新型双氨基喹啉化合物及其制备的药物组合物和它们的用
途
[0002] 本申请要求了标题与本申请一样的美国临时申请的优先权，其申请号为US61/480,641，申请日为2011年4月29日，该申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
[0003] 本
发明由政府支持完成，由美国国家癌症研究所的Abramson癌症中心试办基金赞助。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
[0004] 本发明涉及新型的双氨基喹啉化合物、包含这些新型双氨基喹啉化合物的药物组合物以及在
生物系统中用于抑制自噬的方法。作为本发明的另一个方面，根据本发明单独使用化合物和/或组合物，或与至少一种额外的抗癌剂
联合治疗癌症患者的方法。作为本发明的另一个方面，单独采用本发明化合物联合
放射治疗，或与本文另作说明的额外的抗癌剂联合的用途。作为本发明的另一个方面，采用根据本发明的化合物治疗病状和/或病况的方法，其中抑制自体吞噬起到良好的治疗作用，所述病状和/或病况包括类
风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂
抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病。
背景技术
[0005] 自噬由将细胞器和蛋白隔离在自噬小泡（AV）中，并通过溶酶体融合将其消化（1）组成。自噬允许
肿瘤细胞在代谢和治疗压
力下存活（2-5）。多篇文献指出，治疗诱导的自噬对许多的抗癌剂是重要的抵抗机制。
[0006] 氯喹（CQ）（化合物1，图1）衍生物通过抑制溶酶体来阻断自噬（3、6、7）。氯喹和安慰剂与卡莫司汀和放射疗法治疗神经胶质瘤患者的随机对照III期临床试验中，报道了用氯喹治疗的患者中存活时间翻倍的趋势。基于这些结论，已经启动了将
癌症治疗与羟化氯喹（HCQ；图1化合物2）（增加剂量时比氯喹更安全）联合的临床试验。初步结果显示，这些联合具有活性（9），但是，是否由于HCQ的加入使得活性恒定依然不清楚。抑制自噬需要高微摩尔浓度的HCQ。虽然在癌症患者中存在一些使用HCQ抑制自噬的药效证据，但不是恒定的，因为在所有患者中都没有获得足够的浓度（10）。开放更多潜在的自噬
抑制剂的需求没有得到满足。利用多价赋予的
热力学优势（11、12），氯喹的二聚体类似物的设计和合成已经是有超过10年的深入研究对象了（13-15）。Vennerstrom（14）的一份早期报告描述了异烷
烃桥接的双喹啉的合成，其作为潜在的抗疟药，但是没有一个化合物具有充分的抗疟疾活性来保证进一步的研究。其后，Sergheraert（13）报道了四喹啉，即双喹啉的二聚体，其能提供有效的抗疟药，证实了多价策略的应用能提供增加的效力的可能性，至少对于抗疟活性来说。
[0007] 最近，Lee（16）描述了AKT抑制剂的增强作用通过氟化喹啉类似物来实现。Solomon（17）报道了基于使用哌嗪连接物，来制备“改变
位置（reposition）的”氯喹二聚体。这些结果暗示了这些喹啉类似物可以作为有效癌症
化学治疗的新组别发展的
基础。
[0008] 发明目标
[0009] 本发明的目的是提供新型的化合物用于在生物系统中抑制自噬，特别地，包括需要帮助的患者或对象。
[0010] 本发明的另一个目的是治疗病状和/或病况，其中患者或对象的病状和/或病况受益于自噬的抑制。
[0011] 本发明的又一个目的是提供药物组合物，其用于抑制自噬，特别地，与包括癌症及其转移的病状和/或病况相关的自噬。
[0012] 本发明的进一步目的是采用本发明的化合物、组合物和/或方法抑制、治疗或
预防需要帮助的患者或对象的癌症，包括癌症的转移。
[0013] 本发明的另一个目的是抑制、治疗或预防
疾病，包括类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病等，在这些疾病中，抑制自噬能提供有利的效果。
[0014] 本发明的这些和/或其他目的中的任意一个或多个可容易地从接下来本发明的
说明书中收集到。
发明内容
[0015] 本发明涉及化学结构I的化合物：
[0016]
[0017] 其中，R1和R1′每个独立地为H、卤素（F、Cl、Br或I）、CN、NO2，任选取代的C1-C6烷基（当取代时，优选被1个或2个羟基或3-5个氟取代），任选取代的O-C1-C6烷基（优选地，OCH3），任选取代的C2-C7酰基（优选地，乙酰基）或任选取代的C2-C7酯（
氧羰基酯或羧基酯，优选地，羧基酯）；
[0018] R和R′每个独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C7（优选地C2-C7）酰基、任选取代的C2-C7羧酯基（其与R或R′相连的氮
原子形成尿烷基团）；
[0019] L是―(CH2Y)n―X―(Y′CH2)n―基团或A―(CH2―CH2―Z)n―A′基团（A或A′可连接到化合物I的两个氨基中的一个），其中，L中的至少一个CH2基团任选地被C1-C3烷基取代，该C1-C3烷基本身任选地被一个或两个羟基取代；X不存在、或者为(CH2)jO、S或N-R″；
[0020] Y不存在、或者为CH2、O、CH2O或N-R″，而Y′不存在、或者为CH2、O、OCH2或N-R″，条件是当X、Y和Y′中的一个或多个存在时，每个存在的X和Y、X和Y′或Y和Y′形成一稳定的键；
[0021] R″是H或任选取代的C1-C6（优选地，C1-C3）烷基；
[0022] j是1、2或3（优选地是1或2）；
[0023] n是0、1、2、3或4，条件是当n是0时，X是(CH2)j，其中j是至少为1，并且至少一个CH2基团任选被C1-C3烷基取代，该C1-C3烷基本身任选地被一个或两个羟基取代；
[0024] A不存在或者为(CH2)j，而A′是(CH2)j，其中，A或A′中的至少一个CH2基团任选被C1-C3烷基取代，该C1-C3烷基本身任选地被一个或两个羟基取代；
[0025] Z是O或N-Rz；
[0026] Rz是H或任选取代的C1-C3烷基，
[0027] 或它们药学上可接受的盐、对映异构物、非对称异构体、
溶剂或多晶型物。
[0028] 在本发明优选的方面中，R1和R1′每个独立地为H、卤代基团、硝基或三氟甲基，优选地为氯代基团。R和R′每个独立地为H、任选取代的C1-C3烷基，其本身优选地被至少一个羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基团任选在氨基的位置被一个或两个7-取代-4-喹啉基取代，其中所述氨基连接到喹啉基的4-位置，以及每个喹啉基的7-位置任选地被取代，优选地被上面结构通式I广泛描述的1 1′
R 或R 取代，或所述单烷基氨基或二烷基氨基的一个或两个烷基本身进一步任选地被至少一个羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基任选在氨基的位置被一个或两个7-取代-喹啉基取代，其中，所述氨基连接到喹啉基的
1
4-位置，以及每个喹啉基的7-位置任选地被取代，优选地被上面结构通式I广泛描述的R
1′
或R 取代，并且每个所述的烷氧基（例如甲氧基或乙氧基）可任选地进一步被烷氧基取代，优选是甲氧基取代，从而形成一二醚取代基。
[0029] 在本发明的某些优选方面，L是―(CH2Y)n―X―(Y′CH2)n―基团，其中，X是N-R″，Y和Y′每个独立地为不存在或CH2，并且，R″为H或任选取代的C1-C3烷基，其本身任选地被至少一个羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基团任选在氨基的位置被一个或两个7-取代-4-喹啉基取代，其中所述氨基连接到喹啉基的4-位置，以及每个喹啉基的7-位置任选地被取代，优选地被上面结构通式I广泛1 1′
描述的R 或R 取代，或所述单烷基氨基或二烷基氨基的一个或两个烷基本身进一步任选地被至少一个羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基任选在氨基的位置被一个或两个7-取代-喹啉基取代，其中，所述氨基连接到喹啉基的4-位置，以及每个喹啉基的7-位置任选地被取代，优选地被上面结构通式广泛描述
1 1′
的R 或R 取代，并且每个所述的烷氧基（例如甲氧基或乙氧基）可任选地进一步被烷氧基取代，优选是甲氧基取代，从而形成一二醚取代基。
[0030] 根据本发明进一步优选的化合物，包括在多种方案中提供的那些，它们在本文方案1和方案3-10以及图14、15和15A中显示。
[0031] 在本发明的另一个方面，一种药物组合物包括根据上面式I或本文另有描述的化合物与一药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合，任选地与至少一种另外的抗癌剂组合。
[0032] 在生物系统中，尤其在患者或对象中抑制自噬的方法，是本发明进一步的方面。在本发明的这个方面中，将本文另有说明的双氨基喹啉化合物提供给生物系统，包括给需要帮助的患者或对象
给药，以抑制自噬。可在生物系统中监测或应用产生的抑制以产生有利的效果，包括抑制、治疗和/或预防癌症，包括癌症的转移，或抑制、治疗和/或预防一种或多种病状或病况，其中抑制自噬能提供有利的效果，病状或病况包括类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病等。
[0033] 癌症，包括癌症的转移和耐药的癌症的抑制、治疗和/或降低其可能性的方法，包括给需要帮助的患者至少一种根据本发明的化合物，任选地，与本文另有说明的至少一种另外的抗癌剂联合。
[0034] 本发明还涉及治疗、抑制和/或预防需要帮助的患者中的疾病、病状和/或病况，其中，抑制自噬能提供有利的效果，包括类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病，方法包括给予所述患者至少一种根据本发明的化合物。
附图说明
[0035] 图1.单氨基喹啉和双氨基喹啉的化学结构；
[0036] 图2.双氨基喹啉的合成路线；
[0037] 图3.Lys01-Lys04在LC3免疫印迹和在LN229细胞4小时处理后的溶解产物中LC3II/LC3I比值的定量上的作用。图中示出了每个处理的LC3II/LC3I比值（平均值+/-SD），该比值归一化为每个试验对照处理细胞的LC3II/LC3I比值；
