基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途
阅读：384发布：2020-05-12
专利汇可以提供基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于丙二酰-CoA检测的重组 微 生物 ，在其中III型聚 酮 合酶编码基因插入基因组中，或在其中引入了含有所述基因的重组载体；使用所述重组微生物筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法；筛选参与增加丙二酰-CoA产生的基因的方法；以及一种如下方法，其包括在微生物中敲低通过所述方法筛选的基因从而增加所述微生物中丙二酰-CoA的产生，以及使用丙二酰-CoA作为前体在所述微生物中产生有用的物质。根据本发明的生物 传感器 的使用提供了单步 信号 生成、在各种微生物中的利用、在自 荧光 微生物中的利用、简单的构建方法和简单的筛选方法。另外，当本发明与高通量筛选相结合时，其优点在于可以非常容易且快速地(约3天)筛选具有增加的丙二酰-CoA产生能 力 的菌株，并且所述菌株可以直接应用于有用化合物的基于丙二酰-CoA的产生。，下面是基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途专利的具体信息内容。
1.一种用于丙二酰-CoA检测的重组微生物，在其中III型聚酮合酶编码基因插入所述微生物的基因组中，或在其中引入了含有所述III型聚酮合酶编码基因的重组载体。
2.权利要求1的重组微生物，其中所述III型聚酮合酶是：
源自选自灰色链霉菌、天蓝色链霉菌、阿维链霉菌、红色糖多孢菌、波赛链霉菌和针孢链霉菌的微生物的RppA；
源自荧光假单胞菌的PhlD(聚酮合酶)；
源自地中海拟无枝菌酸菌的DpgA(聚酮合酶)；
源自掌叶大黄的ALS(芦荟酮合酶)；或
源自木立芦荟的PCS(5,7-二羟基-2-甲基色酮合酶)、OKS(八酮合酶)、PKS3(芦荟酮合酶)、PKS4(八酮合酶2)或PKS5(八酮合酶3)。
3.权利要求1的重组微生物，其中编码所述III型聚酮合酶的基因与选自tac、trc、T7、BAD、λPR和Anderson合成启动子的启动子可操作地连接。
4.权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物选自大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、凝聚杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。
5.一种筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法，其包括以下步骤：
(a)培养权利要求1的重组微生物；
(b)向所述重组微生物中添加候选物质；
(c)将添加所述候选物质后的所述重组微生物的培养上清液的颜色与没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液的颜色进行比较；并且
(d)当添加所述候选物质后所述重组微生物的培养上清液显示出比没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。
6.权利要求5的方法，其中步骤(c)中颜色之间的比较是通过肉眼进行。
7.权利要求5的方法，其中步骤(c)中颜色之间的比较是通过测量吸光度来进行，并且步骤(d)包括当添加所述候选物质后测量的吸光度高于未添加所述候选物质的情况下测量的吸光度时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。
8.一种筛选参与增加丙二酰-CoA产生的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将改变重组微生物中的基因表达的基因调节文库引入权利要求1的重组微生物中，从而构建所述重组微生物中的基因表达发生改变的重组微生物文库；
(b)培养所述构建的重组微生物文库，测量所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度，培养所述重组微生物然后将所述基因调节文库引入，并比较所述重组微生物文库的培养上清液的颜色与在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的颜色；
并且
(c)当所述重组微生物文库的培养上清液显示出比在将所述基因调节文库引入之前的重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择引入所述重组微生物文库中的基因作为参与增加丙二酰-CoA产生的基因。
9.权利要求8的方法，其中步骤(b)中颜色之间的比较是通过肉眼进行。
10.权利要求8的方法，其中步骤(b)中的颜色之间的比较是通过测量吸光度来进行，并且步骤(c)包括当所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度高于在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的吸光度时，选择在所述重组微生物文库中引入的基因。
11.权利要求8的方法，其中所述基因调节文库是选自以下的文库：sRNA文库、基因组文库、cDNA文库、gRNA文库和用于构建敲除或突变菌株的寡核苷酸文库。
12.一种产生具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物的方法，所述方法包括调节通过权利要求8至11中任一项的方法筛选的基因在具有丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达。
13.权利要求12的方法，其中所述筛选的基因是选自以下项的一种或多种基因：
fabF(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II)；
yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；
xapR(xapAB的转录激活因子)；
cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；
fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；
mqo(苹果酸脱氢酶)；
yfiD(丙酮酸甲酸裂解酶亚基)；
fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶)；
pyrF(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)；
araA(L-阿拉伯糖异构酶)；
fadR(fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子)；
pabA(氨基脱氧分支酸合酶，亚基II)；
purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)；和
hycI(参与加工HycE的C末端的蛋白酶)，
并且减少所述基因的表达。
14.权利要求12的方法，其中所述微生物是选自以下项的微生物：大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、凝聚杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。
15.一种具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物，其中选自以下基因的一种或多种基因：
fabF(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II)；
yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；
xapR(xapAB的转录激活因子)；
cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；
fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；
mqo(苹果酸脱氢酶)；
yfiD(丙酮酸甲酸裂解酶亚基)；
fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶)；
pyrF(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)；
araA(L-阿拉伯糖异构酶)；
fadR(fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子)；
pabA(氨基脱氧分支酸合酶，亚基II)；
purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)；和
hycI(参与加工HycE的C末端的蛋白酶)在具有丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达与在野生型微生物中的表达相比降低。
16.一种使用丙二酰-CoA作为底物或中间体产生有用物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)构建重组微生物，其中在权利要求15的重组微生物中另外引入参与所述有用物质产生的基因或增加所述基因的表达，或者另外使参与所述有用物质产生的基因缺失或减少所述基因的表达；
(b)培养所构建的微生物；并且
(c)从所培养的微生物回收所述有用物质。
17.权利要求16的方法，其中所述有用物质是选自以下项的一种或多种：
放线菌紫素、多柔比星、道诺霉素、土霉素、雷帕霉素、洛伐他汀、SEK4、SEK4b、SEK34、SEK15、SEK26、FK506、DMAC、阿克拉菌酮、阿克拉酸、ε-紫红霉酮、芦荟苦素、芦荟宁、芦荟苷、
5,7-二羟基-2-甲基色酮、红霉素、利福霉素、阿维菌素、格尔德霉素、伊维菌素、多西环素、安曲霉素、青霉酸、卡奇霉素、埃博霉素、特曲霉素、富伦菌素、三乙酸内酯、6-甲基水杨酸或芦荟酮的聚酮化合物；
松属素、二氢山柰酚、圣草酚、二氢槲皮素、黄豆苷元、染料木素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、槲皮素、儿茶素、天竺葵色素、矢车菊素、阿福豆素、杨梅素、非瑟酮、高良姜素、橙皮素、柑桔黄酮、花翠素、表儿茶素、白杨素、白藜芦醇或柚皮素的苯丙素类化合物；
戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、十九烷醇、二十烷醇、癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、花生酸甲酯、二十烯酸甲酯、芥酸甲酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、棕榈油酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯、花生酸乙酯、二十烯酸乙酯或芥酸甲酯的生物燃料组；
神经酰胺、棕榈酸酯或鞘氨醇的脂质化合物；和
3-羟基丙酸。
18.一种用于产生6-甲基水杨酸的重组微生物，其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码6-甲基水杨酸合酶(6MSAS)和4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)的基因，或者增加所述基因的表达。
19.权利要求18的重组微生物，其中所敲低的基因是选自pabA、fabF、xapR和ytcY的一种或多种。
20.权利要求18的重组微生物，其中在所述重组微生物中另外引入了编码选自葡萄糖-
6-磷酸脱氢酶(Zwf)、苹果酸脱氢酶(Mdh)、磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、乙酰-CoA羧化酶(AccBC和AccD1)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GapA)、磷酸甘油酸激酶(Pgk)、乙酰-CoA合成酶(Acs)和丙酮酸脱氢酶(AceEF和Lpd)的一种或多种酶的基因或增加所述基因的表达。
21.一种产生6-甲基水杨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养权利要求18的重组微生物；并且
(b)从所培养的微生物回收所述6-甲基水杨酸。
22.一种用于产生芦荟酮的重组微生物，其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码芦荟酮合酶的基因或增加所述基因的表达。
23.权利要求22的重组微生物，其中所敲低的基因是pabA。
24.权利要求22的重组微生物，其中在所述重组微生物中另外引入了编码选自葡萄糖-
6-磷酸脱氢酶(Zwf)、苹果酸脱氢酶(Mdh)、磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、乙酰-CoA羧化酶(AccBC和AccD1)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GapA)、磷酸甘油酸激酶(Pgk)、乙酰-CoA合成酶(Acs)和丙酮酸脱氢酶(AceEF和Lpd)的一种或多种酶的基因或增加所述基因的表达。
25.一种产生芦荟酮的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养权利要求22的重组微生物；并且
(b)从所培养的微生物回收所述芦荟酮。
26.一种用于产生白藜芦醇的重组微生物，其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(TAL)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)和芪合酶(STS)的基因或者增加所述基因的表达。
27.权利要求26的重组微生物，其中所述4-香豆酸:CoA连接酶是其中SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为I250L/N404K/I461V的突变酶，或者是其中SEQ ID NO:
131所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为A294G/A318G的突变酶。
28.权利要求26的重组微生物，其中所敲低的基因是选自pabA、yfiD、mqo、xapR、purB、fabH、fabF、yfcY、fadR、cytR、fmt和pyrF中的一种或多种。
29.一种产生白藜芦醇的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养权利要求26的重组微生物；并且
(b)从所培养的微生物回收所述白藜芦醇。
30.一种用于产生柚皮素的重组微生物，其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(TAL)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)、查耳酮合酶(CHS)和查耳酮异构酶(CHI)的基因或者增加所述基因的表达。
31.权利要求30的重组微生物，其中所述4-香豆酸:CoA连接酶是其中SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为I250L/N404K/I461V的突变酶。
32.权利要求30的重组微生物，其中所敲低的基因是选自fadR、hycI和xapR中的一种或多种。
33.一种产生柚皮素的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养权利要求30的重组微生物；并且
(b)从所培养的微生物回收所述柚皮素。
基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途，并且更具体地涉及用于丙二酰-CoA检测的重组微生物(其中引入了含有III型聚酮合酶编码基因的重组载体)；使用重组微生物筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法；筛选参与增加丙二酰-CoA产生的基因的方法；以及一种如下方法，其包括在微生物中敲低通过所述方法筛选的基因从而增加微生物中丙二酰-CoA的产生，以及使用丙二酰-CoA作为前体在微生物中产生有用的物质。
背景技术
[0002] 由于全球环境问题，有限资源的耗竭以及对环境友好型能源的需求增加，基于可再生生物的细胞工厂的建设越来越受到关注。这些细胞工厂可以通过针对产生所需的代谢物优化的细胞内代谢网络产生所需的代谢物(生物能、环境友好的化学物质、新药物物质等)，并且这一技术过程需要各种分子生物技术。
[0003] 在可通过微生物细胞工厂产生的各种物质中，丙二酰-CoA尤为重要，因为它是产生非常有用的物质如聚酮、苯丙素类和生物燃料的关键前体。然而，丙二酰-CoA在细胞中引起各种必需的代谢反应(如脂肪酸生物合成)，因此可用于代谢工程化的丙二酰-CoA的量非常小。此外，需要高性能仪器如LC-MS/MS来测量丙二酰-CoA的细胞内浓度，并且需要一种花费很长时间并要求非常小心的采样方法来测量丙二酰-CoA，所述丙二酰-CoA在细胞中快速产生后消失并且对周围环境条件敏感。因此，已经从先前研究开发了基于转录因子的丙二酰-CoA生物传感器，以更快速且更容易地测量丙二酰-CoA的细胞内浓度(Xu P,Li L,Zhang F,Stephanopoulos G,Koffas M(2014),Proc Natl Acad Sci U S A111:11299-11304；Li S,Si T,Wang M,Zhao H(2015),ACS Synth Biol 4:1308-1315)。然而，如上所述基于转录因子的基于荧光蛋白的传感器的缺点在于它们必须经历各种信号传导步骤并且不能用于自荧光微生物如假单胞菌属(Pseudomonas)。
[0004] 因此，本发明人努力解决上述问题，因此开发出一种基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器，其利用III型聚酮合酶(包括RppA)通过一步反应将丙二酰-CoA转化为有色物质的特性；并且发现生物传感器的使用可以容易地检测丙二酰-CoA，使得可以筛选产生丙二酰-CoA的菌株、丙二酰-CoA产生诱导物质和参与增加丙二酰-CoA产生的基因，以及使得可以容易地构建一种使用丙二酰-CoA作为底物或前体来产生各种有用物质的方法，从而完成本发明。
发明内容
[0005] 技术问题
[0006] 本发明的目的是提供用于丙二酰-CoA检测的新型生物传感器和使用所述生物传感器的各种方法，以及通过使用所述方法增加所述微生物中丙二酰-CoA产生以及使用丙二酰-CoA作为底物或前体在所述微生物中产生有用物质的方法。
[0007] 技术方案
[0008] 为了达到上述目的，本发明提供了一种用于丙二酰-CoA检测的重组微生物，在其中III型聚酮合酶编码基因插入所述微生物的基因组中或在其中引入了含有III型聚酮合酶编码基因的重组载体。
[0009] 本发明还提供了筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法，其包括以下步骤：
[0010] (a)培养上述重组微生物；
[0011] (b)向所述重组微生物中添加候选物质；
[0012] (c)将添加所述候选物质后的所述重组微生物的培养上清液的颜色与没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液的颜色进行比较；并且
[0013] (d)当添加所述候选物质后所述重组微生物的培养上清液显示出比没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。
[0014] 本发明还提供了筛选参与增加的丙二酰-CoA产生的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
[0015] (a)将改变重组微生物中的基因表达的基因调节文库引入上述重组微生物中，从而构建所述重组微生物中的基因表达发生改变的重组微生物文库；
[0016] (b)培养所构建的重组微生物文库和未引入基因调节文库的重组微生物，从而测量所述培养上清液的吸光度，并比较所培养上清液的颜色；并且
[0017] (c)当所述重组微生物文库的培养上清液显示出比未引入所述基因调节文库的重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择引入所述重组微生物文库中的基因。
[0018] 本发明还提供了产生具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物的方法，所述方法包括调节通过上述方法筛选的基因在固有地具有丙二酰-CoA产生能力或外部引入丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达。
[0019] 本发明还提供了具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物，其中选自以下基因的一种或多种基因：
[0021] yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；
[0022] xapR(xapAB的转录激活因子)；
[0023] cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；
[0024] fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；
[0025] mqo(苹果酸脱氢酶)；
[0027] fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶)；
[0029] araA(L-阿拉伯糖异构酶)；
[0030] fadR(fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子)；
[0031] pabA(氨基脱氧分支酸合酶，亚基II)；
[0032] purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)；和
[0033] hycI(参与加工HycE的C末端的蛋白酶)在具有丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达与在野生型微生物中的表达相比降低。
[0034] 本发明还提供了使用丙二酰-CoA作为底物或中间体产生有用物质的方法，所述方法包括以下步骤：
[0035] (a)构建重组微生物，其中另外引入参与所述有用物质产生的基因或增加所述基因的表达，或者另外使参与所述有用物质产生的基因缺失或减少所述基因的表达；
[0036] (b)培养所构建的微生物；并且
[0037] (c)从所培养的微生物回收所述有用物质。
[0038] 本发明还提供了用于产生6-甲基水杨酸的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码6-甲基水杨酸合酶(6MSAS)和4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)的基因，或者增加所述基因的表达。
[0039] 本发明还提供了产生6-甲基水杨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
[0040] (a)培养上述重组微生物；并且
[0041] (b)从所培养的微生物回收所述6-甲基水杨酸。
[0042] 本发明还提供了用于产生芦荟酮(aloesone)的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码芦荟酮合酶的基因或增加了所述基因的表达。
[0043] 本发明还提供了产生芦荟酮的方法，所述方法包括以下步骤：
[0044] (a)培养上述重组微生物；并且
[0045] (b)从所培养的微生物回收所述芦荟酮。
[0046] 本发明还提供了用于产生白藜芦醇的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(TAL)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)和芪合酶(STS)的基因或者增加所述基因的表达。
[0047] 本发明还提供了产生白藜芦醇的方法，所述方法包括以下步骤：
[0048] (a)培养上述重组微生物；并且
[0049] (b)从所培养的微生物回收所述白藜芦醇。
[0050] 本发明还提供了用于产生柚皮素的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(TAL)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)、查耳酮合酶(CHS)和查耳酮异构酶(CHI)的基因或者增加所述基因的表达。
[0051] 本发明还提供了产生柚皮素的方法，所述方法包括以下步骤：
[0052] (a)培养上述重组微生物；并且
[0054] 图1示出了基于III型聚酮合酶(RppA)的丙二酰-CoA生物传感器的操作机制。(A)RppA可以将五分子的丙二酰-CoA转化为一分子的红色淡黄霉素。此时，RppA负责将丙二酰-CoA转化为1,3,6,8-四羟基萘(THN)，然后自发转化为淡黄霉素。(B)当通过RppA生物传感器测得红色变深时，丙二酰-CoA的细胞内水平更高。
