技术领域
[0001] 本
发明涉及组织工程学及三维打印技术，具体地说，涉及一种冰胶三维结构体、其制备方法及应用。
背景技术
[0002] 医疗行业面临着许多紧迫的问题。例如，每年都有大量患有严
重心脏、肾脏、肝脏、
肺等
疾病的患者等待器官移植，而且由于可供移植的器官来源有限，其中大多数患者最终都因等不到移植而死亡。因此，对适用于创伤修复、组织增大、器官修复和器官置换的可植入组织和器官存在迫切的需求。此外，对能促进再生医学和组织工程学技术应用的材料、工具和技术存在需求。
[0003] 三维打印(3D打印)技术是近年来快速发展并且越来越引人注目的一种新兴的成型技术。它是一种以数字模型文件为
基础的直接制造技术，几乎可以制造任意形状三维实体。3D打印运用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层堆叠累积的方式来构造物体，即“积层制造”。3D打印与传统的
机械加工技术不同，经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维成型装置相匹配的方法，利用可成
型材料进行三维精确沉积，直接获得实体。
[0004] 冰胶(cryogel)又称为冰冻凝胶，是指在低于
溶剂正常冰点的
温度下所形成的由
聚合物、
蛋白质、凝胶等构成的结构体。由于在冷冻过程中，所产生的冰晶纯度要远高于初始溶液，相当于溶液中所含的溶质被浓缩在剩余未结冰的溶液中，而溶质的浓缩又导致了剩余溶液冰点的下降，这一过程也被称为冰冻浓缩(cryoconcentration)。冰冻浓缩导致溶液的冷冻过程不是均一的，因而在最后形成的固体中溶质的分布也不是均一的。利用这一性质，先将聚合物、蛋白质、凝胶等的
水溶液冷冻成固体，在冰点下保存，然后解冻，从而形成具有多孔结构的三维结构体(即冰胶)。冰胶具有许多优点，例如较高的贯通孔隙率和多孔性，可以负载药物、细胞和/或
生物材料以用作药物、细胞载体和/或
治疗性
植入物(例如
支架)，
生物相容性高，弹性好，机械性能好等。现有的冰胶制备技术依赖模具成形，存在内部结构不可控、材料分布不可控、难以构建尺寸较大的三维结构体并保证内部细胞存活等等问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种冰胶三维结构体、其制备方法及应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的一种制备冰胶三维结构体的方法，包括以下步骤：
[0007] (a)将冰胶原料与交联溶液混合得到冰胶前体溶液，其中所述冰胶原料包含选自以下的一种或多种物质：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、壳聚糖、层连接蛋白、纤连接蛋白和
纤维蛋白等；所述交联溶液包括选自以下的一种或多种物质：氯化
钙溶液、京尼平溶液、戊二
醛溶液、已二酸二酰肼、环
氧氯丙烷、
碳化二亚胺、凝血酶等；
[0008] (b)将所述冰胶前体溶液三维打印成预凝胶三维结构体；
[0009] (c)冷冻所述预凝胶三维结构体，从而得到冷冻的预凝胶三维结构体；以及
[0010] (d)干燥所述冷冻的预凝胶三维结构体，从而得到冰胶三维结构体。
[0011] 本发明提供的一种制备冰胶三维结构体的方法，包括以下步骤：
[0012] (a)将多种冰胶原料分别配制成多种冰胶前体溶液，其中至少一种冰胶前体溶液是将冰胶原料与交联溶液混合得到冰胶前体溶液；
[0013] 所述冰胶原料包含选自以下的一种或多种物质：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、壳聚糖、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白等；所述交联溶液包括选自以下的一种或多种物质：
氯化钙溶液、京尼平溶液、戊二醛溶液、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶等；
[0014] (b)将所述多种冰胶前体溶液分别通过多个喷头三维打印成预凝胶三维结构体；
[0015] (c)冷冻所述预凝胶三维结构体，从而得到冷冻的预凝胶三维结构体；以及
[0016] (d)干燥所述冷冻的预凝胶三维结构体，从而得到冰胶三维结构体。
[0017] 前述方法包括以下步骤：