[0038] 图4.对比HCQ，Lys01的自噬抑制和细胞毒性。（A）如所示处理4小时后的LN229GFP-LC3细胞的示意图。白色箭头：小点状结构（small puncta）；红色箭头：密集的点状结构。图表显示点/细胞的平均值+/-SEM。（B）使用DMSO、10μM HCQ或10μM Lys01处理LN229-GFP-LC3细胞后的
电子显微图。箭头：自噬小泡。（C）如所示处理24小时后的LN229细胞的LC3免疫印迹；用巴弗洛霉素处理与对照组对比，LC3II/LC3I比值的计算比值。超过虚线表示自噬诱导物或对照，低于虚线表示自噬抑制物。（D）4个细胞系的MTT试验（72小时）。红色：Lys01，蓝色：Lys02，紫色：Lys03，绿色：Lys04，橙色：HCQ每个试验有5个重复，值以平均值+/-SEM表示；
[0039] 图5.Lys05的自噬抑制和细胞毒性，Lys01的
水溶性盐。（A）如所示，对抗处理的c8161细胞中的LC3和p62的免疫印迹。（B）c8161细胞在72小时的MTT试验。HCQ：羟化氯喹。每个试验有5个重复，值以平均值+/-SD表示。*没有剩余的细胞用于分析；
[0040] 图6.Lys05的体内自噬抑制和抗肿瘤活性。（A）c8161异种移植肿瘤每日
腹腔注射（i.p.）PBS、HCQ60mg/kg或Lys0576mg/kg，2天后
收获的电子显微图（12000×）。箭头：自噬小泡；比例尺2μm（B）每个处理组两个代表肿瘤中，自噬小泡/细胞数量平均值+/-SEM的定量。（C-D）1205Lu异种移植5天中3天腹腔注射（i.p.）PBS（蓝色）、HCQ60mg/kg（绿色）或Lys05 76mg/kg（红色）。（C）超过14天的肿瘤体积（D）肿瘤日生长率（E-G）HT29异种移植在裸鼠胁腹生成，并以PBS、每日腹腔注射Lys05 10mg/kg、每日腹腔注射Lys05 40mg/kg或5天中3天腹腔注射Lys05 80mg/kg。（E）肿瘤平均日生长率（F）超过14天的肿瘤体积*（G）
切除的肿瘤重量，p＜0.05；
[0041] 图7.用Lys05或HCQ处理的黑素瘤和结肠癌异体移植中，自噬抑制和肿瘤坏死。（A）如所示，对抗单个c8161肿瘤溶解产物中的LC3的免疫印迹，该肿瘤每日腹腔注射，处理48小时。LC3II/LC3I比值（平均值+/-SEM）的量化（B）处理14天后收获的
1205Lu异种移植肿瘤，其H&E
染色部分中的肿瘤
坏死（箭头）；黑素瘤肿瘤细胞的电子显微图（7000-12000×）。箭头：自噬小泡（白色）；凋亡细胞（橙色）（C）对抗HT29异体移植中LC3的免疫印迹，该HT29异体移植每日定量给药（10,40mg/kg）或5天中3天定量给药（80mg/kg），处理14天；
[0042] 图8.与5天中3天腹腔注射76mg/kg Lys05相关的毒性。（A）定量给药3天后，老鼠拱着背昏睡。（B）3/10的老鼠发展成肠梗阻。（C）一只老鼠回肠末端中的畸形潘氏细胞（箭头）；
[0043] 图9.最高剂量的Lys05处理使得自噬基因
缺陷的肠道表型重现。（A-F）对携带以PBS、Lys05 10-80mg/kg处理的HT29异种移植的老鼠的体重和肠进行分析。（A）每日体重（B）代表处理14天后切除的胃肠道（C）携带HT29异种移植（14天）的老鼠的回肠隐窝（苏木精和伊红染色）的代表图（40×），箭头：潘氏细胞。（D）每个隐窝的潘氏细胞数（E）潘氏* *细胞功能障碍评分，p＜0.05（F）溶菌酶阳性细胞的评分，p=0.001.小鼠回肠溶菌酶免疫
荧光（绿色）的代表图，其中5天中3天以PBS、Lys0580mg/kg腹腔注射处理小鼠；
[0044] 图10.潘氏细胞功能障碍规模。40×放大倍数下,对每个潘氏细胞的嗜伊红颗粒的大小和数目进行计算，每个样本10个潘氏细胞：A0=正常大小和数目；A1=缩小，正常数目；A2：正常大小，数目减小；A3：缩小，数目减小；
[0045] 图11.Lys05通过在溶酶体的积累和使其脱酸来抑制自噬。将1205Lu细胞（用PBS、10μMHCQ或10μM Lys05处理24小时）和收获的1205Lu异种移植肿瘤（5天中3天腹腔注射PBS、HCQ60mg/kg，或5天中3天腹腔注射76mg/kg Lys05，处理14天）搅匀，并分成全细胞（WC）和溶酶体（L）部分。LAMP2免疫印迹确认浓缩的溶酶体分离用于分析。（B）细胞和肿瘤全细胞与溶酶体匀浆中，HCQ或Lys05的浓度。（C）如所示处理30分钟并用溶酶体红色荧光探针染色的1205Lu细胞的荧光图。对每个细胞三个溶酶体荧光探针（红色）高亮区的小点进行计数。蓝色：细胞核DAPI染色。数据表示为平均值±SEM。（D）c8161细胞的荧光图，该细胞如所示处理24小时，并用吖啶橙（AO）染色：橙色：聚集的AO；绿色：扩散的AO；
[0046] 图12.高效液相色谱
串联质谱分析HCQ和Lys05。1205Lu细胞（24小时）和1205Lu肿瘤（14天）。WC：匀质的全细胞；L：小部分的溶酶体；HCQ：羟化氯喹；
[0047] 图13.溶酶体酶的损伤以及与Lys05处理相关的溶酶体
外渗漏。（A）酸性
磷酸酶的活性，以及（B）1205Lu细胞经PBS、10μM HCQ、10μM Lys05处理24小时，其全细胞（白色，WC）和溶酶体部分（黑色；L）中组织蛋白酶D的免疫印迹。图中示出三个独立试验的平均值+/-SEM。（C）酸性磷酸酶的活性，以及（D）1205Lu异体移植在5天中3天（肿瘤）腹腔注射PBS、60mg/kg HCQ、76mg/kg Lys05处理，其全细胞（白色，WC）和溶酶体部分（黑色；L）中组织蛋白酶D的免疫印迹。三个分别的肿瘤合并在一起，从其中制备匀质的全细胞（白色）和*匀质的溶酶体（黑色）。p＜0.05；
[0048] 图14.合成化合物Lys06-Lys12的化学结构；示出了化合物Lys06-Lys12的化学结构；
[0049] 图15.合成化合物Lys13-Lys18的化学结构；示出了化合物Lys13-Lys18的化学结构；
[0050] 图15A.显示了研究中若干另外的双氨基喹啉自噬抑制剂；
[0051] 图16.表1提供了LN229细胞中的MTT IC50值，用于本发明化合物的选择；
[0052] 图17.表2提供了本发明若干化合物在恶性疟原虫（P.falciparum）中IC50（M）值。
具体实施方式
[0053] 以下在整个说明书中使用的术语用来描述本发明。如本领域普通技术人员所理解的，在术语没有明确定义的情况下，该术语将取其所使用的语境中的常规意义。
[0054] 除非文中明确规定，本文提供的值的范围，应当理解为，每个居中值是取到下限的单位的十分位，在这个范围的上限和下限之间，以及在这规定的范围中的任意其他规定的值或居中值，都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，它们也包括在本发明中，其受到任何在所规定的范围中明确排除的限值制约。当所规定的范围包括一个或两个限值时，排除那些已包括的限值的范围同样也包括在本发明中。当取代基是一个或多个
马库什组中的可能的情况下，应当理解为只采用那些能形成稳定键的取代基。
[0055] 除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科技术语具有本领域技术人员所理解的一般含义。虽然任何与本文描述相似或相等的方法和材料也可以在实际或本发明试验中使用，但现在对优选的方法和材料进行描述。
[0056] 必须注意的是,本文及附带的
权利要求中使用的单数形式“一（a）”、“一（an）”和“所述（the）”包括复数形式，除另有明确说明外。
[0057] 此外，以下术语应具有下面设定的含义。
[0058] 在整个说明书背景中使用的术语“患者”或“对象”是指动物，通常为
哺乳动物，特别地，包括家养动物，优选地指使用本发明的组合物治疗（包括预防性治疗（预防））的人类。当治疗针对某种具体动物如人类患者的这些感染、疾病或疾病状态时，术语“患者”是指该特定动物。在大多数的情况下，本发明的所述的患者或对象是任一性别或两种性别的人类患者。
[0059] 除另有说明，本文使用的术语“有效量”是在其使用的背景下，化合物或成分产生或引起预期的效果的量，不论该效果是关于感染和/或疾病状况的预防和/或治疗，还是另有描述的。把所有其他有效量或有效浓度术语（包括术语“治疗有效的”）纳入到这个术语中，这些在本发明申请中另作描述或使用。
[0060] 本文使用的术语“化合物”指任何在本文中公开的具体化合物或生物活性剂，包括任何或所有的立体异构体（包括非对称异构体）、单个旋光异构体（对映异构物）或消旋混合物、药学上可接受的盐和前体药物形式。本文的术语化合物指的是稳定的化合物。在其使用的背景中，如本文另有说明，所述化合物可以指单个化合物或化合物的混合物。应当理解的是，在取代基或键的马库什或其他组中选择取代基或键，是为了在马库什或其他组中的这些选择形成稳定的化合物。
[0061] 术语“生物活性剂”指的是在本发明中可以配制使用的任何生物活性化合物或药物。生物活性剂的例子包括根据本发明的化合物，其可用于抑制自噬，并治疗癌症，以及本文另有描述的其他化合物和
试剂。
[0062] 术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”同义使用，指的是使处于疾病威胁或折磨的病人受益的任何动作，包括通过减轻或抑制至少一种症状、延迟疾病的发展、预防或延迟疾病的发作等来改善身体状况。
[0063] 此处使用的治疗方法包含预防疾病（主要是癌症）的治疗方法和治疗性的治疗方法。例如，本发明的化合物可以预防地向哺乳动物给药，以防疾病的发生，降低这种疾病的可能性。预防性的给药对降低或减少哺乳动物中疾病的后续发生可能性，或对减轻疾病后续发生的严重性，特别包括癌转移是有效的。替代地，根据本发明的化合物可以，例如，治疗性地向已经被疾病折磨的哺乳动物给药。在治疗性给药的一个
实施例中，用本发明的化合物给药对消除疾病，和产生缓解或基本上消除癌转移的可能性是有效的。在癌症的例子中，用本发明的化合物给药对减轻疾病的严重性或延长受折磨的哺乳动物的寿命是有效的。
[0064] 本文使用的术语“药学上可接受的”，意思是该化合物或组合物适于给药对象，以获得本文描述的治疗，根据疾病的严重性和治疗的必然性，没有不适当的有害的
副作用。
[0065] 本文使用的术语“抑制”指的是，当抑制剂是具有抑制能力的化合物时，其能部分或全部消除潜在的影响。
[0066] 在本文背景下使用的术语“预防”应当指“降低可能性”或预防继发于本发明的一种或多种化合物或组合物单独或与另一种试剂联合给药或同时给药的疾病、病症或病状。注意到，几乎没有100%有效的预防；所以，术语预防和降低可能性用于表示这样的事实：
