具有改善的稳定性、增强的免疫原性和降低的反应原性的免疫原性组合物及其制备方法
阅读：776发布：2020-05-08
专利汇可以提供具有改善的稳定性、增强的免疫原性和降低的反应原性的免疫原性组合物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且免疫原性组合物及其制备方法，免疫原性组合物包含 白喉类毒素 抗原 (D)、破伤 风 类毒素(T)抗原、乙型 肝炎 表面抗原(HBsAg)、灭活的全细胞百日咳博德特氏菌(wP)抗原、缀合至载体蛋白的B型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜糖、灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原、以及还有一个或更多个抗原。一种全液体组合 疫苗 ，其显示出改善的免疫原性、降低的反应原性和改善的 稳定性 。改进的甲 醛 灭活方法、分别 吸附 到 磷酸 铝 佐剂上的白喉类毒素抗原(D)、破伤风类毒素(T)抗原和乙型肝炎(HepB)表面抗原的改善的吸附特性、最小的总铝含量(Al3+)、以及2-苯 氧 基 乙醇 (2-PE)作为 防腐剂 的优化的浓度。，下面是具有改善的稳定性、增强的免疫原性和降低的反应原性的免疫原性组合物及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：
(i)白喉类毒素(D)；
(ii)破伤风类毒素(T)；
(iii)灭活的全细胞百日咳抗原(wP)；
(iv)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；
(v)与载体蛋白缀合的b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜糖；
(vi)灭活脊髓灰质炎病毒抗原(IPV)；
(vii)佐剂；
(viii)防腐剂；以及
(ix)稀释介质或缓冲液
其中，所述组合物为全液体组合疫苗并且在2℃-8℃以及室温下显示出改善的免疫原性、降低的反应原性和改善的稳定性。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物还包含选自下述各者的一个或更多个抗原：所述各者为流感嗜血杆菌(a血清型、c血清型、d血清型、e血清型、f血清型和未包封的菌株)、肝炎(A菌株、C菌株、D菌株、E菌株、F菌株和G菌株)、轮状病毒、脑膜炎奈瑟氏菌A抗原、脑膜炎奈瑟氏菌C抗原、脑膜炎奈瑟氏菌W-135抗原、脑膜炎奈瑟氏菌Y抗原、脑膜炎奈瑟氏菌X抗原、肺炎链球菌抗原、脑膜炎奈瑟氏菌B抗原、金黄色葡萄球菌抗原、炭疽、卡介苗、人乳头瘤病毒、鼠伤寒沙门氏菌抗原、无细胞百日咳抗原、经修饰的腺苷酸环化酶、疟疾抗原(RTS，S)、麻疹、腮腺炎、风疹、黄病毒抗原、登革热、寨卡病毒、埃博拉病毒、基孔肯雅热、日本脑炎和腹泻抗原。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，所述无细胞百日咳抗原包含选自下述各者的一个或更多个抗原：所述各者为经修饰的腺苷酸环化酶、百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(P69或PRN)或纤维蛋白(FIM1、FIM2和FIM3)。
4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含选自下述各者的一个或更多个佐剂：所述各者为铝盐(Al3+)比如氢氧化铝(Al(OH)3)或磷酸铝(AlPO4)、铝、钙磷酸盐、MPLA、3D-MPL、QS21、含CpG的低脱氧核苷酸佐剂、脂质体或水包油乳液。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含作为佐剂的磷酸铝(AlPO4)。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含的总铝含量(Al3+)的量为0.1mg/0.5ml至0.6mg/0.5ml。
7.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述灭活的全细胞百日咳抗原(wP)属于百日咳博德特氏菌菌株134、509、25525和6229。
8.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述IPV抗原是选自1型Mahoney、2型MEF、或3型Saukett的Salk菌株、或者是选自1型、2型或3型的Sabin菌株。
9.根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其中，所述IPV抗原被吸附到铝盐上，所述铝盐的Al3+浓度在0.1mg/0.5ml至1.25mg/0.5ml之间，并且所述铝盐的吸附百分比为至少
70％。
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中，所述IPV抗原被吸附到铝盐上，所述铝盐的Al3+浓度在0.1mg/0.5ml至0.6mg/0.5ml之间，并且所述铝盐的吸附百分比为至少
90％。
11.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述D抗原被吸附到具有至少50％的吸附百分比的铝盐上。
12.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述T抗原被吸附到具有至少40％的吸附百分比的铝盐上。
13.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述HBsAg抗原被吸附到具有至少
70％的吸附百分比的铝盐上。
14.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述Hib抗原是使用氰基化缀合化学或还原性胺化缀合化学与载体蛋白缀合的Hib聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)多糖，其中，所述氰基化试剂选自溴化氰、1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)1-氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸盐(CPPT)、1-氰基咪唑(1-CI)、1-氰基苯并三唑(1-CBT)或2-氰基哒嗪-3(2H)-(2-CPO)；所述载体蛋白选自CRM197、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟氏菌外膜复合物、破伤风类毒素片段C、百日咳类毒素、流感嗜血杆菌D蛋白、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、以及来自铜绿假单胞菌的外毒素A、外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)和炭疽芽孢杆菌的解毒浮肿因子(EF)和致死因子(LF)、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)、合成肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人类CD4+T细胞表位的人工蛋白，其中，所述人工蛋白比如为N19、铁摄取蛋白、来自C艰难梭菌的毒素A或B和具有或不具有连接体的无乳链球菌蛋白。
15.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述Hib抗原基本上不被吸附到任何佐剂上。
16.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含选自下述各者的防腐剂：所述各者为2-苯氧基乙醇、苄索氯铵(酚甲醚)、苯酚、硫柳汞、甲醛、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、或苄醇、或其组合。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含作为防腐剂的2-苯氧基乙醇。
18.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物不含防腐剂。
19.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含选自氯化钠、磷酸盐缓冲盐水的缓冲液。
20.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含作为稀释介质或缓冲液的氯化钠。
21.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物还包含药学上可接受的转运蛋白、赋形剂、粘合剂、载体、等渗剂、乳化剂或湿润剂。
22.根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含选自下述各者的药学上可接受的赋形剂；所述各者为糖和多元醇、表面活性剂、聚合物、盐、氨基酸、pH调节剂。
23.根据权利要求1至22中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含：D抗原，所述D抗原的量为约10Lf/0.5ml至25Lf/0.5ml；T抗原，所述T抗原的量为约2Lf/0.5ml至10Lf/0.5ml；wP抗原，所述wP抗原的量为约12IOU/0.5ml至16IOU/0.5ml；HBsAg，所述HBsAg的量为约7μg/0.5ml至15μg/0.5ml；Hib抗原，所述Hib抗原的量为约7μg/0.5ml至13μg/0.5ml；IPV抗原，所述IPV抗原的Salk 1型的量为约1-50DU/0.5ml，Salk 2型的量为约1-
20DU/0.5ml，或Salk 3型的量为约1-50DU/0.5ml；磷酸铝，所述磷酸铝的量为约0.1mg/
0.5ml至2.5mg/0.5ml；2-苯氧基乙醇，所述2-苯氧基乙醇的量为约1mg/0.5ml至6mg/0.5ml；
以及氯化钠，所述氯化钠的量为约0.5％至1.5％。
24.根据权利要求1至23中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含：D抗原，所述D抗原的量为约10Lf/0.5ml至25Lf/0.5ml；T抗原，所述T抗原的量为约2Lf/0.5ml至10Lf/0.5ml；wP抗原，所述wP抗原的量为约12IOU/0.5ml至16IOU/0.5ml；HBsAg，所述HBsAg的量为约7μg/0.5ml至15μg/0.5ml；Hib抗原，所述Hib抗原的量为7μg/0.5ml至13μg/
0.5ml；IPV抗原，所述IPV抗原的Sabin 1型的量为约1-50DU/0.5ml，Sabin 2型的量为约1-
20DU/0.5ml，或Sabin 3型的量为约1-50DU/0.5ml；磷酸铝，所述磷酸铝的量为0.1mg/0.5ml至2.5mg/0.5ml；2-苯氧基乙醇，所述2-苯氧基乙醇的量为约1mg/0.5ml至6mg/0.5ml；以及氯化钠，所述氯化钠的量为约0.5％至1.5％。
25.根据权利要求1至24中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含：D抗原，所述D抗原的量为约10Lf/0.5ml；T抗原，所述T抗原的量为约2Lf/0.5ml；wP抗原，所述wP抗原的量为约12IOU/0.5ml；HBsAg，所述HBsAg的量为约8μg/0.5ml；Hib抗原，所述Hib抗原的量为约8μg/0.5ml；IPV抗原，所述IPV抗原的Salk 1型的量为约40DU/0.5ml，Salk2型的量为约8DU/0.5ml，或Salk 3型的量为约32DU/0.5ml；磷酸铝，所述磷酸铝的量为约1.25mg/
0.5ml；2-苯氧基乙醇，所述2-苯氧基乙醇的量为约2.5mg/0.5ml；以及氯化钠，所述氯化钠的量为约0.9％。
26.根据权利要求1至25中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含：D抗原，所述D抗原的量为约20Lf/0.5ml；T抗原，所述T抗原的量为约4Lf/0.5ml；wP抗原，所述wP抗原的量为约14IOU/0.5ml；HBsAg，所述HBsAg的量为约15μg/0.5ml；Hib抗原，所述Hib抗原的量为约10μg/0.5ml；IPV抗原，所述IPV抗原的Salk 1型的量为约40DU/0.5ml，Salk 2型的量为约8DU/0.5ml，或Salk 3型的量为约32DU/0.5ml；磷酸铝，所述磷酸铝的量为约
