT灌注方法，磁共振波谱(MRS)。此类测定和方法是本领域技术人员所熟知的。
[0310] 在一些实施方式中，本文提供的双重偶联物和使用方法可以增加对肿瘤细胞的杀伤，例如相比涉及采用靶向分子的单一疗法的治疗方法中，涉及采用PIT和包含相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物随后辐照的单一疗法的治疗方法中，或涉及采用治疗剂(例
如，免疫调节剂或抗癌剂)的单一疗法的治疗方法中的细胞杀伤，至少增加1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或更多。
如，免疫调节剂或抗癌剂)的单一疗法的治疗方法中的细胞杀伤，至少增加1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或更多。
[0311] 在一些实施方式中，期望的反应是将患有肿瘤或最近已切除肿瘤的患者的存活时间增加期望的量，例如相比在不存在双重偶联物和照射的情况下的存活时间，将存活延长
至少20％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或至少
100％。在一些实施方式中，增加的存活由以下一种或多种存活指标的增加来显示：中值无进展存活的持续时间，响应的持续时间，中值总存活或其它存活相关的临床终点。在一些实施方式中，存活的差异在治疗后至少7天，至少10天，至少14天，至少30天，至少60天，至少90天，至少120天，至少6个月，至少12个月，至少24个月或至少5年或更长时间后是明显的。在一些实施方式中，相比用涉及采用靶向分子的单一疗法的治疗方法，涉及采用PIT和包含相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物后跟照射的单一疗法的治疗方法，或涉及采用治疗
剂(例如，免疫调节剂或抗癌剂)的单一疗法的治疗方法治疗的对象，本文提供的双重偶联
物和使用方法将中位无进展存活的持续时间，响应时间，中值总存活或其它与存活相关的
临床终点增加至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少9个月，至少10个月，至少11个月，至少12个月，至少18个月，至少24个月，或至少5年或更长时间。
至少20％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或至少
100％。在一些实施方式中，增加的存活由以下一种或多种存活指标的增加来显示：中值无进展存活的持续时间，响应的持续时间，中值总存活或其它存活相关的临床终点。在一些实施方式中，存活的差异在治疗后至少7天，至少10天，至少14天，至少30天，至少60天，至少90天，至少120天，至少6个月，至少12个月，至少24个月或至少5年或更长时间后是明显的。在一些实施方式中，相比用涉及采用靶向分子的单一疗法的治疗方法，涉及采用PIT和包含相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物后跟照射的单一疗法的治疗方法，或涉及采用治疗
剂(例如，免疫调节剂或抗癌剂)的单一疗法的治疗方法治疗的对象，本文提供的双重偶联
物和使用方法将中位无进展存活的持续时间，响应时间，中值总存活或其它与存活相关的
临床终点增加至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少9个月，至少10个月，至少11个月，至少12个月，至少18个月，至少24个月，或至少5年或更长时间。
[0312] 在一些实施方式中，本文提供的本文提供的双重偶联物和使用方法可以增加经治疗对象的存活时间，例如，相比接受采用靶向分子的单一治疗，采用PIT和包含相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物后跟照射的单一治疗，或采用治疗剂(例如，免疫调节剂或抗
癌剂)的单一治疗的对象的存活时间，增加至少1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或更多。在一些实施方式中，相比用采用靶向分子的单一疗法，采用PIT和包含相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物后跟照射的单一疗法，或采用治疗剂(例如，免疫
调节剂或抗癌剂)的单一疗法治疗的情况，本文提供的双重偶联物和使用方法将中位无进
展存活的持续时间，响应时间，中值总存活或其它与存活相关的临床终点增加至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少9个月，至少10个月，至少11个月，至少12个月，至少18个月，至少24个月，或至少5年或更长时间。
癌剂)的单一治疗的对象的存活时间，增加至少1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或更多。在一些实施方式中，相比用采用靶向分子的单一疗法，采用PIT和包含相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物后跟照射的单一疗法，或采用治疗剂(例如，免疫
调节剂或抗癌剂)的单一疗法治疗的情况，本文提供的双重偶联物和使用方法将中位无进
展存活的持续时间，响应时间，中值总存活或其它与存活相关的临床终点增加至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少9个月，至少10个月，至少11个月，至少12个月，至少18个月，至少24个月，或至少5年或更长时间。
[0313] 一方面，利用实体瘤反应评价标准(RECIST)标准来表征对治疗的反应，这是美国国家癌症研究所推荐的评估肿瘤反应的指南(参见Therasse等,(2000)J.Natl.Cancer
Inst.92:205-216)。在一些实施方式中，可以使用修订版1.1指南(RECIST 1.1，参见
Eisenhauer等.(2009)European Journal of Cancer,45:228-247)中概述的RECIST标准评
估患者对治疗的反应。客观状态的标准是评估实体瘤反应的方案所需要的。代表性标准包
括：(1)完全响应(CR)，定义为所有可测量疾病的完全消失；没有新的病灶；无疾病相关症状；没有不可测疾病的证据；(2)部分响应(PR)，定义为目标病灶(例如肿瘤)的最长直径之和减少30％；(3)进行性疾病(PD)，定义为目标病灶的最长直径的总和增加20％或任何新病灶出现；(4)稳定或无响应，定义为不符合CR，PR或PD的条件(参见Therasse等，同上)。
Inst.92:205-216)。在一些实施方式中，可以使用修订版1.1指南(RECIST 1.1，参见
Eisenhauer等.(2009)European Journal of Cancer,45:228-247)中概述的RECIST标准评
估患者对治疗的反应。客观状态的标准是评估实体瘤反应的方案所需要的。代表性标准包
括：(1)完全响应(CR)，定义为所有可测量疾病的完全消失；没有新的病灶；无疾病相关症状；没有不可测疾病的证据；(2)部分响应(PR)，定义为目标病灶(例如肿瘤)的最长直径之和减少30％；(3)进行性疾病(PD)，定义为目标病灶的最长直径的总和增加20％或任何新病灶出现；(4)稳定或无响应，定义为不符合CR，PR或PD的条件(参见Therasse等，同上)。
[0314] 一方面，利用基于计算机断层扫描(CT)的Choi反应标准来表征对治疗的反应，如Choi等所述，(2007)J Clin Oncol.25:1753-1759。Choi标准使用通过CT以豪恩斯菲尔德单位(Hounsfield unit，HU)测量的肿瘤密度，而RECIST标准使用一维(one-dimensional)肿
瘤尺寸(例如，目标病灶最长直径的总和)。CT上肿瘤密度的降低与肿瘤坏死的发展有关。对于一些导致肿瘤坏死但一维肿瘤尺寸没有实质性减少的疗法，RECIST标准可能低估了疗
效。因此，对于主要导致肿瘤坏死的疗法，可以使用Choi标准来衡量响应(另见van der
Veldt等,(2010)Brit J Cancer 102:803-809；Weng等,(2013)Oncol Letters 6:1707-
1712)。客观状态的标准是评估实体瘤响应的方案所需要的。代表性标准包括：(1)完全响应(CR)，定义为所有目标病灶消失且无新病灶；(2)部分响应(PR)定义为肿瘤尺寸减少≥10％或CT上肿瘤密度降低(豪恩斯菲尔德单位(Hounsfield unit，HU))≥15％，无新病灶且无明显不可测疾病进展；(3)进行性疾病(PD)，定义为肿瘤大小增加≥10％，并且不符合肿瘤密度(HU)的PR标准或新病灶或新瘤内结节或现有肿瘤内结节大小增加；(4)稳定或无响应，定义为不具有CR，PR或PD的资格，没有因肿瘤进展而导致的症状恶化。
瘤尺寸(例如，目标病灶最长直径的总和)。CT上肿瘤密度的降低与肿瘤坏死的发展有关。对于一些导致肿瘤坏死但一维肿瘤尺寸没有实质性减少的疗法，RECIST标准可能低估了疗
效。因此，对于主要导致肿瘤坏死的疗法，可以使用Choi标准来衡量响应(另见van der
Veldt等,(2010)Brit J Cancer 102:803-809；Weng等,(2013)Oncol Letters 6:1707-
1712)。客观状态的标准是评估实体瘤响应的方案所需要的。代表性标准包括：(1)完全响应(CR)，定义为所有目标病灶消失且无新病灶；(2)部分响应(PR)定义为肿瘤尺寸减少≥10％或CT上肿瘤密度降低(豪恩斯菲尔德单位(Hounsfield unit，HU))≥15％，无新病灶且无明显不可测疾病进展；(3)进行性疾病(PD)，定义为肿瘤大小增加≥10％，并且不符合肿瘤密度(HU)的PR标准或新病灶或新瘤内结节或现有肿瘤内结节大小增加；(4)稳定或无响应，定义为不具有CR，PR或PD的资格，没有因肿瘤进展而导致的症状恶化。
[0315] 在一些实施方式中，与给药和照射前肿瘤的大小或体积相比，在照射后两周或一个月内，双重偶联物的给予和根据本文提供的方法的使用实现了肿瘤大小或体积的减少至
少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或更多。
少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或更多。
[0316] 在一些实施方式中，可以确定客观响应率(ORR)，其是观察到CR或PR响应的对象的百分比。在肿瘤临床试验中，ORR通常用于测量肿瘤对治疗的响应。
[0317] 在一些实施方式中，与用未偶联的靶向分子(例如抗体或抗原结合抗体片段)，未偶联的治疗剂，或采用PIT和包含相应酞菁染料-靶向分子偶联物的组合物的单一治疗所治
疗的类似状况的对象群体相比，双重偶联物的给予和根据本文提供的方法的使用在治疗的
对象群体中实现了与紊乱或癌症相关的参数的改善，其中所述参数选自以下一种或多种：
a)客观响应率(ORR)；b)无进展生存(PFS)；c)总体生存(OS)；d)毒性降低；e)肿瘤响应；f)生活质量。在一些实施方式中，参数改善至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％或更高。
疗的类似状况的对象群体相比，双重偶联物的给予和根据本文提供的方法的使用在治疗的
对象群体中实现了与紊乱或癌症相关的参数的改善，其中所述参数选自以下一种或多种：
a)客观响应率(ORR)；b)无进展生存(PFS)；c)总体生存(OS)；d)毒性降低；e)肿瘤响应；f)生活质量。在一些实施方式中，参数改善至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％或更高。
[0318] 在一些实施方式中，在治疗的对象群体中，双重偶联物的给予和根据本文提供的方法的使用导致至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％的受治疗对象中的PR。在一些实施方式中，在治疗的对象群体中，根据提供的方法给予双重偶联物导致至少10％，
20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％的受治疗对象中的CR。
20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％的受治疗对象中的CR。
[0319] 在一些实施方式中，在治疗的对象群体中，双重偶联物的给予和根据本文提供的方法的使用导致大于约13％，例如大于约15％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，大于约50％，大于约60％，大于约70％，大于约80％，大于约95％或大于约99％的ORR。
[0320] 在一些实施方式中，本文提供的双重偶联物和使用方法，例如含有免疫调节剂的双重偶联物，可以用于刺激癌症患者中的免疫应答。通常可以通过多种众所周知的参数中
的任何一种来检测免疫应答，这些参数包括但不限于体内或体外确定：可溶性免疫球蛋白
或抗体；和可溶性介体，例如细胞因子，淋巴因子，趋化因子，激素，生长因子等，以及其它可溶性小肽，碳水化合物，核苷酸和/或脂质介体；细胞活化状态的改变，取决于免疫系统细胞功能或结构特性的改变，例如细胞增殖，改变的运动性，诱导特定活动(例如特定基因表达或溶细胞行为)的能力；免疫系统细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡的发作(程序性细胞死亡)；细胞毒性T细胞，活化的巨噬细胞或自然杀伤细胞增加；或可以检测免疫应答存在的任何其它标准。
的任何一种来检测免疫应答，这些参数包括但不限于体内或体外确定：可溶性免疫球蛋白
或抗体；和可溶性介体，例如细胞因子，淋巴因子，趋化因子，激素，生长因子等，以及其它可溶性小肽，碳水化合物，核苷酸和/或脂质介体；细胞活化状态的改变，取决于免疫系统细胞功能或结构特性的改变，例如细胞增殖，改变的运动性，诱导特定活动(例如特定基因表达或溶细胞行为)的能力；免疫系统细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡的发作(程序性细胞死亡)；细胞毒性T细胞，活化的巨噬细胞或自然杀伤细胞增加；或可以检测免疫应答存在的任何其它标准。
[0321] 进行这些和类似测定的方法是众所周知的，并且可见于，例如Lefkovits(《免疫学方法手册：综合技术手册(Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques)》,1998；另参见《新编免疫学方案(Current Protocols in Immunology)》；
另参见，例如，Weir《,实验免疫性手册(Handbook of Experimental Immunology)》,1986布莱克韦尔科学公司(Blackwell Scientific),马萨诸塞州波士顿；Mishell和Shigii(编)
《细胞免疫学选择方法(Selected Methods in Cellular Immunology)》,1979费曼出版公
司(Freeman Publishing),加利福尼亚州旧金山；Green和Reed,1998 Science 281:1309，
和其中所引用的文献)。
另参见，例如，Weir《,实验免疫性手册(Handbook of Experimental Immunology)》,1986布莱克韦尔科学公司(Blackwell Scientific),马萨诸塞州波士顿；Mishell和Shigii(编)
《细胞免疫学选择方法(Selected Methods in Cellular Immunology)》,1979费曼出版公
司(Freeman Publishing),加利福尼亚州旧金山；Green和Reed,1998 Science 281:1309，
和其中所引用的文献)。
[0322] 肿瘤反应性T细胞的增殖的检测可以通过多种已知技术来完成。例如，可以通过测量DNA合成的速率来检测T细胞增殖，并且可以通过控制候选肿瘤反应性T细胞所暴露的、对细胞的刺激(例如，特定的期望的肿瘤或对照抗原致敏的(antigen-pulsed)抗原呈递细