在给定的患者或对象的群体中，给与本发明的化合物将能降低特定的病症或病状，或其他公认的疾病发展的指标发生的可能性，或抑制（特别地，病状的恶化，例如癌细胞生长或转移）。
[0067] 术语“自噬”或“自吞作用”用于描述涉及通过溶酶体降解细胞自身成分的细胞中的分解代谢过程。自噬是一种高度受控生物系统过程，其在细胞生长发育和维持稳态中发挥正常的作用来帮助维持细胞产物的合成和降解以及随后的回收之间的平衡。这是细胞将营养物质从不必要的过程分配到更重要的过程中的主要机制。
[0068] 实际上，许多的自噬过程在发生，所有都具有通过溶酶体降解细胞内成分的共同特征。一个已知的自噬机制涉及围绕细胞中的目标区域形成膜，其将这些内容物从
细胞质其他部分隔离。然后，生成的小泡与溶酶体融合，溶酶体随后将内容物降解。
[0069] 自噬由将细胞器和蛋白隔离在自噬小泡（AV）中，并通过溶酶体融合将其消化（1）组成。自噬允许肿瘤细胞在代谢和治疗压力下存活（2-5）。多篇文献指出，治疗诱导的自噬对许多的抗癌剂是重要的抵抗机制。
[0070] 受益于自噬抑制的疾病、病状和/或病症包括癌症（包括癌转移）、类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病。
[0071] 术语“癌症”应指的是具有独特的失去正常控制的特征的肿瘤
细胞增殖，导致不受控的生长，缺失分化、局部组织侵袭和/或转移。如本文中使用的赘生物（neoplasms），包括但不限于，与相同类型组织中的正常增殖比较，对象或宿主组织中的形态不规则细胞，以及对象组织中病理性增殖的细胞。此外，赘生物包括侵袭性或非侵袭性的良性肿瘤和
恶性肿瘤（如，结肠肿瘤）。恶性赘生物与良性赘生物的区别在于前者显示更大程度的发育异常，或缺乏细胞分化和取向，以及具有侵袭性和转移的特点。在本文背景下，术语癌症也包括耐药癌症，包括耐受多种药物的癌症。赘生物或瘤形成衍生自本发明的目标细胞，其包括但不限于，癌（例如，鳞状细胞癌、腺癌、
肝细胞癌和肾细胞癌），具体地，膀胱、骨、肠、乳房、
宫颈、直肠（结直肠）、食道、头、肾脏、肝、
肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺和胃的那些细胞；白血病，如急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、急性早幼粒细胞白血病（APL）、急性T细胞淋巴性白血病、成人T细胞白血病、嗜
碱性粒细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、粒细胞性白血病、毛细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴球性白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、中性粒细胞白血病、干细胞性白血病；良性和恶性淋巴瘤，特别地，伯基特淋巴瘤、非霍奇金（Hodgkin′s）淋巴瘤和B细胞淋巴瘤；良性和恶性的黑素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤，特别地，尤因氏肉瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤（liposarcomas)、肌肉瘤、外周神经上皮瘤和滑膜肉瘤；中枢神经系统的肿瘤（例如，神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、松果
体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经
纤维瘤和神经鞘瘤）；生殖细胞肿瘤（例如，肠癌、
乳腺癌、
前列腺癌、
宫颈癌、子宫癌、肺癌（如小细胞肺癌、小细胞和非小细胞癌混合）胸膜间皮瘤，包括转移的胸膜间皮瘤、小细胞肺癌和非小细胞肺癌）、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、食道癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和黑素瘤；混合类型的瘤，特别地，癌肉瘤和霍奇金氏病；以及混合的起源细胞（origin）肿瘤，例如维尔姆斯瘤和畸胎癌等。注意到，某些上皮细胞瘤包括卵巢、乳房、结肠、头和颈、成神经管细胞瘤和B细胞淋巴瘤等展示出增强的自噬，并且是本发明化合物和治疗的主要目标癌。
[0072] 术语“另外的抗癌剂”是用于描述另外的化合物，其可与本发明的一种或多种化合物一起给药来治疗癌症。这类试剂包括，例如，依维莫司、曲贝替定、abraxane、TLK286、AV-299、DN-101、帕 唑帕 尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244（ARRY-142886）、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD1152、enzastaurin、凡德他尼（vandetanib）、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、
极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗-HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检测点-1或2抑制剂、粘附斑激酶抑制剂、Map激酶激酶（mek）抑制剂、VEGF trap抗体、培美曲塞、埃罗替尼、达沙替尼（dasatanib）、尼罗替尼、德卡坦尼（decatanib)、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、洛拉曲克（nolatrexed）、azd2171、巴他布林（batabulin）、奥法木单抗、扎木单抗、伊朵堤卡林（edotecarin）、粉防己碱、鲁吡替康（rubitecan）、替米利芬、奥利默森（oblimersen）、替兹木单抗（ticilimumab）、易普利姆玛（Ipilimumab）、
棉酚、Bio111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO140、CC8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽
酮、LY317615、neuradiab、维特斯潘（vitespan）、Rta744、Sdx102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr311、罗咪酯肽、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他（vorinostat）、依托泊苷、吉西他滨、阿霉素、伊立替康、阿霉素脂质体、5′-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、塞利西利（seliciclib）；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧-1H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰]-、二钠盐、七水合物、喜树碱、PEG标记的伊立替康、三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES（乙烯雌酚）、雌二醇、雌
激素、雌激素缀合物、贝伐单抗、IMC-1C11、CHIR-258；3-[5-(甲基磺酰基哌啶基甲基)-吲哚-喹诺酮、瓦他拉尼（vatalanib）、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2
醋酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x，其中，x=1到2.4]、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟
萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特（nilutamide）、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、埃罗替尼、拉帕替尼、卡拉替尼（canertinib)、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、Ionafarnib、BMS-214662、替吡法尼；阿米福汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酶、卡介苗（BCG）、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、
顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素D、道诺霉素、乙烯雌酚、表柔比星、
氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫（gleevac）、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特（nilutamide）、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠（porfimer）、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫
鸟嘌呤、噻替派、维
甲酸、长春地辛、13-顺式视黄酸、苯丙氨酸氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷（5-deooxyuridine）、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春花碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、
角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥单抗、白介素融合毒素（denileukin diftitox）、吉非替尼、
硼替佐米（bortezimib）、紫杉醇、伊立替康、拓扑替康、阿霉素、多烯紫杉醇、长春瑞滨、贝伐单抗（单克隆抗体）和爱必妥、不含聚氧乙烯
