技术领域
[0001] 本
发明属于中草药辣蓼总黄酮的分离纯化技术，尤其涉及一种大孔吸附树脂分离纯化辣蓼黄酮的工艺。
背景技术
[0002] 辣蓼(Polygonum hydropiper Linn.)在我国分布广泛，资源丰富，主要成分为鞣质、黄酮和挥发油，其中黄酮类化合物有：
芦丁、槲皮素、金丝桃苷、山
萘酚、异鼠李素。近年来国内外学者发现黄酮类化合物具有良好的抗菌、抗病毒、抗
氧化活性，除此之外，还能降血压、降血脂，并能提高
机体免疫
力。
[0003] 近年来，大孔吸附树脂被广泛运用于中草药有效成分的分离及新药的开发与研制，是一类有机高分子
聚合物吸附剂，其具有价格便宜，
稳定性高、吸附快，吸附容量大，洗脱率高，
解吸条件温和，再生简便，使用周期长等优点。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简单方便、分离纯化效果好、再生使用周期长的大孔吸附树脂分离纯化辣蓼黄酮的工艺。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：大孔吸附树脂分离纯化辣蓼黄酮的工艺，包括以下步骤：
[0006] (1)利用超声-酶解偶联法对辣蓼药材进行总黄酮的提取；
[0007] (2)将步骤(1)获得的提取液依次经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取，收集乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黄酮，减压蒸干备用；
[0008] (3)将步骤(2)获得的乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黄酮配制成浓度为0.5～1.5mg/mL的上柱液，通过预处理好的大孔吸附树脂，用60～80％
乙醇洗脱4～10倍量柱体积，洗脱液进行
蒸发浓缩，
真空干燥，即得纯化辣蓼总黄酮。
[0009] 预处理按以下操作进行：取大孔吸附树脂用无
水乙醇浸泡24h充分溶胀之后装柱，用95％乙醇冲洗，收集洗脱液，检查洗脱液无浑浊即可停止收集洗脱液(方法为加入等体积的去离子水后无浑浊)，然后用去离子水洗脱，除去乙醇，；用4倍量柱体积的3％
盐酸溶液冲洗，去离子水冲洗至中性；用4倍量柱体积的3％氢氧化钠溶液冲洗，去离子水冲洗至中性即可。
[0010] 大孔吸附树脂为弱极性或极性的大孔吸附树脂。
[0011] 大孔吸附树脂为D101、AB-8、DM-130或XDA-8型号。
[0012] 步骤(1)按以下操作进行：
[0013] (1)将辣蓼药材干燥、
粉碎，分别加入重量为辣蓼药材重量0.2～0.4％的果胶酶和
纤维素酶，混合均匀，加入pH值为4.8的HAc-NaAc缓冲液，进行超声-酶解；
[0014] (2)用Na2CO3溶液调节超声-酶解后的溶液pH值为9.0，80～90℃水浴10～20min使酶失活；
[0015] (3)加入乙醇浸提24h，过滤收集浸提液，滤渣再加入乙醇溶液重复浸提一次，过滤，合并两次浸提液。
[0016] 超声-酶解
温度为30～60℃，时间为1.0～2.0h。
[0017] HAc-NaAc缓冲液与辣蓼药材的体积
质量比为5～50mL∶1g。
[0018] 步骤(3)中加入乙醇后，乙醇的终体积浓度为60～80％。
[0019] 为提高有效辣蓼黄酮有效成分的含量，
发明人建立了一种大孔吸附树脂分离纯化辣蓼黄酮的工艺，该法以超声-酶解偶联法提取的辣蓼总黄酮提取液为原料，经多种
有机溶剂萃取后，将乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黄酮利用大孔吸附树脂进一步分离纯化，获得了纯化辣蓼总黄酮。试验表明，本发明的工艺具有成本较低、稳定性高、吸附快、吸附容量大、洗脱率高、解吸条件温和、再生简便和使用周期长等优点，是一种理想的辣蓼总黄酮分离提纯工艺。
附图说明
[0020] 图1是四种大孔吸附树脂对辣蓼乙酸乙酯部分黄酮的静态吸附动力学曲线。
[0021] 图2是四种大孔吸附树脂对辣蓼正丁醇部分黄酮的静态吸附动力学曲线。
[0022] 图3是上样液浓度对XDA-8大孔吸附树脂辣蓼黄酮吸附量的影响。
[0023] 图4是上样液pH值对XDA-8大孔吸附树脂辣蓼黄酮吸附量的影响。
[0024] 图5是XDA-8大孔吸附树脂动态累积泄露曲线。
[0025] 图6是总黄酮洗脱曲线。
