一种基于HS-SPME和GC-MS检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌
物质的方法
技术领域
[0001] 本
发明属于检测领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y13 挥发性抑菌物质的检测方法。技术背景
[0002] 油茶是我国特有的木本油料
植物，其经济效益好、种植面积大，但由于经营管理粗放，病虫害日益猖獗。油茶
炭疽病(Camellia oleifera anthracnose)是发生在我国油茶产区极其普遍的一种主要病害，其寄主范围广、发病快、危害严重，也是热带、亚热带经济作物的重要病害。长期以来，主要通过化学制剂对油茶炭疽病进行防治。这使得病原菌产生了严重的抗药性，同时也污染环境，使得产品
农药残留量超标，危害消费者健康。在安全、环保、可持续成为发展方向的今天，
生物防治具有
化学防治所不具备的优势。
[0003] 枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Y13是本课题组从油茶健康叶上分离得到的一株对油茶炭疽病具有良好防效的
内生菌，其
发酵过程中产生的挥发性物质对油茶炭疽病菌有较强的抑制作用，但抑制效果不稳定。本研究基于HS-SPME和GC-MS 检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性产物及抑菌活性测定，从另一个
角度进一步准确的揭示其抑菌的主要作用物质，为油茶炭疽菌的综合防治措施的制定和无公害药剂的研发提供理论依据。
[0004] 芽孢杆菌(Bacillus sp.)在生长代谢过程中会产生很多种挥发性物质，包括醇类、
醛类、酸类、苯类、酯类、
酮类和酚类等化合物，其中很多的挥发性化合物已经被报道具有一定的抑制植物病原
真菌的能
力，是芽孢杆菌重要的生防因子之一。1972年Moore-Landecker等首次发现一株蜡状芽孢杆菌(B.cereus)能产生对绿色木霉(Trichoderma viride)有抑菌活性的挥发性抗菌物质(Volatiles)，此后芽孢杆菌能产生具有抑菌活性的挥发性气体的研究被广泛报道，而且产生的挥发性气体普遍具有较好的抑菌广谱性。Yuan等研究发现，解
淀粉芽孢杆菌 NJN-6可产生11种挥发性物质，其挥发物可完全抑制香蕉枯萎病病原菌菌丝的生长及孢子的萌发。Liu等报道芽孢杆菌(Bacillus sp.)BL02、BSH-4和ZB13 的挥发性气体对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等10种植物病原菌均具有不同程度的抑菌活性。Arrebola等研究发现枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PPCB001和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)PPCB004 均能有效抑制指状青霉菌(Penicillium digitatum)、意大利青霉菌(Penicillium italicum)和黄炳曲霉菌(Penicillium crustosum)的生长。因此，研究枯草芽孢杆菌Y13的挥发物对油茶炭疽病的抑制具有十分有意义的价值。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于HS-SPME(Headspace Solid-phase Micro- extraction,顶空固相微萃取技术)和GC-MS(气相-质谱联用)检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性产物及其抑菌活性测定,该方法能较全面、准确的测定Y13挥发物的成分及含量。
[0006] 一种基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤(1)：顶空固相微萃取
[0008] 采用二乙烯苯/
碳分子筛/聚二甲基
硅氧烷的微萃取头固相萃取枯草芽孢杆菌 Y13发酵的挥发成分；
[0009] 步骤(2)：GC-MS检测
[0010] 步骤(1)处理得到的微萃取头进行GC-MS检测；
