本発明は、腫瘍細胞(がん細胞)の増殖を抑制し得る人為的に合成された抗腫瘍ペプチドとその利用に関する。 なお、本出願は2011年12月20日に出願された日本国特許出願2011−278973号および日本国特許出願2011−278974号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。

腫瘍細胞(がん細胞)の特徴の一つとして正常細胞に比べて細胞分裂が活発に行われ、その結果として細胞増殖速度が著しく高いことが挙げられる。従って、腫瘍細胞の死滅もしくは増殖阻害を目的とする抗がん剤の多くは、腫瘍細胞(がん細胞)の細胞分裂を阻害する薬剤である。例えば、アルキル化剤は、腫瘍細胞(がん細胞)のDNAに作用して二重鎖の塩基同士を架橋することにより、DNAの複製を妨害して細胞分裂を阻止する薬剤である。また、5−FU等の代謝拮抗剤はDNAの合成を阻害して細胞分裂を阻止する薬剤である。

かかる腫瘍細胞(がん細胞)の活発な細胞分裂を阻害する薬剤(抗がん剤)として、アミノ酸残基数が比較的短い低分子量の生理活性ペプチドから成る薬剤の開発が期待されている。生理活性ペプチドから成る薬剤は、従来の化学物質から成る抗がん剤と比較して副作用の低減が期待されるとともに、特定の標的細胞(がん細胞)のみに作用することが期待される。例えば、特許文献1や特許文献2には、アミノ酸残基数が50以下のような短い抗腫瘍ペプチド(抗がんペプチド)が開示されている。

国際公開第2008/081812号公報

国際公開第2007/004869号公報

国際公開第2009/093692号公報

国際公開第2011/013698号公報

国際公開第2011/013699号公報

プロテインエンジニアリング、デザイン&セレクション(Protein Engineering, Design & Selection)、18巻(2号)、2005年、pp.85−91

ジャーナル・オブ・アンチマイクロバイアルケモセラピー(Journalof Antimicrobial Chemotherapy)、54巻(1号)、2004年、pp.278−280

本発明は、上記特許文献に記載されているような従前の抗腫瘍ペプチドとは作用機序の異なる新たな抗腫瘍性(抗がん性)のペプチドならびに該ペプチドを成分とする少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制するための抗腫瘍組成物(抗がん性の組成物)を提供することを目的として創出されたものである。

本発明者は、上記非特許文献1或いは非特許文献2において報告された幾つかのペプチド、具体的には、原核生物である細菌に存在し、細菌の細胞分裂に関与するZリングと呼ばれるタンパク質集合体を構成するタンパク質であるフィラメント状温度感受性変異株Z(Filamenting temperature-sensitive mutant Z:FtsZ)タンパク質、或いは、該FtsZタンパク質のC末端側に結合してFtsZタンパク質を細胞膜に繋ぎ止めるアンカーとして機能することが知られているフィラメント状温度感受性変異株A(Filamenting temperature-sensitive mutant A:FtsA)タンパク質の活性(即ち、FtsZタンパク質のGTPアーゼ活性またはFtsAタンパク質のATPアーゼ活性)を阻害するペプチドとして、一般的なファージディスプレー法を採用して単離された幾つかのペプチド(即ちFtsZインヒビターまたはFtsAインヒビターとして機能し得るペプチド)に着目した。 そして、これらFtsZインヒビターまたはFtsAインヒビターとして機能し得るペプチドを種々の腫瘍細胞(がん細胞)に供給すると、該腫瘍細胞(がん細胞)中に正常な二極性の紡錘体ではなく多極紡錘体、即ち細胞中に多数の中心体(中心体の周辺物質(Pericentriolar material:PCM)の断片である場合を包含する。以下同じ。)が散在し該散在した多数の中心体を極として二極性とは異なり該多数の中心体の各々からランダムに伸びる紡錘体(多極紡錘体)が高頻度に形成され得ることを見出した。 さらに、かかる多極紡錘体の形成(以下、単に「多極化」ともいう。)を誘導することによって、正常な細胞分裂が阻害され、対象(標的)とする腫瘍細胞(がん細胞)の増殖を阻止若しくは抑制し得ることを確認して本発明を完成するに至った。 本明細書において、用語「腫瘍細胞」は「がん細胞」と同義であり、がん化(悪性腫瘍化)していない正常細胞と区分するために使用される用語である。

