新丙酮酸转移酶
阅读：195发布：2020-05-08
专利汇可以提供新丙酮酸转移酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新丙 酮 酸 转移酶。当使用本发明的新酶时， 微 生物 的生物量和 代谢物 的产量可以增加，使得通过大量生产具有增加的生长特征的微生物，可以增加生物量、目标 蛋白质 或 生物柴油 的生产效率，并且通过降低生物 能源 的生产 费用 ，可以预期产业发展。，下面是新丙酮酸转移酶专利的具体信息内容。
1.一种丙酮酸转移酶，其包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的丙酮酸转移酶。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列或SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
4.一种载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的载体，其还包括用于过表达所述核酸分子的启动子。
6.一种转化子，其包含权利要求4或5所述的载体。
7.具有提高的生物量或脂质生产能力的三角褐指藻CCMP632 PtPTP-OE11(KCTC
13253BP)；或三角褐指藻CCMP632 PtPTP-OE16(KCTC 13254BP)。
8.一种生产生物量的方法，所述方法包括培养权利要求6所述的转化子。
9.一种用于生产生物量的组合物，其包括选自由以下组成的组中的一种或多种：由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的丙酮酸转移酶和编码所述丙酮酸转移酶的核酸分子。
10.一种转化微生物的方法，所述方法包括将编码包含SEQ ID NO：1的序列的丙酮酸转移酶的核酸分子；和用于过表达所述核酸分子的启动子导入到微生物中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述核酸分子和所述启动子插入到表达载体中。
12.一种生产生物柴油的方法，所述方法包括培养权利要求6所述的转化子。
新丙酮酸转移酶
技术领域
背景技术
[0002] 微藻具有诸如光合作用的细胞内反应机制，因此是基础研究的对象，最近还作为先进生物燃料(如生物柴油和其它碳氢化合物)的下一代原料备受瞩目(Kilian等人,2011)。与地面农作物相比，微藻的优点在于它们不需要耕作地，并且很多种类可在含有污水或盐分的水中环境栽培。
[0003] 但是，从未经改良的野生微藻经济地生产生物燃料具有一定的局限性。克服这些局限性的最佳工具之一需要强有力的分子生物学工具，因此，正在进行对此的研究(Radakovits等人,2010)。长久以来，大部分的分子生物学遗传学研究在绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)上进行。因此，转基因表达和基因敲除等分子生物学方法大部分是针对莱茵衣藻物种开发的。
[0004] 最近，备受工业应用关注的硅藻或其它微藻的研究工具正在快速开发(Radakovits等人2010)。利用营养限制、异养生长条件、基因工程等各种工具，关于微藻中生物量增加引起的有用脂质含量的增加的研究正在踊跃出现。到现在，关于通过基因改造技术使用有用基因来改变微藻中生物量或脂质含量来开发生物燃料，正在持续获得积极研究成果(Kilian等人,2011；Kranz等人,2013)。
[0005] 因此，有关微藻的生长和培养的各种考虑事项中，商业上重要的是，仍然需要开发用于基因工程修饰的新蛋白质、载体或转化子，以开发能够在对外开放的池塘或不开放的光生物反应器(photobioreactor)中增加生物量产量或脂质含量，即，具有理想的生长特征的微藻。
发明内容
[0006] 技术问题
[0007] 因此，鉴于上述问题而完成了本发明，本发明的目的之一在于提供一种新丙酮酸转移酶。具体地，新确定了源自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的丙酮酸转移酶及编码所述丙酮酸转移酶的基因，所述丙酮酸转移酶能够控制丙酮酸(已知丙酮酸是非常重要的代谢物如脂肪酸、萜类化合物、氨基酸的前体，存在于质体中且参加生物合成)的转移，从而影响微藻中生物量或代谢物产量增加。因此，本发明的另一个目的是提供包括上述基因的载体、包括上述载体的转化子以及利用上述转化子生产生物量或生物柴油的方法。
[0008] 技术方案
[0009] 为了达到上述目的，为了利用微生物在生物合成过程中提高微生物的生物量或代谢物的合成，本发明人持续进行研究。结果，新确定了在微生物的代谢过程中起到重要作用的新丙酮酸转移酶。具体地，通过具体实验确认了利用新确定的丙酮酸转移酶可以增加微藻的脂质含量及生物量的产量。将编码丙酮酸转移酶的核酸分子插入到过表达载体中以构建转化子。确认了转化的微藻中生物量及脂质含量被提高，从而完成了本发明。
