크리스마스 로즈 식물 태좌 세포 배양 추출물을 함유한 항노화, 항염, 항산화 화장료 조성물 {Anti-aging and Anti-inflammation and Anti-oxidation cosmetic composition including Christmas rose Plant Placenta Cell Cultures Extracts}

본 발명은 미나리아재비목 식물의 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 크리스마스 로즈 식물의 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 체내의 모든 기관을 기온 및 습도의 변화와 자외선 등 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능을 가지고 있다. 그러나 외부로부터 받는 끊임없는 물리적, 화학적 자극은 피부 기능을 저하시키고 피부의 노화 현상을 촉진시키게 되는데, 이러한 피부의 노화는 피부 구성 성분의 전체적인 악화를 수반하여 결과적으로 피부가 쉽게 갈라지게 된다.

또한, 섬유 아세포의 감소 및 이 세포의 활성도 손상 역시 피부 노화 프로세스 중에 중요한 부분을 차지한다. 이러한 피부 노화현상을 방지하고 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여 종래에는 각종 식물, 동물, 미생물로부터 얻은 생리활성물질들을 함유한 화장품을 사용함으로써, 피부의 고유 기능을 유지시키고 피부 세포를 활성화시켜 피부 노화를 효과적으로 억제하기 위하여 부단히 노력해 왔다. 그러나 기존의 화장품 원료는 만족할만한 효과나 효능을 충족하기에는 여전히 미흡하고, 오히려 피부 부작용을 유발하는 문제점이 있다.

또한, 염증은 세포나 조직이 스트레스나 자외선과 같은 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화 하거나 원래상태로 회복시키려고 하는 방어 기전의 하나로서 신경, 혈관, 조직, 혈액 등과 세포 반응을 일으키는데 그 정도가 지나칠 경우 결과적으로 가려움, 발열, 발적 등이나 통증, 조직 손상 등 피부 염증 및 피부 트러블을 일으키게 된다.

이러한 피부 염증, 피부 트러블은 사이토카인의 조절 및 염증 매개 분자의 발현 억제에 의해 자극과 염증을 조절하여 피부 정상화를 도모할 수 있다.

염증을 소실시키기 위해 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 것을 항염제라 한다. 현재까지 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질은 비스테로이드계로서 프루페나믹산 (flufenamicacid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고, 스테로이드계로는 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 있으며, 그 외에 신경 펩타이드 길항제, 브라디키닌 길항제, COX 억제제 등이 제시되어 왔으나, 피부에 대한 안전성 면에서나 화장료 배합시의 안정성 면에서 대부분 문제점을 안고 있어서, 그 사용이 제한되고 있다(공개특허 10-2008-0020853).

한편, 여드름(심상성 좌창 : Acne vulgaris)이란 모공이 좁아지거나 막혀 피지가 배출되지 못해 생기는 피부병이다.털을 만드는 모낭에는 털에 기름을 분비하여 촉촉하게 하는 피지선이 있는데. 이 피지선의 분비가 늘어나거나 모낭 입구가 막히면 여드름균의 증식이 활발하여 여드름을 일으킨다. 여드름의 원인은 여러 가지가 있지만 남성 호르몬인 안드로겐(androgen), 여드름을 일으키는 세균 즉, 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)의 증식 및 피지 분비 증가가 가장 중요하다. 여드름 환자의 경우 안드로겐이 피지선을 자극하여 피지 분비를 증가시키고, 이렇게 증가된 피지들이 죽은 피부세포들과 엉키고 뭉쳐지게 되면서 모낭 입구를 막는다. 이렇게 막힌 모낭 입구는 혐기성 세균인 프로피오니박테리움 아크네가 자랄 수 있는 환경을 제공하게 되고, 이들이 분비한 리파아제(lipase)들이 피지를 분해하여, 그 분해산물이 모낭에 자극을 주어 결국 염증을 일으킨다. 여드름의 예방과 치료는 과도한 피지 분비 억제와 염증완화를 통해서 얻을 수 있다. 따라서, 그 원인을 복합적으로 제거를 한다면 여드름을 매우 효과적으로 억제할 수 있게 된다. 특히, 여드름은 근래에 와서 외부적 스트레스, 대기 오염물, 호르몬 불균형 등으로 청소년 뿐만 아니라 성인에게서 유발되는 경향이 증가되고 있고, 이 현상은 해마다 현저해지고 있기 때문에 여드름과 관련된 방법들이 많이 제시되고 있다. 여드름과 관련된 피부트러블을 개선하는 방법으로 살리실릭산 및 트리클로산(triclosan) 및 트리하이드록시팔미틱산을 화장료 조성물에 적용함으로써 모공을 열어주고 피지 분비를 촉진하여 여드름의 예방 및 치료하는 방법이 개시되고 있고 (대한민국 공개특허 제2004-0089072호), 올리고사카라이드를 복용함으로써 피지선에서의 피지 분비량을 감소시켜 피지분비를 억제하는 방법을 개시하고 있다(일본 특허공개 평 05-294836호). 또한, 프로피오니박테리움 아크네에 항균력을 가진 제비꽃 추출물을 화장료에 적용시켜 여드름의 예방하는 방법이 제시되고 있다(대한민국공개특허 제2002-0082616호)