[0055] 图2示出了淡黄霉素生物合成。(A)来自五种不同菌株的通过rppA得到的淡黄霉素产量。(B)通过LC-MS和MS/MS分析确认的淡黄霉素产量。(C)淡黄霉素产量的优化。通过优化5'UTR增加淡黄霉素的产量。(D)检验RppA生物传感器的适用性。通过使用浅蓝菌素的间接方法测量由丙二酰-CoA的细胞内水平的变化引起的信号的变化。RppA+表示表达RppA的菌株，而RppA-表示不表达RppA的菌株。
[0056] 图3示出了RppA生物传感器的适用性和可扩展性。(A)随着添加的浅蓝菌素的量增加，淡黄霉素产量增加，并且(B)这即使用肉眼也可以确认。(C)来自所有16种大肠杆菌(E.coli)菌株的淡黄霉素产量是可能的。(D)在表达RppA的菌株(RppA+)和不表达RppA的对照菌株(RppA-)的情况下，来自对照的340nm处的噪声(由箭头指示)最低并且来自RppA+菌株的信号最强，因此340nm处的吸光度用作RppA生物传感器的信号。
[0057] 图4示出了作为丙二酰-CoA生物传感器的三种III型聚酮合酶(AaOKS、AaPKS4和AaPKS5)的表征。(A)通过LC-MS(负扫描模式)生成的表达AaOKS、AaPKS4和AaPKS5的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的培养物上清液的提取离子色谱图。由色谱图预测的产物如下：5,7-二羟基-2-甲基色酮(m/z191)；芦荟酮(m/z 231)；SEK4和SEK4b(m/z 317)。(B)示出了当向培养基中添加不同浓度的浅蓝菌素时表达AaOKS、AaPKS4和AaPKS5的大肠杆菌菌株的培养上清液的颜色，并且(C)示出了不同波长处的培养上清液的光密度(吸光度)。CT，对照菌株(BL21(DE3)pET-30a(+))。此时，与对照相比，丙二酰-CoA生物传感器菌株在300nm处的信号最强，因此在AaOKS、AaPKS4和AaPKS5的情况下，使用300nm处的吸光度作为信号。数据点表示三个生物学重复的平均值。
[0058] 图5指示三种III型聚酮合酶(AaOKS、AaPKS4和AaPKS5)可以用作丙二酰-CoA生物传感器。(A)AaOKS、(B)AaPKS4和(C)AaPKS5指示由丙二酰-CoA水平的增加(通过添加浅蓝菌素控制)引起的归一化信号增加。每个信号指示每个包含或不包含PKS的情况。
[0059] 图6示出了在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和混浊红球菌(Rhodococcus opacus)中测试RppA生物传感器的结果。(A)示出了当将指示的质粒转化至恶臭假单胞菌菌株中时淡黄霉素的产量。
(B)示出了恶臭假单胞菌pBBR1-rppA传感器菌株的浅蓝菌素浓度依赖性信号强度，并且(C)示出了此时相对的淡黄霉素产量。(D)示出了当将指示的质粒转化至谷氨酸棒杆菌菌株中时淡黄霉素的产量。(E)示出了谷氨酸棒杆菌pCES-His-rppA传感器菌株的浅蓝菌素浓度依赖性信号强度，并且(F)示出了此时相对的淡黄霉素产量。(G)示出了当将指示的质粒转化至混浊红球菌菌株中时培养基的颜色。
(B)示出了恶臭假单胞菌pBBR1-rppA传感器菌株的浅蓝菌素浓度依赖性信号强度，并且(C)示出了此时相对的淡黄霉素产量。(D)示出了当将指示的质粒转化至谷氨酸棒杆菌菌株中时淡黄霉素的产量。(E)示出了谷氨酸棒杆菌pCES-His-rppA传感器菌株的浅蓝菌素浓度依赖性信号强度，并且(F)示出了此时相对的淡黄霉素产量。(G)示出了当将指示的质粒转化至混浊红球菌菌株中时培养基的颜色。
[0060] 图7示出了通过使用RppA生物传感器的高通量筛选来筛选菌株的过程，所述菌株显示增加的丙二酰-CoA产量。
[0061] 图8示出了当引入大肠杆菌基因组规模的合成对照sRNA文库并且使用RppA生物传感器进行高通量筛选时筛选示出丙二酰-CoA水平增加的菌株的初始结果。
[0062] 图9示出了当26个最初筛选的参与增加的丙二酰基-CoA产生的合成对照sRNA转化至大肠杆菌传感器菌株中时生成的信号。此时，选择与对照相比显示信号增加70％或更多的14种合成对照sRNA作为最终靶标。
[0063] 图10示出了为鉴定增加的丙二酰-CoA产量而进行的FVSEOF模拟。(A)示出了与丙二酰-CoA生物合成相关的生物合成途径。粗体字母表示反应，而普通字母表示代谢物。灰色箭头表示代谢通量，而红色箭头表示被鉴定为过表达靶标的代谢通量。(B)示出了当过表达由FVSEOF鉴定的基因靶标时出现的生物传感器信号。(C)示出了由FVSEOF鉴定的基因靶标的列表。
[0064] 图11示出了6-甲基水杨酸的生物合成途径。此处，红色X表示敲除基因，而蓝色X表示敲低基因。Bla，β-内酰胺酶基因；kanR，卡那霉素抗性基因；p15A，复制起点；ColE1，复制起点；Ptac，tac启动子；PBAD，阿拉伯糖-诱导型启动子；PR，PR启动子；rrnB，rrnBT1T2终止子；T1/TE，终止子。Gly，甘油；Gly-3P，3-磷酸甘油；DHA，二羟丙酮；DHAP，磷酸二羟丙酮；G3P，3-磷酸甘油醛；1,3BPG，1,3-二磷酸甘油酸；3PG，3-磷酸甘油酸；2PG，2-磷酸甘油酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PYR，丙酮酸；OAA，草酰乙酸；E4P，D-赤藓糖4-磷酸；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸；CHOR，分支酸；AcCoA，乙酰-CoA；MalCoA，丙二酰-CoA；6MSAS，6MSA合酶；
KS，酮基合酶；AT，酰基转移酶；DH，脱水酶；KR，酮还原酶；ACP，酰基载体蛋白。
KS，酮基合酶；AT，酰基转移酶；DH，脱水酶；KR，酮还原酶；ACP，酰基载体蛋白。
[0065] 图12示出了用于产生6-甲基水杨酸的不同基因表达盒。(A)示出了质粒pTac-Pg6MSAS-sfp，并且(B)示出了用质粒pTac-Pg6MSAS在大肠杆菌BAP1菌株的基因组上表达的sfp。(C)示出了为了分析6-甲基水杨酸合酶(Pg6MSAS)和4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)的表达而进行的SDS-PAGE的结果。Pg6MSAS(188kDa)，Sfp(26.1kDa)。
[0066] 图13示出了来自经修饰的大肠杆菌菌株的6-甲基水杨酸的产量。(A)示出了在基于BL21的菌株和基于BAP1的菌株中来自不同浓度的葡萄糖/甘油的6-甲基水杨酸的产量。(B)示出了由大肠杆菌产生的6-甲基水杨酸的LC-MS分析的结果，并且(C)示出了可商购的
6-甲基水杨酸化合物的LC-MS分析的结果。(D)示出了在16种大肠杆菌菌株中试管规模的6-甲基水杨酸产量。蓝色部分指示产量为1mg/L或更高。(E)示出了在大肠杆菌BL21(DE3)pTac-Pg6MSAS-sfp pWAS-抗-pabA(pabA敲低sRNA质粒)菌株中6-甲基水杨酸产量的时间历程。(F)示出了在BAP1 pTac-Pg6MSAS pWAS-抗-pabA菌株中6-甲基水杨酸产量的时间历程。
(G)示出了相同菌株的补料分批发酵。红色箭头表示IPTG诱导的开始。在(E)、(F)和(G)中，蓝色的线和点表示细胞生长(OD600)，而红色的线和点表示6-甲基水杨酸浓度。
6-甲基水杨酸化合物的LC-MS分析的结果。(D)示出了在16种大肠杆菌菌株中试管规模的6-甲基水杨酸产量。蓝色部分指示产量为1mg/L或更高。(E)示出了在大肠杆菌BL21(DE3)pTac-Pg6MSAS-sfp pWAS-抗-pabA(pabA敲低sRNA质粒)菌株中6-甲基水杨酸产量的时间历程。(F)示出了在BAP1 pTac-Pg6MSAS pWAS-抗-pabA菌株中6-甲基水杨酸产量的时间历程。
(G)示出了相同菌株的补料分批发酵。红色箭头表示IPTG诱导的开始。在(E)、(F)和(G)中，蓝色的线和点表示细胞生长(OD600)，而红色的线和点表示6-甲基水杨酸浓度。
[0067] 图14示出了当将实施例2.1中选择的14种合成对照sRNA引入6种筛选的大肠杆菌菌株中并对产生的菌株进行试管规模的培养时的6-甲基水杨酸产量。
[0068] 图15的左图示出了当左图底部的基因在大肠杆菌BAP1 pTac-Pg6MSAS pWAS-抗-pabA(图12中示出最高的6-甲基水杨酸生产力的菌株)中过表达时烧瓶培养物中出现的6-甲基水杨酸的浓度。右图示出了大肠杆菌BAP1pTac-Pg6MSAS pWAS-抗-pabA pBBR1-accBCD1(示出最高生产力的菌株)的补料分批发酵的结果。
[0069] 图16示出了芦荟酮生物合成途径。此处，红色X表示敲除基因，而蓝色X表示敲低基因。Glc，葡萄糖；G6P，葡萄糖6-磷酸；F6P，果糖6-磷酸；F1,6BP，果糖1,6-二磷酸；DHAP，磷酸二羟丙酮；G3P，3-磷酸甘油醛；1,3BPG，1,3-二磷酸甘油酸；3PG，3-磷酸甘油酸；2PG，2-磷酸甘油酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PYR，丙酮酸；OAA，草酰乙酸；E4P，D-赤藓糖4-磷酸；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸；CHOR，分支酸；AcCoA，乙酰-CoA；MalCoA，丙二酰-CoA；
R
ALS，芦荟酮合酶。bla，β-内酰胺酶基因；spc ，大观霉素-抗性基因；CDF，复制起点；ColE1，复制起点；PT7，T7启动子；PBAD，阿拉伯糖-诱导型启动子；PR，PR启动子；rrnB，rrnBT1T2终止子；T1/TE，终止子。
R
ALS，芦荟酮合酶。bla，β-内酰胺酶基因；spc ，大观霉素-抗性基因；CDF，复制起点；ColE1，复制起点；PT7，T7启动子；PBAD，阿拉伯糖-诱导型启动子；PR，PR启动子；rrnB，rrnBT1T2终止子；T1/TE，终止子。
[0070] 图17示出了经修饰的大肠杆菌菌株中的芦荟酮产量。(A)示出了为了分析芦荟酮合酶(RpALS，43kDa)和芦荟酮合酶(AaPKS3，44kDa)的表达而进行的SDS-PAGE的结果。(B)示出了当使用葡萄糖/甘油作为碳源表达RpALS/AaPKS3时芦荟酮的产量。(C)示出了在大肠杆菌中产生的芦荟酮的LC-MS和MS/MS谱。(D)示出了BL21(DE3)pCDF-RpALS菌株中芦荟酮产量的时间历程，并且(E)示出了BL21(DE3)pCDF-RpALS pWAS-抗-pabA菌株中芦荟酮产量的时间历程。在(D)和(E)中，蓝色的线和点描绘细胞生长(OD600)，而红色的线和点描绘芦荟酮浓度。(F)示出了通过将实施例2.1中选择的14种合成对照sRNA引入两种类型的大肠杆菌菌株中而产生的菌株的试管规模培养的结果。
[0071] 图18示出了当图底部的基因在BL21(DE3)pCDF-RpALS pWAS-抗-pabA(图17(E)中示出最高的芦荟酮生产力的菌株)中过表达时烧瓶培养物中出现的芦荟酮的浓度。
[0072] 图19示出了白藜芦醇生物合成途径。此处，红色X表示敲除基因，而蓝色X表示敲低基因。黑色箭头以及用粗体字母书写的基因表示过表达的代谢通量。红色虚线(以及圆圈中的符号-)指示转录抑制。黑色虚线(以及圆圈中的符号+)指示转录激活。Gly，甘油；Gly-3P，3-磷酸甘油；DHA，二羟丙酮；DHAP，磷酸二羟丙酮；G3P，3-磷酸甘油醛；1,3BPG，1,3-二磷酸甘油酸；3PG，3-磷酸甘油酸；2PG，2-磷酸甘油酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PYR，丙酮酸；OAA，草酰乙酸；E4P，D-赤藓糖4-磷酸；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸；SHIK，莽草酸；
CHOR，分支酸；PPHN，预苯酸；HPP，4-羟基苯丙酮酸；FOR，甲酸；AcCoA，乙酰-CoA；MalCoA，丙二酰-CoA。bla，β-内酰胺酶基因；kanR，卡那霉素-抗性基因；spcR，大观霉素-抗性基因；
p15A，复制起点；ColE1，复制起点；CDF，复制起点；Ptac，tac启动子；PBAD，阿拉伯糖-诱导型启动子；PR，PR启动子；Ptrc，trc启动子；rrnB，rrnBT1T2终止子；T1/TE，终止子。
CHOR，分支酸；PPHN，预苯酸；HPP，4-羟基苯丙酮酸；FOR，甲酸；AcCoA，乙酰-CoA；MalCoA，丙二酰-CoA。bla，β-内酰胺酶基因；kanR，卡那霉素-抗性基因；spcR，大观霉素-抗性基因；
p15A，复制起点；ColE1，复制起点；CDF，复制起点；Ptac，tac启动子；PBAD，阿拉伯糖-诱导型启动子；PR，PR启动子；Ptrc，trc启动子；rrnB，rrnBT1T2终止子；T1/TE，终止子。
[0073] 图20示出了通过经修饰的大肠杆菌菌株得到的对香豆酸和白藜芦醇的产量。(A)示出了通过各种经构建用于检验N末端蛋白质标签的作用的质粒得到的对香豆酸的产量。将除了pTY13-HisTAL以外的每一种载体转化至BTY5.13菌株中，并将pTY13-HisTAL转化至BTY5菌株中。(B)示出了为了分析每种蛋白质表达而进行的SDS-PAGE的结果。At4CL1m(61.1kDa)，At4CL3(61.3kDa)，At4CL4(62.6kDa)，Sc4CLm(55.3kDa)，STS(42.8kDa)。CT描绘了对照。M描绘了蛋白质大小标记物。(C)示出了通过STS和不同4CL的组合得到的白藜芦醇产量的结果。(D)示出了通过不同质粒构建策略得到的白藜芦醇产量。此处，1至5描述了质粒，并且每种质粒如下。1，pTac-VvSTS-At4CL1m；2，pTac-At4CL1m-opr-VvSTS(表达操纵子中的两个基因)；3，pTac-At4CL1m-fus-VvSTS(表达At4CL1m和STS的融合蛋白)；4和5，pTacCDF-VvSTS-At4CL1m。此处，将对应于1至4的质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)中并将其在
2mM对香豆酸和20g/L甘油的存在下培养。将对应于5的质粒引入BTY5 pTY13-HisTAL中，并将其在20g/L甘油的存在下培养。对应于5的菌株用作产生白藜芦醇的碱性菌株，并通过较深的蓝色条指示。(E)示出了通过将实施例2.1中选择的14种合成对照sRNA转化至产生白藜芦醇的碱性菌株(BTY5 pTY13-HisTAL pTacCDF-VvSTS-At4CL1m)中，接着进行烧瓶培养获得的白藜芦醇的产量。与对照相比，展示为较深的红色图的对应于六种菌株的sRNA示出白藜芦醇产量的2.5倍增加，因此将这六种sRNA用于组合双敲低测试中。(F)示出了使用先前选择的六种sRNA的组合的组合双敲低测试的结果。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(双尾学生t检验)。
2mM对香豆酸和20g/L甘油的存在下培养。将对应于5的质粒引入BTY5 pTY13-HisTAL中，并将其在20g/L甘油的存在下培养。对应于5的菌株用作产生白藜芦醇的碱性菌株，并通过较深的蓝色条指示。(E)示出了通过将实施例2.1中选择的14种合成对照sRNA转化至产生白藜芦醇的碱性菌株(BTY5 pTY13-HisTAL pTacCDF-VvSTS-At4CL1m)中，接着进行烧瓶培养获得的白藜芦醇的产量。与对照相比，展示为较深的红色图的对应于六种菌株的sRNA示出白藜芦醇产量的2.5倍增加，因此将这六种sRNA用于组合双敲低测试中。(F)示出了使用先前选择的六种sRNA的组合的组合双敲低测试的结果。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(双尾学生t检验)。
[0074] 图21示出了为了确定由经修饰的大肠杆菌产生的白藜芦醇的真实性而进行的LC-MS的结果。(A)示出了由经修饰的大肠杆菌产生的白藜芦醇的LC-MS谱，并且(B)示出了可商购的白藜芦醇化合物的LC-MS谱。
[0075] 图22示出了柚皮素生物合成途径。此处，红色X表示敲除基因，而蓝色X表示敲低基因。黑色箭头以及用粗体字母书写的基因表示过表达的代谢通量。红色虚线(以及圆圈中的符号-)指示转录抑制。黑色虚线(以及圆圈中的符号+)指示转录激活。bla，β-内酰胺酶基因；kanR，卡那霉素-抗性基因；spcR，大观霉素-抗性基因；p15A，复制起点；ColE1，复制起点；CDF，复制起点；Ptac，tac启动子；PBAD，阿拉伯糖-诱导型启动子；PR，PR启动子；Ptrc，trc启动子；rrnB，rrnBT1T2终止子；T1/TE，终止子。Gly，甘油；Gly-3P，3-磷酸甘油；DHA，二羟丙酮；
DHAP，磷酸二羟丙酮；G3P，3-磷酸甘油醛；1,3BPG，1,3-二磷酸甘油酸；3PG，3-磷酸甘油酸；
2PG，2-磷酸甘油酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PYR，丙酮酸；OAA，草酰乙酸；E4P，D-赤藓糖4-磷酸；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸；SHIK，莽草酸；CHOR，分支酸；PPHN，预苯酸；
HPP，4-羟基苯丙酮酸；FOR，甲酸；AcCoA，乙酰-CoA；MalCoA，丙二酰-CoA；TYR，L-酪氨酸；
COU，对香豆酸；CouCoA，对香豆酰-CoA。
DHAP，磷酸二羟丙酮；G3P，3-磷酸甘油醛；1,3BPG，1,3-二磷酸甘油酸；3PG，3-磷酸甘油酸；
2PG，2-磷酸甘油酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PYR，丙酮酸；OAA，草酰乙酸；E4P，D-赤藓糖4-磷酸；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸；SHIK，莽草酸；CHOR，分支酸；PPHN，预苯酸；
HPP，4-羟基苯丙酮酸；FOR，甲酸；AcCoA，乙酰-CoA；MalCoA，丙二酰-CoA；TYR，L-酪氨酸；
COU，对香豆酸；CouCoA，对香豆酰-CoA。
[0076] 图23示出了经修饰的大肠杆菌中的柚皮素产量。(A)示出了含有pTrcCDF-At4CL1m-AtCHI-PhCHS质粒的菌株中的柚皮素产量。此处，在具有对香豆酸途径的菌株的情况下，将载体转化至BTY5 pTY13-HisTAL菌株中，而在其他情况下，将载体转化至BL21(DE3)菌株中，然后将2mM对香豆酸添加至培养基中。添加20g/L的葡萄糖或甘油。(B)示出了异源酶的SDS-PAGE分析。At4CL1m，PhCHS(42.6kDa)，AtCHI(26.6kDa)。
[0077] 图24示出了为了确定由经修饰的大肠杆菌产生的柚皮素的真实性而进行的LC-MS的结果。(A)示出了由经修饰的大肠杆菌产生的柚皮素的LC-MS谱，并且(B)示出了可商购的柚皮素化合物的LC-MS谱。
[0078] 图25示出了经修饰的大肠杆菌中的柚皮素产量。(A)示出了将实施例2.1中选择的14种合成对照sRNA转化至碱性柚皮素菌株(BTY5 pTY13-HisTAL pTrcCDF-At4CL1m-AtCHI-PhCHS)中，然后进行烧瓶培养而产生的柚皮素的量。与对照相比，展示为较深的红色条的对应于三种菌株的sRNA示出柚皮素产量增加15％或更多，因此将这三种sRNA用于组合双敲低测试。(B)示出了使用先前选择的三种sRNA的组合的组合双敲低测试的结果。*P<0.05，**P<
0.01(双尾学生t检验)。
0.01(双尾学生t检验)。
具体实施方式
[0079] 除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的那些相同的含义。通常，本文使用的命名法和下文将描述的实验方法是本领域公知且常用的方法。
[0080] 在本发明中，已发现与常规的测量丙二酰-CoA浓度的方法相比，使用引入III型聚酮合酶的重组微生物使得能够以在时间、成本、便利性等方面显著改善的方式来测量丙二酰-CoA浓度。
[0081] 因此，在一方面，本发明涉及用于丙二酰-CoA检测的重组微生物，在其中III型聚酮合酶编码基因插入所述微生物的基因组中或在其中引入了含有III型聚酮合酶编码基因的重组载体。
[0082] 在本发明中，III型聚酮合酶可以是：
[0083] 源自选自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)和针孢链霉菌(Streptomyces aculeolatus)的微生物的RppA；
[0084] 源自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的PhlD(聚酮合酶)；
[0085] 源自地中海拟无枝菌酸菌的DpgA(聚酮合酶)；
[0086] 源自掌叶大黄的ALS(芦荟酮合酶)；或
[0087] 源自木立芦荟(Aloe arborescens)的PCS(5,7-二羟基-2-甲基色酮合酶)、OKS(八酮合酶)、PKS3(芦荟酮合酶)、PKS4(八酮合酶2)或PKS5(八酮合酶3)，但不限于这些。
[0088] 源自上述六种放线菌(Actinomycetes)菌株的III型聚酮合酶RppA使用丙二酰-CoA作为底物产生淡黄霉素作为产物。此外，其他III型聚酮合酶也使用丙二酰-CoA作为底物，但PhlD产生间苯三酚作为产物，DpgA产生二羟基苯乙酸酯作为产物，PCS产生5,7-二羟基-2-甲基色酮作为产物，并且OKS、PKS4或PKS5产生SEK4和SEK4b作为产物。ALS和PKS3产生芦荟酮作为产物。
[0089] 用于本发明的每种RppA酶的氨基酸序列如下：
[0090] 灰色链霉菌RppA[SEQ ID NO:93]：
[0091]
[0092] 天蓝色链霉菌RppA[SEQ ID NO:94]：
[0093]
[0094] 阿维链霉菌RppA[SEQ ID NO:95]：
[0095]
[0096] 红色糖多孢菌RppA[SEQ ID NO:96]：
[0097]
[0098] 波赛链霉菌RppA[SEQ ID NO:97]：
[0099]
[0100] 针孢链霉菌RppA[SEQ ID NO:98]：
[0101]
[0102] 用于本发明的其他III型聚酮合酶的氨基酸序列如下：
[0103] 荧光假单胞菌III型聚酮合酶(PhlD)[SEQ ID NO:99]：
[0104]
[0105] 东方拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis orientalis)III型聚酮合酶(DpgA)[SEQ ID NO:100]：
[0106]
[0107] 掌叶大黄(Rheum palmatum)III型聚酮合酶(芦荟酮合酶，ALS)[SEQ ID NO:101]：
[0108]
[0109] 木立芦荟(Aloe arborescens)III型聚酮合酶(5,7-二羟基-2-甲基色酮合酶，PCS)[SEQ ID NO:102]：
[0110]
[0111] 木立芦荟III型聚酮合酶(八酮合酶，OKS)[SEQ ID NO:103]：
[0112]
[0113] 木立芦荟III型聚酮合酶(芦荟酮合酶，PKS3)[SEQ ID NO:104]：
[0114]
[0115]
[0116] 木立芦荟III型聚酮合酶(八酮合酶2，PKS4)[SEQ ID NO:105]：
[0117]
[0118] 木立芦荟III型聚酮合酶(八酮合酶3，PKS5)[SEQ ID NO:106]：
[0119]
[0120] 上述III型聚酮合酶的氨基酸序列示出了一些可用于构建根据本发明的用于丙二酰-CoA检测的重组微生物的酶。本发明的技术特征在于可通过引入III型聚酮合酶进行丙二酰-CoA检测。因此，对于本领域技术人员明显的是，本发明使得可以构建引入除上述III型聚酮合酶之外的III型聚酮合酶的重组微生物。
[0121] 在本发明中，重组微生物的特征可以在于编码III型聚酮合酶的基因与选自tac、trc、T7、BAD、λPR和Anderson合成启动子(但不限于这些)的启动子可操作地连接。
[0122] 在本发明中，重组微生物可以选自由以下项组成的菌株组：大肠杆菌、根瘤菌属(Rhizobium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、假丝酵母属(Candida)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属
(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红杆菌属(Rhodobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、蓝细菌(Cyanobacterium)和圆杆菌属(Cyclobacterium)，但应用本发明的微生物不限于这些。优选地，本发明的重组微生物可以通过将重组载体引入选自大肠杆菌、假单胞菌属物种、棒杆菌属物种和红球菌属物种(但不限于这些)的微生物中来构建。
作为大肠杆菌，优选使用选自下表2中所示的大肠杆菌菌株中的一种，但是本领域技术人员将理解，也可以使用预期表现出类似效果的其他大肠杆菌菌株。本发明的重组微生物可以通过使用作为假单胞菌属物种的恶臭假单胞菌、作为棒杆菌属物种的谷氨酸棒杆菌和作为红球菌属物种的混浊红球菌来构建，但这是代表性微生物的例子，并且应用本发明的微生物不限于这些。
(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红杆菌属(Rhodobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、蓝细菌(Cyanobacterium)和圆杆菌属(Cyclobacterium)，但应用本发明的微生物不限于这些。优选地，本发明的重组微生物可以通过将重组载体引入选自大肠杆菌、假单胞菌属物种、棒杆菌属物种和红球菌属物种(但不限于这些)的微生物中来构建。