[0011] GC-MS检测过程中，气相色谱条件为：采用HP-5
石英毛细管色谱柱，进样口
温度225～235℃，载气为氦气，色谱柱初始温度45～55℃，保持1.5～2.5min，柱流量0.9～1.1mL/min，分流进样，分流比为9～10∶1，以5.5～6.5℃/min升温速率至175～185℃，保持0.9～1.1min，在以9.5～10.5℃/min升温速率至245～255℃，保持2.9～3.1min；
[0012] 质谱条件为：
电子轰击离子源(EI)，离子源温度为225～235℃，GC-MS
接口温度225～235℃，四极杆温度145～155℃，电子
能量65～75eV，
质量扫描范围为30～450m/z。
[0013] 本发明创新地开发出一种能够快速、准确测定草芽孢杆菌Y13的抗菌挥发成分的方法，其通过顶空固相微萃取捕收挥发成分，并创新地在所述的GC条件下成分的分离，并配合MS快速鉴定GC分离的物质，从而实现快速检测、鉴定。
[0014] 不同菌种需要相互分离的挥发成分不同，研究发现，通过所述的创新地 HS-SPME、GC-MS方法，能够成功实现芽孢杆菌Y13的抗菌挥发成分中的壬醛、 2-庚酮、
苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑、3，5-二叔丁基
苯酚、苯丙噻唑、过氧化二碳酸二酯等挥发成分的成功分离以及快速鉴定。
[0015] 作为优选，步骤(1)中，将枯草芽孢杆菌Y13菌液与NB液体培养基混合，然后置于顶空进样瓶中，将顶空瓶置于26～30℃、130～150r/min恒温摇床中培养；顶空瓶平衡后再采用HS-SPME技术，向顶空瓶中插入活化后的微萃取头，固相萃取顶空瓶中收集的挥发成分。
[0016] 作为优选，枯草芽孢杆菌Y13菌液的浓度为0.8～1.2×109CFU/mL。
[0017] 作为优选，枯草芽孢杆菌Y13菌液、NB液体培养基的体积比为1:15～25。
[0018] 作为优选，平衡过程的温度为35～45℃，平衡时间为1h以上。
[0019] 作为优选，微萃取头的活化的温度为220～240℃；时间为8～12min。
[0020] 作为优选，固相萃取的时间为15～25min。
[0021] 作为优选，HP-5石英毛细管色谱柱为30.0m×0.25mm×0.25μm的色谱柱。
[0022] 作为优选，将固相萃取后的微萃取头插入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进样口解析2～3min，后进行GC-MS分析。
[0023] 作为优选，GC-MS检测过程中，气相色谱条件为：采用HP-5石英毛细管色谱柱，进样口温度230℃，载气为氦气，色谱柱初始温度50℃，保持2min，柱流量1mL/min，分流进样，分流比为10∶1，以6℃/min升温速率至180℃，保持1min，在以10℃/min升温速率至250℃，保持3min；
[0024] 质谱条件为：电子轰击离子源(EI)，离子源温度为230℃，GC-MS接口温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，质量扫描范围为30～450m/z。
[0025] 作为优选，通过气相色谱-质谱鉴定出挥发物成分；并且以果生炭疽菌作为指示菌，鉴定枯草芽孢杆菌Y13挥发物的抑菌作用。
[0026] 作为优选，鉴定枯草芽孢杆菌Y13挥发物的抑菌作用的步骤为：制备PDA 培养基平板并在平板中央接入新鲜的果生炭疽菌菌饼，再分别在培养皿皿盖中央放置无菌干燥的
滤纸片，用移液枪分别往滤纸片上滴加不同体积的挥发物化合物纯品，然后将培养皿用双层
封口膜封住，于28℃恒温
培养箱中倒置培养，每个纯品均设5μL、10μL、15μL、20μL四种体积梯度，以滤纸片上滴加无菌
水为对照，待对照组病原真菌菌落直径长至超过培养皿直径的3/4时，测量病原真菌的菌落直径，每个处理设3次重复。
[0027] 一种优选的基于动态顶空固相微萃取技术和GC-MS检测Y13挥发物的方法，该方法区别于其他收集挥发物的方法在于对挥发性气体进行手动萃取并配置一定条件的萃取头，并且将顶空瓶置于28℃、140r/min恒温摇床中培养3d为前提，然后收集Y13的挥发性气体，从而实现对Y13有机挥发物的高效收集。