한편, 미나리아재비목 식물에 대하여 종래에 위와 같은 화장료 조성물의 재료로써 기능적인 연구가 된 적은 없었다.

본 발명자들은 피부개선능이 있는 화장료 조성물을 제조하기 위해 노력하던 중, 미나리아재비목 식물의 태좌세포를 분리하고, 식물조직배양을 통해 배양하여 미나리아재비목 식물의 태좌조직 배양물 또는 그 추출물이 피부 세포의 성장 및 증식을 활성화시키고, 피부보습, 미백, 항염, 피지억제, 여드름 개선 및 주름개선효능 등이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미나리아재비목(Ranunculales) 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 미나리아재비목 식물은 작약과 (Paeonia) , 연꽃과(Nelumbo), 수련과(Nymphaea), 매자나무과 (Berberidaceae), 키르카에아스테르과 (Circaeasteraceae), 킹도니아과 (Kingdoniaceae), 유프텔레아과 (Eupteleaceae), 으름덩굴과 (Lardizabalaceae), 새모래덩굴과 (Menispermaceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 현호색과 Fumariaceae), 프테리도필룸과 (Pteridophyllaceae), 또는 미나리아재비과 (Ranunculaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미나리아재비목 식물은 아네모네(Anemone, Anemone coronaria), 작약(Poeny, Paeonia lactiflora), 노루귀(Hepatica asiatica Nakai), 할미꽃(Pulsatilla koreana), 연꽃(Lotus, Nelumbo nucifera), 크리스마스로즈(Christmas rose, Helleborus niger), 모란꽃(Paeonia suffruticosa), 수련화(Nymphaea teragona)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름 방지 또는 개선용, 항염용, 모공 축소용, 피지분비 억제용, 여드름개선용, 미백용, 항균용 또는 피부보습용일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 미나리아재비목 식물의 씨방내의 태좌조직을 분리하여 태좌세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물 함유 화장료 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하며, 피부 보습, 항염, 모공 축소, 피지분비 억제, 여드름 개선, 항산화 효능을 가지고 있다.

본 발명은 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다. 이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 2중량%의 경우를 실험하였으나, 이 이외에 10중량%까지, 또는 그 이상의 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 모공축소, 피부보습, 여드름개선, 피지억제, 항염, 주름개선 기능을 비롯한 피부개선효과를 가짐은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서, 미나리아재비목(Ranunculales) 식물은 쌍떡잎 식물강에 속하는 분류체계에 따른 식물로, 다음과 같은 과(order)의 식물을 포함한다: 작약과 (Paeoniaceae) , 연꽃과(Nelumbonaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 매자나무과 (Berberidaceae), 키르카에아스테르과 (Circaeasteraceae), 킹도니아과 (Kingdoniaceae), 유프텔레아과 (Eupteleaceae), 으름덩굴과 (Lardizabalaceae), 새모래덩굴과 (Menispermaceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 현호색과 Fumariaceae), 프테리도필룸과 (Pteridophyllaceae), 또는 미나리아재비과 (Ranunculaceae) 식물.