作为大肠杆菌，优选使用选自下表2中所示的大肠杆菌菌株中的一种，但是本领域技术人员将理解，也可以使用预期表现出类似效果的其他大肠杆菌菌株。本发明的重组微生物可以通过使用作为假单胞菌属物种的恶臭假单胞菌、作为棒杆菌属物种的谷氨酸棒杆菌和作为红球菌属物种的混浊红球菌来构建，但这是代表性微生物的例子，并且应用本发明的微生物不限于这些。
[0123] 同时，在本发明中，当使用用于丙二酰-CoA检测的重组微生物(在其中III型聚酮合酶编码基因插入微生物的基因组中或在其中引入了含有III型聚酮合酶编码基因的重组载体)时，可以通过来自丙二酰-CoA的浓度依赖性显色容易地确认丙二酰-CoA的产量，并且可以容易地筛选丙二酰-CoA产生诱导物质。
[0124] 因此，在另一方面，本发明涉及筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法，其包括以下步骤：
[0125] (a)培养所述重组微生物；
[0126] (b)向所述重组微生物中添加候选物质；
[0127] (c)将添加所述候选物质后的所述重组微生物的培养上清液的颜色与没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液的颜色进行比较；并且
[0128] (d)当添加所述候选物质后所述重组微生物的培养上清液显示出比没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。
[0129] 在本发明中，步骤(c)可以包括通过肉眼清楚地观察颜色的变化，或者测量吸光度并定量地表示吸光度的变化。
[0130] 因此，步骤(c)中颜色之间的比较可以通过肉眼进行。
[0131] 另外，步骤(c)中颜色之间的比较可以通过测量吸光度来进行，并且步骤(d)可以包括当添加所述候选物质后测量的吸光度高于未添加所述候选物质的情况下测量的吸光度时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。
[0132] 在本发明中，可以测量280至450nm、优选300至340nm的吸光度(OD值)，并且OD值随着丙二酰-CoA浓度的增加而增加。
[0133] 丙二酰-CoA产生诱导物质可以通过如下机制诱导丙二酰-CoA的产生，所述机制调节参与增加丙二酰-CoA产生的基因的表达。
[0134] 因此，在再另一方面，本发明涉及筛选参与增加丙二酰基-CoA产生的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
[0135] (a)将改变重组微生物中的基因表达的基因调节文库引入上述重组微生物中，从而构建所述重组微生物中的基因表达发生改变的重组微生物文库；
[0136] (b)培养所述构建的重组微生物文库，测量所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度，培养所述重组微生物然后将所述基因调节文库引入，并比较所述重组微生物文库的培养上清液的颜色与在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的颜色；并且
[0137] (c)当所述重组微生物文库的培养上清液显示出比在将所述基因调节文库引入之前重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择引入所述重组微生物文库中的基因。
[0138] 在本发明中，步骤(b)可以包括通过肉眼清楚地观察颜色的变化，或者测量吸光度并定量地表示吸光度的变化。
[0139] 因此，步骤(c)中颜色的比较可以通过肉眼进行。
[0140] 另外，步骤(b)中的颜色之间的比较是通过测量吸光度来进行，并且步骤(c)可以包括当所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度高于在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的吸光度时，选择在所述重组微生物文库中引入的基因作为参与增加丙二酰-CoA产生的基因。
[0141] 在本发明中，可以测量280至450nm、优选300至340nm的吸光度(OD值)，并且OD值随着丙二酰-CoA浓度的增加而增加。
[0142] 在本发明中，基因调节文库可以是选自以下的文库：sRNA文库、基因组文库、cDNA文库、gRNA文库和用于构建敲除或突变菌株的寡核苷酸文库，但不限于这些。
[0143] 具体地，为了达到本发明的目的，基因调节文库可以适当地选自以下：
[0144] sRNA文库或用于构建敲除或突变菌株以抑制重组微生物中的内源基因表达的寡核苷酸文库；
[0145] 作为针对内源或外源基因过表达的文库的基因组文库或cDNA文库；和
[0146] gRNA(指导RNA，其用于CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)-Cas9技术)文库，它是能够实现基因表达抑制和基因过表达二者的文库。
[0147] 也就是说，以下实施例2中描述的合成对照sRNA文库的添加是用于描述本发明的例子，并且呈现了使用所述合成对照sRNA文库的方法，并且可以引入表现出类似功能的任何其他文库。
[0148] 同时，当微生物中通过所述方法筛选的基因被敲低时，可以增加微生物中丙二酰-CoA产量。因此，在又另一个方面，本发明涉及产生具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物的方法，所述方法包括调节通过所述方法筛选的基因在具有丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达。
[0149] 具有丙二酰-CoA产生能力的微生物意指固有地具有丙二酰-CoA产生能力或外部引入丙二酰-CoA产生能力的微生物。
[0150] 在本发明中，筛选的基因可以是选自以下项的一种或多种基因：
[0151] fabF(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II)；
[0152] yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；
[0153] xapR(xapAB的转录激活因子)；
[0154] cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；
[0155] fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；
[0156] mqo(苹果酸脱氢酶)；
[0157] yfiD(丙酮酸甲酸裂解酶亚基)；
[0158] fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶)；
[0159] pyrF(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)；
[0160] araA(L-阿拉伯糖异构酶)；
[0161] fadR(fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子)；
[0162] pabA(氨基脱氧分支酸合酶，亚基II)；
[0163] purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)；和
[0164] hycI(参与加工HycE的C末端的蛋白酶)，
[0165] 并且可以减少所述基因的表达，但所述筛选的基因不限于这些。
[0166] 在本发明中，对应地，fabF编码3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II，yfcY编码β-酮酰-CoA硫解酶，xapR编码xapAB的转录激活因子，cytR编码deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物，fabH编码3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III，mqo编码苹果酸脱氢酶，yfiD编码丙酮酸甲酸裂解酶亚基，fmt编码10-甲酰基四氢叶酸:L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶，pyrF编码乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶，araA编码L-阿拉伯糖异构酶，fadR编码fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子，pabA编码氨基脱氧分支酸合酶亚基II，purB编码腺苷酸琥珀酸裂解酶，并且hycI编码参与加工HycE的C末端的蛋白酶。
[0167] 被筛选并用于本发明的每种酶的氨基酸序列如下，但可以在氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加，并且在这种情况下，得到的突变氨基酸序列可以表现出与本发明相同或更好的功能。例如，明显的是，如果突变氨基酸序列的结构构型与野生型氨基酸序列相同或类似，并因此对底物表现出相同或更高的作用，则突变氨基酸序列也落入本发明的范围内。在相同的上下文中，明显的是，除了本发明中使用的酶之外，具有相同或类似功能的其他微生物来源的酶可以适当地应用于本发明，并且相应酶的在可由本领域普通技术人员容易地应用的范围内的应用落入本发明的范围内。
[0168] FabF[SEQ ID NO:107]：
[0169] MSKRRVVVTGLGMLSPVGNTVESTWKALLAGQSGISLIDHFDTSAYATKFAGLVKDFNCEDIISRKEQRKMDAFIQYGIVAGVQAMQDSGLEITEENATRIGAAIGSGIGGLGLIEENHTSLMNGGPRKISPFFVPSTIVNMVAGHLTIMYGLRGPSISIATACTSGVHNIGHAARIIAYGDADVMVAGGAEKASTPLGVGGFGAARALSTRNDNPQAASRPWDKERDGFVLGDGAGMLVLEEYEHAKKRGAKIYAELVGFGMSSDAYHMTSPPENGAGAALAMANALRDAGIEASQIGYVNAHGTSTPAGDKAEAQAVKTIFGEAASRVLVSSTKSMTGHLLGAAGAVESIYSILALRDQAVPPTINLDNPDEGCDLDFVPHEARQVSGMEYTLCNSFGFGGTNGSLIFKKI
[0170] YfcY[SEQ ID NO:108]：
[0171] MGQVLPLVTRQGDRIAIVSGLRTPFARQATAFHGIPAVDLGKMVVGELLARSEIPAEVIEQLVFGQVVQMPEAPNIAREIVLGTGMNVHTDAYSVSRACATSFQAVANVAESLMAGTIRAGIAGGADSSSVLPIGVSKKLARVLVDVNKARTMSQRLKLFSRLRLRDLMPVPPAVAEYSTGLRMGDTAEQMAKTYGITREQQDALAHRSHQRAAQAWSDGKLKEEVMTAFIPPYKQPLVEDNNIRGNSSLADYAKLRPAFDRKHGTVTAANSTPLTDGAAAVILMTESRAKELGLVPLGYLRSYAFTAIDVWQDMLLGPAWSTPLALERAGLTMSDLTLIDMHEAFAAQTLANIQLLGSERFAREALGRAHATGEVDDSKFNVLGGSIAYGHPFAATGARMITQTLHELRRRGGGFGLVTACAAGGLGAAMVLEAE
[0172] XapR[SEQ ID NO:109]：
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[0175] MKAKKQETAATMKDVALKAKVSTATVSRALMNPDKVSQATRNRVEKAAREVGYLPQPMGRNVKRNESRTILVIVPDICDPFFSEIIRGIEVTAANHGYLVLIGDCAHQNQQEKTFIDLIITKQIDGMLLLGSRLPFDASIEEQRNLPPMVMANEFAPELELPTVHIDNLTAAFDAVNYLYEQGHKRIGCIAGPEEMPLCHYRLQGYVQALRRCGIMVDPQYIARGDFTFEAGSKAMQQLLDLPQPPTAVFCHSDVMALGALSQAKRQGLKVPEDLSIIGFDNIDLTQFCDPPLTTIAQPRYEIGREAMLLLLDQMQGQHVGSGSRLMDCELIIRGSTRALP
[0176] FabH[SEQ ID NO:111]：
[0177] MYTKIIGTGSYLPEQVRTNADLEKMVDTSDEWIVTRTGIRERHIAAPNETVSTMGFEAATRAIEMAGIEKDQIGLIVVATTSATHAFPSAACQIQSMLGIKGCPAFDVAAACAGFTYALSVADQYVKSGAVKYALVVGSDVLARTCDPTDRGTIIIFGDGAGAAVLAASEEPGIISTHLHADGSYGELLTLPNADRVNPENSIHLTMAGNEVFKVAVTELAHIVDETLAANNLDRSQLDWLVPHQANLRIISATAKKLGMSMDNVVVTLDRHGNTSAASVPCALDEAVRDGRIKPGQLVLLEAFGGGFTWGSALVRF
[0178] Mqo[SEQ ID NO:112]：
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[0180] YfiD[SEQ ID NO:113]：
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[0182] Fmt[SEQ ID NO:114]：
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[0184] PyrF[SEQ ID NO:115]：
[0185] MTLTASSSSRAVTNSPVVVALDYHNRDDALAFVDKIDPRDCRLKVGKEMFTLFGPQFVRELQQRGFDIFLDLKFHDIPNTAAHAVAAAADLGVWMVNVHASGGARMMTAAREALVPFGKDAPLLIAVTVLTSMEASDLVDLGMTLSPADYAERLAALTQKCGLDGVVCSAQEAVRFKQVFGQEFKLVTPGIRPQGSEAGDQRRIMTPEQALSAGVDYMVIGRPVTQSVDPAQTLKAINASLQRSA
[0186] AraA[SEQ ID NO:116]：
[0187] MTIFDNYEVWFVIGSQHLYGPETLRQVTQHAEHVVNALNTEAKLPCKLVLKPLGTTPDEITAICRDANYDDRCAGLVVWLHTFSPAKMWINGLTMLNKPLLQFHTQFNAALPWDSIDMDFMNLNQTAHGGREFGFIGARMRQQHAVVTGHWQDKQAHERIGSWMRQAVSKQDTRHLKVCRFGDNMREVAVTDGDKVAAQIKFGFSVNTWAVGDLVQVVNSISDGDVNALVDEYESCYTMTPATQIHGKKRQNVLEAARIELGMKRFLEQGGFHAFTTTFEDLHGLKQLPGLAVQRLMQQGYGFAGEGDWKTAALLRIMKVMSTGLQGGTSFMEDYTYHFEKGNDLVLGSHMLEVCPSIAAEEKPILDVQHLGIGGKDDPARLIFNTQTGPAIVASLIDLGDRYRLLVNCIDTVKTPHSLPKLPVANALWKAQPDLPTASEAWILAGGAHHTVFSHALNLNDMRQFAEMHDIEITVIDNDTRLPAFKDALRWNEVYYGFRR
[0188] ArgC[SEQ ID NO:117]：
[0189] MLNTLIVGASGYAGAELVTYVNRHPHMNITALTVSAQSNDAGKLISDLHPQLKGIVDLPLQPMSDISEFSPGVDVVFLATAHEVSHDLAPQFLEAGCVVFDLSGAFRVNDATFYEKYYGFTHQYPELLEQAAYGLAEWCGNKLKEANLIAVPGCYPTAAQLALKPLIDADLLDLNQWPVINATSGVSGAGRKAAISNSFCEVSLQPYGVFTHRHQPEIATHLGADVIFTPHLGNFPRGILETITCRLKSGVTQAQVAQVLQQAYAHKPLVRLYDKGVPALKNVVGLPFCDIGFAVQGEHLIIVATEDNLLKGAAAQAVQCANIRFGYAETQSLI
[0190] FadR[SEQ ID NO:118]：
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[0194] PabA[SEQ ID NO:120]：
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[0196] PurB[SEQ ID NO:121]：
[0197] MELSSLTAVSPVDGRYGDKVSALRGIFSEYGLLKFRVQVEVRWLQKLAAHAAIKEVPAFAADAIGYLDAIVASFSEEDAARIKTIERTTNHDVKAVEYFLKEKVAEIPELHAVSEFIHFACTSEDINNLSHALMLKTARDEVILPYWRQLIDGIKDLAVQYRDIPLLSRTHGQPATPSTIGKEMANVAYRMERQYRQLNQVEILGKINGAVGNYNAHIAAYPEVDWHQFSEEFVTSLGIQWNPYTTQIEPHDYIAELFDCVARFNTILIDFDRDVWGYIALNHFKQKTIAGEIGSSTMPHKVNPIDFENSEGNLGLSNAVLQHLASKLPVSRWQRDLTDSTVLRNLGVGIGYALIAYQSTLKGVSKLEVNRDHLLDELDHNWEVLAEPIQTVMRRYGIEKPYEKLKELTRGKRVDAEGMKQFIDGLALPEEEKARLKAMTPANYIGRAITMVDELK
[0198] HycI[SEQ ID NO:122]：
[0199] MTDVLLCVGNSMMGDDGAGPLLAEKCAAAPKGNWVVIDGGSAPENDIVAIRELRPTRLLIVDATDMGLNPGEIRIIDPDDIAEMFMMTTHNMPLNYLIDQLKEDIGEVIFLGIQPDIVGFYYPMTQPIKDAVETVYQRLEGWEGNGGFAQLAVEEE
[0200] 在本发明中，重组微生物可以选自大肠杆菌、根瘤菌属(Rhizobium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、假丝酵母属(Candida)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红杆菌属(Rhodobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、蓝细菌(Cyanobacterium)和圆杆菌属(Cyclobacterium)，但可以应用本发明的微生物不限于这些。优选地，本发明的微生物可以通过将重组载体引入选自大肠杆菌、假单胞菌属物种、棒杆菌属物种和红球菌属物种(但不限于这些)的微生物中来构建。作为大肠杆菌，优选使用选自下表2中所示的大肠杆菌菌株中的一种，但是本领域技术人员将理解，也可以使用预期表现出类似效果的其他大肠杆菌菌株。本发明的重组微生物可以通过使用作为假单胞菌属物种的恶臭假单胞菌、作为棒杆菌属物种的谷氨酸棒杆菌和作为红球菌属物种的混浊红球菌来构建，但这是代表性微生物的例子，并且应用本发明的微生物不限于这些。
[0201] 此外，利用丙二酰-CoA作为底物或中间体，使用筛选的基因仅通过非常简单的遗传操作能够以高产率产生有用的物质。
[0202] 因此，在第一个另外的方面，本发明涉及具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物，其中选自以下基因的一种或多种基因：
[0203] fabF(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II)；
[0204] yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；
[0205] xapR(xapAB的转录激活因子)；
[0206] cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；
[0207] fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；
[0208] mqo(苹果酸脱氢酶)；
[0209] yfiD(丙酮酸甲酸裂解酶亚基)；
[0210] fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶)；
[0211] pyrF(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)；
[0212] araA(L-阿拉伯糖异构酶)；
[0213] fadR(fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子)；
[0214] pabA(氨基脱氧分支酸合酶，亚基II)；
[0215] purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)；和
[0216] hycI(参与加工HycE的C末端的蛋白酶)在具有丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达与在野生型微生物中的表达相比降低。
[0217] 具有丙二酰-CoA产生能力的微生物意指固有地具有丙二酰-CoA产生能力或外部引入丙二酰-CoA产生能力的微生物。
[0218] 本发明还涉及使用丙二酰-CoA作为底物或中间体产生有用物质的方法，所述方法包括以下步骤：
[0219] (a)构建重组微生物，其中另外引入参与所述有用物质产生的基因或增加所述基因的表达，或者另外使参与所述有用物质产生的基因缺失或减少所述基因的表达；
[0220] (b)培养所构建的微生物；并且
[0221] (c)从所培养的微生物回收所述有用物质。
[0222] 在本发明中，有用物质可以是选自以下项的一种或多种有用物质：
[0223] 聚酮化合物，其由放线菌紫素、多柔比星、道诺霉素、土霉素、雷帕霉素、洛伐他汀、SEK4、SEK4b、SEK34、SEK15、SEK26、FK506、DMAC、阿克拉菌酮、阿克拉酸、ε-紫红霉酮、芦荟苦素、芦荟宁、芦荟苷、5,7-二羟基-2-甲基色酮、红霉素、利福霉素、阿维菌素、格尔德霉素、伊维菌素、多西环素、安曲霉素、青霉酸、卡奇霉素、埃博霉素、特曲霉素、富伦菌素、三乙酸内酯、6-甲基水杨酸和芦荟酮构成；
[0224] 苯丙素类化合物，其由松属素、二氢山柰酚、圣草酚、二氢槲皮素、黄豆苷元、染料木素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、槲皮素、儿茶素、天竺葵色素、矢车菊素、阿福豆素、杨梅素、非瑟酮、高良姜素、橙皮素、柑桔黄酮、花翠素、表儿茶素、白杨素、白藜芦醇和柚皮素构成；
[0225] 生物燃料组，其由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、十九烷醇、二十烷醇、癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、花生酸甲酯、二十烯酸甲酯、芥酸甲酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、棕榈油酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯、花生酸乙酯、二十烯酸乙酯和芥酸甲酯构成；
[0226] 由神经酰胺、棕榈酸酯和鞘氨醇构成的脂质化合物；和
[0227] 3-羟基丙酸，但不限于这些。换言之，本发明的生物传感器(即重组微生物)可以应用于高价值产物，如除了上述有用物质之外的其他任何丙二酰-CoA来源的天然物质、化合物、生物燃料等。
[0228] 本发明还涉及用于产生6-甲基水杨酸的重组微生物，其中在重组微生物中另外引入了编码6-甲基水杨酸合酶(6MSAS)和4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)的基因，或者增加所述基因的表达。
[0229] 6MSAS可以源自展青霉(Penicillium patulum)(或灰黄青霉(Penicillium griseofulvum))、土曲霉(Aspergillus terreus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、韦斯特迪克氏曲霉(Aspergillus westerdijkiae)、雪白丝衣霉(Byssochlamys nivea)、Glarea lozoyensis、扩展青霉(Penicillium expansum)或抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)，但不限于这些。
[0230] Sfp可以源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、智人(Homo sapiens)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻(Ricinus communis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、菠菜(Spinacia oleracea)、橙黄标桩菌(Stigmatella aurantiaca)、天蓝色链霉菌、肺炎链霉菌(Streptomyces pneumonia)、轮丝链霉菌(Streptomyces verticillus)或哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，但不限于这些。
