【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エイコサペンタエン酸トリグリセリド及びその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ω−３系高度不飽和脂肪酸は、サバ、イワシなどの魚油等の海産食品に多く含まれ、これが人体に摂取され、コレステロールの低下、抗血栓症などに有用な物質として健康食品として利用され、医学的な応用にも注目されているが、酸化され易く、変質、劣化し、非常に高価なものである。 又、そのエチルエステルは知られているが、トリグリセリドより生理活性が劣るとされている。 ω−３系高度不飽和脂肪酸を摂取するには、トリグリセリドが理想的であるとの報告がある。
（Ｃａｒｏｌ Ｍ．Ｈｏｊｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０８１
（１９９１）３３〜３８） 更に一方、エイコサペンタエン酸、リノレン酸などのトリグリセリド混合物のω−３系高度不飽和脂肪酸濃縮物も公知であるが、オレイン酸、リノール酸などのω−６
系高度不飽和脂肪酸トリグリセリドが含まれているため、脂肪過多の患者には、純粋なω−３系高度不飽和脂肪酸トリグリセリドが必要である。 又、リパーゼによる高度不飽和脂肪酸のグリセリド合成について検討され、
その研究報告がある。 〔第２９回油化学討論会・油化学研究発表会講演要旨集Ｐ１９２（１９９０）〕。 これによれば、リパーゼＴＯＹＯ、リパーゼＯＦの２種類のリパーゼを夫々の酸素液に使用し、α−リイレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの各高度不飽和脂肪酸単独とグリセリンとを各酵素と反応させてその夫々のグリセリドを合成したものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来の技術では、固定化リパーゼによりωー３系高度不飽和脂肪酸のトリグリセリドを高濃度に収得することができなかった。 即ち、前記に報告されたグリセリドの合成法によっても、その固定化リパーゼを最適条件下においてさえ、而もその生産物中に食用に適さない遊離脂肪酸を１
０〜２０％含んでいる。 その上、リパーゼＴＯＹＯでは２６〜３８％の、リパーゼＯＦでは１８〜３３％のトリグリセリドの合成率しか達成できず、これでは、そのトリグリセリドを単品とすることができず、機能性食品その他の分野に、例えば、医学用に、食品への添加物などとして利用する製品として得ることができない。 特に、
ω−３系高度不飽和脂肪酸として代表的なエイコサペンタエン酸のトリグリセリドを高収率に製造でき、又単離することができることが望まれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記従来の課題を解決し、上記の要望を満足したもので、機能性食品などとして極めて有効なエイコサペンタエン酸トリグリセリドを提供したもので、下記の化学構造式で示され、
且つ添付図面の図１及び図２に示す^−１ ＨＮＭＲスペクトラム及び図３に示すＦＴ一ＩＲスペクトラムを有する。

【０００５】

【化１】

【０００６】更に、本発明は、上記のエイコサペンタエン酸トリグリセリドを高収率に得る製造法に係り、エイコサペンタエン酸とグリセリンとを所定の割合で混合して基質を調製し、該基質と固定化リパーゼとの接触反応とその反応液の脱水処理とを同時に行うことを特徴とする。

【０００７】

【作用】本発明の上記物質は、エイコサペンタエン酸エチルエステルより吸収性が良好であった。 本発明の上記物質の製造法によれば、該基質を固定化リパーゼと反応させると同時に脱水処理を行うので、７０％以上のエイコサペンタエン酸トリグリセリドを含む反応生成物が得られるので、工業生産が可能となり、又、これから夾雑物を除去して９９％の純度の該エイコサペンタエン酸トリグリセリドを得ることができる。

【０００８】上記の製造法において、該エイコサペンタエン酸トリグリセリドを高収率に得る好ましい条件は、
基質として、該エイコサペンタエン酸に対し９〜１１重量％のグリセリンから成るものが好ましい。 又、固定化リパーゼの初期含水量は、１．３〜８．３％であり、該基質の初期水分濃度は、約５０〜８０００ｐｐｍであり、反応温度は４０℃以上、一般に３０〜６０℃である。 又、脱水処理は、真空脱水方式又は乾燥不活性ガスの通気方式で行い、これにより反応系内を１０００ｐｐ
ｍ以下の水分濃度の超微水系を保持するようにすることであり、この場合、固定化リパーゼとして、ムコール属又はキャンディダ属のリパーゼが特に最適である。 尚、
上記の反応生成物からのエイコサペンタエン酸トリグリセリドの分離、精製は、該反応生成物を塩基性アルミナカラム或いはシリカゲルから成る液体クロマトクラフを用い、夾雑物を除き、その溶出液を蒸発することにより遂行され、純度９９％の精製品が得られる。