胞)，来确定肿瘤特异性。已被刺激增殖的T细胞表现出增加的DNA合成速率。测量DNA合成速率的典型方法是，例如，用氚化胸腺嘧啶对T细胞培养物进行脉冲标记，所述胸腺嘧啶是掺入新合成的DNA中的核苷前体。掺入的氚化胸腺嘧啶的量可以使用液体闪烁分光光度计测
定。检测T细胞增殖的其它方法包括测量白介素2(IL-2)产量，Ca2+流量或染料摄取的增加，例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑盐。或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成，或者可以量化对特定抗原有响应的T细胞的相对数量。
胞)，来确定肿瘤特异性。已被刺激增殖的T细胞表现出增加的DNA合成速率。测量DNA合成速率的典型方法是，例如，用氚化胸腺嘧啶对T细胞培养物进行脉冲标记，所述胸腺嘧啶是掺入新合成的DNA中的核苷前体。掺入的氚化胸腺嘧啶的量可以使用液体闪烁分光光度计测
定。检测T细胞增殖的其它方法包括测量白介素2(IL-2)产量，Ca2+流量或染料摄取的增加，例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑盐。或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成，或者可以量化对特定抗原有响应的T细胞的相对数量。
[0323] 抗体产生(例如，肿瘤特异性抗体产生)的检测可以例如通过使用放射免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，平衡透析或固相免疫印迹(包括Western印迹)等体外方法，测定来自用根据本发明的组合物治疗的宿主的样品(例如，包含免疫球蛋白的样品，例如血清，血浆或血液)来实现。在优选的实施方式中，ELISA测定还可包括用对靶肿瘤抗原具有特异性的固相单克隆抗体对该抗原进行肿瘤抗原捕获固定化，例如，以增强该测定的敏
感性。可溶性介体(例如细胞因子，趋化因子，淋巴因子，前列腺素等)的加工也可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)容易地确定，例如使用可从商业渠道获得的方法，仪器和试剂(例
如，位于密苏里州圣路易斯的西格玛(Sigma)；另参见《R&D系统公司2006目录(R&D Systems
2006Catalog)》(R&D系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯)。
感性。可溶性介体(例如细胞因子，趋化因子，淋巴因子，前列腺素等)的加工也可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)容易地确定，例如使用可从商业渠道获得的方法，仪器和试剂(例
如，位于密苏里州圣路易斯的西格玛(Sigma)；另参见《R&D系统公司2006目录(R&D Systems
2006Catalog)》(R&D系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯)。
[0324] 可以使用本领域众所周知的常规测定监测任意数量的其它免疫学参数。这些可以包括，例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定，次级体外抗体应答，使用公认的标志物抗原系统对各种外周血或淋巴样单核细胞亚群进行流式免疫细胞荧光分析，免疫组
织化学或其它相关测定。这些测定和其它测定可见于，例如，Rose等.(编)《,临床实验免疫性手册(Manual of Clinical Laboratory Immunology)》,第5版,1997美国微生物学会
(American Society of Microbiology),华盛顿。
织化学或其它相关测定。这些测定和其它测定可见于，例如，Rose等.(编)《,临床实验免疫性手册(Manual of Clinical Laboratory Immunology)》,第5版,1997美国微生物学会
(American Society of Microbiology),华盛顿。
[0325] III.药物组合物，试剂盒和生产制品
[0326] 本文提供了包含双重偶联物的药物组合物，所述双重偶联物包含酞菁染料，靶向分子和治疗剂。在一些实施方式中，所述组合物可用于本文所述的PIT方法中。在一些实施方式中，双重偶联物或包含双重偶联物的组合物可以包装为生产制品或试剂盒。
[0327] A.组合物，制剂和剂型
[0328] 在一些实施方式中，双重偶联物，例如，双重偶联物，可以在药学上可接受的缓冲液中配制，例如含有药学上可接受的运载体或载剂的缓冲液。通常，药学上可接受的运载体或载剂，例如存在于药学上可接受的缓冲剂中的那些，可以是本领域已知的。《雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences),E.W.Martin编,马克出版公司(Mack Publishing Co.),宾夕法尼亚州伊斯顿,第19版(1995)描述了适用于药物递送一种或多种
治疗化合物的组合物和制剂。药学上可接受的组合物通常是根据对监管机构或其它机构的
批准，按照用于动物和人类的公认药典而制备的。
治疗化合物的组合物和制剂。药学上可接受的组合物通常是根据对监管机构或其它机构的
批准，按照用于动物和人类的公认药典而制备的。
[0329] 药物组合物可以包括与化合物一起给予的运载体，例如稀释剂，佐剂，赋形剂或载剂。合适的药物运载体的示例参见E.W.Martin的“《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”。这类组合物将含有治疗有效量的化合物，通常是其纯化形
式，以及适量运载体，以提供适合给予对象的形式。这类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。局部给予该药物组合物时，水是典型运载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体
运载体，特别适用于注射液。伴随活性成分，组合物中还可包含：稀释剂(如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素)；润滑剂(如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石)以及粘结剂(如淀粉、天然树胶、如阿拉伯胶明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其他这类本领域技术人员已知的粘结剂)。合适的药物赋形剂包括，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇。需要时，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂，例如乙酸盐，柠檬酸钠，环糊精衍生物，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺乙酸钠，三乙醇胺油酸酯和其它此类试剂。
式，以及适量运载体，以提供适合给予对象的形式。这类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。局部给予该药物组合物时，水是典型运载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体
运载体，特别适用于注射液。伴随活性成分，组合物中还可包含：稀释剂(如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素)；润滑剂(如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石)以及粘结剂(如淀粉、天然树胶、如阿拉伯胶明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其他这类本领域技术人员已知的粘结剂)。合适的药物赋形剂包括，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇。需要时，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂，例如乙酸盐，柠檬酸钠，环糊精衍生物，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺乙酸钠，三乙醇胺油酸酯和其它此类试剂。
[0330] 在一些实施方式中，药物制剂可以是液体形式，例如溶液，糖浆或悬浮液。可通过常规方式用药学上可接受的添加剂如助悬剂(如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(如，杏仁油、油性酯或分馏植物油)；和防腐剂(如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，或山梨酸)配制这类液体制剂。在一些情况下，药物制剂可以冻干形式存在，以便在使用前用水或其它合适的载剂复原。
[0331] 在一些实施方式中，药学上可接受的缓冲剂或运载体的性质取决于所采用的特定给药方式。例如，在一些实施方式中，肠胃外制剂可包含可注射的流体，其包括药学上和生理上可接受的流体，例如水，生理盐水，平衡盐溶液，右旋糖水溶液或甘油作为载剂。在一些实施方式中，对于固体组合物，例如粉末，丸剂，片剂或胶囊剂形式，无毒固体运载体可包括例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性运载体之外，在一些实施方式中，待给予的药物组合物可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂和pH缓冲剂，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
[0332] 可以将化合物配制成合适的药物制剂，例如溶液剂，混悬剂，片剂，可分散片剂，丸剂，胶囊剂，粉末剂，缓释制剂或酏剂，用于口服给药，以及透皮贴剂和干粉吸入器。通常，使用本领域已知的技术和方法将所述化合物配制为药物组合物(参见例如《药物剂型导论(Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)》，第4版，1985，126)。通常，配制的模式取决于给药途径。
[0333] 可以配制组合物以通过本领域技术人员已知的任何途径给予，包括肌肉内，静脉内，皮内，病灶内，腹膜内注射，皮下，肿瘤内，硬膜外，鼻腔，口服，阴道，直肠，局部，外用，耳，吸入，颊(例如舌下)和经皮给药或任何途径。也可以考虑其它给药方式。取决于治疗的部位，给药可以是局部，外用或全身的。对需要治疗的区域的局部给药可以通过例如但不限于手术过程中的局部输注，局部使用，例如结合手术后的伤口敷料，通过注射，通过导管，通过栓剂或通过植入物来实现。
[0334] 本文设想通常以皮下，肌内，肿瘤内，静脉内或皮内注射为特征的肠胃外给药。注射剂(injectable)可以常规形式制备，例如液体溶液或悬浮液，适合于在注射前在液体中形成溶液或悬浮的固体形式或乳液。合适的赋形剂是例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。另外，需要时，待给予的药物组合物还可包含溶剂形式的活化剂，例如pH缓冲剂，金属离子盐或其它此类缓冲剂。药物组合物还可包含其它少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂，以及其它此类试剂，例如乙酸钠，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯和环糊精。本文还考虑了缓释或持续释放系统的植入，从而维持恒定的剂量水平(参见例如，美国专利号3,710,795)。此类肠胃外组合物中包含的活性化合物的百分比高度取决于其具体性质，化合物的活性和对象的需求。
[0335] 注射剂设计用于局部和全身给药。用于胃肠道外给药的制剂包括准备注射的无菌溶液、无菌干燥可溶性产品(如冻干的粉末)、准备在使用前与溶剂混合的物质(包括皮下片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与载剂混合的无菌干燥不溶性产品和无菌乳
液。溶液可以是水性或非水性的。如果静脉内给予，合适的运载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及含有增稠和增溶剂(葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物)的溶液。
液。溶液可以是水性或非水性的。如果静脉内给予，合适的运载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及含有增稠和增溶剂(葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物)的溶液。
[0336] 胃肠道外制剂中使用的药学上可接受的运载体包括水性载剂、非水性载剂、抗微生物剂、等渗剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬和分散剂、乳化剂、掩蔽或螯合剂和其他药学上可接受的物质。水性载剂的示例包括氯化钠注射剂，林格注射剂，等渗右旋糖注射剂，无菌水注射剂，右旋糖和乳酸林格注射剂。非水性肠胃外载剂包括植物来源的非挥发性油，棉籽油，玉米油，芝麻油和花生油。可以将抗细菌或抗真菌浓度的抗微生物剂添加到装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，其包括苯酚或甲酚，汞，苯甲醇，氯丁醇，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，硫柳汞，苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡聚糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。
[0337] 如果静脉内给予，合适的运载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及含有增稠和增溶剂(葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物)的溶液。
[0338] 该组合物可以配制成单剂量给药或多剂量给药。可以将所述试剂配制成直接给药。该组合物可以以液体或冻干制剂的形式提供。当组合物以冻干形式提供时，可以在使用前通过适当的缓冲液例如无菌盐水溶液将其重建。
[0339] 组合物也可以与其它生物活性剂顺序地，间歇地或以相同的组合物一起给予。给药还可以包括控释系统，包括控释制剂和装置控释，例如通过泵。
[0340] 在任何给定情况下，最合适的途径取决于多种因素，例如疾病的性质，疾病的进展，疾病的严重程度以及所使用的特定组合物。例如，组合物例如通过静脉内给药全身给
药。也可以采用皮下方法，尽管与静脉内方法相比，增加吸收时间对于确保等效的生物利用度可能是必需的。
药。也可以采用皮下方法，尽管与静脉内方法相比，增加吸收时间对于确保等效的生物利用度可能是必需的。
[0341] 可以将药物组合物配制成适合每种给药途径的剂型。药物和治疗活性化合物及其衍生物通常以单位剂型或多种剂型配制和给药。各单位剂量含有预定量治疗活性化合物，
其与所需药物运载体、载剂或稀释剂联用时足以产生需要的治疗效果。单位剂量形式包括
但不限于，片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、无菌胃肠道外溶液剂或混悬剂和口服溶液剂或混悬剂以及油水乳液，其含有合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物。单位剂型
可以包括安瓿和注射器或单独包装的片剂或胶囊剂。单位剂型可以逐份给予或给予多份。
多重剂型是包装在单个容器内的多个相同的单位剂型，从而以分开的单位剂型形式给予。