[0010] 在该方面，本发明提供了丙酮酸转移酶，其包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[0011] 另外，本发明还提供了编码上述丙酮酸转移酶的核酸分子。
[0012] 另外，本发明还提供了包括上述核酸分子的载体。
[0013] 另外，本发明还提供了包括上述载体的转化子。
[0014] 另外，本发明还提供了一种生产生物量或生物柴油的方法，所述方法包括培养上述转化子。
[0015] 另外，本发明还提供了一种用于生产生物量的组合物，所述组合物包括选自由以下组成的组中的一种或多种：包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的丙酮酸转移酶和编码上述丙酮酸转移酶的核酸分子。
[0016] 另外，本发明还提供了一种转化微生物的方法，所述方法包括将包括SEQ ID NO：1的序列并编码丙酮酸转移酶的核酸分子；和用于过表达所述核酸分子的启动子导入到微生物中。
[0017] 有益效果
[0018] 从前面的描述中可以明显看出，通过使用本发明的新酶，可以增加微生物的生物量产量及代谢物产量。因此，通过大量培养具有提高的代谢特征的微生物，可以提高目标物质的生产力和生物柴油的生产效率，并降低生物能源的生产费用，这可能有利于产业发展的效果。附图说明
[0020] 图2显示根据本发明的一个实施例，在JGI网站分析预测为源自三角褐指藻的丙酮酸转移酶的蛋白质序列的结果。
[0021] 图3显示根据本发明的一个实施例，基于JGI基因组分析，为了确认是否从预计的基因生成了RNA而进行的PCR的结果。
[0022] 图4a显示根据本发明的一个实施例制造的丙酮酸转移酶的重组过表达载体的示意图。
[0023] 图4b显示根据本发明的一个实施例的质粒结构的PCR结果。
[0024] 图5显示为了确认外来基因是否成功插入根据本发明的一个实施例制造的转化子的PCR结果。
[0025] 图6显示根据本发明的一个实施例制造的转化子中插入基因(PtPTP)的mRNA表达水平。
[0026] 图7显示根据本发明的一个实施例制造的转化子的生长曲线。
[0027] 图8显示根据本发明的一个实施例制造的转化子中的生物量及脂质含量。
具体实施方式
[0028] 本发明可加以各种改变，可具有各种实施例，因此将在书面描述中详细描述特定实施例。然而，这并不旨在将本发明限制为特定的实践模式，并且应当理解，不脱离本发明的精神和技术范围的所有改变、等同物和替代物均包含在本发明中。
[0029] 以下，对本发明进行详细说明。
[0030] 本发明提供了源自微藻的新丙酮酸转移酶。
[0031] 在本发明中，“丙酮酸转移酶(丙酮酸转移酶(pyruvate transporter)；或丙酮酸转移蛋白(pyruvate transporter protein))”指参与丙酮酸向质体递送的蛋白质。多数起到丙酮酸转移功能的蛋白质存在于C4植物中，但硅藻(如三角褐指藻)中是否存在丙酮酸转移酶尚不知晓。本发明的发明人努力寻找源自硅藻的转移酶，结果，通过三角褐指藻的基因组分析，确定了丙酮酸转移酶的氨基酸序列及编码所述氨基酸序列的核酸分子序列，并将该蛋白质命名为丙酮酸转移酶质体-型蛋白(pyruvate transporter plastid-type protein,PtPTP)。另外，通过实验确认，当将所述转移酶插入到微生物(例如微藻)中并在其中过表达时，转基因微生物的生物量和脂质含量与野生型相比提高约20％或更多。
[0033] 本发明的丙酮酸转移酶可以包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。另外，本发明的丙酮酸转移酶包括功能等同物。作为氨基酸的添加、取代或缺失的结果，“功能等同物”与SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列具有至少70％，优选80％以上，更优选90％以上，甚至更优选95％以上的序列同源性。“功能等同物”指具有与SEQ ID NO：1表示的蛋白质基本相同的生理活性的蛋白质。“基本相同的生理活性”指微生物中转移丙酮酸的活性。
[0034] 优选地，本发明的新丙酮酸转移酶可以具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[0035] 本发明中提到的丙酮酸转移酶包括利用编码丙酮酸转移酶的核酸分子制造的重组蛋白质以及从三角褐指藻中分离并纯化的蛋白质。
[0036] 在该方面，本发明提供了编码丙酮酸转移酶的核酸分子。
[0037] 在本发明中，“核酸分子”涵盖DNA(gDNA及cDNA)分子和RNA分子。核苷酸是核酸分子的基础组成单位，它可以是天然核苷酸，或者是具有修饰的糖或碱基位点的其相似物。
[0038] 根据本发明的一个实施例，本发明的核酸分子可以包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列或SEQ ID NO：3的核苷酸序列。SEQ ID NO：2的核苷酸序列是从本发明的丙酮酸转移酶获得的cDNA，SEQ ID NO：2的核苷酸序列是通过三角褐指藻的基因组分析获得的gDNA。
