相互参照 本出願は、2015年12月14日出願の米国仮特許出願第61/267,238号、および2016年4月6日出願の米国仮特許出願第62/319,015号の利益を主張するものであり、該出願は参照によって本明細書に組み込まれる。配列リストへの言及

本出願は配列表を包含しており、これは、EFS−Webを介してASCIIフォーマットで提出され、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。2016年12月12日に作成されたASCIIのコピーは、47991−714_601_SL.txtのファイル名であり、24,385,314バイトのサイズである。前述のファイルは2016年12月12日に作成され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

肝臓病は、推定死亡率が80%の衰弱性で多くの場合致命的な疾病群である。肝臓は、限定されないが、血液から有害な毒素を取り除くこと、グルコースを放出すること、胆汁の生成、鉄分の貯蔵、および感染に対する抵抗を助けることを含む、身体の多くの機能にとって重要である。肝臓の機能不全は他の主要な器官の機能不全を引き起こし、最終的には死に至る。肝臓移植はしばしば死亡率を防ぐ一方で、ドナーの肝臓を受け取る見込みは一般に低い。

肝臓に関連する多くの疾患や疾病があるが、肝臓病の一部は、遺伝子の発現における欠失と同様に遺伝子産物における欠失によって進行することが分かっている。発現の増加により肝臓の疾患または疾病が恩恵を受けることができる遺伝子産物の例としては、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、およびNCOA5が挙げられる。

1つの態様において、本明細書では、被験体の細胞により標的タンパク質または機能的RNAの発現を増加させることによって被験体の肝臓病を処置する方法が開示され、ここで、該細胞は、保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)を有し、該RIC mRNA前駆体は、保持されたイントロン、5’スプライス部位に隣接しているエクソン、および3’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、RIC mRNA前駆体は、標的タンパク質または機能的RNAをコードし、該方法は、被験体の細胞を、標的タンパク質または機能的RNAをコードするRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー(ASO)と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的RNAをコードするRIC mRNA前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能的RNAの発現を増加させる。

いくつかの実施形態において、肝臓病は、グリシン脳症、ツェルヴェーガー症候群、ハイムラー(Heimler)症候群、アデノシンデアミナーゼ欠損症、異型ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症、超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、イソ吉草酸血症、高カイロミクロン血症、高トリグリセリド血症、ガラクトース血症、高コレステロール血症、若年発症成人型1型糖尿病、若年発症成人型2型糖尿病、若年発症成人型3型糖尿病、非インスリン依存型糖尿病、インスリン依存性糖尿病1、インスリン依存性糖尿病20、若年発症成人型糖尿病を伴うファンコーニ尿細管症候群4(Falconi renotubular symdrome)、家族性高インスリン低血糖症3、永続的な新生児糖尿病、肝腺腫、ダウリング・デゴス病4、SHORT症候群、免疫不全症36、無ガンマグロブリン血症7、脂質代謝欠失、肝臓炎症、ヘモクロマトーシス2B型、血小板減少症、非アルコール性脂肪肝疾患、ウィルソン病、チロシン血症1型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、ヘモクロマトーシスI型、アルストレーム症候群、先天性の胆汁酸合成欠損症1、脂肪性肝炎、インシュリン抵抗性、耐糖能障害、II型糖尿病、あるいは肝臓癌である。

1つの態様において、保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)を有している細胞によって、標的タンパク質の発現を増加させる方法が本明細書で提供され、該RIC mRNA前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、RIC mRNA前駆体は標的タンパク質をコードし、該方法は、細胞を、標的タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー(ASO)と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、細胞内で標的タンパク質をコードするmRNAのレベルを増加させ、標的タンパク質の発現を増加させ、ここで、標的タンパク質は、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソバレリルCoA脱水素酵素、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝性核因子−1−アルファアルブミン近位因子、Oグルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子ベータ−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1,3−β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ、インターロイキン6、セラミド合成酵素2、あるいは核受容体コアクチベーター5である。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソバレリルCoA脱水素酵素、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝性核因子−1−アルファアルブミン近位因子、タンパク質Oグルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子ベータ−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1,3−β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ、インターロイキン6、セラミド合成酵素2、あるいは核受容体コアクチベーター5である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的RNAは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的RNAを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的RNAである。

いくつかの実施形態では、細胞は、標的タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体内にあるか、または被験体に由来する。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質の量の不足は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで被験体は、機能的な標的タンパク質をコードする第1の対立遺伝子、標的タンパク質が産生されない第2の対立遺伝子、または非機能的な標的タンパク質をコードする第2の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第1の対立遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の標的部分に結合する。

