技术领域
[0001] 本
发明涉及内标法测定领域，尤其是涉及一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方法。
背景技术
[0002] “皮革奶”是一种通过添加皮革
水解蛋白从而提高
蛋白质含量检测指标的
牛奶。皮革水解蛋白中含有严重超标的重金属铬等有害物质，严重危害消费者的身体健康甚至生命安全。皮革水解蛋白也称水解
胶原蛋白，而L-羟脯氨酸是水解胶原蛋白特有的氨基酸，在
乳蛋白中则没有(即水解胶原蛋白的水解产物含有L-羟脯氨酸)。因此，通过测定乳蛋白水解样品中的L-羟脯氨酸，就可以确定掺入的水解胶原蛋白或皮革水解蛋白的量。
[0003] 低含量L-羟脯氨酸的测定，可以提高水解胶原蛋白的检出限。内标法在液相色谱-串联质谱是一种较为准确的定量分析技术。对于乳蛋白样品的前处理较为复杂，包括蛋白水解、样品反复加水旋蒸除
盐酸等等，这时使用内标更为合适，可以校准和消除由于样品前处理条件和检测条件
波动产生的影响，获得较高的测量
精度和准确度。
[0004] 液相色谱-串联质谱内标法，以L-茶氨酸为内标，检测蛋白水解物中的L-羟脯氨酸(夏金根陈波姚守拙，高效液相色谱-质谱联用测定胶原蛋白中的羟脯氨酸，色谱，2008,26(5):595～598；赵善贞，邓晓军，彭涛等，亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性
离子阱质谱测定蛋白食品中L-羟脯氨酸残留，分析化学，2011,39(9):1373～1379)。L-茶氨酸的结构存在酰胺键(如下所示)，构成蛋白的肽键本质上也是酰胺键，在酸中长时间水解时，茶氨酸酰胺键和蛋白的肽键都同时水解。因此，酸水解使用茶氨酸为内标并不合适。
从结构的看，4-羟基-哌啶-2-
羧酸为六元环，L-羟脯氨酸为五元环，而L-茶氨酸为开链式；前二者的只有一个氨基，都是环上的亚胺结构，无酰胺，而L-茶氨酸有两个氨 基，都与L-羟脯氨酸不同。因此，结构上，4-羟基-哌啶-2-羧酸与L-羟脯氨酸相似程度远大于L-茶氨酸。作为内标，相似程度越大，效果越好。
[0005]
[0006] 4-羟基-哌啶-2-羧酸不是基本氨基酸，在乳蛋白和水解胶原蛋白的结构单元(氨基酸)中，不存在4-羟基-哌啶-2-羧酸，即乳蛋白和水解胶原蛋白的水解物，没有4-羟基-哌啶-2-羧酸。结构上，4-羟基-哌啶-2-羧酸不存在酰胺键等不稳定的键，即使在酸中长时间水解时，也不容易降解。因此，作为蛋白酸水解的检测内标，4-羟基-哌啶-2-羧酸优于L-茶氨酸。
发明内容
[0007] 本发明的目的就是为了克服上述
现有技术存在的
缺陷而提供一种较高的测量精度和准确度的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)内标法测定L-羟脯氨酸的方法。
[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0009] 一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)内标法测定L-羟脯氨酸的方法，其特征在于，该方法以4-羟基-哌啶-2-羧酸为检测内标，采用内标标准曲线法定量。具体采用以下步骤：
[0010] 1)内标的配制：选用纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶1～20配制得到的
溶剂，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为1g/L；
[0011] 2)标样的配制：选用纯度≥99.0％的L-羟脯氨酸，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶1～20配制得到的溶剂，溶解，定容，摇匀，L-羟脯氨酸/溶剂为1g/L；
[0012] 3)水解用标样准备：选用纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸和L-羟脯氨酸，分别置于容量瓶中，加浓度为4～12M的盐酸，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸浓度和L-羟脯氨酸浓度都是为50mg/L；
[0013] 4)样品准备：将待测的样品蛋白置于封管中，加入水解用标样以及浓度 为4～12M的盐酸，样品蛋白与水解用标样、盐酸的比例为：20～100mg：1～10mL：10～30mL，氮气置换，密封，水解；
[0014] 5)样品前处理：步骤4)的样品在
温度为90～120℃水解4～24小时，水解样品
真空蒸馏除去盐酸(至pH＝5～7)，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶1配制得到的溶剂，定容，摇匀，控制溶液中4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为0.1～10mg/L；