蓖麻油的紫杉醇、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬（pipendoxifene）、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、吲哚昔酚（idoxifene）、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司（temsirolimus）、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀（darbepoetin）、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸、强的松、西妥昔单抗、粒细胞-巨噬细胞集刺激因子、组氨瑞林、PEG化干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替伊莫单抗（ibritgumomab tiuxetan）、雄激素、地西他滨、六甲嘧胺、蓓萨罗丁、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、柔红霉素脂质体、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基强的松龙、普鲁氯嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、ssPEG非格司亭（sspegfilgrastim）、红细胞生成素、依泊汀α、达贝泊汀α、易普利姆玛、维罗非尼等。
[0073] 本文使用的术语“烷基”指的是包含
碳和氢（不大于10个碳原子或如另有说明）的完全饱和单价基团，并且可以是直链、支链或环状的。烷基的例子是甲基、乙基、正丁基、正庚基、异丙基、2-甲基丙基、叔丁基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。
[0074] 关于以上描述的烷基的术语“取代的”包括一个或多个官能团，例如包含1-6个碳原子的低级烷基，任选地，它们被以下基团取代：1个或2个羟基或1个到5个的氟（优选地，3-5个）、酰基（C1-C6）、卤素（氟、氯、溴，例如，卤代烷，例如CF3）、氨基、羟基、羧基/
羧酸、硫代酰氨基（thioamido）、氰基、硝基、链烯基（C2-C6）、炔基（C2-C6）、叠氮基、烷氧基（C1-C6）（包括进一步被C1-C6烷氧基取代从而生成二醚基的烷氧基）、氨基、C1-C6烷基氨基和二烷基氨基，其中，任选地，所述烷基可被以下基团取代：1个或2个羟基或氨基（amine）、氨烷基或二烃基，其自身可被以下基团取代：一个或两个烷基，或7-取代-4-喹啉基、C2-C6酰氨基、C2-C6氧代酰基酯（oxyacylester）或羧酸酯、芳氧基、芳氧基（C1-C6）烷基、酰氨基（carboxamido）、巯基、C2-C6醚或硫醚、7-取代-4-氨基喹啉（或在氨基上取代，生成7-取代-4-氨基喹啉）等等。烷基上（本文背景中，特别低，在7-取代-4-氨基喹啉的氨基上）优选的取代基，或包含至少一个氨基的连接基团（linker）包括，例如，至少一个羟基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基（其中，任选地，一个或两个烷基本身进一步被二烷基氨基取代，或氨基被一个或两个（优选一个）7-取代-4-喹啉取代，其中的氨基连接在喹啉基的4-位）或烷氧基（例如，甲氧基或乙氧基），该烷氧基可进一步被烷氧基，优选甲氧基取代，从而生产二醚取代基。
[0075] 术语“芳基”指的是具有单环（例如，苯基）或多个稠环（例如，萘基）的，取代或未取代的单价芳香自由基。其他例子包括环中具有一个或多个氮、氧或硫原子，特别是喹啉基，特别是7-取代-氨基喹啉基，以及其他基团的杂环芳香（芳杂环或杂芳基）环基团。
[0076] 在本文术语“取代的芳基、取代的芳香烃、取代的杂芳基或取代的芳杂环”中使用的术语“取代的”表示在4-氨基喹啉的7-位置上出现的取代物，所述取代基选自原子和基团，当存在时，提高作为自噬抑制剂的化合物的活性。可以出现在取代的芳香烃或芳杂环中的取代基例子包括，但不限于，基团例如，H、卤素（F、Cl、Br或I）、CN、NO2，任选取代的C1-C6烷基（当取代时，优选被1个或2个羟基或3-5个氟取代），任选取代的O-C1-C6烷基（优选地，OCH3），任选取代的C2-C7酰基（优选地，乙酰基）或任选取代的C2-C7酯（氧羰基酯或羧基酯，优选地，羧基酯）。注意到，本文公开的每个取代基可以本身被取代。
[0077] 术语“同时给药”或“
辅助治疗”应当表示至少两种化合物或组合物同时给病人施用，这样，可以在给定时间点上，在病人体内得到两种或多种化合物中的每种的有效量或有效浓度。尽管根据本发明的化合物可以在相同的时间向病人同时给药，但该术语不仅包含在相同的时间，还包含在不同时间施用两种或多种试剂，包括连续给药。优选地，所有同时给药的化合物或组合物的有效浓度在给定时间的对象中找到。术语同时给药或辅助治疗也考虑与本发明药物组合物同时给药的其他生物活性剂，特别地，当癌症已经转移或处于转移的危险下。
[0078] 术语“放射疗法”或“放射治疗”用于描述连同本发明化合物用于治疗癌症的疗法。放射治疗使用高剂量的
辐射，例如，X-射线，或其他
能源，如
放射性同位素（γ、β或α发射体）来杀死癌细胞。辐射将细胞的遗传物质破坏，这样它们就不能生长。虽然辐射在破坏正常细胞，同时破坏癌细胞，但是正常细胞能自我修复并恢复功能，而癌细胞不能。
[0079] 根据所要治疗的癌症，放射治疗可以单独和本发明要求保护的化合物联合，或本文另作说明的那样与另外的抗癌剂联合使用。放射治疗在治疗没有扩散到原始肿瘤区域外的癌症是最有效的，但如果肿瘤已经扩散到附近的组织也是可以使用的。在手术后，通常采用放射治疗来杀死任何剩余的癌细胞，并减轻转移癌带来的痛楚。
[0080] 药物组合物
[0081] 根据本发明的化合物可容易地配制成药物组合物，用于生物系统中的自噬抑制，和/或由于自噬抑制而受益的病状和/或病况抑制、治疗或预防，所述病状和/或病况包括癌症（及其转移）、类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮（全身性红斑狼疮）、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病。药物组合物包括一有效量的一种或多种根据本发明的化合物与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂结合，任选地，在癌症的例子中，与至少一种另外的试剂结合，优选地，如本文另有描述的抗癌剂。
[0082] 如上面提到的，本发明的化合物和方法可用于抑制本文另有描述的自噬，并对癌症及其转移、类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮（全身性红斑狼疮）、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病的治疗和抑制（包括预防）是有用的。癌症或疟疾的治疗是本发明的重要方面。
[0083] 根据本发明的方法中，需要帮助的对象或患者以本发明的化合物、药物组合物治疗，以抑制、治疗本文另有描述的病状、病况和/或感染，或降低其可能性。本领域技术人员能容易地识别并诊断出本发明化合物和组合物治疗的病状、病况和感染，并且通过给患者施用有效量的一种或多种本发明的化合物来治疗。
[0084] 一般地，化合物的给药剂量和方式是根据标准药学操作，按照对象的大小和身体状况来确定的。采用的剂量水平可以很广泛，并且本领域技术人员可容易地确定。通常，采用的量在毫克到克之间。可以通过多种方式来给患者给药组合物，例如，口服、经皮、经神经周（perineurally）或胃肠外，即静脉注射、皮下注射、腹腔注射或肌肉注射等，包括
口腔给药、直肠给药、
经皮给药。根据本发明的方法考虑到治疗的对象包括人类、伴侣动物、实验室动物等。
[0085] 包含本发明化合物的制剂可以采用固体、半固体、冻干粉末或液体的剂型，例如，片剂、胶囊、粉末、持续释放剂型、溶液、悬浮液、乳剂、栓剂、乳膏、药膏、洗剂、气雾剂、
皮肤药贴等，优选地，以适于精确剂量的简易给药的单位剂型。
[0086] 根据本发明的药物组合物通常包括一传统药物载体或赋形剂，并可额外地包括其他药物试剂、载体、佐药、添加剂等。优选地，本发明的一种化合物或多种化合物占该组合物重量的大约0.1%到大约85%，大约0.5%到大约75%，余量本质上由合适的药物赋形剂组成。对于口服给药，这类赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、
淀粉、
硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、
纤维素、
葡萄糖、明胶、
蔗糖、碳酸钠等等。如果需要的话，该组合物还可保护较少量的非毒性辅助物质，例如润湿剂、乳化剂或缓冲剂。
[0087] 可以通过将化合物（按重量算，大约占0.5%到大约20%，或更多）或任选的药物佐剂溶解或分散到载体如，盐的水溶液、右旋糖的水溶液、甘油或
乙醇中，从而形成溶液或悬浮液，来制备液体组合物。对于用在口服中的液体制剂，该组合物可制备成溶液、悬浮液、乳液或糖浆剂，以适于在水或生理盐水中以水化的液体形式或干燥形式来提供。
[0088] 当组合物使用
固体制剂形成进行口服给药时，制剂可以是药片、颗粒、粉末、胶囊等。在药片制剂中，组合物制备通常用添加剂，例如赋形剂如糖类或纤维素制剂、一结合物如淀粉糊或甲基纤维素、一填充剂、一分解剂或其他通常用于医药制剂制备的添加剂。
[0089] 用于
肠胃外给药的可注射组合物通常包括在合适的i.v.溶液，例如无菌生理盐水中的化合物。该组合物还可制备成脂质或磷脂的悬浮液、脂质体的悬浮液或水性乳液。
[0090] 对于本领域技术人员来说，用于制备这种剂型的方法是已知的或是显而易见的，例如，见Remington′s Pharmaceutical Sciences(17th Ed.,Mack Pub.Co.,1985)。待给药的组合物包含药学上有效量的一些的选择化合物，用于在生物系统内抑制自噬，包括本发明的患者或对象。
[0091] 本发明的化合物的合成
[0092] 二价氨基喹啉自噬抑制剂的合成路径
[0093] 本
发明人通过购买的材料制备二聚氯喹（图1，化合物3：Lys01）来检验采用多价来合成新型自噬抑制剂的策略（11,12）。基于现有的文献（14），我们预期从一个当量的化合物5和两个当量的化合物6来制备化合物3（14），如图2逆合成所示。