본 발명에 있어서, 상기 미나리아재비목 식물은 아네모네속 (Anemone), 작약속(Paeonia), 노루귀속(Hepatica), 할미꽃속(Pulsatilla), 연꽃속(Nelumbo), 헬레보루스속(Helleborus), 또는 수련속(Nymphaea) 식물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 미나리아재비목에 속하는 대표종으로, 아네모네(Anemone, Anemone coronaria), 작약(Poeny, Paeonia lactiflora), 노루귀(Hepatica asiatica Nakai), 할미꽃(Pulsatilla koreana), 연꽃(Lotus, Nelumbo nucifera), 크리스마스로즈(Christmas rose, Helleborus niger), 모란꽃(Paeonia suffruticosa), 수련화(Nymphaea teragona)의 태좌세포 배양을 통하여 배양물 및 그 추출물에 대한 효능을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 상기 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~100℃로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 태좌조직 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 피부개선용이란, 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부보습, 피지분비억제, 여드름개선, 모공축소, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 화장료 조성물로써 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 화장료 조성물로써 항산화, 모공축소, 피부보습, 피지억제, 여드름개선, 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성 또는 iNOS 억제 활성 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 특히, 프로콜라겐 증가, 콜라겐 생합성 증가능을 가지고 있어, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선/방지용으로 적용될 수 있으며, 이외에도 항산화, 미백, 모공수축, 피지억제, 항균, iNOS 억제 활성을 통한 항염, 피부 염증 예방, 완화, 경감, 치료용으로 적용될 수 있다.

이러한 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물의 효능은, 실험예들에서 구체적으로 제시된 바와 같이, 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물이 다른 부위, 예컨대, 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 조직 유래 세포 배양물의 추출물에 비해 항염, 항산화, 보습, 주름방지, 미백, 모공수축, 피지억제, 여드름개선, 항균 등의 탁월한 효능을 가지고 있으며, 폴리페놀함량, 플라보노이드 함량 또한 탁월하다.

식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내( in vitro )에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

식물의 태좌(胎座, Placenta)는 동물 유래의 태반과 같이, 종자 육성을 주관하는 중요한 부위로, 암술의 씨방(자방, 子房, Ovary)안에서 밑씨가 붙는 부분이다. 보통 씨방을 형성하는 심피(心皮, carpel)의 가장자리에 있는데, 때로는 심피의 중맥에도 있다. 또 씨방의 기저나, 기저로부터 씨방 안에 직립하는 기둥 모양으로 생길 때도 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 미나리아재비목 식물의 태좌조직을 분리하여 태좌세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 미나리아재비목 식물 태좌 세포를 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH ₄ NO ₃ 1650 mg, KNO ₃ 1900 mg, CaCl ₂ .2H ₂ O 440 mg, MgSO ₄ .7H ₂ O 370 mg, KH ₂ PO ₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H ₃ BO ₃ 6.2 mg, MnSO ₄ .4H ₂ O 22.3 mg, ZnSO ₄ .7H2O 8.6 mg, Na ₂ MoO ₄ .2H ₂ O 0.25 mg, CuSO ₄ ,5H ₂ O 0.025 mg, CoCl ₂ .6H ₂ O 0.025 mg, FeSO ₄ .7H ₂ O 27.8 mg, Na ₂ EDTA.2H ₂ O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 화장료 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 화장료 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나,

(a)단계에서 얻어진 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 이차대사산물인 폴리페놀 화합물(polyphenolic compounds)함량을 높이기 위하여 물리적 및 화학적 유인제(elicitor)를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 실험예 2에 제시된 과정을 통하여 처리할 수 있으며, 특히, 이차대사산물인 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀성 화합물의 함량을 높이기 위한 방법에는

1. 100~300μM, 일 예로, 200μM 메틸자스몬산(methyl jasmonic acid)을 MS배지에 넣어서 배양한다.

2. 미나리아재비목(Ranunculales)에 속하는 식물 부위별 세포배양체를 고주파 세포 배양기에서 배양하면서 하루동안 고주파를 240 내지 270kHz, 일 예로 240 또는 270kHz로 하여 3~10분, 일예로 5분 간격으로 2~4번, 일예로 3번 처리하고 이를 일주일 또는 이주일간 반복한다.

이러한 유인제 처리를 통하여, 페놀, 플라보노이드 함량을 증가된 것으로 나타났으며, 특히, 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 보습, 모공축소, 피지억제, 항균, 여드름개선에도 우수한 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.