多重剂型的示例包括小瓶、片剂或胶囊剂瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是包装中未分开的单位剂量的倍数。通常，可以制备剂型或组合物，所述剂型或组合物包含0.005％至100％范围内的活性成分，余量由无毒运载体组成。可以将药物组合物配制成适合每种给药途径的剂型。
其与所需药物运载体、载剂或稀释剂联用时足以产生需要的治疗效果。单位剂量形式包括
但不限于，片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、无菌胃肠道外溶液剂或混悬剂和口服溶液剂或混悬剂以及油水乳液，其含有合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物。单位剂型
可以包括安瓿和注射器或单独包装的片剂或胶囊剂。单位剂型可以逐份给予或给予多份。
多重剂型是包装在单个容器内的多个相同的单位剂型，从而以分开的单位剂型形式给予。
多重剂型的示例包括小瓶、片剂或胶囊剂瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是包装中未分开的单位剂量的倍数。通常，可以制备剂型或组合物，所述剂型或组合物包含0.005％至100％范围内的活性成分，余量由无毒运载体组成。可以将药物组合物配制成适合每种给药途径的剂型。
[0342] 调节药物活性化合物的浓度，使得注射剂提供有效量以产生所需的药理作用。如本领域中已知的，确切的剂量取决于患者或动物的年龄，体重和状况。单位剂量肠胃外制剂包装在安瓿瓶，小瓶或带针注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液或重建粉末制剂的
体积取决于要治疗的疾病，和选择用于包装的特定制品。如本领域已知和实践的，用于肠胃外给予的所有制剂必须是无菌的。在一些实施方式中，组合物可以冻干粉末形式提供，其可以被重建以溶液，乳液和其它混合物的形式给药。它们也可以被重建并配制成固体或凝胶。
冻干粉末可以由上述任何溶液制备。
体积取决于要治疗的疾病，和选择用于包装的特定制品。如本领域已知和实践的，用于肠胃外给予的所有制剂必须是无菌的。在一些实施方式中，组合物可以冻干粉末形式提供，其可以被重建以溶液，乳液和其它混合物的形式给药。它们也可以被重建并配制成固体或凝胶。
冻干粉末可以由上述任何溶液制备。
[0343] 可以通过将双重偶联物溶解在缓冲溶液中来制备无菌的冻干粉末。缓冲溶液可以包含赋形剂，该赋形剂改善粉末或由粉末制备的重建溶液的其它药理成分的稳定性。
[0344] 在一些实施方式中，所需的制剂由依次无菌过滤溶液随后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干而提供。简而言之，通过将赋形剂例如葡萄糖，山梨糖醇，果糖，玉米糖浆，木糖醇，甘油，葡萄糖，蔗糖或其它合适的试剂溶解在合适的缓冲剂例如柠檬酸盐，钠或钾的磷酸盐或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂中来制备冻干粉末。然后，将选择的
酶添加到所得混合物中，并搅拌直至其溶解。将所得的混合物无菌过滤或处理以除去颗粒
并确保无菌，然后分配到小瓶中进行冻干。各小瓶可以包含单剂量(1mg-1g，通常为1-
100mg，例如1-5mg)或多剂量的化合物。冻干的粉末可在适当条件下储存，如在约4℃至室温下。用缓冲溶液重建该冻干粉可提供用于肠胃外给药的制剂。确切的量取决于所治疗的适
应症和所选化合物。该量可以根据经验确定。
酶添加到所得混合物中，并搅拌直至其溶解。将所得的混合物无菌过滤或处理以除去颗粒
并确保无菌，然后分配到小瓶中进行冻干。各小瓶可以包含单剂量(1mg-1g，通常为1-
100mg，例如1-5mg)或多剂量的化合物。冻干的粉末可在适当条件下储存，如在约4℃至室温下。用缓冲溶液重建该冻干粉可提供用于肠胃外给药的制剂。确切的量取决于所治疗的适
应症和所选化合物。该量可以根据经验确定。
[0345] 在一些实施方式中，组合物的pH在或在约6-10，例如在或在约6-8，在约6.9-7.3，例如约pH 7.1。在一些实施方式中，药学上可接受的缓冲剂的pH为至少或约5，至少或约6，至少或约7，至少或约8，至少或约9或至少或约10，或7.1。
[0346] 该组合物可以配制成单剂量给药或多剂量给药。可以将所述试剂配制成直接给药。
[0347] 在一些实施方式中，本文提供的组合物以直接给予活性化合物(例如双重偶联物)的量配制，其范围为约0.01mg-约3000mg，约0.01mg-约1000mg，约0.01mg-约500mg，约
0.01mg-约100mg，约0.01mg-约50mg，约0.01mg-约10mg，约0.01mg-约1mg，约0.01mg-约
0.1mg，约0.1mg-约2000mg，约0.1mg-约1000mg，约0.1mg-约500mg，约0.1mg-约100mg，约
0.1mg-约50mg，约0.1mg-约10mg，约0.1mg-约1mg，约1mg-约2000mg，约1mg-约1000mg，约
1mg-约500mg，约1mg-约100mg，约1mg-约10mg，约10mg-约2000mg，约10mg-约1000mg，约
10mg-约500mg，约10mg-约100mg，约100mg-约2000mg，约100mg-约1000mg，约100mg-约
500mg，约500mg-约2000mg，约500mg-约1000mg，和约1000mg-约3000mg。在一些实施方式中，组合物的体积可为0.5mL-1000mL，例如0.5mL-100mL，0.5mL-10mL，1mL-500mL，1mL-10mL，例如至少或约至少或约或0.5mL，1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，7mL，8mL，9mL，10mL，15mL，20mL，
30mL，40mL，50mL或更多。例如，配制用于单剂量给予的组合物的量为或为约100mg-500mg，或约200mg-400mg。在一些实施方式中，配制用于单剂量给予的组合物的量为约500mg-
1500mg，800mg-1200mg或1000mg-1500mg。在一些实施方式中，组合物的体积为或为约10mL-
1000mL或50mL-500mL；或所述组合物的体积是至少10mL，20mL，30mL，40mL，50mL，75mL，
100mL，150mL，200mL，250mL，300mL，400mL，500mL或1000mL。
0.01mg-约100mg，约0.01mg-约50mg，约0.01mg-约10mg，约0.01mg-约1mg，约0.01mg-约
0.1mg，约0.1mg-约2000mg，约0.1mg-约1000mg，约0.1mg-约500mg，约0.1mg-约100mg，约
0.1mg-约50mg，约0.1mg-约10mg，约0.1mg-约1mg，约1mg-约2000mg，约1mg-约1000mg，约
1mg-约500mg，约1mg-约100mg，约1mg-约10mg，约10mg-约2000mg，约10mg-约1000mg，约
10mg-约500mg，约10mg-约100mg，约100mg-约2000mg，约100mg-约1000mg，约100mg-约
500mg，约500mg-约2000mg，约500mg-约1000mg，和约1000mg-约3000mg。在一些实施方式中，组合物的体积可为0.5mL-1000mL，例如0.5mL-100mL，0.5mL-10mL，1mL-500mL，1mL-10mL，例如至少或约至少或约或0.5mL，1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，7mL，8mL，9mL，10mL，15mL，20mL，
30mL，40mL，50mL或更多。例如，配制用于单剂量给予的组合物的量为或为约100mg-500mg，或约200mg-400mg。在一些实施方式中，配制用于单剂量给予的组合物的量为约500mg-
1500mg，800mg-1200mg或1000mg-1500mg。在一些实施方式中，组合物的体积为或为约10mL-
1000mL或50mL-500mL；或所述组合物的体积是至少10mL，20mL，30mL，40mL，50mL，75mL，
100mL，150mL，200mL，250mL，300mL，400mL，500mL或1000mL。
[0348] 在一些实施方式中，可以取出制剂的整个小瓶内容物以进行给药，或者可以将其分成多个剂量以进行多次给药。在取出一定量的用于给药的药物后，如果需要，可以将制剂进一步稀释，例如在水，盐水(例如0.9％)或其它生理溶液中稀释。
[0349] 在一些实施方式中，还提供了包含用于其它或联合疗法的其它治疗剂的组合物和组合，其可以根据如上所述的已知或标准制剂指南来制备。在一些实施方式中，双重偶联物和其它治疗剂被配制成单独的组合物。在一些实施方式中，其它治疗剂作为与双重偶联物
分开的组合物提供，并且两种组合物分开给予。可以将组合物配制成用于肠胃外递送(即，用于全身递送)。例如，配制组合物或组合物的组合用于皮下递送或静脉内递送。例如双重偶联物和/或其它治疗剂之类的试剂可以通过不同的给药途径来给药。
分开的组合物提供，并且两种组合物分开给予。可以将组合物配制成用于肠胃外递送(即，用于全身递送)。例如，配制组合物或组合物的组合用于皮下递送或静脉内递送。例如双重偶联物和/或其它治疗剂之类的试剂可以通过不同的给药途径来给药。
[0350] B.包装和生产制品
[0351] 还提供了包含包装材料，本文提供的任何药物组合物或组合物以及表明该组合物和组合物将用于治疗癌症的标签的制品。示例性制品是包括单室和双室容器的容器。容器
包括但不限于管，瓶和注射器。容器可以还包括用于皮下给予的针。
包括但不限于管，瓶和注射器。容器可以还包括用于皮下给予的针。
[0352] 在一些实施方式中，可以将例如双重偶联物的试剂分开提供以包装成制品。在一些实施方式中，制品包含含有本文提供的双重偶联物的药物组合物。
[0353] 本文提供的制品含有包装材料。用于包装药用产品的包装材料是本领域技术人员已知的。例如，参见美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，各篇在此全文纳入。药物包装材料的例子包括但不限于泡罩包装，瓶，管，吸入器，泵，袋，小瓶，容器，注射器，瓶以及适合于选定制剂和预期给药方式和治疗方式的任何包装材料。包装的选择取决于所述试
剂。通常，包装与其中所含的组合物不反应。
剂。通常，包装与其中所含的组合物不反应。
[0354] 组分可以包装在相同的不同容器中。例如，在一些实施方式中，将组分分别包装在同一容器中。通常，这样的容器的例子包括具有封闭的，限定空间的容器，该空间包含双重偶联物；以及单独的封闭的，限定空间的容器，该空间包含其它组分或组分，使得随后的区域被分离以允许组分被分开给予。可以考虑任何容器或其它制品，只要在给予前将试剂与其它组分分开即可。对于合适的实施方式，参见例如美国专利号3,539,794和5,171,081。在一些实施方式中，提供了多个容器，每个容器分别包含双重偶联物和其它治疗剂。在这样的示例中，多个容器可以作为试剂盒包装在一起。
[0355] 在一些实施方式中，将含有双重偶联物的容器容纳在避光容器中。在一些实施方式中，容器是小瓶，例如去热原的玻璃小瓶。在一些实施方式中，容器，例如小瓶，阻挡特定波长的光，例如被本文提供的双重偶联物中的染料吸收的光的波长。在一些实施方式中，使用保护内容物免受光或一些波长或强度的光的容器保护双重偶联物免受光影响。例如，在
一些实施方式中，容器的透光率不大于50％，不大于40％，不大于30％，不大于20％，不大于
10％，不大于5％，或不大于1％。在一些实施方式中，容器防止波长在约500nm-725nm，例如在约650nm-725nm的光的透射，或者不透射大于700lux，600lux，500lux，400lux，300lux，
200lux或100lux的光的强度。在一些实施方式中，容器是绿色的，琥珀色的，半透明的，不透明的，或者被包裹在不透明的材料中，例如箔片，例如铝箔。在一些实施方式中，容器是无菌的或去热原的。
一些实施方式中，容器的透光率不大于50％，不大于40％，不大于30％，不大于20％，不大于
10％，不大于5％，或不大于1％。在一些实施方式中，容器防止波长在约500nm-725nm，例如在约650nm-725nm的光的透射，或者不透射大于700lux，600lux，500lux，400lux，300lux，
200lux或100lux的光的强度。在一些实施方式中，容器是绿色的，琥珀色的，半透明的，不透明的，或者被包裹在不透明的材料中，例如箔片，例如铝箔。在一些实施方式中，容器是无菌的或去热原的。
[0356] 在一些实施方式中，制品包含含有本文提供的双重偶联物和其它治疗剂的药物组合物。例如，在一些实施方式中，可以与其它治疗剂组合提供组合物。在一些实施方式中，双重偶联物和/或其它治疗剂可以作为单独的组合物包装为制品，用于一起，顺序或间歇地给予。这些组合可以包装成试剂盒。
[0357] 在一些实施方式中，双重偶联物被提供在多个可密封的容器中。例如，容器可以各自单独包含含有本文提供的双重偶联物的组合物的单次给药剂量的一部分。在一些实施方式中，在多个可密封容器中的双重偶联物的组合量在约100mg至1500mg之间，或在100mg至
1200mg之间。在一些实施方式中，在多个可密封容器中的双重偶联物的组合量为或为约
100mg-500mg，约200mg-400mg，约500mg-1500mg，约800mg-1200mg或约1000mg-1500mg。
1200mg之间。在一些实施方式中，在多个可密封容器中的双重偶联物的组合量为或为约
100mg-500mg，约200mg-400mg，约500mg-1500mg，约800mg-1200mg或约1000mg-1500mg。
[0358] 在一些实施方式中，制品包含包装材料和标签或包装插页，其中包含用于组合多个小瓶的内容物以制备组合物的单剂量制剂的说明。
[0359] 包括其制品的选定组合物也可以作为试剂盒提供。试剂盒可包括本文所述的药物组合物和作为制品提供的用于给药的物品。试剂盒可以任选地包括例如根据本文所述的用
于光免疫疗法(PIT)的任何方法的包括剂量，给药方案和给予方式的说明书和/或照射的说
明书。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。
于光免疫疗法(PIT)的任何方法的包括剂量，给药方案和给予方式的说明书和/或照射的说
明书。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。
[0360] 在一些实施方式中，用于给予试剂(例如双重偶联物)的组合物包含有效量的每种试剂以及适合于所考虑的给予类型的常规药物运载体和赋形剂。
[0361] 在一些实施方式中，单一剂量的试剂，例如双重偶联物，被包含在单个容器内，例如在其中存储了试剂的容器。在一些实施方式中，单一剂量的试剂包含在多个容器中。因此，在一些实施方式中，将多个容器(例如小瓶)组合在用于给予试剂的容器中，例如静脉内(IV)袋。在一些实施方式中，用于给药的容器例如IV袋通过如下方式制备：打开一个或多个包含试剂的容器并将内容物放入袋中，例如直到达到所需剂量的用于给药，例如，输注的试剂。在制备例如IV袋的给药容器期间，采取防光措施以避免试剂暴露于光，例如本文所述的各种防光措施。
[0362] IV.定义
[0363] 除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐
明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理
解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理
解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
[0364] 如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种(一个)”或(一种(个)或多种(个)”。应理解本文中所述的方面和变化形式包括：由“(这些方面和变化形式)组成”和/或“基本由(这些方面和变化形式)组成”。
[0365] 本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个
