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一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法

阅读：396发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法，该方法为将片剂、乳膏、凝胶、栓剂、溶液样品经不同前处理后，采用气相色谱-质谱(GC-MS)进行检测，同位素内标法定量。在优化的条件下，克霉唑在0.05～5.0μg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9999，方法平均回收率为88.5％～103.2％，相对标准偏差不大于3.6％。本方法提取效率高、灵敏度高、重复性好，可用于药品中克霉唑含量的测定。，下面是一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：样品的制备和提取
(1.1)含有克霉唑的片剂、乳膏、凝胶样品的制备和提取：含有克霉唑的片剂取1片用水溶解并定容至500mL，含有克霉唑的乳膏称1.0g、含有克霉唑的凝胶取一支，分别用丙酮溶剂溶解并定容至30mL。
各取1mL上述液体，加入5mL乙腈提取，再加入1g 氯化钠盐析，静置分层，移取乙腈层至
10mL刻度离心管中，下层再加入5mL乙腈进行提取，合并提取层于10mL刻度离心管中并用乙腈定容至10mL。取上述定容液0.1mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。
(1.2)含有克霉唑的栓剂样品制备和提取：取含有克霉唑的栓剂一枚，用乙酸乙酯/环己烷(1:1,v/v)溶解并定容至100mL。取10μL上述液体，于10mL容量瓶中，用乙腈定容至
10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。
(1.3)含有克霉唑的溶液样品的制备和提取：取1mL含有克霉唑的溶液，加甲醇稀释并定容至10mL。取10μL上述液体，于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。
步骤(2)：标准曲线的配制：取克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg/mL克霉唑标准储备液；取d5-克霉唑标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg/mLd5-克霉唑标准储备液。各取100μg/mL的克霉唑和d5-克霉唑标准储备液1mL，并分别用乙腈稀释定容至10mL，配制成10μg/mL克霉唑和d5-克霉唑标准工作液。制作校准曲线用工作溶液制备：各取5、1、0.2、0.1、0.05mL的10μg/mL的克霉唑标准工作溶液，分别加入200μL的10μg/mL的d5-克霉唑标准工作溶液，用乙腈定容至10mL，配成0.05、0.1、0.2、1.0、5μg/mL的系列浓度标准曲线溶液，其中d5-克霉唑同位素内标溶液浓度均为0.2μg/mL。
步骤(3)：待测样品溶液的检测：将步骤(1)中制备的待测样品溶液和步骤(2)中制备的标准曲线溶液在气相色谱-质谱仪上分别进样，根据标准曲线对定量离子进行内标法定量计算，获得待测样品溶液中克霉唑的浓度，继而获得药品中克霉唑的含量。
2.根据权利要求1所述的一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法，其特征在于：步骤(3)中气相色谱-质谱的参数条件如下：
色谱柱：DB-35ms，30m×0.25mm×0.25μm，程序升温：
进样量：1μL；载气：高纯氦气，纯度≥99.999％，
流量1.0mL/min；进样量口温度：260℃；四极杆温度：180℃；离子源温度：300℃；质谱传输线温度：310℃；监测模式：选择离子监测(SIM)，克霉唑监测离子m/z 165、243、278，其中定量离子为m/z 165；d5-克霉唑监测离子m/z 170、248、283，其中定量离子为m/z 283。

说明书全文

一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药品检测领域，涉及气相色谱-质谱检测法，具体是指一种药品(片剂、乳膏、凝胶、栓剂和溶液样品)中克霉唑含量的的测定方法。

背景技术

[0002] 克霉唑是一种咪唑类广谱抗真菌药，临床上用于浅部及某些深部真菌感染的治疗，如皮肤霉菌病、手足癣、体癣、耳道、阴道霉菌病等。复方克霉唑搽剂、复方替硝唑栓剂、复方克霉唑溶液、克霉唑阴道片是临床常用的药物，具有见效快、低毒、高效以及广谱抗菌效果，其中克霉唑是其主要成分。临床主要是采用滴定和高效液相色谱法测定克霉唑含量，为了更加快速、准确、灵敏地测定药品中的克霉唑含量，本发明采用了气相色谱-质谱法快速、准确测定药品中克霉唑的含量。

发明内容

[0003] 本发明提供一种药品(片剂、乳膏、凝胶、栓剂和溶液样品)中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法，该方法具有前处理简单快速、抗基质干扰强、准确、灵敏度高的优点，为药品(片剂、乳膏、凝胶、栓剂和溶液样品)中克霉唑的快速、准确检测提供了可靠的分析方法。

[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明提供的一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法，包括以下步骤：

[0005] 步骤(1)：样品的制备和提取

[0006] (1.1)含有克霉唑的片剂、乳膏、凝胶样品的制备和提取：含有克霉唑的片剂取1片用水溶解并定容至500mL，含有克霉唑的乳膏称1.0g、含有克霉唑的凝胶取一支，分别用丙酮溶剂溶解并定容至30mL。

