提高微藻生长速率和油脂产率的方法
阅读：1018发布：2020-12-31
专利汇可以提供提高微藻生长速率和油脂产率的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种提高微藻生长速率和油脂产率的方法，包括：1）微藻株进行接种后，在20～35℃和20～200μmol 光子 m-2s-1条件下，连续光照或按一定光暗循环光照进行培养2～5天；2）将步骤1）培养的微藻株再次进行接种后培养；3）将步骤1）作为一个培养循环，按照步骤2）的方法进入下一个培养循环，经进行培养循环，获得生长速率和油脂产率都提高的微藻株。本发明使微藻野生株和微藻基因 缺陷 突变体的生长速率和油脂产率都有了提高，与大规模筛选相比，工作量少，效率高，是有效的藻种选育新方法，在微藻 生物 燃料 开发中有广阔的应用前景。，下面是提高微藻生长速率和油脂产率的方法专利的具体信息内容。
1.一种提高微藻生长速率和油脂产率的方法，其特征在于，包括步骤：
-2 -1
1）微藻株进行接种后，在20～35℃和20～200μmol光子m s 条件下，连续光照或按一定光暗循环光照进行培养2～5天；
2）将步骤1）培养的微藻株再次进行接种后，在20～35℃下培养2～5天；
3）将步骤1）作为一个培养循环，按照步骤2）的方法进入下一个培养循环，经进行20～
200个培养循环，获得生长速率和油脂产率都提高的微藻株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法，还包括：4）将经过20～200个培养循环后的微藻株在20～35℃下正常培养2～5天后，转入20～35℃的缺氮培养3～9天。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，微藻株进行接种的步骤为：
选择对数增长期的微藻株，以680nm的光密度OD680为0.1～0.6进行接种；
微藻株包括：CC4324、CC4326和CC4334；
所述微藻株的培养基包括：TAP培养基或HS培养基；
所述一定光暗循环光照，是光照时间与暗时间的比例为6：18～24：0。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，以680nm的光密度OD680为-2 -1
0.1进行接种，在25℃和50μmol光子m s 条件下，连续光照培养3天。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，微藻株再次进行接种的步骤为：将步骤1）培养的微藻株稀释到接种密度OD680为0.1～0.6进行接种。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，将步骤1）培养的微藻株稀释到接种密度OD680为0.1进行接种，在25℃下培养3天；
所述步骤3）中，进行28个培养循环。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤4）中，将经过28个培养循环后的微藻株在25℃下正常培养3天后，转入25℃的缺氮培养6天。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤4）中，将经过28个培养循环后的微藻株以OD680为0.2进行接种，在25℃下正常培养3天后，转入25℃的缺氮培养6天。
9.一种微藻，其特征在于：所述微藻是通过如权利要求1所述的方法获得。
10.一种如权利要求9所述的微藻在提高微藻生长速率和油脂产率中的应用。
提高微藻生长速率和油脂产率的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微藻的培养改进方法，特别是涉及一种提高微藻生长速率和油脂产率的方法。
背景技术
[0002] 随着我国经济的高速发展，能源需求缺口逐年增加。据《2012年国民经济和社会发展统计公报》，去年我国进口原油2.71亿吨，煤炭2.88亿吨。化石能源还存在开采和使用过程中的温室气体排放问题，导致气候异常和自然灾害。2005年实施的《京都议定书》对各国承担温室气体，特别是CO2减排的义务进行了明确规定，减碳势在必行。开发可再生能源可以降低对化石能源的依赖，有效控制CO2排放，已成为包括我国在内的世界各国所要共同面对的重大课题。国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年），科技部“十二五”生物技术发展规划等都将生物能源技术作为重点。近年来，化石能源价格逐步攀升也为生物质能源的更大范围利用提供了可能。微藻既能通过光合作用固定二氧化碳，又可在胁迫条件下产生油脂等，与以玉米等为原料生产生物燃料相比，微藻燃料不存在与人争粮、与粮争地等问题，同时具有种类多、生长快、油脂生物合成效率高等优点。微藻燃料，特别是微藻生物柴油引起广泛关注【Li YG,Xu L,Huang YM,Wang F,Guo C,Liu CZ.Microalgal biodiesel in China:Opportunities and challenges.Applied Energy2011,88(10):3432-3437】。