1.25mg/0.5ml；2-苯氧基乙醇，所述2-苯氧基乙醇的量为约2.5mg/0.5ml；以及氯化钠，所述氯化钠的量为约0.9％。
27.根据权利要求1至26中的任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含：D抗原，所述D抗原的量为约25Lf/0.5ml；T抗原，所述T抗原的量为约10Lf/0.5ml；wP抗原，所述wP抗原的量为约16IOU/0.5ml；HBsAg，所述HBsAg的量为约15μg/0.5ml；Hib抗原，所述Hib抗原的量为约13μg/0.5ml；IPV抗原，所述IPV抗原的Salk 1型的量为约40DU/0.5ml，Salk 2型的量为约8DU/0.5ml，或Salk 3型的量为约32DU/0.5ml；磷酸铝，所述磷酸铝的量为约
1.25mg/0.5ml；2-苯氧基乙醇，所述2-苯氧基乙醇的量为约2.5mg/0.5ml；以及氯化钠，所述氯化钠的量为约0.9％。
28.一种制备全液体组合疫苗组合物的方法，所述方法显示出改善的免疫原性、降低的反应原性和改善的稳定性，所述全液体组合疫苗组合物包含：
(i)白喉类毒素(D)；
(ii)破伤风类毒素(T)；
(iii)灭活的全细胞百日咳抗原(wP)
(iv)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；
(v)与载体蛋白缀合的b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜糖；以及
(vi)灭活脊髓灰质炎病毒抗原(IPV)；
所述方法包括下述步骤：
a)在混合器皿/容器中添加生理盐水
b)添加包含白喉类毒素的组分-I
c)添加包含破伤风类毒素的组分-II
d)添加灭活的全细胞百日咳抗原
e)添加包含乙型肝炎表面抗原的组分-III
f)添加Hib抗原
g)添加IPV抗原
h)添加2-苯氧基乙醇
i)用氢氧化钠/碳酸钠将pH调节至6.0至7.0
j)添加生理盐水以补足体积。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述组分I的制备包括下述步骤：
a)转移所述容器/器皿中的磷酸铝
b)添加所述白喉类毒素
c)用醋酸/氢氧化钠将pH值调节至4.5至5.5
d)稳定化
e)用氢氧化钠/碳酸钠将pH值调节至5.5至6.5
f)稳定化
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述组分II的制备包括下述步骤：
a)转移所述容器/器皿中的磷酸铝
b)添加所述破伤风类毒素
c)用醋酸/氢氧化钠将pH值调节至4.5至5.5
d)稳定化
e)用氢氧化钠/碳酸钠将pH值调节至5.5至6.5
f)稳定化
31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述组分III的制备包括下述步骤：
a)转移所述容器/器皿中的磷酸铝
b)添加所述乙型肝炎表面抗原
c)用醋酸/氢氧化钠将pH值调节至4.5至5.5
d)稳定化
e)用氢氧化钠/碳酸钠将pH值调节至5.8至6.8
f)稳定化
32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述灭活的全细胞百日咳抗原的制备包括下述步骤：
a)百日咳博德特氏菌菌株134在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟
b)百日咳博德特氏菌菌株509在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟
c)百日咳博德特氏菌菌株25525和6229在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟c)百日咳博德特氏菌菌株6229在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟
d)随后以1:1:0.25:0.25的比例将灭活的百日咳博德特氏菌菌株134、509、25525和
6229混合。
e)可选地吸附到铝基佐剂上。
其中，所述方法没有硫柳汞，并且所述灭活的全细胞百日咳抗原保持不结块且是均质的，从而降低了反应原性并在更长的持续时间内提供了更好的效力。
33.根据权利要求28所述的方法，其中，所述Hib抗原的制备包括下述步骤：
a)发酵b型流感嗜血杆菌
b)在0.1％甲醛存在下于37℃灭活2小时
C)对Hib聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)多糖进行纯化
d)在己二酸二酰肼(ADH)连接体存在的情况下，使用溴化氰氰化缀合化学将步骤c的纯化产物与破伤风类毒素(TT)缀合
e)对步骤d的缀合物进行纯化
F)优选地通过0.22μm过滤器对纯化的缀合物进行过滤
其中，游离PRP百分比在总的纯化的Hib体缀合物中不超过5％。
34.一种基本上如文中参照所附示例所描述的全液体组合疫苗组合物，所述全液体组合疫苗组合物显示出改善的免疫原性、降低的反应原性和改善的稳定性。
35.一种基本上如文中参照所附示例所描述的制备全液体组合疫苗组合物的方法，所述方法显示出改善的免疫原性、降低的反应原性和改善的稳定性。
具有改善的稳定性、增强的免疫原性和降低的反应原性的免
疫原性组合物及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 可以提供针对多种疾病的免疫原性的组合疫苗总是比单价疫苗更具优势，这是因为组合疫苗通过减少单独接种的次数而减少了注射次数、减少了与多次肌肉注射相关联的并发症、降低了给药和生产成本、降低了储存成本、降低了延迟或错过接种的风险、并且改善了患者依从性。此外，与需要重构的疫苗相比，组合疫苗的全液体制剂具有明显的优势。发现全液体疫苗的平均制备时间几乎是非全液体疫苗的一半。在同一项研究中，几乎所有的医护人员(97.6％)表示，他们在日常实践中更喜欢使用全液体疫苗。(参考文献：
Soubeyrand B等人；使用全液体和非全液体的儿科六价疫苗的制备时间的评估；时间和运动的研究；疫苗2015；33:3976-82)。
Soubeyrand B等人；使用全液体和非全液体的儿科六价疫苗的制备时间的评估；时间和运动的研究；疫苗2015；33:3976-82)。
[0003] 目前已知的和可用的组合疫苗可能不包含呈适当的免疫原形式的适当抗原的适当制剂，以在易感人群中在一次注射中针对若干疾病而实现期望水平的安全性、效力和免疫原性。仅用少量附加抗原就能产生的不同疫苗组合的数量是相当大的。通过向DTwP或DTaP中添加1种-4种其他抗原组分(例如HIB(冷冻干燥或液体)、HBV、IPV、HAV)，可以产生44种可能的不同疫苗组合。如果考虑来自不同制造商的单个组分，则数量将增加到数千。由于必须单独开发每种新的组合疫苗(考虑到不同来源的组分差异)，以证明其安全性、稳定性、兼容性和效力，因此开发所有这些疫苗成为一项艰巨的任务。
[0004] 组合疫苗的抗原：
[0005] 白喉抗原和破伤风抗原
[0006] 白喉和破伤风分别是由白喉杆菌和破伤风梭菌引起的急性感染。在这两种情况下，这些细菌的强效外毒素是造成临床疾病的原因。提供抗这些细菌的保护的疫苗包含这些毒素，所述这些毒素经过化学修饰，因此不再有毒但仍具有抗原性。白喉和破伤风毒素是通过在含有牛提取物的培养基中培养白喉棒状杆菌和破伤风梭菌而产生的。使用以下处理来使毒素灭活以制备类毒素[白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)]，所述处理包括加热、UV、福尔马林/甲醛、戊二醛、乙酰乙撑亚胺等。有关牛海绵状脑病(BSE)、可传染性海绵状脑病(TSE)、克雅氏病(CJD和变体CJD疾病)的担忧可能源于在含有通过疫苗传播的牛提取物的生长培养基中使用的动物组分。(参考文献：《世界卫生组织关于与生物和医药产品有关的传染性海绵状脑病的准则》；2003&EMEA/CPMP/BWP/819/01；2001年4月24日)。
[0007] 百日咳抗原
[0008] 在20世纪40年代，由化学和热灭活的百日咳博德氏菌构成的全细胞疫苗的引入大大降低了百日咳博德氏菌引起的百日咳发病率。
[0009] 全细胞DTP疫苗通常与几种局部不良事件(例如，注射部位处的红斑、肿胀和疼痛)、发烧和其他轻度全身事件(例如，嗜睡、烦躁和厌食)相关联(参考文献：Cody CL，Baraff LJ，Cherry JD，Marcy SM，Manclarck CR；与婴幼儿的DTP和DT免疫相关联的不良反应的性质和发生率；儿科学1981；68:650-60)和(参考文献：Long SS，DeForest A，Pennridge Pediatric Associates等人，婴儿期白喉-破伤风-百日咳疫苗接种后不良反应的纵向研究(儿科学，1990年；85:294-302)。在接受全细胞DTP疫苗的儿童中，较严重的全身性事件(例如，抽搐(发烧或不发烧)和低渗低反应症状)的发生频率较低(1例对1750服用剂量的比例)(参考文献：Cody CL，Baraff LJ，Cherry JD，Marcy SM，Manclarck CR；与婴幼儿的DTP和DT免疫相关联的不良反应的性质和发生率；儿科学1981；68:650-60)。急性脑病的发生率甚至更低(0例-10.5例对一百万服用剂量的比例)。专家确实同意，在某些罕见情况下，全细胞百日咳疫苗会造成持久的脑损伤。(参考文献：医学研究所；DPT疫苗和慢性神经系统功能障碍，新的分析；华盛顿特区，国家科学院出版社，1994)。
[0010] 几篇报道指出，全细胞百日咳疫苗接种、反应原性和严重副作用之间的关系导致了疫苗接受度下降，并且因此导致了新的流行病(Miller,D.L.,Ross,E.M.,Alderslade,R.,Bellman,M.H.,and Brawson,N.S.B.(1981).儿童的百日咳免疫法和严重急性神经系统疾病：英国医学杂志.282:1595-1599)。
[0011] 全细胞百日咳(wP)相关的不良反应阻碍了其在全世界的继续使用，并且因此，在工业化世界中基于wP的组合疫苗逐渐被基于无细胞百日咳的组合疫苗所替代。
[0012] 最近，已经开发了确定组分的百日咳疫苗。先前(EP1028750)已经报道了所有基于液体六价无细胞百日咳的疫苗(DTaP IPV PRP-T-HBsAg)。
[0013] (GSK)是目前全球唯一市售的包含Salk IPV的六价小儿组合疫苗。该产品(DTaP3-IPV-HBV//Hib)作为五价产品的预填充注射器出售，该五价产品与冻干的Hib抗原PRP-T缀合物共包装在单独的小瓶中，以在使用前与其余疫苗一起重构。
[0014] 第二种六价疫苗 (也称为 和 )是赛诺菲巴斯德公司生产的全液体六价疫苗；然而，第二种六价疫苗 也带有aP。该疫苗可能针对欧洲和全球的私人市场。由默克公司和赛诺菲巴斯德公司联合开发的另一种也带有aP的六价疫苗目前正处于III期临床研究。
[0015] Bharat Biotech International正在开发一种七价组合疫苗，该七价组合疫苗由DT、无细胞百日咳、Sabin IPV(1:40DU型、2:8DU型、3:32DU型)、单菌株灭活的轮状病毒(G9菌株，即，116E菌株)、与TT缀合的b型流感嗜血杆菌PRP、以及重组乙型肝炎疫苗构成。
[0016] 但是，已经出现了关于无细胞百日咳(aP)疫苗的长期有效性的担忧，尤其是在发展中国家环境中。最近的报道表明，青春期对百日咳的免疫力下降，并且这是导致六个月以下的婴儿在完全接种疫苗之前病例增加的原因。据估计，在婴儿期使用aP免疫的8岁至12岁的儿童中，疫苗的效力为24％。在澳大利亚进行的一项观察性研究还显示，婴儿期接种aP疫苗的青少年患病率高于接种wP疫苗的青少年(相对风险为3.3，95％的置信区间为2.4-4.5)。
[0017] 从成本的角度来看，由于制造差异和特许权使用费，aP抗原历来比wP抗原的成本高出10到30倍，因此对发展中国家构成了经济负担。因此，基于wP的六价疫苗的成本将更适合在资源匮乏国家的公共部门使用。
[0018] 因此，由于成本和对aP疫苗的长期有效性的担忧，尤其是在发展中国家环境中，对用于发展中国家的六价疫苗中全细胞百日咳(wP)的使用已变得很重要。与最佳的全细胞百日咳(wP)疫苗相比，aP疫苗在大规模免疫计划中效果不佳(Vickers等人，2006；Cherry 2012)。