[0007] 各取1mL上述液体，加入5mL乙腈提取，再加入1g 氯化钠盐析，静置分层，移取乙腈层至10mL刻度离心管中，下层再加入5mL乙腈进行提取，合并提取层于10mL刻度离心管中并用乙腈定容至10mL。取上述定容液0.1mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。

[0008] (1.2)含有克霉唑的栓剂样品制备和提取：取含有克霉唑的栓剂一枚，用乙酸乙酯/环己烷(1:1,v/v)溶解并定容至100mL。取10μL上述液体，于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。

[0009] (1.3)含有克霉唑的溶液样品的制备和提取：取1mL含有克霉唑的溶液，加甲醇稀释并定容至10mL。取10μL上述液体，于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。

[0010] 步骤(2)：标准曲线的配制：取克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg/mL克霉唑标准储备液；取d5-克霉唑标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg/mLd5-克霉唑标准储备液。各取100μg/mL的克霉唑和d5-克霉唑标准储备液1mL，并分别用乙腈稀释定容至10mL，配制成10μg/mL克霉唑和d5-克霉唑标准工作液。制作校准曲线用工作溶液制备：各取5、1、0.2、0.1、0.05mL的10μg/mL的克霉唑标准工作溶液，分别加入200μL的10μg/mL的d5-克霉唑标准工作溶液，用乙腈定容至10mL，配成0.05、0.1、0.2、1.0、5μg/mL的系列浓度标准曲线溶液，其中d5-克霉唑同位素内标溶液浓度均为0.2μg/mL。

[0011] 步骤(3)：待测样品溶液的检测：将步骤(1)中制备的待测样品溶液和步骤(2)中制备的标准曲线溶液在气相色谱-质谱仪上分别进样，根据标准曲线对定量离子进行内标法定量计算，获得待测样品溶液中克霉唑的浓度，继而获得药品中克霉唑的含量。

[0012] 进一步地，步骤(3)中气相色谱-质谱的参数条件如下：

[0013] 色谱柱：DB-35ms，30m×0.25mm×0.25μm，程序升温：(总运行时间14.33min)；进样量：1μL；载气：高纯氦气，纯度≥
99.999％，流量1.0mL/min；进样量口温度：260℃；四极杆温度：180℃；离子源温度：300℃；
质谱传输线温度：310℃；监测模式：选择离子监测(SIM)，克霉唑监测离子m/z 165、243、
278，其中定量离子为m/z 165；d5-克霉唑监测离子m/z 170、248、283，其中定量离子为m/z
283。

[0014] 本发明的有益效果是：采用上述方案，本发明根据不同药品类型，分别采用不同溶剂进行快速有效提取。不同类型的药剂(如片剂、溶液、乳膏、栓剂、凝胶等)含有不同的辅料，需要用不同的溶剂先溶解样品以获得澄清的液体，使所含的克霉唑均匀分布在溶剂中，才能进行下一步的提取。本实验根据不同类型的药剂，选取了含克霉唑的片剂、溶液、乳膏、栓剂、凝胶五种常见的药品，根据其所含的辅料不同，选取水、丙酮、甲醇或乙酸乙酯/环己烷(1:1,v/v)预溶解样品。采用有机溶剂溶解的样品经乙腈稀释一定倍数后直接供GC-MS测定，采用水溶解的样品用乙腈反萃取其中的克霉唑，然后稀释一定倍数后供GC-MS测定。

[0015] 其次，本发明对于药品(片剂、乳膏、凝胶、栓剂和溶液样品)中克霉唑残留量的定性定量检测分析是通过气相色谱-质谱仪分析。先配置一组阶梯形的标准曲线溶液，然后将标准曲线溶液和待检液在气相色谱-质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的质谱定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有克霉唑。另外，在质谱定量分析中，有两种方法分别是内标法和外标法。内标法是将一定量的同位素标记物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。外标法是用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。由于内标法是通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差，其测定结果较为准确。而外标法虽然简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。由于气相色谱-质谱法一般都有基体效应的影响，采用外标法进行定量，结果不准确。本发明采用同位素d5标记克霉唑为内标物进行定量，克服了外标法定量不准确的问题。
附图说明

[0016] 图1为本发明具体实施例中的克霉唑化学结构式；分子式为C22H17N2Cl；

[0017] 图2为0.2μg/mL的克霉唑及d5-克霉唑标准溶液的定量离子谱图；

[0018] 图3为克霉唑和d5-克霉唑的全扫描质谱图(A:克霉唑；B:d5-克霉唑)；

[0019] 图4为本发明具体实施例中标准工作曲线；

[0020] 图5为含克霉唑的代表性样品定量离子谱图(A:片剂样品；B:乳膏样品；C:溶液样品；D:栓剂样品；E:凝胶样品)。

具体实施方式

[0021] 以下结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。

[0022] 本发明提供的一种药品中克霉唑含量的气相色谱-质谱测定方法，包括以下步骤：

[0023] 步骤(1)：样品的制备和提取，如图1所示，为本发明具体实施例中的克霉唑化学分子式为C22H17N2Cl。

[0024] (1.1)含有克霉唑的片剂、乳膏、凝胶样品的制备和提取：含有克霉唑的片剂取1片用水溶解并定容至500mL，含有克霉唑的乳膏称1.0g、含有克霉唑的凝胶取一支，分别用丙酮溶剂溶解并定容至30mL。