上記の目的を実現するべく、本発明によると以下の構成の組成物が提供される。即ち、ここで開示される組成物の一態様は、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制するための組成物であって、該少なくとも一種の腫瘍細胞中に多極紡錘体の発生を誘導し得る抗腫瘍ペプチドと、薬学上許容され得る少なくとも一種の担体とを備えている。 そして、上記抗腫瘍ペプチドとして、FtsZインヒビターまたはFtsAインヒビターとして機能する以下のアミノ酸配列: (1)CSSATGKSC (配列番号1); (2)CLAPSPSKC (配列番号2); (3)CLGQTKMRC (配列番号3); (4)CGHRPYQYC (配列番号4); (5)CWAFPLHHC (配列番号5); (6)CTLNSHSNC (配列番号6); (7)CEISAKRTC (配列番号7); (8)CHILHAQAC (配列番号8); (9)CPRPPSLEC (配列番号9); (10)CTGHWASEC (配列番号10); (11)CSYEKRPMC (配列番号11); (12)CLTKSYTSC (配列番号12); (13)SVSVGMKPSPRP (配列番号13); (14)FTTSNHTSRHGS (配列番号14); (15)TPSLPPTMFRLT (配列番号15); (16)GPHHYWYHLRLP (配列番号16); (17)QSPVNHHYHYHI (配列番号17); (18)NMTTYPMHNNTV (配列番号18); (19)SLLPHSNHAKHY (配列番号19); (20)EFEYFHPATFRL (配列番号20); (21)GPHLGMNQRRRP (配列番号21); (22)GAVTYSRISGQY (配列番号22); のうちの何れかのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列から成る合成ペプチドを含有することを特徴とする。

かかる構成の組成物によると、上記アミノ酸配列の合成ペプチド(抗腫瘍ペプチド)を含有する結果、該組成物(該抗腫瘍ペプチド)を対象(標的)とする腫瘍(即ち該腫瘍組織を構成している腫瘍細胞)に供給することにより、該組織を構成する腫瘍細胞中(典型的にはM期の細胞中)に3個以上(典型的には5個以上、好ましくは8個以上)の中心体を生じさせ、それら複数の中心体を極とする多極紡錘体の発生を誘導することができる。これにより、多極紡錘体が形成された細胞(多極化細胞)の細胞分裂が阻害され、結果、腫瘍細胞の増殖を阻止若しくは抑制することができる。

また、ここで開示される組成物の他の好ましい一態様は、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制するための組成物であって、該少なくとも一種の腫瘍細胞の多極化を誘導し得る抗腫瘍ペプチドと、薬学上許容され得る少なくとも一種の担体とを備えている。 そして、上記抗腫瘍ペプチドとして、FtsZインヒビターまたはFtsAインヒビターとして機能する以下のアミノ酸配列: (1)CSSATGKSC (配列番号1); (2)CLAPSPSKC (配列番号2); (3)CLGQTKMRC (配列番号3); (4)CGHRPYQYC (配列番号4); (5)CWAFPLHHC (配列番号5); (6)CTLNSHSNC (配列番号6); (7)CEISAKRTC (配列番号7); (8)CHILHAQAC (配列番号8); (9)CPRPPSLEC (配列番号9); (10)CTGHWASEC (配列番号10); (11)CSYEKRPMC (配列番号11); (12)CLTKSYTSC (配列番号12); (13)SVSVGMKPSPRP (配列番号13); (14)FTTSNHTSRHGS (配列番号14); (15)TPSLPPTMFRLT (配列番号15); (16)GPHHYWYHLRLP (配列番号16); (17)QSPVNHHYHYHI (配列番号17); (18)NMTTYPMHNNTV (配列番号18); (19)SLLPHSNHAKHY (配列番号19); (20)EFEYFHPATFRL (配列番号20); (21)GPHLGMNQRRRP (配列番号21); (22)GAVTYSRISGQY (配列番号22); のうちの何れかのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列と、核小体局在シグナル(NoLS)を構成するアミノ酸配列であって配列番号23〜配列番号30のうちから選択される何れかの配列番号のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列とから成る合成ペプチドを含有することを特徴とする。