[0019] 最近对高度免疫人群暴发的研究表明，aP疫苗的保护时间太短(Klein等人，2012；Misegades等人，2012)，从而导致年龄较大的儿童和青少年的免疫力下降，并且该年龄段的病例相应地增加(Skowronski等人，2002；Klein等人，2012)。这与wP疫苗相反，wP疫苗可以在青少年时期提供良好的保护(Klein等人，2012)。由于这些缺点，在20世纪90年代转向aP疫苗的国家中，现在有一代儿童不仅受到较少的百日咳保护，而且对加强免疫的反应也较弱，这是因为儿童接种的这种疫苗可能决定他们对后来的加强疫苗接种的免疫反应(Podda等人，1995；Mascart等人，2007；Sheridan等人，2012；Liko，Robison和Cieslak，2013；Smits等人，2013)。
[0020] 促成wP的反应原性的最重要因素之一是脂寡糖(LOS)的存在，脂寡糖是细菌外膜产生的内毒素。
[0021] wP疫苗中毒素的灭活可以通过各种方法完成，但在最终产品中不应检测到任何对热不稳定的活性毒素。许多制造商实施的用于灭活wP毒素的全细胞百日咳(wP)批量处理过程使用热处理/福尔马林。一些报道引用了硫柳汞用于使wP灭活。然而，硫柳汞的使用会导致IPV抗原性的丧失(疫苗1994年第12卷第9号第851-856页，硫柳汞对灭活脊髓灰质炎病毒疫苗的效力的有害影响)，并且因此，在含有IPV的组合疫苗的情况下可能需要存在于与含有硫柳汞的wP分开的小瓶中，以随时间保持其效力或改变百日咳源的整体灭活。一些抗原，即，活性PT也可以用作免疫应答调节剂，并且已经观察到不同疫苗之间对各种抗原的免疫应答存在显著差异(WHO，1993)。
[0022] 根据所使用的体外或体内试验，LOS的化学提取导致内毒素含量显著下降(20％)和内毒素相关毒性显著下降(高达97％)。LOS提取不影响产品的完整性，更重要的是，不影响DTP的效力和/或稳定性低。此外，几乎没有观察到抗体和T细胞应答的任何差异。(参考文献：Waldely Oliveira Dias等人；具有减少含量的内毒素的改进的全细胞百日咳疫苗；人类疫苗与免疫疗法9:2，339–348；2012年2月)。
[0023] 乙型肝炎抗原
[0024] 有各种各样的肝炎病毒菌株。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepB)引起的疾病，它会感染人类的肝脏并引起称为肝炎的炎症。该疾病的疫苗含有病毒包膜蛋白之一，即，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。现在已经获得用于大规模免疫的疫苗，例如默克公司的产品和 葛兰素史克公司的产品 和 与乙型肝炎单抗原疫苗相比，具有乙型肝炎组分的组合疫苗具有更高的完成率和依从性结果。(参考文献：Kurosky等人；美国儿童中组合疫苗对乙型肝炎疫苗依从性的影响；《小儿传染病杂志》
36(7)：e189-e196，2017年7月)。一些参考文献引用了乙型肝炎表面抗原与其他抗原结合吸附到磷酸铝上。乙型肝炎组分应当基本不含硫柳汞(EP1307473先前已发布了不含硫柳汞的HBsAg制备方法)。由于乙型肝炎组分的低免疫原性而从市场上撤出 组合疫苗。因此，需要包含具有足够或增强的免疫原性的乙型肝炎抗原的组合疫苗组合物。
36(7)：e189-e196，2017年7月)。一些参考文献引用了乙型肝炎表面抗原与其他抗原结合吸附到磷酸铝上。乙型肝炎组分应当基本不含硫柳汞(EP1307473先前已发布了不含硫柳汞的HBsAg制备方法)。由于乙型肝炎组分的低免疫原性而从市场上撤出 组合疫苗。因此，需要包含具有足够或增强的免疫原性的乙型肝炎抗原的组合疫苗组合物。
[0025] 流感嗜血杆菌(Hib)抗原
[0026] 流感嗜血杆菌是为上呼吸道菌群的正常部分的革兰氏阴性球菌。b型流感嗜血杆菌(Hib b)是导致儿童脑膜炎侵入性血源性感染的主要原因，并且也是婴儿出生后头2年脑膜炎的主要原因。1987年加拿大开始使用多糖疫苗[聚核糖核糖醇磷酸(PRP)]进行流感嗜血杆菌免疫接种。Hib的聚核糖核糖醇磷酸(PRP)胶囊是生物体的主要毒力因子。PRP的抗体是血清杀菌活性的主要贡献者，并且抗体水平的提高与侵袭性疾病风险的降低有关。PRP是T细胞非依赖性抗原，因此具有以下特征：a)在不到18个月大的婴儿和儿童中诱导差的抗体反应，b)与T细胞依赖性抗原相比可变的和数量上较小的抗体反应，c)产生较高比例的免疫球蛋白M(IgM)，以及d)无法诱导加强反应。
[0027] 最初仅基于PRP组分的疫苗被证明对婴儿无效。针对PRP缀合物疫苗的进一步努力，其中，PRP缀合至称为载体蛋白的蛋白，比如脑膜炎奈瑟氏球菌、白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM 197的外膜蛋白。组合疫苗中包含Hib缀合物组分与降低的Hib免疫原性有关。此外，Hib-缀合物在水性介质中不稳定并且不能以该形式长期保存。因此，流感嗜血杆菌b(Hib)的PRP多糖通常被配制成干燥的固体，其在交付时会用其他抗原的液体制剂重构，例如在 中(WO99/48525)。
[0028] 脊髓灰质炎抗原
[0029] 可以使用不同种类的疫苗：
[0030] ·Albert Sabin博士于1961年研发的减毒活(弱)口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)。包含Sabin菌株的OPV是口服给药的。
[0031] ·Jonas Salk博士于1955年研发的灭活的(灭活的)脊髓灰质炎疫苗(IPV)。包含Salk菌株的IPV作为注射给药。
[0032] ·最近，Sabin灭活脊髓灰质炎病毒已经被开发用于注射并且也已经可以在商业产品中获得，所述Sabin灭活脊髓灰质炎病毒是通过用福尔马林使Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活来制备的。
[0033] 减毒活脊髓灰质炎疫苗(OPV)和灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)在全世界范围内都可有效控制脊髓灰质炎疾病。脊髓灰质炎疫苗可包含Salk或Sabin菌株。
[0034] 1955年，Jonas Salk博士成功灭活了野生型脊髓灰质炎病毒，因此使其成为注射型制剂并将其命名为Salk菌株，该Salk菌株包括已经用于抗脊髓灰质炎疾病的疫苗中的1型Mahoney、2型MEF和3型Saukett。Sabin菌株包括Sabin1菌株和Sabin2菌株。
[0035] 目前可接受的标准剂量的脊髓灰质炎疫苗包含40D抗原单元的灭活1型脊髓灰质炎病毒(Mahoney)、8D抗原单元的灭活2型脊髓灰质炎病毒(MEF-1)和32D抗原单元的灭活3型脊髓灰质炎病毒(Saukett)，例如 (WO99/48525)。
[0036] IPV目前可以作为无佐剂的独立制剂获得或者以各种组合获得，所述各种组合包括DT-IPV(具有白喉和破伤风类毒素)和六价IPV疫苗(另外具有百日咳、乙型肝炎和流感嗜血杆菌b)例如 (WO99/48525)。
[0037] 然而，当与OPV相比时，IPV的总生产成本要高得多。这主要是由于对以下方面的需求：(i)每剂量更多病毒；(ii)额外的下游处理(即，浓缩、纯化和灭活)和相关的QC-测试；(iii)抗原丢失或下游回收率低；以及iv围堵。迄今为止，在中低收入国家中，财务挑战一直是IPV创新和实施的主要弊端。
[0038] 在根除脊髓灰质炎病毒之后未来全球对IPV的需求可能会从目前的80百万剂量水平/年增加到450百万剂量水平/年。因此，可能需要“延长”IPV的供应的方法。
[0039] 在常规疫苗的供应不足以满足全球需求或常规疫苗的制造成本阻止疫苗以发展中国家可承受的价格出售的情况下，需要使用较低剂量的IPV抗原来提供抗感染保护作用的剂量减少的有效疫苗制剂。此外，与现有的市售制剂相比，暴露于较低剂量的IPV可能更安全。因此，需要评估各种策略来使IPV以更负担得起的价格可用。因此，包含剂量减少的IPV的组合疫苗可以使其更便宜且易于施用。
[0040] 在大流行性流感疫苗的情况下，佐剂的使用允许减少疫苗的剂量，增加疫苗的可用性，并且降低疫苗的成本。因此，已经推测IPV的佐剂疫苗制剂将降低成本，并且还将增加全世界范围内可用的IPV剂量的数量。
[0041] 此外，铝盐被认为是安全的，已用于含有IPV的组合疫苗中，具有最低的发展障碍，并且制造便宜。然而，还不知道铝佐剂允许显著的剂量减少。
[0042] 抗原
[0043] 可以包含在组合疫苗中的其他抗原是流感嗜血杆菌(a血清型、c血清型、d血清型、e血清型、f血清型和未包封的菌株)，肝炎(A菌株、C菌株、D菌株、E菌株、F菌株和G菌株)、脑膜炎A、B或C、流感、肺炎球菌、链球菌、炭疽、登革热、疟疾、麻疹、腮腺炎、风疹、卡介苗、日本脑炎、轮状病毒、天花、黄热、伤寒、单打、水痘病毒等。
[0044] 组合疫苗中所使用的抗原范围和类型取决于将要使用的目标人群年龄，比如婴儿、幼儿、儿童、青少年和成人。最早已知的可以预防百日咳博德特氏菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌和可选的灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)和/或乙型肝炎病毒和/或流感嗜血杆菌B型感染的组合疫苗是已知的(例如参见WO93/24148、WO97/00697、WO2000/030678、WO2008/028956、US 6013264和WO2005089794)。
[0045] 同时，多剂量疫苗注射必须使用防腐剂以避免被微生物污染。对于由联合国(UN)等出口到欠发达国家的组合疫苗产品，考虑到使用疫苗的国家的环境、分配方法、费用等，优选含防腐剂的多剂量疫苗。用于疫苗产品中的防腐剂的示例可以包含硫柳汞、2-PE、苯酚、甲醛，并且常规剂量的防腐剂是本领域已知的。
[0046] 发明人发现，组合疫苗组合物中抗原的免疫原性、反应原性、稳定性和正确形式的维持取决于组合物的配制方式，包括制备单个抗原的过程、抗原的添加顺序、对某些抗原使用特定量的特定佐剂、抗原在佐剂上的单独吸附或组合吸附、抗原在佐剂上的吸附程度、总铝含量、所用防腐剂的浓度和类型、包括搅拌、温度和pH值的各种参数的使用。
发明内容
[0047] 公开了具有改善的免疫原性和降低的反应原性的液体型的稳定的组合疫苗组合物、及其制备方法。
[0048] 本公开涉及一种组合疫苗组合物，该组合疫苗组合物包含：
[0049] a)高纯化的白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)，其使用半合成培养基生产并随后进行解毒。
[0050] b)灭活的全细胞百日咳博德特氏菌(wP)组分，其通过使用加热和化学灭活的组合而制备，特定比例的特定百日咳博德特氏菌菌株导致反应原性降低和效力提高。
[0051] c)与载体蛋白(CP)缀合的B型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖抗原(PRP)
[0053] e)抗原的最佳吸附特性，其使得乙型肝炎(HepB)表面抗原被单独吸附到磷酸铝佐剂上，D和T抗原被单独吸附到磷酸铝佐剂上，从而增强免疫原性
[0054] f)最小的铝含量，从而确保降低的反应原性
[0055] g)作为防腐剂的最佳浓度的2-苯氧基乙醇(2-PE)。
[0056] 目的
[0057] 本公开的一些目的——本文中的至少一个实施方式满足这些目的——如下：
[0058] 本公开的目的是改善现有技术的一个或多个问题或者至少提供有用的替代方案。
[0059] 本公开的另一目的是提供一种液体的、稳定的、反应原性较低和免疫原性更强的组合疫苗组合物/制剂，其适于预防和治疗一种以上的疾病状态并且满足针对所述免疫原性组分中的每个免疫原性组分的血清保护标准。
[0060] 本公开的又一目的是提供一种用于制备组合疫苗的这种组合物/制剂的方法。
[0061] 本公开的其他目的和优点将从以下描述中变得更加明显，以下描述不旨在限制本公开的范围。
具体实施方式
[0062] 根据本公开的第一实施方式，组合疫苗组合物包含选自但不限于下述各者的一组抗原/免疫原：所述各者为白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、全细胞百日咳博德特氏菌(wP)、B型流感嗜血杆菌(Hib)PRP-CP缀合物、乙型肝炎(HepB)、和灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)，并且组合疫苗组合物另外包含铝基佐剂和防腐剂。