[0039] 在不影响丙酮酸转移酶的活性或功能的范围内，本发明的蛋白质或核酸分子可能具有突变。另外，本发明的丙酮酸转移酶或编码它的核酸分子不限于附件的序列表中记载的氨基酸序列或核苷酸序列，这是本领域技术人员所熟知的。具体来说，核苷酸的突变可能不会引起蛋白质的变化。这种核酸可包括核酸分子，所述核酸分子包括功能上等效的密码子或编码相同氨基酸的密码子(例如，因密码子的简并性，精氨酸或丝氨酸有六个密码子)或编码生物学上等效的氨基酸的密码子。另外，本发明甚至可以包括可以改变丙酮酸转移酶蛋白质本身的核苷酸突变，只要能够获得具有与本发明的丙酮酸转移酶的功能或活性几乎相同的蛋白质。
[0040] 因此，与编码本发明的丙酮酸转移酶的核酸分子的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列被解释为包括在本发明的范围内。“基本上相同的”序列指当将某一序列与本发明的序列比对以与之最大限度地对齐，并利用本领域常用的算法分析比对的序列时，显示至少80％同源性，优选90％同源性，最优选98％同源性的序列。这种序列比较可以使用本发明中通常已知的用于序列比较的比对方法和算法进行。
[0041] 上述核酸分子可以是包括编码丙酮酸转移酶的核酸分子的基因构建体。在本发明中，术语“表达构建体”被定义为仅包括在细胞内表达蛋白质所用的最小要素(elemnet)的核酸分子。本发明的表达构建体另外包括限制酶识别序列，用于克隆与其启动子序列可操作地连接的编码外来蛋白质的核苷酸序列。本发明的表达构建体中所包括的限制酶识别序列的限制酶不特别限制，包括例如但不限于EcoRI、EcoRII、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinfI、Sau3A、PovII、SmaI、HaeIII、HgaI、AluI、EcoRV、EcoP15I、KpnI、PstI、SacI、SalI、ScaI、SpeI、SphI、StuI、XbaI等。在本发明中，“可操作地连接”指核酸表达控制序列(如启动子序列)和其它核酸序列之间的功能性连接。通过该功能性连接，控制序列可以控制其它核酸序列的转录及/或翻译。在本发明中，外来蛋白质的实例包括为了藻(algae)的有益转化可表达的任何蛋白质，不做特别限制。本发明的表达构建体可以包括作为转录终止序列的多腺苷酸化序列。
[0042] 本发明还提供了一种载体，其包括编码丙酮酸转移酶的核酸分子。
[0043] 本发明的载体系统可以通过本领域已知的各种方法构建。方法的具体实例描述于Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)，该文献通过引用并入本文。
[0044] 在本发明中，“载体”可以与“转化载体”、“表达载体”等互换使用，指重组DNA分子，其包括所需的编码序列和在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列时必需的适当核酸序列。所述适当核酸序列可以是启动子，此外还可以包括增强子、转录终止子、腺苷化信号等。
[0045] 本发明的丙酮酸转移酶源自真核细胞，因此考虑到培养便利性，可以将真核细胞作为宿主。真核细胞中可利用的启动子、增强子、转录终止子及多腺苷化信号是本领域已知的。上述载体可以是其中插入了上述基因的碱基序列的表达载体，因此可以将载体直接导入到真核细胞中。
[0046] 同时，本发明的载体包括本领域常用的抗生素抗性基因，作为选择标记。例如，存在对博来霉素(Zeocin)、氨苄西林、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素、腐草霉素(phleomycin)及四环素具有抗性的基因。另外，本发明的表达载体可以另外地包括编码报道分子(如，荧光素酶及β-葡糖苷酸酶)的基因。
[0047] 上述载体的目的可以是在转化子中过表达丙酮酸转移酶或编码它的核酸分子。当微生物过表达本发明的丙酮酸转移酶时，可以增加代谢物的生产。例如，当微藻过表达丙酮酸转移酶时，丙酮酸向质体的转移增加，因此微藻的生物量和微藻中的脂质含量可能增加。因此，在生产生物柴油等的微藻培养中可以大幅提高生产效率。另外，可以将本发明的丙酮酸转移酶插入到酵母、细菌等微生物中以增加代谢物，从而增加目标物质的生产。
[0048] “过表达”指诱导目标蛋白质或基因的表达高于野生微生物中的水平。可以利用各种已知的方法进行过表达，不做特别限制。
[0049] 例如，可以诱导位于结构基因上游的核糖体结合部位或启动子及调控区域突变或将其导入，以增加适当基因的拷贝数量，并且其中导入了结构基因上游的表达盒可以按在结构基因中的相同方式起作用。另外，编码本发明的丙酮酸转移酶的核酸分子诱导性启动子可以增加核酸分子的表达，或者可以通过延长mRNA的寿命的方法来增加核酸分子的表达。另外，可通过改变培养基的组成和/或培养技术来过表达核酸分子。