[0231] 与野生型微生物中基因的表达相比表达降低的基因可以是选自pabA、fabF、xapR和ytcY的一种或多种，但不限于此。
[0232] 用于产生6-甲基水杨酸的重组微生物的特征可以在于：在重组微生物中另外引入了编码选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)、苹果酸脱氢酶(Mdh)、磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、乙酰-CoA羧化酶(AccBC和AccD1)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GapA)、磷酸甘油酸激酶(Pgk)、乙酰-CoA合成酶(Acs)和丙酮酸脱氢酶(PDH：AceEF和Lpd)的一种或多种酶的基因或增加所述基因的表达。
[0233] Zwf、Mdh、SerA、GapA、Pgk、Acs、AceE、AceF和Lpd可以源自大肠杆菌(E.coli)，但不限于此。AccBC和AccD1可以源自谷氨酸棒杆菌，但不限于此，并且可以扩展至对应于其他微生物来源的乙酰-CoA羧化酶的酶。
[0234] 被筛选并用于本发明的每种酶的氨基酸序列如下，但可以在氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加，并且在这种情况下，得到的突变氨基酸序列可以表现出与本发明相同或更好的功能。例如，明显的是，如果突变氨基酸序列的结构构型与野生型氨基酸序列相同或类似，并因此对底物表现出相同或更高的作用，则突变氨基酸序列也落入本发明的范围内。在相同的上下文中，明显的是，除了本发明中使用的酶之外，具有相同或类似功能的其他微生物来源的酶可以适当地应用于本发明，并且相应酶的在可由本领域普通技术人员容易地应用的范围内的应用落入本发明的范围内。
[0235] Zwf[SEQ ID NO:171]：
[0236] MAVTQTAQACDLVIFGAKGDLARRKLLPSLYQLEKAGQLNPDTRIIGVGRADWDKAAYTKVVREALETFMKETIDEGLWDTLSARLDFCNLDVNDTAAFSRLGAMLDQKNRITINYFAMP
[0237] PSTFGAICKGLGEAKLNAKPARVVMEKPLGTSLATSQEINDQVGEYFEECQVYRIDHYLGKETVLNLLALRFANSLFVNNWDNRTIDHVEITVAEEVGIEGRWGYFDKAGQMRDMIQNHLLQILCMIAMSPPSDLSADSIRDEKVKVLKSLRRIDRSNVREKTVRGQYTAGFAQGKKVPGYLEEEGANKSSNTETFVAIRVDIDNWRWAGVPFYLRTGKRLPTKCSEVVVYFKTPELNLFKESWQDLPQNKLTIRLQPDEGVDIQVLNKVPGLDHKHNLQITKLDLSYSETFNQTHLADAYERLLLETMRGIQALFVRRDEVEEAWKWVDSITEAWAMDNDAPKPYQAGTWGPVASVAMITRDGRSWNEFE[0238] Mdh[SEQ ID NO:172]：
[0239] MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDATPALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAAEVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGVSFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAYVEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
[0240] SerA[SEQ ID NO:173]：
[0241] MAKVSLEKDKIKFLLVEGVHQKALESLRAAGYTNIEFHKGALDDEQLKESIRDAHFIGLRSRTHLTEDVINAAEKLVAIGCFCIGTNQVDLDAAAKRGIPVFNAPFSNTRSVAELVIGELLLLLRGVPEANAKAHRGVWNKLAAGSFEARGKKLGIIGYGHIGTQLGILAESLGMYVYFYDIENKLPLGNATQVQHLSDLLNMSDVVSLHVPENPSTKNMMGAKEISLMKPGSLLINASRGTVVDIPALCDALASKHLAGAAIDVFPTEPATNSDPFTSPLCEFDNVLLTPHIGGSTQEAQENIGLEVAGKLIKYSDNGSTLSAVNFPEVSLPLHGGRRLMHIHENRPGVLTALNKIFAEQGVNIAAQYLQTSAQMGYVVIDIEADEDVAEKALQAMKAIPGTIRARLLY
[0242] GapA[SEQ ID NO:174]：
[0243] MTIKVGINGFGRIGRIVFRAAQKRSDIEIVAINDLLDADYMAYMLKYDSTHGRFDGTVEVKDGHLIVNGKKIRVTAERDPANLKWDEVGVDVVAEATGLFLTDETARKHITAGAKKVVMTGPSKDNTPMFVKGANFDKYAGQDIVSNASCTTNCLAPLAKVINDNFGIIEGLMTTVHATTATQKTVDGPSHKDWRGGRGASQNIIPSSTGAAKAVGKVLPELNGKLTGMAFRVPTPNVSVVDLTVRLEKAATYEQIKAAVKAAAEGEMKGVLGYTEDDVVSTDFNGEVCTSVFDAKAGIALNDNFVKLVSWYDNETGYSNKVLDLIAHISK
[0244] Pgk[SEQ ID NO:175]：
[0245] MSVIKMTDLDLAGKRVFIRADLNVPVKDGKVTSDARIRASLPTIELALKQGAKVMVTSHLGRPTEGEYNEEFSLLPVVNYLKDKLSNPVRLVKDYLDGVDVAEGELVVLENVRFNKGEKKDDETLSKKYAALCDVFVMDAFGTAHRAQASTHGIGKFADVACAGPLLAAELDALGKALKEPARPMVAIVGGSKVSTKLTVLDSLSKIADQLIVGGGIANTFIAAQGHDVGKSLYEADLVDEAKRLLTTCNIPVPSDVRVATEFSETAPATLKSVNDVKADEQILDIGDASAQELAEILKNAKTILWNGPVGVFEFPNFRKGTEIVANAIADSEAFSIAGGGDTLAAIDLFGIADKISYISTGGGAFLEFVEGKVLPAVAMLEERAKK
[0246] Acs[SEQ ID NO:176]：
[0247] MSQIHKHTIPANIADRCLINPQQYEAMYQQSINVPDTFWGEQGKILDWIKPYQKVKNTSFAPGNVSIKWYEDGTLNLAANCLDRHLQENGDRTAIIWEGDDASQSKHISYKELHRDVCRFANTLLELGIKKGDVVAIYMPMVPEAAVAMLACARIGAVHSVIFGGFSPEAVAGRIIDSNSRLVITSDEGVRAGRSIPLKKNVDDALKNPNVTSVEHVVVLKRTGGKIDWQEGRDLWWHDLVEQASDQHQAEEMNAEDPLFILYTSGSTGKPKGVLHTTGGYLVYAALTFKYVFDYHPGDIYWCTADVGWVTGHSYLLYGPLACGATTLMFEGVPNWPTPARMAQVVDKHQVNILYTAPTAIRALMAEGDKAIEGTDRSSLRILGSVGEPINPEAWEWYWKKIGNEKCPVVDTWWQTETGGFMITPLPGATELKAGSATRPFFGVQPALVDNEGNPLEGATEGSLVITDSWPGQARTLFGDHERFEQTYFSTFKNMYFSGDGARRDEDGYYWITGRVDDVLNVSGHRLGTAEIESALVAHPKIAEAAVVGIPHNIKGQAIYAYVTLNHGEEPSPELYAEVRNWVRKEIGPLATPDVLHWTDSLPKTRSGKIMRRILRKIAAGDTSNLGDTSTLADPGVVEKLLEEKQAIAMPS
[0248] AceE[SEQ ID NO:177]：
[0249] MSERFPNDVDPIETRDWLQAIESVIREEGVERAQYLIDQLLAEARKGGVNVAAGTGISNYINTIPVEEQPEYPGNLELERRIRSAIRWNAIMTVLRASKKDLELGGHMASFQSSATIYDVCFNHFFRARNEQDGGDLVYFQGHISPGVYARAFLEGRLTQEQLDNFRQEVHGNGLSSYPHPKLMPEFWQFPTVSMGLGPIGAIYQAKFLKYLEHRGLKDTSKQTVYAFLGDGEMDEPESKGAITIATREKLDNLVFVINCNLQRLDGPVTGNGKIINELEGIFEGAGWNVIKVMWGSRWDELLRKDTSGKLIQLMNETVDGDYQTFKSKDGAYVREHFFGKYPETAALVADWTDEQIWALNRGGHDPKKIYAAFKKAQETKGKATVILAHTIKGYGMGDAAEGKNIAHQVKKMNMDGVRHIRDRFNVPVSDADIEKLPYITFPEGSEEHTYLHAQRQKLHGYLPSRQPNFTEKLELPSLQDFGALLEEQSKEISTTIAFVRALNVMLKNKSIKDRLVPIIADEARTFGMEGLFRQIGIYSPNGQQYTPQDREQVAYYKEDEKGQILQEGINELGAGCSWLAAATSYSTNNLPMIPFYIYYSMFGFQRIGDLCWAAGDQQARGFLIGGTSGRTTLNGEGLQHEDGHSHIQSLTIPNCISYDPAYAYEVAVIMHDGLERMYGEKQENVYYYITTLNENYHMPAMPEGAEEGIRKGIYKLETIEGSKGKVQLLGSGSILRHVREAAEILAKDYGVGSDVYSVTSFTELARDGQDCERWNMLHPLETPRVPYIAQVMNDAPAVASTDYMKLFAEQVRTYVPADDYRVLGTDGFGRSDSRENLRHHFEVDASYVVVAALGELAKRGEIDKKVVADAIAKFNIDADKVNPRLA
[0250] AceF[SEQ ID NO:178]：
[0251] MAIEIKVPDIGADEVEITEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPSPQAGIVKEIKVSVGDKTQTGALIMIFDSADGAADAAPAQAEEKKEAAPAAAPAAAAAKDVNVPDIGSDEVEVTEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGTVKEIKVNVGDKVSTGSLIMVFEVAGEAGAAAPAAKQEAAPAAAPAPAAGVKEVNVPDIGGDEVEVTEVMVKVGDKVAAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGVVKELKVNVGDKVKTGSLIMIFEVEGAAPAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKAEGKSEFAENDAYVHATPLIRRLAREFGVNLAKVKGTGRKGRILREDVQAYVKEAIKRAEAAPAATGGGIPGMLPWPKVDFSKFGEIEEVELGRIQKISGANLSRNWVMIPHVTHFDKTDITELEAFRKQQNEEAAKRKLDVKITPVVFIMKAVAAALEQMPRFNSSLSEDGQRLTLKKYINIGVAVDTPNGLVVPVFKDVNKKGIIELSRELMTISKKARDGKLTAGEMQGGCFTISSIGGLGTTHFAPIVNAPEVAILGVSKSAMEPVWNGKEFVPRLMLPISLSFDHRVIDGADGARFITIINNTLSDIRRLVM
[0252] Lpd[SEQ ID NO:179]：
[0253] MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIGLEMGTVYHALGSQIDVVEMFDQVIPAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK
[0254] AccBC[SEQ ID NO:180]：
[0255] VSVETRKITKVLVANRGEIAIRVFRAARDEGIGSVAVYAEPDADAPFVSYADEAFALGGQTSAESYLVIDKIIDAARKSGADAIHPGYGFLAENADFAEAVINEGLIWIGPSPESIRSLGDKVTARHIADTAKAPMAPGTKEPVKDAAEVVAFAEEFGLPIAIKAAFGGGGRGMKVAYKMEEVADLFESATREATAAFGRGECFVERYLDKARHVEAQVIADKHGNVVVAGTRDCSLQRRFQKLVEEAPAPFLTDDQRERLHSSAKAICKEAGYYGAGTVEYLVGSDGLISFLEVNTRLQVEHPVTEETTGIDLVREMFRIAEGHELSIKEDPAPRGHAFEFRINGEDAGSNFMPAPGKITSYREPQGPGVRMDSGVVEGSEISGQFDSMLAKLIVWGDTREQALQRSRRALAEYVVEGMPTVIPFHQHIVENPAFVGNDEGFEIYTKWIEEVWDNPIAPYVDASELDEDEDKTPAQKVVVEINGRRVEVALPGDLALGGTAGPKKKAKKRRAGGAKAGVSGDAVAAPMQGTVIKVNVEEGAEVNEGDTVVVLEAMKMENPVKAHKSGTVTGLTVAAGEGVNKGVVLLEIK
[0256] AccD1[SEQ ID NO:181]：
[0257] MTISSPLIDVANLPDINTTAGKIADLKARRAEAHFPMGEKAVEKVHAAGRLTARERLDYLLDEGSFIETDQLARHRTTAFGLGAKRPATDGIVTGWGTIDGREVCIFSQDGTVFGGALGEVYGEKMIKIMELAIDTGRPLIGLYEGAGARIQDGAVSLDFISQTFYQNIQASGVIPQISVIMGACAGGNAYGPALTDFVVMVDKTSKMFVTGPDVIKTVTGEEITQEELGGATTHMVTAGNSHYTAATDEEALDWVQDLVSFLPSNNRSYTPLEDFDEEEGGVEENITADDLKLDEIIPDSATVPYDVRDVIECLTDDGEYLEIQADRAENVVIAFGRIEGQSVGFVANQPTQFAGCLDIDSSEKAARFVRTCDAFNIPIVMLVDVPGFLPGAGQEYGGILRRGAKLLYAYGEATVPKITVTMRKAYGGAYCVMGSKGLGSDINLAWPTAQIAVMGAAGAVGFIYRKELMAADAKGLDTVALAKSFEREYEDHMLNPYHAAERGLIDAVILPSETRGQISRNLRLLKHKNVTRPARKHGNMPL
[0258] 本发明还涉及产生6-甲基水杨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
[0259] (a)培养上述重组微生物；并且
[0260] (b)从所培养的微生物回收所述6-甲基水杨酸。
[0261] 本发明的产生6-甲基水杨酸的方法可以包括通过添加1-50g/L的葡萄糖或1-100g/L的甘油作为碳源来培养重组微生物。
[0262] 本发明还涉及用于产生芦荟酮的重组微生物，其中在重组微生物中另外引入了编码芦荟酮合酶的基因或增加所述基因的表达。在本发明中，芦荟酮合酶可以是ALS或PKS3，ALS可以源自掌叶大黄，并且PKS3可以源自木立芦荟，但除了所述芦荟酮合酶以外的芦荟酮合酶可以应用于本发明。
[0263] 与野生型微生物中基因的表达相比表达降低的基因可以是pabA，但不限于此。
[0264] 用于产生芦荟酮的重组微生物的特征可以在于：在重组微生物中另外引入了编码选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)、苹果酸脱氢酶(Mdh)、磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、乙酰-CoA羧化酶(AccBC和AccD1)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GapA)、磷酸甘油酸激酶(Pgk)、乙酰-CoA合成酶(Acs)和丙酮酸脱氢酶(PDH：AceEF和Lpd)的一种或多种酶的基因或增加所述基因的表达。
[0265] Zwf、Mdh、SerA、GapA、Pgk、Acs、AceE、AceF和Lpd可以源自大肠杆菌(E.coli)，但不限于此。AccBC和AccD1可以源自谷氨酸棒杆菌，但不限于此，并且可以扩展至对应于其他微生物来源的乙酰-CoA羧化酶的酶。
[0266] 本发明还涉及产生芦荟酮的方法，所述方法包括以下步骤：
[0267] (a)培养上述重组微生物；并且
[0268] (b)从所培养的微生物回收所述芦荟酮。
[0269] 本发明的产生芦荟酮的方法可以包括通过添加1-50g/L的葡萄糖或1-100g/L的甘油作为碳源来培养重组微生物。
[0270] 本发明还涉及用于产生白藜芦醇的重组微生物，其中在重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(TAL)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)和芪合酶(STS)的基因或者增加所述基因的表达。
[0271] TAL可以源自荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、蝶豆(Clitoria ternatea)、草莓(Fragaria x ananassa)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、玉米(Zea mays)或西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)，
[0272] 4CL可以源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、天蓝色链霉菌、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、藿香(Agastache rugose)、燕麦(Avena sativa)、野茶树(Camellia sinensis)、百金花(Centaurium erythraea)、翁柱(Cephalocereus senilis)、椰子(Cocos nucifera)、枇杷(Eriobotrya japonica)、鸡冠刺桐(Erythrina cristagalli)、连翘属物种(Forsythia sp.)、草莓(Fragaria x ananassa)、大豆(Glycine max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麻槿(Hibiscus cannabinus)、卡氏落叶松(Larix cajanderi)、兴安落叶松(Larix gmelinii)、日本落叶松(Larix kaempferi)、Larix kamtschatica、西伯利亚落叶松(Larix sibirica)、Larix sukaczewii、紫草
(Lithospermum erythrorhizon)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、金银花(Lonicera japonica)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、烟草(Nicotiana tabacum)、罗勒(Ocimum basilicum)、小冠熏(Ocimum tenuiflorum)、稻(Oryza sativa)、毛泡桐(Paulownia tomentosa)、香芹(Petroselinum crispum)、桂竹(Phyllostachys
bambusoides)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、欧洲云杉(Picea abies)、辐射松(Pinus radiate)、火炬松(Pinus taeda)、豌豆(Pisum sativum)、侧柏(Platycladus orientalis)、Polyporus hispidus、毛白杨(Populus tomentosa)、颤杨(Populus tremuloides)、加杨(Populus x canadensis)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)、野葛(Pueraria montana)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、芸香(Ruta graveolens)、酿酒酵母、垂柳(Salix babylonica)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、欧洲花楸(Sorbus aucuparia)、小麦(Triticum aestivum)或葡萄(Vitis vinifera)，并且[0273] STS可以源自落花生(Arachis hypogaea)、赤松(Pinus densiflora)、马尾松(Pinus massoniana)、北美乔松(Pinus strobus)、虎杖(Polygonumcuspidatum)、松叶蕨(Psilotum nudum)或葡萄，但不限于这些。
(Lithospermum erythrorhizon)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、金银花(Lonicera japonica)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、烟草(Nicotiana tabacum)、罗勒(Ocimum basilicum)、小冠熏(Ocimum tenuiflorum)、稻(Oryza sativa)、毛泡桐(Paulownia tomentosa)、香芹(Petroselinum crispum)、桂竹(Phyllostachys
bambusoides)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、欧洲云杉(Picea abies)、辐射松(Pinus radiate)、火炬松(Pinus taeda)、豌豆(Pisum sativum)、侧柏(Platycladus orientalis)、Polyporus hispidus、毛白杨(Populus tomentosa)、颤杨(Populus tremuloides)、加杨(Populus x canadensis)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)、野葛(Pueraria montana)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、芸香(Ruta graveolens)、酿酒酵母、垂柳(Salix babylonica)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、欧洲花楸(Sorbus aucuparia)、小麦(Triticum aestivum)或葡萄(Vitis vinifera)，并且[0273] STS可以源自落花生(Arachis hypogaea)、赤松(Pinus densiflora)、马尾松(Pinus massoniana)、北美乔松(Pinus strobus)、虎杖(Polygonumcuspidatum)、松叶蕨(Psilotum nudum)或葡萄，但不限于这些。
[0274] 4-香豆酸:CoA连接酶可以是其中SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为I250L/N404K/I461V的突变酶，或者是其中SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为A294G/A318G的突变酶，但不限于这些。
[0275] 与野生型微生物中基因的表达相比表达降低的基因可以是选自pabA、yfiD、mqo、xapR、purB、fabH、fabF、ytcY、argC、nudD、araA、fadR、cytR、fmt和pyrF的一种或多种，但不限于这些。
[0276] 本发明还涉及产生白藜芦醇的方法，所述方法包括以下步骤：
[0277] (a)培养上述重组微生物；并且
[0278] (b)从所培养的微生物回收所述白藜芦醇。
[0279] 本发明的产生白藜芦醇的方法可以包括通过添加1-50g/L的葡萄糖或1-100g/L的甘油作为碳源来培养重组微生物。