[0063] 根据本公开的第二实施方式，组合疫苗组合物还可以包含选自包括但不限于下述各者的组的一个或更多个抗原：所述各者为流感嗜血杆菌(a血清型、c血清型、d血清型、e血清型、f血清型和未包封的菌株)、肝炎(A菌株、C菌株、D菌株、E菌株、F菌株和G菌株)、脑膜炎A、B、C、Y、W-135或X、流感、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌抗原、无细胞百日咳抗原、经修饰的腺苷酸环化酶、疟疾抗原(RTS，S)、肺炎球菌、链球菌、炭疽、登革热、疟疾、麻疹、腮腺炎、风疹、卡介苗、人乳头瘤病毒、日本脑炎、登革热、寨卡病毒、埃博拉病毒、基孔肯雅热、轮状病毒、天花、黄热病、黄病毒、带状疱疹、水痘病毒抗原。
[0064] 根据本公开的第三实施方式，在组合疫苗组合物中使用的IPV菌株包含选自1型、2型和3型的灭活的Sabin菌株或者选自1型Mahoney、2型MEF和3型Saukett的灭活的Salk菌株。
[0065] 在第三实施方式的一个方面中，脊髓灰质炎病毒可以通过以下方法培养：
[0066] ·CCL81-VERO(猴肾)细胞系用作脊髓灰质炎病毒，即，Sabin菌株和Salk菌株生长的宿主细胞。
[0067] ·在用所需的脊髓灰质炎病毒菌株感染宿主细胞并孵育72小时之后，将含有病毒和细胞碎片的培养基合并并收集在单个容器中。
[0069] ·在对患者给药之前，必须使用适当的灭活方法使病毒灭活。
[0070] 然而，本发明人惊奇地发现，D-抗原甲醛灭活后的高百分比损失可能归因于磷酸盐缓冲液的存在，该磷酸盐缓冲液意外地引起脊髓灰质炎病毒颗粒的不期望的聚集。
[0071] 因此，本公开的重要方面包括福尔马林灭活的改进方法，其包括以下步骤：
[0072] a)将纯化后的病毒库进行缓冲液交换，即，从磷酸盐缓冲液交换为Tris缓冲液，pH在7至7.5的(30mM至50mM)范围内，
[0073] b)向上述混合物中添加含有甘氨酸(5gm/l)的M-199培养基，
[0074] c)添加0.025％甲醛并且然后混合，
[0075] d)随后将混合物在37℃下孵育5天至13天，同时在磁力搅拌器上连续搅拌病毒块，[0076] e)在第7天将孵育后的混合物置于中间TFF系统(100KDa，0.1m2)中，灭活后进行最终过滤，
[0077] f)随后将过滤后的物料储存在2℃-8℃，以及
[0078] g)用D-Ag ELISA法测定D-Ag单元
[0079] 根据本公开的第四实施方式，在组合疫苗组合物中使用的IPV菌株包含选自1型、2型和3型的剂量降低的灭活的Sabin菌株或者选自1型Mahoney、2型MEF和3型Saukett的灭活的Salk菌株。
[0080] 根据本公开的第五实施方式，IPV(Sabin菌株和Salk菌株)不被吸附到任何佐剂上(例如，在与其他组分——如果存在的话——混合之前)。
[0081] 根据本公开的第六实施方式，IPV(Sabin菌株和Salk菌株)组分可以被吸附到选自下述各者的助剂上：所述各者为铝盐(Al3+)比如氢氧化铝(Al(OH)3)或磷酸铝(AlPO4)、铝、磷酸钙、MPLA、3D-MPL、QS21、含有CpG的低脱氧核苷酸佐剂、脂质体、或水包油乳剂或其组合(例如，在与其他组分——如果存在的话——混合之前或之后)。如果被吸附，则一个或更多个IPV组分可以单独或一起作为混合物被吸附在氢氧化铝上。
[0082] 可以通过以下步骤将IPV(Sabin菌株和Salk菌株)组分吸附到铝盐上：
[0083] ·将所需体积的高压灭菌的Al(OH)3浸入50ml容器中以使得最终铝(Al+++)浓度在0.1mg/剂量至0.8mg/剂量之间
[0084] ·添加具有调节的D-Ag单元的IPV物料，并且使用稀释剂(10xM-199+0.5％甘氨酸)补足体积，
[0085] ·调节最终制剂的pH值，并且获得pH在6至6.8之间的最终制剂。
[0086] 在第六实施方式的一个方面中，福尔马林灭活的IPV可以在铝(Al3+)上进行吸附，该铝(Al3+)的浓度选自针对每种血清型的0.1mg/剂量、0.2mg/剂量、0.3mg/剂量、0.4mg/剂量、0.5mg/剂量、0.6mg/剂量、0.7mg/剂量和0.8mg/剂量，优选地在0.1mg/剂量至1.25mg/剂量之间，并且pH值选自6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7和6.8，优选地为6.5。
[0087] 在第六实施方式的又一方面中，在Tris存在下福尔马林灭活后D-抗原的回收百分比可以为50％、60％、70％或80％，并且氢氧化铝吸附后的吸附百分比可以在70％至80％、80％至90％、或90％至99％、或95％至99％之间。
[0088] 根据本公开的第七实施方式，分别从白喉棒状杆菌和破伤风梭菌获得白喉类毒素(外毒素)和破伤风毒素(外毒素)，并且随后使用合适的灭活方法将其解毒。使用凝胶过滤色谱法进一步纯化由此获得的白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)。由此获得的纯化的DT进一步用于配制组合疫苗。
[0089] 在第七实施方式的一个方面中，白喉类毒素是通过在半合成培养基中培养白喉棒状杆菌而产生的，该白喉棒状杆菌由最佳浓度的以下组分以下列组合中的任一组合而组成：
[0090] 组合1：
[0092] 组合2：
[0093] 酪蛋白水解物、麦芽糖一水合物、冰醋酸、乳酸钠、硫酸镁、β-丙氨酸、庚二酸、烟酸、氯化锰、L-胱氨酸、二水氯化钙、正磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸亚铁。
[0094] 组合3：
[0095] 酪蛋白水解物、麦芽糖一水合物、冰醋酸、乳酸钠、β-丙氨酸、庚二酸、烟酸、硫酸铜、硫酸锌、氯化锰、L-胱氨酸、二水氯化钙、正磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和WFI。
[0096] 组合4：
[0097] 酵母提取物、麦芽糖一水合物、冰醋酸、乳酸钠、硫酸镁、β-丙氨酸、庚二酸、烟酸、硫酸铜、硫酸锌、氯化锰、L-胱氨酸、二水氯化钙、正磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁和WFI。
[0098] 根据第七实施方式的第二方面，破伤风毒素是通过在半合成培养基中培养破伤风梭状芽胞杆菌而产生的，该破伤风梭状芽胞杆菌由最佳浓度的以下组分以下列组合中的任一组合而组成：
[0099] 组合1：
[0100] 酪蛋白消化液、氯化钙、磷酸氢二钾、无水葡萄糖、氯化钠、硫酸镁、核黄素、硫胺素盐酸盐、盐酸吡y醇、泛酸钙、烟酸、L-胱氨酸、氯化铁、维生素B12溶液、生物素、浓缩HCl、NaOH、无水乙醇和WFI
[0101] 组合2：
[0102] 酪蛋白消化液、氯化钙、β-丙氨酸磷酸氢二钾、无水葡萄糖、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、核黄素、硫胺素盐酸盐、吡y醇盐酸盐、泛酸钙、烟酸、L-胱氨酸、氯化铁、维生素B12溶液、生物素、浓缩HCl、NaOH、无水乙醇和WFI
[0103] 组合3：
[0104] 酪蛋白消化液、氯化钙、磷酸氢二钾、无水葡萄糖、氯化钠、硫酸锌、核黄素、盐酸硫胺素、盐酸吡rid醇、泛酸钙、烟酸、L-胱氨酸、氯化铁、维生素B12溶液、生物素、浓缩HCl、NaOH、无水乙醇和WFI
[0105] 组合4：
[0106] 酪蛋白水解物、氯化钙、磷酸氢二钾、无水葡萄糖、氯化钠、硫酸镁、氯化锰核黄素、盐酸硫胺素、吡y醇盐酸盐、泛酸钙、烟酸、L-胱氨酸、氯化铁、维生素B12溶液、生物素、浓缩HCl、NaOH、无水乙醇和WFI
[0107] 在第七实施方式的又一方面中，使用以下灭活方法中的一种或组合对白喉和破伤风毒素进行解毒，所述灭活方法包括加热、UV、福尔马林/甲醛、乙酰基乙烯亚胺等。
[0108] 根据本公开的第八实施方式，在组合疫苗组合物中使用的肝炎(Hep)抗原包含源自乙型肝炎菌株(HBsAg)表面的Hep抗原。
[0109] 在第九实施方式的一个方面中，可以通过以下方法之一制备HBsAg：
[0110] ·通过从慢性乙型肝炎病毒携带者的血浆中对呈颗粒状的抗原进行纯化，原因在于在HBV感染期间肝脏中会合成大量的HBsAg并被释放到血流中
[0111] ·通过重组DNA方法来表达蛋白质
[0112] 根据本公开的第九实施方式，白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)被分别吸附到选自下述各者的佐剂上：所述各者为铝盐(Al3+)比如氢氧化铝(Al(OH)3)或磷酸铝(AlPO4)、铝、磷酸钙、MPLA、3D-MPL、QS21、含有CpG的低脱氧核苷酸佐剂、脂质体、或水包油乳剂或其组合。
[0113] 更优选地，白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)被分别吸附到磷酸铝上。
[0114] 在第九实施方式的一个方面中，吸附到磷酸铝上的白喉类毒素(D)抗原具有至少50％的吸附百分比。
[0115] 在第九实施方式的另一方面中，吸附到磷酸铝上的破伤风类毒素(T)抗原具有至少40％的吸附百分比。
[0116] 在第九实施方式的又一方面中，吸附到磷酸铝上的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有至少70％的吸附百分比。
[0117] 根据本公开的第十实施方式，在本公开的组合疫苗中使用的Hib抗原衍生自Hib b菌株760705的荚膜多糖。
[0118] 根据第十实施方式的一个方面，Hib b PRP抗原与选自一组载体蛋白的载体蛋白缀合，所述一组载体蛋白包括但不限于CRM197、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟氏菌外膜复合物、破伤风类毒素片段C、百日咳类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、以及来自铜绿假单胞菌的外毒素A、外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)和炭疽杆菌的解毒浮肿因子(EF)和致死因子(LF)、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)、合成肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人类CD4+T细胞表位的人工蛋白，其中，人工蛋白比如为N19、铁摄取蛋白、来自C艰难梭菌的毒素A或B和无乳链球菌蛋白。
[0119] 还优选地，Hib b PRP通过CNBr化学、还原性胺化化学、氰基化化学或任何其他化学与破伤风类毒素(TT)缀合，上述化学已经在Kniskern等人的《缀合物：设计、化学和分析》以及Ellis等人的《嗜血杆菌b缀合物疫苗的开发和临床应用》，纽约：Marcel Dekker，1994年：37页-69页中公开。
[0120] 根据第十实施方式的第二方面，载体蛋白以游离形式和缀合形式存在于本公开的组合物中，未缀合形式优选地总体上不超过组合物中载体蛋白总量的20％，并且更优选地以小于按重量计为5％而存在。
[0121] 根据第十实施方式的第三方面，Hib抗原基本上不被吸附到任何佐剂上。
[0122] 根据第十实施方式的第四方面，Hib抗原可以不进行蓄意或故意地吸附到任何佐剂上。
[0123] 根据本公开的第十一实施方式，用于本公开的组合疫苗组合物中的全细胞百日咳(wP)抗原制剂优选地由以特定比例混合的百日咳博德特氏菌菌株134、509、25525和6229制成，随后通过利用改进的不含硫柳汞的灭活方法进行灭活由此促成降低的反应原性和增加的效力，并且可以或不可以被吸附到铝基佐剂上。
[0124] 根据第十一实施方式的一个方面，用于本公开的组合疫苗组合物中的全细胞百日咳(wP)抗原制剂优选地由以1:1:0.25:0.25的比例混合的百日咳博德特氏菌菌株134、509、25525和6229制成。
[0125] 根据第十一实施方式的第二方面，使用以下灭活处理中的一种或多种对组合疫苗组合物中使用的全细胞百日咳(wP)抗原制剂进行灭活：所述灭活处理包括加热、UV、福尔马林/甲醛、乙酰基乙撑亚胺等。
[0126] 更优选地，通过使用热处理和化学处理的组合来对组合疫苗组合物中使用的全细胞百日咳(wP)抗原制剂进行灭活。更优选地，在甲醛存在下于56℃±2℃下加热灭活10分钟至15分钟，其中，wP物料保持不结块且易于均质化，从而促成反应原性降低并在更长的持续时间内提供更好的wP效力。
[0127] 根据第十一实施方式的第三方面，在组合疫苗组合物中使用的全细胞百日咳(wP)抗原制剂可以或不可以被吸附到铝基佐剂比如氢氧化铝、磷酸铝或其组合上(例如，在与其他组分——如果存在的话——混合之前或之后)。如果被吸附，则一个或更多个wP菌株(即134、509、25525和6229)可以被单独或一起作为混合物被吸附。