[0018] (a1)将第一冰胶原料与交联溶液混合得到第一冰胶前体溶液；
[0019] (a2)将第二冰胶原料或第二冰胶原料与交联溶液混合配制成第二冰胶前体溶液；
[0020] (b)将所述第一冰胶前体溶液和第二冰胶前体溶液分别通过第一喷头和第二喷头三维打印成预凝胶三维结构体；
[0021] (c)冷冻所述预凝胶三维结构体，从而得到冷冻的预凝胶三维结构体；以及
[0022] (d)干燥所述冷冻的预凝胶三维结构体，从而得到冰胶三维结构体。
[0023] 前述方法包括以下步骤：
[0024] (a1)将第一冰胶原料与交联溶液混合得到第一冰胶前体溶液；
[0025] (a2)将第二冰胶原料或第二冰胶原料与交联溶液混合配制成第二冰胶前体溶液；
[0026] (a3)将第三冰胶原料或第三冰胶原料与交联溶液混合配制成第三冰胶前体溶液；
[0027] (b)将所述第一冰胶前体溶液、第二冰胶前体溶液和第三冰胶前体溶液分别通过第一喷头、第二喷头和第三喷头三维打印成预凝胶三维结构体；
[0028] (c)冷冻所述预凝胶三维结构体，从而得到冷冻的预凝胶三维结构体；以及
[0029] (d)干燥所述冷冻的预凝胶三维结构体，从而得到冰胶三维结构体。
[0030] 前述的方法，步骤(c)中以梯度方式冷冻所述预凝胶三维结构体，优选地在4℃下孵育0.5-4h，然后在-20℃下孵育3-24h，更优选地，在4℃下孵育1至3h，然后在-20℃下孵育4-12h。
[0031] 前述的方法，步骤(d)中以
真空冷冻干燥的方式干燥所述冷冻的预凝胶三维结构体，优选地在-20℃～-40℃、10-50Pa的条件下进行真空冷冻干燥，更优选地，在-25℃～-35℃、20-40Pa的条件下进行真空冷冻干燥。
[0032] 前述的方法，所述冰胶原料、第一冰胶原料以及第二冰胶原料为冰胶原料水溶液，浓度为0.5％-20％，优选1％-10％，更优选2％-5％。
[0033] 前述的方法，所述交联溶液的浓度为10-1000mmol-1，优选50-300mmol-1，更优选80-150mmol-1。
[0034] 前述的方法，所述冰胶原料与交联溶液按100:1-1:100的体积比混合。
[0035] 前述的方法，步骤(b)中所述三维打印是指通过自动的或半自动的、计算机辅助的三维成型装置进行三维精确沉积。
[0036] 前述方法还包括步骤(e)：将细胞或细胞与生物材料混合物添加到步骤(d)得到的所述冰胶三维结构体中，从而得到负载有细胞的冰胶三维结构体；所述细胞选自以下一种或多种细胞：内皮细胞、
成纤维细胞、神经细胞、血管细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、免疫细胞、软骨细胞、骨来源细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、
肝细胞、肝来源的干细胞或祖细胞、肝巨噬细胞、星状细胞、胆管上皮细胞、
肿瘤细胞、肝窦内皮细胞和其他各种组织和器官来源细胞等；所述生物材料选自以下一种或多种材料：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、壳聚糖、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白等。
[0037] 本发明还提供根据前述方法制得的冰胶三维结构体，所述冰胶三维结构体为
块状、片状、囊状或管状，其孔隙率为10％-90％，平均孔径为1-300μm，且具有0.1-10kPa的
杨氏模量。
[0038] 所述冰胶三维结构体是器官或微器官，优选肝、肾、胰、脾、肺、心肌、胃、输尿管、泌尿
导管、肝
门十二指肠肠导管、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、尿道、肠、食道、膀胱、胆囊或其一部分。
[0039] 本发明还提供借助芯片或不借助芯片、借助
生物反应器或不借助生物反应器的活的三维组织结构体的阵列，其包含多个所述冰胶三维结构体。
[0040] 本发明还提供所述冰胶三维结构体或阵列在制备用于治疗疾病或病症、组织修复或再生以及矫形或整形的植入物中的应用。
[0041] 本发明进一步提供所述冰胶三维结构体或阵列在体外研究中的应用，其中所述体外研究包括但不限于细胞培养、细胞生物学研究、药物开发、药物筛选、药物检测、药物测试、构建药理模型、病理模型、组织/器官模型和肿瘤模型。