[0028] 将制备好的Y13菌液(1.0×109CFU/mL)以1∶20(v/v)的比例与加热冷却至45℃～50℃的NB液体培养基混合，然后用移液枪吸取5mL混合完Y13菌液的NB液体培养基于20mL顶空进样瓶中，对照组为顶空进样瓶中添加5mL不混合Y13菌液的NB液体培养基，将顶空瓶置于28℃、140r/min恒温摇床中培养3d后收集Y13的挥发性气体。挥发性气体的收集采用顶空固相微萃取技术(Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)，对挥发性气体进行手动萃取并配置50/30μm二乙烯苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷微萃取头(DVB /CAR/PDMS、灰色)。将顶空进样瓶置于40℃，恒温装置中平衡1h以上，且将萃取
纤维头在气相色谱的进样口中活化10min，活化温度为230℃，然后将萃取纤维头插入顶空进样瓶中萃取
20min，
吸附完成后，迅速取出萃取纤维头插入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进样口解析
2min，后进行GC-MS分析。本萃取过程中已对萃取头、萃取温度、萃取时间等条件进行优化选择，以上所述的萃取条件都是最终对比筛选后的结果，所以在该条件下最适合Y13的挥发性气体萃取。
[0029] 气相色谱-质谱(GC-MS)分析条件：
[0030] 气相色谱条件：采用HP-5石英毛细管色谱柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度230℃，载气为高纯度氦气(＞99.999％)，色谱柱初始温度50℃，保持2min，柱流量1mL/min，分流进样，分流比为10∶1，以6℃/min升温速率至180℃，保持1min，在以10℃/min升温速率至250℃，保持3min。
[0031] 质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度为230℃，GC-MS接口温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，质量扫描范围为30～450m/z。 GC-MS所得质谱图经NIST2011质谱
数据库检索，结合每个峰的质谱数据和化合物的标准图谱特征，对其进行定性分析，利用色谱峰面积归一法测得各组分的相对百分比来表示单个化合物的质量分数。
[0032] 为确定出枯草芽孢杆菌Y13挥发物中对油茶炭疽病病原菌具有较强作用的抑菌物质，特从市面上购买GC-MS分析鉴定出的10种枯草芽孢杆菌Y13挥发性物质化合物的纯品，并分别检测其抑菌活性，以果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)作为指示菌进行检测。
[0033] 检测方法具体为：制备PDA培养基平板并在平板中央接入新鲜的果生炭疽菌菌饼(直径6mm)，再分别在培养皿皿盖中央放置无菌干燥的滤纸片(直径 6mm)，用移液枪分别往滤纸片上滴加不同体积的挥发物化合物纯品，然后将培养皿用双层封口膜封住，于28℃恒温培养箱中倒置培养，每个纯品均设5μL、 10μL、15μL、20μL四种体积梯度，以滤纸片上滴加无菌水为对照，待对照组病原真菌菌落直径长至超过培养皿直径的3/4时，测量病原真菌的菌落直径(mm)，每个处理设3次重复。病原真菌菌落直径的测量采用十字交叉法，计算抑菌率。
[0034] 本发明具有的有益效果是：
[0035] 能够全面、准确的测定枯草芽孢杆菌Y13挥发物的成分及含量；并且在常温范围内即可完成，避免了分析过程中产生新的化合物；本发明的顶空固相微萃取技术工作条件，能有效富集Y13挥发物各成分；GC-MS检测采用分段升温，可以使挥发物成分得到有效分离，相应的质谱参数可以实现快速准确地鉴定出挥发物成分；并且以果生炭疽菌作为指示菌，鉴定出了枯草芽孢杆菌Y13挥发物具强抑菌效果的有效成分。
附图说明
[0036] 图1是枯草芽孢杆菌Y13挥发挥发性物质的总离子流图
[0037] 表1是枯草芽孢杆菌Y13挥发性物质的GC-MS鉴定结果
[0038] 表2是不同浓度的10种挥发性化合物纯品对果生炭疽菌的抑菌活性