本発明者は、核小体局在シグナル(NoLS:Nucleolar localization signal)として知られるアミノ酸配列(特許文献3、4及び5参照)が細胞外から核内(典型的には核小体)へのペプチド移行に関与するアミノ酸配列であることを見出しており、該アミノ酸配列を含むように構成された合成ペプチド(NoLS付き抗腫瘍ペプチド)を使用することにより、対象とする腫瘍組織(腫瘍細胞)により効率よく抗腫瘍ペプチドを導入することができる。従って、本態様の組成物(抗腫瘍ペプチド)の利用により、多極化細胞の形成効率が向上し、より効果的に腫瘍細胞の増殖を阻止若しくは抑制することができる。

また、本発明は、ここで開示される何れかの組成物を、対象とする腫瘍細胞に対して(例えば生体外において、或いは生体内において)少なくとも1回供給することを特徴とする、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。 かかる構成の方法では、上述した何れかのアミノ酸配列から成る合成ペプチド(抗腫瘍ペプチド)を腫瘍細胞に供給することによって、該腫瘍細胞を多極化して細胞分裂を阻害し、結果として対象とする腫瘍細胞(腫瘍:癌組織)の増殖を阻止若しくは抑制することができる。 好ましい一態様では、ここで開示される方法によって、扁平上皮癌を構成する腫瘍細胞若しくは腺癌を構成する腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制することができる。

図1は、HeLa細胞の培養液にサンプルペプチド(サンプル1)を培養液中の濃度が50μMとなるように添加して24時間培養した後、培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真(画像)であり、DAPIによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた(マージした)画像である。

図2は、HeLa細胞の培養液にサンプルペプチド(サンプル9)を培養液中の濃度が50μMとなるように添加して24時間培養した後、培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真(画像)であり、DAPIによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた(マージした)画像である。

図3は、HeLa細胞の培養液にサンプルペプチド(サンプル13)を培養液中の濃度が100μMとなるように添加して24時間培養した後、培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真(画像)であり、DAPIによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた(マージした)画像である。

図4は、HeLa細胞の培養液にサンプルペプチド(サンプル16)を培養液中の濃度が100μMとなるように添加して24時間培養した後、培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真(画像)であり、DAPIによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた(マージした)画像である。

図5は、HeLa細胞の培養液にサンプルペプチド(サンプル21)を培養液中の濃度が100μMとなるように添加して24時間培養した後、培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真(画像)であり、DAPIによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた(マージした)画像である。

図6は、HeLa細胞の培養液にサンプルペプチド(サンプル35)を培養液中の濃度が100μMとなるように添加して24時間培養した後、培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真(画像)であり、DAPIによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた(マージした)画像である。

以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項(例えばここで開示される抗腫瘍ペプチドの一次構造)以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄(例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項)は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した1文字表記(但し配列表では3文字表記)で表す。 また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。

本明細書において「合成ペプチド」とは、人為的な化学合成或いは生合成(即ち遺伝子工学に基づく生産)によって製造されるペプチド断片をいう。 また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね50以下(例えば30以下)のような比較的分子量の小さいものをいう。 また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸及びC末端アミノ酸を包含する用語である。

本明細書において「腫瘍」とは、広義に解釈される用語であり、癌腫及び肉腫或いは血液や造血組織の病変(白血病、リンパ腫等)を含む腫瘍一般(典型的には悪性腫瘍)をいう。また、「腫瘍細胞」とは、そのような腫瘍を形成する細胞であって、典型的には周辺の正常組織とは無関係に異常に増殖を行うに至った細胞(所謂がん化した細胞)をいう。従って、特別に規定しない限り、正常細胞ではなく腫瘍細胞(がん細胞)に区分される細胞であれば、該細胞の起源や性状に関わりなく腫瘍細胞と呼称される。上皮性腫瘍(扁平上皮癌、腺癌等)、非上皮性腫瘍(各種の肉腫、骨肉腫等)、各種の細胞腫(神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等)、リンパ腫、メラノーマ等を構成する細胞は、ここでいう腫瘍細胞に包含され得る。 また、本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能(例えば上記抗腫瘍ペプチドが有する多極化誘導能やNoLSが有する細胞外から核内への移行能)を損なうことなく、1個又は数個(例えば2個又は3個)のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加(挿入)されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、1個又は数個(典型的には2個又は3個)のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換(conservative amino acid replacement)によって生じた配列(例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列:例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換)、或いは、所定のアミノ酸配列について1個又は数個(典型的には2個又は3個)のアミノ酸残基が付加(挿入)した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示される抗腫瘍ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において1個又は数個(典型的には2個又は3個)のアミノ酸残基が置換(例えば上記同類置換)、欠失及び/又は付加したアミノ酸配列であって、同様に多極化誘導性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。 また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー(核酸)を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのDNAフラグメント及びRNAフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖(全長)がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成(即ち遺伝子工学に基づく生産)によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。