[0050] 用于过表达的启动子可以是本发明的技术领域中公知的。例如，可以使用用于开发微藻转化子的岩藻黄质叶绿素a/c结合蛋白(fucoxathin chlorophyll a/c binding protein)基因启动子，或针对微藻中外来基因的非-光周期性表达的Ef2启动子(KR10-1646991的内容作为参考包括在内)，但本发明并不仅限于此。
[0051] 因此，根据具体的实施例，本发明的载体还可以包括用于过表达编码丙酮酸转移酶的核酸分子的启动子。具体地，使用开发用于操作启动子来非-光周期性表达外源基因的转基因载体(pPhaT-EF2)，构建了能够诱导丙酮酸转移酶过表达的转基因系统，并利用该转基因系统生产了转化子。另外，通过实验确认了转化子中的过表达。
[0052] 在该方面，本发明提供了一种转化子，其包含包括编码丙酮酸转移酶的核酸分子的载体。
[0053] 在本发明中，“转基因”指使外来基因(其不同于细胞中的天然基因)的DNA链片段或包括外源基因的质粒穿透到细胞中并与细胞中的天然DNA结合，从而改变天然DNA的遗传特质的分子生物学技术。在本发明中，转基因是指将编码丙酮酸转移酶的核酸分子与载体一起插入到微生物，优选微藻内的过程。因此，转化子可以是微藻。
[0054] 将载体转移到受试细胞的方法可以利用本发明的技术领域中已知的方法，如CaCl2方法(Cohen,S.N.等人,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973))、Hannahan方法(Cohen,S.N.等人,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973)；和Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))、电穿孔方法(Dower,W.J.等人,Nucleic.Acids Res.,16:6127-6145(1988))和微粒传递方法(Seo等人2015)。
[0055] 注入到微生物内的载体可以在微生物内表达，也可以诱导过表达。在这种情况下，微生物内的丙酮酸转移变得活跃，导致活跃地产生代谢物。
[0056] 在本发明中，待转化的微生物可以是细胞，优选原核细胞或真核细胞。因此，转化子还可以被称为重组细胞或重组微生物。微生物可能更优选酵母、大肠菌或微藻。当在微藻中诱导丙酮酸转移酶的过表达时，向质体的丙酮酸转移变得活跃，从而增加微藻内的脂质含量和生物量产量。另外，当将本发明的丙酮酸转移酶导入到酵母、大肠菌或微藻等微生物内时，微生物的代谢变得活跃，从而目标物质的产量通过代谢而增加。目标物质指通过培养其中导入了本发明的丙酮酸转移酶的微生物而生产的物质。例如，目标物质可以是通过导入外来基因而生产的蛋白质、多肽等，或者可以是通过微生物的代谢过程而获得的脂肪酸。因此，转化子可以是转基因的酵母、大肠菌或微藻。
[0057] 根据本发明的一个实施例，本发明人构建了一种重组载体，其中插入了编码丙酮酸转移酶的基因；和用于诱导丙酮酸转移酶的过表达的启动子，并把该重组载体注入到三角褐指藻中。结果，通过2步选拔，确定了两种PTP基因过表达转化子——三角褐指藻CCMP632 PtPTP-OE11和三角褐指藻CCMP632PtPTP-OE16，于3月21日把它们保藏到韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，分别被给予保藏编号KCTC 18558P和KCTC 18559P。2017年4月24日，再次将转化子保藏在国际保藏中心，分别被给予保藏编号KCTC13253BP和KCTC13254BP。
[0058] 另外，本发明提供了一种生物量生产方法，所述方法包括培养转化子，所述转化子包括一种载体，所述载体包括编码丙酮酸转移酶的核酸分子。上述转化子可以是转基因微生物，优选转基因大肠菌、酵母或微藻。
[0059] 上述转化子可以是包括使编码丙酮酸转移酶的核酸分子过表达的过表达载体的转化子，或上述培养可以诱导导入基因的过表达。在上文中描述了过表达的诱导。
[0060] 当利用本发明的转化子时，微生物的代谢物前体丙酮酸向质体的转移变得活跃，因此微生物的代谢过程中生合成变得活跃，从而增加微生物内的代谢物的含量。例如，已经确认，在被重组以过表达本发明的酶的微藻中，生物量产量及脂质含量增加。因此，被重组以过表达本发明的酶的微生物可以用于提高目标物质、生物柴油等的生产力。
[0061] 考虑到转化子的培养特性等，可以利用本发明的技术领域中已知的培养基，按照最佳培养条件进行培养，还包括在实验室进行的培养及产业上的大量培养系统。
[0062] 另外，本发明还提供了一种转化微生物的方法，所述方法包括将编码丙酮酸转移酶蛋白质的SEQ ID NO：1的核酸分子；和过表达所述核酸分子的启动子导入到微生物中。
[0063] 另外，本发明还提供了一种用于生产生物量的组合物，所述组合物包括选自由丙酮酸转移酶和编码丙酮酸转移酶的核酸分子组成的组中的一种或多种；用于提高生物量产量的组合物；或用于提高微生物内代谢物含量的组合物。
[0064] 转基因方法包括将外源基因导入到微生物内，以增加微生物内生物量或代谢物产量。在该方面，本发明提供了一种提高微生物中生物量产量或代谢物含量的方法，所述方法包括将编码丙酮酸转移酶蛋白质的核酸分子；和用于过表达所述核酸分子的启动子导入到微生物中。