[0042] 本发明创造性地将冰胶技术与三维打印技术相结合，通过三维打印技术来构建冰胶三维结构体(例如冰胶支架)，使得在保留冰胶优点的同时显著地改善了其缺点。
[0043] 本发明提供的冰胶三维结构体及其制备方法，可形成预先设计复杂三维结构的冰胶组织工程支架，用于三维细胞培养、体外类组织构建、组织工程与再生医学、病理学、药理学研究和药物检测等领域。所述三维打印冰胶支架具有个性化、可定制、细胞负载高、孔隙率和通透率高、孔径大小可调节、
弹性模量高以及可注射移植的特点。
[0044] 相比于常规的凝胶结构体，本发明的冰胶三维结构体具有以下优点：
[0045] (一)多孔性，其孔隙率为10％-90％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或其任意区间，平均孔径为1-300μm；
[0046] (二)生物相容性，本发明的冰胶三维结构具有非常好的生物相容性，能够适合于体内植入；
[0047] (三)负载率高，本发明的冰胶三维结构体和生物相容性植入物能够负载药物和/或细胞以用作药物载体和/或治疗性植入物(例如支架)；
[0048] (四)能够实现所负载物质的受
控释放；
[0049] (五)弹性好，本发明的冰胶三维结构体具有0.1-10kPa的杨氏模量，例如0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其任意区间，在压缩时，本发明的冰胶三维结构表现出至少
60％、70％、80％、90％、95％、98％或更高的压缩应变而不发生永久形变或机械破坏，在外
力撤除时仍能恢复原有的形状；
[0050] (六)机械性能好，本发明的冰胶三维结构体相比于常规凝胶表述出更高的机械
稳定性；
[0051] (七)内部结构可控，通过三维打印实现了对本发明的冰胶三维结构体内部结构的精确控制和对多种材料所沉积的空间
位置的精确控制；以及可以构建大尺寸的三维结构体；
[0052] (八)在负载细胞培养物时，显著地改善了细胞培养物的生长，例如显著增加了细胞培养物的生长速度以及显著增加了细胞培养物的生物学活性。
附图说明
[0053] 图1为冰胶形成过程的示意图。
[0054] 图2为本发明
实施例1中使用的单喷头三维打印设备示意图；其中，21表示喷头，22表示打印形成的三维结构体，23表示可三维运动的成形平台。
[0055] 图3为本发明实施例2中使用的双喷头三维打印设备示意图；其中，31表示第一喷头，32表示第二喷头，33表示可三维运动的辅助成形微流控芯片。
[0056] 图4为本发明实施例4中制备的三维打印冰胶支架的照片及其性能；其中，A图为三维打印形成的预凝胶三维结构体；B图为三维打印技术制备的冰胶支架；C图为扫描电镜观察的三维打印冰胶支架微观形貌；D图为肝脏祖细胞在三维打印冰胶支架中培养5天后的形貌；E图为肝脏祖细胞在三维打印冰胶支架中增殖情况，与常规二维培养相比，各个检测时间点都有显著性差异。
具体实施方式
[0057] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0058] 本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指
质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
[0059] 除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
[0060] 本文使用的术语“冰胶”是指在低于溶剂正常冰点的温度下所形成的由聚合物、蛋白质、或凝胶等构成的结构体，即通过冰冻浓缩(cryoconcentration)过程所形成的具有多孔结构的三维结构体。具体地，由于在冷冻过程中，所产生的冰晶纯度要远高于初始的溶液，那么就相当于溶液中所含的溶质被浓缩在剩余未结冰的溶液中，而溶质的浓缩又导致了剩余溶液冰点的下降，这一过程也被称为冰冻浓缩(cryoconcentration)。冰冻浓缩导致溶液的冷冻过程不是均一的，因而在最后形成的固体中溶质的分布也不是均一的。利用这一性质，先将聚合物、蛋白质、凝胶等的水溶液冷冻成固体，在冰点下保存，然后解冻，从而形成具有多孔结构的三维结构体(即冰胶)。本发明的冰胶可以由任何本领域技术人员已知可用的材料制成，包括但不限于：水凝胶、海藻酸盐、明胶、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide,PLGA)、