数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较
小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非
明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括
排除所述限值之一个或两个的范围。这普遍适用，与范围宽度无关。
数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较
小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非
明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括
排除所述限值之一个或两个的范围。这普遍适用，与范围宽度无关。
[0366] 本文使用的术语“约”是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。提及值或参数时的“约”包括(并公开)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
[0367] 如本文所用，“偶联物”是指直接或间接连接至一个或多个其它多肽或化学部分的多肽。此类偶联物包括融合蛋白，通过化学偶联物产生的那些以及通过任何其它方法产生的那些。例如，偶联物可指直接或间接连接至一个或多个其它多肽或化学部分，例如结合至或靶向细胞表面分子的靶向分子的酞菁染料，例如IR700分子。
[0368] 本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物，包括细胞，的任何混合物。组合物可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任意组合。
[0369] 如本文所用，“药物组合物”或“药物制剂”是指这样的制剂，其形式为允许其中包含的活性成分的生物活性有效，并且不包含对待给予该制剂的对象具有不可接受的毒性的其它组分。
[0370] 如本文所用，“药学上可接受的运载体”指药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对对象无毒。药学上可接受的运载体包括但是不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0371] 如本文所用，组合是指两个或更多个物项(item)之间的任何关联。所述组合可以是两个或更多个单独的物项，例如两个组合物或两个集合，可以是它们的混合物，例如两个或更多物项的单个混合物，或其任何变体。组合的元素通常在功能上相关联或相关。
[0372] 如本文所用，衍生物是指相对于参考药物或试剂已经发生变化或修饰但仍保留活性(例如，显示增加或降低的活性)的药物形式。通常，化合物的衍生物形式是指该化合物的侧链已被修饰或改变。
[0373] 如本文所用，药物或试剂的类似物(analogue)或相似物(analog)是与参考药物有关的药物或试剂，但是其化学和生物学活性可以不同。通常，类似物显示与参考药物或试剂相似的活性，但是活性可以增加或降低或以其它方式改善。化合物或药物的类似物形式通
常是指与参考药物相比，该结构的骨架核心被修饰或改变。
常是指与参考药物相比，该结构的骨架核心被修饰或改变。
[0374] 如本文所用，试剂盒是包装的组合，其任选地包括其它元素，例如其它试剂和其组合或元素的使用说明。
[0375] 术语“包装插页”指治疗性产品的商品包装中常包括的说明书，所述说明书包含关于这类治疗性产品使用的说明、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
[0376] 如本文所用，“生产制品”是制成的产品，在一些情况下可以出售。在一些实施方式中，该术语可以指包含在包装制品中，例如在容器中的组合物。
[0377] 如本文所用，“组合疗法”是指其中给予对象两种或更多种治疗剂，例如至少两种或至少三种治疗剂，用于治疗单一疾病的治疗。在一些实施方式中，每种疗法可导致独立的药物作用，并且一起可导致累加或协同的药物作用。
[0378] 如本文所用，“疾病(disease)”，“紊乱(disorder)”或“病症(condition)”是指由病因或病症引起的生物体中的病理病症，所述病因或病症包括但不限于感染，获得性病症，遗传病症，并且以可识别的症状为特征。
[0379] 如本文所用，“治疗”患有疾病、紊乱或病症的对象是指该对象的症状在治疗后被部分或全部减轻或保持静止。因此，治疗包括预防，治疗和/或治愈。预防是指预防潜在的疾病和/或预防症状恶化或疾病进展。
[0380] 如本文所用，“治疗”意指改善或以其它方式有益地改变病症，紊乱或疾病或其它适应症的症状的任何方式。
[0381] 如本文所用，“治疗效果”是指由对象的治疗产生的效果，其改变，通常改善或减轻疾病、紊乱或病症的症状或治愈疾病、紊乱或病症。
[0382] 如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指至少足以产生治疗效果的试剂，化合物，材料或包含化合物的组合物的量。因此，它是预防，治愈，减轻，阻止或部分阻止疾病，病症或障碍的症状所必需的量。
[0383] 如本文所用，通过治疗例如通过给予药物组合物或其它治疗剂来减轻特定疾病，紊乱或病症的症状是指可归因于组合物或治疗剂的给予或与其有关的症状的减轻，不论是
永久还是暂时，持久还是短暂减弱。
永久还是暂时，持久还是短暂减弱。
[0384] 如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物，例如人。
[0385] 如本文所用，“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团未被取代或被取代。
[0386] 本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据集，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其他出版物中所示的定义不同或其他
情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
[0387] 本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述主题。
[0388] 示例性实施方案
[0389] 提供的实施方式包括：
[0390] 1.双重偶联物，其包含酞菁染料、靶向分子和治疗剂。
[0391] 2.如实施方式1所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料和治疗剂各自独立地连接至所述靶向分子。
[0392] 3.如实施方式1所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子和治疗剂各自独立地连接至所述酞菁染料。
[0393] 4.如实施方式1所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料和靶向分子各自独立地连接至所述治疗剂。
[0394] 5.如实施方式1所述的双重偶联物，其中，所述双重偶联物包含如下组分：
[0395] (酞菁染料)n，(靶向分子)q和(治疗剂)m，其中：
[0396] n、q和m独立选择，至少为1。
[0397] 6.如实施方式5所述的双重偶联物，其中，独立选择的n和q为1-5。
[0398] 7.如实施方式5所述的双重偶联物，其中，独立选择的n和m为1-5。
[0399] 8.如实施方式5所述的双重偶联物，其中，q是1，n是1-100，且m是1-5。
[0400] 9.如实施方式5所述的双重偶联物，其中，n与q的比率为或为约1-约1000，或约1-约10，或约2-约5。
[0401] 10.如实施方式1-9中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子能够结合病灶微环境中细胞上的细胞表面分子。
[0402] 11.如实施方式1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子与所述酞菁染料或治疗剂直接连接。
[0403] 12.如实施方式1-11中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子和酞菁染料和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。
[0404] 13.如实施方式1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料与所述靶向分子或治疗剂直接连接。
[0405] 14.如实施方式1-10和13中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料与靶向分子和/或治疗剂之间的连接是共价或非共价的。
[0406] 15.如实施方式1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂与所述酞菁染料或靶向分子直接连接。
[0407] 16.如实施方式1-10和15中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂和酞菁染料或靶向分子之间的连接是共价或非共价的。
[0408] 17.如实施方式1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂通过接头与所述酞菁染料或靶向分子间接连接。
[0409] 18.如实施方式1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子通过接头间接连接至所述酞菁染料或治疗剂。
[0410] 19.如实施方式1-10中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料通过接头间接连接至所述靶向分子或治疗剂。
[0411] 20.如实施方式17-19中任一项所述的双重偶联物，其中，所述接头是肽或多肽或是化学接头。
[0412] 21.如实施方式17-20中任一项所述的双重偶联物，其中，所述接头是可释放的接头或可裂解的接头。
[0413] 22.如实施方式21所述的双重偶联物，其中，所述可释放的接头或所述可裂解的接头在病灶微环境中释放或裂解。
[0414] 23.如实施方式22所述的双重偶联物，其中，病灶是肿瘤，并且所述可释放的接头或可裂解的接头在肿瘤微环境(TME)中释放或裂解。
[0415] 24.如实施方式21-23中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可释放的接头或所述可裂解的接头由TME中存在的基质金属蛋白酶(MMP)释放或裂解。
[0416] 25.如实施方式21-24中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头包含氨基酸PLGLWA序列。
[0417] 26.如实施方式21-23中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可释放的接头或所述可裂解的接头在缺氧条件或酸性条件下释放或裂解。
[0418] 27.如实施方式21-23和26中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头在酸性条件下可裂解，并且所述可裂解的接头包含一个或多个腙、缩氨基脲
(semicarbazone)、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic
amide)、原酸酯、缩醛、缩酮或硫醚连接。
(semicarbazone)、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic
amide)、原酸酯、缩醛、缩酮或硫醚连接。
[0419] 28.如实施方式21-23和26中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头在缺氧条件下可裂解，并且所述接头包含一个或多个二硫键。
[0420] 29.如实施方式21-23中任一项所述的双重偶联物，其中，所述可裂解的接头可被光照射裂解，并且所述接头包含一个或多个光不稳定的苯甲酰甲基酯，光不稳定的肼或光
不稳定的邻硝基苄基连接或光不稳定的喹喔啉与硫醚。
不稳定的邻硝基苄基连接或光不稳定的喹喔啉与硫醚。
[0421] 30.如实施方式1-29中任一项所述的双重偶联物，其中，所述治疗剂是免疫调节剂和/或抗癌剂。
[0422] 31.如实施方式30所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是细胞因子或是在病灶的微环境中诱导细胞因子表达增加的试剂。
[0423] 32.如实施方式31所述的双重偶联物，其中，所述细胞因子选自IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，肿瘤坏死因子(TNF)-α，TNF-β，人类生长激素，N-甲硫基人生长激素，甲状旁腺激素，甲状腺素，胰岛素，胰岛素原，松弛素，松弛素原，糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)，肝生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，催乳激素，胎盘乳原，肿瘤坏死因子-α和-β，缪勒抑制剂，小鼠促性腺激素相关肽，抑制素，激活素，血管内皮生长因子(VEGF)，整联蛋白，血小板生成素(TPO)，神经生长因子(NGF)-β，血小板生长因子，转化生长因子(TGF)-α，TGF-β，胰岛素样生长因子(IGF)-1，IGF-2，促红细胞生成素(EPO)，骨诱导因子，巨噬细胞-CSF(M-CSF)，粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)，粒细胞CSF(G-CSF)，白血病抑制因子(LIF)，kit配体(KL)和/或其部分和/或组合。
[0424] 33.如实施方式30-32中任一项所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是细胞因子，并且所述细胞因子是IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、TNF-α或GM-CSF。
[0425] 34.如实施方式30所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂或激动剂。
[0426] 35.如实施方式30或实施方式34所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂特异性结合选自以下的分子：CD25、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28 VISTA、ICOS、ICOS-L、CD27、CD30、STING和A2A腺苷受体。
[0427] 36.如实施方式30、34和35中任一项所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂是抗体或其抗原结合片段、小分子或多肽。
[0428] 37.如实施方式30和34-36中任一项所述的双重偶联物，其中，所述免疫调节剂选自：尼莫单抗，派姆单抗，匹利珠单抗，MK-3475，BMS-936559，MPDL3280A，伊匹木单抗，特姆单抗，IMP31，BMS-986016，乌鲁单抗，TRX518，达昔妥珠单抗，鲁卡妥姆单抗，SEQ-CD40，CP-
870，CP-893，MED16469，MED14736，MOXR0916，AMP-224和MSB001078C，或是其抗原结合片段。
870，CP-893，MED16469，MED14736，MOXR0916，AMP-224和MSB001078C，或是其抗原结合片段。