【０００９】

【実施例】次に本発明の実施例を詳述する。 原料として、従来法など所望の方法で単離した或いは市販のエイコサペンタエン酸とグリセリンを用意する。 その両者の配合割合は、通常、化学量論量又はその付近である。 通常エイコサペンタエン酸に対し９〜１１重量％のグリセリンを配合した基質を調製する。

【００１０】該基質に作用させる固定化リパーゼは、初期含水量１．３〜８．３％が好ましく、又該基質の初期水分濃度は、約５０〜８０００ｐｐｍが好ましい。 固定化リパーゼとしては、リパーゼＳＰ３８２（Ｃａｎｄｉ
ｄａ属リパーゼを固定化したもの）、リパーゼＡ（Ａｓ
ｐｅｒｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ． ）を固定化したもの、リパーゼＴＯＹＯ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖ
ｉｓｃｏｓｕｍ）を固定化したもの、ムコール属のリパーゼ、例えば、リポザイムＩＭ６０（Ｍｕｃｏｒ ｍｉ
ｅｈｅｉのリパーゼを固定化したもの）などが使用できるが、好ましくは、ムコール属又はキャンディダ属のリパーゼを固定化したものである。 該リポザイム及びリパーゼＳＰ３８２はノボ社製のものであり、水分含有量が１００ｐｐｍ以下で活性を維持できる。 リパーゼの種類によっては、レシチンやポリオールなどの存在下にリパーゼを固定すれば、超微水系でも活性が維持できる。

【００１１】かくして、該基質を該固定化リパーゼに作用させるのであるが、この場合、適宜の装置が使用できる。 又、先に発明者が特願平２−３０７２１４号で提示した「高酸価油の精製法」で用いた各種の装置が利用できる。 即ち、その所望の装置を使用して、該基質を該固定化リパーゼと接触反応させるが、この場合、同時にその反応液の脱水処埋を行うことが重要であり、これにより約７０〜８０％の高含有のエイコサペンタエン酸トリグリセリドを合成することができる。

【００１２】この合成を確保するには、その脱水速度は、該エイコサペンタエン酸の減少速度の１００．１％
以上になるように脱水し乍ら、反応液を固定化リパーゼに繰り返し接触させるようにすることにより、反応と脱水処理を連続的に行うことが良い。 この脱水処理を行うには、真空脱水方式或いは乾燥不活性ガスの通気である。 而して、その反応系内を１００ｐｐｍ以下の水分濃度に保持するように脱水処理を行うことが好ましい。

【００１３】尚、この場合の反応温度は、４０℃以上、
一般に３０〜６０℃の範囲とし、これにより、酵素反応の効率性が特に良い。 最適温度は４０〜６０℃である。
かゝる温度範囲で目的とする生産物、該エイコサペンタエン酸トリグリセリドの二重結合の移動などを防止することができる。 装置は、クローズト型連続製造装置が好ましく、リアクター内の酸素を、窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換し、大気中の酸素が反応物質に触れないように、不活性ガス雰囲気下で反応させることが好ましく、これにより、過酸化物価の上昇が防止される。

【００１４】次に、更に詳細な実施例につき説明する。 ［実施例１］容器中の大気を窒素で置換した反応容器に、エイコサペンタエン酸０．３ｇとグリセリン０．０
３０５ｇ及び固定化リパーゼＳＰ３８２を０．０３ｇ加え、１０ｍｍＨｇ程度まで真空乾燥し、６０℃で振とう反応させた。 エーテル・エタノールで反応を停止させ、
反応生成物をＧＰＣカラムを装備した高速液体クロマトグラフで測定した。 反応４６時間の該反応生成物には、
７５．２％のエイコサペンタエン酸トリグリセリドが得られた。 残りは、２２．３％のエイコサペンタエン酸ジグリセリド及び２．５％のエイコサペンタエン酸モノグリセリドであった。