본 발명의 화장료 조성물은 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 화장료 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물을 함유 화장료 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물을 함유 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 화장료 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부보습, 모공축소, 피지분비억제, 여드름개선, 항균, 항산화, 콜라겐 합성 증진능에 따른 피부 노화 방지, iNOS 활성 저해를 통한 염증의 완화/예방 등을 비롯한 면역질환 치료/예방의 기능을 할 수 있는 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 이하의 실시예에서는 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물에 관한 효능을 확인하였으나, 추출물이 아닌 배양물 자체에 대해서도 이러한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명에 따른 미나리아재비목(Ranunculales) 부위별 추출물의 제조

(1) 세포 분리

1.1 미나리아재비목(Ranunculales) 태좌세포의 분리

배양을 위해서, 미나리아재비목(Ranunculales) 대표적으로, 아네모네, 작약, 노루귀, 할미꽃, 연꽃, 크리스마스 로즈, 모란꽃, 수련화의 꽃봉오리를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 5분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋을 이용하여 씨방벽을 벗겨내고, 태좌세포를 분리하여 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

1.2 미나리아재비목(Ranunculales) 꽃 세포의 분리

배양을 위해서, 미나리아재비목(Ranunculales) 대표적으로, 아네모네, 작약, 노루귀, 할미꽃, 연꽃, 크리스마스 로즈, 모란꽃, 수련화의 꽃잎을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 꽃 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

1.3 미나리아재비목(Ranunculales) 잎 세포의 분리

배양을 위해서, 미나리아재비목(Ranunculales) 대표적으로, 아네모네, 작약, 노루귀, 할미꽃, 연꽃, 크리스마스 로즈, 모란꽃, 수련화의 잎을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 잎 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

1.4 미나리아재비목(Ranunculales) 줄기 세포의 분리

배양을 위해서, 미나리아재비목(Ranunculales) 대표적으로, 아네모네, 작약, 노루귀, 할미꽃, 연꽃, 크리스마스 로즈, 모란꽃, 수련화의 줄기를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 줄기 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

1.5 미나리아재비목(Ranunculales) 뿌리 세포의 분리

배양을 위해서, 미나리아재비목(Ranunculales) 대표적으로, 아네모네, 작약, 노루귀, 할미꽃, 연꽃, 크리스마스 로즈, 모란꽃, 수련화의 뿌리를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 뿌리 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

(2) 분리된 미나리아재비목(Ranunculales) 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포의 배양 및 대량생산

무균적으로 분리된 미나리아재비목(Ranunculales) 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포를 5% Sucrose가 포함된 MS배지에서 2~ 3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였고, 이후, 풍선형 생물반응기(삼성과학)를 이용하여 Agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃ , 공기공급량을 0.1vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양증식하여 대량생산하였다.

(3) 미나리아재비목(Ranunculales) 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포 배양추출물의 제조

증식된 미나리아재비목(Ranunculales) 대표적으로, 아네모네, 작약, 노루귀, 할미꽃, 연꽃, 크리스마스 로즈, 모란꽃, 수련화의 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포를 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 미나리아재비목(Ranunculales)의 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포분말 100g을 용기에 담고, 정제수 10 L를 넣은 후, 열탕증류기에서 8 ~ 48시간동안, 80 ~ 100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻었다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 아네모네, 작약, 노루귀, 할미꽃, 연꽃, 크리스마스 로즈, 모란꽃, 수련화 세포배양추출물을 제조하였다.

실험예 1: 본 발명에 따른 미나리아재비목 ( Ranunculales ) 부위별 세포배양추출물의 세포생존율에 미치는 영향 시험

본 발명에 따른 미나리아재비목(Ranunculales) 부위별 세포배양추출물의 피부 세포의 증식 활성을 알아보기 위하여, 인간각질형성 세포(Human Skin Keratinocyte, HaCaT)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다. 세포를 1×10 ⁴ cells/ml의 농도로 하여 24 well 배양판에 접종하였다. 배지는 10 % FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 미나리아재비목(Ranunculales) 태좌조직배양추출물이 10 % 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200㎕의 Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕씩을 96 well 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 증식 활성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였다.