[0280] 本发明还涉及用于产生柚皮素的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(TAL)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)、查耳酮合酶(CHS)和查耳酮异构酶(CHI)的基因或者增加所述基因的表达。
[0281] TAL可以源自荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、蝶豆(Clitoria ternatea)、草莓(Fragaria x ananassa)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、玉米(Zea mays)或西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)，
[0282] 4CL可以源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、天蓝色链霉菌、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、藿香(Agastache rugose)、燕麦(Avena sativa)、野茶树(Camellia sinensis)、百金花(Centaurium erythraea)、翁柱(Cephalocereus senilis)、椰子(Cocos nucifera)、枇杷(Eriobotrya japonica)、鸡冠刺桐(Erythrina cristagalli)、连翘属物种(Forsythia sp.)、草莓(Fragaria x ananassa)、大豆(Glycine max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麻槿(Hibiscus cannabinus)、卡氏落叶松(Larix cajanderi)、兴安落叶松(Larix gmelinii)、日本落叶松(Larix kaempferi)、Larix kamtschatica、西伯利亚落叶松(Larix sibirica)、Larix sukaczewii、紫草
(Lithospermum erythrorhizon)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、金银花(Lonicera japonica)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、烟草(Nicotiana tabacum)、罗勒(Ocimum basilicum)、小冠熏(Ocimum tenuiflorum)、稻(Oryza sativa)、毛泡桐(Paulownia tomentosa)、香芹(Petroselinum crispum)、桂竹(Phyllostachys
bambusoides)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、欧洲云杉(Picea abies)、辐射松(Pinus radiate)、火炬松(Pinus taeda)、豌豆(Pisum sativum)、侧柏(Platycladus orientalis)、Polyporus hispidus、毛白杨(Populus tomentosa)、颤杨(Populus tremuloides)、加杨(Populus x canadensis)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)、野葛(Pueraria montana)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、芸香(Ruta graveolens)、酿酒酵母、垂柳(Salix babylonica)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、欧洲花楸(Sorbus aucuparia)、小麦(Triticum aestivum)或葡萄(Vitis vinifera)，[0283] CHS可以源自小苍兰属杂交品种(Freesia hybrid cultivar)、紫花苜蓿
(Medicago sativa)、小立碗藓、钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)、小麦、葡萄、甜橙(Citrus sinensis)、拟南芥、燕麦、胡萝卜(Daucus carota)、荞麦(Fagopyrum esculentum)、大豆(Glycine max)、棘甘草(Glycyrrhiza echinata)、啤酒花(Humulus lupulus)、金丝桃(Hypericum androsaemum)、香芹、小立碗藓、覆盆子(Rubus idaeus)、黄岑(Scutellaria baicalensis)、Xanthisma gracile、硫华菊(Cosmos sulphureus)、非洲菊杂交品种(Gerbera hybrid cultivar)、大麦(Hordeum vulgare)、胡桃属物种(Juglans sp.)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、野葛(Pueraria montana)、黑麦(Secale cereal)、蝇子草属物种(Silene sp.)、白芥子(Sinapis alba)、菠菜、长须银柴胡(Stellaria longipes)、郁金香属杂交品种(Tulipa hybrid cultivar)、马鞭草属物种(Verbena sp.)或矮牵牛(Petunia x hybrida)，并且
(Lithospermum erythrorhizon)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、金银花(Lonicera japonica)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、烟草(Nicotiana tabacum)、罗勒(Ocimum basilicum)、小冠熏(Ocimum tenuiflorum)、稻(Oryza sativa)、毛泡桐(Paulownia tomentosa)、香芹(Petroselinum crispum)、桂竹(Phyllostachys
bambusoides)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、欧洲云杉(Picea abies)、辐射松(Pinus radiate)、火炬松(Pinus taeda)、豌豆(Pisum sativum)、侧柏(Platycladus orientalis)、Polyporus hispidus、毛白杨(Populus tomentosa)、颤杨(Populus tremuloides)、加杨(Populus x canadensis)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)、野葛(Pueraria montana)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、芸香(Ruta graveolens)、酿酒酵母、垂柳(Salix babylonica)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、欧洲花楸(Sorbus aucuparia)、小麦(Triticum aestivum)或葡萄(Vitis vinifera)，[0283] CHS可以源自小苍兰属杂交品种(Freesia hybrid cultivar)、紫花苜蓿
(Medicago sativa)、小立碗藓、钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)、小麦、葡萄、甜橙(Citrus sinensis)、拟南芥、燕麦、胡萝卜(Daucus carota)、荞麦(Fagopyrum esculentum)、大豆(Glycine max)、棘甘草(Glycyrrhiza echinata)、啤酒花(Humulus lupulus)、金丝桃(Hypericum androsaemum)、香芹、小立碗藓、覆盆子(Rubus idaeus)、黄岑(Scutellaria baicalensis)、Xanthisma gracile、硫华菊(Cosmos sulphureus)、非洲菊杂交品种(Gerbera hybrid cultivar)、大麦(Hordeum vulgare)、胡桃属物种(Juglans sp.)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、野葛(Pueraria montana)、黑麦(Secale cereal)、蝇子草属物种(Silene sp.)、白芥子(Sinapis alba)、菠菜、长须银柴胡(Stellaria longipes)、郁金香属杂交品种(Tulipa hybrid cultivar)、马鞭草属物种(Verbena sp.)或矮牵牛(Petunia x hybrida)，并且
[0284] CHI可以源自紫苏(Perilla frutescens)、银杏(Ginkgo biloba)、胡芦巴(Trigonella foenumgraecum)、紫花苜蓿、黄岑、大豆、翁柱、甜橙、棘甘草、乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)、白花百合(Lilium candidum)、杨梅(Morella rubra)、矮牵牛、菜豆、Soja hispida、郁金香属杂交品种、拟南芥或烟草，但不限于这些。
[0285] 4-香豆酸:CoA连接酶可以是其中SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为I250L/N404K/I461V的突变酶，但不限于此。
[0286] 与野生型微生物中基因的表达相比表达降低的基因可以是选自fadR、hycI和xapR的一种或多种。
[0287] 本发明还涉及产生柚皮素的方法，所述方法包括以下步骤：
[0288] (a)培养上述重组微生物；并且
[0289] (b)从所培养的微生物回收所述柚皮素。
[0290] 本发明的产生柚皮素的方法可以包括通过添加1-50g/L的葡萄糖或1-100g/L的甘油作为碳源来培养重组微生物。
[0291] 在本发明中，基因的“调节”包括所有基因缺失、表达抑制、表达促进、敲低、启动子替换和通过技术(如调节机制)诱导基因的表达，并且意在包括使生物合成途径中呈现的一种或多种酶进化或突变。
[0292] 在本发明中，“敲低”意指显著降低基因的表达水平以降低基因的功能，这与完全阻断基因表达的“敲除”不同。它可以在基因转录物水平或蛋白质水平上进行调节。然而，由于本发明在抑制或降低编码参与相应途径的酶的基因的表达方面具有重要意义，因此使用“敲低”和“敲除”中的任何一种都可以实现所需的目的。
[0293] 如本文所使用的，术语“载体”是指包含与合适的控制序列可操作连接的DNA序列的DNA构建体，其能够在合适的宿主中实现DNA的表达。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或简单地潜在的基因组插入物。一旦掺入合适的宿主中，载体可以独立于宿主基因组复制和起作用，或者在一些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。出于本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于此目的的典型质粒载体包含：(a)复制起点，通过所述复制起点高效地进行复制，使得每个宿主细胞产生数百个质粒载体；(b)抗生素抗性基因，可以通过所述抗生素抗性基因选择用质粒载体转化的宿主细胞；和(c)可以插入外源DNA片段的限制酶切割位点。即使载体中不存在合适的限制酶切割位点，使用常规合成寡核苷酸衔接子或接头也能够将载体与外源DNA片段之间容易连接。连接后，载体应转化至合适的宿主细胞中。通过氯化钙法或电穿孔(Neumann等人,EMBO J.,1:841,1982)可以容易地实现转化。
[0294] 载体的启动子可以是组成型或诱导型的，并且可以进一步修饰以实现本发明的效果。此外，表达载体包含用于选择含有所述载体的宿主细胞的选择标记物，并且可复制表达载体包含复制起点。载体可以是自我复制的，或者可以整合至宿主基因组DNA中。优选地，插入载体中的基因不可逆地融合至宿主细胞的基因组中，使得所述基因在细胞中的表达长时间稳定地持续。
[0295] 当核苷酸序列被放置成与另一核苷酸序列有功能关系时，所述核苷酸序列为“可操作地连接”。核苷酸序列可以是基因和连接的一个或多个控制序列，当所述基因与一个或多个控制序列(例如转录激活蛋白)结合时，所述一个或多个控制序列能够使得基因表达。例如，当表达为参与多肽分泌的前蛋白时，用于前序列或分泌前导序列的DNA与编码多肽的DNA可操作地连接；当影响序列的转录时，启动子或增强子与编码序列可操作地连接；以及当影响序列的转录时，核糖体结合位点(RBS)与编码序列可操作地连接，或当安排为促进翻译时，RBS与编码序列可操作地连接。通常，术语“可操作地连接”是指DNA连接的序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且存在于阅读框中。但是，增强子不一定是连续的。这些序列之间通过在便利的限制性酶切位点处的连接进行连接。然而，当位点不存在时，根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
[0296] 如本领域熟知的，为了增加转染基因在宿主细胞中的表达水平，相应的基因应该与在选择的表达宿主中操作的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，表达控制序列和相应的基因与细菌选择标记物和复制起点一起被包括在一个重组载体中。当宿主细胞是真核细胞时，重组载体应还包含可用于真核表达宿主的表达标记物。
[0297] 由上述重组载体转化的宿主细胞构成了本发明的另一个方面。如本文所使用的，术语“转化”是指通过将DNA导入宿主中，DNA可以作为染色体外的因子或通过完整的染色体的完成来复制。
[0298] 当然，应该理解，根据本发明所有载体和表达控制序列不能等同地发挥作用以表达DNA序列。同样，对于相同的表达系统，所有宿主并非等同地发挥作用。然而，本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围或承担过多的实验负担的情况下，从各种载体、表达控制序列和宿主中作出适当的选择。例如，必须在考虑宿主的情况下选择载体，因为必须在宿主中复制载体。具体地，还应考虑载体的拷贝数、调节拷贝数的能力和由相应载体编码的其他蛋白的表达(例如抗生素标记物的表达)。
[0299] 另外，可以将本发明中引入的基因引入宿主细胞的基因组中并以染色体因子的形式呈现。对于本发明所属领域的技术人员明显的是，即使当将基因插入宿主细胞的基因组染色体中时，所述基因的作用与当如上所述将重组载体引入宿主细胞中时的作用也是相同的。
[0300] 实施例
[0301] 在下文将参照实施例进一步详细描述本发明。对于本领域普通技术人员将明显的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应被解释为限制本发明的范围。
[0302] 实施例1.基于III型聚酮合酶的丙二酰-CoA生物传感器的构建
[0303] 1.1.多种III型聚酮合酶的性能测试
[0304] 本实施例和以下实施例中使用的限制酶购自New England Labs(美国)或Enzynomics(韩国)，并且PCR聚合酶购自Biofact(韩国)。其他的单独标记。另外，本实施例和以下实施例中引入的外源基因与在其上含有信息的数据库中的登录号及其序列一起总结在下表1中。另外，除非另有说明，否则用于克隆的大肠杆菌是DH5α菌株，将其在LB培养基(每升：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和10g NaCl)中或在LB琼脂板(1/5％，v/v)上培养。此外，如果需要的话，添加适当浓度的抗生素(50μg/mL卡那霉素，100μg/mL氨苄青霉素和/或
100μg/mL大观霉素)。
100μg/mL大观霉素)。
[0305] 在本发明中，使用III型聚酮合酶RppA由五分子丙二酰-CoA产生红色淡黄霉素，并将其用作细胞内丙二酰-CoA水平的指示剂(图1)。为此，比较和测试了多种III聚酮合酶的性能。克隆了来自总共五种放线菌菌株(灰色链霉菌、天蓝色链霉菌、阿维链霉菌、红色糖多孢菌、针孢链霉菌(Streptomyces aculeolatus))的III型聚酮合酶编码rppA基因，并将每一种基因转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。然后，将每种构建的菌株接种至含有补充有10g/L葡萄糖的M9基本培养基的烧瓶中，随后在初始指数期用0.5mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)处理。接着，将每种菌株培养48小时，并观察到淡黄霉素的产生。此时，观察到在表达基于灰色链霉菌的酶Sgr_RppA的菌株中淡黄霉素产量最高(25.7mg/L；图2A)。构建的质粒是基于pET-30a(+)(Novagen)，并且分别命名为pET-Sgr_rppA、pET-Sco_rppA、pET-Sma_rppA、pET-Sen_rppA和pET-Sac_rppA。为了构建pET-Sgr_rppA，使用灰色链霉菌的基因组DNA作为模板以及引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增rppA基因。使用Gibson组件将基因在EcoRI和BamHI位点处克隆到pET-30a(+)质粒中(Gibson DG等人(2009),Nature Methods 6:343-345)。其他质粒也通过与上述相同的方法构建。M9基本培养基每升含有以下组分：12.8g Na2HPO4·7H2O、3g KH2PO4、0.5g NaCl、1g NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2。
[0306] [SEQ ID NO: 1] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'[0307] [SEQ ID NO: 2] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'[0308] [表1]
[0309] 关于本发明中提出的外源基因的信息
[0310]
[0311] *描绘了酶的NCBI编号
[0312] 针对大肠杆菌K-12MG1655进行了密码子优化。
[0313] 在图1A中，通过RppA酶将丙二酰-CoA转化为THN。然后，通过自发氧化反应将THN转化为淡黄霉素。据报道，WhiE_ORFIII参与这一最终步骤(Austin MB等人(2004),J Biol Chem 279:45162-45174)，并且因此在本发明中，将相应基因另外克隆至pET-30a(+)中，但这导致降低的淡黄霉素产量。这表明rppA单个基因足以产生淡黄霉素。通过LC-MS和MS/MS证实了产生的淡黄霉素(图2B)。此后，除了常规的基于T7启动子的系统之外，在基于tac启动子的质粒中针对其在所有大肠杆菌菌株中的用途建立rppA表达平台。为此，首先构建了基于pCDFDuet-1(Novagen)质粒的pTacCDFS质粒，其含有CDF复制起点并具有大观霉素抗生素抗性和基于tac启动子的基因表达盒。为此，使用pTac15K质粒(Lee SY等人(2008)，美国专利20110269183)作为模板以及引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4通过PCR扩增含有tac启动子的DNA片段，并且使用pCDFDuet-1质粒作为模板以及引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6将相应质粒线性化。使用Gibson组件(Gibson assembly)将产生的两个DNA片段进行组装，从而构建pTacCDFS质粒。还构建了pTrcCDFS质粒用于进一步使用，并且此质粒与pTacCDFS质粒相同，不同之处在于前者含有trc启动子。另外，以与pTacCDFS质粒相同的方式构建pTrcCDFS质粒，不同之处在于使用pTrc99A质粒(Lee SY等人(2008)，美国专利20110269183)作为模板通过PCR扩增含有trc启动子的DNA片段。此后，通过以下方法构建基于pTacCDFS质粒的rppA表达质粒pTac-Sgr_rppA。首先，使用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8从灰色链霉菌的基因组DNA扩增rppA基因，并且使用引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10将pTacCDFS质粒线性化。使用Gibson组件将两个产生的DNA片段进行组装，从而构建pTac-Sgr_rppA质粒。此外，为了优化rppA的表达，进行5'非翻译区(5'UTR)的优化。使用先前报道的UTR设计器(url:https://sbi.postech.ac.kr/utr_designer/)设计5’UTR DNA序列。为了构建相应引物pTac-5'UTR-Sgr_rppA，使用pTac-Sgr_rppA作为模板以及引物SEQ ID NO:
9和SEQ ID NO:11进行反向PCR。用DpnI处理产生的线性化质粒以去除模板，并通过T4多核苷酸激酶(PNK)(Enzynomics，韩国)和T4连接酶(Elpis Biotech，韩国)处理进行连接。将得到的质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并在M9基本培养基中培养，从而产生17.8mg/L的淡黄霉素(图2C)。
9和SEQ ID NO:11进行反向PCR。用DpnI处理产生的线性化质粒以去除模板，并通过T4多核苷酸激酶(PNK)(Enzynomics，韩国)和T4连接酶(Elpis Biotech，韩国)处理进行连接。将得到的质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并在M9基本培养基中培养，从而产生17.8mg/L的淡黄霉素(图2C)。
[0314] [SEQ ID NO:3] 5'-CGACTCCTGCATTAGGAAATGACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[0315] [SEQ ID NO:4] 5'-GCGTTTCACTTCTGAGTTCG-3'
[0316] [SEQ ID NO:5] 5'-CGAACTCAGAAGTGAAACGCCTGAAACCTCAGGCATTTGAG-3'
[0317] [SEQ ID NO:6] 5'-ATTTCCTAATGCAGGAGTCG-3'
[0318] [SEQ ID NO:7] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'
[0319] [SEQ ID NO:8] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'[0320] [SEQ ID NO:9] 5'-GGTACCCGGGGATCCTCTAGAG-3'
[0321] [SEQ ID NO:10] 5'-TCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3'
[0322] [SEQ ID NO:11] 5'-GATGCTCCTTTCTTGTTATTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC-3'[0323] 1.2.基于III型聚酮合酶的丙二酰-CoA生物传感器的适用性的检验
[0324] 在构建基于灰色链霉菌RppA的丙二酰-CoA生物传感器后，进行了以下实验以检验生物传感器的适用性。首先，将RppA丙二酰-CoA生物传感器的信号定义为340nm处培养上清液的吸光度(图3D)。通常，为了表征生物传感器，必须添加不同浓度的目标化合物以检查信号是否增加。然而，因为丙二酰-CoA是不能穿过细胞膜的物质，所以将丙二酰-CoA添加至培养基中是没有意义的。因此，使用已知阻断脂肪酸生物合成途径的浅蓝菌素(Sigma-aldrich，美国)来间接表征生物传感器(Omura S(1976),Bacteriol Rev40:681-697)。浅蓝菌素阻断脂肪酸生物合成途径，从而导致丙二酰-CoA(一种脂肪酸前体)的积累。因此，测量了根据先前研究中所述添加不同浓度的浅蓝菌素时在大肠杆菌中丙二酰-CoA的浓度(Xu P,Li L,Zhang F,Stephanopoulos G,Koffas M(2014),Proc Natl Acad Sci U S A111:11299-11304)。将含有质粒pTac-5'UTR-Sgr_rppA的大肠杆菌BL21(DE3)菌株接种至14-mL一次性Falcon圆底试管中的3mL LB培养基中。接着，将菌株在培养箱中于30℃和220rpm下培养16小时，随后接种至另一个14-mL一次性Falcon圆底试管中的3mL改良R/2培养基(pH