いくつかの実施形態において、被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、ここで、被験体は、標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、標的タンパク質が生成されない、第1の変異対立遺伝子と、および、標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で生成され、あるいは、標的タンパク質が生成されない、第2の変異対立遺伝子とを有し、ここで、被験体が第1の変異対立遺伝子(a)(iii)を有するとき、第2の変異対立遺伝子は(b)(i)あるいは(b)(ii)であり、ここで、被験体が第2の変異対立遺伝子(b)(iii)を有するとき、第1の変異対立遺伝子は(a)(i)あるいは(a)(ii)であり、ここで、RIC mRNA前駆体は、(a)(i)あるいは(a)(ii)である第1の変異対立遺伝子、および/または、(b)(i)あるいは(b)(ii)である第2の変異対立遺伝子から転写される。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で生成される。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態で生成される。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16までの領域内の保持されたイントロンにある。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+69〜保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−79までの領域内の保持されたイントロンにある。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体の標的部分は、以下の内部の保持されたイントロンにある:保持されたイントロンの5’スプライス部位に対する、+6から+100の領域;あるいは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対する、−16から−100の領域。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体の標的部分は、以下の内部にある:保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域;あるいは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも1つの保持されたイントロンの5’スプライス部位の約500ヌクレオチド下流から、少なくとも1つの保持されたイントロンの3’スプライス部位の約500ヌクレオチド上流までの領域内にあるRIC mRNA前駆体の一部を標的とする。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも1つの保持されたイントロンの5’スプライス部位の約100ヌクレオチド下流から、少なくとも1つの保持されたイントロンの3’スプライス部位の約100ヌクレオチド上流までの領域内にあるRIC mRNA前駆体の一部を標的とする。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、(a)AMT、(b)ADA、(c)PPOX、(d)UROD、(e)HMBS、(f)ACADVL、(g)PC、(h)IVD、(i)APOA5、(j)GALT、(k)LDLRAP1、(l)HNF4A、(m)GCK、(n)POGLUT1、(o)PIK3R1、(p)HNF1A、(q)TRIB1、(r)TGFB1、(s)HAMP、(t)THPO、(u)PNPLA3、(v)ATP7B、(w)FAH、(x)ASL、(y)HFE、(z)ALMS1、(aa)PPARD、(bb)IL6、(cc)HSD3B7、(dd)CERS2、または(ee)NCOA5である。

いくつかの実施形態では、RIC mRNA前駆体の標的部分は、(a)SEQ ID NO2813−3910のいずれか1つ、(b)SEQ ID NO 65847−67281のいずれか1つ、(c)SEQ ID NO 1900−2599のいずれか1つ、(d)SEQ ID NO 926−1779のいずれか1つ、(e)SEQ ID NO 37483−38044のいずれか1つ、(f)SEQ ID NO 49423−49969のいずれか1つ、(g)SEQ ID NO 35900−36292のいずれか1つ、(h)SEQ ID NO 44626−47013のいずれか1つ、(i)SEQ ID NO 36293−37482のいずれか1つ、(j)SEQ ID NO 34521−35899のいずれか1つ、(k)SEQ ID NO 131−925のいずれか1つ、(l)SEQ ID NO 58958−65846、あるいは67532−77374のいずれか1つ、(m)SEQ ID NO 25058−30976のいずれか1つ、(n)SEQ ID NO 3911−5264のいずれか1つ、(o)SEQ ID NO 14473−14876のいずれか1つ、(p)SEQ ID NO 38045−42105のいずれか1つ、(q)SEQ ID NO 32469−34520のいずれか1つ、(r)SEQ ID NO 51972−52025のいずれか1つ、(s)SEQ ID NO 51670−51971のいずれか1つ、(t)SEQ ID NO 5265−14472のいずれか1つ、(u)SEQ ID NO 77375−78348のいずれか1つ、(v)SEQ ID NO 42106−44370のいずれか1つ、(w)SEQ ID NO 44371−44625のいずれか1つ、(x)SEQ ID NO 30977−32468のいずれか1つ、(y)SEQ ID NO 21810−23485のいずれか1つ、(z)SEQ ID NO 2600−2812のいずれか1つ、(aa)SEQ ID NO 14877−21809のいずれか1つ、(bb)SEQ ID NO 23486−25057のいずれか1つ、(cc)SEQ ID NO 47014−49422のいずれか1つ、(dd)SEQ ID NO 1780−1899のいずれか1つ、またはSEQ ID NO 67282−67531のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、または100%相補的な配列を含む。