[수학식 1]

세포생존율(Viability)효과(%) = (추출물 처리시의 흡광도/대조군의 흡광도)× 100

인간각질형성세포(keratinocyte)를 이용하여, 미나리아재비목(Ranunculales) 대표적 식물의 부위별 세포배양추출물을 처리하여 피부에 쓰기 적합한 범위를 알아본 결과, 즉, Cell Viability 세포생존율효과를 확인하였다. 2 % 고농도의 미나리아재비목 식물부위별 세포배양추출물이 함유된 경우, 작약의 뿌리, 노루귀의 꽃과 줄기, 모란의 줄기와 뿌리의 경우 대조군과 비교하여 약간의 독성을 보였고, 그 외의 경우에는 세포생존율에 영향을 주지 않음을 확인하였다.

실험예 2: 추출물별 성분 확인 및 함량 시험

미나리아재비목(Ranunculales)에 속하는 식물을 부위별로 세포배양하여 증식시키고 증식된 부위별 세포에서 이차대사산물인 폴리페놀 화합물(polyphenolic compounds)함량을 높이기 위하여 물리적 및 화학적 유인제(elicitor)를 이용하였다.

미나리아재비목(Ranunculales)에 속하는 식물세포의 부위별로 이차대사산물인 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀성 화합물의 함량을 높이기 위한 방법에는,

1. 미나리아재비목(Ranunculales)에 속하는 식물 부위별 세포배양시 200μM 메틸자스몬산(methyl jasmonic acid, MeJA)을 MS배지에 넣어서 배양한다.

2. 미나리아재비목(Ranunculales)에 속하는 식물 부위별 세포배양체를 고주파 세포 배양기에서 배양하면서 하루동안 고주파(RF)를 240 또는 270kHz로 하여 5분 간격으로 3번 처리하고 이를 일주일 또는 이주일간 반복하였다.

또한, 본 발명에 따른 미나리아재비목(Ranunculales) 부위별 세포배양추출물의 주요성분 중 항산화 효과와 관련된 페놀성 물질, 플라보노이드에 대한 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 확인하기 위해 아래와 같이 실험을 수행하였다.

총 페놀 함량 측정

추출액 1ml에 증류수 10ml을 첨가한 후, 2ml의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2ml 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 시킨 후 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 680nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지표물질은 갈릭산(gallic acid, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표 물질의 농도별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 표에 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

미나리아재비목(Ranunculales) 부위별 세포배양추출물 1.5ml에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl36H2O을 혼합한 다음 상온에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 367nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 카테킨(catechin, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표 물질의 농도별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 표에 나타내었다.

상기 표의 결과 미나리아재비목 식물중 MeJA 유인제 처리에 의하여 아네모네에서 부위별로 유도된 세포 배양 추출물이 폴리페놀함량, 플라보노이드 함량이 높게 나타내었고, Radiofrequency 유인제 처리에 의하여 작약, 할미꽃, 연, 수련에서 부위별로 유도된 세포배양 추출물이 높은 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량을 나타내었다. MeJA나 Radiofrequency에 의한 유인제 의해서 미나리아재비목 식물중 다른 부위에 비해 태좌세포배양추출물이 가장 높은 폴리페놀함량, 플라보노이드 함량을 보여주었다.

실험예 3: 미나리아재비목 식물 태좌세포배양추출물의 항산화 효과 ( ABTS Radical Scavenging Activity )

ABTS radical을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법을 변형하여 측정하였다.

1.0 mM의 AAPH(2,2'-azo-bis 2-amidinopropanedeihydrochloride)는 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68℃ 의 항온조에서 12분 동안 반응시켰다. 2% 농도 실시예1의 추출물 20㎕ 와 980㎕ ABTS 용액을 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox 0.1 % 을 사용하였다. ABTS radical 소거능은 다음의 수학식 2에 따라 계산하였으며, 결과는 표 3과 같았다.

[수학식 2]

상기 표에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 조성물인 2% 농도의 미나리아재비목 식물부위별 중 태좌세포배양추출물이 다른 부위에서 유도된 세포배양추출물보다 가장 우수한 항산화능을 보임을 확인하였다. 특히, MeJA, RF 유인제 처리에 의해 더 높은 항산화능을 보이는 것으로 나타났다.