6.8)中。将改良R/2培养基制备为每升含有以下组分：3g酵母提取物、6.75g KH2PO4、2g(NH4)2HPO4、0.8g MgSO4·7H2O、3g(NH4)2SO4、0.85g柠檬酸、5mL痕量金属溶液[每1L的0.1M HCl：10g FeSO4·7H2O、2.25g ZnSO4·7H2O、0.58g MnSO4·5H2O、1g CuSO4·5H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24、4H2O、0.02g Na2B4O7·10H2O、2g CaCl2·2H2O]。向其中添加20g/L葡萄糖、100μg/mL大观霉素、0.2mM IPTG和适当浓度的浅蓝菌素。添加的浅蓝菌素浓度如下：0、5、10、15、
20、25、50和100μM。将接种的细胞在培养箱中于30℃和220rpm下培养16小时，随后测量细胞的生长(OD600)和培养上清液在340nm处的吸光度。测量结果显示在图2D中。此时，可以看出，与不表达RppA的菌株相比，表达RppA的菌株生成了随着浅蓝菌素浓度的增加而明显增加的归一化信号。如图3A所示，可以证实，如通过肉眼观察到的那样，淡黄霉素的归一化产量也随着浅蓝菌素浓度的增加而增加(图3B)。此外，证实了当将pTac-5'UTR-Sgr_rppA质粒引入
16种不同的大肠杆菌菌株(表2)中时，所有菌株均产生淡黄霉素。这表明本发明中提出的丙二酰-CoA生物传感器适用于所有大肠杆菌菌株(图3C)。
6.8)中。将改良R/2培养基制备为每升含有以下组分：3g酵母提取物、6.75g KH2PO4、2g(NH4)2HPO4、0.8g MgSO4·7H2O、3g(NH4)2SO4、0.85g柠檬酸、5mL痕量金属溶液[每1L的0.1M HCl：10g FeSO4·7H2O、2.25g ZnSO4·7H2O、0.58g MnSO4·5H2O、1g CuSO4·5H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24、4H2O、0.02g Na2B4O7·10H2O、2g CaCl2·2H2O]。向其中添加20g/L葡萄糖、100μg/mL大观霉素、0.2mM IPTG和适当浓度的浅蓝菌素。添加的浅蓝菌素浓度如下：0、5、10、15、
20、25、50和100μM。将接种的细胞在培养箱中于30℃和220rpm下培养16小时，随后测量细胞的生长(OD600)和培养上清液在340nm处的吸光度。测量结果显示在图2D中。此时，可以看出，与不表达RppA的菌株相比，表达RppA的菌株生成了随着浅蓝菌素浓度的增加而明显增加的归一化信号。如图3A所示，可以证实，如通过肉眼观察到的那样，淡黄霉素的归一化产量也随着浅蓝菌素浓度的增加而增加(图3B)。此外，证实了当将pTac-5'UTR-Sgr_rppA质粒引入
16种不同的大肠杆菌菌株(表2)中时，所有菌株均产生淡黄霉素。这表明本发明中提出的丙二酰-CoA生物传感器适用于所有大肠杆菌菌株(图3C)。
[0325] [表2]
[0326]
[0327] 此外，为了证明除了基于灰色链霉菌RppA的丙二酰-CoA生物传感器以外的其他III型聚酮合酶也可用作丙二酰-CoA生物传感器，测试了三种III型聚酮合酶。为此，测试了木立芦荟III型聚酮合酶(八酮合酶，OKS)[SEQ ID NO:103]、木立芦荟III型聚酮合酶(八酮合酶2，PKS4)[SEQ ID NO:105]和木立芦荟III型聚酮合酶(八酮合酶3，PKS5)[SEQ ID NO:106]，如下构建质粒pET-AaOKS、pET-AaPKS4和pET-AaPKS5，每一种质粒含有编码每一种酶的基因。首先，使用合成的AaOKS基因(Integrated DNA Technologies,Inc.，美国)作为模板以及引物SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138通过PCR扩增AaOKS，随后将所述AaOKS在NdeI和EcoRI位点处插入pET-30a(+)质粒中。其他质粒也以如上所述的相同方法来构建，不同之处在于AaPKS4是使用引物SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142来扩增，而AaPKS5是使用引物SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144来扩增。
[0328] [SEQ ID NO: 135] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTTCACTCTCCAACTCTC-3'[0329] [SEQ ID NO: 136] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACATGAGAGGCAGGCTGTG-3'[0330] [SEQ ID NO: 137] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTTCACTCTCCAACGCTTC-3'[0331] [SEQ ID NO: 138] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACATGAGAGGCAGGCTGTG-3'[0332] [SEQ ID NO: 139] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTTCACTCTCCGACTCTAC-3'[0333] [SEQ ID NO: 140] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACACAGGAGGCAGGCTATG-3'[0334] [SEQ ID NO: 141] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTTCACTCTCCAACTAC-3'[0335] [SEQ ID NO: 142] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACACAGGGGGCAGGCTG-3'[0336] [SEQ ID NO: 143] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTTCGATCGCCGAG-3'[0337] [SEQ ID NO: 144] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTAGACAGGAGGCAGGCTG-3'[0338] [SEQ ID NO: 145] 5'-GCTCACCATCATTGGGCTCCGTGGCCCCAATG-3'
[0339] [SEQ ID NO: 146] 5'-CATTGGGGCCACGGAGCCCAATGATGGTGAGC-3'
[0340] 当培养含有每一种构建的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株时，可以观察到表达AaOKS、AaPKS4和AaPKS5的菌株的颜色变化。因此，通过LC-MS分析对促成颜色变化的聚酮合酶进行了分析(图4A)。如上所述，进行了使用浅蓝菌素的丙二酰-CoA实验，并且结果表明，随着细胞内丙二酰-CoA浓度的增加，由每种菌株生成的信号增加(图4和图5)。此处，信号指示培养上清液在300nm处的吸光度(图4C)。因此，在本发明中，证明了不仅RppA酶，能够由丙二酰-CoA产生基于有色聚酮的化合物的所有其他III型聚酮合酶都可以用作丙二酰-CoA生物传感器。
[0341] 在以下实施例中，使用上述III型聚酮合酶中的RppA进行另外的实验。
[0342] 1.3.其他工业上有用的菌株的可扩展性的检验
[0343] 在上述实施例中证明了在大肠杆菌中的适用性后，检验这种RppA丙二酰-CoA生物传感器对于其他工业上有用的菌株的可扩展性。除了大肠杆菌之外，此检验中使用的菌株的例子包括恶臭假单胞菌(它是代表性的革兰氏阴性菌)以及谷氨酸棒杆菌和混浊红球菌(它们是代表性革兰氏阳性菌)。首先，使用pBBR1MCS2作为基础质粒构建了用于在恶臭假单胞菌菌株中产生淡黄霉素的质粒(Kovach ME等人(1995),Gene 166:175-176)。首先，使用引物SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13将pBBR1MCS2质粒线性化。然后，使用pTac-Sgr_rppA质粒作为模板以及引物SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15通过PCR扩增含有tac启动子的rppA表达盒。使用Gibson组件将获得的两个DNA片段进行组装，从而构建pBBR1-rppA质粒。此外，为了检验N末端聚His标签对酶表达和淡黄霉素产量的影响，首先构建了pTac-His-Sgr_rppA。此时，使用Gibson组件将使用引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10通过PCR线性化的pTacCDFS质粒和使用引物SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:8从灰色链霉菌的基因组DNA通过PCR扩增的经His标记的rppA基因组装至单个质粒(pTac-His-Sgr_rppA)中。将构建的质粒使用引物SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15通过PCR再次扩增，并将其使用Gibson组件与线性化pBBR1MCS2质粒进行组装，从而构建pBBR1-His-rppA质粒。此时，将pBBR1-rppA和pBBR1-His-rppA质粒中的每一种转化至恶臭假单胞菌菌株中，随后将每一种得到的菌株接种至含有5mL LB培养基的试管中，然后在30℃和220rpm下培养18小时。接着，将0.8g/L MgSO4·7H2O、10g/L葡萄糖和抗生素添加至5mL LB中，然后进行传代培养。在相同条件下培养25小时后，进行采样。作为结果，在含有pBBR1-rppA质粒的菌株中产生了较大量的淡黄霉素(44.7mg/L；图6A)。因此，使用筛选的恶臭假单胞菌pBBR1-rppA菌株，以与上文实施例1.2中所述相同的方式使用浅蓝菌素进行丙二酰-CoA生物传感器的表征。作为结果，可以观察到淡黄霉素的归一化信号和归一化产量也随着相应菌株中浅蓝菌素浓度的增加而增加(图6B和图6C)。此处，在补充有20g/L葡萄糖、25μg/mL卡那霉素、0.5mM IPTG和适当浓度的浅蓝菌素的2mL MR-MOPS培养基中进行传代培养，并且MR-MOPS培养基的组合物(pH 7.0)每升含有以下组分：6.67g KH2PO4、4g(NH4)2HPO4、0.8g柠檬酸、5mL痕量金属溶液、20.09g MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、
0.8g/L MgSO4·7H2O。结果证明RppA丙二酰-CoA生物传感器成功地在恶臭假单胞菌中起作用。
0.8g/L MgSO4·7H2O。结果证明RppA丙二酰-CoA生物传感器成功地在恶臭假单胞菌中起作用。
[0344] [SEQ ID NO:12] 5'-CGAACTCAGAAGTGAAACGCTGCCTAATGAGTGAGCTAAC-3'
[0345] [SEQ ID NO:13] 5'-CATTGGTGCACCGTGCAGTCAAAATTCGCGTTAAATTTTTG-3'
[0346] [SEQ ID NO:14] 5'-GACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[0347] [SEQ ID NO:15] 5'-GCGTTTCACTTCTGAGTTCG-3'
[0348] [SEQ ID NO:16] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATGCACCATCACCATCACCATGCGACCCTGTGC CGACC-3'
[0349] 此外，为了将此生物传感器应用于谷氨酸棒杆菌菌株，使用pCES-H36作为基础质粒构建rppA表达质粒(Yim SS,An SJ,Kang M,Lee J,Jeong KJ(2013),Biotechnol Bioeng 110:2959-2969)。为此，使用pCES-H36-GFP质粒作为模板以及引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18将相应质粒线性化。使用pTac-Sgr_rppA作为模板以及引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20通过PCR扩增基于tac启动子的rppA表达盒，并使用pTac-His-Sgr_rppA作为模板以及引物SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:20扩增基于tac启动子的N末端His标记的rppA表达盒。使用Gibson组件将两种不同的rppA表达盒与上述线性化pCES-H36质粒进行组装，从而构建pCES-rppA和pCES-His-rppA质粒。将构建的质粒转化至谷氨酸棒杆菌菌株中，然后将其接种至5mL LB培养基中。将每一种所得菌株在培养箱中于30℃和220rpm下培养18小时，然后将其在5mL LB培养基中传代培养48小时，之后进行采样。此时，仅在含有N末端His标记的rppA表达盒(pCES-His-rppA)的菌株中产生了3.9mg/L淡黄霉素(图6D)。因此，使用选择的谷氨酸棒杆菌pCES-His-rppA菌株，以与上文实施例1.2中所述相同的方式使用浅蓝菌素进行丙二酰-CoA生物传感器的表征。作为结果，可以观察到淡黄霉素的归一化信号和归一化产量也随着相应菌株中浅蓝菌素浓度的增加而增加(图6E和图6F)。
[0350] [SEQ ID NO:17]5'-CCATTATAATTAGGCCTCGG-3'
[0351] [SEQ ID NO:18] 5'-CCATGCTACTCCTACCAACC-3'
[0352] [SEQ ID NO:19] 5'-GGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'[0353] [SEQ ID NO:20] 5'-CCGAGGCCTAATTATAATGGATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'
[0354] [SEQ ID NO:21] 5'-GGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGCACCATCACCATCACCATGC-3'[0355] 在另一个例子中，为了将此生物传感器应用于混浊红球菌菌株，使用pCH作为基础质粒构建rppA表达质粒。使用乙酰胺诱导型启动子(G.Roberts等人,FEMS Microbiol.Lett.222:131-136,2003)，使用引物SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23通过PCR将其扩增。另外，使用引物SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25通过PCR从灰色链霉菌的基因组DNA扩增rppA表达盒，并且使用引物SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25通过PCR扩增rppA表达盒用于另外表达N末端His标签。使用Gibson组件将每一种rppA表达盒、乙酰胺诱导型启动子DNA片段和通过PstI线性化的pCH质粒组装在一起，从而构建两种载体(pCH-rppA和pCH-His-rppA)。将每一种构建的质粒转化至混浊红球菌菌株中，然后将其接种至5mL LB培养基中。
将每一种所得菌株在培养箱中于30℃和220rpm下培养18小时，然后将其在5mL LB培养基中传代培养48小时，之后进行采样。可以看出，红色淡黄霉素仅在含有pCH-rppA的菌株中产生(图6G)。
将每一种所得菌株在培养箱中于30℃和220rpm下培养18小时，然后将其在5mL LB培养基中传代培养48小时，之后进行采样。可以看出，红色淡黄霉素仅在含有pCH-rppA的菌株中产生(图6G)。
[0356] [SEQ ID NO:22] 5'-CTTGATCAGCTTGCATGCCTGCAGAAGCTTTCTAGCAGAAATAATTC-3'[0357] [SEQ ID NO:23] 5'-GTGCATGTGGACTCCCTTTCTCTTATC-3'
[0358] [SEQ ID NO:24] 5'-GATAAGAGAAAGGGAGTCCACATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'
[0359] [SEQ ID NO:25] 5'-GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'[0360] [SEQ ID NO:26] 5'-GATAAGAGAAAGGGAGTCCACATGCACCATCACCATCACCATGC-3'[0361] 实施例2.通过使用RppA生物传感器对具有增加的丙二酰-CoA产生能力的菌株进行高通量筛选
[0362] 2.1.通过引入大肠杆菌基因组规模的合成对照sRNA文库对具有增加的丙二酰-CoA产生能力的菌株进行高通量筛选
[0363] 在构建RppA丙二酰-CoA生物传感器、确认其成功操作以及证明生物传感器的适用性和可扩展性后，将通过本发明人开发的合成对照sRNA技术引入，以通过使用生物传感器来筛选具有增加的丙二酰-CoA产生能力的菌株(KR 10-1575587、US 9388417、EP 13735942.8、CN 201380012767.X、KR10-1690780、KR 10-1750855、US 15317939、CN
201480081132.X；Na D等人(2013),Nat Biotechnol 31:170-174；Yoo SM,Na D,Lee SY(2013),Nat Protoc 8:1694-1707)。另外，为了包含大肠杆菌中的所有主要基因，将先前构建的大肠杆菌基因组规模的合成对照sRNA文库(包括大肠杆菌K-12W3110菌株中的1,858个基因)引入，并在基因水平上敲低，并且筛选对于增加丙二酰-CoA产生有效的敲低基因靶标。因此，将大肠杆菌基因组规模的合成对照sRNA文库引入含有pTac-5'UTR_Sgr_rppA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，然后进行高通量筛选(图7)。为了覆盖所有1,858种sRNA，从获得的克隆选择大小等于大于6倍文库大小的11,488个克隆，然后使用机器人自动高通量筛选系统。为此，使用K3菌落挑选器(KBiosystems，巴斯尔登，英国)，并通过机器人(韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and
Biotechnology，KRIBB)；井邑市，韩国)将每一种菌落接种至96孔微型板中的LB培养基(补充有抗生素和0.2mM IPTG)中。K3菌落挑选器照亮琼脂板并将琼脂板成像。然后，内在程序识别并定位菌落，并且指导尖端带有针的机器人手臂挑选所选择的菌落。将接种的细胞在HT-MegaGrow培养箱(Bioneer，韩国)中于30℃和500rpm下培养24小时。培养后，选择具有相对较强信号的231种菌株。将所选择的菌株在含有3mL LB培养基(补充有抗生素和0.2mM IPTG)的14mL一次性Falcon圆底试管中于30℃和250rpm下培养24小时。其中，70种菌株显示出高于对照菌株(不含sRNA的生物传感器菌株)的信号，并对这些菌株中含有的sRNA进行测序(图8)。此时，两次观察到三种sRNA(argB、fabF、nudD)。另外，其中26种菌株与对照菌株相比，信号增加45％或更多。因此，将对应于26种菌株的sRNA载体转化回原始传感器菌株(图
9)，并如上所述再次在3mL LB中培养。作为结果，其中最终选择了显示与对照菌株相比信号增加超过70％的14种sRNA。用于增加丙二酰-CoA产生的14种选择的敲低基因靶标列于下表
3中。
201480081132.X；Na D等人(2013),Nat Biotechnol 31:170-174；Yoo SM,Na D,Lee SY(2013),Nat Protoc 8:1694-1707)。另外，为了包含大肠杆菌中的所有主要基因，将先前构建的大肠杆菌基因组规模的合成对照sRNA文库(包括大肠杆菌K-12W3110菌株中的1,858个基因)引入，并在基因水平上敲低，并且筛选对于增加丙二酰-CoA产生有效的敲低基因靶标。因此，将大肠杆菌基因组规模的合成对照sRNA文库引入含有pTac-5'UTR_Sgr_rppA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，然后进行高通量筛选(图7)。为了覆盖所有1,858种sRNA，从获得的克隆选择大小等于大于6倍文库大小的11,488个克隆，然后使用机器人自动高通量筛选系统。为此，使用K3菌落挑选器(KBiosystems，巴斯尔登，英国)，并通过机器人(韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and
Biotechnology，KRIBB)；井邑市，韩国)将每一种菌落接种至96孔微型板中的LB培养基(补充有抗生素和0.2mM IPTG)中。K3菌落挑选器照亮琼脂板并将琼脂板成像。然后，内在程序识别并定位菌落，并且指导尖端带有针的机器人手臂挑选所选择的菌落。将接种的细胞在HT-MegaGrow培养箱(Bioneer，韩国)中于30℃和500rpm下培养24小时。培养后，选择具有相对较强信号的231种菌株。将所选择的菌株在含有3mL LB培养基(补充有抗生素和0.2mM IPTG)的14mL一次性Falcon圆底试管中于30℃和250rpm下培养24小时。其中，70种菌株显示出高于对照菌株(不含sRNA的生物传感器菌株)的信号，并对这些菌株中含有的sRNA进行测序(图8)。此时，两次观察到三种sRNA(argB、fabF、nudD)。另外，其中26种菌株与对照菌株相比，信号增加45％或更多。因此，将对应于26种菌株的sRNA载体转化回原始传感器菌株(图
9)，并如上所述再次在3mL LB中培养。作为结果，其中最终选择了显示与对照菌株相比信号增加超过70％的14种sRNA。用于增加丙二酰-CoA产生的14种选择的敲低基因靶标列于下表
3中。
[0364] [表3]
[0365] 14种最终选择的敲低靶基因的列表
[0366]
[0368] 通过RppA生物传感器不仅证明了敲低基因靶标，还证明了过表达基因靶标。此时，使用了利用FVSEOF算法鉴定的基因靶标(Park JM等人(2012),BMC Syst Biol 6:106)。使用大肠杆菌基因组规模的代谢模型iJO1366进行计算机模拟分析(Orth JD等人(2011),Mol Syst Biol 7:535)。因此鉴定的9种基因靶标如下：zwf、mdh、fumA、fumB、fumC、serA、serB、serC和tpiA(图10A和图10C)。将每一种基因靶标在大肠杆菌BL21(DE3)中扩增，在trc启动子下插入pTrc99A质粒中，并转化至BL21(DE3)pTac-5'UTR-Sgr_rppA菌株中。以与上文实施例2.1中所述相同的方式将构建的传感器菌株在试管中培养，并在此时测量信号。作为结果，在9种基因靶标中的8种基因靶标(serA、mdh、zwf、tpiA、serB、fumB、serC和fumC)中观察到与对照相比增加的信号(图10B)。
[0369] 实施例3.使用通过RppA生物传感器筛选的敲低基因靶标增加有用产物的产量[0370] 除非另有说明，否则本实施例和以下实施例中使用的烧瓶培养条件如下。将菌落接种至含有10mL LB培养基的试管中，并在培养箱中于37℃和200rpm下培养。将1mL细胞培养物接种至含有50mL改良R/2培养基的带挡板烧瓶中。当已经在37℃和200rpm下生长的菌株达到0.8的OD600值时，用0.5mM IPTG处理菌株以诱导产生，并将其在30℃和200rpm下培养48小时。添加甘油或葡萄糖作为碳源。
[0371] 3.1.使用选择的敲低基因靶标增加6-甲基水杨酸的产生
[0372] 在下一步骤中，将上述实施例中选择的且能够增加丙二酰-CoA产生的敲低基因靶标用于产生有用的产物，以证明本发明的生物传感器可以成功地筛选有效的敲低基因靶标。因此，作为第一种产物，试图由基因工程化大肠杆菌产生据报道由灰黄青霉(或展青霉)菌株产生的6-甲基水杨酸(6MSA)。6-甲基水杨酸具有抗菌和抗真菌活性(Dimroth P,Ringelmann E,Lynen F(1976),Eur J Biochem 68:591-596)，并且由一分子乙酰-CoA和三分子丙二酰-CoA通过真菌中发现的6-甲基水杨酸合酶(6MSAS)(I型迭代聚酮合酶)产生(图11)。
[0373] 用于本发明的6-甲基水杨酸合酶(6MSAS)的序列如下：
[0374] 6-甲基水杨酸合酶(6MSAS)[SEQ ID NO:123]：
[0375]
[0376]
[0377]
[0378] 为了构建能够产生6-甲基水杨酸的大肠杆菌菌株，首先使用引物SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28通过反向PCR将pTac15K质粒线性化，然后使用灰黄青霉的基因组DNA作为模板并顺序地使用引物SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30以及SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:30扩增编码6-甲基水杨酸合酶的Pg6MSAS基因。使用Gibson组件将两个DNA片段进行组装，从而构建pTac-Pg6MSAS质粒(图12B)。6MSAS酶在其末端含有酰基-载体蛋白结构域，并且需要4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)来激活此结构域。
