一株生产微生物油脂的卷曲巴克斯霉菌株及其应用
阅读：914发布：2020-05-08
专利汇可以提供一株生产微生物油脂的卷曲巴克斯霉菌株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 微 生物 制备柴油技术领域，本发明提供了一株卷曲巴克斯霉(Backusella circina)菌株XY00947 CGMCC No.18837及其在在制备 生物柴油 中的应用。本发明提供的菌株已于2019年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的菌株具有生长迅速、易于培养、生物量高、含油率高和能生产大量的油酸。，下面是一株生产微生物油脂的卷曲巴克斯霉菌株及其应用专利的具体信息内容。
一株生产微生物油脂的卷曲巴克斯霉菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物制备柴油技术领域。
背景技术
[0002] 微生物油脂作为一种可再生资源，具有生物量大、发酵周期短、不受时间和地点的限制等特点而得到广泛关注。主要的产油微生物有细菌、酵母、藻类和丝状真菌。其中，丝状真菌在发酵过程中能够积累大量的油脂，且油脂成分丰富，富含多种多不饱和脂肪酸，能够为工业提供大量的优良菌株，具有重要的价值(李元森et al,2009)。
[0003] 目前对于丝状真菌的研究大部分集中在一些特定的物种，例如毛霉属的卷枝毛霉(Wynn et al,2001；Tang et al,2015)，被孢霉属的高山被孢霉(Sakuradani et al,2013；Li et al,2015；Kikukawa et al,2018)，根霉属(Oliveira et al,2011)和小克银汉霉属(Fakas et al,2008；Sukrutha et al,2014)。还没有将菌株应用到合成微生物油脂生产领域的研究和报道。
发明内容
[0005] 本发明提供的菌株已于2019年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该中心简称为CGMCC，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCC No.18837。
[0007] 图1是菌株XY00947的孢囊梗和孢囊孢子显微图。
[0008] 图2是菌株XY00947脂肪酸成分气相色谱图。
具体实施方式
[0009] 实施例1
[0010] 1.菌株采集和培养
[0012] 菌株进行活化之后，无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于培养基中，然后在摇床中140rpm，25℃培养5天。培养完成后，真空抽滤发酵液得到鲜菌体，取出100mg鲜菌体采用气相色谱的方法对脂肪酸成分进行鉴定，其余进行烘干处理得到干菌体提取微生物油脂。
[0013] 2.菌株的生物学特征和鉴定：
[0014] (1)分子生物学鉴定
[0015] 使用ITS rDNA序列，为此设计特异性引物：
[0016] 引物1：5'-GGC TTA ATT TGA CTC AAC ACG G-3'；
[0017] 引物2：5'-GCT ATC CTG AGG GAA ACT TCG-3'。
[0019] (2)形态学鉴定
[0020] 菌株形态：菌株XY00947属于低等真菌，菌丝无隔多核，有大孢子囊和小孢子囊，大孢子囊生长在直立孢囊梗顶端，在同一个孢囊梗的中部着生单轴分枝的小孢子囊，多达6个小孢子囊连续分枝，小孢子囊囊轴弯曲，一个大孢子囊中有多个孢囊孢子，一个小孢子囊中只有一个孢囊孢子，孢囊壁上有小刺，孢子近圆形，直径约10um，内含物丰富。
[0021] (3)菌株鉴定
[0022] 菌株XY00947的rDNA序列在National Center for Biotechnology Information,U.S.National Library of Medicine(NCBI)数据库中进行BLAST，结果显示其与卷曲巴克斯霉(Backusella circina)菌株CBS 322.69的序列最为相似，相似度为99.65％，同时结合显微图片，推测菌株XY00947是卷曲巴克斯霉(Backusella circina)。
[0023] 卷曲巴克斯霉(Backusella circina)菌株XY00947已于2019年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该中心简称为CGMCC，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCC No.18837。