[0094] 虽然化合物4（R=Cl）是已知的化合物（14），但是双氨基喹啉化合物3（R2=Me）在文献中没有描述。由于它推断的趋溶酶体性，我们提到的化合物3指的是Lys01。化合物5与两个当量的化合物4的反应生成期望的产物化合物3和一些单喹啉化合物7（图1，Lys02，图2）的混合物，这个合成过程由Higuchi（18）在此前报道。为了检验C-7氯取代基在化合物3中的作用，我们制备了化合物3的二甲氧基类似物，化合物9（图1，化合物9：Lys03）。
[0095] 为了确定化合物的多胺连接的重要性，我们采用购买的2,2′-(乙烯二氧)双(乙胺)10（见图2）制备了化合物3的多醚类似物化合物11（图1，化合物11：Lys04）。
[0096] 本发明人通过检验化合物3（即，12R=Cl）结构的系统修饰（systematicmodification），如图15A的方案A，以尝试获得先导化合物3（Lys01）的构效（SAR）数据。
最初的尝试焦点在研究化合物12三个不同区域的结构变化：1）化合物3中出现的C-7氯取代基的修饰（X在图15A的化合物12中）；2）C-4氮取代基（即，N-烷基化作用或酰化作用）以及相邻的碳原子（在CQ和HCQ（图1）中包含一立体中心）的修饰；以及3）化合物12（图15A）中N-甲基基团的修饰。
[0097] 图15A（化合物13-16）显示的每个必需的起始化合物都是已知或可以购买得到的，基于Lee（16）的研究，通过将不同吸电子基团混合可促进不同于化合物3（12R=Cl）的类似物家族的合成。
[0098] 发明人还检测了化合物12、化合物17和化合物18（图15A）的N-烷基化和N-酰基化类似物的生物活性。这些新型化合物通过直接烷基化、还原烷基化或酰基化，直接从12（R=Cl）进行制备。
[0099] 发明人还检测了向化合物12中引入CQ和HCQ（图1）中出现的
手性，如化合物19（图15A的方案C）所示。必需的连接基团化合物20采用Kokotos的方法来获得（J.Chem.Res，Synopses1992,12,391）。
[0100] 最后，研究了通过将N-甲基基团（图15A的方案A）替换成其他官能团的化合物12的结构修饰。图15A的方案D显示了两种有趣的可能性，即，化合物21和化合物22，其中，N-甲基基团被HCQ中的羟乙基取代，其中，N-甲基基团被另外的喹啉部分取代，生成三喹啉化合物22。形成21和22的合成路线分别紧密地基于Lee（19）和Solomon（17）的研究。
[0101]
[0102] 继续描述第二代化合物的特性的同时，这里有一些另外的化合物被认为是更有效的自噬抑制剂。发明人以化合物12（方案1；Lys01）为先导化合物，描述了12结构的三个部分的更全面的系统修饰，如结构通式23（见上）所示，作为SAR分析中的下一逻辑步骤。1 2 3
如下所示，结构的三个部分中的每个（R、R 和R）都被修饰。
[0103] R1的作用
[0104] Egan和他的同事（20）已经研究了替换氯喹1（方案2）中氯部分的作用，他们确认了
[0105]
[0106] 吸电子基团对于这些7-取代喹啉的抗疟原虫活性时重要的。因此，发明人检测了1 1′ 1′
结构通式23的这些相同的取代，23中同时取代R 和R ，然后其中的R 取代基是Cl，如
12中，或是氢（X=H）。Egan的研究表明，所有必需的4-氯-7-取代-喹啉是已知的，从而方便了方案3中所示的每个化合物的制备。方案3中所示的化合物都不是已知的，但键合的
1
（linked）双喹啉（R=H）已有描述（21）。
[0107]2
[0108] R 的作用2 2
[0109] 方案4中，通过乙酰化（R=MeCO-；单或二）或甲基化（R=Me；单或二）得出结构2
41-44来检测先导结构3中R=H的作用。虽然同系列的类似物45和46（在氮原子之间包含一条或两条丙烯链）是已知的（FR1345573；CAN60:68181），但每个41-44类似物代表一个新的结构。
2 2
[0110] R 上耐受良好的取代基进一步指向以羟化氯喹2中的羟乙基部分来取代R（方案5）。苯胺与环氧乙烷的反应生成相应的羟乙基化合物已有很多先例（22），因此，先导结构3转
化成单或二羟乙基化的类似物47和48是容易实现的。
[0111]
[0112] 发明人还研究了包含三和四喹啉的结构的制备，如方案6所示，基于Bailey和他的同事的研究（23），其通过47和48中伯醇的氧化得到相应的
醛，采用7-氯-4-氨基喹啉还原烷基化得到三和四喹啉49和50。
[0113]
[0114] 基于Drefahl和Konig的研究（Chem.Ber.1954,87,1632-4），发明人还研究了方案2
7中在先导结构中并入亲油基团，即长链烷基，以及更加极性的取代基取代R 的作用，其通过此
[0115]
[0116] 采用可以购买的烷化剂59-62对仲胺（R2=H）进行烷基化，使得51-58的制备通过两个仲胺官能团的单和二烷基化。
[0117] 发明人研究了先导结构23中改变R3的影响（见上面的方案1）。R3的某些取代是已知的，例如下面方案8中63-65所示。发明人基于已知仲胺63的烷基化（13），采用方案7中所示的烷化剂（59-62）来生成新的结构（66-69），从而制备新的类似物。对底物70进行
3
研究，其中R=CH2CH2OH，即，最接近羟化氯喹的相应63的类似物。这一化合物可通过使用与方案5中制备类似物相同的顺序，或通过66的去甲基化来获得。
[0118]
[0119] 先导结构3和氯喹1（方案9）之间的另一重要的区别在于1中立体中心位于氮原子旁边。发明人还制备了混合结构，其中23的两侧或一侧更接近类似1，例如，71/72和73/74。每种
[0120]
[0121] 情况下必需的二胺从（L）谷氨酸开始制备，然后采用Craig在立体选择合成氯喹中采用的过程（J.Org.Chem.1988,53,1167-1170）。
[0122] 发明人制备包含氯喹1的立体中心的先导结构3的类似物，即，75/76和77/78，其可采用Charlton和他的同事的方法（24），通过还原烷基化分别从丙氨酸和丝氨酸中获得。
[0123] 最后，发明人研究了连接喹啉环的链上包含四个氮原子的一系列化合物，如下面方案10中所示，而不是3（方案9）中连接链中的三个氮原子。Denny和他的同事（24）描述了必需的四胺81和82的合成。80中出现的额外的氯喹部分的连接通过方案8中合成65采用的相同方法进行。
[0124]
[0125] 治疗方法
[0126] 根据本发明的一个方面，提供治疗哺乳类患者或对象的方法，以抑制该患者或对象中的自噬。根据本发明，本文描述的化合物可用于抑制自噬，其方式与抑制、治疗和/或预防包括癌症（包括癌症的转移）、类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病的病状和/或病况。
[0127] 根据本发明，在需要帮助的患者或对象中，通过给患者或对象施用一有效量的一种或多种本发明的化合物来治疗，任选地，与至少一种另外的有利于治疗相同病状或病况的生物活性剂联合。本发明的化合物可用于癌症的抑制、降低其可能性或治疗，包括需要这种治疗帮助的患者或对象中的癌症的转移。这种治疗对任何以自噬抑制表示一有利的结果，或以转移为一风险因素的癌症来说，是有用的。采用本文另有描述的至少一种另外的抗癌剂的治疗也理解为本发明的方法。在上文描述了根据本发明方法可以治疗的多种癌症。
[0128] 本发明的另一个方面是涉及治疗受益于自噬抑制的病状和/或病况的方法，包括类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病。在这个方法中，给需要治疗帮助的患者或对象施用一有效量的本文另有描述的化合物，任选地，与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合，以抑制、治疗和/或预防上述病状和/或病况。
[0129] 在本发明中，治疗的方法包括给需要治疗帮助的对象施用一有效量的以下I的化合物，该化合物在一药学上可接受的载体中：
[0130]
[0131] 其中，R1和R1′每个独立地为H、卤素（F、Cl、Br或I）、CN、NO2，任选取代的C1-C6烷基（当取代时，优选被1个或2个羟基或3-5个氟取代），任选取代的O-C1-C6烷基（优选地，OCH3），任选取代的C2-C7酰基（优选地，乙酰基）或任选取代的C2-C7酯（氧羰基酯或羧基酯，优选地，羧基酯）；
[0132] R和R′每个独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C7（优选地C2-C7）酰基、任选取代的C2-C7羧酯基（其与R或R′相连的氮原子形成尿烷基团）；
[0133] L是―(CH2Y)n―X―(Y′CH2)n―基团或A―(CH2―CH2―Z)n―A′基团（A或A′可连接到化合物I的两个氨基中的一个），其中，L中的至少一个CH2基团任选地被C1-C3烷基取代，该C1-C3烷基本身任选地被一个或两个羟基取代；
[0134] X不存在、或者为(CH2)jO、S或N-R″；
[0135] Y不存在、或者为CH2、O、CH2O或N-R″，而Y′不存在、或者为CH2、O、OCH2或N-R″，条件是当X、Y和Y′中的一个或多个存在时，每个存在的X和Y、X和Y′或Y和Y′形成一稳定的键；
[0136] R″是H或任选取代的C1-C6（优选地，C1-C3）烷基；
[0137] j是1、2或3（优选地是1或2）；
[0138] n是0、1、2、3或4，条件是当n是0时，X是(CH2)j，其中j是至少为1，并且至少一个CH2基团任选被C1-C3烷基取代，该C1-C3烷基本身任选地被一个或两个羟基取代；
[0139] A不存在或为(CH2)j，而A′是(CH2)j，其中，A或A′中的至少一个CH2基团任选被C1-C3烷基取代，该C1-C3烷基本身任选地被一个或两个羟基取代；
[0140] Z是O或N-Rz；
[0141] Rz是H或任选取代的C1-C3烷基，
[0142] 或它们药学上可接受的盐、对映异构物、非对称异构体、溶剂或多晶型物。
[0143] 在本发明优选的方法中，R1和R1′每个独立地为H、卤代基团、硝基或三氟甲基，优选地为氯代基团。R和R′每个独立地为H、任选取代的C1-C3烷基，其本身任选地被至少一个羟基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基团任选在氨基的位置被7-取代-4-喹啉基取代，其中所述氨基连接到喹啉基的4-位置，或所述单烷基氨基或二烷基氨基的一个或两个烷基本身进一步任选地被至少一个羟基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基任选在氨基的位置被一个或两1