胶原蛋白、MatrigelTM、和透明质酸。冰胶形成过程的示意图见图1。
[0061] 本文中使用的术语“阵列”是指一种科学工具，其包含多个空间排列的元件的集合体，以允许对一个样品进行多个测定、对多个样品进行一个或多个测定。
[0062] 本文中使用的术语“交联溶液”是指在冰胶形成过程中起到交联作用的溶液，其可以是本领域技术人员公知可用于使得冰胶原料发生交联从而形成冰胶的材料，例如氯化钙溶液，优选10-1000mmol-1，更优选50-300mmol-1，最优选80-150mmol-1，例如100mmol-1浓度的氯化钙溶液。
[0063] 本文中使用的术语“三维打印”是指：经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维成型装置(例如三维
打印机)相匹配的方法，利用三维打印相容的原料进行的三维精确沉积。
[0064] 在一些实施方案中，本发明的三维结构体是工程化的。术语“工程化的”是指：根据计算机脚本，通过计算机辅助的装置(例如三维打印机)，将原料(例如冰胶原料和/或冰胶前体溶液)和它们的层放置以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本,例如是一个或多个
计算机程序、计算机应用或计算机模块。
[0065] 在一些实施方案中，三维打印方法是连续的和/或基本连续的。连续三维打印方法的非限制性实例是：经由连接到打印墨水储存器的分配末端(例如，
注射器、毛细管等)从三维打印机分配打印墨水(例如冰胶原料和/或冰胶前体溶液)。在进一步的非限制性实施方案中，连续三维打印方法是按功能单元的重复图案(pattern)分配打印墨水。在各个实施方案中，重复功能单元具有任何适宜的几何形状，包括例如：圆形、正方形、矩形、三
角形、多边形和不规则的几何形状，从而产生具有通过独特打印墨水和/或间隙空间的空间
图案化而获得的平面几何形状的一个或多个组织层。在进一步的实施方案中，三维打印的功能单元的一个重复图案包括一个层，相邻地三维打印(例如堆叠)多个层以形成具有层状几何形状的工程化结构体。在各个实施方案，相邻地三维打印(例如堆叠)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化结构体。在进一步的实施方案中，具有层状几何形状的组织的一个或多个层也具有平面几何形状。
[0066] 在一些实施方案中，连续三维打印的方法包括：独立地或相对于彼此优化和/或平衡诸如打印高度、
泵速、机扑速度或其组合的参数。在一个实例中，用于沉积的三维打印机头速度为3mm/s，第一层的分配高度为0.5mm，而后面每个层的分配高度增加0.4mm。在一些实施方案中，该分配高度与三维打印机分配末端的直径基本相等。不受限制地，适宜的和/或最佳的分配距离不会导致材料变平或附着到分配针上。在各个实施方案中，三维打印机分配末端具有约20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或更大的内径，包括其中任意范围。在各个实施方案中，三维打印机的打印墨水储存器具有约0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100cm3或更大的容积，包括其中任意范围。在一些情况下，当系统中的残余压力积累较低时，该泵速是适宜的或最佳的。在一些情况下，有利的泵速取决于储存器的横截面积与分配针之间的比例，该比例越大，则需要越低的泵速。在一些实施方案中，适宜的和/或最佳的打印速度使得能够沉积均匀的线，而不影响材料的机械完整性。
[0067] 本文中公开的发明包括商业方法。在一些实施方案中，本文中公开的技术和方法的速度和可放大性用来设计、构建和操作用于生产供植入使用的三维结构体或用于生成基于细胞的工具(用于研究和开发，例如体外分析)的工业和/或商业设施。在进一步的实施方案中，三维结构体及其阵列被生产、储存、分发、上市、宣传并销售，例如作为用于生物分析和高通量药物筛选的细胞阵列(例如微阵列或芯片)、组织阵列(例如微阵列或芯片)以及
试剂盒。在其它实施方案中，冰胶三维结构体及其阵列被制造并用来进行作为服务的生物分析和/或药物筛选。
[0068] 实施例1 通过单喷头三维打印制备冰胶三维结构体