[0128] 根据本公开的第十二实施方式，在最终的组合疫苗组合物/制剂中，白喉类毒素(D)的量在1Lf-40Lf的范围内；破伤风类毒素(T)的量在4Lf-25Lf的范围内；wP的量在4IOU-30IOU/0.5ml的范围内；流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量在1μg-20μg PRP含量/0.5ml的范围内；HBsAg抗原的量在1μg-20μg/0.5ml的范围内；Sabin IPV包含1型、2型和3型，其中，1型的含量为1-50DU/0.5ml，2型的含量为1-20DU/0.5ml，并且3型的含量为1-50DU/0.5ml，并且Sabin IPV另外包含铝基佐剂和防腐剂。
[0129] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约25Lf。
[0130] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约20Lf。
[0131] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0132] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0133] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约4Lf。
[0134] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约2Lf。
[0135] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约16IOU/0.5ml。
[0136] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约14IOU/0.5ml。
[0137] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约12IOU/0.5ml。
[0138] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约13μg PRP含量/0.5ml。
[0139] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约10μg PRP含量/0.5ml。
[0140] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约8μg PRP含量/0.5ml。
[0141] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约15μg/0.5ml。
[0142] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约10μg/0.5ml。
[0143] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约8μg/0.5ml。
[0144] 更优选地，存在包含1型菌株、2型菌株、3型菌株的Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sIPV)，其在最终的组合疫苗组合物中的量分别为约40DU/0.5ml、8DU/0.5ml和32DU/0.5ml。
[0145] 根据本发明的第十三实施方式，在最终的组合疫苗组合物/制剂中，白喉类毒素(D)的量在1Lf-40Lf的范围内；破伤风类毒素(T)的量在4Lf-25Lf的范围内；wP的量在4IOU-30IOU/0.5ml的范围内；流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量在1μg-20μg PRP含量/0.5ml的范围内；HBsAg抗原的量在1μg-20μg/0.5ml的范围内；Salk灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)包含1型Mahoney菌株、2型MEF菌株和3型Saukett菌株，其中，1型Mahoney的含量为1-50DU/0.5ml，
2型MEF的含量为1-20DU/0.5ml，并且3型Saukett的含量为1-50DU/0.5ml，并且Salk灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)另外包含铝基佐剂和防腐剂。
2型MEF的含量为1-20DU/0.5ml，并且3型Saukett的含量为1-50DU/0.5ml，并且Salk灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)另外包含铝基佐剂和防腐剂。
[0146] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约25Lf。
[0147] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约20Lf。
[0148] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0149] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0150] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约4Lf。
[0151] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约2Lf。
[0152] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约16IOU/0.5ml。
[0153] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约14IOU/0.5ml。
[0154] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约12IOU/0.5ml。
[0155] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约13μg PRP含量/0.5ml。
[0156] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约10μg PRP含量/0.5ml。
[0157] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约8μgPRP含量/0.5ml。
[0158] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约15μg/0.5ml。
[0159] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约10μg/0.5ml。
[0160] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约8μg/0.5ml。
[0161] 更优选地，存在包含1型Mahoney菌株、2型MEF菌株、3型Saukett菌株的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗，其在最终的组合疫苗组合物中的量分别为约40DU/0.5ml、8DU/0.5ml和32DU/0.5ml。
[0162] 根据本发明的第十四实施方式，在最终的组合疫苗组合物/制剂中，白喉类毒素的量在1Lf-40Lf的范围内；破伤风类毒素的量在4Lf-25Lf的范围内；wP的量在4IOU-30IOU/0.5ml的范围内；流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量在1μg-20μg PRP含量/0.5ml的范围内；
HEP抗原的量在1μg-20μg/0.5ml的范围内；组合疫苗组合物中使用的剂量降低的Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sIPV)包含1型、2型和3型，其中，1型的含量为2.5–10DU/0.5ml，2型的含量为5-20DU/0.5ml，3型的含量为1-20DU/0.5ml，并且Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sIPV)另外包含铝基佐剂和防腐剂。
HEP抗原的量在1μg-20μg/0.5ml的范围内；组合疫苗组合物中使用的剂量降低的Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sIPV)包含1型、2型和3型，其中，1型的含量为2.5–10DU/0.5ml，2型的含量为5-20DU/0.5ml，3型的含量为1-20DU/0.5ml，并且Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sIPV)另外包含铝基佐剂和防腐剂。
[0163] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约25Lf。
[0164] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约20Lf。
[0165] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0166] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0167] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约4Lf。
[0168] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约2Lf。
[0169] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约16IOU/0.5ml。
[0170] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约14IOU/0.5ml。
[0171] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约12IOU/0.5ml。
[0172] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约13μg PRP含量/0.5ml。
[0173] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约10μg PRP含量/0.5ml。
[0174] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约8μg PRP含量/0.5ml。
[0175] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约15μg/0.5ml。
[0176] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约10μg/0.5ml。
[0177] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约8μg/0.5ml。
[0178] 更优选地，存在包含1型菌株、2型菌株、3型菌株的Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sIPV)，其在最终的组合疫苗组合物中的量分别为约40DU/0.5ml、8DU/0.5ml和32DU/0.5ml。
[0179] 根据本公开的第十五实施方式，在最终的组合疫苗组合物/制剂中，白喉类毒素的量在1Lf-40Lf的范围内；破伤风类毒素的量在4Lf-25Lf的范围内；wP的量在4IOU-30IOU/0.5ml的范围内；流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量在1μg-20μg PRP含量/0.5ml的范围内；