[0015] 6)用液相色谱-串联质谱内标法，利用内标和标样的确定含量获得L-羟脯氨酸和4-羟基-哌啶-2-羧酸的峰面积比和标准工作曲线，然后利用上述工作曲线测定、计算样品蛋白中的L-羟脯氨酸含量。
[0016] 步骤6)具体采用以下步骤：
[0017] 利用步骤1)和步骤2)的内标和标样配制7个样品，样品中4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为100mg/L，L-羟脯氨酸/溶剂为1～200mg/L；用液相色谱-串联质谱测定L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积，以自变量(L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的
质量比或质量浓度比)，和因变量L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比)数据，计算得到工作曲线y＝10.12x+0.00892(y为L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比，x为L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的质量比或质量浓度比)；
[0018] 利用液相色谱-串联质谱测定前处理的样品，由保留时间确定L-羟脯氨酸和4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比，通过工作曲线计算得到L-羟脯氨酸含量。
[0019] 液相色谱条件如下：色谱柱为Venusil Hilic柱(2.1×150mm，5μm， )，预处理柱为Venusil Hilic Venusil Hilic柱(2.1×10mm，5μm， )；流动相A为乙腈：0.5mmol/L乙酸铵＝9∶1，pH＝6.68；流动相B为乙腈：25mmol/L乙酸铵＝6∶4，pH＝
6.67；梯度洗脱，流速为300μL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；
[0020] 梯度洗脱采用以下流程：
[0021]Time(min) A％ B％
0 95 5
10 75 25
12 75 25
12.5 95 5
15.0 95 5
[0022]
[0023] 质谱条件如下：喷雾
电压为5000V；鞘气压为172.4kPa；辅助气压为34.5kPa；毛细管温度为275℃；第一对扫描离子为132.1/86.2，碰撞
能量为15eV；第二对扫描离子为146.1/127.2，碰撞能量为18eV；扫描模式为单离子检测扫描(SRM)。
[0024] 液相色谱-串联质谱测定采用美国热电公司制作的TSQ Quantum Access高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪，配有喷雾电离源和
大气压化学电离源。
[0025] 所述的样品蛋白为乳蛋白。
[0026] 所述的样品蛋白包括牛奶、羊奶、骆驼奶、人奶、豆奶或椰奶。
[0027] 所述的样品蛋白为奶粉、炼乳、酸奶、奶油、奶酪、乳品饮料、蛋白粉、豆粉、奶糖、奶巧克
力或奶油巧克力。
[0028] 与现有技术相比，本发明采用的内标4-羟基-哌啶-2-羧酸价格较低，更重要的是在酸水解过程中稳定，对样品前处理和测定的全过程，通过内标校正，有较高的测量精度和准确度，对不同基质蛋白水解物中的L-羟脯氨酸，定量限达到1mg/L，回收率80.2～116.5％，相对误差(RSD)为4.2～12.6％。
具体实施方式
[0029] 下面结合具体
实施例对本发明进行详细说明。
[0030] 实施例1
[0031] 乳蛋白-1.0％L-羟脯氨酸水解的检测结果
[0032] 1)内标：纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸，溶于乙腈∶水＝1∶1(体积比)中，配成4-羟基-哌啶-2-羧酸浓度为1g/L内标100mL；
[0033] 2)标样的配制：纯度≥99.0％的L-羟脯氨酸，溶于乙腈∶水＝1∶1(体积比)中，配成L-羟脯氨酸浓度为1g/L标样100mL；
[0034] 3)水解用标样1准备：纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸和L-羟脯氨酸，溶于浓度为6M的盐酸，配成4-羟基-哌啶-2-羧酸浓度和和L-羟脯氨酸浓度都是50mg/L的水解用标样100mL；水解用标样2准备：只含内标4-羟基-哌啶-2-羧酸，不含L-羟脯氨酸，其余同标样1；