[0429] 38.如实施方式30所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂是烷基化剂，铂类药物，抗代谢物，抗肿瘤抗生素，拓扑异构酶抑制剂，有丝分裂抑制剂，皮质类固醇，蛋白酶体抑制剂，激酶抑制剂，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，抗肿瘤剂或其组合。
[0430] 39.如实施方式30或实施方式38所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂是抗体或其抗原结合片段、小分子或多肽。
[0431] 40.如实施方式30、38和39中任一项所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂选自5-氟尿嘧啶/亚叶酸，奥沙利铂，伊立替康，雷戈非尼，齐夫-阿非普西，卡培他滨，顺铂，紫杉醇，托普替康，卡铂，吉西他滨，多西他赛，5-FU，异环磷酰胺，丝裂霉素，培美曲塞，长春瑞滨，卡莫司汀韦格，替莫唑胺，甲氨蝶呤，卡巴他滨，拉帕替尼，依托泊苷，达布拉非尼，维拉非尼，脂质体阿糖胞苷，阿糖胞苷，干扰素α，厄洛替尼，长春新碱，环磷酰胺，洛美霉素，普罗卡巴嗪，舒尼替尼，索马他汀，阿霉素，聚乙二醇化脂质体包封的阿霉素，表柔比星，艾瑞布林，结合白蛋白的紫杉醇，伊沙匹隆，磺胺甲基异噁唑，紫杉烷，长春碱，替西罗莫司，替莫唑胺，苯达莫司汀，口服依托泊苷，依维莫司，奥曲肽，兰瑞肽，达卡巴嗪，梅斯纳，帕唑帕尼，艾瑞布林，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，他莫昔芬，托瑞米芬，放线菌素，西罗莫司，克唑替尼，赛替尼，恩杂鲁胺，醋酸阿比特龙，米托蒽醌，卡巴他赛，氟嘧啶，奥沙利铂，亚叶酸钙，阿法替尼，塞立替尼，吉非替尼，卡波替尼，奥沙利铂和金尿嘧啶。
[0432] 41.如权利要求30、38和39中任一项所述的双重偶联物，其中，所述抗癌剂选自：贝伐单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，雷莫昔单抗，伊匹木单抗，利妥昔单抗，曲妥珠单抗，阿多曲妥珠单抗美坦，培妥珠单抗，尼莫单抗，拉帕替尼，达拉非尼，维拉非尼，厄洛替尼，舒尼替尼，帕唑帕尼，伊马替尼，雷戈非尼，索拉非尼，尼洛替尼，达沙替尼，塞来昔布，克唑替尼，赛替尼，阿法替尼，阿西替尼，贝伐单抗，博舒替尼，卡博替尼，阿法替尼，吉非替尼，替西罗莫司，依维莫司，西罗莫司，依鲁替尼，伊马替尼，乐伐替尼，奥拉帕尼，帕博西尼，鲁索替尼，曲美替尼，凡德他尼或维莫德吉或其抗原结合片段。
[0433] 42.如实施方式1-41中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料具有约600nm-约850nm的最大吸收波长。
[0434] 43.如实施方式1-42中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料包含下式：
[0435] 其中：
[0436] L是接头；
[0437] Q是使染料附连至靶向分子的反应性基团；
[0438] R2、R3、R7和R8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0439] R4、R5、R6、R9、R10和R11各自独立地选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烷酰基，任选取代的烷氧羰基，任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中R4、R5、R6、R9、R10和R11中至少一个包含水可溶性基团；
[0440] R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22和R23各自独立地选自氢，卤素，任选取代的烷硫基，任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基；且
[0441] X2和X3各自独立地是C1–C10亚烷基，其任选被杂原子中断。
[0442] 44.如实施方式1-42中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料包含下式：
[0443]其中：
[0444] X1和X4各自独立地是C1-C10亚烷基，其任选被杂原子中断；
[0445] R2、R3、R7和R8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0446] R4、R5、R6、R9、R10和R11各自独立地选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烷酰基，任选取代的烷氧羰基，任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中R4、R5、R6、R9、R10和R11中至少一个包含水可溶性基团；且
[0447] R16、R17、R18和R19各自独立地选自氢，卤素，任选取代的烷硫基，任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基。
[0448] 45.如实施方式1-44中任一项所述的双重偶联物，其中，所述酞菁染料包含IRDye 700DX(IR700)。
[0449] 46.如实施方式1-45中任一项所述的双重偶联物，其中，所述靶向分子是抗体或其抗原结合片段。
[0450] 47.如实施方式46所述的双重偶联物，其中，所述抗体是抗原结合片段，其为Fab，单VH结构域，单链可变片段(scFv)，多价scFv，双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。
[0451] 48.如实施方式10-47中任一项所述的双重偶联物，其中，所述病灶是癌前异常结构，原位癌，赘生物，增生性肿瘤或与癌症相关的肿瘤。
[0452] 49.一种组合物，其包含如实施方式1-48中任一项所述的双重偶联物。
[0453] 50.如实施方式49所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
[0454] 51.一种试剂盒，包括：
[0455] 如实施方式1-48中任一项所述的双重偶联物，或如实施方式49或实施方式50所述的组合物；和
[0456] 任选的使用说明。
[0457] 52.一种治疗对象中病灶的方法，包括：
[0458] a)给予所述对象治疗有效量的如实施方式1-48中任一项所述的双重偶联物或如实施方式49或实施方式50所述的组合物或如实施方式51所述的试剂盒；和
[0459] b)在给予所述偶联物之后，在一定波长下照射该病灶，以诱导所述偶联物的光毒性活性。
[0460] 53.如实施方式52所述的方法，其中，对所述病灶的照射在500nm-900nm(含端值)的波长下以至少1J cm-2或1J/cm纤维长度的剂量进行。
[0461] 54.如实施方式52或实施方式53所述的方法，其中，对所述病灶的照射在600nm-850nm的波长下进行。
[0462] 55.如实施方式52-54中任一项所述的方法，其中，对所述病灶的照射在690±50nm的波长或在约690±20nm的波长下进行。
[0463] 56.如实施方式52-55中任一项所述的方法，其中，对所述病灶的照射以从或从约2J cm-2至约400J cm-2或从或从约2J/cm纤维长度至约500J/cm纤维长度的剂量进行。
[0464] 57.如实施方式52-56中任一项所述的方法，其中：
[0465] 对所述病灶的照射以如下剂量进行：至少或至少约2J cm-2，5J cm-2，10J cm-2，25J cm-2，50J cm-2，75J cm-2，100J cm-2，150J cm-2，200J cm-2，300J cm-2，400J cm-2，或500J cm-2；或
[0466] 对所述病灶的照射以如下剂量进行：至少或至少约2J/cm纤维长度，5J/cm纤维长度，10J/cm纤维长度，25J/cm纤维长度，50J/cm纤维长度，75J/cm纤维长度，100J/cm纤维长度，150J/cm纤维长度，200J/cm纤维长度，250J/cm纤维长度，300J/cm纤维长度，400J/cm纤维长度或500J/cm纤维长度。
[0467] 58.如实施方式52-57中任一项所述的方法，其中，所述病灶是肿瘤或与癌症相关的肿瘤。
[0468] 59.如实施方式58所述的方法，其中，所述肿瘤是肉瘤或癌。
[0469] 60.如实施方式58或实施方式59所述的方法，其中，所述肿瘤是癌，其为鳞状细胞癌、基底细胞癌或腺癌。
[0470] 61.如实施方式58-60中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤是癌，其是膀胱，胰腺，结肠，卵巢，肺，乳腺，胃，前列腺，子宫颈，食道或头颈的癌。
[0471] 62.如实施方式58-61中任一项所述的方法，其中，所述癌是位于头颈部，乳腺，肝，结肠，卵巢，前列腺，胰腺，脑，子宫颈，骨，皮肤，眼，膀胱，胃，食道，腹膜或肺的癌。
[0472] 63.如实施方式52-62中任一项所述的方法，其中，对所述病灶的照射在给予所述方法后约30分钟-约96小时进行。
[0473] 64.如实施方式52-63中任一项所述的方法，其中，双重偶联物以如下剂量给予：从或从约50mg/m2至约5000mg/m2，从约250mg/m2至约2500mg/m2，从约750mg/m2至约1250mg/m2，2 2
或从约100mg/m至约1000mg/m。
或从约100mg/m至约1000mg/m。
[0474] 65.如实施方式52-64中任一项所述的方法，其还包括给予其它治疗剂或抗癌治疗。
[0475] 66.如实施方式65所述的方法，其中，所述其它抗癌治疗包括放射疗法。
[0476] 67.如实施方式52-66中任一项所述的方法，其中，所述双重偶联物与用于治疗所述病灶、疾病或病症的其它治疗物联合。
[0477] 68.如实施方式52-67中任一项所述的方法，其中：
[0478] 靶向的病灶包括神经元，且所述疾病或病症是神经性疾病，其任选包括疼痛；
[0479] 靶向的病灶包括脂肪细胞或脂细胞，且所述疾病或病症包括过量的脂肪；
[0480] 靶向的病灶包括病原体感染的细胞，且所述疾病或病症包括感染；
[0481] 靶向的病灶包括炎性细胞，且所述疾病或病症包括炎症。
[0482] VI.实施例
[0483] 下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。
[0484] 实施例1：西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物的生成
[0485] 该实施例描述了制备示例性偶联物的方法，该偶联物包含与示例性靶向分子例如抗体连接的IRDye 700DX(IR700)，以产生抗体-IRDye 700DX(抗体-IR700)。提供的方法是
示例性的，并且可采用类似的方法将其它靶向分子(例如其它抗体或非抗体靶向分子)与
IRDye 700Dx偶联。考虑到染料的光敏性，这些方法以限制染料和偶联物暴露于光的方式进行，这包括在生产设备中使用波长为425至575nm且强度小于200Lux的低水平绿光。以下缓
冲液用于偶联：偶联缓冲液(100mM磷酸钠，pH 8.65)，淬灭缓冲液(1.0M甘氨酸，pH 9)和最终磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制缓冲液：(5.60mM Na2HPO4,1.058KH2PO4,154mM NaCl,pH
7.1)。
示例性的，并且可采用类似的方法将其它靶向分子(例如其它抗体或非抗体靶向分子)与
IRDye 700Dx偶联。考虑到染料的光敏性，这些方法以限制染料和偶联物暴露于光的方式进行，这包括在生产设备中使用波长为425至575nm且强度小于200Lux的低水平绿光。以下缓
冲液用于偶联：偶联缓冲液(100mM磷酸钠，pH 8.65)，淬灭缓冲液(1.0M甘氨酸，pH 9)和最终磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制缓冲液：(5.60mM Na2HPO4,1.058KH2PO4,154mM NaCl,pH
7.1)。
[0486] A.染料和西妥昔单抗的制备
[0487] 1.西妥昔单抗的制备
[0489] 然后通过超滤/渗滤(UF/DF)进行浓缩和缓冲液交换步骤。清洗UF/DF装置并用100mM磷酸钠，pH 8.65缓冲液平衡。在进行UF/DF操作之前，将汇集、过滤的西妥昔单抗放在
25℃的孵育箱中温热120-150分钟。首先将该物质浓缩至5mg/mL的目标浓度，然后渗滤至
100mM磷酸钠，pH 8.65缓冲液中。确定渗滤的西妥昔单抗产物的浓度，然后使用100mM磷酸钠，pH 8.65缓冲液稀释至2mg/mL(1.8–2.4mg/mL)的目标浓度。
25℃的孵育箱中温热120-150分钟。首先将该物质浓缩至5mg/mL的目标浓度，然后渗滤至
100mM磷酸钠，pH 8.65缓冲液中。确定渗滤的西妥昔单抗产物的浓度，然后使用100mM磷酸钠，pH 8.65缓冲液稀释至2mg/mL(1.8–2.4mg/mL)的目标浓度。
[0490] 2.染料制备
[0491] 在偶联之前，通过将IRDye 700DX NHS酯(染料；目录号929-70011；Li-COR，内布拉斯加州林肯)在无水DMSO中溶解至10mg/mL的浓度来制备。这些步骤在绿光(例如，从425至575nm的波长和小于200Lux的强度)下进行以保护染料免受染料强吸收的光的波长影响。
[0492] B.偶联
[0493] 偶联和淬灭步骤在装有渗滤西妥昔单抗的大瓶(carboy)中进行，所述小瓶包裹在铝箔中以避光。所述步骤在室温下在绿光下(例如，波长从425至575nm，强度小于200Lux)进行以保护偶联物免于光降解。
[0494] 偶联反应采用DMSO中的IRDye 700DX NHS酯以4:1的最终摩尔比(IRDye 700DX NHS酯:西妥昔单抗)进行，以使每个西妥昔单抗分子掺入约2-3个染料残基。将IRDye 700DX NHS酯添加到含有西妥昔单抗的大瓶中，并在搅拌板上混合10-15分钟。然后，偶联反应通过将大瓶放置在25℃的孵育箱中进行120分钟。
[0495] 偶联反应通过添加1M甘氨酸至终浓度4.2mM，并混合10-12分钟淬灭。大瓶在25℃的孵育箱中另孵育20-25分钟。
[0496] 进行最终的UF/DF步骤以将偶联的产物交换到最终的PBS制剂缓冲液中。将淬灭的偶联物转移到UF/DF系统中，首先浓缩至8-10L，然后用8-12分体积(diavolume)的PBS渗滤，以将产物交换到最终的制剂缓冲液中。确定蛋白质浓度，如果需要，用PBS进一步稀释以达到2.0mg/mL(1.8–2.1mg/mL)的最终目标产物浓度。
[0497] 进行通过0.22μm滤器的过滤，将西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物在2-8℃于50L的铝箔纸覆盖的HyQtainer中避光保存，以防止内容物受光。该步骤在室温下在绿灯下进行以保护西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物。将所得的偶联物提交进行SEC-HPLC分析，以确定浓
度，染料与抗体之比(DAR)，同一性和纯度，并确定外观，pH，生物负荷和内毒素水平。
度，染料与抗体之比(DAR)，同一性和纯度，并确定外观，pH，生物负荷和内毒素水平。
[0498] 实施例2：西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物的药代动力学和治疗功效
[0499] 本实施例描述了临床研究(1期)的中期结果，该研究评估了在单次或多次给予西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物治疗后接受照射以诱导光免疫疗法(PIT)治疗的头颈癌患者
中的安全性和有效性。确定西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物单次给药后人患者的药代动力