个7-取代-喹啉基（如上面结构通式I所概括地描述，每个喹啉基的7-位置可被R 和/或
1′
R 取代），或烷氧基（例如甲氧基或乙氧基）取代，优选甲氧基（从而形成一二醚取代基），其中烷氧基可进一步被一烷氧基取代。
[0144] 在本发明的另外优选方法中，L是―(CH2Y)n―X―(Y′CH2)n―基团，其中，X是N-R″，Y和Y′每个独立地为不存在或CH2，以及R″是H或任选取代的C1-C3烷基，其本身任选地被至少一个羟基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基团任选在氨基的位置被7-取代-4-喹啉基取代，其中所述氨基连接到喹啉基的4-位置，或所述单烷基氨基或二烷基氨基的一个或两个烷基本身进一步任选地被至少一个羟基、氨基、单烷基氨或二烷基氨基团取代，其中所述氨基或所述单烷基氨基任选在氨基的位置被一个或两个7-取代-喹啉基（如上面结构通式I所概括地描述，每个喹啉基的7-位置1 1′
可被R 和/或R 取代），或烷氧基（例如甲氧基或乙氧基）取代，优选甲氧基（从而形成一二醚取代基），其中烷氧基可进一步被一烷氧基取代。
[0145] 进一步优选的方法涉及本发明化合物的使用/给药，其以多种方案提供，在本文方案1和方案3-10以及图14、15和15A中显示。
[0146] 在治疗或抑制癌症或癌症的转移的方法中，上述化合物可与至少一种另外的抗癌剂一起给药，包括，例如，依维莫司、曲贝替定、abraxane、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244（ARRY-142886）、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD1152、enzastaurin、凡德他尼（vandetanib）、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗-HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检测点-1或2抑制剂、粘附斑激酶抑制剂、Map激酶激酶（mek）抑制剂、VEGF trap抗体、培美曲塞、埃罗替尼、达沙替尼（dasatanib）、尼罗替尼、德卡坦尼（decatanib)、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、洛拉曲克（nolatrexed）、azd2171、巴他布林（batabulin）、奥法木单抗、扎木单抗、伊朵堤卡林（edotecarin）、粉防己碱、鲁吡替康（rubitecan）、替米利芬、奥利默森（oblimersen）、替兹木单抗（ticilimumab）、易普利姆玛（Ipilimumab）、棉酚、Bio111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO140、CC8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、维特斯潘（vitespan）、Rta744、Sdx102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr311、罗咪酯肽、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他（vorinostat）、依托泊苷、吉西他滨、阿霉素、伊立替康、阿霉素脂质体、5′-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、塞利西利（seliciclib）；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧-1H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰]-、二钠盐、七水合物、喜树碱、PEG标记的伊立替康、三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES（乙烯雌酚）、雌二醇、雌激素、雌激素缀合物、贝伐单抗、IMC-1C11、CHIR-258；3-[5-(甲基磺酰基哌啶基甲基)-吲哚-喹诺酮、瓦他拉尼（vatalanib）、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2醋酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x，其中，x=1到2.4]、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特（nilutamide）、醋酸甲地孕酮、CP-724714；
TAK-165、HKI-272、埃罗替尼、拉帕替尼、卡拉替尼（canertinib)、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、Ionafarnib、BMS-214662、替吡法尼；阿米福汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酶、卡介苗（BCG）、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素D、道诺霉素、乙烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫（gleevac）、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特（nilutamide）、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠（porfimer）、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、维甲酸、长春地辛、13-顺式视黄酸、苯丙氨酸氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷（5-deooxyuridine）、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春花碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥单抗、白介素融合毒素（denileukin diftitox）、吉非替尼、硼替佐米（bortezimib）、紫杉醇、伊立替康、拓扑替康、阿霉素、多烯紫杉醇、长春瑞滨、贝伐单抗（单克隆抗体）和爱必妥、不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬（pipendoxifene）、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、吲哚昔酚（idoxifene）、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司（temsirolimus）、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉 素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀（darbepoetin）、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸、强的松、西妥昔单抗、粒细胞-巨噬细胞集刺激因子、组氨瑞林、PEG化干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替伊莫单抗（ibritgumomab tiuxetan）、雄激素、地西他滨、六甲嘧胺、蓓萨罗丁、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、柔红霉素脂质体、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基强的松龙、普鲁氯嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、非格司亭、红细胞生成素、依泊汀α、达贝泊汀α等，以及它们的混合物。
[0147] 在涉及由类风湿性关节炎、疟疾、抗磷脂抗体综合症、狼疮、慢性荨麻疹和干燥（Sjogren′s）病引起的感染、病状和/或病况的方法中，根据本发明的化合物可与另外的传统用于治疗这些病状和/或病况的试剂一起给药。
[0148] 实施例
[0149] 以下实施例解释和描述本发明，但并不旨在以任何方式限制本发明。
[0150] 化合物3（Lys01）的合成。圆底烧瓶中装有4-溴-7氯喹（化合物5）（734mg，3.0mmol）、Pd(OAc)2（23mg，0.1mmol）、BINAP（125mg，0.2mmol）、K3PO4（1.06g，5.0mmol）以及三胺（化合物6）（117mg，1.0mmol）。通过隔片加入二氧杂环乙烷（10mL）。在90℃下，得到的悬浮液在氩气中搅拌18个小时，并冷却。混合物
吸附到
硅胶上，并由闪式柱层析（CH2Cl2/MeOH:90/9/1）纯化，得到黄色固体化合物3（387mg，88%）。熔点199-200℃；
1
Rf=0.28（硅 胶，CH2Cl2/MeOH/NH4OH:90/9/1）：H NMR(500MHz,CDCl3:δ8.53(d,J=5.5Hz,2H),7.94(d,J=2.0Hz,2H),7.41(d,J=9.0Hz,2H),6.98(dd,J=9.0,2.0Hz,2H),6.39(d,J=5.
13
0Hz,2H),5.44(s,2H),3.42(q,J=5.0Hz,4H),2.90(t,J=6.0Hz,2H),2.46(s,9H). C NMR(1
25MHz,CDCl3):δ152.1,149.5,149.1,135.1,128.9,125.5,120.6,117.1,99.3,55.5,42.4+
,40.3FTIR(
薄膜):3215,2917,1609,1579,1449.HRMS-ESI(m/z):C23H24N5Cl2[M+H] 计算值（calcdfor）:440.1409,实验值（found）:440.1406.