具体实施方式
[0027] (1)利用超声-酶解偶联法对辣蓼药材进行总黄酮的提取；
[0028] 将辣蓼原药粉至100目，按料液比为1∶30与pH 4.8的Hac-NaAc缓冲液混合，加入0.25％的
纤维素酶与果胶酶在50摄氏度下超声1.5h，之后用Na2CO3溶液调pH至9.0，在85℃下水浴15min使酶灭活。加入纯乙醇使酶解液中醇浓度为60％，浸提24h，回收浸提液，滤渣按1∶30的料液比再加入60％乙醇溶液重复浸提一次，过滤，合并两次的滤液，滤液经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。收集乙酸乙酯与部分与正丁醇部分，减压蒸干备用。
[0029] 实施例2大孔吸附树脂对辣蓼黄酮的吸附试验
[0030] 大孔吸附树脂的预处理——取各型大孔吸附树脂(D101、AB-8、DM-130和XDA-8型号)分别用无水乙醇浸泡24h充分溶胀之后装柱，用95％乙醇冲洗，收集洗脱液，检查洗脱液无浑浊即可停止收集洗脱液(方法为加入等体积的去离子水后无浑浊)，然后用去离子水洗脱，除去乙醇；用4倍量柱体积的3％盐
酸溶液冲洗，去离子水冲洗至中性；用4倍量柱体积的3％氢氧化钠溶液冲洗，去离子水冲洗至中性。
[0031] 静态吸附试验——将辣蓼乙酸乙酯部分黄酮或正丁醇部分黄酮配制成黄酮浓度为0.75mg/mL的待上样溶液。将预处理好的大孔吸附树脂抽滤至不滴水，各精密称取2.0g放置于100mL具塞锥形瓶中，分别准确加入50mL辣蓼乙酸乙酯部分黄酮或正丁醇部分黄酮，于室温下以120r.min-1的速度在摇床中振摇24h充分吸附后，取上清液用0.22μm滤
膜过滤，滤液用分光光度计测定剩余黄酮含量，分别计算各大孔吸附树脂的静态吸附量，结果见表1。
[0032] 静态解吸试验——取上述方法中已吸附饱和的树脂，分别加入50mL 95％的乙醇溶液。在室温下以120r.min-1的速度在摇床中振摇24h，使大孔吸附树脂解吸完全，取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液用分光光度计测定其中芦丁和黄酮含量的含量，分别计算各大孔吸附树脂的静态解吸量，结果见表2。
[0033] 静态解吸率的计算将由静态解吸量和静态吸附量之比求得，公式如下：
[0034] 静态吸附量(mg/g)＝V药液×(C0-C1)/M树脂
[0035] 静态解吸量(mg/g)＝V洗脱液×C2/M树脂
[0036] 解吸率％＝静态解析量/静态吸附量×100％
[0037] 其中，C0为黄酮初始浓度(mg/mL)，C1为黄酮剩余浓度(mg/mL)，C2为洗脱液中黄酮浓度(mg/mL)，M树脂为树脂质量(g)。
[0038] 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定——将辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮配制成黄酮浓度为0.75mg/mL的待上样溶液。准确移取辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮50mL，分别加入盛有4种大孔树脂的锥形瓶内，置恒温
振荡器上振荡，30℃，120r/min，每隔一段时间取1mL溶液测定，连续测定8h，计算树脂对辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮的吸附率，确定吸附容率与时间的关系，绘制吸附动力学曲线，研究其吸附速率，结果见图1、图2。
[0039] 表1四种大孔吸附树脂对辣蓼黄酮静态吸附量
[0040]
[0041] 表2四种大孔吸附树脂对辣蓼黄酮静态解吸量
[0042]
[0043] 表3四种大孔吸附树脂对辣蓼黄酮静态解吸率
[0044]
[0045] 结果显示：用四种大孔树脂分别对辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮进行吸附与解吸，XDA-8大孔吸附树脂对辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮不仅有较大的静态吸附量，而且有较大的静态解析量。XDA-8大孔吸附树脂对辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮都有良好的静态吸附动力学特性，能在4小时内达到吸附的平衡，与其他大孔吸附树脂相比更适合进行试验性研究与工业化生产。