HEP抗原的量在1μg-20μg/0.5ml的范围内；减少剂量的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗包含1型Mahoney菌株、2型MEF菌株和3型Saukett菌株，其中，1型Mahoney的含量为5-15DU/0.5ml，2型MEF的含量为1-18DU/0.5ml，3型的Saukett的含量为5-15DU/0.5ml，并且减少剂量的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗另外包含铝基佐剂和防腐剂。
HEP抗原的量在1μg-20μg/0.5ml的范围内；减少剂量的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗包含1型Mahoney菌株、2型MEF菌株和3型Saukett菌株，其中，1型Mahoney的含量为5-15DU/0.5ml，2型MEF的含量为1-18DU/0.5ml，3型的Saukett的含量为5-15DU/0.5ml，并且减少剂量的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗另外包含铝基佐剂和防腐剂。
[0180] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约25Lf。
[0181] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约20Lf。
[0182] 更优选地，白喉类毒素(D)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0183] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约10Lf。
[0184] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约4Lf。
[0185] 更优选地，破伤风类毒素(T)在最终的组合疫苗组合物中的量为约2Lf。
[0186] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约16IOU/0.5ml。
[0187] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约14IOU/0.5ml。
[0188] 更优选地，wP在最终的组合疫苗组合物中的量为约12IOU/0.5ml。
[0189] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约13μg PRP含量/0.5ml。
[0190] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约10μg PRP含量/0.5ml。
[0191] 更优选地，流感嗜血杆菌B PRP-TT缀合物的量为约8μgPRP含量/0.5ml。
[0192] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约15μg/0.5ml。
[0193] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约10μg/0.5ml。
[0194] 更优选地，HBsAg抗原在最终的组合疫苗组合物中的量为约8μg/0.5ml。
[0195] 更优选地，存在包含1型Mahoney菌株、2型MEF菌株、3型Saukett菌株的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗，其在最终的组合疫苗组合物中的量分别为约10DU/0.5ml、2DU/0.5ml和10DU/0.5ml。
[0196] 根据本公开的第十六实施方式，最终的组合疫苗组合物的一个或更多个抗原可以基本上不吸附到任何佐剂上。
[0197] 根据本公开的第十七实施方式，组合物包含选自下述各者的一个或更多个佐剂：所述各者为铝盐(Al3+)比如氢氧化铝(Al(OH)3)或磷酸铝(AlPO4)、铝、磷酸钙、MPLA、3D-MPL、QS21、含有CpG的低脱氧核苷酸佐剂、脂质体或水包油乳液。
[0198] 更优选地，组合物包含作为佐剂的磷酸铝(AlPO4)。
[0199] 在第十七实施方式的一个方面中，最终制剂的抗原可以吸附到原位磷酸铝凝胶或现成的磷酸铝凝胶或其组合上。
[0200] 在第十七实施方式的一个优选方面中，本公开的组合物可以包含2.5mg/0.5ml或更少，并且特别地1.5mg/0.5ml至0.1mg/0.5ml的量的佐剂。
[0201] 在第十七实施方式的又一优选方面中，最终的组合疫苗组合物/制剂中的铝含量(Al+3)可以不超过1.25mg/0.5ml，优选地1mg/0.5ml，最优选地为0.1mg/0.5ml至0.63mg/0.5ml。
[0202] 根据本公开的第十八实施方式，组合疫苗组合物/制剂可以包含选自下述各者的防腐剂：所述各者为2-苯氧基乙醇、苄索氯铵(酚甲醚)、苯酚、硫柳汞、甲醛、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、或苄醇、或其组合。
[0203] 更优选地，组合疫苗组合物/制剂可以包含作为防腐剂的2-苯氧基乙醇(2-POE)。
[0204] 根据本发明的另一方面，本发明的组合疫苗中的2-苯氧基乙醇的量优选地不超过3.5mg/0.5ml；更优选地3.0mg/0.5ml；最优选地2.5mg/0.5ml。
[0205] 根据本发明的第十九实施方式，本公开的组合疫苗组合物/制剂可以包含选自包括下述各者的组的药学上可接受的赋形剂：所述各者为糖和多元醇、表面活性剂、聚合物、盐、氨基酸、pH调节剂(调节疫苗组合物的pH)等。所使用的糖和多元醇的示例可以包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、甘油等。表面活性剂的示例可以包括非离子表面活性剂比如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等。聚合物的示例可以包括葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、环糊精等。盐的示例可以包括NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2等。氨基酸的示例可以包括精氨酸、甘氨酸、组氨酸等。pH调节剂的示例可以包括氢氧化钠、盐酸等。
[0206] 根据本公开的第二十实施方式，所述组合疫苗可以是冻干或液体制剂，优选地液体制剂。
[0207] 根据本发明的第二十一实施方式，所述组合疫苗可以在2摄氏度-8摄氏度下稳定12个月至36个月；在25摄氏度下稳定2个月至6个月；在37℃下稳定1周至4周，最终pH在pH
6.0至pH 7.0的范围内，更优选地在pH 6.2至pH 6.8的范围内，最优选地在pH 6.3至pH 6.7的范围内。
6.0至pH 7.0的范围内，更优选地在pH 6.2至pH 6.8的范围内，最优选地在pH 6.3至pH 6.7的范围内。
[0208] 根据本公开的第二十二实施方式，申请人发现，当考虑到通过下面所公开的方法制备疫苗时，可以获得具有改善的免疫原性和降低的反应原性的稳定的多价疫苗：i)制备单个抗原的过程ii)抗原的添加顺序iii)对某些抗原使用特定量的特定佐剂iv)抗原在佐剂上的单独吸附或组合吸附v)抗原在佐剂上的吸附程度vi)所使用的最低铝浓度vii)所使用的防腐剂的最佳浓度和类型以及viii)包括搅拌、温度和pH的各种参数的使用。
[0209] SIIPL组合疫苗所用菌株的生物来源：
[0210] 二氢叶酸类毒素：
[0211] 白喉棒状杆菌PW8 CN2000菌株是由位于印度的喜马偕尔邦的卡苏里的国家控制局中央研究所(C.R.I.)于1973年从英国伦敦的惠康研究实验室获得的呈冻干形式的菌株。菌株在C.R.I.卡苏里处的主种子C批次白喉CN2000 A1下被复苏并进一步冻干。
[0212] 破伤风毒素：
[0213] 破伤风梭状芽胞杆菌哈佛菌株49205是由位于卡苏里处的国家控制局C.R.I从瑞克斯国立大众艺术研究所(荷兰)获得的呈冻干形式的菌株。
[0214] 百日咳：
[0215] 在SIIPL批量生产百日咳疫苗涉及使用四种百日咳博德特氏菌菌株，即，菌株134、菌株509、菌株6229和菌株25525。菌株134和菌株509的主种子最初来自荷兰的瑞克斯研究所，是通过位于印度的喜马偕尔邦的卡苏里的国家控制局中央研究院获得的。菌株6229和25525的主种子最初来自英格兰的李斯特研究所。
[0216] 乙型肝炎：
[0217] 莱茵生物技术公司(德国)构建了含有HBsAg表面抗原基因的重组多形汉逊酵母菌株。莱茵生物技术公司还制作了主细胞库(MCB多形汉逊酵母K3/8-1菌株ADW，12/94)并且对该库进行了所有表征测试。
[0218] B型流感嗜血杆菌
[0219] 产生细胞底物的来源生物是b型流感嗜血杆菌，即，菌株760705。该菌株最初于1976年11月从一个2岁零2个月大的男婴(出生于14-8-74)中分离出来。在阿姆斯特丹大学学术医学中心(AMC)于-70℃储存之前，进行菌株的三次传代。该菌株被转移到SIIPL作为SIIPL和荷兰疫苗研究所(荷兰NVI)之间合作的一部分。
[0220] IPV：
[0221] 脊髓灰质炎病毒的菌株和来源如下。
[0222] 脊髓灰质炎病毒1型：
[0223] 菌株：Mahoney
[0224] 来源：J.Salk博士(皮特曼摩尔公司)
[0225] 脊髓灰质炎病毒2型：
[0226] 菌株：MEF1
[0227] 来源：斯塔滕血清研究所，哥本哈根
[0228] 脊髓灰质炎病毒3型：
[0229] 菌株：Saukett
[0230] 来源：斯塔滕血清研究所，哥本哈根
[0231] 在整个说明书中，词语“包含(comprise)”或其变体比如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所阐述的元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤的组，但不排除任何其他元素、整体或步骤、或者元素、整体或步骤的组。
[0232] 表述“至少”或“至少一个”的使用暗示使用一种或多种元素或组分或数量，因为该使用可以在本发明的实施方式中用以实现一个或更多个期望的目的或结果。尽管已经对本发明的某些实施方式进行了描述，但是这些实施方式仅通过示例的方式呈现，并且并非旨在限制本发明的范围。在阅读本文的公开内容之后，本领域技术人员可以想到在本发明范围内对本发明的制剂进行改变或修改。这样的改变或修改完全在本发明的精神之内。
[0233] 针对各种物理参数、尺寸和数量给出的数值仅为近似值，并且可以设想的是，除非在说明书中存在相反的陈述，否则比分配给物理参数、尺寸和数量的数值高的值均落在本发明的范围内。
[0234] 尽管本文已经将重点放在优选实施方式的具体特征上，但是应当理解的是，在不脱离本公开的原理的情况下，可以添加许多附加特征并且可以在优选实施方式中做出许多改变。根据本文的公开内容，本公开的优选实施方式中的这些和其他改变对于本领域技术人员而言将是明显的，由此应当清楚地理解，前述描述性内容仅应被解释为是对本公开的说明而非作为限制。
[0235] 优点
[0236] 本文所述的本公开具有若干技术进步和优点，所述若干技术进步和优点包括但不限于实现包含D、T、wP、HBsAg、Hib PRP-TT缀合物和IPV的组合疫苗组合物及其制备方法。当与其他组合疫苗组合物相比时，本公开提供以下优点：
[0237] 1.全液体组合疫苗
[0238] 2.改善的免疫原性
[0239] 3.降低的反应原性
[0240] 4.经过12个月的测试在2℃-8℃和室温下的稳定性得到改善。
[0241] 5.使用无传染性海绵状脑病(TSE)或牛海绵状脑病(BSE)的半合成培养基生产的高纯化白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)。
[0242] 6.全细胞百日咳博德特氏菌(wP)抗原包含以1:1:0.25:0.25的比例的百日咳博德特氏菌菌株134、509、25525和6229，从而提高了针对百日咳博德特氏菌的效力和免疫原性。
[0243] 7.使用了加热和甲醛灭活的组合的使全细胞百日咳博德特氏菌(wP)组分灭活的改进方法。该方法没有硫柳汞，并且灭活的全细胞百日咳抗原仍然保持不结块且是均质的，从而降低了反应原性并在更长的持续时间内提供了更好的效力。
[0244] 8.在总的b型流感嗜血杆菌PRP-TT缀合体中，游离PRP低(小于7％)
[0245] 9.分别吸附在磷酸铝佐剂上的白喉类毒素抗原(D)、破伤风类毒素(T)抗原和乙型肝炎(HepB)表面抗原的吸附特性得到改善，从而提高了药效和免疫原性。