[0379] 用于本发明的4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)的序列如下：
[0380] 4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)[SEQ ID NO:124]：
[0381]
[0382] 使用引物SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33通过PCR从枯草芽孢杆菌的基因组DNA扩增编码4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfp基因片段，并将所述sfp基因片段在EcoRI位点处插入pTac15K质粒中。将得到的质粒使用引物SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35通过PCR再次扩增，然后将其在SphI位点处插入pTac-Pg6MSAS质粒中，从而构建pTac-Pg6MSAS-sfp质粒(图12A)。将构建的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并通过SDS-PAGE检查酶表达(图12C)。然后，菌株的烧瓶培养在不同浓度的葡萄糖或甘油的存在下在改良R/2培养基中进行，并且作为结果，可以看出当添加100g/L的甘油时，产生了4.7mg/L的6-甲基水杨酸(图
13A)。通过LC-MS确认所产生的6-甲基水杨酸的真实性(图13B和图13C)。在引入上文实施例中选择的sRNA之前，为了检验不同大肠杆菌菌株中6-甲基水杨酸的产量，将pTac-Pg6MSAS-sfp质粒引入上表1中所示的16种大肠杆菌菌株中，然后在3mL改良R/2培养基中进行每一种菌株的试管规模的培养。在这些菌株中，选择产生超过1mg/L 6MSA的6种菌株(NM522、BL21、S17-1、JM110、HB101和XL1-蓝)(图13D)。然后，将14种选择的sRNA引入每种选择的菌株中，从而构建总共84种菌株，并对每种构建的菌株进行试管规模的培养。作为结果，pabA-敲低BL21(DE3)菌株产生最大量的6-甲基水杨酸(6.1mg/L；图14)。在相同的培养基条件下对此菌株进一步进行烧瓶培养(50mL)，结果产生了8.0mg/L的6-甲基水杨酸(图13E)。
13A)。通过LC-MS确认所产生的6-甲基水杨酸的真实性(图13B和图13C)。在引入上文实施例中选择的sRNA之前，为了检验不同大肠杆菌菌株中6-甲基水杨酸的产量，将pTac-Pg6MSAS-sfp质粒引入上表1中所示的16种大肠杆菌菌株中，然后在3mL改良R/2培养基中进行每一种菌株的试管规模的培养。在这些菌株中，选择产生超过1mg/L 6MSA的6种菌株(NM522、BL21、S17-1、JM110、HB101和XL1-蓝)(图13D)。然后，将14种选择的sRNA引入每种选择的菌株中，从而构建总共84种菌株，并对每种构建的菌株进行试管规模的培养。作为结果，pabA-敲低BL21(DE3)菌株产生最大量的6-甲基水杨酸(6.1mg/L；图14)。在相同的培养基条件下对此菌株进一步进行烧瓶培养(50mL)，结果产生了8.0mg/L的6-甲基水杨酸(图13E)。
[0383] [SEQ ID NO:27] 5'-GCTGAGAAGCTTGCCAAATAATGGATCCTCTAGAGTCGACCTG-3'[0384] [SEQ ID NO:28] 5'-CTGGGGATGTTTTCCCAGAGGGGTATGTAGAAGTTGCAGCGGAATGCATGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3'
[0385] [SEQ ID NO:29] 5'-ACAGTGAATATGAATTCTCCAACG-3'
[0386] [SEQ ID NO:30] 5'-ATTATTTGGCAAGCTTCTCAGC-3'
[0387] [SEQ ID NO:31] 5'-CTCTGGGAAAACATCCCCAGCACCAGTCGGAACCCCTGGGACTGAGTACAGTGAATATGAATTCTCCAACG-3'
[0388] [SEQ ID NO:32] 5'-TAATAAGAATTCATGAAGATTTACGGAATTTATATG-3'
[0389] [SEQ ID NO:33] 5'-TTATTAGAATTCTTATAAAAGCTCTTCGTACGAG-3'
[0390] [SEQ ID NO:34] 5'-CTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCCACTCCCGTTCTGGATAATG-3'[0391] [SEQ ID NO:35] 5'-CAAAACAGCCAAGCTTGCATGC-3'
[0392] 为了进一步优化产生6-甲基水杨酸的菌株，用质粒(pTac-Pg6MSAS)仅表达具有长度(5.3kb)的Pg6MSAS基因，并且使用菌株BAP1表达sfp(Pfeifer BA,Admiraal SJ,Gramajo H,Cane DE,Khosla C(2001),Science291:1790-1792)，所述菌株BAP1是将sfp插入BL21(DE3)菌株的基因组中的菌株。烧瓶培养的结果显示了增加的6-甲基水杨酸产量为17.6mg/L，并且从SDS-PAGE分析的结果来看，这被认为是由于改善的4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶表达和未激活的6-甲基水杨酸合酶的降低的比例(图12C)。因此，当将pabA-敲低sRNA引入大肠杆菌BAP1 pTac-Pg6MSAS菌株中时，可以产生23.9mg/L的量的6-甲基水杨酸，这对应于约35.8％的增加(图13F)。当进行此菌株的补料分批发酵时，在约27小时后可以获得97.8mg/L的增加的6-甲基水杨酸浓度(图13G)。在50g/L甘油作为初始碳源的存在下，在
6.6L发酵罐(BioFlo320，Eppendofr，德国)中的1.9L改良R/2培养基中进行补料分批发酵。
将菌落接种至含有10mL LB培养基的试管中，然后在37℃和200rpm下培养一天。接着，将细胞接种至两个带挡板的烧瓶中，每个烧瓶含有50mL改良R/2培养基，此时使用50g/L甘油作为碳源。进行烧瓶培养约9小时直至OD600值达到约2，然后将细胞接种至发酵罐中。通过28％(v/v)氨溶液将培养物pH维持在6.8，并且通过以2L/min供应空气和自动控制搅拌速度为
1000rpm并且通过增加氧流速，将溶解氧(DO)浓度控制在40％的空气饱和下。使用pH-stat进料策略以提供营养。当pH高于6.86时，自动添加进料溶液。进料溶液每升含有以下组分：
800g甘油、6mL痕量金属溶液和12g MgSO4·7H2O。当接种后的OD600值达到2至3时，用0.5mM IPTG诱导异源蛋白表达。
6.6L发酵罐(BioFlo320，Eppendofr，德国)中的1.9L改良R/2培养基中进行补料分批发酵。
将菌落接种至含有10mL LB培养基的试管中，然后在37℃和200rpm下培养一天。接着，将细胞接种至两个带挡板的烧瓶中，每个烧瓶含有50mL改良R/2培养基，此时使用50g/L甘油作为碳源。进行烧瓶培养约9小时直至OD600值达到约2，然后将细胞接种至发酵罐中。通过28％(v/v)氨溶液将培养物pH维持在6.8，并且通过以2L/min供应空气和自动控制搅拌速度为
1000rpm并且通过增加氧流速，将溶解氧(DO)浓度控制在40％的空气饱和下。使用pH-stat进料策略以提供营养。当pH高于6.86时，自动添加进料溶液。进料溶液每升含有以下组分：
800g甘油、6mL痕量金属溶液和12g MgSO4·7H2O。当接种后的OD600值达到2至3时，用0.5mM IPTG诱导异源蛋白表达。
[0393] 为了进一步增加6-甲基水杨酸的产量，试图增加先前选择的三种FVSEOF基因靶标(P<0.05；zwf、mdh、serA；图10)和以下五种酶的表达：谷氨酸棒杆菌乙酰-CoA羧化酶(AccBC和AccD1)、大肠杆菌甘油醛3-磷酸脱氢酶(GapA)、大肠杆菌磷酸甘油酸激酶(Pgk)、大肠杆菌乙酰-CoA合成酶(Acs)和大肠杆菌丙酮酸脱氢酶(PDH：AceEF和Lpd)。此时，插入相应基因片段并克隆至pBBR1TaC质粒中。pBBR1TaC质粒是由pBBR1MCS构建的基于tac启动子的表达质粒。对于构建pBBR1TaC，首先使用引物SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148通过反向PCR扩增pBBR1MCS，使用pTac15K作为模板以及引物SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:150扩增由tac启动子、MCS和rrnBT1T2构成的DNA片段，并使用Gibson组件将所述DNA片段克隆至质粒中。接着，为了将来自上文实施例2.2中构建的pTrc99A-zwf、pTrc99A-mdh和pTrc99A-serA质粒的基因转移至pBBR1TaC，进行以下实验。首先，使用引物SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:152扩增zwf、mdh和serA各个基因，使用引物SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76扩增pBBR1TaC质粒，然后进行Gibson组装，从而构建pBBR1-zwf、pBBR1-mdh和pBBR1-serA质粒。谷氨酸棒杆菌乙酰-CoA羧化酶由α亚基AccBC和β亚基AccD1构成，并且将相应基因各自克隆至pBBR1TaC中，从而构建pBBR1-accBC和pBBR1-accD1。此时，使用引物SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154扩增accBC基因，并且使用引物SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:156扩增accD1基因。通过Gibson组件将这两个基因片段均插入使用引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10扩增的pBBR1TaC质粒中。在这两个构建的质粒中使用pBBR1-accD1作为模板，使用引物SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:158扩增含有tac启动子和accD1的DNA片段，然后将所述DNA片段通过Gibson组件插入通过HindIII限制酶消化的pBBR1-accBC质粒中，从而构建pBBR1-accBCD1质粒。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶(PDH)由亚基E1(AceE)、E2(AceF)和E3(Lpd)构成。首先，将aceEF基因片段和lpd基因片段克隆至pBBR1TaC质粒中，从而构建pBBR1-aceEF和pBBR1-lpd质粒。使用引物SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160扩增基因片段aceEF，并且使用引物SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162扩增lpd。通过Gibson组件将这两个基因片段各自插入用于构建pBBR1-accBC和pBBR1-accD1质粒的线性化pBBR1TaC质粒中。在这两个构建的质粒中使用pBBR1-lpd作为模板，使用引物SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164扩增包含tac启动子和lpd的基因片段，然后将所述基因片段插入通过SalI限制酶消化的pBBR1-aceEF质粒中，从而构建pBBR1-aceEF-lpd质粒。对于构建分别含有大肠杆菌甘油醛3-磷酸脱氢酶(GapA)、大肠杆菌磷酸甘油酸激酶(Pgk)和大肠杆菌乙酰-CoA合成酶(Acs)的pBBR1-gapA、pBBR1-pgk和pBBR1-acs质粒，使用引物SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:168以及SEQ ID NO:
169和SEQ ID NO:170通过PCR扩增gapA、pgk和acs基因片段，然后将其每一种通过Gibson组件插入线性化pBBR1TaC质粒中。
169和SEQ ID NO:170通过PCR扩增gapA、pgk和acs基因片段，然后将其每一种通过Gibson组件插入线性化pBBR1TaC质粒中。
[0394] [SEQ ID NO:147] 5'-GACGGATGGCCTTTTACTAGTGCCTGGGGTGCCTAATGAG-3'
[0395] [SEQ ID NO:148] 5'-CGATGATTAATTGTCAACTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAG-3'[0396] [SEQ ID NO:149] 5'-GTTGACAATTAATCATCGGCTC-3'
[0397] [SEQ ID NO:150] 5'-ACTAGTAAAAGGCCATCCGTCAGGATG-3'
[0398] [SEQ ID NO:151] 5'-GTTGACAATTAATCATCGGC-3'
[0399] [SEQ ID NO:152] 5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGG-3'
[0400] [SEQ ID NO:153] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGTGTCAGTCGAGACTAGGAAG-3'[0401] [SEQ ID NO:154] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACTTGATCTCGAGGAGAAC-3'[0402] [SEQ ID NO:155] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGACCATTTCCTCACCTTTG-3'[0403] [SEQ ID NO:156] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACAGTGGCATGTTGCCGTG-3'[0404] [SEQ ID NO:157] 5'-GAGTCGACCTGCAGGCATGCATTGACAATTAATCATCGGCTCG-3'[0405] [SEQ ID NO:158] 5'-CTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTT-3'
[0406] [SEQ ID NO:159] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGTCAGAACGTTTCCCAAATG-3'[0407] [SEQ ID NO:160] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACATCACCAGACGGCGAATG-3'[0408] [SEQ ID NO:161] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGAGTACTGAAATCAAAACTC-3'[0409] [SEQ ID NO:162] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACTTCTTCTTCGCTTTCGG-3'[0410] [SEQ ID NO:163] 5'-GTACCCGGGGATCCTCTAGAGTTGACAATTAATCATCGGCTCG-3'[0411] [SEQ ID NO:164] 5'-CAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3'
[0412] [SEQ ID NO:165] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGACTATCAAAGTAGGTATCAAC-3'
[0413] [SEQ ID NO:166] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTATTTGGAGATGTGAGCGATC-3'[0414] [SEQ ID NO:167] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGTCTGTAATTAAGATGACCGATC-3'
[0415] [SEQ ID NO:168] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACTTCTTAGCGCGCTCTTCG-3'[0416] [SEQ ID NO:169] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGAGCCAAATTCACAAACAC-3'[0417] [SEQ ID NO:170] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACGATGGCATCGCGATAG-3'[0418] 将如上所述构建的8种质粒各自转化至显示最高产量的菌株大肠杆菌BAP1 pTac-Pg6MSAS pWAS-抗-pabA中，然后对菌株进行烧瓶培养。烧瓶培养的结果显示在图15A中。当谷氨酸棒杆菌乙酰-CoA羧化酶过表达时，6-甲基水杨酸的产量增加至63.6mg/L。进行相应菌株的补料分批发酵，结果如图15B所示，来自甘油的6-甲基水杨酸的产量增加至440.3mg/L±30.2mg/L。
[0419] 3.2.使用选择的敲低基因靶标增加芦荟酮的产生
[0420] 作为第二种产物，测试了由掌叶大黄(Abe I,Utsumi Y,Oguro S,Noguchi H(2004),FEBS Lett 562:171-176)或木立芦荟(Mizuuchi Y等人(2009),FEBS J 276:2391-2401)III型聚酮合酶产生的芦荟酮。芦荟酮是芦荟苦素的前体，由于其美白效果而广泛用于化妆品领域。然而，尚未报道由芦荟酮产生芦荟苦素的生物合成途径。据报道，芦荟酮由一分子乙酰-CoA和六分子丙二酰-CoA(图16)产生，并且通过掌叶大黄芦荟酮合酶(ALS)或木立芦荟芦荟酮合酶(PKS3)产生。
[0421] 掌叶大黄芦荟酮合酶(ALS)的序列如下。
[0422] 掌叶大黄芦荟酮合酶(ALS)[SEQ ID NO:125]：
[0423]
[0424] 另外，木立芦荟芦荟酮合酶(PKS3)的序列如下。
[0425] 木立芦荟芦荟酮合酶PKS3[SEQ ID NO:126]：
[0426]
[0427]
[0428] 对应于这两种酶的基因均通过Integrated DNA Technologies公司(美国)来合成，然后将其通过Gibson组件在NcoI位点处插入pCDFDuet-1(Novagen)质粒中。将这两种构建的质粒pCDF-RpALS和pCDF-AaPKS3各自转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，然后通过SDS-PAGE分析异源酶的表达(图17A)。进行菌株的烧瓶培养，结果由20g/L葡萄糖产生20.5mg/L和4.7mg/L芦荟酮(图17B)。因此，将质粒pCDF-RpALS用于以下实验。通过LC-MS和MS/MS分析证实了产生的芦荟酮的真实性(图17C)。接着，如上文实施例3.1中所述，将上述实施例中选择的14种sRNA引入各种大肠杆菌菌株中。为此，将每种sRNA引入BL21(DE3)菌株和W3110(DE3)菌株中，从而构建28种菌株。构建的菌株的试管规模的培养的结果显示在图17F中。此时，pabA敲低BL21(DE3)菌株显示出最高的芦荟酮产量(18.5mg/L)，烧瓶培养中菌株的芦荟酮产量为27.1mg/L，这对应于与对照菌株(不含sRNA)的芦荟酮产量相比32.2％的增加(图17D和图17E)。
[0429] 为了进一步增加芦荟酮的产生，增加了三种FVSEOF基因靶标(zwf、mdh和serA；图10)和以下用于增加6-甲基水杨酸产生的五种酶：谷氨酸棒杆菌乙酰-CoA羧化酶(AccBC和AccD1)、大肠杆菌甘油醛3-磷酸脱氢酶(GapA)、大肠杆菌磷酸甘油酸激酶(Pgk)、大肠杆菌乙酰-CoA合成酶(Acs)和大肠杆菌丙酮酸脱氢酶(PDH：AceEF和Lpd)。为此，将含有相应基因的八种质粒pBBR1-zwf、pBBR1-mdh、pBBR1-serA、pBBR1-accBCD1、pBBR1-gapA、pBBR1-pgk、pBBR1-acs和pBBR1-aceEF-lpd各自转化至显示最高芦荟酮产量的菌株(具有pCDF-RpALS和pWAS-抗-pabA的大肠杆菌BL21(DE3))中，然后对所得菌株进行烧瓶培养。烧瓶培养的结果显示在图18中。当谷氨酸棒杆菌乙酰-CoA羧化酶过表达时，芦荟酮的产量增加至30.9mg/L。
在这种情况下，将20g/L葡萄糖用作碳源。
在这种情况下，将20g/L葡萄糖用作碳源。
[0430] 3.3.使用选择的敲低基因靶标增加白藜芦醇的产生
[0431] 作为第三种产物，选择了在植物中产生的白藜芦醇。白藜芦醇是属于基于苯丙素类的天然产物中的芪类化合物家族的化合物，它是具有抗氧化、抗老化和抗癌等作用的非常有用的天然产物。白藜芦醇由一分子对香豆酰-CoA和三分子丙二酰-CoA产生(图19)。因此，构建了由简单的碳源产生对香豆酸的菌株。为此，使用先前构建的过度产生酪氨酸的菌株(Kim B,Binkley R,Kim HU,Lee SY(2018),Biotechnol Bioeng)。此菌株(BTY5.13)含有基于pTac15K质粒的质粒(pTY13)，所述质粒在基于大肠杆菌BL21(DE3)的tyrR、tyrP敲低菌株(BTY5)中过表达运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)tyrC、大肠杆菌aroGfbr和aroL。为了将酪氨酸转化为对香豆酸，应表达酪氨酸氨裂解酶(TAL)。因此，使用引物SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37从西班牙糖丝菌的基因组DNA扩增编码酪氨酸氨裂解酶的基因SeTAL，然后使用引物SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39通过PCR将pTrc99A质粒线性化。接着，使用Gibson组件将这两个DNA片段进行组装，从而构建质粒pTrc-SeTAL。
[0432] 用于本发明的酪氨酸氨裂解酶的序列如下。
[0433] 酪氨酸氨裂解酶(TAL)[SEQ ID NO:127]：
[0434]
[0435] 为了优化酪氨酸氨裂解酶的表达，将His标签和硫氧还蛋白标签(TrxA)均连接至N末端。对于His标签的附接，使用西班牙糖丝菌的基因组DNA以及引物SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:37通过PCR扩增His-SeTAL，并且使用引物SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41通过反向PCR将pTrc-SeTAL作为模板线性化。使用Gibson组件将这两个DNA片段进行组装，从而构建pTrc-HisTAL。使用大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板以及引物SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43通过PCR扩增trxA基因，并且使用西班牙糖丝菌的基因组DNA作为模板以及引物SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45通过PCR扩增TrxA-TAL。使用引物SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:37，通过PCR对这两个DNA片段进行延伸PCR以获得单个DNA片段。通过Gibson组件将获得的DNA片段与用于构建pTrc-HisTAL的线性化pTrc-SeTAL DNA片段组装，从而构建pTrc-TrxTAL。将三种构建的质粒pTrc-SeTAL、pTrc-HisTAL和pTrc-TrxTAL均转化至BTY5.13菌株中，然后将其接种至含有补充有20g/L葡萄糖的50mL改良MR培养基的烧瓶中，并且将菌株在30℃和
200rpm下培养。当细胞达到约0.8的OD600值时，用1mM IPTG处理细胞，然后培养36小时。改良MR培养基每升含有以下组分：6.67g KH2PO4、4g(NH4)2HPO4、0.8g柠檬酸、0.8g MgSO4·7H2O、
5mL痕量金属溶液、2g酵母提取物和15g(NH4)2SO4。当表达His-TAL时，可以获得最高水平的对香豆酸产量(0.41g/L)(图20A)。因此，为了通过将pTrc-HisTAL与pTY13质粒组装来构建单个质粒，使用引物SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48扩增HisTAL部分，然后将其通过Gibson组件在NheI位点处插入pTY13质粒中，从而构建pTY13-HisTAL质粒。将构建的质粒转化至BTY5菌株中，然后对菌株进行烧瓶培养。作为结果，由20g/L甘油产生了0.35g/L对香豆酸(图20A)。