【００１５】［実施例２］容器中の大気を窒素で置換した反応容器に、エイコサペンタエン酸１ｇとグリセリン０．１ｇ、リポザイムＩＭ６０を０．０５ｇ加え、７５
０ｍｍＨｇ程度脱気し真空乾燥し乍ら、６０℃で振とう反応した。 ５ｍｌのエーテル−エタノール（１：１）に４滴の反応生成物液をとり反応を停止させた。 該反応停止させた反応生成物をＧＰＣカラムを装備した高速液体クロマトグラフで測定した。 反応時間４８時間の該反応生成物には、８１％のエイコサペンタエン酸トリグリセリドが検出され、残りはエイコサペンタエン酸ジグリセリドであった。 反応７２時間では、エイコサペンタエン酸トリグリセリド８３％、エイコサペンタエン酸ジグリセリド１７％であった。 ［実施例３］容器中の大気を窒素で置換した反応容器に、エイコサペンタエン酸０．５ｇとグリセリン０．０
５ｇ、リポザイムＩＭ６０を０．０５ｇ加え、７５０ｍ
ｍＨｇ程度脱気し真空乾燥し乍ら、４０℃で振とう反応した。 反応時間９４時間のサンプルには、７６％のエイコサペンタエン酸トリグリセリドが検出され、残りはエイコサペンタエン酸ジグリセリド２０％、エイコサペンタエン酸４％であった。 反応１９２時間では、エイコサペンタエン酸トリグリセリド８３％、エイコサペンタエン酸ジグリセリド１７％であった。

【００１６】一般に、このように本法の処理により、約７０〜８５％のエイコサペンタエン酸トリグリセリドを含有する反応生成物が得られ、夾雑物として大部分がエイコサペンタエン酸ジグリセリド、エイコサペンタエン酸モノグリセリド、微量の過酸化物である。 かゝる反応生成物を下記のようにして９９％の高純度のエイコサペンタエン酸トリグリセリドの精製品が得られる。

【００１７】上記の反応を停止させた反応生成物をエーテルに溶かし、塩基性アルミナカラムから成る液体クロマトグラフにより該夾雑物を吸着除去する一方、エイコサペンタエン酸トリグリセリドを溶出し、その溶出液を蒸散させて高純度の９９％の精製品を得た。 或いは、該反応生成物をヘキサンに溶かし、シリカゲルカラムから成る液体クロマトグラフにより、該夾雑物を吸着させた後、ヘキサンとエーテル（９５：５）混液で溶出させ、
その溶出液を蒸散させて９９％の高純度の精製品を得た。

【００１８】次に、その精製法の実施例を詳述する。 実施例２で得られた反応生成物をジエチルエーテルに溶かし固定化酵素を濾別した後、塩基性アルミナカラムにかけた。 塩基性アルミナカラムは、活性度を調節したアルミニウムオキシド９０（メルク 製品番号１０７６）を４ｇ充填したもので３本用意し、３度のクロマトを行つた。 溶出液は、窒素を吹き込んでエーテルを飛ばし、アルゴンガス中−６０℃で保存した。 得られたエイコサペンタエン酸トリグリセリドは、キャピラリーガスクロマトグラム（ＷＣＯＴ ＣＰ−Ｓｉｌ８８）及びＨＰＬＣ
カラム（Ｓｈｏｄｅｘ ＧＰＣ ＫＦ−８０２ ３００
×３）にて純度が９９％以上であることを確認した。