ここで開示される組成物は、本発明者によって初めて所定の腫瘍細胞において上述の多極化を誘導し得るという作用が見出されたアミノ酸配列から成る抗腫瘍ペプチド若しくは該ペプチドのアミノ酸配列のN末端側若しくはC末端側にNoLSを連結して構成されるNoLS付き抗腫瘍ペプチドを有効成分として含有する腫瘍細胞の増殖を抑制するための組成物(以下、「抗腫瘍組成物」と略称する場合がある。)である。腫瘍細胞の増殖阻害剤ともいう。 ここで開示される抗腫瘍ペプチドの幾つかは、配列番号1〜配列番号22のうちの何れかの配列番号に示すアミノ酸配列(又はその改変配列)から構成される。これらアミノ酸配列から成るペプチドは、上述のとおり、上記非特許文献1或いは非特許文献2において報告されたように、ある種の細菌に対してFtsAインヒビター(配列番号1〜10,13〜21)またはFtsZインヒビター(配列番号11〜12,22)として機能し得るペプチドである。しかし、従来、かかるFtsAインヒビターまたはFtsZインヒビターとして機能し得る種々のペプチドが腫瘍細胞(真核細胞)において多極化を誘導することは全く知られておらず、そのことを示唆するものも存在しない。

或いはまた、ここで開示される抗腫瘍ペプチドの幾つかは、配列番号1〜配列番号22のうちの何れかの配列番号に示すアミノ酸配列(又はその改変配列)と、以下に示す配列番号23〜配列番号30: (23)KKRTLRKNDRKKR (配列番号23); (24)WRRQARFK (配列番号24); (25)RSRKYTSWYVALKR (配列番号25); (26)MAKSIRSKHRRQMRMMKRE (配列番号26); (27)MARRRRHRGPRRPRPP (配列番号27); (28)GRCRRLANFGPRKRRRRRR (配列番号28); (29)RRRKRNRDARRRRRKQ (配列番号29); (30)MQRKPTIRRKNLRLRRK (配列番号30); のうちの何れかの配列番号に示すNoLSを構成するアミノ酸配列(又はその改変配列)とから構成される。これら列挙したアミノ酸配列はいずれもNoLSとして知られており、その情報は例えばNCBI(National Center for Biotechnology Information)が提供するタンパク質のアミノ酸配列データベースから得ることができる。 即ち、配列番号23のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの1種であるヒト内皮細胞に存在するLIMキナーゼ2(LIM Kinase 2)の第491番目のアミノ酸残基から第503番目のアミノ酸残基までの13個のアミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 配列番号24のアミノ酸配列は、コロナウイルス属に属するIBV(トリ伝染性気管支炎ウイルス:avian infectious bronchitis virus)のNタンパク質(nucleocapsid protein)に含まれる8個のアミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 配列番号25のアミノ酸配列は、FGF2(塩基性線維芽細胞増殖因子)由来の合計14アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 配列番号26のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の一種(ApLLP)由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 配列番号27のアミノ酸配列は、HSV−1(単純ヘルペスウイルス タイプ1)のタンパク質(γ(1)34.5)由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 配列番号28のアミノ酸配列は、HIC(human I-mfa domain-containing protein)のp40タンパク質由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 配列番号29のアミノ酸配列は、MDV(Marek病ウイルス)のMEQタンパク質由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 配列番号30のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計17アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。 これら配列番号に示されるNoLSを上記配列番号1〜配列番号22のうちの何れかの配列番号に示すアミノ酸配列(又はその改変配列)のN末端側若しくはC末端側に配置することにより、好適な抗腫瘍ペプチド(合成ペプチド)を構築することができる。

ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基(典型的にはペプチド鎖のC末端アミノ酸残基)のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性(例えばプロテアーゼ耐性)を向上させることができる。 ここで開示される抗腫瘍ペプチドはアミノ酸残基数が比較的少ない(典型的には30以下)鎖長の短いペプチドである。このため、化学合成が容易であり、容易に抗腫瘍ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション(立体構造)については、使用する環境下(生体外若しくは生体内)で抗腫瘍活性(即ち上記多極化を誘導して細胞分裂ひいては細胞増殖を阻害又は抑制する活性)を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原(抗原)になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、ここで開示される少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制するための組成物(抗腫瘍剤)を作製するのに用いられるペプチドとして好ましい。 なお、ここで開示される抗腫瘍ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がL型アミノ酸であるものが好ましいが、上記多極化を誘導する能力を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がD型アミノ酸に置換されているものであってもよい。

ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてBoc(t-butyloxycarbonyl)或いはFmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)を適用した固相合成法が好適である。 ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、市販のペプチド合成機(例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。)を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾(C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することができる。

或いは、遺伝子工学的手法に基づいて抗腫瘍ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望する抗腫瘍ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(ATG開始コドンを含む。)のポリヌクレオチド(典型的にはDNA)を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド(DNA)と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント(プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。)とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。 一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞(例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞)に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の抗腫瘍ペプチドを得ることができる。 なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。

例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の抗腫瘍ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子(DNA)を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター(例えばノバジェン社から提供されているpETシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているpGEXシリーズのようなGST(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター)の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞(典型的には大腸菌)を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素(プロテアーゼ)で切断し、遊離した目的のペプチド断片(設計した抗腫瘍ペプチド)をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム(例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるGST/Hisシステムを利用し得る。)を用いることによって、ここで開示される抗腫瘍ペプチドを製造することができる。 或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型DNA(即ち抗腫瘍ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片)を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物(ATP、RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等)を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット(例えば、日本の東洋紡績(株)から入手可能なPROTEIOS(商標)Wheat germ cell-free protein synthesis kit)が市販されている。

ここで開示される抗腫瘍ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び/又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造(合成)することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、抗腫瘍ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、DNA合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド(一本鎖)を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖DNAを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段(典型的にはPCR)を採用して目的の二本鎖DNAを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもよく、RNA(mRNA等)の形態であってもよい。DNAは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖(センス鎖)であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖(アンチセンス鎖)であってもよい。 こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、抗腫瘍ペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。

ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、少なくとも1種の腫瘍細胞に作用し、(典型的にはM期の)該腫瘍細胞中に多数の中心体(典型的には一つの細胞中に3個以上、好ましくは5個以上、特に好ましくは8個以上、さらに好ましくは10個以上、例えば3〜20個程度の中心体)を生じさせ、それに対応する数の多極紡錘体が形成されることを誘導することができる。かかる多極紡錘体の形成により、正常な細胞分裂は阻害され、結果として当該腫瘍細胞を増殖させることなく死に至らしめることができる。このため、腫瘍細胞の増殖を抑制(或いは阻害)する用途の組成物(即ち、抗腫瘍剤等の薬学的組成物)の有効成分として好適に使用し得る。なお、抗腫瘍ペプチドは、上記多極化の形成誘導活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記多極化の形成誘導活性を有する限り、他の塩(例えば金属塩)であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。

ここで開示される抗腫瘍組成物は、有効成分である抗腫瘍ペプチドの上記多極化を誘導する能力が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学(医薬)上許容され得る種々の担体を含み得る。例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体を適用し得る。 ここで開示される組成物(即ち抗腫瘍組成物)の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール(エタノール等)水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、抗腫瘍組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。 抗腫瘍組成物(抗腫瘍剤)の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液(例えばPBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。 なお、抗腫瘍ペプチド(主成分)及び種々の担体(副成分)を材料にして種々の形態の組成物(薬剤)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。

ここで開示される抗腫瘍組成物(抗腫瘍ペプチド)の適用対象細胞は、腫瘍細胞であって多極化を誘導し得る腫瘍細胞(がん細胞)であれば特に制限されず、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に発生する種々のタイプの腫瘍細胞に対して適用可能である。例えば、扁平上皮癌を構成する細胞、腺癌を構成する細胞、或いは、神経芽細胞腫(神経芽腫)、網膜芽細胞腫、褐色細胞腫その他の細胞腫を構成する細胞が挙げられる。