[0025] 各取1mL上述液体，加入5mL乙腈提取，再加入1g氯化钠盐析，静置分层，移取乙腈层至10mL刻度离心管中，下层再加入5mL乙腈进行提取，合并提取层于10mL刻度离心管中并用乙腈定容至10mL。取上述定容液0.1mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。

[0026] (1.2)含有克霉唑的栓剂样品制备和提取：取含有克霉唑的栓剂一枚，用乙酸乙酯/环己烷(1:1,v/v)溶解并定容至100mL。取10μL上述液体，于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。

[0027] (1.3)含有克霉唑的溶液样品的制备和提取：取1mL含有克霉唑的溶液，加甲醇稀释并定容至10mL。取10μL上述液体，于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱GC-MS测定。

[0028] 步骤(2)：标准曲线的配制：取克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg/mL克霉唑标准储备液；取d5-克霉唑标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg/mLd5-克霉唑标准储备液，如图2所示，为0.2μg/mL的克霉唑及d5-克霉唑标准溶液的定量离子谱图，谱图背景干净，说明没有干扰，灵敏度高；各取100μg/mL的克霉唑和d5-克霉唑标准储备液1mL，并分别用乙腈稀释定容至
10mL，配制成10μg/mL克霉唑和d5-克霉唑标准工作液。制作校准曲线用工作溶液制备：各取
5、1、0.2、0.1、0.05mL的10μg/mL的克霉唑标准工作溶液，分别加入200μL的10μg/mL的d5-克霉唑标准工作溶液，用乙腈定容至10mL，配成0.05、0.1、0.2、1.0、5μg/mL的系列浓度标准曲线溶液，其中d5-克霉唑同位素内标溶液浓度均为0.2μg/mL。如图3所示，为克霉唑和d5-克霉唑的全扫描质谱图，d5-克霉唑是在克霉唑结构式基础上，把苯环上的5个氢(H)用5个氘(D,氢的同位素)替代，故分子量增加5，在图谱上的质谱峰也相对应的分子量大5。如图4所示，为本发明具体实施例中标准工作曲线，由于本发明采用的是同位素内标法，图4中横坐标是克霉唑标准品浓度/d5-克霉唑浓度的比值，d5-克霉唑浓度为0.2μg/mL，故标准曲线横坐标的范围是0.25、0.5、1、5、25，纵坐标为响应比，为克霉唑标准品在GC-MS上的响应值/d5-克霉唑标准品在GC-MS上的响应值，可以看出标准曲线溶液在浓度为0.05、0.1、0.2、
1.0、5μg/mL的范围内，呈现良好的线性关系，线性方程为Y＝2.364X-0.2852，相关系数：
0.9999。

[0029] 步骤(三)待测样品溶液的检测：将步骤(一)中的待测样品溶液和步骤(二)中的标准曲线溶液在气相色谱-质谱仪上分别进样，根据标准曲线对定量离子进行内标法定量计算，获得待测样品溶液中克霉唑的浓度，继而获得药品中克霉唑的含量。

[0030] 气相色谱-质谱的参数条件如下：

[0031] 色谱柱：DB-35ms，30m×0.25mm×0.25μm，程序升温：60℃(1min)200℃(1min)300℃(1min)(总运行时间14.33min)；进样量：1μL；载气：高纯氦气，纯度≥99.999％，流量1.0mL/min；进样量口温度：260℃；四极杆温度：180℃；离子源温度：300℃；质谱传输线温度：310℃；监测模式：选择离子监测(SIM)，克霉唑监测离子m/z 165、243、278，其中定量离子为m/z 165；d5-克霉唑监测离子m/z 170、248、283，其中定量离子为m/z 283。

[0032] 实际样品测定：取含克霉唑的片剂、乳膏、溶液、栓剂、凝胶样品(购置于药店)，按步骤(一)-(三)进行检测，如图5所示，为含克霉唑的代表性样品定量离子谱图(A:片剂样品；B:乳膏样品；C:溶液样品；D:栓剂样品；E:凝胶样品)，谱图背景非常干净，说明没有样品中其他杂质干扰，非常适合药品中克霉唑的测定分析。检测结果分别为：片剂含克霉唑0.31g/片、乳膏含克霉唑0.033g/g、溶液含克霉唑11.9mg/mL、栓剂含克霉唑0.105g/枚、凝胶含克霉唑118mg/枚。

[0033] 结果表明克霉唑在0.05～5.0μg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9999，方法平均回收率为88.5％～103.2％，相对标准偏差不大于3.6％。本方法提取效率高、灵敏度高、重复性好，可用于药品中克霉唑含量的测定。

[0034] 本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。

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