[0003] 微藻生物柴油生产包括藻种选育、微藻规模化培养、胁迫产油、藻类收获、油脂提取和转化等多个步骤，藻种选育是这条产业链的起点【Lam MK,Lee KT.Microalgae biofuels:A critical review of issues,problems and the way forward.Biotechnology Advances 2012,30(3):673-690】。微藻通过光合作用固定CO2，并经一系列反应形成游离脂肪酸，游离脂肪酸再由Kennedy途径生成甘油三酯。藻种、培养模式和培养条件等都对微藻固碳产油有影响。首先要选择合适的藻种。优良藻种需要有高的固碳效率、高油脂产率和较强的环境适应性等。已知的微藻超过40000种。一般来说，蓝藻是生产碳水化合物或醇类物质的良好藻种。基因工程蓝藻产油也有了突破性进展【Liu X,Sheng J,Curtiss Iii R.Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.Proceedings of the National Academy of Sciences 2011,108(17):6899-6904】，但是绿藻仍是最受关注的固碳产油微藻。莱茵衣藻是绿藻中的模型藻。
[0004] 通过优化反应器结构等提高CO2在培养基中传质，可以改善固碳速率，但更关注的是如何提高微藻自身的固碳能力。基因工程等生物技术手段是可能的选择。胡强教授等通过化学诱变筛选到2株微拟球藻突变体，生物质合成速率和油脂含量等都显著高于野 生 株 （Anandarajah K,Mahendraperumal G,Sommerfeld M,Hu Q.Characterization of microalga Nannochloropsis sp.mutants for improved production of biofuels.Applied Energy 2012,96:371-377）。黄迎春等（中国专利申请CN 102943048A）通过诱变的方法获得了高含油量小环藻突变体。然而，物理或化学诱变的专一性不强，筛选的工作量大。微藻的基因工程操作在最近十五年才取得明显进展，但是基因敲除仍很困难。Kilian 等【Kilian O,Benemann CSE,Niyogi KK,Vick B.High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp.Proceedings of the National Academy of Sciences 2011,108(52):21265-21269】通过同源重组技术敲除了微拟球藻的硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的相关基因。迄今基因工程构建基因敲除突变体的成功案例还很少，与微藻基因组复杂性和同源重组效率过低等有关。RNA干扰等技术可以使微藻的特定基因表达下调，目前较多的用于莱茵衣藻等模式体系的基因功能鉴别等（Lv HX,Qu G,Qi XZ,Lu LN,Tian CG,Ma YH.Transcriptome analysis of Chlamydomonas reinhardtii during the process of lipid accumulation.Genomics,2013,in press）。
通过基因工程手段调控微藻代谢面临的问题还包括转基因的表达不够稳定，突变体不能生长，人们对转基因生物技术还有疑虑。
通过基因工程手段调控微藻代谢面临的问题还包括转基因的表达不够稳定，突变体不能生长，人们对转基因生物技术还有疑虑。
[0005] 适应进化可以不通过基因工程手段而活化潜在途径、强化特定代谢表型或 提 高 环 境 适 应 能 力【Portnoy VA,Bezdan D,Zengler K.Adaptive laboratory evolution--harnessing the power of biology for metabolic engineering.Current opinion in biotechnology 2011,22(4):590-594】。自然界的生命体在长期演变中为适应环境变化存在自然选择，由此产生适应进化。使得生命体的特定表型在遗传和变异中得以保存。实验室内，微生物的适应进化实验可以作为研究进化的工具，也可以作为工业开发新菌株的手段。适应进化的常用方法是培养微生物到达一定的指标（细胞密度、生长速率或底物消耗等）后进行传代培养。不断重复这个过程直至代谢表型不再变化。野生型大肠杆菌的生物质合成只能达到理论计算值的40-60%。刚刚构建的单基因敲除突变体甚至无法正常生长。这些突变体经过适应进化，生物质合成或代谢产物生产等会显著增加，与基因组尺度代谢网络模型的预测结果接近【Ibarra RU,Edwards JS,Palsson BO.Escherichia coli K-12 undergoes adaptive evolution to achieve in silico predicted optimal growth.Nature 2002,420(6912):186-189】。因此，需要研发适应进化等藻种选育新方法，以促进微藻的生长速率和油脂产率等。