[0246] 10.最小的总铝含量(Al3+)，从而确保降低的反应原性。
[0247] 11.2-苯氧基乙醇(2-PE)作为防腐剂的优化的浓度。
[0248] 示例
[0249] 包括以下实施方式用以对本发明的优选实施方式进行说明。本领域技术人员应当理解的是，以下实施方式中公开的组合物和技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解的是，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在所公开的特定实施方式中做出许多改变并且仍获得相同或相似的结果。
[0250] 示例1：
[0251] 表1：该表给出了在2℃-8℃下在12个月的时间段内SIIPL组合疫苗中的单个抗原的吸附百分比、单个抗原的效力和稳定性概况的简介。
[0252]
[0253]
[0254] NA–不可用
[0255] 表2：该表给出了在25℃±2℃下在12个月的时间段内组合疫苗中的单个抗原的吸附百分比、单个抗原的效力和稳定性概况的简介。
[0256]
[0257]
[0258] NA–不可用
[0259] 示例2：
[0260] 该示例给出了各种组合疫苗组合物的简介：
[0261] 表3：组合疫苗组合物1
[0262]
[0263] 表4：组合疫苗组合物2
[0264]
[0265]
[0266] 表5：组合疫苗组合物3
[0267]
[0268] 表6：组合疫苗组合物4
[0269]
[0270] 表7：组合疫苗组合物5
[0271]
[0272]
[0273] 表8：组合疫苗组合物6
[0274]
[0275] 表9：组合疫苗组合物7
[0276]
[0278] 示例3：
[0279] 制备b型流感嗜血杆菌缀合体的过程
[0280] 借助该过程的53个步骤，呈现了制备b型流感嗜血杆菌缀合体的过程的各个步骤的概括图，所述53个步骤将在下面进行简要描述：
[0281] 步骤1：接种物阶段I摇瓶(S1)：
[0282] 使用工作种子批小瓶来接种接种物阶段摇瓶，该摇瓶中含有0.22μm过滤种子培养基。使用工作容积为25ml的一次性PETG 125ml烧瓶。该阶段在受控搅拌(200rpm±50rpm)和温度(36℃±2℃)下的恒温振荡器中进行。在达到适当的细菌生长(OD590≥1.0)之后，将培养物转移至下一接种物阶段(S2阶段)，如步骤2所述。进行革兰氏染色作为过程中的对照，以确保培养物纯度(革兰氏阴性球菌)。
[0283] 步骤2：接种物阶段II摇瓶(S2)：
[0284] S2接种物阶段由具有800ml工作容积的2Lfernbach烧瓶(S2A和S2B)组成。S2A烧瓶用于OD590的测量，直至OD590在可接受标准之内为止，并且S2B烧瓶用于S3阶段的接种。两个烧瓶中均装有经过过滤灭菌的培养基，这与S1接种物阶段相同。S1级烧瓶用于接种两个阶段II摇瓶。该阶段在受控搅拌(200rpm±50rpm)和温度(36℃±2℃)的恒温振荡器中进行。在达到适当的细菌生长(OD590≥1.0)之后，将培养物转移至下一接种物阶段(S3阶段)，如步骤3所述。进行革兰氏染色作为过程中的对照，以确保培养物纯度(革兰氏阴性球菌)。
[0286] S3接种物阶段由工作容积为35L的120L发酵罐组成。发酵罐中装有与先前接种物阶段相同的培养基。S2级烧瓶用于接种接种物发酵罐。在接种物发酵罐中，在温度(36℃±2℃)、溶解氧(设定值10％)、搅拌(300rpm-600rpm)、曝气(1-5LPM)和背压(0.2bar)下进行生长。在达到适当的细菌生长(OD590≥1.0)之后，将培养物转移至下一生产阶段(S4阶段)，该步骤在步骤4中进行描述。革兰氏染色作为过程中的对照，以确保培养物的纯度(革兰氏阴性球菌)。
[0287] 步骤4：1200L规模生产发酵：
[0288] 1200L的生产发酵罐的工作容积为800升。它与基础培养基组分一起进行分批处理，并且就地进行蒸汽灭菌。随后，在通过0.22μm过滤器之后添加各种培养基补充剂。用从步骤3获得的S3级培养物接种发酵罐。发酵在受控的溶解氧(20％-设定点)、温度(36℃±2℃)、pH(7.1-7.4)、搅拌(40rpm-400rpm)、曝气(50LPM–300LPM)和背压(0.2bar)下进行。在发酵过程中加入两个离散的营养峰值。通过测量OD590(OD590≥3.5)来监测生长，并且在达到稳定阶段后认为发酵已完成。在生长阶段和稳定阶段期间，多糖产物被分泌并积聚在培养液中。进行革兰氏染色作为过程中的对照，以确保培养物的纯度(革兰氏阴性球菌)。
[0289] 步骤5：福尔马林处理：
[0290] 本步骤使用化学试剂(福尔马林)实现了生物负荷减少。添加0.1％福尔马林，并将发酵后的肉汤在37℃下孵育2小时。福尔马林处理后，将容器迅速冷却至<15℃。已验证添加福尔马林可实现生物负荷减少。潜伏期后通过培养板证实了这一点。如步骤6所述，即可收获减少了生物负荷的肉汤。
[0291] 步骤6：连续离心收获：
[0292] 连续离心被用作主要收获步骤。进行该步骤以从灭活的生物质中分离出含多糖的粗肉汤。使用连续离心机的目的是去除>90％的生物质，如通过OD590还原所测定的)。离心机的运行速度为约15000g，液体流量为200L/h-500L/h。离心的上清液如步骤7所述进行进一步处理。
[0293] 步骤7：50LP深度过滤：
[0294] 离心的上清液穿过50LP深度过滤器，以去除粗糙的物质比如细胞碎片。该步骤允许产品穿过滤液，并且与附加的深度过滤器串联，如步骤8所述。
[0295] 步骤8：90LP深度过滤：
[0296] 来自50LP深度过滤器的滤液进一步穿过90LP深度过滤器(标称值为0.22μm)，以进一步去除以前的深度过滤器可能没有保留的任何不溶物。该步骤确保：滤液基本不含细胞碎片并且可以牢固地穿过0.22μm过滤器。在步骤9中将对后续的过滤步骤进行描述。
[0297] 步骤9和10：0.22μm过滤：
[0298] 来自90LP深度过滤器的滤液进一步穿过0.22μm过滤器，并且滤液被收集在储罐中。
[0299] 步骤11和12：100kD浓度和渗滤：
[0300] 进行该步骤以去除介质组分和小分子量杂质。另外，进行浓缩以减少工作容积。选择的截断分子量为100kD，因为Hib多糖(PRP)的分子量≥500kD。将肉汤浓缩至约10倍，并且随后使用0.01M PBS缓冲液(pH 7.2)渗滤NLT 5体积。渗余物中由此产生的产物被称为“粗制PRP”，并且被如步骤13中所述进行进一步处理。浓缩的肉汤经由0.22μm过滤器穿过转移端口转移至DSP区域，以确保没有细菌转移到DSP区域。
[0301] 步骤13：CTAB沉淀：
[0302] CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是阳离子去污剂，其用于沉淀多糖。CTAB由亲水区域和疏水部分组成，并且CTAB对蛋白质、核酸和多糖进行沉淀。从步骤12获得的粗制PRP在1％CTAB浓度下沉淀并孵育>2小时。在步骤14中将对CTAB颗粒收获进行描述。
[0303] 步骤14、15和16：CTAB颗粒离心、收集和存储：
[0304] 在SEZ-3、FF中，使用连续离心机以15000rpm离心CTAB沉淀。CTAB沉淀在≤-20℃被收获、称重、等分并储存以便进一步处理。这是第一过程内保持步骤。
[0305] 步骤17和18：CTAB糊状物解冻并溶解：
[0306] 将冷冻的CTAB糊解冻至室温。解冻的沉淀溶解在5.85％的NaCl溶液中。在搅拌罐中进行溶解，并且将多糖产物溶解在水相中。储罐中包含一些不溶的物质，这些物质来自沉淀的蛋白质和核酸。如步骤19中所述，对该悬浮液进行进一步处理。
[0307] 步骤19：离心：
[0308] 将步骤18中获得的物质在2℃-8℃、5000rpm-6500rpm下离心20分钟-30分钟，以去除未溶解的物质。收集离心的上清液，并且如步骤20所述进行进一步处理。
[0309] 步骤20：72％的乙醇沉淀：
[0310] 72％的乙醇用于对PRP进行沉淀。相对于在步骤19中获得的上清液，使用96％的乙醇产生最终浓度为72％的乙醇。该沉淀在2℃-8℃下进行过夜。如步骤21中所述收获由此产生的沉淀物。
[0311] 步骤21和22：离心和沉淀溶解：
[0312] 通过在2℃-8℃、5000rpm-6500rpm离心20分钟-30分钟来收集72％的乙醇沉淀。将由此产生的沉淀溶解在W.F.I.中直至获得清晰的视觉效果为止。在步骤23中将对溶解颗粒的后续处理进行描述。
[0313] 步骤23：DOC和32％的乙醇沉淀：
[0314] 向从步骤22获得的物质中添加6％的乙酸钠和1％的脱氧胆酸钠(DOC)。96％的乙醇用于产生32％乙醇的最终浓度。DOC和32％的乙醇两者均会驱动蛋白质杂质的沉淀同时使多糖呈液相。该沉淀在2℃-8℃下进行过夜(NLT 8小时)。
[0315] 步骤24：离心：
[0316] 将步骤23中获得的物质在2℃-8℃、5000rpm-6500rpm下离心20分钟-30分钟以去除沉淀物。如步骤25中所述收集离心的上清液并进行进一步处理。
[0318] 在步骤24中获得的上清液包含可溶性PRP并且经受深度过滤，然后进行碳过滤，以去除核酸和色素。通过间歇性地测量260nm处的吸光度来监测核酸的去除(A260)。在达到目标A260后，将溶液通过0.22μm过滤器进行过滤，并且如步骤26中所述对该过滤的溶液进行进一步处理。
[0319] 步骤26：64％乙醇沉淀：
[0320] 将步骤25中获得的经过滤的物质进一步用96％乙醇以64％乙醇的最终浓度进行沉淀。该沉淀在2℃-8℃下进行过夜。通过离心来收获由此产生的沉淀物，并且如步骤27所述进行进一步处理。
[0321] 步骤27：沉淀物的收集和溶解：
[0322] 倒出上清液并丢弃以收集沉淀物。将沉淀物在室温下溶于W.F.I.中。
[0323] 步骤28：300kD浓缩和渗滤：
[0324] 使用300kD NMWCO膜来对溶解的沉淀溶液进行浓缩。使用W.F.I进一步过滤使得不小于(NLT)8X。如步骤29中所述，对所得渗余物进行进一步处理。
[0325] 步骤29和30：0.22μm过滤和纯化的PRP储存：
[0326] 作为澄清步骤，使300kD UF渗余物穿过0.22μm过滤器，以最大程度地减少生物负荷。将由此产生的纯化的PRP等分并在≤-20℃下储存，直至如步骤31中所述进行进一步使用为止。传送纯化的PRP样品以进行Q.C分析。
[0327] 步骤31：解冻和合并：
[0328] 基于缀合物批次大小，对从步骤30获得的适量的天然多糖进行解冻。对合并的物质的PRP含量进行检测，这是步骤32中所述进行进一步处理所必需的。
[0329] 步骤32：100kD浓度：
[0330] 合并的纯化多糖必须具有最低浓度(8mg/ml-12mg/ml)才能进行进一步处理。如果合并的多糖浓度低于目标浓度，则使用100kD UF NMWCO膜来对合并的多糖溶液进行浓缩。浓缩后抽取样品，以确保后续步骤达到最低浓度(步骤33)。
[0331] 步骤33：碱性解聚：
[0332] 在使用碳酸氢盐-碳酸氢盐缓冲液的温和碱性条件下，将从步骤32获得的浓缩多糖(相当于74g/110g)解聚。在达到目标多糖大小后，如步骤34中所述使解聚的多糖活化。
[0333] 步骤34：多糖活化：
[0334] 使用溴化氰将步骤33中获得的解聚多糖活化。该活化在氮气环境下进行。溴化氰是剧毒化学品，在处理该化学品时要格外小心。
[0335] 步骤35：链接器附件：
[0336] 在6分钟-10分钟内向由步骤34获得的反应混合物中添加新鲜制备的己二酸二酰肼(ADH)溶液。该反应在2℃-10℃下进行NLT 16小时。ADH连接体的作用是在多糖中提供缀合反应所需的胺基。
[0337] 步骤36：浓缩和渗滤：
[0338] 对从步骤35获得的反应混合物进行浓缩，并且使用10kD NMWCO UF膜用磷酸盐缓冲盐水(PBS)按体积进行体积渗滤，以去除游离的ADH。在HPLC上监测ADH的去除，并且继续进行渗滤直至游离ADH水平达到5％以下为止。将由此产生的渗余物进一步用NLT 5X MES-NaCl缓冲液渗滤。将该渗余物进一步浓缩以达到NLT 20mg/ml的浓度。将该浓缩的经处理的PRP保持处于2℃-8℃，直至如步骤37中所述进行进一步使用为止。
[0339] 步骤37和38：0.22μm过滤和经处理的PRP储存：
[0340] 使来自步骤36的渗余物穿过0.22μm过滤器，其用作澄清步骤。这也确保了在过程期间对生物负荷水平进行控制，该过程在C级区域进行。收集、取样、等分并在2℃-8℃下储存过滤的活化多糖，直至进行进一步处理为止。从经处理的多糖池中提取样品进行分析，其中包括PRP分子大小(kD)、PRP含量和PRP活化度。在步骤40中将对已处理PRP的进一步处理进行描述。