学参数和肿瘤反应，以评估该疗法的安全性和有效性。
中的安全性和有效性。确定西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物单次给药后人患者的药代动力
学参数和肿瘤反应，以评估该疗法的安全性和有效性。
[0500] A.方法
[0501] 九(9)名头颈部鳞癌患者进入了剂量递增临床试验。将患者分为三(3)个剂量组，如下表1所示。每个组包括三(3)名患者。参加该试验的所有患者均患有复发性进行性癌症，这些癌症经过多轮市售可得治疗均告失败，其中一些患者先前未接受西妥昔单抗抗体治
疗。该研究既包括HPV阳性和阴性肿瘤患者，也包括P16阳性和阴性肿瘤患者。
疗。该研究既包括HPV阳性和阴性肿瘤患者，也包括P16阳性和阴性肿瘤患者。
[0502] 表1.西妥昔单抗-IRDye 700DX的I期临床研究的剂量组
[0503]
[0504] 装有偶联物的静脉(IV)袋由包含50mL 2mg/mL的如实施例1所述制备的西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物溶液的小瓶制备。如实施例1中所述，使用前，将小瓶包装在单个纸盒中，然后装在不透明的小袋中。西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物的处理及其通过输注的
给予是在避光房间内进行的，其荧光灯低于400lux。输液袋的制备过程中从未使用钨丝灯。
房间中的所有窗户都被遮荫帘覆盖，因此西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物绝不会直接或间
接暴露于阳光下。
给予是在避光房间内进行的，其荧光灯低于400lux。输液袋的制备过程中从未使用钨丝灯。
房间中的所有窗户都被遮荫帘覆盖，因此西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物绝不会直接或间
接暴露于阳光下。
[0505] 在关灯的生物安全柜或通风橱中，使偶联物暴露于不超过200lux(等于60瓦的灯泡或15瓦的荧光室内灯)的光强度下，从不透明袋取出各小瓶，然后从纸盒中取出。打开每个包含偶联物的小瓶的包装，并将该小瓶中的内容物放入无菌的IV袋中，直到达到所需的
用于输注的偶联物剂量。
用于输注的偶联物剂量。
[0506] 以上述表8A中列出的临床剂量向患者静脉内给予单剂量的西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物。在第1天通过2小时的IV输注来给予偶联物。在给予期间，静脉内(IV)输注袋用不透明的套筒覆盖以保护偶联物免受光照射。
[0507] 为了诱导光免疫疗法(PIT)，在偶联物给予后24小时±3小时(第2天)用波长为690nm的光进行一次光施加。通过表面(superficial)和间隙(interstitial)照明探针向肿
瘤给予690nm的光。对于表面照明，将光处理固定为50J/cm2的低通量，或对于间隙照明，将光处理固定为100J/cm纤维长度。
瘤给予690nm的光。对于表面照明，将光处理固定为50J/cm2的低通量，或对于间隙照明，将光处理固定为100J/cm纤维长度。
[0508] 对于微透镜表面光处理，位于肿瘤周围0.5-1.0cm的正常组织也包括在光处理领域中，以接触肿瘤边缘的微观浸润性疾病。
[0509] 对于圆柱形扩散器直接植入肿瘤中的情况，采用标准技术来放置近距离放射治疗(brachytherapy)导管，包括基于介入放射学方法的超声(US)或计算机断层扫描(CT)指导。
在一些情况下，采用了近距离放射治疗格栅。通过侧向X线，US或CT确认定位导管。然后，根据制造商的说明，将圆柱形扩散器纤维连接到690nm激光控制台。
在一些情况下，采用了近距离放射治疗格栅。通过侧向X线，US或CT确认定位导管。然后，根据制造商的说明，将圆柱形扩散器纤维连接到690nm激光控制台。
[0510] B.响应
[0511] 评估患有头颈癌，先给予西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物单次治疗，然后照射以诱导光免疫疗法(PIT)的患者的肿瘤响应。根据在修订版1.1指南(RECIST 1.1,参见
Eisenhauer等(2009)European Journal of Cancer,45:228-247)中概述的RECIST(实体瘤
中的响应评价标准)标准来评价肿瘤响应。如果所有目标病灶均消失，并且任何病理性淋巴结(无论是目标还是非目标)的短轴减少至<10mm，则将响应确定为“完全响应”(CR)。以治疗之前目标病灶的基线总和直径作为参考，如果目标病灶直径的总和至少减少30％(例如，肿瘤生长至少减少30％)，则将响应确定为“部分响应”(PR)。“客观响应率”(ORR)是观察到CR或PR响应的对象的百分比。
Eisenhauer等(2009)European Journal of Cancer,45:228-247)中概述的RECIST(实体瘤
中的响应评价标准)标准来评价肿瘤响应。如果所有目标病灶均消失，并且任何病理性淋巴结(无论是目标还是非目标)的短轴减少至<10mm，则将响应确定为“完全响应”(CR)。以治疗之前目标病灶的基线总和直径作为参考，如果目标病灶直径的总和至少减少30％(例如，肿瘤生长至少减少30％)，则将响应确定为“部分响应”(PR)。“客观响应率”(ORR)是观察到CR或PR响应的对象的百分比。
[0512] 实施例3：抗体-IR700偶联物介导的PIT降低肿瘤密度
[0513] 根据Choi标准，进一步评估来自以上实施例2中描述的临床研究的七(7)名患者的肿瘤响应，所述Choi标准是通过肿瘤密度的降低来测量的，以评估PIT的功效并确定在PIT
治疗的肿瘤中坏死的存在。
治疗的肿瘤中坏死的存在。
[0514] A.方法
[0515] 在治疗前和照射以活化PIT后一(1)个月，通过计算机断层扫描(CT)对来自以上实施例2中所述临床研究的七(7)名患者进行了评估。基于CT扫描，确定以豪恩斯菲尔德单位
(Hounsfield Unit，HU)为单位测量的肿瘤密度在治疗前肿瘤CT扫描和照射后一(1)个月的
肿瘤CT扫描之间的变化。
(Hounsfield Unit，HU)为单位测量的肿瘤密度在治疗前肿瘤CT扫描和照射后一(1)个月的
肿瘤CT扫描之间的变化。
[0516] B.响应
[0517] 使用Choi响应标准来表征对PIT的响应，如Choi等,(2007)J Clin Oncol.25:1753-1759所述。Choi标准使用肿瘤密度的变化来确定响应，而CT上肿瘤密度的降低与肿瘤坏死的发生有关。对于导致肿瘤坏死但一维肿瘤尺寸没有实质性减少的疗法，与使用一维
肿瘤尺寸(例如，目标病灶的最长直径的总和)的RECIST标准相比，Choi标准可以更好地预
测治疗结果(另参见van der Veldt等,(2010)Brit J Cancer 102:803-809；Weng等,
(2013)Oncol Letters 6:1707-1712)。代表性Choi标准包括：(1)完全响应(CR)，定义为所有目标病灶消失且无新病灶；(2)部分响应(PR)定义为肿瘤尺寸减少≥10％或CT上肿瘤密
度降低(豪恩斯菲尔德单位(HU))≥15％，无新病灶且无明显不可测疾病进展；(3)进行性疾病(PD)，定义为肿瘤大小增加≥10％，并且不符合肿瘤密度(HU)的PR标准或新病灶或新瘤
内结节或现有肿瘤内结节大小增加；和(4)稳定或无响应，定义为不具有CR，PR或PD的资格，没有因肿瘤进展而导致的症状恶化。
肿瘤尺寸(例如，目标病灶的最长直径的总和)的RECIST标准相比，Choi标准可以更好地预
测治疗结果(另参见van der Veldt等,(2010)Brit J Cancer 102:803-809；Weng等,
(2013)Oncol Letters 6:1707-1712)。代表性Choi标准包括：(1)完全响应(CR)，定义为所有目标病灶消失且无新病灶；(2)部分响应(PR)定义为肿瘤尺寸减少≥10％或CT上肿瘤密
度降低(豪恩斯菲尔德单位(HU))≥15％，无新病灶且无明显不可测疾病进展；(3)进行性疾病(PD)，定义为肿瘤大小增加≥10％，并且不符合肿瘤密度(HU)的PR标准或新病灶或新瘤
内结节或现有肿瘤内结节大小增加；和(4)稳定或无响应，定义为不具有CR，PR或PD的资格，没有因肿瘤进展而导致的症状恶化。
[0518] 响应结果示于表2(错误！没有找到参考源)。结果表明，六(6)名患者的肿瘤在用西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物进行PIT治疗后，在Choi标准下至少显示部分响应(PR)，如CT上的肿瘤密度减小(HU)≥15％所示。这些结果与以上实施例4中所述的结果一起显示，PIT治疗导致指示坏死的靶细胞死亡，显示接受了使用西妥昔单抗-IRDye 700DX偶联物和照射
的PIT治疗的肿瘤表现出坏死和肿瘤密度的实质性减少，如在Choi标准下的响应所示。因
此，结果显示PIT治疗可通过坏死和ICD显著减少肿瘤负荷。
的PIT治疗的肿瘤表现出坏死和肿瘤密度的实质性减少，如在Choi标准下的响应所示。因
此，结果显示PIT治疗可通过坏死和ICD显著减少肿瘤负荷。
[0519] 表2.西妥昔单抗-IR700-介导的PIT之后，患者肿瘤密度减小。
[0520]患者 基于CT，肿瘤密度减小>15％(HU)
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[0521] 实施例4：抗体-IR700偶联物介导的PIT所致的免疫原性细胞死亡和免疫活化
[0522] 进行了以下研究，以评估在PIT处理的细胞中是否发生免疫刺激变化，以及PIT处理的细胞是否具有活化免疫细胞的潜力。为了评估在PIT处理的细胞中发生了哪些免疫刺
激性变化，评估了使用PIT和未使用PIT处理的癌细胞的免疫原性细胞死亡(ICD)标志物的
表达。免疫原性细胞死亡是坏死细胞表现出的一种特定类型的细胞死亡，其特征是免疫刺
激标志物的呈递和释放增加。表现出ICD的细胞显示出膜变化，例如热休克蛋白90的表面表达升高，以及称为危险相关分子模式(DAMP)的可溶性细胞内标志物，例如ATP和高迁移率族蛋白(HMGB1)的分泌(Kromer等.(2013)Annual Review of Immunology,31:51-72)。如下所
示，与未用PIT处理的细胞相比，用PIT处理的癌细胞表现出增加的HMGB1分泌，这表明PIT处理的细胞表现出坏死和ICD的特征。
激性变化，评估了使用PIT和未使用PIT处理的癌细胞的免疫原性细胞死亡(ICD)标志物的
表达。免疫原性细胞死亡是坏死细胞表现出的一种特定类型的细胞死亡，其特征是免疫刺
激标志物的呈递和释放增加。表现出ICD的细胞显示出膜变化，例如热休克蛋白90的表面表达升高，以及称为危险相关分子模式(DAMP)的可溶性细胞内标志物，例如ATP和高迁移率族蛋白(HMGB1)的分泌(Kromer等.(2013)Annual Review of Immunology,31:51-72)。如下所
示，与未用PIT处理的细胞相比，用PIT处理的癌细胞表现出增加的HMGB1分泌，这表明PIT处理的细胞表现出坏死和ICD的特征。
[0523] 因为用PIT处理的细胞显示升高的HMGB1释放，所以进行了后续研究以评估PIT处理的细胞是否可以激活免疫细胞。为了确定免疫细胞是否可以被PIT处理的肿瘤细胞激活，将经PIT处理和未经PIT处理的癌细胞与单核细胞衍生的未成熟树突细胞(iDC)共培养。任
何变化中，观察到DC成熟/活化标志物CD80，CD86，CD40和MHCII的表面表达在炎症刺激例如通过PIT引起的免疫原性细胞死亡时上调。共刺激分子CD80，CD86和CD40的增强表明DC激活T细胞的能力增强，且随着DC成熟，MHCII的增加代表抗原呈递能力增强。与对照(未经PIT处理的肿瘤细胞)相比，在暴露至由PIT杀伤的肿瘤的iDC上观察到共刺激分子和MHCII的表达
均增加。
何变化中，观察到DC成熟/活化标志物CD80，CD86，CD40和MHCII的表面表达在炎症刺激例如通过PIT引起的免疫原性细胞死亡时上调。共刺激分子CD80，CD86和CD40的增强表明DC激活T细胞的能力增强，且随着DC成熟，MHCII的增加代表抗原呈递能力增强。与对照(未经PIT处理的肿瘤细胞)相比，在暴露至由PIT杀伤的肿瘤的iDC上观察到共刺激分子和MHCII的表达
均增加。
[0524] 抗原呈递细胞(APC)共培养是使用另一个模型系统进行的，该系统使用THP1细胞，一种人单核细胞系，其广泛用于基于APC的体外激活和功能测定。与和非PIT处理的肿瘤细
胞共同培养的THP1细胞不同，看到暴露于PIT杀伤的肿瘤细胞上的THP1细胞上的活化标志
物CD86的上调，进一步证实了PIT的免疫刺激潜力。
胞共同培养的THP1细胞不同，看到暴露于PIT杀伤的肿瘤细胞上的THP1细胞上的活化标志
物CD86的上调，进一步证实了PIT的免疫刺激潜力。
[0525] 总之，数据表明用PIT处理的细胞表现出坏死和ICD特征的标志物，并且用PIT处理的细胞具有激活免疫细胞的潜力。因此，采用PIT与免疫调节剂的联合处理可进一步增强
PIT的免疫激活潜能。
PIT的免疫激活潜能。
[0526] A.通过西妥昔单抗-IR700进行PIT的肿瘤细胞中HMGB1水平的估计
[0527] A431和FaDu肿瘤细胞系分别在完全RPMI 1640和完全EMEM培养基中生长。将细胞以每孔100μL总体积中15,000个细胞接种在96孔组织培养板上，贴壁过夜。通过台盼蓝排除法检查接种前细胞的活力，并且>95％的细胞是有活力的。
[0528] 第二天，细胞用500ng/mL西妥昔单抗-IR700(如实施例1中所述制备)在37℃下于CO2孵育箱中处理1小时，然后以32J/cm2的光通量用690nm激光照射。对照代表对应于未用光处理的组的孔。
[0529] 进行PIT后，从处理过的细胞中除去培养基，然后用PBS洗涤一次。然后加入无血清培养基，并在37℃的CO2孵育箱中孵育1小时。孵育后收集上清液，并在-20℃下保存直至使用。
[0530] 根据制造商的说明，对来自各处理过的孔的培养上清液进行HMGB1 ELISA(IBL International，目录号ST51011)。简言之，根据试剂盒说明书，将冻干的HMGB1对照和标准品用稀释缓冲液溶剂化。通过将HMGB1标准储备液以1:4的比例稀释在稀释缓冲液中，然后
以1:2的比例连续稀释，共6个点(80ng/mL–2.5ng/mL)来制备标准曲线。将100μL/孔的稀释缓冲液添加到试剂盒中提供的ELISA板的每个使用的孔中。向每个孔中添加10μL/孔的标准品，对照或样品，将板密封，并在37℃下孵育过夜。20-24小时后，用提供的洗涤缓冲液(用蒸馏水稀释至1x)洗去未结合的样品。根据试剂盒说明书，将冻干的酶偶联物用酶偶联物稀释剂溶剂化，并以100μL/孔添加到洗涤的板中。板经轻敲以混合，然后密封并在室温下孵育2小时。然后用1x洗涤缓冲液洗去多余的酶偶联物，并以100μL/孔将colrea A和colrea B溶液的1:1混合物添加至平板，并在室温下孵育30分钟。然后通过添加100μL/孔的终止溶液并轻轻敲打板进行混合来终止反应。黄色产物的量通过其在450nm处的吸收来定量。用4参数
对数绘制HMGB1标准曲线，并将测试样品数据内插到标准曲线中以确定每个样品中的HMGB1
浓度。数据描述为相对于各自的无光对照物的倍数增加。
以1:2的比例连续稀释，共6个点(80ng/mL–2.5ng/mL)来制备标准曲线。将100μL/孔的稀释缓冲液添加到试剂盒中提供的ELISA板的每个使用的孔中。向每个孔中添加10μL/孔的标准品，对照或样品，将板密封，并在37℃下孵育过夜。20-24小时后，用提供的洗涤缓冲液(用蒸馏水稀释至1x)洗去未结合的样品。根据试剂盒说明书，将冻干的酶偶联物用酶偶联物稀释剂溶剂化，并以100μL/孔添加到洗涤的板中。板经轻敲以混合，然后密封并在室温下孵育2小时。然后用1x洗涤缓冲液洗去多余的酶偶联物，并以100μL/孔将colrea A和colrea B溶液的1:1混合物添加至平板，并在室温下孵育30分钟。然后通过添加100μL/孔的终止溶液并轻轻敲打板进行混合来终止反应。黄色产物的量通过其在450nm处的吸收来定量。用4参数