[0039] 图2是10种挥发性化合物纯品(10μL/plate)对果生炭疽菌的抑菌活性；A：对照组；B～K：壬醛、苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑、苯丙噻唑、3,5-二叔丁基苯酚、2-壬酮、2-庚酮、邻苯二
甲酸二丁酯、过氧化二碳酸二酯、正十八烷。
[0040] 表3是筛选出的4种挥发性化合物纯品(10μL/plate)对多种油茶病原真菌的抑菌活性
具体实施方式
[0041] 下面结合附图、表和
实施例对本发明作进一步说明
[0042] 采用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)收集枯草芽孢杆菌Y13的挥发性气体，具体做法是：将制备好的Y13菌液(1.0×109CFU/mL)以1∶20(v/v)的比例与加热冷却至45℃～50℃的NB液体培养基混合，然后用移液枪吸取5mL 混合完Y13菌液的NB液体培养基于20mL顶空进样瓶中，对照组为顶空进样瓶中添加5mL不混合Y13菌液的NB液体培养基，将顶空瓶置于28℃、140r/min 恒温摇床中培养3d后收集Y13的挥发性气体。对挥发性气体进行手动萃取并配置50/30μm二乙烯苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷微萃取头(DVB/CAR/PDMS、灰色)。将顶空进样瓶置于40℃，恒温装置中平衡1h以上，且将萃取纤维头在气相色谱的进样口中活化
10min，活化温度为230℃，然后将萃取纤维头插入顶空进样瓶中萃取20min，吸附完成后，迅速取出萃取纤维头插入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进样口解析2min，后进行GC-MS分析。
[0043] 进一步进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析，具体的分析条件为：①气相色谱条件：采用HP-5石英毛细管色谱柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度230℃，载气为高纯度氦气(＞99.999％)，色谱柱初始温度50℃，保持2min，柱流量1mL/min，分流进样，分流比为10∶1，以6℃/min升温速率至180℃，保持1min，在以10℃/min升温速率至250℃，保持3min。②质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度为230℃，GC-MS接口温度230℃，四极杆温度 150℃，电子能量70eV，质量扫描范围为30～450m/z。GC-MS所得质谱图经 NIST2011质谱数据库检索，结合每个峰的质谱数据和化合物的标准图谱特征，对其进行定性分析，利用色谱峰面积归一法测得各组分的相对百分比来表示单个化合物的质量分数。
[0044] 经过HS-SPME和GC-MS后，共发现13种明显不同的典型峰(图1)，经 NIST2011质谱数据库检索，共检测出13种不同的挥发性化合物(表1)，包括醇类、酚类、醛类、酯类、酮类、烯
烃类、烷烃类等，这13种挥发性化合物总含量占挥发物质总量的53.52％。其中邻苯二甲酸二丁酯是13种挥发性化合物中含量最高的组分，相对含量为12.81％；其次是十六甲基-1,15-二羟基八硅氧烷，相对含量为9.82％；最低的为3-甲基-4-苯基吡唑，相对含量为
1.61％。在这13 种挥发性化合物中，醇类仅有1种，相对含量为2.63％；醛类有2种，相对含量为7.41％；酮类有2种，相对含量为3.83％；酯类有2种，相对含量为15.45％；烯烃类有1种，相对含量为5.00％；烷烃类有2种，相对含量为11.43％。
[0045] 进一步为确定出枯草芽孢杆菌Y13挥发物中对油茶炭疽病病原菌具有较强作用的抑菌物质，特从市面上购买GC-MS分析鉴定出的10种枯草芽孢杆菌Y13 挥发性物质化合物的纯品，并分别检测其抑菌活性，以果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)作为指示菌进行检测。具体检测方法为：制备PDA培养基平板并在平板中央接入新鲜的果生炭疽菌菌饼(直径6mm)，再分别在培养皿皿盖中央放置无菌干燥的滤纸片(直径6mm)，用移液枪分别往滤纸片上滴加不同体积的挥发物化合物纯品，然后将培养皿用双层封口膜封住，于28℃恒温培养箱中倒置培养，每个纯品均设5μL、10μL、15μL、20μL四种体积梯度，以滤纸片上滴加无菌水为对照，待对照组病原真菌菌落直径长至超过培养皿直径的3/4时，测量病原真菌的菌落直径(mm)，每个处理设3次重复。