[0151] 化合物11（Lys05）的合成。在0℃下，向MeOH（40mL）中的化合物3（896mg，2.04mmol）悬浮液通入HCl气体10分钟，以生成
水溶性的化合物3的盐。在室温下继续搅拌该化合物12个小时。旋转
蒸发除去溶剂，残留物在50℃下
真空干燥过夜，得到黄色固体盐3
1
（1.13g，100%）。熔点270℃（分解）；H NMR(500MHz,D2O):δ8.12(d,J=7.0Hz,2H),7.73(d,J=9.0Hz,2H),7.58(d,J=2.0Hz,2H),7.26(dd,J=9.0,2.0Hz,2H),6.62(d,J=2.0Hz,2H),3.8
13
9(br,4H),3.68(br,4H),3.12(s,3H). C NMR(125MHz,D2O):δ155.8,142.8,140.2,137.2,
128.1,123.8,119.1,114.8,98.7,52.9,42.7,38.2.FTIR(薄膜):3376,3019,2914,1631,16-1 +
12,1215cm .HRMS-ESI(m/z):C23H24N5Cl2[M-3HCl+H] 计算值:440.1409,实验值:440.1408.[0152] 生物试验
[0153] Lys01是比HCQ或CQ更有效的自噬抑制剂。
[0154] 采用Lys01和衍生物Lys02、Lys03、Lys04、HCQ和CQ来处理LN229（人类胶质母细胞瘤）。采用浓度为10μM或更高的Lys01处理的细胞中，在4-24个小时内观察到培养的细胞几乎完全死亡。LC3是一种泛素样蛋白，其存在一种未结合AV膜的形式（LC3I）或结合到AV膜的形式（LC3II）（25）。LC3II/LC3I的比值反应细胞中AV的积聚，从而能产生自噬抑制的效果。LC3免疫印迹（图3）表明浓度为10μM的Lys01是比HCQ或CQ大10倍的更有效的自噬抑制剂。与HCQ或CQ类似，Lys02和Lys03的LC3免疫印迹呈现剂量效应的关系，然而，在Lys01中保留两个氯喹环的Lys04在LC3自噬试验中证明具有中等效力。
[0155] 为进一步表征Lys01在自噬上的效果，采用Lys01或HCQ来处理LN229GFP-LC3细胞。用1μM HCQ处理的细胞中，在处理的4小时内能在少数细胞中观察到荧光点，这些荧光点表示无效自噬小泡的积聚。10μM的HCQ能产生大量的小点，而100μM的HCQ产生更大
密度的小点，表明积聚的自噬小泡的融合。1μM的Lys01处理能产生大量的小点，而用10μM的Lys01处理的细胞中能产生密集的小点，这与在100μM HCQ处理的细胞中观察到的情况类似。用100μM的Lys01处理的细胞，在4小时内全部死亡。每个细胞中GFP-LC3小点的定量表明，与10μM HCQ的处理相比，10μM之间的Lys01处理时，GFP-LC3小点明显增加了5倍。用10μM Lys01处理的细胞中，每个细胞的平均小泡数比用100μM HCQ处理的细胞中要大（图4A）。DMSO、HCQ或Lys01处理的LN229GFP-LC3细胞的电子显微图进一步表征了，由这些试剂引起的自噬阻塞产生的小泡大小和数目上的明显形态学差异。因此，Lys01使用比已知的溶酶体抑制剂HCQ低10倍的浓度时，产生更显著的形态学改变。为了确定Lys01处理是否诱导了新的自噬小泡（自噬诱导剂）的产生或阻碍了自噬小泡的清除（自噬抑制剂），进行巴伐洛霉素钳试验（图4C）。在巴伐洛霉素存在或不存在时，用DMSO、雷帕霉素、10μM HCQ、10μM Lys01处理LN229GFP-LC3细胞。24小时后，与对照细胞相比，雷帕霉素处理使得巴伐洛霉素处理的细胞的LC3II/LC3I比值进一步增加，然而，与对照细胞相比，在巴伐洛霉素处理的细胞中，HCQ或Lys05处理的细胞的LC3II/LC3I比值并没有增加，为Lys01是一种自噬抑制剂提供了进一步的证明（图4C）。
[0156] 为了确定更有效的自噬抑制与细胞毒性的密切关系，采用浓度在0.01-100μM之间的Lys01、Lys02、Lys03、Lys04和HCQ来处理LN229（神经胶质瘤）、1205Lu（黑素瘤）、HT-29（结肠）和c8161（黑素瘤）细胞（图4D）。MTT试验是用于在72小时后评估活细胞的。在4个测试细胞系中，Lys01的IC50是4-8μM（后附表2）。采用浓度为10μM的Lys01处理的1205Lu和HCC827（高度耐受HCQ的细胞系）细胞中，在24个小时后观察到细胞几乎完全死亡。相比之下，单功能的CQ衍生物Lys02（35-91μM）、甲氧基取代氯的双氨基喹啉Lys03（24-53μM）或HCQ（15-42μM）的LC50都一致地比Lys01低效9-30倍。保留二价氨基喹啉环但具有改变的连接基团的Lys04具有中等活性，IC50为10-17μM。这些研究表明，Lys01始终比其他测试的氨基喹啉或HCQ更有细胞毒性。连同LC3的
蛋白质印迹数据一起，这些数据表明，最有效的细胞毒性自噬抑制剂包含两个氨基喹啉环，Lys01中存在三胺连接基团，并且氨基喹啉环的C-7位置被氯取代。
[0157] Lys05的体内自噬抑制和抗肿瘤效力。
[0158] 合成Lys01的三盐
酸化物盐Lys05以提高水溶性，并使其可用于体内研究。Lys01和Lys05在LC3II/LC3I比值中表现相等的剂量依赖性增加，以及自噬货物蛋白p62的积聚（26），并且在MTT试验中具有相同的IC50值（图5A、B）。为研究Lys05的安全性及其体内自噬的效果，对与肿瘤大小相匹配的c8161异体移植采用每日腹腔注射（i.p.）PBS或等摩尔量的HCQ或Lys05（HCQ60mg/kg（138nmoles/g），Lys05 76mg/kg（138nmoles/g））处理48小时。没有老鼠在这种高剂量、短时间的处理下死亡，但是，观察到腹腔注射76mg/kgLys05处理的老鼠，2天后出现弓背和昏睡。使48小时处理的老鼠安乐死，并对肿瘤进行电子
显微镜（EM）检查。形态学上，EM检查表明，Lys05处理的肿瘤中，细胞具有完整的细胞核以及包含大的AV的细胞质膜（图6A）。每个处理组中的两个代表肿瘤中，AV/细胞的平均数定量发现，与对照或HCQ处理的肿瘤相比，Lys05处理的肿瘤中，AV/细胞的平均数显著增加大于2倍（图6B）。与对照或HCQ处理的肿瘤相比，Lys05处理的肿瘤中观察到明显更高的LC3II/LC3I水平，提供了体内自噬抑制的进一步证据（图7A）。48小时处理后，与HCQ或PBS处理的肿瘤相比，表示细胞凋亡的剪切了的半胱天冬酶3（cleaved caspase3）水平在Lys05处理的肿瘤中升高。
[0159] 除了某些胰腺癌的模型（27），在许多的动物肿瘤模型中，高水平的自噬是很可能出现在未处理的肿瘤中的（4、28），采用单个试剂HCQ处理不会削弱肿瘤的生长（29、30）。为了确定更有效的自噬抑制剂，如Lys05作为单个试剂是否显著地削弱肿瘤的生长，在裸鼠的两侧形成1205Lu异体移植。对于慢性治疗实验，选择1205Lu黑素瘤模型优先于c8161异体移植模型，因为c8161异体移植趋于自发地形成溃疡，混淆肿瘤的测量和
安全分析。对于3个处理组，携带与每组肿瘤体积相匹配的1205Lu异体移植的10只老鼠被分配腹腔注射PBS、HCQ60mg/kg或Lys05 76mg/kg（等摩尔量给药），3天的日常处理，2天不处理（3/5天），以允许症状恢复并避免超额毒性。这一处理安排在14天期间内耐受良好。3个组中的每个的肿瘤生长曲线表明，与对照相比，在Lys05处理的肿瘤中，肿瘤生长被明显破坏了。与溶
3
剂处理的对照相比，Lys05处理使得肿瘤的平均每日生长速度降低53%（31.2对14.6 mm/day；p=0.002；图6D）。在HCQ和Lys05处理的肿瘤中，14天处理后观察到AV的明显积聚，但与对照处理的肿瘤相比，Lys05处理的肿瘤的AV/细胞数增加了6倍，而HCQ处理的肿瘤的AV/细胞数增加了3倍（图7B）。在Lys05处理的肿瘤中心可以观察到广泛的肿瘤坏死（图7B）。