发明内容
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的提高微藻生长速率和油脂产率的方法，包括步骤：
[0008] 1）微藻株进行接种后，在20～35℃和20～200μmol光子（photons）m-2s-1条件下，连续光照或按一定光暗循环光照进行培养2～5天；
[0009] 2）将步骤1）培养的微藻株再次进行接种后，在20～35℃下培养2～5天； [0010] 3）将步骤1）作为一个培养循环，按照步骤2）的方法进入下一个培养循环，经进行20～200个培养循环【即总共进行了20～200个步骤1）】，使得微藻株的生长速率趋向稳定，获得生长速率和油脂产率都提高的微藻株。
[0011] 所述方法，还可包括：4）将经过20～200个培养循环后的微藻株在20～35℃下正常培养2～5天后，转入20～35℃的缺氮培养3～9天。
[0012] 所述步骤1）中，微藻株进行接种的步骤为：选择对数增长期的微藻株，按照一定的细胞密度进行接种（如以680nm的光密度OD680为0.1～0.6进行接种）；微藻株包括：CC4324、CC4326和CC4334。该微藻株的培养基包括：常规的TAP培养基或HS培养基；一定光暗循环光照，是光照时间与暗时间的比例为（6～24）/（18～0），即（6：18）～（24：0）。 [0013] 优选的，步骤1）中，以680nm的光密度OD680为0.1进行接种，在25℃和50μmol-2 -1
光子m s 条件下，连续光照培养3天。
光子m s 条件下，连续光照培养3天。
[0014] 步骤2）中，微藻株再次进行接种的步骤为：将步骤1）培养的微藻株稀释到接种密度OD680为0.1～0.6进行接种（即稀释到步骤1）的初始细胞密度）。优选的，将步骤1）培养的微藻株稀释到接种密度OD680为0.1进行接种，在25℃下培养3天。
[0015] 优选的，步骤3）中，进行28个培养循环。
[0016] 优选的，步骤4）中，将经过28个培养循环后的微藻株在25℃下正常培养3天后，转入25℃的缺氮培养6天。进一步优选为，将经过28个培养循环后的微藻株以OD680为0.2进行接种，在25℃下正常培养3天后，转入25℃的缺氮培养6天。
[0017] 另外，本发明还公开了一种提高微藻生长速率和油脂产率的微藻，该微藻主要是通过上述的“提高微藻生长速率和油脂产率的方法”获得。
[0018] 再者，本发明还公开了一种上述微藻在提高微藻生长速率和油脂产率中的应用。 [0019] 通过适应进化，微藻野生株和微藻基因缺陷突变体的生长速率和油脂产率都有了提高，与大规模筛选相比，工作量少，效率高。微藻的生长和油脂合成基因等调控机制非常复杂，基因敲除等分子生物学手段还不完善，转基因技术对环境和生态的影响还不确定。适应进化没进行转基因等操作，仅通过实验室培养就可以提高微藻生长速率和油脂产率，是有效的藻种选育新方法，在微藻生物燃料开发中有广阔的应用前景。
[0020] 此外，在微藻代谢途径及生理学研究中，通常也会通过物理或化学诱变等方法构建基因缺陷突变体，这些突变体在藻种库保存以及研究过程中由于生长能力差而不能长时间培养， 但通过本发明的方法可改善这些微藻基因缺陷突变体的生长速率，利于藻株的研究。附图说明
[0021] 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0022] 图1是莱茵衣藻野生株CC4324和2株基因缺陷突变体（CC4326和CC4334）在适应进化后的缺氮培养3-6天的结果图；其中，在图（I）～（IV）中，左侧培养瓶都为CC4324、中间培养瓶都为CC4326、右侧培养瓶都为CC4334；
[0023] 图2是莱茵衣藻野生株CC4324和2株基因缺陷突变体（CC4326和CC4334）在适应进化后并经缺氮培养6天后的生长速率比较图；
[0024] 图3是莱茵衣藻野生株CC4324和2株基因缺陷突变体（CC4326和CC4334）在适应进化后并经缺氮培养6天后的总脂浓度比较图；
[0025] 图4是莱茵衣藻野生株CC4324和2株基因缺陷突变体（CC4326和CC4334）在适应进化后并经缺氮培养6天后的油脂产率比较图。
具体实施方式
[0026] 实施例1