[0024] 3含油率测定和脂肪酸分析：
[0025] 菌株活化，无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于培养基中，然后在摇床中140rpm，25℃条件下培养5天。培养完成后，真空抽滤得到鲜菌体，取出100mg采用气相色谱的方法对脂肪酸成分进行鉴定，其余进行烘干处理得到干菌体提取微生物油脂。
[0026] 培养基(Kendrick&Ratledge,1992)的主要成分是50g/L葡萄糖,2g/L酒石酸胺,7.0g/L KH2P04,2.0g/L Na2HP04,1.5g/L MgS04·7H20,1.5g/L酵母粉,0.1g/L CaCl2.2H20,
8mg/L FeCl3·6H20,1mg/L ZnS04·7H20,0.1mg/L CuSO4·5H20,0.1mg/L CO(NO3)2·
6H20and 0.1mg/L MnS04·5H20,pH 6.0，。
8mg/L FeCl3·6H20,1mg/L ZnS04·7H20,0.1mg/L CuSO4·5H20,0.1mg/L CO(NO3)2·
6H20and 0.1mg/L MnS04·5H20,pH 6.0，。
[0027] 微生物油脂的提取：1g干菌体加入6M盐酸5mL，之后沸水浴30min，冷却后加入95％乙醇10mL，之后再加入石油醚和乙醚各5mL，震荡均匀后，5000rpm离心3min，最后蒸发萃取剂得到微生物油脂。
[0028] 气相色谱样品制备：称取100mg菌体，置于5mL的螺口玻璃管中。向样品管中加入1mL试剂I(皂化试剂Saponification Reagent：150mL去离子水、150mL甲醇、45g NaOH)，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出观察试管是否漏气，如有漏气，将样品冷却到室温，转移到新的试管，重新沸水浴5min测试，如无漏气现象，将试管震荡5–10s，继续沸水浴25min，取出试管，用流水冲洗试管壁使其冷却。将冷却的试管打开，加入2mL试剂II(甲基化试剂Methylation Reagent：325mL 6mol·L-1HCl、275mL甲醇)，拧紧盖子，震荡5–10s,迅速放入设定为80℃的水浴锅中加热10min，取出试管用流水快速冷却至室温。向冷却后的试管中加入1.25mL试剂III(萃取试剂Extraction Solvent：200mL甲基叔丁基醚(MTBE)、200mL正己烷)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和摇晃10min，用干净的巴斯德吸管将每个试管中的下层水相丢弃。向样品中加入3mL试剂IV(洗涤试剂Base Wash：10.8g NaOH、900mL去离子水)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和摇晃5min，用干净的巴斯德吸管收集上层有机相的2/3[若液面浑浊，可向试管中加几滴试剂V(饱和NaCl溶液：40g NaCl、100mL去离子水)，减少乳化现象]，装入干净的气相色谱瓶，用于气相检测。
[0029] 脂肪酸成分分析：气相色谱系统采用美国安捷伦7890A型(Agilent Chromatograph:GC)，包括全自动进样装置、石英毛细管柱(HP-ULTRA 2，25.0m×200μm×0.33μm)及氢火焰离子化检测器。按以下色谱条件平行分析脂肪酸甲酯混合物标样(美国MIDI公司)和待检样本。二阶程序升高柱温，初始温度170℃，5℃·min-1升至260℃，然后40℃·min-1升温至310℃，维持90s；汽化室温度250℃，检测器温度300℃，载气为氢气(2mL·min-1)，尾吹气为氮气(30mL·min-1)，柱前压10psi，进样量1μL，进样分流比100:l。使用林营志等人编写的PLFAsEco程序(Lin et al,2009)，将Sherlock MIS 6.2检测出的原始单个菌株脂肪酸数据提取并转换成以菌株为样本、脂肪酸为指标的数据矩阵Excel文件，对各属脂肪酸组成进行分析，其中生物量为12.2g/L，油脂量是7.2g/L，干菌体含油率为59％。
[0030]
[0031] 4由微生物油脂制备生物柴油
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