对数绘制HMGB1标准曲线，并将测试样品数据内插到标准曲线中以确定每个样品中的HMGB1
浓度。数据描述为相对于各自的无光对照物的倍数增加。
[0531] 如图1A所示，通过西妥昔单抗-IR700的PIT导致肿瘤细胞强HMGB1分泌。与无光对照相比，A431和FaDu均显示出HMGB1的大量释放。因此，结果表明使用西妥昔单抗-IR700的PIT处理导致细胞死亡，其表现出坏死和ICD的特征。
[0532] B.在与PIT处理的肿瘤细胞共培养的DC上测定DC成熟标志物CD80，CD86，CD40和MHCII的上调
[0533] FaDu细胞在完全EMEM培养基中生长。将细胞以每孔100μL的总体积接种到96孔组织培养板中，贴壁过夜。通过台盼蓝排除法检查接种前细胞的活力，并且>95％的细胞是有活力的。
[0534] 第二天，在二氧化碳孵育箱中，在37℃下用500ng/mL的西妥昔单抗–IRDye700DX处2
理细胞1小时，然后使其经历690nm的12J/cm 激光通量对其进行光处理。对照代表与未用光处理的组(未PIT处理的肿瘤细胞)相对应的孔。
理细胞1小时，然后使其经历690nm的12J/cm 激光通量对其进行光处理。对照代表与未用光处理的组(未PIT处理的肿瘤细胞)相对应的孔。
[0535] 对于共培养，将来自健康供体的人iDC(Astarte Biologics)以1:1的比例直接添加到具有PIT处理的肿瘤细胞的孔和对照孔(非PIT处理的肿瘤细胞)中。然后将共培养物在
二氧化碳孵育箱中于37℃孵育48小时。然后使用非酶剥离溶液剥离细胞。然后将来自各种
处理条件的收获细胞与活/死区分染料Zombie Green(BioLegend,1:500)在室温下孵育20
分钟，然后用染色缓冲液洗涤。
二氧化碳孵育箱中于37℃孵育48小时。然后使用非酶剥离溶液剥离细胞。然后将来自各种
处理条件的收获细胞与活/死区分染料Zombie Green(BioLegend,1:500)在室温下孵育20
分钟，然后用染色缓冲液洗涤。
[0536] 将细胞重悬浮在染色缓冲液中，然后加入人Fc封闭剂(BD Biosciences)，并将细胞在室温下孵育20分钟。随后添加抗人CD80(BioLegend，克隆2D10)，抗人CD86(BioLegend，克隆IT2.2)，抗人CD40(BioLegend，克隆5C3)，抗人CD11c(BD，克隆B-ly6)和抗人MHCII
(BioLegend，克隆L243)抗体(1:20)，细胞在室温下孵育30分钟。还进行了相应的同种型对照染色以评估背景信号。随后洗涤，将细胞重悬于染色缓冲液中。然后在高灵敏度模式下通过流式细胞仪( 声学聚焦细胞仪)获取数据。使用抗人CD14(克隆63D3，BioLegend，
加利福尼亚州圣地亚哥)和抗人CD86(克隆IT2.2，BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)抗体进行流式细胞术，其中抗体以1:40的稀释度添加至细胞，使细胞在室温下孵育30分钟。随后洗涤，并将细胞重悬于染色缓冲液中。然后在高灵敏度模式下通过流式细胞仪( 声
学聚焦细胞计数仪，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)获取数据。在分析数据以排除细胞碎片的同时进行了适当的门控，并通过对实时事件进行门控来分析数据。
以下描述的结果基于每组的平均荧光强度(MFI)数据，将其绘制为相对无光照对照的倍数
增加。
(BioLegend，克隆L243)抗体(1:20)，细胞在室温下孵育30分钟。还进行了相应的同种型对照染色以评估背景信号。随后洗涤，将细胞重悬于染色缓冲液中。然后在高灵敏度模式下通过流式细胞仪( 声学聚焦细胞仪)获取数据。使用抗人CD14(克隆63D3，BioLegend，
加利福尼亚州圣地亚哥)和抗人CD86(克隆IT2.2，BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)抗体进行流式细胞术，其中抗体以1:40的稀释度添加至细胞，使细胞在室温下孵育30分钟。随后洗涤，并将细胞重悬于染色缓冲液中。然后在高灵敏度模式下通过流式细胞仪( 声
学聚焦细胞计数仪，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)获取数据。在分析数据以排除细胞碎片的同时进行了适当的门控，并通过对实时事件进行门控来分析数据。
以下描述的结果基于每组的平均荧光强度(MFI)数据，将其绘制为相对无光照对照的倍数
增加。
[0537] 图1B显示了与通过西妥昔单抗-IRDye 700DX进行PIT的FaDu肿瘤共培养的iDC上的树突细胞(DC)成熟标志物的上调。与无光照对照相比，与FaDu的共培养造成iDC上表面
CD80，CD86，CD40和MHCII表达的增加。Y轴表示相对于相应的无光照对照的倍数增加。
CD80，CD86，CD40和MHCII表达的增加。Y轴表示相对于相应的无光照对照的倍数增加。
[0538] C.与经PIT和未经PIT处理的肿瘤细胞共培养后THP1细胞中的CD86表达
[0539] A431细胞系在完全RPMI和T98G中生长，FaDu和U87肿瘤细胞系在完全EMEM培养基中生长。将细胞以每孔100μL总体积的15,000个细胞接种在96孔组织培养板上，贴壁过夜。
通过台盼蓝排除法检查接种前细胞的活力，并且>95％的细胞是有活力的。
通过台盼蓝排除法检查接种前细胞的活力，并且>95％的细胞是有活力的。
[0540] 第二天，在二氧化碳孵育箱中，在37℃下用500ng/mL的西妥昔单抗–IR700处理细胞1小时，然后使其经历690nm的12J/cm2激光通量对其进行光处理。对照代表与未用光处理的组(未PIT处理的肿瘤细胞)相对应的孔。
[0541] THP1细胞 在完整的RPMI中生长。对于共培养，将15,000个THP1细胞直接添加至具有PIT处理的肿瘤细胞和对照非PIT治疗的肿瘤细胞的孔中。然后将
共培养物在二氧化碳孵育箱中于37℃孵育24小时。第二天，然后使用非酶剥离溶液剥离细
胞。然后将来自各种处理条件的收获细胞仅重悬于PBS中，并添加活/死区分染料Zombie
Green(BioLegend)(1:500)。将细胞在室温下孵育20分钟，然后用染色缓冲液洗涤。
共培养物在二氧化碳孵育箱中于37℃孵育24小时。第二天，然后使用非酶剥离溶液剥离细
胞。然后将来自各种处理条件的收获细胞仅重悬于PBS中，并添加活/死区分染料Zombie
Green(BioLegend)(1:500)。将细胞在室温下孵育20分钟，然后用染色缓冲液洗涤。
[0542] 将细胞重悬浮在染色缓冲液中，然后加入人Fc封闭剂(BD Biosciences)，并将细胞在室温下孵育20分钟。使用抗人CD14(克隆63D3，BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)和抗人CD86(克隆IT2.2，BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)抗体进行流式细胞术，其中抗体以1:40的稀释度添加至细胞，使细胞在室温下孵育30分钟。随后洗涤，并将细胞重悬于染色缓冲液中。然后在高灵敏度模式下通过流式细胞仪 声学聚焦细胞计数仪，Thermo
Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)获取数据。在分析数据以排除细胞碎片的同时
进行了适当的门控，并通过对实时事件进行门控来分析数据。CD14标志物用于鉴定THP1细
胞。结果基于每组的平均荧光强度(MFI)数据，将其绘制为相对于无光照对照组的倍数增
加。数据描述为CD86表面表达相对于无光照对照的倍数增加。
Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)获取数据。在分析数据以排除细胞碎片的同时
进行了适当的门控，并通过对实时事件进行门控来分析数据。CD14标志物用于鉴定THP1细
胞。结果基于每组的平均荧光强度(MFI)数据，将其绘制为相对于无光照对照组的倍数增
加。数据描述为CD86表面表达相对于无光照对照的倍数增加。
[0543] 如图1C所示，CD86在与通过西妥昔单抗-IR700经受PIT的肿瘤共培养的THP1细胞上上调。与无光照对照相比，与A431和FaDu细胞进行共培养并经历PIT，使THP1细胞上的表面CD86表达增加。
[0544] 实施例5：PIT与免疫调节剂联合治疗可增强免疫活化
[0545] 进行了研究以评估当免疫细胞被PIT杀伤的肿瘤引发并用免疫调节剂治疗时是否有更高的免疫活化。如实施例4中所示，PIT产生炎性环境，其导致免疫细胞如树突细胞(DC)和单核细胞的活化。这些PIT引发的细胞与免疫调节剂联合使用时，也可能显示进一步活化的更高潜能。为了对此进行测试，将经PIT处理的肿瘤细胞与单核细胞衍生的未成熟树突细胞(iDC)共培养，然后用示例性的免疫调节性多聚I:C(合成的双链RNA类似物)进行处理。然后评估DC活化标志物CD80和CD86的表达水平的变化。将iDC与未经PIT处理的肿瘤细胞共培
养用作对照。与先前未用PIT处理肿瘤的情况相比，先前已暴露于其中肿瘤被PIT杀伤的环
境的DC上观察到CD80和CD86表达的增加。
养用作对照。与先前未用PIT处理肿瘤的情况相比，先前已暴露于其中肿瘤被PIT杀伤的环
境的DC上观察到CD80和CD86表达的增加。
[0546] 在完全EMEM培养基中生长的FaDu细胞以每孔100μL的总体积接种在96孔组织培养板中，贴壁过夜。通过台盼蓝排除法检查接种前细胞的活力，并且发现>95％的细胞是有活力的。第二天，细胞用西妥昔单抗-IRDye 700DX(500ng/mL，在37℃的CO2孵育箱中处理1小时)处理。PIT细胞杀伤通过以12J/cm2的能量通量用690nm激光照射诱导。对照代表对应于
未用光处理的组的孔。
未用光处理的组的孔。
[0547] 对于共培养，将来自健康供体的人iDC(Astarte Biologics)直接添加到具有PIT杀伤的肿瘤细胞的孔中，并添加到对照孔(未经PIT处理的肿瘤细胞)中。然后将共培养物在二氧化碳孵育箱中于37℃孵育48小时。然后将收获的DC经历多聚I:C处理(1μg/mL)过夜。然后使用非酶剥离溶液剥离细胞。
[0548] 将来自各种处理条件的收获细胞与活/死区分染料Zombie Green(BioLegend,1:500)在室温下孵育20分钟，然后用染色缓冲液洗涤。将细胞重悬浮在染色缓冲液中，然后加入人Fc封闭剂(BD)，并将细胞在室温下孵育20分钟。添加抗人CD80(BioLegend，克隆2D10)，抗人CD86(BioLegend，克隆IT2.2)，抗人CD40(BioLegend，克隆5C3)，抗人CD11c(BD，克隆B-ly6)和抗人MHCII(BioLegend，克隆L243)抗体(1:20)，细胞在室温下孵育30分钟。还进行了相应的同种型对照染色以评估背景信号。细胞经洗涤并重悬于染色缓冲液中。然后在高灵
敏度模式下通过流式细胞仪( 声学聚焦细胞仪)获取数据。
敏度模式下通过流式细胞仪( 声学聚焦细胞仪)获取数据。
[0549] 在分析数据以排除细胞碎片的同时进行了适当的门控，并通过对实时事件进行门控来分析数据。以下描述的结果基于每组的中值荧光强度(MFI)数据，将其绘制为相对无光照对照的倍数增加。
[0550] 图2的结果显示，与未进行PIT处理与免疫调节剂联合的DC相比，经PIT并与免疫调节剂(多聚I:C)联合处理的树突细胞(DC)显示出增强的免疫活化。与无光照(无PIT)对照相
比，采用PIT联合免疫调节剂对DC进行预处理可提高CD80和CD86表达水平。
比，采用PIT联合免疫调节剂对DC进行预处理可提高CD80和CD86表达水平。
[0551] 因此，数据表明，暴露于由PIT产生的环境的DC本质上更倾向于被免疫调节剂活化。因此，采用PIT与免疫调节剂的联合处理可进一步增强PIT的免疫激活潜能。
[0552] 实施例6：抗体-IR700偶联介导的PIT联合免疫调节剂的处理释放促炎性细胞因子
[0553] 进行研究以评估在用PIT杀伤的肿瘤引发后免疫细胞中增强的免疫活化是否还导致促炎性细胞因子/趋化因子的释放，以及所述释放是否被免疫调节剂进一步刺激。
[0554] 如实施例4和实施例5所示，PIT产生了炎性环境，其导致免疫细胞如树突细胞(DC)和单核细胞的活化，并且免疫调节剂进一步增强了PIT的免疫活化潜能。从PIT引发的细胞
释放的促炎细胞因子和趋化因子可能会在肿瘤附近形成促炎环境，并调节其它免疫细胞的
迁移或募集。促炎细胞因子(例如TNFα，GM-CSF，IL-1α，IL-1β和IL-12)参与与抗肿瘤免疫反应相关的免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)，TH1和NK细胞)的分化和激活。促炎趋化因子
(例如IP-10，IL-8，MIP-1α和MIP-1β)可在肿瘤微环境中募集或调节免疫细胞(例如T细胞和APC)的迁移。
释放的促炎细胞因子和趋化因子可能会在肿瘤附近形成促炎环境，并调节其它免疫细胞的
迁移或募集。促炎细胞因子(例如TNFα，GM-CSF，IL-1α，IL-1β和IL-12)参与与抗肿瘤免疫反应相关的免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)，TH1和NK细胞)的分化和激活。促炎趋化因子
(例如IP-10，IL-8，MIP-1α和MIP-1β)可在肿瘤微环境中募集或调节免疫细胞(例如T细胞和APC)的迁移。
[0555] A.与PIT处理的肿瘤细胞共培养的DC的细胞因子和趋化因子产生
[0556] 为了测试PIT增强的免疫活化是否导致促炎性细胞因子和趋化因子的释放，将经PIT处理的肿瘤细胞与单核细胞衍生的未成熟树突细胞(iDC)共同培养，可以使用或不使用
示例性免疫调节剂多聚I:C进行进一步刺激。在完全EMEM培养基中生长的FaDu肿瘤细胞以
每孔100μL的总体积接种在96孔组织培养板中，贴壁过夜。通过台盼蓝排除法检查接种前细胞的活力，并且发现>95％的细胞是有活力的。第二天，细胞用抗体-酞菁染料偶联物(西妥昔单抗-IRDye 700DX；500ng/mL)在37℃的CO2孵育箱中处理1小时。PIT细胞杀伤通过以
12J/cm2的能量通量用690nm激光照射诱导。
示例性免疫调节剂多聚I:C进行进一步刺激。在完全EMEM培养基中生长的FaDu肿瘤细胞以
每孔100μL的总体积接种在96孔组织培养板中，贴壁过夜。通过台盼蓝排除法检查接种前细胞的活力，并且发现>95％的细胞是有活力的。第二天，细胞用抗体-酞菁染料偶联物(西妥昔单抗-IRDye 700DX；500ng/mL)在37℃的CO2孵育箱中处理1小时。PIT细胞杀伤通过以
12J/cm2的能量通量用690nm激光照射诱导。
[0557] 对于共培养，将来自两个健康供体的人iDC(Astarte Biologics)直接添加至具有PIT杀伤的肿瘤细胞的孔中，并添加到对照孔中。阴性对照包括以下共培养：iDC与未经处理的肿瘤细胞；iDC与仅接受照射的肿瘤细胞；iDC与用西妥昔单抗-IRDye 700DX孵育的肿瘤
细胞(无照射)和仅仅iDC培养。为了测试实验中使用的iDC是否能够产生炎症细胞因子，将
与脂多糖(LPS)孵育的iDC用作阳性对照。在培养的最后24小时内添加LPS(5μg/ml)以刺激
iDC。
细胞(无照射)和仅仅iDC培养。为了测试实验中使用的iDC是否能够产生炎症细胞因子，将
与脂多糖(LPS)孵育的iDC用作阳性对照。在培养的最后24小时内添加LPS(5μg/ml)以刺激
iDC。
[0558] 将共培养物在二氧化碳孵育箱中于37℃孵育48小时。然后收集来自各培养条件的培养上清液，转移到Eppendorf管中，以6000rpm离心3分钟以去除细胞/碎片，并保存在-80℃直至针对所选的细胞因子/趋化因子TNFα，GM-CSF，IL-1α，IL-1β，IL-12，IP-10，IL-8，MIP-1α和MIP-1β的细胞因子/趋化因子测量。
[0559] 将培养上清液样品进行Luminex免疫测定分析(eBiosciences；Thermo Fisher Scientific)，以确定细胞因子和趋化因子水平。样品设三重复(未稀释和以1:5稀释)运行，以确保值落在程序的可检测范围内。对于阴性对照和背景水平的测定，单独的培养基也进