[0069] 1.将海藻酸钠粉末(Sigma-Aldrich)溶于去离子水中制成3％均质溶液，经过45μm
滤纸过滤灭菌。
[0070] 2.将2mL如上所述制备的海藻酸钠溶液与0.2mL氯化钙溶液(100mmol-1)均匀混合，形成具有一定
粘度的前体溶液并装载到1mL一次性无菌注射器中。
[0071] 3.将无菌注射器装载到生物三维打印设备中(可参见Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；24：5)，在常温下，在计算机
软件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步进
电机速度2mm/s，扫描速度10mm/s的参数条件下，在无菌的平面平台上三维打印，形成体积为1cm/1cm/0.5cm的预凝胶三维结构体。单喷头
3D打印机的示意图如图2所示。
[0072] 4.梯度冷却预凝胶三维结构体，4℃保存2h，-20℃保存过夜。
[0073] 5.在-30℃，30Pa的低温、高真空度条件下干燥三维结构体24h，形成三维
细胞支架，紫外照射灭菌45min后无菌条件下保存。
[0074] 6.将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自Invitrogen)以106/mL的
密度均匀分散在内皮细胞培养基(含有20％FBS的DMEM)中，将1mL含有细胞的培养基滴加在如上所述制备的三维细胞支架中，细胞
培养箱中静置4h。
[0075] 7.加入足量内皮细胞培养基，常规条件下(37℃，5％CO2孵箱)培养细胞三维结构体。
[0076] 实施例2 通过双喷头三维打印制备冰胶三维结构体
[0077] 1.将海藻酸钠粉末(Sigma-Aldrich)溶于去离子水中制成3％均质溶液，经过45μm滤纸过滤灭菌。
[0078] 2.将明胶粉末溶于去离子水中制成10％均质溶液，经过反复高温灭菌后常温保存。
[0079] 3.将2mL如上所述制备的海藻酸钠溶液与0.2mL氯化钙溶液(100mmol-1)均匀混合，形成具有一定粘度的前体溶液并装载到10mL一次性无菌注射器中。
[0080] 4.将2mL如上所述制备的明胶溶液装载到装载到10mL一次性无菌注射器中，在10℃下保存10min，形成具有一定粘度的明胶前体溶液。
[0081] 5.将装载海藻酸钠前体溶液和明胶前体溶液的无菌注射器分别加载到三维打印机的两个喷头上，并将两个喷头的温度分别设置在25℃和10℃，在计算机软件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步进电机速度2mm/s，扫描速度10mm/s的参数条件下，在10℃无菌的平面平台完成双喷头三维打印，将两种前体材料分别打印在预定的位置，形成体积为1cm/1cm/0.5cm的预凝胶多材料三维结构体(三维打印机的结构可参见Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；24：5)。双喷头3D打印机的结构基本与单喷头
3D打印机相同，区别仅在于有两套喷头系统(即包括两个喷头以及与各个喷头相连的管路)。双喷头3D打印机的示意图如图3所示。
[0082] 6.梯度冷却预凝胶三维结构体，4℃保存2h，-20℃保存过夜。
[0083] 7.在-30℃，30Pa的低温、高真空度条件下干燥三维结构体24h，形成三维细胞支架，紫外照射灭菌45min后无菌条件下保存。
[0084] 8.将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自Invitrogen)和
宫颈癌细胞(来自ADCC)以106/mL的密度均匀分散在细胞培养基(内皮细胞培养基EGM：癌细胞培养基DMEM+10％胎
牛血清＝1:1)中，形成两种细胞的混悬液，将1mL细胞混悬液滴加在三维细胞支架中，细胞培养箱中静置4h。
[0085] 9.加入足量细胞培养基(内皮细胞培养基：癌细胞培养基＝1:1)，常规条件下(37℃，5％CO2孵箱)培养细胞三维结构体。
[0086] 实施例3 使用含胶原的细胞培养液制备负载细胞的冰胶三维结构体
[0087] 1.将海藻酸钠粉末(Sigma-Aldrich)溶于去离子水中制成3％均质溶液，经过45μm滤纸过滤灭菌。