ここで開示される抗腫瘍組成物は、従来のペプチド製剤と同様、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)の患部(典型的には悪性腫瘍組織)に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織(即ち腫瘍細胞を含む組織や器官等の患部)に投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護(コーティング)材の適用が好ましい。 或いは、生体外(インビトロ)において培養している腫瘍細胞(生体から摘出された細胞塊又は組織又は器官である場合を包含する。)に対し、ここで開示される抗腫瘍組成物の適当量(即ち抗腫瘍ペプチドの適当量)を、対象とする培養細胞(組織等)の培地に供給するとよい。 1回当たりの供給量及び供給回数は、培養する腫瘍細胞の種類、細胞密度(培養開始時の細胞密度)、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されないが、培地中の抗腫瘍ペプチド濃度が概ね20μM〜200μMの範囲内、好ましくは50μM〜100μMの範囲内となるように、1回〜複数回添加することが好ましい。

以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。

<実施例1:ペプチド合成> 表1、2に示す各アミノ酸配列から成る計44種類の合成ペプチドを、後述するペプチド合成機を用いて製造した。なお、以下の説明では、合成した計44種類のペプチドをサンプル1〜44と呼称する。

各サンプルは、表1、2(及び配列表)に示す何れかのアミノ酸配列を有するように構成されている。具体的には、サンプル1〜12は、上記非特許文献1若しくは非特許文献2に記載のFtsAインヒビター(配列番号1〜10)またはFtsZインヒビター(配列番号11〜12)として機能し得るペプチドであり、何れもN末端及びC末端のアミノ酸残基がシステインであることを特徴とする計9アミノ酸残基から成る合成ペプチドである。サンプル13〜22は、上記非特許文献1若しくは非特許文献2に記載のFtsAインヒビター(配列番号13〜21)またはFtsZインヒビター(配列番号22)として機能し得るペプチドであり、何れも計12アミノ酸残基から成る合成ペプチドである。 また、サンプル23〜44は、それぞれ、サンプル1〜22の各ペプチドのアミノ酸配列のC末端側に、上記配列番号23のNoLSを構成するアミノ酸配列を連結したことを特徴とする計22アミノ酸残基(サンプル23〜34)または計25アミノ酸残基(サンプル35〜44)から成る合成ペプチドである。 いずれのペプチドも、市販のペプチド合成機(Intavis AG社製品)を用いてマニュアルどおりに固相合成法(Fmoc法)を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。 合成した各サンプルは、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)に溶かし、ペプチド濃度が1mMのストック液を調製した。

<実施例2:各合成ペプチドの抗腫瘍活性(多極化誘導能)評価試験1> 上記実施例1において得られたサンプルペプチドのうちの幾つかの抗腫瘍活性を、培養腫瘍細胞を対象にして調べた。評価試験の詳細は以下のとおりである。 供試腫瘍細胞として市販のマウス神経芽細胞腫の細胞株(N1E−115)を使用した。かかる細胞株を予めDMEM培地(即ち、10%のウシ胎児血清(FBS:Gibco社製品)、2mMのL−グルタミン、50ユニット/mLのペニシリン、及び50μg/mLのストレプトマイシンを含むダルベッコのMEM培地(DMEM培地:Gibco社製品))で培養し、96穴(ウェル)プレートの1ウェルあたりの細胞数が約5×10³個となるように調整した。このときの培地量はウェルあたり100μLとした。 次いで、ウェル中のペプチド濃度が50μM或いは100μMとなるように、表3に示す何れかのサンプルペプチドの上記ストック液を各ウェルに注入した。

上記のようにしてサンプルペプチドを添加後、当該96穴(ウェル)プレートを、CO₂インキュベータ内に配置し、37℃、5%CO₂条件下で静置培養した。そして、ペプチド添加時(処理開始時)、ペプチド添加培養開始から6時間或いは24時間を経過して時点において、供試培養細胞の生存状態を市販の発色測定キットを使用して測定した。即ち、細胞培養ウェルに発色試薬として「水溶性テトラゾリウム塩(WST−8)」を添加し、添加から2時間インキュベート後、該発色試薬を添加した細胞培養液を回収するとともにテトラゾリウム塩の還元に基づき波長450nmの吸光度(波長620nmの吸光度で補正した値:A450−A620)を測定する比色法により、細胞増殖阻害の程度を評価した。そして、サンプルペプチド添加時(処理開始時)の吸光度を基準として6時間或いは24時間経過時の吸光度の減少率を細胞増殖阻害率(%)とした。結果を表3に示す。