[0027] 采用微藻株：莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）野生株CC4324（Ball 330精氨酸营养缺陷型，无细胞壁）、突变株CC4326（AGPase大亚基失活）和突变株CC4334（异淀粉酶失活）为例，说明本技术方案的可行性。以上藻种均来自美国衣藻藻种保存中心（Chlamydomonas Resource Center）。
[0028] 对微藻株进行适应进化的步骤如下：
[0029] 1）、三种微藻株的基础培养基都为TAP液体培养基，在25℃和50μmol photons -2 -1m s 的光照振荡培养箱中培养，连续光照。初代将微藻株（CC4324、CC4326和CC4334）分别以680nm下的光密度OD680为0.1的条件下，各自接种于50mL TAP培养基中（100mL三角摇瓶），培养3天，测量干重。
[0030] 2）、取培养3天后的初代微藻株继续接种于50mL TAP培养基（另一个100mL三角摇瓶），保持接种密度OD680为0.1，25℃下培养3天，测量干重。
[0031] 3）、重复步骤1）的培养循环，并按步骤2）进行下一个循环过程，进行28个循环培养【即进行了28个步骤1）】。每种微藻株设立三个平行样。
[0032] 4）、经过28个循环的传代培养后，得到适应进化的微藻株，并将这些微藻株以OD680为0.2的密度分别接种于新鲜TAP培养基，25℃下培养3天，5500rpm离心5min，将收集得到的藻体分成2部分，其中，一部分藻体进行液氮速冻后，置-80℃冰箱保存备用；另一部分藻体，用灭菌蒸馏水洗涤3次并离心收集，然后，将离心收集的藻细胞以等密度转入新鲜缺 氮的TAP培养基开始氮饥饿培养（缺氮培养，如图1所示），共培养6天，并在培养时间为1天、3天、6天取样后，5500rpm离心5min，收集藻体，液氮速冻后，置-80℃冰箱保存备用，并测定其生物量增长和总脂含量。
[0033] 同时，以未适应进化的藻（未进行光照处理培养的CC4324、CC4326和CC4334）作为对照，即：将未进化的微藻株以OD680为0.2的密度接种于新鲜TAP培养基，25℃下培养3天后，按照上述方法进行缺氮培养6天并离心收集藻体，液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用，并测定其生物量增长和总脂含量。
[0034] 其中，干重法测定生物量的具体步骤为：
[0035] （1）微孔滤膜（Whatman，GF/F，0.7μm/47mm）于105℃烘箱过夜烘干，称量滤膜干重为W1；
[0036] （2）取10mL藻液于干燥后的滤膜上抽滤；
[0037] （3）置于105℃烘箱中烘干至恒重（24h），称量膜的重量为W2；
[0038] （4）利用以下公式计算出单位体积藻液的干重，即生物量浓度W： [0039] W（g/L）=100×（W2-W1），W为生物量浓度（g/L）。
[0040] 抽提总脂的方法具体如下：
[0041] （1）-80℃冰箱保存的藻于冷冻干燥机中过夜冻干；
[0042] （2）取冻干的藻粉0.1g于干净的15mL玻璃瓶中（保持藻粉粉末状），加入5mL氯仿：甲醇混合液（氯仿：甲醇的体积比为2:1），涡旋振荡1min，35℃水浴中以150rpm震荡1h，涡旋振荡1min；
[0043] （3）转移溶液到15mL离心管中，5000rpm离心10min，取上悬液于一新的玻璃管中；
[0044] （4）将剩余的藻渣再加入5mL氯仿甲醇混合液（氯仿：甲醇的体积比为2:1），涡旋振荡1min，35℃水浴中以150rpm震荡30min，涡旋振荡1min，离心后合并抽提液于玻璃管中；
[0045] （5）在抽提液中加入0.2体积的去离子水，涡流震荡1min，室温下静置，使其分层； [0046] （6）抽提液分为两层，下层为有机相，抽提的总脂溶于有机相，测量有机相的总体积；
[0047] （7）取3mL有机相于一个预先称重的4mL玻璃瓶中，氮气吹干样品并称重； [0048] （8）总脂占细胞干重的比例，即总脂浓度（LW）的计算按照以下公式： [0049] LW(g/g)=(m2-m0)×V/(3×m1)。
[0050] 其中，m1是称量的藻干重（0.1g）；m2是玻璃管和总脂的重量；m0是空玻璃管的重量；V是抽提后总有机相的体积。
[0051] 干重法测定的生物量浓度和总脂浓度结果，如图2-3所示。
[0052] 油脂产率（LY）的计算按照以下公式进行：
[0053] LY（g/L）=W×LW
[0054] 其中，W为上述的生物量浓度（g/L），LW为上述的总脂浓度（g/g）。 [0055] 油脂产率的结果如图4所示。由图4可知，经适应进化后，CC4324、CC4326和CC4334微藻株的油脂产率分别提高60.93%、60.29%和125.6%。
[0056] 根据上述试验，采用本发明的方法，明显提高了微藻野生株CC4324和微藻基因缺陷突变体（CC4326和CC4334）的生长速率和油脂产率，而且操作简单，无需进行基因敲除等手段，具有广泛的应用前景。
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