いくつかの実施形態では、RIC mRNA前駆体の標的部分は、(a)SEQ ID NO 78483、78465、または78434;(b)SEQ ID NO 78385、78482、または78369;(c)SEQ ID NO 78461、78473、78480、または78421;(d)SEQ ID NO 78410、78386、78411、78460、または78463;(e)SEQ ID NO 78355、78467、または78454;(f)SEQ ID NO 78367、78376、78440、78448、78477、78485、78496、78422、または78412;(g)SEQ ID NO 78495、(h)SEQ ID NO 78464、78375、または78380;(i)SEQ ID NO 78407、78499、78420、78372、または78397;(j)SEQ ID NO 78489、78416、78476、78352、78435、78493、78423、78437、または78449;(k)SEQ ID NO 78354、または78459;(l)SEQ ID NO 78441、78392、78456、78428、78491、78501、78360、78429、78358、78364、78475、78391、78479、78401、78373、または78450;(m)SEQ ID NO 78445、78481、78379、78431、78469、78408、78377、78417、78387、78455、78484、または78370;(n)SEQ ID NO 78368、78350、78432、78439、または78389;(o)SEQ ID NO 78390、またはSEQ ID NO 78418、(p)SEQ ID NO 78462、78468、78453、78361、78363、78433、78438、78430、78488、78405、78492、または78427;(q)SEQ ID NO 78487、78486、または78474;(r)SEQ ID NO 78458、(s)SEQ ID NO 78497、または78426;(t)SEQ ID NO 78425、78400、78393、78351、78381、78366、78457、78443、78362、または78446;(u)SEQ ID NO 78388、78402、78471、または78356;(v)SEQ ID NO 78427、78383、78444、または78394;(w)SEQ ID NO 78382;(x)SEQ ID NO 78494、78404、78371、78365、または78353;(y)SEQ ID NO 78419、78384、78500、78424、または78466;(z)SEQ ID NO 78399、(aa)SEQ ID NO 78414、78478、78472、78359、78395、78357、78374、または78490;(bb)SEQ ID NO 78436、78413、78415、78398、または78403;(cc)SEQ ID NO 78349、78470、78498、78406、78442、78451、78396、78409、または78378;(dd)SEQ ID NO 78447;またはSEQ ID NO 78452の少なくとも8つの隣接する核酸を含む領域に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、または100%の配列同一性を備えた配列を含む。

いくつかの実施形態では、ASOは、(a)SEQ ID NO2813−3910のいずれか1つ、(b)SEQ ID NO 65847−67281のいずれか1つ、(c)SEQ ID NO 1900−2599のいずれか1つ、(d)SEQ ID NO 926−1779のいずれか1つ、(e)SEQ ID NO 37483−38044のいずれか1つ、(f)SEQ ID NO 49423−49969のいずれか1つ、(g)SEQ ID NO 35900−36292のいずれか1つ、(h)SEQ ID NO 44626−47013のいずれか1つ、(i)SEQ ID NO 36293−37482のいずれか1つ、(j)SEQ ID NO 34521−35899のいずれか1つ、(k)SEQ ID NO 131−925のいずれか1つ、(l)SEQ ID NO 58958−65846、あるいは67532−77374のいずれか1つ、(m)SEQ ID NO 25058−30976のいずれか1つ、(n)SEQ ID NO 3911−5264のいずれか1つ、(o)SEQ ID NO 14473−14876のいずれか1つ、(p)SEQ ID NO 38045−42105のいずれか1つ、(q)SEQ ID NO 32469−34520のいずれか1つ、(r)SEQ ID NO 51972−52025のいずれか1つ、(s)SEQ ID NO 51670−51971のいずれか1つ、(t)SEQ ID NO 5265−14472のいずれか1つ、(u)SEQ ID NO 77375−78348のいずれか1つ、(v)SEQ ID NO 42106−44370のいずれか1つ、(w)SEQ ID NO 44371−44625のいずれか1つ、(x)SEQ ID NO 30977−32468のいずれか1つ、(y)SEQ ID NO 21810−23485のいずれか1つ、(z)SEQ ID NO 2600−2812のいずれか1つ、(aa)SEQ ID NO 14877−21809のいずれか1つ、(bb)SEQ ID NO 23486−25057のいずれか1つ、(cc)SEQ ID NO 47014−49422のいずれか1つ、(dd)SEQ ID NO 1780−1899のいずれか1つ、またはSEQ ID NO 67282−67531のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、または100%の配列同一性を備えた配列を含む。

いくつかの実施形態では、RIC mRNA前駆体は、(a)SEQ ID NO 41−44、(b)SEQ ID NO 28 121−124、(c)SEQ ID NO37または38、(d)SEQ ID NO33または34、(e)SEQ ID NO 92−95、(f)SEQ ID NO 109−112、(g)SEQ ID NO 87−89、(h)SEQ ID NO 104または105、(i)SEQ ID NO 90または91、(j)SEQ ID NO 85または86、(k)SEQ ID NO 32、(l)SEQ ID NO 115−120、あるいは126−129、(m)SEQ ID NO 76−78、(n)SEQ ID NO 45または46、(o)SEQ ID NO 57−60、(p)SEQ ID NO 96または97、(q)SEQ ID NO 83または84、(r)SEQ ID NO 114、(s)SEQ ID NO 223、(t)SEQ ID NO 47−56、(u)SEQ ID NO 130、(v)SEQ ID NO 98−102、(w)SEQ ID NO 103、(x)SEQ ID NO 80−82、(y)SEQ ID NO 66−73、(z)SEQ ID NO 39、(aa)SEQ ID NO 61−65、(bb)SEQ ID NO 74または75、(cc)SEQ ID NO 106−108、(dd)SEQ ID NO 35または36、あるいはSEQ ID NO 125のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を備えた配列を含む。