[0046] 采用四种大孔吸附树脂分离纯化辣蓼总黄酮，均具有良好的静态吸附动力学特性，利用大孔吸附树脂分离纯化辣蓼总黄酮是一种理想的分离纯化工艺。其中，XDA-8的效果相对最优，对乙酸乙酯部分总黄酮和正丁醇部分总黄酮解吸率分别为97.44％和88.76％。
[0047] 实施例3大孔吸附树脂XDA-8对辣蓼黄酮的动态吸附试验
[0048] 上样液浓度的影响——将辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮配制成黄酮浓度为0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5mg/mL的待上样溶液25mL。以1BV/h的速度加入装有180mL XDA-8树脂的层析柱内(2×60cm，树脂柱床高约50cm)进行吸附，静止吸附3h后，用
2BV蒸馏水除杂，用95％的乙醇溶液以2BV/h的速度进行洗脱，计算吸附量。结果见图3。
[0049] 由图可知，用XDA-8大孔树脂分离纯化辣蓼黄酮乙酸乙酯部分，其最佳上样浓度为750μg/mL，正丁醇部分最佳上样浓度为1mg/mL。
[0050] 上样液pH值的影响——将辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮(黄酮浓度为0.75mg/mL)配制成pH值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的待上样溶液25mL，以1BV/h的速度加入加入装有180mL XDA-8树脂的层析柱内(2×60cm，树脂柱床高约50cm)进行吸附，静止吸附3h后，用2BV蒸馏水除杂。用100mL 95％的乙醇溶液以2BV/h的速度进行洗脱。计算吸附量。结果见图4。
[0051] 由图可知，用XDA-8大孔树脂分离纯化辣蓼黄酮乙酸乙酯和正丁醇部分，其最佳上样pH值均为6。
[0052] XDA-8大孔吸附树脂动态累积泄露曲线——将辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮(黄酮浓度为0.75mg/mL)以1BV/h的速度加入装有180mL XDA-8树脂的层析柱内(2×60cm，树脂柱床高约50cm)进行吸附。按照柱床体积(BV)收集流出液，测定每一份渗出液中总黄酮浓度，以流出液中总黄酮浓度为上样液总黄酮浓度的十分之一为
泄漏点。以洗脱液体积为横坐标，黄酮浓度为纵坐标绘制曲线，结果见图5。
[0053] 由图可知用XDA-8大孔树脂分离纯化辣蓼黄酮，对于乙酸乙酯部分黄酮，5BV时达到泄
露点，50BV时达到饱和；对于正丁醇部分黄酮，10BV时达到泄露点，50BV时达到饱和。
[0054] 洗脱剂浓度的影响——将25mL辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮(黄酮浓度为0.75mg/mL，pH 6)以1BV/h的速度加入装有180mL XDA-8树脂的层析柱内(2×60cm，树脂柱床高约50cm)进行吸附，分别用0％(蒸馏水)，15％，30％，45％，60％，75％，90％的乙醇溶液各10BV进行洗脱，收集洗脱液并测定其中黄酮含量，计算洗脱率，结果见表4。
[0055] 表4洗脱剂浓度对辣蓼总黄酮洗脱率的影响
[0056]
[0057] 结果表明用XDA-8大孔树脂分离纯化辣蓼黄酮，对于乙酸乙酯部分最佳洗脱剂为75％乙醇，洗脱率为92％；对于正丁醇部分最佳洗脱剂为60％乙醇，洗脱率为90％。
[0058] 洗脱曲线的绘制——精密吸取25mL的辣蓼乙酸乙酯部分黄酮与正丁醇部分黄酮(黄酮浓度为0.75mg/mL，pH值6)以1BV/h的速度加入装有180mL XDA-8大孔树脂的层析柱内(2×60cm，树脂柱床高约50cm)进行吸附，静置吸附4h后，用最佳洗脱浓度的乙醇溶液以2BV/h的流速进行洗脱，按照柱床体积(BV)收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮浓度，绘制洗脱曲线结果见图6。
[0059] 由图可知用XDA-8大孔树脂分离纯化辣蓼黄酮，用75％乙醇洗脱乙酸乙酯部分黄酮，用60％乙醇洗脱正丁醇部分黄酮，在5个床体积的洗脱剂的洗脱下辣蓼黄酮黄酮能大部分洗脱下来。