病原真菌菌落直径的测量采用十字交叉法，计算抑菌率。结果发现10种挥发性化合物纯品对果生炭疽菌的抑菌活性检测结果显示，除了正十四烷对果生炭疽菌没有抑菌活性外，其他9种挥发性化合物纯品对果生炭疽菌，均具有不同程度的抑菌活性。当培养皿(直径9cm)中的施药剂量为5μL时，壬醛、苯甲醛均能完全抑制果生炭疽菌的生长。随着施药剂量的增加，挥发性化合物纯品的抑菌活性逐渐增加，当施药剂量为20μL时，壬醛、苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑、苯丙噻唑四种纯品均能抑制完全果生炭疽菌的生长。随着施药浓度的上升，壬醛、2-庚酮、苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑、3，5-二叔丁基苯酚、苯丙噻唑、过氧化二碳酸二酯等7种挥发性化合物纯品的抑菌活性均呈现逐渐上升趋势；邻苯二甲酸二丁酯在施药浓度为 20μL时，抑菌率反而有所下降。对比9种具有抑菌活性的挥发性化合物纯品的抑菌活性发现，壬醛、苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑和苯丙噻唑的抑菌活性较强，施药剂量为10μL时，这4种挥发性化合物纯品对果生炭疽菌的抑菌率均达到 90％以上，另外几种挥发性化合物纯品的抑菌率均低于75％(表2、图2)。所以进一步探究筛选出的壬醛、苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑和苯丙噻唑4种挥发性化合物纯品的抑菌活性。
[0046] 进一步以10种常见的植物病原真菌为指示菌，测定筛选出的4种高效抑菌挥发性化合物(苯甲醛、壬醛、3-甲基-4-苯基吡唑、苯丙噻唑)对它们的抑菌活性。抑菌活性的测定方法同上，滤纸片中的施药量为10μL，以滤纸片上滴加无菌水为对照，待对照组病原真菌菌落直径长至超过培养皿直径的3/4时，测量病原真菌的菌落直径(mm)，此后用新的无菌培养皿盖替换原来放置有滴有挥发性抑菌化合物纯品的滤纸片的皿盖，并继续观察3d，观察被抑制的病原真菌的生长有无恢复，每个处理设3次重复。结果表明筛选出的4种挥发性化合物纯品(壬醛、为苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑、苯丙噻唑)在10μL/plate的浓度下，对7种常见的油茶病原真菌均具有较好的抑菌活性(表2)，壬醛的抑菌活性是本研究中筛选出的4种高效抑菌挥发性化合物纯品中抑菌活性最强、效果最显著的，能完全抑制7种油茶病原菌的生长；苯甲醛能完全抑制果生炭疽菌、胶孢炭疽菌、山茶炭疽菌的生长，对暹罗炭疽菌、君子兰炭疽菌、链格孢菌、拟盘多毛孢菌的抑制活性均在90％以上；3-甲基-4-苯基吡唑能完全抑制果生炭疽菌、君子兰炭疽菌的生长，对拟盘多毛孢的抑菌活性最低，抑菌率为57.2％；苯丙噻唑对果生炭疽菌、胶孢炭疽菌、山茶炭疽菌、暹罗炭疽菌、君子兰炭疽菌的抑制率均在90％以上，对拟盘多毛孢的抑菌活性最低，抑菌率为53.1％。此外，用新的无菌培养皿盖替换原来放置有滴有挥发性化合物纯品的滤纸片的皿盖并连续观察3d后，发现被壬醛完全抑制的7种油茶病原真菌的生长均没有变化，未见到植物病原真菌有新的菌丝生长。
[0047] 通过采用HS-SPME和GC-MS技术，诸多种类的挥发性化合物已经从芽孢杆菌的挥发性物质中鉴定出来，其中采用抑菌活性检测发现不同种类的挥发性化合物对病原真菌的抑菌效果差异显著。其中施药量为10μL时，壬醛就能完全抑制7种常见的油茶病原真菌的生长，显示出了较大的开发价值和应用前景。
[0048] 表1枯草芽孢杆菌Y13产挥发性物质的GC-MS鉴定结果
[0049]
[0050] 表2不同浓度的10种挥发性化合物纯品对果生炭疽菌的抑菌活性分析
[0051]
[0052] 注：同列中不同小写字母表示差异显著性(P＜0.05)
[0053] 表3筛选出的4种挥发性化合物纯品(10μL/平板)对多种油茶病原真菌的抑菌活性[0054]
[0055] 注：同列中不同小写字母表示差异显著性(P＜0.05)。