いくつかの実施形態では、RIC mRNA前駆体は、(a)SEQ ID NO 6、(b)SEQ ID NO 28、(c)SEQ ID NO 4、(d)SEQ ID NO 2、(e)SEQ ID NO 19、(f)SEQ ID NO 25、(g)SEQ ID NO 17、(h)SEQ ID NO 23、(i)SEQ ID NO 18、(j)SEQ ID NO 16、(k)SEQ ID NO 1、(l)SEQ ID NO 30、(m)SEQ ID NO 13、(n)SEQ ID NO 7、(o)SEQ ID NO 9、(p)SEQ ID NO 20、(q)SEQ ID NO 15、(r)SEQ ID NO 27、(s)SEQ ID NO 26、(t)SEQ ID NO 8、(u)SEQ ID NO 31、(v)SEQ ID NO 21、(w)SEQ ID NO 22、(x)SEQ ID NO 14、(y)SEQ ID NO 11、(z)SEQ ID NO 5、(aa)SEQ ID NO 10、(bb)SEQ ID NO 12、(cc)SEQ ID NO 24、(dd)SEQ ID NO 3、または(ee)SEQ ID NO 29に対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、機能的RNAまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNA前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的RNAの量を増加させない。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的RNAの量を増加させない。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体は、全長のmRNA前駆体の部分的なスプライシング、または野生型のmRNA前駆体の部分的なスプライシングによって生成された。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAは、全長の成熟mRNA、あるいは野生型の成熟mRNAである。

いくつかの実施形態において、生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞において生成された標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAの総量は、対照細胞において生成された標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAの総量と比較して、約1.1〜約10倍、約1.5〜約10倍、約2〜約10倍、約3〜約10倍、約4〜約10倍、約1.1〜約5倍、約1.1〜約6倍、約1.1〜約7倍、約1.1〜約8倍、約1.1〜約9倍、約2〜約5倍、約2〜約6倍、約2〜約7倍、約2〜約8倍、約2〜約9倍、約3〜約6倍、約3〜約7倍、約3〜約8倍、約3〜約9倍、約4〜約7倍、約4〜約8倍、約4〜約9倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、あるいは少なくとも約10倍増加する。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって生成された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって生成された標的タンパク質の総量と比較して、約1.1〜約10倍、約1.5〜約10倍、約2〜約10倍、約3〜約10倍、約4〜約10倍、約1.1〜約5倍、約1.1〜約6倍、約1.1〜約7倍、約1.1〜約8倍、約1.1〜約9倍、約2〜約5倍、約2〜約6倍、約2〜約7倍、約2〜約8倍、約2〜約9倍、約3〜約6倍、約3〜約7倍、約3〜約8倍、約3〜約9倍、約4〜約7倍、約4〜約8倍、約4〜約9倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、あるいは少なくとも約10倍増加する。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、2’−O−メチル、2’−フルオロ、あるいは2’−O−メトキシエチル部分を含む。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも1つの修飾された糖部を含む。

いくつかの実施形態において、それぞれの糖部は修飾された糖部である。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、8〜50の核酸塩基、8〜40の核酸塩基、8〜35の核酸塩基、8〜30の核酸塩基、8〜25の核酸塩基、8〜20の核酸塩基、8〜15の核酸塩基、9〜50の核酸塩基、9〜40の核酸塩基、9〜35の核酸塩基、9〜30の核酸塩基、9〜25の核酸塩基、9〜20の核酸塩基、9〜15の核酸塩基、10〜50の核酸塩基、10〜40の核酸塩基、10〜35の核酸塩基、10〜30の核酸塩基、10〜25の核酸塩基、10〜20の核酸塩基、10〜15の核酸塩基、11〜50の核酸塩基、11〜40の核酸塩基、11〜35の核酸塩基、11〜30の核酸塩基、11〜25の核酸塩基、11〜20の核酸塩基、11〜15の核酸塩基、12〜50の核酸塩基、12〜40の核酸塩基、12〜35の核酸塩基、12〜30の核酸塩基、12〜25の核酸塩基、12〜20の核酸塩基、あるいは12〜15の核酸塩基からなる。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の標的部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、あるいは100%相補的である。

いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の集団を含み、ここで、RIC mRNA前駆体の集団は2つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、RIC mRNA前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する。

いくつかの実施形態において、最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAを生成するRIC mRNA前駆体の集団からの2つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。

いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の集団を含み、ここで、RIC mRNA前駆体の集団は2つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、RIC mRNA前駆体の集団で2番目に豊富な保持されたイントロンに結合する。

いくつかの実施形態において、2番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAを生成するRIC mRNA前駆体の集団からの2つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。

いくつかの実施形態では、疾病は疾患または障害である。

いくつかの実施形態において、疾患または障害は肝臓病である。

いくつかの実施形態において、肝臓病は、グリシン脳症、ツェルヴェーガー症候群、ハイムラー(Heimler)症候群、アデノシンデアミナーゼ欠損症、異型ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症、超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、イソ吉草酸血症、高カイロミクロン血症、高トリグリセリド血症、ガラクトース血症、高コレステロール血症、若年発症成人型1型糖尿病、若年発症成人型2型糖尿病、若年発症成人型3型糖尿病、非インスリン依存型糖尿病、インスリン依存性糖尿病1、インスリン依存性糖尿病20、若年発症成人型糖尿病を伴うファンコーニ尿細管症候群4(Falconi renotubular symdrome)、家族性高インスリン低血糖症3、永続的な新生児糖尿病、肝腺腫、ダウリング・デゴス病4、SHORT症候群、免疫不全症36、無ガンマグロブリン血症7、脂質代謝欠失、肝臓炎症、ヘモクロマトーシス2B型、血小板減少症、非アルコール性脂肪肝疾患、ウィルソン病、チロシン血症1型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、ヘモクロマトーシスI型、アルストレーム症候群、先天性の胆汁酸合成欠損症1、脂肪性肝炎、インシュリン抵抗性、耐糖能障害、II型糖尿病、あるいは肝臓癌である。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質およびRIC mRNA前駆体は遺伝子によってコードされ、遺伝子は、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5が挙げられる。

いくつかの実施形態において、当該方法はタンパク質発現を評価する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。

いくつかの実施形態では、被験体はヒト以外の動物である。

いくつかの実施形態において、被験体は胎児、胚、あるいは子供である。

いくつかの実施形態では、細胞はエクスビボである。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、被験体の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される。

いくつかの実施形態において、5’スプライス部位に隣接するエクソンの−3e〜−1eと、保持されたイントロンの+1〜+6にある9つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。

いくつかの実施形態において、保持されたイントロンの−15〜−1と3’スプライス部位に隣接するエクソンの+1eにある16のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。

1つの態様では、本明細書に記載された方法で使用されるようなアンチセンスオリゴマーが本明細書で提供される。

1つの態様では、SEQ ID NO:131−78348のいずれか1つに対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、あるいは100%の配列同一性を備えた配列を含むアンチセンスオリゴマーが本明細書で提供される。

1つの態様では、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴマーと賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に提供される。

1つの態様では、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって本明細書に記載された医薬組成物を投与することにより、被験体を処置する方法が本明細書に提供される。

1つの態様において、本明細書には、不足しているタンパク質または不足している機能的RNAに関連付けられる被験体の肝臓病を処置するために細胞によって標的タンパク質または機能的RNAの発現を増加させる方法で使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物が開示され、ここで、不足しているタンパク質または機能的RNAは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする、保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)の構成的のスプライシングを増強し、ここで、標的タンパク質は:不足しているタンパク質;あるいは、被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、ここで、機能的RNAは:不足しているRNA;あるいは、被験体の不足している機能的RNAを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償機能的RNAであり、ここでRIC mRNA前駆体は、保持されたイントロン、5’スプライス部位に隣接しているエクソン、および3’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的RNAをコードするRIC mRNA前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体において標的タンパク質または機能的RNAの産生または活性を増加させる。

いくつかの実施形態において、肝臓病は、グリシン脳症、ツェルヴェーガー症候群、ハイムラー(Heimler)症候群、アデノシンデアミナーゼ欠損症、異型ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症、超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、イソ吉草酸血症、高カイロミクロン血症、高トリグリセリド血症、ガラクトース血症、高コレステロール血症、若年発症成人型1型糖尿病、若年発症成人型2型糖尿病、若年発症成人型3型糖尿病、非インスリン依存型糖尿病、インスリン依存性糖尿病1、インスリン依存性糖尿病20、若年発症成人型糖尿病を伴うファンコーニ尿細管症候群4(Falconi renotubular symdrome)、家族性高インスリン低血糖症3、永続的な新生児糖尿病、肝腺腫、ダウリング・デゴス病4、SHORT症候群、免疫不全症36、無ガンマグロブリン血症7、脂質代謝欠失、肝臓炎症、ヘモクロマトーシス2B型、血小板減少症、非アルコール性脂肪肝疾患、ウィルソン病、チロシン血症1型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、ヘモクロマトーシスI型、アルストレーム症候群、先天性の胆汁酸合成欠損症1、脂肪性肝炎、インシュリン抵抗性、耐糖能障害、II型糖尿病、あるいは肝臓癌である。