表3に示すように、本実施例において使用したサンプルペプチドは何れも供試腫瘍細胞(マウス神経芽細胞腫:N1E−115)の増殖を阻害した。特に、サンプル1のペプチドや、NoLSが付加されたサンプル23、24、26、38、42、43のペプチドについて、高い抗腫瘍活性(腫瘍細胞増殖阻害活性)が認められた。一方、詳細な結果は示していないが、供試細胞として正常細胞であるヒト皮膚線維芽細胞(CCD1079sk)やヒト胎児皮膚細胞(WS-1)を使用して同様の試験を行った結果、細胞増殖阻害率は概ね5%未満(典型的には3%未満)であった。このことは、ここで開示されるペプチドが腫瘍細胞に対して特異的に多極化を誘導して当該腫瘍細胞(がん細胞)の増殖を阻止若しくは抑制し得ることを示している。

<実施例3:各合成ペプチドの抗腫瘍活性(多極化誘導能)評価試験2> 供試腫瘍細胞をHeLa細胞(HeLa S3)に代え、上述した実施例2と同様の試験を行った。本実施例では、サンプル1〜7、9、10、13、16、21、35のペプチドを使用した。サンプル1〜7、9、10に係る細胞増殖阻害率(%)を表4に示す。

表4に示すように、本実施例において使用したサンプル1〜7、9、10のペプチドは、何れも供試腫瘍細胞(HeLa細胞)の増殖を阻害した。 また、あわせてペプチドを添加した培養細胞の蛍光顕微鏡観察を行った。ここでは、一例として、サンプル1、9、13、16、21、35に係る観察例を示す。具体的には、各ウェル中のペプチド濃度が50μM(サンプル1、9)または100μM(サンプル13、16、21、35)となるようにペプチドを添加して、24時間経過後、培養細胞についてDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)による核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。また、紡錘体のマーカーとしてα−チューブリンを採用し、当該チューブリンを識別する蛍光色素標識抗チューブリン抗体を用いた蛍光抗体法によって細胞中のチューブリンの存在(即ち紡錘体の存在)を調べた。図1〜6は、DAPIによる染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた(マージした)画像である。 各画像が示すように、サンプル1(図1)、サンプル9(図2)、サンプル13(図3)、サンプル16(図4)、サンプル21(図5)、サンプル35(図6)の何れかのペプチドを添加して培養した培養液中では、図示されるように、多極紡錘体の形成、即ち多極化した細胞(ここではHeLa細胞)が数多く認められた。

<実施例4:各合成ペプチドの抗腫瘍活性(多極化誘導能)評価試験3> 供試腫瘍細胞をヒトの扁平上皮癌を構成する細胞(ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞:A549細胞)に代え、上述した実施例2と同様の試験を行った。本実施例では、サンプル1〜13、15〜22、24、29、35、40のペプチドを使用した。結果を表5に示す。

表5に示すように、本実施例において使用したサンプルペプチドは何れも供試腫瘍細胞(ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞:A549細胞)の増殖を阻害した。なかでも、サンプル1、3、6、11、21のペプチドや、NoLSが付加されたサンプル24、29、35、40のペプチドについて高い抗腫瘍活性(腫瘍細胞増殖阻害活性)が認められた。このことは、ここで開示されるペプチドが、ヒトに発生し得る腫瘍細胞の多極化を誘導し、当該腫瘍細胞(がん細胞)の増殖を阻止若しくは抑制し得ることを示している。

上述のように、ここで開示される抗腫瘍ペプチドによると、腫瘍細胞の多極化を高頻度に誘導し、当該腫瘍細胞の増殖を阻害又は抑制することができる。このため、本発明によって提供される抗腫瘍ペプチドを使用することによって、腫瘍細胞の増殖を阻害若しくは抑制する抗腫瘍組成物(抗腫瘍剤)を提供することができる。

配列番号1〜22,31〜52 合成ペプチド