【００１９】この精製品につき、 ^１ ＨＮＭＲ（ＪＥＯＬ
ＪＮＨ−ＧＳＸ５００型）及びＩＲ分析（ＪＥＯＬ
ＪＩＲ−１００）を行った。 その結果は図１及び図２及び図３の如くである。 即ち、図１示のＮＭＲスペクトルのメインピークａ−ｈと図１示の化学結合との帰属関係がエイコサペンタエン酸トリグリセリドと完全に一致することが解る。 ピークの大きさから判定される水素原子数は、ｆ，ｇの大きさを４，０００として計算すると、
これも理論値とほぼ一致した。 更に詳述すれば、エイコサペンタエン酸トリグリセリドのＣＤＣＬ _３を溶媒とした^１ ＨＮＭＲではメインピークは図２示の如くである。
即ち、化学シフトδ５．３７，４．２９，４．１５，
２．８４，２．８０，２．３３，２．０８，１．６９，
０．９７ｐｐｍにピークがあり、それらの帰属は図１の如くである。 一方、ＮａＣｌ板に塗布したＦＴ−ＩＲスペクトルでは図３の如く、３０１２ｃｍ ^−１にＣＨの吸収、１７４５ｃｍ ^−１にエステルＣ＝０の吸収、１６５
３ｃｍ ^−１にＣ＝Ｃの吸収、１１４４ｃｍ ^−１にＣ−０
の吸収があり、これらの存在が確認された。 尚、プロトンピーク面積強度は、下記表１の通りであった。

【００２０】

【表１】

【００２１】表１より明らかな如く、ｆ＋ｇを基準とするとその他のピークは１〜３％理論値より弱い。 積分強度の理論誤差は、通常数〜５％以下と考えられるので、
この範囲は誤差の範囲内であることが判る。 以上の測定結果より、該精製品は、化１に示す構造式を有するエイコサペンタエン酸トリグリセリドであることを特定した。

【００２２】更に、該精製品は、下記の構造と理化学特性を有する。 即ち、その元素組成は、炭素、酸素、水素である。 ガスクロマトグラフィーのキャピラリーカラムによる溶出パターンより構成脂肪酸は、エイコサペンタエン酸のみである。 又、高速液体クロマトグラフィーのＧＰＣカラム（ケルパーションカラム）による溶出位置及びＮＭＲのプロトン強度と帰属から推定される構造式より、分子量は９４５．４である。 −４０℃においても液体状態であり、ヘキサン、エーテル、アセトンに可溶な無色透明な物質であり、塩基性アルミナカラムを素通りするので、中性を示す脂肪である。 シリカゲル薄層クロマトグラフィーのスポットは、ヨウ素蒸気下で褐色に発色する。

【００２３】

【発明の効果】このように本発明により得られるエイコサペンタエン酸トリグリセリドは、精製品であるから、
エイコサペンタエン酸の生理機能の研究、コレステロールの低下、抗血栓症などの循環器系疾病の予防、医学実験用などに有効であり、又、更にその生埋的活性が解明されることにより、医薬品としての利用の可能性を有し、更に又、その所定量を食品などに機能性食品として適確に添加でき、又必要に応じ、又、ωー６系高度不飽和脂肪酸トリグリセリドとのバランスをとるなどに有用であるなどの効果を有する。 更に、本発明の製造法によれば、エイコサペンタエン酸とグリセリンの所定割合から成る基質を固定化リパーゼにより反応させると同時に、該反応液の脱水処理を行うようにしたので、著しく高収率にエイコサペンタエン酸トリグリセリドを製造することができる効果を有する。 而して、かゝるエイコサペンタエン酸トリグリセリドを高濃度に含有する反応生成物が得られるので、これから夾雑物を分離し、生成することが容易で、９９％の高純度の精製品が得られる効果を有する。 更に、上記の製造法において、基質として該エイコサペンタエン酸に対し９〜１１重量％のグリセリンを配合した基質を使用し、固定化リパーゼにより、
特に、ムコール属又はキャディダ属のリパーゼにより、
３０〜６０℃の温度で反応させると共に脱水処理を反応系内が１００ｐｐｍ以下の超微系を維持するように行うときは、上記の高収率の生産が適確に得られ、又その精製法として、液体クロマトグラフによる夾雑物の除去する一方、該エイコサペンタエン酸トリグリセリドの溶出を行うとき、高能率に９９％の精製品が得られる効果をもたらす。

【図面の簡単な説明】

【図１】及び

【図２】 エイコサペンタエン酸トリグリセリドの^１ Ｈ
ＮＭＲスペクトラム及びそのメインピークの帰属を表す図である。

【図３】 エイコサペンタエン酸トリグリセリドのＦＴ
−ＩＲスペクトラムの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 白木 勝 茨木県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 東 直輝 千葉県船橋市日の出２丁目17番１号 ボー ソー油脂株式会社内