行相同的分析，其显示的值低于所有评估的细胞因子和趋化因子测定的检测极限。
行相同的分析，其显示的值低于所有评估的细胞因子和趋化因子测定的检测极限。
[0560] 初始细胞因子和趋化因子分析的结果显示在表3和表4中。与阴性对照环境相比，在暴露于通过PIT杀伤肿瘤的环境的iDC中，观察到促炎细胞因子水平的增加。用PIT杀伤的肿瘤引发的供体来源的DC表现出评估促炎细胞因子和趋化因子的一致(两名供体)和强健
释放。与实施例4中的结果一起，显示了在用PIT杀伤的肿瘤引发的DC中活化标志物例如
MHCII和CD86的上调，结果表明，对肿瘤进行PIT处理可以产生免疫活化和促炎性环境。
释放。与实施例4中的结果一起，显示了在用PIT杀伤的肿瘤引发的DC中活化标志物例如
MHCII和CD86的上调，结果表明，对肿瘤进行PIT处理可以产生免疫活化和促炎性环境。
[0561] 表3.DC共培养上清液的细胞因子和趋化因子产量(供体1)
[0562]
[0563]
[0564] 表4.DC共培养上清液的细胞因子和趋化因子产量(供体2)
[0565]
[0566] 括号中的值表示标准偏差
[0567] *:超出标准范围外推的值
[0568] #:值以1:5稀释度表示
[0569] OOR:范围外(上)
[0570] B.与PIT处理的肿瘤细胞共培养外加免疫刺激的DC的细胞因子和趋化因子产生
[0571] 将来自供体1的DC进一步暴露于示例性的免疫调节性多聚I:C，以测试免疫活化是否通过免疫调节剂进一步增强。对于一组iDC(来自供体1)，对共培养物另进行多聚I:C处理
24小时。如上实施例5A所述，在多聚I:C刺激后收集培养物上清液，离心并储存。如上所述评估细胞因子/趋化因子，不同之处在于另外评估GM-CSF和IL-12的水平。
24小时。如上实施例5A所述，在多聚I:C刺激后收集培养物上清液，离心并储存。如上所述评估细胞因子/趋化因子，不同之处在于另外评估GM-CSF和IL-12的水平。
[0572] 表5中显示了在进一步用多聚I:C刺激后，来自供体1的DC中细胞因子和趋化因子产生的结果。与以上表1中的结果相比，通过PIT杀伤的肿瘤引发的DC通过用免疫调节剂(例如多聚I:C)处理而进一步活化，如细胞因子和趋化因子释放的显著较高水平所示。与仅用
多聚I:C引发的DC相比，用PIT引发并用多聚I:C刺激的DC中细胞因子/趋化因子水平的程度
也明显更高。另外，与用多聚I:C引发的阴性对照DC相比，用PIT引发并用多聚I:C刺激的DC中也产生了更大量的GM-CSF和IL-12。因此，数据表明，暴露于由PIT产生的环境的DC本质上更倾向于被免疫调节剂活化。因此，采用PIT与免疫调节剂的联合处理可进一步增强PIT的
免疫激活潜能。
多聚I:C引发的DC相比，用PIT引发并用多聚I:C刺激的DC中细胞因子/趋化因子水平的程度
也明显更高。另外，与用多聚I:C引发的阴性对照DC相比，用PIT引发并用多聚I:C刺激的DC中也产生了更大量的GM-CSF和IL-12。因此，数据表明，暴露于由PIT产生的环境的DC本质上更倾向于被免疫调节剂活化。因此，采用PIT与免疫调节剂的联合处理可进一步增强PIT的
免疫激活潜能。
[0573] 表5.在多聚I:C刺激后，DC共培养上清液产生的细胞因子和趋化因子(供体1)
[0574]
[0575]
[0576] 括号中的值表示标准偏差
[0577] *:超出标准范围外推的值
[0578] #:值以1:5稀释度表示
[0579] OOR:范围外(上)
[0580] C.PIT处理的肿瘤细胞的细胞因子产生
[0581] 为了评估PIT处理的肿瘤细胞是否在PIT治疗后也分泌细胞因子，在PIT处理的肿瘤的培养上清液中测试了促炎细胞因子IL-1α的水平。FaDu肿瘤细胞与西妥昔单抗-IRDye
700DX一起孵育，并如上所述进行照射以诱导PIT。实验进行了两次，样品在未稀释的上清液中重复三次。
700DX一起孵育，并如上所述进行照射以诱导PIT。实验进行了两次，样品在未稀释的上清液中重复三次。
[0582] 结果显示在表6中。结果显示，PIT杀伤的肿瘤细胞比未处理的肿瘤细胞产生更高量的促炎细胞因子IL-1α。结果表明，PIT除了可以通过活化免疫细胞来创造促炎性微环境之外，还可以诱导被杀伤的肿瘤细胞分泌促炎性细胞因子。
[0583] 表6.来自PIT杀伤的FaDu肿瘤细胞的IL-1α释放
[0584]
[0585] 括号中的值表示标准偏差
[0586] *:超出标准范围外推的值
[0587] 总之，结果表明，暴露于PIT处理的肿瘤微环境中的DC固有地更倾向于促炎性细胞因子和趋化因子的分泌。在免疫调节剂(例如多聚I:C)刺激下，该反应会进一步增强。此外，被PIT杀伤的肿瘤细胞还可以通过促炎细胞因子的分泌来促成炎性环境的产生。
[0588] 实施例7：干扰素γ和抗PD-L1-IR700 PIT的联合治疗
[0589] 进行了以下研究，以评估PIT能否与免疫调节剂(其也可以影响癌细胞)联合使用以增强PIT的杀伤活性。
[0590] A.干扰素γ对细胞死亡的作用
[0591] 将BxPC3细胞(#CRL-1687，ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)以每孔5000个细胞的密度接种在96孔黑色透明平底培养皿中，并置于37℃，5％CO2孵育箱中。第二天，将细胞用补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(完全培养基)洗涤一次。然后，细胞与含有
0ng/mL至3.75μg/mL的不同浓度的重组人干扰素γ(IFNγ)(无运载体)(目录号：570202，
BioLegend，加利福尼亚州圣迭戈)的完全培养基孵育18小时。
0ng/mL至3.75μg/mL的不同浓度的重组人干扰素γ(IFNγ)(无运载体)(目录号：570202，
BioLegend，加利福尼亚州圣迭戈)的完全培养基孵育18小时。
[0592] 18小时后，将含有不同浓度干扰素γ的培养基替换为含有1x CellTox Green(目录号：G8731，Promega，威斯康星州麦迪逊)的完全培养基。不包含任何细胞的孔也与在完全培养基中稀释的1xCellTox Green试剂一起孵育，以在荧光信号检测过程中用作背景扣除
孔。使用荧光板读数器在光处理后24.5小时测量CellTox Green荧光信号。然后，细胞用去污剂裂解，在37℃下孵育30分钟，裂解后再次测量CellTox Green荧光信号。死细胞百分比的计算方法是：求扣减了背景(不含细胞的完全培养基中的1x CellTox Green)的每孔
CellTox Green信号的裂解前与裂解后的比率，然后将该比率乘以100。
孔。使用荧光板读数器在光处理后24.5小时测量CellTox Green荧光信号。然后，细胞用去污剂裂解，在37℃下孵育30分钟，裂解后再次测量CellTox Green荧光信号。死细胞百分比的计算方法是：求扣减了背景(不含细胞的完全培养基中的1x CellTox Green)的每孔
CellTox Green信号的裂解前与裂解后的比率，然后将该比率乘以100。
[0593] 图3A的结果显示增加IFNγ浓度导致BxPC3细胞的细胞死亡剂量依赖性增加。
[0594] B.干扰素γ对PD-L1表达的作用
[0595] 将BxPC3细胞以每孔145,000个细胞接种到12孔培养皿中，并置于37℃的5％CO2孵育箱中。第二天，将细胞用补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(完全培养基)
洗涤一次。然后，细胞与单独的完全培养基，包含375pg/mL重组人干扰素γ(无运载体)(目录号：570202，BioLegend，加利福尼亚圣迭戈)的完全培养基，或含37.5ng/mL重组人干扰素γ的完全培养基(无运载体)一起孵育18小时。在有或没有重组干扰素γ的条件下孵育18小
时后，将BxPC3细胞用完全培养基洗涤一次。
洗涤一次。然后，细胞与单独的完全培养基，包含375pg/mL重组人干扰素γ(无运载体)(目录号：570202，BioLegend，加利福尼亚圣迭戈)的完全培养基，或含37.5ng/mL重组人干扰素γ的完全培养基(无运载体)一起孵育18小时。在有或没有重组干扰素γ的条件下孵育18小
时后，将BxPC3细胞用完全培养基洗涤一次。
[0596] 然后，细胞与单独的完全培养基或含有10μg/mL抗PD-L1-IRDye 700DX的完全培养基在37℃下孵育1小时。抗PD-L1-IRDye 700DX的制备如下：将小鼠抗人抗PD-L1(目录号：
329728，Biolegend，加利福尼亚圣迭戈)的抗体溶液首先用pH 7的磷酸盐缓冲盐水采用30,
000道尔顿分子量截止值离心过滤器交换，然后通过添加pH＝9的磷酸盐缓冲液将抗体溶液
的pH调节至8.5。IRDye 700DX NHS酯的冷冻固体等分试样(目录号929-70011；Li-COR，内布拉斯加州林肯)在室温下融化，然后用DMSO溶解，以达到10mg/mL的浓度。然后在避光的环境中，将溶解的IR700 NHS酯以4(IR700 NHS酯)对1(抗体)的摩尔比添加到抗体溶液中。在避
光的条件下，偶联反应在25℃下进行2小时。添加甘氨酸(pH 8.2)至终浓度10mM保持15分钟以淬灭反应。然后，抗体偶联物溶液采用30,000道尔顿分子量截止值离心过滤器和24mL
PBS pH 7进行交换，以去除游离染料，甘氨酸和甘氨酸-IR700，并将溶液的pH调节回pH 7。
329728，Biolegend，加利福尼亚圣迭戈)的抗体溶液首先用pH 7的磷酸盐缓冲盐水采用30,
000道尔顿分子量截止值离心过滤器交换，然后通过添加pH＝9的磷酸盐缓冲液将抗体溶液
的pH调节至8.5。IRDye 700DX NHS酯的冷冻固体等分试样(目录号929-70011；Li-COR，内布拉斯加州林肯)在室温下融化，然后用DMSO溶解，以达到10mg/mL的浓度。然后在避光的环境中，将溶解的IR700 NHS酯以4(IR700 NHS酯)对1(抗体)的摩尔比添加到抗体溶液中。在避
光的条件下，偶联反应在25℃下进行2小时。添加甘氨酸(pH 8.2)至终浓度10mM保持15分钟以淬灭反应。然后，抗体偶联物溶液采用30,000道尔顿分子量截止值离心过滤器和24mL
PBS pH 7进行交换，以去除游离染料，甘氨酸和甘氨酸-IR700，并将溶液的pH调节回pH 7。
[0597] 孵育1小时后，细胞用磷酸盐缓冲盐水(pH 7)洗涤3次，并用无酶细胞解离缓冲液(目录号：S-014-C，EMD Millipore，马萨诸塞州比勒利卡)孵育直至细胞被剥离。细胞剥离后，将含0.5％牛血清白蛋白级分V(目录号：15260-037，ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)的磷酸盐缓冲盐水添加至细胞，并立即通过流式细胞仪基于抗PD-L1-IRDye
700DX的IR700染料的荧光信号分析样品中的PD-L1表达。表达的倍数增加通过如下方式计
算：首先，从各处理的抗-PD-L1-IRDye 700D染色的荧光强度扣减未染色的细胞样品，然后通过扣减背景荧光强度(由无干扰素γ处理的抗-PD-L1-IRDye 700DX染色的样品的平均值
确定)对各处理进行标准化。
700DX的IR700染料的荧光信号分析样品中的PD-L1表达。表达的倍数增加通过如下方式计
算：首先，从各处理的抗-PD-L1-IRDye 700D染色的荧光强度扣减未染色的细胞样品，然后通过扣减背景荧光强度(由无干扰素γ处理的抗-PD-L1-IRDye 700DX染色的样品的平均值
确定)对各处理进行标准化。
[0598] 如图3B所示，结果显示增加的IFNγ浓度导致BxPC3细胞中PD-L1表达的剂量依赖性增加。
[0599] C.干扰素γ和抗PD-L1-IR700偶联物的组合对PIT细胞杀伤的作用
[0600] 进行研究以评估用干扰素γ处理细胞以增加PD-L1表达能否增强抗PD-L1介导的PIT杀伤，将BxPC3细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔白色透明平底皿中，并置于37
℃，5％CO2的孵育箱中。第二天，将细胞用补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(完全培养基)洗涤一次。然后，细胞与单独的完全培养基，包含375pg/mL重组人干扰素γ
(无运载体)(目录号：570202，BioLegend，加利福尼亚圣迭戈)的完全培养基，或含37.5ng/mL重组人干扰素γ的完全培养基(无运载体)一起孵育18小时。
℃，5％CO2的孵育箱中。第二天，将细胞用补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(完全培养基)洗涤一次。然后，细胞与单独的完全培养基，包含375pg/mL重组人干扰素γ
(无运载体)(目录号：570202，BioLegend，加利福尼亚圣迭戈)的完全培养基，或含37.5ng/mL重组人干扰素γ的完全培养基(无运载体)一起孵育18小时。
[0601] 在有或没有重组干扰素γ的条件下孵育18小时后，将BxPC3细胞用完全培养基洗涤一次。然后，细胞与单独的完全培养基或包含10μg/mL抗PD-L1-IRDye 700DX或10μg/mL抗PD-L1-IRDye 700DX和100ug/mL未偶联的抗PD-L1的完全培养基在37℃下孵育1小时。孵育1
小时后，细胞用完全培养基洗涤一次。
小时后，细胞用完全培养基洗涤一次。
[0602] 然后将细胞用690nm激光在690nm波长下以96J/cm2的光照射，或者保护免受光作用(“无光”)。如上所述使用CellTox Green试剂评估细胞死亡。
[0603] 如图3C所示，与单独的抗PD-L1-IR700 PIT处理相比，在用抗PD-L1-IR700偶联物处理之前采用IFNγ的联合处理增强了抗PD-L1光活化杀伤。与没有光照的对照组相比，在
抗PD-L1-IR700孵育之前未经干扰素γ处理的BxPC3细胞在690nm光照下显示出适度的细胞
死亡增加。与干扰素γ孵育，然后与抗PD-L1-IR700偶联物孵育的BxPC3细胞在未光照的细
胞中显示基底细胞死亡的IFNγ剂量依赖性增加，这与IFNγ介导细胞死亡的作用一致。对
于各相应处理组，相对于无光照对照，用IFNγ孵育、用抗PD-L1-IR700偶联物孵育并用
690nm光照射的BxPC3细胞在细胞死亡方面显示IFNγ剂量依赖性的细胞死亡增加。结果显
示，抗PD-L1-IR700 PIT的杀伤活性是特异性的，因为与10x摩尔过量的未偶联抗-PD-L1的
竞争性抗-PD-L1-IR700结合消除了抗-PD-L1-IR700偶联物的光活化杀伤，如有光照和无光
照处理中细胞死亡的相同百分比所显示。
抗PD-L1-IR700孵育之前未经干扰素γ处理的BxPC3细胞在690nm光照下显示出适度的细胞
死亡增加。与干扰素γ孵育，然后与抗PD-L1-IR700偶联物孵育的BxPC3细胞在未光照的细
胞中显示基底细胞死亡的IFNγ剂量依赖性增加，这与IFNγ介导细胞死亡的作用一致。对
于各相应处理组，相对于无光照对照，用IFNγ孵育、用抗PD-L1-IR700偶联物孵育并用
690nm光照射的BxPC3细胞在细胞死亡方面显示IFNγ剂量依赖性的细胞死亡增加。结果显
示，抗PD-L1-IR700 PIT的杀伤活性是特异性的，因为与10x摩尔过量的未偶联抗-PD-L1的
竞争性抗-PD-L1-IR700结合消除了抗-PD-L1-IR700偶联物的光活化杀伤，如有光照和无光
照处理中细胞死亡的相同百分比所显示。
[0604] 结果显示，与单独的抗PD-L1-IR700 PIT处理或单独的干扰素γ处理相比，干扰素γ，一种抗癌剂和免疫调节剂以及抗PD-L1-IR700 PIT的联合处理显示出增强的抗癌活性。
[0605] 本发明并不意在将范围限制于具体公开的实施方式，这些实施方式仅为提供，例如，对于本发明不同方面的说明。本文所述的组合物和方法的各种修饰将在本文的说明和
启示后变得显而易见。可实施这类变化而不偏离本公开的真正范围和精神，并且落入本发
明的范围内。
启示后变得显而易见。可实施这类变化而不偏离本公开的真正范围和精神，并且落入本发
明的范围内。
[0606] 序列
[0607]
[0608]
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