[0160] 为了确定低剂量的Lys05是否能产生抗肿瘤活性，5天中的3天对携带HT-29结肠癌异体移植的老鼠进行PBS处理或每日腹腔注射10mg/kg的Lys05、每日腹腔注射40mg/kg的Lys05、或每日腹腔注射80mg/kg的Lys05。仅在80mg/kg的组中观察到临床毒性，8只老鼠中的2只由于肠梗阻在早期被安乐死。每日剂量为10mg/kg和40mg/kg的组耐受良好。采用Lys05处理，以剂量依赖的方式明显地破坏肿瘤的平均每日生长速度（图6E）。与对照相比，肿瘤生长曲线表明所有3种Lys05的剂量都产生明显的肿瘤生长破坏。在实验的最后，切除的肿瘤重量表明，10mg/kg每日剂量的组能观察到明显的抗肿瘤活性（图6G）。14天处理后收获的肿瘤溶解产物对抗LC3的免疫印迹显示，与对照相比，所有Lys05处理的肿瘤中，包括10mg/kg剂量处理的肿瘤的LC3II/LC3I比值明显提高（图7C）。
[0161] 最大剂量给药Lys05时，肠毒类似于自噬基因缺陷。
[0162] 在1205Lu异体移植试验中，5天中的3天腹腔注射76mg/kgLys05处理的单个动物出现昏睡以及弓背（图8A）。Lys05处理的10只老鼠中的3只发展出肠梗阻的体征（图8B）。肠道检查发现膨胀的小肠近端具有假狭窄（pseudostricture）的回肠末端。回肠的
组织学检查显示，没有过度发炎、纤维化或机械性梗阻的迹象，表明在老鼠中观察到的肠梗阻体征是由于假狭窄或功能性肠梗阻。虽然小肠绒毛和隐窝构造是完整的，但是观察到畸形的潘氏细胞（图8C）。潘氏细胞功能不全包括含有嗜酸性溶菌酶的颗粒大小和数目减少，其先前被描述为老鼠自噬缺陷的特殊病征，而一部分的克罗恩氏病患者在必要的自噬基因ATG16L1中具有遗传缺陷。
[0163] 在HT-29剂量探索异体移植试验中，没有在任何剂量组中观察到明显的体重减低（图9A）。14天处理后，从携带HT-29的老鼠上切除整个胃肠道，表明肠壁增厚和肠梗阻仅限于80mg/kg剂量组（图9B）。5天中的3天对HT-29异体移植每日腹腔注射PBS，或每日腹腔注射10mg/kg Lys05、每日腹腔注射40mg/kg Lys05和每日腹腔注射80mg/kg Lys05，处理14天后，从携带该HT-29异体移植的老鼠上切除回肠末端进行组织学检查，表面潘氏细胞形态学上的剂量依赖性作用（图9C）。处理后，潘氏细胞/隐窝没有变化（图9D），而颗粒的大小和数目以剂量依赖的方式下降。尽管毒性体征和症状仅限于80mg/kg的剂量（图9E），但是潘氏细胞功能不全规模的评分（图10）显示在Lys05的所有剂量测试中都观察到潘氏细胞功能不全。在用40mg/kg或80mg/kg，而不是10mg/kgLys05处理的老鼠中，溶菌酶在潘氏细胞中明显降低或不存在（图9F）。综合这些发现，指出Lys05相关的潘氏细胞功能不全呈现ATG16L1缺陷的形象，并且较低剂量的Lys05产生明显的抗癌活性，没有剂量限制性毒性。
[0164] Lys05通过溶酶体的脱酸来抑制自噬。
[0165] 为了比较Lys05相对于HCQ的相对溶酶体的积聚，从采用PBS、10μM HCQ或10μMLys05处理的1205Lu细胞分出溶酶体部分，并且其中1205Lu肿瘤在5天中的3天采用每日腹腔注射PBS、60mg/kg HCQ或76mg/kg Lys05，14天后收获。对抗溶酶体标记LAMP2的免疫印迹证实了，在细胞和肿瘤样品中溶酶体和全细胞群能充分分开（图12A）。采用
10μMLys05或10μM HCQ处理全细胞匀浆24小时后，用HPLC串联质谱分析（MS/MS）测量（图11）其中Lys05和HCQ的浓度，分别是57μM和8μM，表明与HCQ相比，细胞中的Lys05浓度高出6倍。采用10μM Lys05或10μM HCQ处理细胞溶菌体部分后，其中的Lys05和HCQ的浓度，分别是105μM和13μM，表明与HCQ相比，溶菌体中的Lys05浓度高出8倍。细胞和溶菌体中Lys05和HCQ积聚的差异比肿瘤组织中更明显。肿瘤中的全细胞匀浆和溶菌体的Lys05浓度比HCQ分别高出11倍和34倍（图12B）。
[0166] 已经确定了Lys05在溶菌体中积聚比HCQ更有效，考察了这种积聚的功能性效应。用溶剂、Lys05和HCQ处理1205Lu细胞，并用溶酶体红色荧光探针染色（图12C）。30分钟的处理时间内，在浓度为10μM和100μM的Lys05处理细胞中很少观察到溶酶体荧光探针的阳性小点。相反，在用100μM HCQ处理的细胞中观察到溶酶体荧光探针的阳性小点明显减少，但没有在10μM HCQ处理的细胞中观察到溶酶体荧光探针的阳性小点。为理解这一更有效及完全的溶酶体抑制的影响，对1205Lu细胞进行溶剂、Lys05或HCQ处理，并用吖啶橙（AO；一种在血管内所有酸性房室中聚集的染料）在24小时时处理（图12D）。HCQ产生剂量依赖的酸性小泡积聚。相反，Lys05在较低剂量（10μM）时导致酸性小泡的积聚，但在较高剂量（50μM）时，没有观察到酸性小泡，表示血管内系统的完全脱酸化。
[0167] 最后，通过测量酸性磷酸酶的酶活性考察溶酶体脱酸化的功能性结果。1205Lu细胞采用PBS、10μM HCQ或10μM Lys05处理24小时内，与PBS处理的细胞相比，Lys05处理的溶酶体部分中，酸性磷酸酶活性下降43%（图13A）。某些溶酶体酶的
泄漏，如活化的组织蛋白酶会导致不依赖自噬的细胞死亡。与在用PBS、HCQ或Lys05处理1205Lu细胞的24个小时内，与HCQ或PBS处理的细胞相比，Lys05处理的细胞溶酶体中未成熟的组织蛋白酶D到成熟的活化形式的酸性依赖过程减少了（图13B）。14天处理后，在1205Lu异体移植肿瘤中，Lys05处理的肿瘤的非溶酶体性（extralysosomal）酸性磷酸酶活性增加了1.75倍，说明慢性治疗能导致酶的非溶酶体性泄漏（图13C），但在Lys05处理的肿瘤全细胞匀浆中没有观察到组织蛋白酶D的酸性依赖增加过程（图13D）。这些结果表明，高剂量的Lys05通过溶酶体的去酸化导致溶酶体的功能不全，导致溶酶体酶的破坏，以及有效的自噬抑制，而高剂量的HCQ不完全地使溶酶体脱酸，导致与较少细胞死亡相关的不完全自噬抑制。
[0168] 另外的化合物Lys06-Lys18。合成并测试了另外的Lys01衍生物（图14、图15）。在72个小时的MTT试验中，与HCQ或CQ相比，化合物Lys01-Lys13化合物的IC50展示出升高或降低的活性（表1，图16）。在大多数的情况下，Lys01的衍生物比CQ或HCQ更有效。
这些发现进一步完善深入Lys01衍生物的药物开发的出发点。
[0169] Lys01衍生物在疟疾中的活性。表2、图17示出了Lys01衍生物在人类癌细胞LN229中诱导细胞死亡的IC50值，以及在人类RBC中体外生长的若干恶性疟原虫（P. Falciparum）中的IC50值。Lys01衍生物具有类似的抗癌活性和疟疾细胞毒性。在许多抵抗CQ的细胞系中，Lys01比青蒿琥酯更有效。
[0170] 结论
[0171] 潜在的商业用途和应用：Lys01和Lys05是先导化合物，其效力进一步用于新型自噬抑制剂具有巨大优化潜力。自噬抑制是癌症的新型治疗策略，其可用于任何癌症。在癌症病人中现存超过30种HCQ试验，涉及几乎所有肿瘤类型。由于HCQ的低效力和差的药理作用，在人类中或许不会得到有前景的在实验室模型中观察到的抗癌治疗的提升。一优化的Lys01衍生物能开发出第二代自噬抑制剂。使用LD30剂量的Lys05时观察到的与潘氏细胞功能不全相关的GI毒性支持药物的作用机理，以及还暗示通常与潘氏细胞存在相同特征的结肠癌可能是一种对Lys05和其优化的衍生物特别敏感的癌症类型。另外的值得研究的癌症包括黑素瘤以及非小细胞肺癌，因为相对于HCQ，黑素瘤细胞系展现出最大不同的Lys01敏感性，而EGFR突变的肺癌细胞系对HCQ和Lys05都显示出敏感性。将Lys01的合成设计成与其他申请
专利和/或公开的氨基喹啉化合物没有重叠。计划下一步的机理研究是确定药效学试验来指导药物开发。药物代谢动力学研究计划最初在老鼠体内进行。
[0172] 其他类似的技术和竞争产品：用作抗癌剂的新型氯喹衍生物是研究的热点区（16）。自噬已被鉴定为十大研究领域之一，其中NIH将是未来几年的研究方向。迄今为止，没有研究如本发明人在本文提供的那样对二价的潜力进行评价（leveraged）。此外，大多数的研究缺乏如本文报道的体内研究和机理研究，其能指导用于药物开发的优化先导化合物的进一步开发。
[0173] 与其他类似技术和产品相比的优势：因此，本申请显示了，公开的一系列双氨基喹啉是有效的自噬抑制剂，其在体内肿瘤模型中具有单药（single agent）抗肿瘤活性。
[0174] 参考文献
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