200rpm下培养。当细胞达到约0.8的OD600值时，用1mM IPTG处理细胞，然后培养36小时。改良MR培养基每升含有以下组分：6.67g KH2PO4、4g(NH4)2HPO4、0.8g柠檬酸、0.8g MgSO4·7H2O、
5mL痕量金属溶液、2g酵母提取物和15g(NH4)2SO4。当表达His-TAL时，可以获得最高水平的对香豆酸产量(0.41g/L)(图20A)。因此，为了通过将pTrc-HisTAL与pTY13质粒组装来构建单个质粒，使用引物SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48扩增HisTAL部分，然后将其通过Gibson组件在NheI位点处插入pTY13质粒中，从而构建pTY13-HisTAL质粒。将构建的质粒转化至BTY5菌株中，然后对菌株进行烧瓶培养。作为结果，由20g/L甘油产生了0.35g/L对香豆酸(图20A)。
[0436] [SEQ ID NO:36] 5'-GAATTGTGAGCGGATAACAAAGACCGAGGAAAAGGAGCATCGCAAATGACGCAGGTCGTGGAACGTC-3'
[0437] [SEQ ID NO:37] 5'-TAGAGGATCCCCGGGTACTCATCCGAAATCCTTCCCGTC-3'
[0438] [SEQ ID NO:38] 5'-GTACCCGGGGATCCTCTAG-3'
[0439] [SEQ ID NO:39] 5'-TTGTTATCCGCTCACAATTC-3'
[0440] [SEQ ID NO:40] 5'-GAGGAAAAGGAGCATCGCAAATGCACCATCATCATCATCATACGCAGGTCGTGGAACGTC-3'
[0441] [SEQ ID NO:41] 5'-TTGCGATGCTCCTTTTCCTC-3'
[0442] [SEQ ID NO:42] 5'-ATGAGCGATAAAATTATTCACCTG-3'
[0443] [SEQ ID NO:43] 5'-CGCCAGGTTAGCGTCGAGG-3'
[0444] [SEQ ID NO:44] 5'-CCTCGACGCTAACCTGGCGACGCAGGTCGTGGAACGTC-3'
[0445] [SEQ ID NO:45] 5'-TCATCCGAAATCCTTCCCGTC-3'
[0446] [SEQ ID NO:46] 5'-AGACCGAGGAAAAGGAGCATCGCAAATGAGCGATAAAATTATTCACCTG-3'[0447] [SEQ ID NO:47] 5'-GTAAGCCAGTATACACTCCGGACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[0448] [SEQ ID NO:48] 5'-CTGTTGGGCGCCATCTCCTTGTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATC-3'[0449] 在成功地如上所述构建产生对香豆酸的菌株后，构建了从对香豆酸开始的下游白藜芦醇生物合成途径，所述生物合成途径由拟南芥突变4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)1(At4CL1m)和葡萄芪合酶(STS)构成。首先，使用引物SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50从拟南芥cDNA扩增At4CL1基因，然后将其通过Gibson组件在EcoRI和KpnI位点处插入pTac15K质粒中，从而构建pTac-At4CL1质粒。接着，通过连续三轮定点诱变来构建pTac-At4CL1m(At4CL1m；I250L/N404K/I461V)，以增强底物对于对香豆酰-CoA的特异性。此时，对于连续三轮定点诱变，使用引物对SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54以及SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56。接着，分别使用引物对SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58以及SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60通过PCR扩增分别编码4-香豆酸:CoA连接酶3和4-香豆酸:CoA连接酶4的来自拟南芥的At4CL3和At4CL4基因，并且使用引物对SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62通过PCR扩增编码4-香豆酸:CoA连接酶的来自天蓝色链霉菌的Sc4CL基因。以与上述相同的方式克隆扩增的基因，从而构建pTac-At4CL3、pTac-At4CL4和pTac-Sc4CL。对于pTac-Sc4CL，使用引物对SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64进行一轮定点诱变，以增强底物对于对香豆酰-CoA的特异性(Kaneko M,Ohnishi Y,Horinouchi S(2003),J Bacteriol185:20-27)，从而构建pTac-Sc4CLm(Sc4CLm；A294G/A318G)质粒。由Integrated DNA Technologies公司来合成编码葡萄芪合酶的STS基因，并使用引物对SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66通过PCR扩增所述STS基因，然后使用Gibson组件将所述STS基因在EcoRI和KpnI位点处插入pTac15K质粒中，从而构建pTac-VvSTS质粒。
[0450] 用于本发明的拟南芥4-香豆酸:CoA连接酶1的序列如下。
[0451] 拟南芥4-香豆酸:CoA连接酶1[SEQ ID NO:128]：
[0452]
[0453]
[0454] 用于本发明的拟南芥4-香豆酸:CoA连接酶3的序列如下。
[0455] 拟南芥4-香豆酸:CoA连接酶3[SEQ ID NO:129]：
[0456]
[0457] 用于本发明的拟南芥4-香豆酸:CoA连接酶4的序列如下。
[0458] 拟南芥4-香豆酸:CoA连接酶4[SEQ ID NO:130]：
[0459]
[0460]
[0461] 用于本发明的天蓝色链霉菌4-香豆酸:CoA连接酶的序列如下。
[0462] 天蓝色链霉菌4-香豆酸:CoA连接酶[SEQ ID NO:131]：
[0463]
[0464] 用于本发明的芪合酶的序列如下。
[0465] 芪合酶[SEQ ID NO:132]：
[0466]
[0467] 将每一种上述质粒转化至BL21(DE3)菌株中，然后使用SDS-PAGE分析所得菌株中异源酶的表达。然后，为了将4CL基因与STS基因组装成单个质粒，进行以下操作。首先，使用引物SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48通过PCR从pTac-VvSTS扩增用于芪合酶表达的DNA片段(含有tac启动子)，然后将其通过Gibson组件在NheI位点处插入pTac-At4CL3、pTac-At4CL4l和pTac-Sc4CLm质粒中，从而构建pTac-VvSTS-At4CL3、pTac-VvSTS-At4CL4和pTac-VvSTS-Sc4CLm质粒。对于At4CL1m，使用引物SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68通过PCR从pTac-At4CL1m扩增用于4-香豆酸:CoA连接酶表达的DNA片段，然后将所述DNA片段在PvuII位点处插入pTac-VvSTS质粒中，从而构建pTac-VvSTS-At4CL1m质粒。将构建的质粒pTac-VvSTS-At4CL1m、pTac-VvSTS-At4CL3、pTac-VvSTS-At4CL4和pTac-VvSTS-Sc4CLm转化至BL21(DE3)菌株中，并且在补充有2mM对香豆酸的培养基中对菌株进行烧瓶培养。烧瓶培养的结果显示在图20C中。此时，BL21(DE3)pTac-VvSTS-At4CL1m菌株显示出最高的白藜芦醇产量(18.0mg/L)。如下事实是丙二酰-CoA为瓶颈的间接证据：即使以2mM(328.1mg/L)的浓度添加对香豆酸，也能产生这个量的白藜芦醇。在本发明中，在通过增加丙二酰-CoA浓度根据此假设解决问题之前，通过以各种方式调节用于白藜芦醇产生的外源基因的表达来解决此问题，然后解决丙二酰-CoA。因此，为了在单个操纵子中表达At4CL1m基因和STS基因，使用引物SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70通过PCR扩增STS基因，然后将所述STS基因在SphI位点处插入pTac-At4CL1m质粒中，从而构建pTac-At4CL1m-opr-VvSTS质粒。另外，为了促进通过将这两种酶表达为单个融合酶的底物转化，使用引物对SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72通过PCR扩增At4CL1m基因，然后将所述At4CL1m基因在NdeI位点处插入pTac-VvSTS质粒中，从而构建pTac-At4CL1m-fus-VvSTS质粒。对于融合蛋白的表达，使用甘氨酸-丝氨酸接头(Gly-Gly-Gly-Ser)。然而，这两种策略都没有产生更高水平的白藜芦醇(图20D)。因此，选择pTac-VvSTS-At4CL1m作为最终质粒，此质粒与pTY13-HisTAL不相容(这两个质粒都具有p15A复制起点)，因此将此质粒转移至上述pTacCDFS质粒中。为此，使用引物SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74通过PCR扩增STS表达盒，然后通过Gibson组件将所述表达盒与使用引物SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76线性化的pTacCDFS质粒组装。用PstI限制酶处理构建的质粒，然后通过Gibson组件或T4连接与使用引物SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76扩增的At4CL1m表达盒组装，从而构建单个质粒(pTacCDF-VvSTS-At4CL1m)。将构建的质粒转化至BL21(DE3)菌株中，然后对菌株进行烧瓶培养，从而产生21.2mg/L白藜芦醇(图20D)。然而，这是提供2mM对香豆酸的结果。因此，为了直接由甘油产生白藜芦醇，将pTacCDF-VvSTS-At4CL1m质粒转化至BTY5 pTY13-HisTAL菌株中，并对菌株进行烧瓶培养，作为结果，由20g/L甘油产生12.4mg/L白藜芦醇。通过LC-MS确认产生的白藜芦醇的真实性(图21)。
[0468] [SEQ ID NO:49] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGGCGCCACAAGAACAAGC-3’[0469] [SEQ ID NO:50] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACAATCCATTTGCTAGTTTTG-3'[0470] [SEQ ID NO:51] 5'-CACAGCGATGACGTCCTACTCTGTGTTTTG-3'
[0471] [SEQ ID NO:52] 5'-CAAAACACAGAGTAGGACGTCATCGCTGTG-3'
[0472] [SEQ ID NO:53] 5'-CTCTTTCGAGGAAACAACCCGGTGAG-3'
[0473] [SEQ ID NO:54] 5'-CTCACCGGGTTGTTTCCTCGAAAGAG-3'
[0474] [SEQ ID NO:55] 5'-GATTGAAAGAACTTGTCAAGTATAAAGG-3'
[0475] [SEQ ID NO:56] 5'-CCTTTATACTTGACAAGTTCTTTCAATC-3'
[0476] [SEQ ID NO:57] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGATCACTGCAGCTCTACAC-3'[0477] [SEQ ID NO:58] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTAACAAAGCTTAGCTTTGAGG-3'[0478] [SEQ ID NO:59] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGGTGCTCCAACAACAAACG-3'[0479] [SEQ ID NO:60] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTATTTAGAGCACATGGTTTCC-3'[0480] [SEQ ID NO:61] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGTTCCGCAGCGAGTACGC-3'[0481] [SEQ ID NO:62] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTATCGCGGCTCCCTGAGCTGTC-3'[0482] [SEQ ID NO:63] 5'-GTACATCGTCAGCGGCGCCGCCCCGCTCGACG-3'
[0483] [SEQ ID NO:64] 5'-CGTCGAGCGGGGCGGCGCCGCTGACGATGTAC-3'
[0484] [SEQ ID NO:65] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGGCAAGTGTCGAGGAATTC-3'[0485] [SEQ ID NO:66] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTAATTGGTAACCATCGGAATGG-3'[0486] [SEQ ID NO:67] 5'-GTAAGCCAGTATACACTCCGGACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[0487] [SEQ ID NO:68] 5'-CTGTTGGGCGCCATCTCCTTGTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATC-3'[0488] [SEQ ID NO:69] 5'-GAGTCGACCTGCAGGCATGCAATTTCACACAGGAAACAGA-3'
[0489] [SEQ ID NO:70] 5'-CAAAACAGCCAAGCTTGCATG-3'
[0490] [SEQ ID NO:71] 5'-TTTCACACAGGAAACAGACATATG-3'
[0491] [SEQ ID NO:72] 5'-GAATTCCTCGACACTTGCCATACTACCACCACCCAATCCATTTGCTAGTTTTG-3'
[0492] [SEQ ID NO:73] 5'-GTTGACAATTAATCATCGGC-3'
[0493] [SEQ ID NO:74] 5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGG-3'
[0494] [SEQ ID NO:75] 5'-CCGAACTCAGAAGTGAAACG-3'
[0495] [SEQ ID NO:76] 5'-GCCGATGATTAATTGTCAAC-3'
[0496] 将上文实施例2.1中选择的14种sRNA引入如上所述构建的最终的产白藜芦醇菌株中，并对菌株进行烧瓶培养。烧瓶培养的结果显示在图20E中。作为结果，当敲低pabA时，由甘油产生51.8mg/L白藜芦醇，并且与对照菌株(不具有sRNA的菌株)相比，此产量增加了4.2倍。另外，值得注意的是，pabA是敲低靶标，其显示出如上所述的6-甲基水杨酸和芦荟酮的产量的最大增加。接着，选择能够使白藜芦醇滴度增加超过2.5倍的六种敲低基因靶标，并且构建sRNA质粒，其中每一种质粒都含有基因靶标中的两种基因靶标的组合。将每一种sRNA质粒转化至产生白藜芦醇的菌株中，然后对每一种所得菌株进行烧瓶培养。烧瓶培养的结果显示在图20中。然而，未实现白藜芦醇产量的额外增加，因为当yfiD和purB同时被敲低时最高的白藜芦醇产量为50.0mg/L。
[0497] 此处，如下构建用于组合双敲低的sRNA质粒。使用引物SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78从亲本质粒扩增有待插入的对合成对照sRNA进行编码的DNA片段，然后通过Gibson组件将所述DNA片段与使用引物SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80通过PCR线性化的含有合成对照sRNA的亲本质粒组装。
[0498] [SEQ ID NO:77] 5'-GAATTTTAACAAAATATTAACGAATTCTAACACCGTGCGTG-3'[0499] [SEQ ID NO:78] 5'-GTGCCACCTAAATTGTAAGCGGCGAATTGGGTACCTATAAAC-3'[0500] [SEQ ID NO:79] 5'-GCTTACAATTTAGGTGGCAC-3'
[0501] [SEQ ID NO:80] 5'-GTTAATATTTTGTTAAAATTCGCG-3'
[0502] 3.4.使用选择的敲低基因靶标增加柚皮素的产生
[0503] 作为第四种产物，选择了在植物中产生的柚皮素。柚皮素是许多药理学上有用的产品的常见前体，其属于基于苯丙素类的天然产物中的类黄酮家族。另外，据报道柚皮素具有抗阿尔茨海默病、抗癌、抗氧化和抗真菌活性。柚皮素由一分子对香豆酰-CoA和三分子丙二酰-CoA(如白藜芦醇)产生(图21)。由于在上文实施例3.3中构建了产生对香豆酸的菌株，因此在本实施例中构建了下游柚皮素生物合成途径。此处，使用拟南芥突变4-香豆酸:CoA连接酶1(At4CL1m)进行从对香豆酸到对香豆酰-CoA的转化，使用矮牵牛查耳酮合酶(CHS)进行从对香豆酰-CoA和丙二酰-CoA到柚皮素查耳酮的转化，并且使用拟南芥查耳酮异构酶(CHI)进行从柚皮素查耳酮到柚皮素的转化。
[0504] 用于本发明的查耳酮合酶(CHS)的序列如下。
[0505] 查耳酮合酶(CHS)[SEQ ID NO:133]：
[0506]
[0507]
[0508] 用于本发明的查耳酮异构酶(CHI)的序列如下。
[0509] 查耳酮异构酶(CHI)[SEQ ID NO:134]：
[0510]
[0511] 使用拟南芥cDNA作为模板以及引物SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82通过PCR扩增编码突变4-香豆酸:CoA连接酶1的At4CL1m基因，并且使用拟南芥cDNA作为模板以及引物SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84扩增编码查耳酮合酶的AtCHI基因。然后，使用引物SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:84通过延伸PCR将这两个DNA片段组装成单个DNA片段，随后将所述单个DNA片段在KpnI和BamHI位点处插入pTrc99A质粒中。另外，使用DNA片段(由Integrated DNA Technologies公司合成)作为模板以及引物SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86的引物通过PCR扩增编码查耳酮合酶的PhCHS基因，然后将所述PhCHS基因在BamHI和XbaI位点处插入上述构建的质粒中，从而构建pTrc-At4CL1m-AtCHI-PsCHS质粒。由于与上文实施例3.3中所述相同的原因，用NcoI和PstI限制酶消化质粒pTrc-At4CL1m-AtCHI-PsCHS以使得其与产生对香豆酸的菌株中的质粒相容。通过Gibson组件将产生的DNA片段与使用引物SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88通过反向PCR线性化的pTrcCDFS质粒组装，从而构建pTrcCDF-At4CL1m-AtCHI-PhCHS质粒。
[0512] [SEQ ID NO:81] 5'-AGACAGGGTACCATGGCGCCACAAGAACAAG-3'
[0513] [SEQ ID NO:82] 5'-ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAATTACAATCCATTTGCTAGTTTTGCCC-3'
[0514] [SEQ ID NO:83] 5'-TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCTTCATCCAACGCCTGC-3'[0515] [SEQ ID NO:84] 5'-AGACAGGGATCCTCAGTTCTCTTTGGCTAGTTTTTCC-3'
[0516] [SEQ ID NO:85] 5'-AGAGAGGATCCATAACAATTCCCCATCTTAG-3'
[0517] [SEQ ID NO:86] 5'-AGAGATCTAGATTAGGTAGCCACACTATGCAGAACC-3'
[0518] [SEQ ID NO:87] 5'-GAAACTGCTTGTTCTTGTGGCGCCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3'[0519] [SEQ ID NO:88] 5'-CTAATCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG-3'
[0520] 将如上所述构建的质粒pTrcCDF-At4CL1m-AtCHI-PhCHS引入BTY5pTY13-HisTAL菌株中，然后对菌株进行烧瓶培养。作为结果，分别由葡萄糖和甘油产生37.2mg/L和64.5mg/L柚皮素(图23A)。因此，以下关于柚皮素产生的实验均使用甘油进行。通过SDS-PAGE分析菌株中异源酶的表达(图23B)，并通过LC-MS确认产生的柚皮素的真实性(图24)。将上文实施例2.1中选择的14种sRNA引入构建的产柚皮素菌株中，并对每一种所得菌株进行烧瓶培养。烧瓶培养的结果显示在图25A中。此时，fadR敲低菌株显示出最高的柚皮素产量(92.3mg/L)，与对照菌株(不具有sRNA的产柚皮素菌株)中的柚皮素产量相比，柚皮素产量增加43％。
另外，将与对照相比显示出超过15％增加的敲低靶标进行组合并进行组合双敲低实验，并且实验结果显示在图25B中。此时，在fadR和xapR二者均被敲低的菌株中，由甘油产生
103.8mg/L柚皮素，与对照中的柚皮素产量相比，柚皮素产量增加61％。
另外，将与对照相比显示出超过15％增加的敲低靶标进行组合并进行组合双敲低实验，并且实验结果显示在图25B中。此时，在fadR和xapR二者均被敲低的菌株中，由甘油产生
103.8mg/L柚皮素，与对照中的柚皮素产量相比，柚皮素产量增加61％。
[0521] 此处，如下构建用于组合双敲低的sRNA质粒。使用引物SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90从亲本质粒扩增有待插入的对合成对照sRNA进行编码的DNA片段，然后通过Gibson组件将所述DNA片段与使用引物SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92通过PCR线性化的含有合成对照sRNA的亲本质粒组装。
[0522] [SEQ ID NO:89] 5'-CACTAGATCTCAAATGTGCTGGAATTCTAACACCGTGCGTG-3'[0523] [SEQ ID NO:90] 5'-CCTTATAAATCAAACATGTGCGGCGAATTGGGTACCTATAAAC-3'[0524] [SEQ ID NO:91] 5'-GCACATGTTTGATTTATAAGGG-3'
[0525] [SEQ ID NO:92] 5'-CAGCACATTTGAGATCTAGTGG-3'
[0526] 如上文实施例3中所检验的，通过RppA丙二酰-CoA生物传感器容易且快速地筛选的用于增加丙二酰-CoA产生的敲低靶标都极大地促成有用化合物的基于丙二酰-CoA的产生。在上文实施例中检验的四种产生有用产物的菌株不是通过先前研究中报道的许多代谢工程化策略构建的那些，而是通过构建基本产生途径和简单转化sRNA在短时间内构建的那些。以与如上所述相同的方式构建的菌株显示出卓越产生能力的事实在本领域中是值得注目的。另外，对于本领域技术人员明显的是，RppA生物传感器的实用性和适用性不仅限于上述实施例。
[0528] 实用性
[0529] 用于测量丙二酰-CoA浓度的常规方法具有各种缺点和局限性，因为它们费时费力，需要熟练的技术，具有低的数据可靠性，难以进行大批量实验，并且需要高性能装置。然而，根据本发明的生物传感器的使用提供了单步信号生成、在各种微生物中使用、在自荧光微生物中使用、简单的构建方法和简单的筛选方法。另外，当本发明与高通量筛选相结合时，其优点在于可以非常容易且快速地(约3天)筛选具有增加的丙二酰-CoA产生能力的菌株，并且所述菌株可以直接应用于有用化合物的基于丙二酰-CoA的产生。
[0530] 文本文件
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