[0065] 代谢物含量增加或提高可以是增加或提高微生物内脂质含量。
[0066] 可以将核酸分子及启动子插入到表达载体中。
[0067] 另外，微藻中的这种生物量或脂质可以用于生物柴油的生产。通过本发明的丙酮酸转移酶的过表达提高了微藻的生物量产能能力和脂质含量，当通过扩大将这种微藻用于生物柴油的生产时，可大幅增加生物柴油的生产效率。在该方面，本发明提供了一种生产生物柴油的方法，所述方法包括培养本发明的转化子。
[0068] 生产生物柴油的方法的条件可以根据包括丙酮酸转移酶的转化子的种类、培养特性等而变化。一般，可以使用转化子的相应培养方法生产柴油。
[0069] 与野生型微生物相比，本发明的转化子具有提高的生物量及脂质生产量，它们可以转换成生物柴油。在此，可以按照本发明的技术领域中常用的方法，将从上述转化子获得的培养产物转换成生物柴油。
[0070] 以下通过参考制造例及实验例详细说明本发明。这些实施例及实验例只是处于解释本发明的目的，不应解释为对本发明的范围和精神的限制。
[0071] 【实施例】
[0072] 【实施例1】微藻(三角褐指藻)培养
[0073] 用于本发明实验的三角褐指藻(三角褐指藻Bohlin，CCMP632)从美国国家海洋藻类和微生物群中心(NCMA，USA)购买。在20℃条件下，将三角褐指藻在f/2培养基进行无菌培养。培养基用人工海水制备，添加了10mM的碳酸氢盐。将细胞按12小时光/12小时暗的昼夜循环，在20℃恒温培养室中，在振荡培养箱中以130rpm进行培养，利用荧光灯来提供50μ-2 -1mol·m ·s 的光量。
[0074] 【实施例2】丙酮酸转移相关基因的研究及全长ORF基因的获取
[0075] 2-1.丙酮酸转移相关基因的研究
[0076] 丙酮酸是非常重要的代谢物如脂肪酸、萜类化合物和支链氨基酸的代谢前体，存在于质体中且参与生物合成。为了研究对于代谢物的生产而言重要的丙酮酸转移功能，利用源自植物的丙酮酸转移酶(BASS2)进行了基因分析，以寻找硅藻三角褐指藻中存在的同源基因。首先，在NCBI上对拟南芥(Arabidopsis)BASS2基因At2g26900的氨基酸序列进行同源性分析。
[0077] 分析结果确认，如图1所示，位于三角褐指藻6号染色体上的一个基因显示出与At2g26900具有49％的最高相似性。将上述基因定义为丙酮酸转移质体-型(Pyruvate Transporter Plastid-type,PtPTP)。
[0078] 但是，图1中示出的基因序列(NCBI参照序列：XM_002179385)并不是完整的全长基因，因此为了分析并获得全长基因序列，实施了补充分析。
[0079] 具体地，在JGI网站(http://genome.jgi.doe.gov/Phatr2/Phatr2.home.html)分析了三角褐指藻的丙酮酸转移。结果确认，Protein ID 3046与NCBI的XM_002179385一致。但是，如图2所示，该基因没有起始密码子，并且没有完整基因结构，因此该基因是部分序列。因此，为了研究该基因的全长序列，实施了补充分析。
[0080] 2-2.丙酮酸转移质体-型的全长ORF的获取
[0081] 为了获取丙酮酸转移质体-型的全长ORF，进行了以mRNA为基础的PCR。
[0082] 为了分离RNA，将野生型三角褐指藻CCMP632细胞在指数生长期通过离心方法(2,000g，10分钟)收集，使用RNA纯化试剂盒Hybrid-R(GeneAll有限公司，韩国)分离了RNA。
[0083] 利用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems有限公司)将上述分离的RNA转化成cDNA。
[0084] 为了研究丙酮酸转移基因的起始密码子和终止密码子的位置，基于JGI基因组序列，选别位置使其能够包括整个全长序列。如下制备了预计与所选位置相对应的引物。
[0085] 上游引物5'-ATGCCAATGATTGCTCCCACGATTTCTAC-3'
[0086] 下游引物5'-ATATCCCCGTCATCGAGAAACTAC-3'
[0087] 为了确认所选择的ORF会不会实际生成RNA，利用上述引物，以基因组DNA和源自RNA的cDNA为模板进行了PCR。在这里，使用了Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)，PCR反应条件如下：35个循环的预变性(98℃，30sec)和变性(98℃，10sec)，退火(58℃，20sec)，和延伸(72℃，1min)，和最后延伸(72℃，10min)。
[0088] 从PCR结果确定，如图3所示，与以cDNA为模板进行的PCR相比，在以基因组DNA为模板进行的PCR中，生成了相对较大的条带。以基因组DNA和cDNA为模板的PCR产物之间条带大小差异是因为ORF内有内含子区域。