[0035] 4)样品的准备：50mg蛋白，置于封管中，加10.0mL步骤3)所述水解 用标样10mL，加20mL浓度为6M的盐酸，氮气置换，密封，水解；
[0036] 5)样品前处理：步骤4)的样品在温度为110℃水解12小时，水解样品真空蒸馏除去盐酸(至pH＝5～7)至中性，置于容量瓶中，加入乙腈∶水(体积比)溶液，溶解，定容，摇匀，配成20.0mL，为待测的样品1；
[0037] 6)用液相色谱-串联质谱内标法测定蛋白水解物中的L-羟脯氨酸，由保留时间和质谱数据确定L-羟脯氨酸和4-羟基-哌啶-2-羧酸，通过峰面积比和标准工作曲线，计算L-羟脯氨酸含量；
[0038] 7)用液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的工作曲线，通过以下步骤进行：
[0039] 7-1)工作曲线样品配制：以上述1)和2)的内标和标样，配制7个样品，样品中4-羟基-哌啶-2-羧酸浓度都是100mg/L，L-羟脯氨酸浓度为1～200mg/L；
[0040] 7-2)用液相色谱-串联质谱测定L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积，工作曲线为y＝10.12x+0.00892(y为L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比比，x为L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的质量比或质量浓度比)，相关系数R＝0.9999(仪器为TSQ Quantum Access高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪，美国热电公司，配有喷雾电离源和大气压化学电离源)
[0041] 7-3)质谱条件如下：喷雾电压为5000V；鞘气压为172.4kPa；辅助气压为34.5kPa；毛细管温度为275℃；第一对扫描离子为132.1/86.2，碰撞能量为15eV；第二对扫描离子为104.3/58.5碰撞能量为12eV；扫描模式为单离子检测扫描(SRM)。
[0042] 7-4)色谱条件：色谱柱为Venusil Hilic柱(2.1×150mm，5μm， )，预柱为Venusil Hilic Venusil Hilic柱(2.1×10mm，5μm， )；流动相A为乙腈：0.5mmol/L乙酸铵＝9∶1，pH＝6.68；流动相B为乙腈：25mmol/L乙酸铵＝6∶4，pH＝6.67；梯度洗脱，具体条件如表1所示；流速为300μL/min；柱温为30℃；进样量为10μL。
[0043] 8)用液相色谱-串联质谱内标法检测样品1，L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比为0.9811，由此计算得到L-羟脯氨酸的量为0.4805mg，回收率96.1％。
[0044] 实施例2
[0045] 乳蛋白-0.34％L-羟脯氨酸水解的检测结果
[0046] 类似实施例1，其中步骤4)中的水解用标样1改为3.40mL，加26mL浓度为6M的盐酸；按步骤5)水解、除盐酸后，配成10mL，为待测的样品2；其余步骤与实施例1相同。
[0047] 测定样品2中的L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比为0.8647，由此计算得到L-羟脯氨酸的量为0.1438mg，回收率84.6％。
[0048] 实施例3
[0049] 乳蛋白-0.10％L-羟脯氨酸水解的检测结果
[0050] 类似实施例1，步骤4)中的水解用标样1改为2.0mL，加28mL浓度为6M的盐酸；按步骤5)水解、除盐酸后，配成5.0mL，为样品3；其余步骤与实施例1相同。
[0051] 测定样品3中的L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比为0.8422，由此计算得到L-羟脯氨酸的量为0.8234mg，回收率82.3％。
[0052] 实施例4
[0053] 测定乳蛋白-10％水解胶原蛋白水解产物中的L-羟脯氨酸
[0054] 类似实施例1，其中步骤4)中的“加10.0mL水解用标样1”，改为“加10.0mL水解用标样2，加5.0mg水解胶原蛋白”，按步骤5)水解、除盐酸后，配成20.0mL，为样品4；其余步骤与实施例1相同。
[0055] 测定样品4中的L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比为0.9246，由此计算得到L-羟脯氨酸的量为0.4525mg。水解胶原蛋白中的L-羟脯氨酸含量为10.0％，水解胶原蛋白量为4.52mg，回收率90.4％。
[0056] 实施例5
[0057] 测定乳蛋白-2％水解胶原蛋白水解产物中的L-羟脯氨酸