1つの態様において、被験体において標的タンパク質に関係する疾病を処置する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物が本明細書で提供され、該方法は、被験体の細胞によって標的タンパク質の発現を増加させる工程を含み、ここで、細胞は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)を有し、RIC mRNA前駆体は、標的タンパク質をコードし、該方法は、細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAのレベルを増加させ、標的タンパク質の発現を増加させる。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソバレリルCoA脱水素酵素、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝性核因子−1−アルファアルブミン近位因子、タンパク質Oグルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子ベータ−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1,3−β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ、インターロイキン6、セラミド合成酵素2、あるいは核受容体コアクチベーター5である。

いくつかの実施形態では、疾病は疾患または障害である。

いくつかの実施形態において、疾患または障害は肝臓病である。

いくつかの実施形態において、肝臓病は、グリシン脳症、ツェルヴェーガー症候群、ハイムラー(Heimler)症候群、アデノシンデアミナーゼ欠損症、異型ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症、超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、イソ吉草酸血症、高カイロミクロン血症、高トリグリセリド血症、ガラクトース血症、高コレステロール血症、若年発症成人型1型糖尿病、若年発症成人型2型糖尿病、若年発症成人型3型糖尿病、非インスリン依存型糖尿病、インスリン依存性糖尿病1、インスリン依存性糖尿病20、若年発症成人型糖尿病を伴うファンコーニ尿細管症候群4(Falconi renotubular symdrome)、家族性高インスリン低血糖症3、永続的な新生児糖尿病、肝腺腫、ダウリング・デゴス病4、SHORT症候群、免疫不全症36、無ガンマグロブリン血症7、脂質代謝欠失、肝臓炎症、ヘモクロマトーシス2B型、血小板減少症、非アルコール性脂肪肝疾患、ウィルソン病、チロシン血症1型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、ヘモクロマトーシスI型、アルストレーム症候群、先天性の胆汁酸合成欠損症1、脂肪性肝炎、インシュリン抵抗性、耐糖能障害、II型糖尿病、あるいは肝臓癌である。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質およびRIC mRNA前駆体は遺伝子によってコードされ、遺伝子は、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5が挙げられる。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6から、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16までの領域内の保持されたイントロンにあるRIC mRNA前駆体の一部を標的とする。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはRIC mRNA前駆体の一部を標的とし、これは、以下の内部の保持されたイントロンにある:保持されたイントロンの5’スプライス部位に対する、+6から+100の領域;あるいは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対する−16から−100の領域。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも1つの保持されたイントロンの5’スプライス部位の約500ヌクレオチド下流から、少なくとも1つの保持されたイントロンの3’スプライス部位の約500ヌクレオチド上流までの領域内にあるRIC mRNA前駆体の一部を標的とする。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも1つの保持されたイントロンの5’スプライス部位の約100ヌクレオチド下流から、少なくとも1つの保持されたイントロンの3’スプライス部位の約100ヌクレオチド上流までの領域内にあるRIC mRNA前駆体の一部を標的とする。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体の標的部分は、以下の内部にある:保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域;あるいは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、(a)AMT、(b)ADA、(c)PPOX、(d)UROD、(e)HMBS、(f)ACADVL、(g)PC、(h)IVD、(i)APOA5、(j)GALT、(k)LDLRAP1、(l)HNF4A、(m)GCK、(n)POGLUT1、(o)PIK3R1、(p)HNF1A、(q)TRIB1、(r)TGFB1、(s)HAMP、(t)THPO、(u)PNPLA3、(v)ATP7B、(w)FAH、(x)ASL、(y)HFE、(z)ALMS1、(aa)PPARD、(bb)IL6、(cc)HSD3B7、(dd)CERS2、または(ee)NCOA5である。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体の標的部分は、(a)SEQ ID NO2813−3910のいずれか1つ、(b)SEQ ID NO 65847−67281のいずれか1つ、(c)SEQ ID NO 1900−2599のいずれか1つ、(d)SEQ ID NO 926−1779のいずれか1つ、(e)SEQ ID NO 37483−38044のいずれか1つ、(f)SEQ ID NO 49423−49969のいずれか1つ、(g)SEQ ID NO 35900−36292のいずれか1つ、(h)SEQ ID NO 44626−47013のいずれか1つ、(i)SEQ ID NO 36293−37482のいずれか1つ、(j)SEQ ID NO 34521−35899のいずれか1つ、(k)SEQ ID NO 131−925のいずれか1つ、(l)SEQ ID NO 58958−65846、あるいは67532−77374のいずれか1つ、(m)SEQ ID NO 25058−30976のいずれか1つ、(n)SEQ ID NO 3911−5264のいずれか1つ、(o)SEQ ID NO 14473−14876のいずれか1つ、(p)SEQ ID NO 38045−42105のいずれか1つ、(q)SEQ ID NO 32469−34520のいずれか1つ、(r)SEQ ID NO 51972−52025のいずれか1つ、(s)SEQ ID NO 51670−51971のいずれか1つ、(t)SEQ ID NO 5265−14472のいずれか1つ、(u)SEQ ID NO 77375−78348のいずれか1つ、(v)SEQ ID NO 42106−44370のいずれか1つ、(w)SEQ ID NO 44371−44625のいずれか1つ、(x)SEQ ID NO 30977−32468のいずれか1つ、(y)SEQ ID NO 21810−23485のいずれか1つ、(z)SEQ ID NO 2600−2812のいずれか1つ、(aa)SEQ ID NO 14877−21809のいずれか1つ、(bb)SEQ ID NO 23486−25057のいずれか1つ、(cc)SEQ ID NO 47014−49422のいずれか1つ、(dd)SEQ ID NO 1780−1899のいずれか1つ、またはSEQ ID NO 67282−67531のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%相補的な配列を含む。