[0089] 为了克隆由此生成的cDNA PCR产物，将PCR产物进行了凝胶洗脱，将洗脱后的PCR产物插入到克隆载体(Dr.Blunt TOPO克隆试剂盒，(株)MGMED)进行克隆。将由此获得的基因进行测序分析，由此确认了如下碱基序列。对确认的碱基序列进行分析，从而确定该碱基序列是丙酮酸转移质体-型(PtPTP)基因的全长ORF。
[0090] SEQ ID NO：1：由PtPTP cDNA的ORF编码的氨基酸
[0091] MPMIAPTISTTTTSTALSATSLQAANGEAAGKSFGQKLFEGYEKTANVATTLFPLWTVLFTGLALKSPSSFAWFTTEYFTAGLAALMLSMGITLTPNDFKKVAARPNATLMQFALCYGMMPMLALGLGKAFALEPALIAGMVLVGSINGGQASNLCTYIARGNVALSVLMTTATTLGAIVMTPLLCKSLLGAVVPVDAAGIAKSTIQVVLAPIVIGMTTNKFFPRFVEKILPFAPVVGVVSTCLLVASAVAQVAEPILNAGLRLQIPIMLIHLLGGLVGYILPRLTGFGETSSRTMAIETSMKSSAFGFLLAKLHFGDYAARVPSAVSVVWMALIGSLLAVVWRYIPVETTGKFDRSLVDKYPPFSPKRAFGKFLQSVGLQKKDDDATPTPSVTEA
[0092] SEQ ID NO：2：PtPTP cDNA全长序列
[0093] ATGCCAATGATTGCTCCCACGATTTCTACGACGACGACGTCCACTGCTCTTTCCGCAACGTCTCTCCAAGCCGCTAACGGCGAGGCAGCCGGAAAATCCTTCGGTCAGAAACTCTTTGAAGGCTACGAAAAGACGGCCAACGTCGCCACGACGCTCTTTCCCCTCTGGACCGTCCTTTTCACCGGTCTCGCCCTCAAAAGCCCGTCCTCGTTCGCCTGGTTTACCACCGAATACTTTACGGCGGGTCTGGCCGCACTCATGCTCTCCATGGGTATCACGCTCACCCCCAACGATTTCAAAAAGGTAGCCGCCCGTCCCAACGCCACGCTCATGCAGTTTGCTCTCTGTTACGGAATGATGCCAATGCTGGCTCTGGGACTCGGTAAGGCTTTCGCCTTGGAACCCGCCTTGATTGCCGGTATGGTGTTGGTCGGGTCCATCAACGGTGGACAAGCTTCCAACTTGTGTACCTACATTGCCCGGGGTAACGTCGCCTTGTCGGTCCTCATGACCACCGCTACCACCTTGGGCGCCATCGTCATGACCCCGCTCTTGTGCAAGAGCCTCCTGGGGGCCGTCGTACCCGTCGACGCTGCTGGGATCGCCAAGTCCACCATTCAGGTCGTGCTAGCTCCGATTGTGATTGGTATGACTACCAACAAATTCTTCCCCCGGTTTGTCGAGAAAATCCTTCCGTTCGCCCCCGTTGTTGGGGTCGTCTCGACCTGTTTACTGGTTGCCAGTGCGGTCGCTCAAGTTGCCGAACCCATCCTGAACGCCGGATTGCGTTTACAGATCCCCATTATGTTGATTCATCTTTTGGGAGGACTCGTCGGCTACATTTTGCCTCGTTTGACCGGATTTGGCGAGACGTCCTCCCGCACCATGGCGATTGAAACCTCCATGAAGAGCTCCGCTTTTGGTTTCCTCTTGGCCAAGCTGCACTTTGGCGACTACGCGGCCCGTGTGCCTTCGGCCGTCTCCGTCGTGTGGATGGCCTTGATCGGTTCCTTGTTGGCCGTCGTATGGCGGTACATCCCGGTGGAAACCACCGGCAAGTTCGACCGTTCCTTGGTGGACAAGTACCCGCCCTTTAGTCCCAAGCGAGCGTTTGGAAAATTCCTACAGTCGGTTGGTCTGCAAAAGAAGGATGACGACGCGACACCGACACCCTCGGTGACGGAAGCGTAGTTTCTCGATGACGGGGATAT
[0094] SEQ ID NO：3：从基因组DNA获得的PtPTP序列(ATG：起始密码子；TAG：终止密码子；下划线：内含子区域；其他：外显子区域)