[0341] 步骤39：TT 10kD浓缩和渗滤：
[0342] 缀合反应需要两个组分，即，加工的多糖和载体蛋白(TT)。浓缩载体蛋白，并且使用10kD UF NMWCO膜用MES-NaCl缓冲液进行渗滤。然后使用同一膜将该渗滤的载体蛋白进一步浓缩至NLT 20mg/ml。
[0343] 步骤40：缀合：
[0344] 缀合反应需要两个组分，即，加工的多糖和载体蛋白(TT)。活化的多糖组分从步骤38中获得。载体蛋白从步骤39中获得。在EDC存在下在搅拌下以PRP:TT＝1:1(w/w)的比例将两种组分以适当的量混合。在HPLC上监测缀合反应，并且持续直至达到≥85％的蛋白质转化率(基于游离蛋白向缀合物的转化率)为止。
[0345] 步骤41：淬火：
[0346] 在缀合反应已进行至转化的可接受标准(步骤40)之后，通过淬灭终止反应。使用磷酸盐EDTA缓冲液淬灭缀合反应。随后如步骤42中所述对该缀合反应进行处理。
[0347] 步骤42：30SP和0.22微米过滤：
[0348] 将从步骤41获得的缀合物通过30SP过滤器进行过滤，然后进行0.22μm过滤。这确保了任何大的骨料的去除。如步骤43中所述对经过滤的缀合物进行处理。
[0349] 步骤43：300kD超滤和渗滤：
[0350] 使用300kD UF NMWCO膜用0.05％盐水对从步骤42获得的缀合反应混合物进行渗滤。进行渗滤以去除缀合试剂和未反应的TT。如步骤44中所述对由此产生的渗余物进行进一步处理。
[0351] 步骤44和45：0.22μm过滤和粗缀合物储存：
[0352] 使来自步骤43的渗余物穿过0.22μm过滤器，其用作澄清步骤。这也确保了在过程期间对生物负荷水平进行控制，该过程在C级区域进行。收集、取样并在2℃-8℃下储存经过滤的粗缀合物，直至进行进一步处理为止。在步骤46中将对粗缀合物的进一步处理进行描述。
[0353] 步骤46：粗缀合物稀释：
[0354] 用W.F.I.稀释来自步骤45的粗缀合物——如果需要的话——将其稀释至目标浓度4±1mg/ml，并且通过步骤47中所述的沉淀步骤进行进一步处理。
[0355] 步骤47：硫酸铵沉淀：
[0356] 使用硫酸铵(50％w/v储备溶液)将稀释的缀合反应混合物进一步处理以去除游离的PRP。在搅拌下在低于15℃下进行沉淀步骤。沉淀步骤将缀合物带入沉淀物中，并且将游离的PRP留在上清液中。在加入硫酸铵之后，将由此产生的悬浮液在不搅拌的情况下在低于15℃的条件下储存NLT 12小时。
[0357] 步骤48：沉淀物的收集和溶解：
[0358] 将得自步骤47的悬浮液在2℃-8℃下于～7000g离心40分钟±10分钟。通过倾析丢弃上清液并且将获得的沉淀物溶解在Tris-盐水中。
[0359] 步骤49：300kD渗滤：
[0360] 将来自步骤48的由此产生的溶液通过30SP深度过滤器进行过滤，并且使用300kD NMWCO膜用20mM Tris-盐水进行渗滤。
[0361] 步骤50：GPC色谱纯化：
[0362] 将来自步骤49的所得溶液加载到约70L的GPC柱上以用于尺寸排阻色谱法，该柱包含Toyopearl HW-65F羟基化甲基丙烯酸聚合物珠粒凝胶。针对经处理的缀合物(硫酸铵后)使用GPC色谱法降低了由此产生的物质中的游离PRP水平。用20mM Tris 0.9％NaCl洗脱该柱，并且基于A280收集馏分。如步骤51中所述，将基于关于游离PRP、比例和分子大小的接受标准的适当馏分合并在一起，并且进一步处理合并后的部分。
[0363] 步骤51：300kD渗滤：
[0364] 使用300kD UF NMWCO膜并用20mM Tris对来自步骤50的由此产生的合并的缀合物洗脱液进行渗滤。该渗余物体积的目标是使其中的PRP含量为约1mg/ml。
[0365] 步骤52和53：0.22μm过滤：
[0366] 将从步骤51获得的体缀合物在等级A环境下通过0.22μm过滤器进行过滤，以确保无菌性。0.22μm过滤器经过完整性测试。将来自经过滤的体缀合物的样品送至Q.C.以进行完整的分析。经过滤的缀合物被标记为“无菌的Hib体缀合物”并且储存在2℃-8℃下。散装缀合物将在2℃-8℃下储存最多3个月，并且此后如果不使用，则其可以在-70℃下储存总持续时间长达1年。
[0367] 获得的Hib PRP-TT缀合物抗原的质量特征如下：
[0368] PRP含量(μg/0.5ml)：8.1
[0369] 比例(PRP:TT)：0.5
[0370] 游离PRP(％)：4.8％
[0371] PMW(kD)：983
[0372] 平均MW(kD)：752
[0373] 示例4：
[0374] 全细胞百日咳(wP)抗原的灭活方法：
[0375] 在进行各种实验后进行灭活方法的优化，其包括在甲醛存在下于56℃灭活10min，在甲醛存在下于56℃灭活15min，在亚胺存在下于56℃灭活10min，并且在亚胺存在下于56℃灭活15min且仅在56℃加热30min。用这些方法没有观察到效力的显著差异。在这些方法中，选择在甲醛存在下于56℃持续10分钟，这是因为与以上提到的其他方法相比，使用该方法生成的百日咳细胞团更均一。
[0376] 制备灭活的wP抗原的过程包括以下步骤：
[0377] a)百日咳博德特氏菌菌株134在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟
[0378] b)百日咳博德特氏菌菌株509在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟
[0379] c)百日咳博德特氏菌菌株25525和6229在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟[0380] )。百日咳博德特氏菌菌株6229在甲醛存在下于56℃灭活10分钟-15分钟
[0381] d)随后以1:1:0.25:0.25的比例将灭活的百日咳博德特氏菌菌株134、509、25525和6229混合。
[0382] e)可选地吸附到铝基佐剂上。
[0383] 该过程没有硫柳汞，灭活的全细胞百日咳抗原仍然保持不结块且是均质的，从而降低了反应原性并在更长的持续时间内提供了更好的效力。
[0384] 示例5：制备灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的过程
[0385] 脊髓灰质炎病毒可以通过以下方法培养：
[0386] ·CCL81-VERO(猴肾)细胞系用作脊髓灰质炎病毒，即，Sabin菌株和Salk菌株生长的宿主细胞。
[0387] ·在用所需的脊髓灰质炎病毒菌株感染宿主细胞并孵育72小时之后，将含有病毒和细胞碎片的培养基合并收集在单个容器中。
[0388] ·滤液用100KDa盒进行切向流过滤；用磷酸盐缓冲液渗滤，并且用阴离子交换色谱法纯化。
[0389] ·在对患者给药之前，必须使用适当的灭活方法使病毒灭活。
[0390] 福尔马林灭活包括以下步骤：
[0391] a)将纯化后的病毒库进行缓冲液交换，即，从磷酸盐缓冲液交换为Tris缓冲液，pH在7至7.5的(30mM至50mM)范围内，
[0392] b)向上述混合物中添加含有甘氨酸(5gm/l)的M-199培养基，
[0393] c)添加0.025％甲醛并且然后混合，
[0394] d)随后将混合物在37℃下孵育5天至13天，同时在磁力搅拌器上连续搅拌病毒块，[0395] e)在第7天将孵育后的混合物置于中间TFF系统(100KDa，0.1m2)中，灭活后进行最终过滤
[0396] f)随后将过滤后的物料储存在2℃-8℃，以及
[0397] g)用D-Ag ELISA法测定D-Ag单元
[0398] 示例6：
[0399] 该示例给出了制备包含D、T、wP、HBsAg、Hib PRP-TT缀合物和IPV的组合疫苗组合物的过程的简介：
[0400] 1.组分I的配制方法：
[0401] a)转移容器/器皿中的磷酸铝
[0402] b)添加白喉类毒素
[0403] c)用醋酸/氢氧化钠将pH值调节至4.5至5.5
[0404] d)等待稳定化
[0405] e)用氢氧化钠/碳酸钠将pH值调节至5.5至6.5
[0406] f)等待稳定化
[0407] 2.组分II的配制方法：
[0408] a)转移容器/器皿中的磷酸铝
[0409] b)添加破伤风类毒素
[0410] c)用醋酸/氢氧化钠将pH值调节至4.5至5.5
[0411] d)等待稳定化
[0412] e)用氢氧化钠/碳酸钠将pH值调节至5.5至6.5
[0413] f)等待稳定化
[0414] 3.组分III的配制方法：
[0415] a)转移容器/器皿中的磷酸铝
[0416] b)添加乙型肝炎表面抗原
[0417] c)用醋酸/氢氧化钠将pH值调节至4.5至5.5
[0418] d)等待稳定化
[0419] e)用氢氧化钠/碳酸钠将pH值调节至5.5至6.5
[0420] f)等待稳定化
[0421] 4.将组分I在组分II中混合并在室温(RT)下搅拌
[0422] 5.向上述混合物中添加灭活的wP抗原，然后在室温下搅拌
[0423] 6.在室温下，向步骤5中获得的混合物中添加组分III
[0424] 7.在6℃–16℃下，向步骤6中获得的混合物中添加Hib PRP缀合物
[0425] 8.在6℃–16℃下，向步骤6中获得的混合物中添加IPV抗原
[0426] 9.在6℃–16℃下，向步骤7中获得的混合物中添加2-苯氧基乙醇
[0427] 10.检查pH值，如果需要，用氢氧化钠/碳酸钠将pH值调节至6.0至7.0
[0428] 11.向步骤10中获得的混合物中添加NaCl，然后搅拌3小时
[0429] 示例7：
[0430] 六价疫苗毒性研究
[0431] 根据与关于疫苗的非临床评估的附表“Y”和WHO指南相符的研究计划并且根据OECD良好实验室规范，对DTwP-HepB-IPV-Hib疫苗进行了以下毒性研究。
[0432] 1.通过皮下途径对Sprague Dawley大鼠进行单剂量毒性研究
[0433] 在治疗开始时，将总共20只5-6周龄的雄性大鼠和20只5-6周龄的雌性大鼠随机分为四组。每组包括5只雄性大鼠和5只雌性大鼠。通过皮下途径施用即用型安慰剂、佐剂、DTwP-HepB-IPV-Hib单剂量疫苗和多剂量疫苗。在给药后14天观察大鼠。
[0434] 2.通过肌内途径对Sprague Dawley大鼠进行重复剂量毒性研究
[0435] 将总共100只雄性大鼠和100只雌性大鼠随机分为主要组和恢复组。在第1天、29天、57天和85天通过深肌内注射缓慢注射即用型安慰剂对照、佐剂对照、DTwP-HepB-IPV-Hib单剂量疫苗和多剂量疫苗。恢复组中的动物未经处理并且被观察28天。
[0436] 3.通过皮下途径对新西兰白兔进行单剂量毒性研究
[0437] 将总共16只雄性兔子和16只雌性兔子随机分为四组。通过皮下途径向各组的每只动物施用即用型安慰剂、佐剂、DTwP-HepB-IPV-Hib单剂量疫苗和多剂量疫苗。给兔子单次皮下给药并观察15天。
[0438] 4.通过肌内途径对新西兰白兔进行重复剂量毒性研究
[0439] 将总共40只雄性兔子和40只雌性兔子随机分为主要组和恢复组。在第1天、29天、57天和85天通过深肌内注射缓慢注射即用型安慰剂对照、佐剂对照、以及不同剂量的单次和多次DTwP-HepB-IPV-Hib疫苗。恢复组中的动物未经任何处理并且被观察28天。
[0440] 根据结果得出结论，当在所采用的测试条件下通过皮下或肌内途径施施用单人剂量(0.5ml)时，单剂量和多剂量的六价疫苗[白喉、破伤风、百日咳(全细胞)、乙型肝炎、脊髓灰质炎(灭活)和b型流感嗜血杆菌缀合物疫苗(吸附)]没有在Sprague-Dawley大鼠和新西兰白兔中产生任何全身性副作用。在施用含铝佐剂疫苗的毒性研究中，预期且通常观察到在疫苗治疗组中观察到的局部注射部位炎症反应和免疫反应发现。因此，在所采用的测试条件和剂量下，最高剂量为0.5ml/动物(1人剂量)的测试项目“DTwP-HepB-IPV-Hib疫苗”被视为“未观察到不良反应水平”(NOAEL)。
[0441] 示例8
[0442] 表10：该表比较了SIIPL组合疫苗与Easy Six(Panacea)之间的单个抗原的吸附百分比、效力、游离PRP含量：
[0443]
[0444]
[0445] D＝白喉类毒素抗原
[0446] T＝破伤风类毒素抗原
[0447] wP＝全细胞百日咳抗原
[0448] HBsAg＝乙型肝炎表面抗原
[0449] IPV＝灭活的脊髓灰质炎病毒抗原
[0450] 吸附百分比(％)＝抗原吸附到铝盐(Al3+)上的百分比。
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