실험예 4: B16F10 malanoma cell 을 이용한 melanogenesis 저해 측정

Melanin 생성 세포인 B16F10을 10% FBS, 1% antibiotics를 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5%, CO2 조건에서 배양하였다. 2%의 미나리아재비목 식물 태좌세포배양추출물에 의한 melanin 생성량 변화를 확인하기위해 B16F10 cell을 1.5×10 ³ cells/well의 농도로 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 현탁시켰다. 현탁세포 (5ml)를 tissue culture flask에 넣은 후 1일간 부착시킨다. 부착한 후에 검정 시료를 첨가한 후, 5% CO2 조건으로 37에서 5일간 배양하였다. 배양을 마친 B16F10 cell을 phosphate buffered saline (PBS)로 씻고 trypsinization 하였다. 세포를 corning tube에 모은 후 1×10 ⁶ cell/ 당 1N NaOH 용액 1을 넣어 세포를 녹인 다음, microplate reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 melanogenesis 저해율을 구하였다.

[수학식 3]

Inhibition of melanogenesis (%) = [1 - (Absample/Abcontrol)]× 100

본 발명에서 미나리아재비목 식물의 부위별 세포배양추출물이 B16/F10 melanoma cell의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 2% 농도로 처리하여 3일간 배양한 후 총 멜라닌 양을 측정하였다. 그 결과, 2% 미나리아재비목 식물의 부위별 세포배양추출물에 의한 미백효과는 태좌부위에서만 멜라닌 합성을 감소시킴을 확인하였고, 나머지 부위에서의 미백효과는 미비하였다. 또한, 200μM 메틸자스몬산(methyl jasmonic acid) 유인제 처리에 의해서 배양된 부위별 세포의 경우, 태좌세포배양 추출물은 유인제를 처리하지 않은 경우보다 2 배정도 멜라닌 합성을 감소시키는 것으로 나타났다.

실험예 5: Procollagen 합성 증진 시험

인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO ₂ 배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×10 ⁵ 개/ml로 24 well plate에 500㎕ 씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 대조군(DMEM 배지)과 2%의 농도의 실시예 1에서 얻은 미나리아재비목 식물 부위별 세포배양추출물을 함유한 배지를 넣고 48시간동안 37℃, 5% CO ₂ 배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕을 취해 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit(PICP, Takara, Cat No. MK101)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. PICP양은 ng/1×10 ⁵ 세포로 환산하였으며, 하기 수학식에 따라 계산하여 그 결과는 표 5에 나타나 있다.

[수학식 4]

상기 표에서 볼 수 있듯이, 실시예1의 2% 농도로 미나리아재비목 식물 부위별 중 태좌세포배양추출물을 처리함에 따라 Procollagen 생합성량을 크게 증가시킴을 확인할 수 있었고, 또한, 200μM 메틸자스몬산(methyl jasmonic acid) 유인제 처리에 의해서 배양된 부위별 세포의 경우, 태좌세포배양 추출물은 유인제를 처리하지 않은 경우보다 2.5배정도 Procollagen 생합성량 증가를 보였다.

실험예 6: iNOS 활성 저해에 의한 항염효과 실험

Raw 264.7 세포주로부터 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO ₂ ^- 형태로서 Griess시약을 이용하여 측정하였다. 1g LPS로 활성화된 Raw 264.7 cell에서 NO 생성 억제를 측정하기 위해, 2% 농도의 미나리아재비목 식물 부위별 세포배양추출물을 처리한 실험군과 대조군을 24시간 세포배양 한 후 Griess reagent를 세포배양 상층액 100㎕와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid, 1% -naphthylamide in H ₂ O)100㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO ₂ ^- 의 농도는 sodium nitrate를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 얻었다.

상기 표에서와 같이, iNOS의 활성은 2% 농도의 미나리아재비목 식물의 부위별 중 태좌세포배양추출물 처리에 의하여 대조군과 비교하여 NO 생산을 저해하며 가장 우수한 염증 억제 효과를 보였다. 또한, 유인제로 고주파 세포배양기에서 배양하면서 하루동안 고주파를 240~270 kHz로 5분 간격으로 3번 처리하고, 이를 이주일간 반복처리하며 배양된 부위별 세포의 경우, 태좌세포배양 추출물은 유인제를 처리하지 않은 경우보다 1.8배정도 iNOS 활성을 보였고, 다른 부위 세포배양 추출물은 효과가 미비하였다.

실험예 7: 피부 보습 효능 실험

1. 아네모네

2. 작약

3. 노루귀