[0095] ATGCCAATGATTGCTCCCACGATTTCTACGACGACGACGTCCACTGCTCTTTCCGCAACGGTACGTACCAATCGACAACGATACCGCACACATCGATACAATACCAACCGAGCGCGAGAGAGGATTCCGGTTTCACCACAAAGCAGCGATCCTCACGGTCTTTCTTCCTATATCCTCTTCTTGGTACAGTCTCTCCAAGCCGCTAACGGTGAGGCAGCCGGAAAATCCTTCGGTCAGAAACTCTTTGAAGGCTACGAAAAGACGGCCAACGTCGCCACGACGCTCTTTCCCCTCTGGACCGTCCTTTTCACCGGTCTCGCCCTCAAAAGCCCGTCCTCTTTCGCCTGGTTTACCACCGAATACTTTACGGCGGGTCTGGCCGCACTCATGCTCTCCATGGGCATCACGCTCACCCCCAACGATTTCAAAAAGGTAGCCGCCCGTCCCAACGCCACGCTCATGCAGTTTGCTCTCTGTTACGGAATGATGCCAATGCTGGCTCTGGGACTCGGTAAGGCTTTCGCCTTGGAACCCGCCTTGATTGCCGGTATGGTGTTGGTCGGGTCCATCAACGGTGGACAAGCTTCCAACTTGTGTACCTACATTGCCCGGGGTAACGTCGCCTTGTCGGTCCTCATGACCACCGCTACCACCTTGGGCGCCATCGTCATGACCCCGCTCTTGTGCAAGAGCCTCCTGGGGGCCGTCGTACCCGTCGACGCCGCTGGGATCGCCAAATCCACCATTCAGGTACGTTCATCGCTGTCCGCCTAGTAACGCGTAGTTGCAGTACACCACCCACTCGTTGCACCGTTCGTCGATGGAGGTTCCTGGAGAGCAGAGCTCACACATTAGTGTTGTTGTCGCTACGTTTGCAGGTCGTGCTAGCTCCGATTGTGATTGGTATGACCACCAACAAATTCTTCCCCCGGTTTGTCGAGAAAATCCTTCCGTTCGCCCCCGTTGTTGGGGTCGTCTCGACCTGTTTACTGGTTGCCAGTGCGGTCGCTCAAGTTGCCGAACCCATCCTGAACGCCGGATTGCGTTTACAGATCCCCATAATGTTGATTCATCTTTTGGGAGGACTCGTCGGCTACATTTTGCCCCGTTTGACCGGATTTGGCGAGACGTCCGCCCGCACCATGGCGATTGAAACCTCCATGAAGAGCTCCGCCTTTGGTTTCCTCTTGGCCAAGCTGCACTTTGGTGACTACGCGGCCCGTGTGCCTTCGGCCGTCTCCGTCGTGTGGATGGCCTTGATCGGTTCCTTGTTGGCCGTCGTATGGCGGTACATCCCGGTGGAAACCACCGGCAAGTTCGACCGTTCCTTGGTGGACAAGTACCCGCCCTTTAGTCCCAAGCGAGCGTTTGGAAAATTCCTACAGTCGGTTGGTCTGCAAAAGAAGGATGACGACGCGACACCGACACCCTCGGTGACGGAAGCGTAGTTTCTCGATGACGGGGATAT
[0096] 【实施例3】转基因用表达载体的构建
[0097] 为了将在实施例2中克隆的PtPTP基因的全长ORF插入到转基因用载体中，利用了上述构建的转基因系统pPhaT-EF2载体构建体(图4a)。为了便于插入，制作了包括Xba I位置接头的引物(上游引物5'-TCTAGATGCCAATGATTGCTCCCACGA-3'；下游引物5'-TCTAGACC CCGTCATCGAGAAACTAC-3')。用实施例2的PCR方法合成了PtPTP ORF基因的全长cDNA。将所得DNA片段用Xba I限制酶切割后，插入到用Xba I和Spe I限制酶切割的pPhaT-EF2表达载体中，从而构建了重组载体pPhaT-EF2-PTP(图4a)。pPhaT-EF2-PTP含有博来霉素(Zeocin)抗性基因，能够选择博来霉素抗性转化子。
[0098] 确认了上述构建的质粒结构是否构建成功，其结果示于图4b中。
[0099] 【实施例4】丙酮酸转移酶过表达转化子的构建
[0100] 用构建好的转基因用质粒包被钨粒子，通过基因枪法(biolistic bombardment)(粒子递送(particle delivery))导入到三角褐指藻中。具体地，通过如下方法获得质粒DNA包被的钨粒子：向钨粒子M17(Bio-rad，直径：1.1μm)中加入质粒、CaCl2、亚精胺(spermidine)，混合，然后用70％乙醇和100％乙醇洗涤两次。将所得产物放在微载体(macrocarrier)上干燥后，按照制造商推荐的方法利用具有1550psi压力破裂板的基因枪粒子传递系统PDS-1000/He(biolistic particle delivery system PDS-1000/He)(Bio-Rad Laboratories)通过粒子轰击(particle bombardment)方法转化铺在培养基上的三角褐指藻。转化后，将转化子在光条件下培养24小时，涂抹在含有博来霉素(100ug/ml)的f/2固体培养基上。3周后，选择博来霉素抗性转化子菌落(Seo等人2015)。