いくつかの実施形態では、RIC mRNA前駆体の標的部分は、(a)SEQ ID NO 78483、78465、または78434;(b)SEQ ID NO 78385、78482、または78369;(c)SEQ ID NO 78461、78473、78480、または78421;(d)SEQ ID NO 78410、78386、78411、78460、または78463;(e)SEQ ID NO 78355、78467、または78454;(f)SEQ ID NO 78367、78376、78440、78448、78477、78485、78496、78422、または78412;(g)SEQ ID NO 78495、(h)SEQ ID NO 78464、78375、または78380;(i)SEQ ID NO 78407、78499、78420、78372、または78397;(j)SEQ ID NO 78489、78416、78476、78352、78435、78493、78423、78437、または78449;(k)SEQ ID NO 78354、または78459;(l)SEQ ID NO 78441、78392、78456、78428、78491、78501、78360、78429、78358、78364、78475、78391、78479、78401、78373、または78450;(m)SEQ ID NO 78445、78481、78379、78431、78469、78408、78377、78417、78387、78455、78484、または78370;(n)SEQ ID NO 78368、78350、78432、78439、または78389;(o)SEQ ID NO 78390、またはSEQ ID NO 78418、(p)SEQ ID NO 78462、78468、78453、78361、78363、78433、78438、78430、78488、78405、78492、または78427;(q)SEQ ID NO 78487、78486、または78474;(r)SEQ ID NO 78458、(s)SEQ ID NO 78497、または78426;(t)SEQ ID NO 78425、78400、78393、78351、78381、78366、78457、78443、78362、または78446;(u)SEQ ID NO 78388、78402、78471、または78356;(v)SEQ ID NO 78427、78383、78444、または78394;(w)SEQ ID NO 78382;(x)SEQ ID NO 78494、78404、78371、78365、または78353;(y)SEQ ID NO 78419、78384、78500、78424、または78466;(z)SEQ ID NO 78399、(aa)SEQ ID NO 78414、78478、78472、78359、78395、78357、78374、または78490;(bb)SEQ ID NO 78436、78413、78415、78398、または78403;(cc)SEQ ID NO 78349、78470、78498、78406、78442、78451、78396、78409、または78378;(dd)SEQ ID NO 78447;またはSEQ ID NO 78452の少なくとも8つの隣接する核酸を含む領域に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を備えた配列を含む。

いくつかの実施形態において、ASOは、(a)SEQ ID NO2813−3910のいずれか1つ、(b)SEQ ID NO 65847−67281のいずれか1つ、(c)SEQ ID NO 1900−2599のいずれか1つ、(d)SEQ ID NO 926−1779のいずれか1つ、(e)SEQ ID NO 37483−38044のいずれか1つ、(f)SEQ ID NO 49423−49969のいずれか1つ、(g)SEQ ID NO 35900−36292のいずれか1つ、(h)SEQ ID NO 44626−47013のいずれか1つ、(i)SEQ ID NO 36293−37482のいずれか1つ、(j)SEQ ID NO 34521−35899のいずれか1つ、(k)SEQ ID NO 131−925のいずれか1つ、(l)SEQ ID NO 58958−65846、あるいは67532−77374のいずれか1つ、(m)SEQ ID NO 25058−30976のいずれか1つ、(n)SEQ ID NO 3911−5264のいずれか1つ、(o)SEQ ID NO 14473−14876のいずれか1つ、(p)SEQ ID NO 38045−42105のいずれか1つ、(q)SEQ ID NO 32469−34520のいずれか1つ、(r)SEQ ID NO 51972−52025のいずれか1つ、(s)SEQ ID NO 51670−51971のいずれか1つ、(t)SEQ ID NO 5265−14472のいずれか1つ、(u)SEQ ID NO 77375−78348のいずれか1つ、(v)SEQ ID NO 42106−44370のいずれか1つ、(w)SEQ ID NO 44371−44625のいずれか1つ、(x)SEQ ID NO 30977−32468のいずれか1つ、(y)SEQ ID NO 21810−23485のいずれか1つ、(z)SEQ ID NO 2600−2812のいずれか1つ、(aa)SEQ ID NO 14877−21809のいずれか1つ、(bb)SEQ ID NO 23486−25057のいずれか1つ、(cc)SEQ ID NO 47014−49422のいずれか1つ、(dd)SEQ ID NO 1780−1899のいずれか1つ、またはSEQ ID NO 67282−67531のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を備えた配列を含む。