[0088] 2.将2mL如上所述制备的海藻酸钠溶液与0.2mL氯化钙溶液(100mmol-1)均匀混合，形成具有一定粘度的前体溶液并装载到1mL一次性无菌注射器中。
[0089] 3.将无菌注射器装载到生物三维打印设备中，在常温下，在计算机软件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步进电机速度2mm/s，扫描速度10mm/s的参数条件下，在无菌的平面平台上三维打印，形成体积为1cm/1cm/0.5cm的预凝胶三维结构体(三维打印机的结构可参见Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue
Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；
24：5)。
[0090] 4.梯度冷却预凝胶三维结构体，4℃保存2h，-20℃保存过夜。
[0091] 5.在-30℃，30Pa的低温、高真空度条件下干燥三维结构体24h，形成三维细胞支架，紫外照射灭菌45min后无菌条件下保存。
[0092] 6.在冰上，将胶原溶液以1:10的浓度稀释在内皮细胞培养基中，并调节PH值为中性。
[0093] 7.将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自Invitrogen)以106/mL的密度均匀分散在含有胶原材料的内皮细胞培养基(含20％FBS的DMEM)中，将1mL细胞混悬液滴加在三维细胞支架中，细胞培养箱中静置4h。
[0094] 8.加入足量内皮细胞培养基，常规条件下(37℃，5％CO2孵箱)培养细胞三维结构体。
[0095] 实施例4 冰胶三维结构体的制备及其性能
[0096] 1.将海藻酸钠粉末(Sigma-Aldrich)溶于去离子水中制成3％均质溶液，经过45μm滤纸过滤灭菌。
[0097] 2.将2mL如上所述制备的海藻酸钠溶液与0.2mL氯化钙溶液(100mmol-1)均匀混合，形成具有一定粘度的前体溶液并装载到1mL一次性无菌注射器中。
[0098] 3.将无菌注射器装载到生物三维打印设备中，在常温下，在计算机软件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步进电机速度2mm/s，扫描速度10mm/s的参数条件下，在无菌的平面平台上三维打印，形成体积为1cm/1cm/0.5cm的预凝胶三维结构体(三维打印机的结构可参见Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue
Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；
24：5)。图4A显示三维打印形成的预凝胶三维结构体。
[0099] 4.梯度冷却预凝胶三维结构体，4℃保存2h，-20℃保存过夜。
[0100] 5.在-30℃，30Pa的低温、高真空度条件下干燥三维结构体24h，形成三维细胞支架，紫外照射灭菌45min后无菌条件下保存。图4B显示了所制备的冰胶支架。图4C为扫描电镜观察的三维打印冰胶支架微观形貌。
[0101] 6.在冰上，将胶原溶液以1:10的浓度稀释在细胞培养基中，并调节PH值为中性。
[0102] 7.将肝脏祖细胞(Life Technologies)以106/mL的密度均匀分散在含有胶原材料的细胞培养基(含20％FBS的DMEM)中，将1mL细胞混悬液滴加在三维细胞支架中，细胞培养箱中静置4h。
[0103] 8.加入足量细胞培养基，常规条件下(37℃，5％CO2孵箱)培养细胞三维结构体。图4D图为肝脏祖细胞在三维打印冰胶支架中培养5天后的形貌。图4E图为肝脏祖细胞在三维打印冰胶支架中增殖情况。与常规二维培养相比，在初始负载细胞数量、培养环境、培养液和培养条件等完全相同的情况下，通过常用的细胞代谢活性检测试剂盒鉴定(
Cell Viability Assay，Promega)，各个检测时间点都显示出在本发明
所制备的三维打印冰胶支架中培养肝脏祖细胞相比于二维培养使得所培养细胞的代谢活性显著提高。
[0104] 以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。
[0105] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