[0101] 针对在博来霉素选别培养基中生长的抗性菌落，为了确认插入到基因组DNA中的外来基因是否稳定存在，进行了基因组DNA PCR。将菌落独立地转移到新的固体培养基并培养一个星期。然后，从生长的微藻中取一些微藻，用蒸馏水(DW)稀释。使用EF2启动子区域的上游引物(5'-CTGTGAAGCCGTGGTGAATCTT-3')和PtPTP ORF区域的下游引物(5'-CCGGGCAATGTAGGTACACAAG-3')，以来自稀释的微藻的基因组DNA为模板进行PCR。对于该PCR，使用了rTaq 5ХPCR Master Mix(ELPIS-Biotech,韩国大田市)，反应条件如下：变性温度：95℃，退火温度：58℃，延伸温度：72℃(各10秒)。
[0102] 如图5所示，确认了外来基因成功插入到转化子PtPTP-OE-11和PtPTP-OE-16中。
[0103] 【实施例5】丙酮酸转移酶过表达转化子的定量qRT-PCR
[0104] 为了研究所得转化子中PtPTP基因的转录本(mRNA)的表达水平，从两个转化子中分离RNA后，进行了qRT-PCR。
[0105] 利用RNA纯化试剂盒Hybrid-R(GeneAll公司，韩国)，按照该试剂盒的使用方法进行了RNA分离。利用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems有限公司)将分离的RNA转换成cDNA。针对上述合成的cDNA，利用SYBR pre-mix Ex Taq(Takara Bio有限公司)，用热循环仪Thermal Cycler Dice Real Time System TP 810(Takala Bio有限公司)进行逆转录-定量PCR(实时PCR)。在这里，反应条件如下：在95℃反应30秒；在95℃反应5秒以及在58℃反应30秒，40个循环；在95℃反应15秒；在60℃反应30秒；在95℃反应15秒。使用Thermal Cycler Dice Real Time System Software Ver.5(Takara Bio有限公司)通过DDCT方法(Pfaffl,2001)分析了基因表达水平的相对变化。按照之前的研究(Seo等人
2015)，利用了TATA盒-结合蛋白质(TBP，JGI蛋白质ID：10199)基因作为内部对照。
2015)，利用了TATA盒-结合蛋白质(TBP，JGI蛋白质ID：10199)基因作为内部对照。
[0106] qRT-PCR的引物如下。
[0107] 为了研究PtPTP转录本的表达水平，使用了上游引物(5 '-TGGAT GGCCTTGATCGGTTC-3')和下游引物(5'-AACGCTCGCTTGGGACTAAA-3')。此外，使用上游引物(5'-TTGCCAGTTACGAGCCAGAG-3')和下游引物(5'-CGCCAGGTCCATTTCCTTCT-3')作为合成作为内部参照基因的TATA盒蛋白(TBP)基因的引物组。
[0108] 所选转化子的PtPTP转录本(mRNA)表达水平如图6所示。
[0109] 如图6所示，与对照(WT)相比，PTP-OE11和PTP-OE16转化子中PtPTP转录本的表达水平分别增加了4.9倍和21.4倍。
[0111] KCTC13253BP：三角褐指藻CCMP632 PtPTP-OE11
[0112] KCTC13254BP：三角褐指藻CCMP632 PtPTP-OE16
[0113] 【实施例6】丙酮酸转移酶过表达转化子中生物量和脂质增加的确认
[0114] 为了研究所选丙酮酸转移酶过表达转化子中生物量产量是否增加，如下测量了其生长速度、生物量的量和总脂质含量。
[0115] 6.1.细胞浓度(生长速度)测量
[0116] 使用血球计数器(Neubauer)通过细胞计数确定了微藻的细胞浓度。生长速度随时间的结果如图7所示。
[0117] 如图7所示，与对照藻(WT)相比，两个转化子显示出正常的生长速度，未见差异。然后，分析了显示正常生长曲线的转化子的生物量和脂质含量。
[0118] 6.2.总生物量的量及总脂质的量的分析
[0120] 在第一次接种微藻后第三、五、七天，按生物量的干重分析了总脂质含量，在第7天——稳定期，其中生长停滞并发生脂质成分积累——研究了总脂质含量。
[0121] 具体地，分别培养野生型微藻(WT190.0)、转基因微藻PTP-OE11及转基因微藻PTP-OE16，将培养的微藻离心(2,000g，15分钟)，然后去除上清，并收获沉淀。向收获物中加入氯仿2ml、甲醇2ml、5％NaCl 1ml，涡旋两分钟后进行离心(2,000g，10分钟)，由此诱导分层。小心取下层氯仿层，并收集到另外的试管中。此过程重复三次。将收集的溶液放在提前称重的铝盘上，将铝盘轻微加热使氯仿蒸发。此后，在65℃反应室放置一晚，待完全干燥后，对铝盘称重以测量脂质含量。转化子的生长曲线示于表1及图8中。
[0122] 【表1】
[0123]
[0124]
[0125] 如图8所示，在指数生长期(第5天)，PTP过表达转化子中的生物量分别增加了117％和125％，在培养的第7天，其中的总脂质含量分别增加了117％和118％(*是t-test结果；p-值<0.05的可信水平)。最终确认，其中过表达本发明的丙酮酸转移酶的新转化子表现出增加的生物量和脂质生产力。
[0126]
[0127]
[0128]
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