[0058] 类似实施例4，步骤4)中的“加5.0mg水解胶原蛋白，加10.0mL水解用标样2”改为“加1.0mg水解胶原蛋白，加2.0mL水解用标样2”；按步骤5)水解、除盐酸后，配成5.0mL待测样品5；其余与实施例4相同。
[0059] 测定样品5中的L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比为0.8194，由此计算得到羟脯氨酸的量为0.0801mg。水解胶原蛋白中的L-羟脯氨酸含量为10.0％，水解胶原蛋白量为0.801mg，回收率80.1％。
[0060] 实施例6
[0061] 基质(乳蛋白)加标水解回收率
[0062] 类似实施例1，其中步骤4)中的“50mg蛋白，加10.0mL水解用标样1”，改为“50mg蛋白，分别为添加0.10mg、0.25mg、0.5mgL-羟脯氨酸”，水解后，测定L-羟脯氨酸的含量，各重复6次实验，结果如下表所示，可见L-羟脯氨酸的回收率较高。因此，以4-羟基-哌啶-2-羧酸检测内标，可以获得较高的检测准确度。
[0063] 乳蛋白加L-羟脯氨酸水解结果
[0064]
[0065] 实施例7
[0066] 其它基质加标水解回收率
[0067] 类似实施例6，其中步骤4)中的“50.0mg蛋白”改为1.67g牛奶(蛋白含量为3.0％，质量比)、1.25g羊奶(蛋白含量为4.0％，质量比)、0.286g奶粉(蛋白含量为17.5％，质量比)、100.0mg蛋白粉(蛋白含量为50.0％，质量比)，分别添加0.10mg、0.167mg、0.5mgL-羟脯氨酸。水解后，真空蒸馏除盐酸至溶液pH＝5，样品过PEP固相萃取小柱(200mg，6mL)，过0.22μm亲水PTFE滤膜，测定L-羟脯氨酸，各组重复6次的实验结果如下表所示，可见L-羟脯氨酸的回收率较高。因此，以4-羟基-哌啶-2-羧酸检测内标，对不同的基质的检测，也可以获得较高的检测准确度。
[0068] 基质加L-羟脯氨酸水解结果
[0069]
[0070]
[0071] 实施例8
[0072] 羟脯氮酸检测
[0073] 类似实施例1，没有蛋白和水解，测定配制样品中羟脯氨酸浓度。步骤：准确称取L-羟脯氨酸，用乙腈∶水＝1∶1(体积比)配制L-羟脯氨酸6个样品，浓度为1～150mg/L，用液相色谱串联质谱测定L-羟脯氨酸，每个样品重复3次测试的结果如下表所示，L-羟脯氨酸回收率较高。可见以4-羟基-哌啶-2-羧酸检测内标，测定L-羟脯氨酸，也可以获得较高的检测准确度。
[0074] L-羟脯氨酸测定结果
[0075]
[0076] 实施例9
[0077] 一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)内标法测定L-羟脯氨酸的方法，其特征在于，该方法以4-羟基-哌啶-2-羧酸为检测内标，采用内标标准曲线法定量。具体采用以下步骤：
[0078] 1)内标的配制：选用纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶1配制得到的溶剂，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为1g/L；
[0079] 2)标样的配制：选用纯度≥99.0％的L-羟脯氨酸，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶1配制得到的溶剂，溶解，定容，摇匀，L-羟脯氨酸/溶剂为1g/L；
[0080] 3)水解用标样准备：选用纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸和L-羟脯氨酸，分别置于容量瓶中，加浓度为4M的盐酸，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸浓度和L-羟脯氨酸浓度都是为50mg/L；
[0081] 4)样品准备：将待测的样品蛋白置于封管中，加入水解用标样以及浓度为4M的盐酸，样品蛋白与水解用标样、盐酸的比例为：20mg∶1mL∶10mL，氮气置换，密封，水解；
[0082] 5)样品前处理：步骤4)的样品在温度为90℃水解24小时，水解样品真空蒸馏除去盐酸，至pH＝5，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶1配制得到的溶剂，定容，摇匀，控制溶液中4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为0.1mg/L；
[0083] 6)用液相色谱-串联质谱内标法，利用内标和标样的确定含量获得L-羟脯氨酸和4-羟基-哌啶-2-羧酸的峰面积比和标准工作曲线，然后利用上述工作曲线测定、计算样品蛋白中的L-羟脯氨酸含量，具体采用以下步骤：
[0084] 利用步骤1)和步骤2)的内标和标样配制7个样品，样品中4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为100mg/L，L-羟脯氨酸/溶剂为1mg/L；用液相色谱-串联质谱测定L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积，以自变量(L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的质量比或质量浓度比)，和因变量L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比)数据，计算得到工作曲线y＝10.12x+0.00892(y为L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比，x为L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的质量比或质量浓度比)；
[0085] 利用液相色谱-串联质谱测定前处理的样品，由保留时间确定L-羟脯氨酸和4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比，通过工作曲线计算得到L-羟脯氨酸含量。
[0086] 液相色谱条件如下：色谱柱为Venusil Hilic柱(2.1×150mm，5μm， )，预处理柱为Venusil Hilic Venusil Hilic柱(2.1×10mm，5μm， )；流动相 A为乙腈：0.5mmol/L乙酸铵＝9∶1，pH＝6.68；流动相B为乙腈：25mmol/L乙酸铵＝6∶4，pH＝
6.67；梯度洗脱，流速为300μL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；
[0087] 梯度洗脱采用以下流程：
[0088]Time(min) A％ B％
0 95 5
10 75 25
12 75 25
12.5 95 5
15.0 95 5
[0089] 质谱条件如下：喷雾电压为5000V；鞘气压为172.4kPa；辅助气压为34.5kPa；毛细管温度为275℃；第一对扫描离子为132.1/86.2，碰撞能量为15eV；第二对扫描离子为146.1/127.2，碰撞能量为18eV；扫描模式为单离子检测扫描(SRM)。
[0090] 液相色谱-串联质谱测定采用美国热电公司制作的TSQ Quantum Access高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪，配有喷雾电离源和大气压化学电离源。
[0091] 所测试样品蛋白为乳蛋白，例如牛奶、羊奶、骆驼奶、人奶、豆奶或椰奶，除此之外，还可以是奶粉、炼乳、酸奶、奶油、奶酪、乳品饮料、蛋白粉、豆粉、奶糖、奶巧克力或奶油巧克力。
[0092] 实施例10
[0093] 一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)内标法测定L-羟脯氨酸的方法，其特征在于，该方法以4-羟基-哌啶-2-羧酸为检测内标，采用内标标准曲线法定量。具体采用以下步骤：
[0094] 1)内标的配制：选用纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶20配制得到的溶剂，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为1g/L；
[0095] 2)标样的配制：选用纯度≥99.0％的L-羟脯氨酸，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶20配制得到的溶剂，溶解，定容，摇匀，L-羟脯氨酸/溶剂为1g/L；
[0096] 3)水解用标样准备：选用纯度≥99.0％的4-羟基-哌啶-2-羧酸和L-羟脯氨酸， 分别置于容量瓶中，加浓度为12M的盐酸，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸浓度和L-羟脯氨酸浓度都是为50mg/L；
[0097] 4)样品准备：将待测的样品蛋白置于封管中，加入水解用标样以及浓度为12M的盐酸，样品蛋白与水解用标样、盐酸的比例为：100mg∶10mL∶30mL，氮气置换，密封，水解；
[0098] 5)样品前处理：步骤4)的样品在温度为120℃水解4小时，水解样品真空蒸馏除去盐酸，至pH＝7，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1∶1配制得到的溶剂，定容，摇匀，控制溶液中4-羟基-哌啶-2-羧酸/溶剂为10mg/L；
[0099] 6)用液相色谱-串联质谱内标法，利用内标和标样的确定含量获得L-羟脯氨酸和4-羟基-哌啶-2-羧酸的峰面积比和标准工作曲线，然后利用上述工作曲线测定、计算