いくつかの実施形態では、RIC mRNA前駆体は、(a)SEQ ID NO 41−44、(b)SEQ ID NO 28 121−124、(c)SEQ ID NO37または38、(d)SEQ ID NO33または34、(e)SEQ ID NO 92−95、(f)SEQ ID NO 109−112、(g)SEQ ID NO 87−89、(h)SEQ ID NO 104または105、(i)SEQ ID NO 90または91、(j)SEQ ID NO 85または86、(k)SEQ ID NO 32、(l)SEQ ID NO 115−120、あるいは126−129、(m)SEQ ID NO 76−78、(n)SEQ ID NO 45または46、(o)SEQ ID NO 57−60、(p)SEQ ID NO 96または97、(q)SEQ ID NO 83または84、(r)SEQ ID NO 114、(s)SEQ ID NO 223、(t)SEQ ID NO 47−56、(u)SEQ ID NO 130、(v)SEQ ID NO 98−102、(w)SEQ ID NO 103、(x)SEQ ID NO 80−82、(y)SEQ ID NO 66−73、(z)SEQ ID NO 39、(aa)SEQ ID NO 61−65、(bb)SEQ ID NO 74または75、(cc)SEQ ID NO 106−108、(dd)SEQ ID NO 35または36、あるいはSEQ ID NO 125のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を備えた配列を含む。

いくつかの実施形態では、RIC mRNA前駆体は、(a)SEQ ID NO 6、(b)SEQ ID NO 28、(c)SEQ ID NO 4、(d)SEQ ID NO 2、(e)SEQ ID NO 19、(f)SEQ ID NO 25、(g)SEQ ID NO 17、(h)SEQ ID NO 23、(i)SEQ ID NO 18、(j)SEQ ID NO 16、(k)SEQ ID NO 1、(l)SEQ ID NO 30、(m)SEQ ID NO 13、(n)SEQ ID NO 7、(o)SEQ ID NO 9、(p)SEQ ID NO 20、(q)SEQ ID NO 15、(r)SEQ ID NO 27、(s)SEQ ID NO 26、(t)SEQ ID NO 8、(u)SEQ ID NO 31、(v)SEQ ID NO 21、(w)SEQ ID NO 22、(x)SEQ ID NO 14、(y)SEQ ID NO 11、(z)SEQ ID NO 5、(aa)SEQ ID NO 10、(bb)SEQ ID NO 12、(cc)SEQ ID NO 24、(dd)SEQ ID NO 3、または(ee)SEQ ID NO 29に対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子から転写されたmRNA前駆体の選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能的RNAの量を増加させない。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的RNAまたは機能的タンパク質の量を増加させない。

いくつかの実施形態において、RIC mRNA前駆体は、全長のmRNA前駆体、または野生型のmRNA前駆体の部分的なスプライシングによって生成された。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAは、全長の成熟mRNA、あるいは野生型の成熟mRNAである。

いくつかの実施形態において、生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。

いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは律速イントロンである。

いくつかの実施形態において、前記保持されたイントロンは前記RIC mRNA前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである。

いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは前記RIC mRNA前駆体で2番目に豊富な保持されたイントロンである。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。

いくつかの実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、2’−O−メチル、2’−フルオロ、あるいは2’−O−メトキシエチル部分を含む。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも1つの修飾された糖部を含む。

いくつかの実施形態において、それぞれの糖部は修飾された糖部である。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、8〜50の核酸塩基、8〜40の核酸塩基、8〜35の核酸塩基、8〜30の核酸塩基、8〜25の核酸塩基、8〜20の核酸塩基、8〜15の核酸塩基、9〜50の核酸塩基、9〜40の核酸塩基、9〜35の核酸塩基、9〜30の核酸塩基、9〜25の核酸塩基、9〜20の核酸塩基、9〜15の核酸塩基、10〜50の核酸塩基、10〜40の核酸塩基、10〜35の核酸塩基、10〜30の核酸塩基、10〜25の核酸塩基、10〜20の核酸塩基、10〜15の核酸塩基、11〜50の核酸塩基、11〜40の核酸塩基、11〜35の核酸塩基、11〜30の核酸塩基、11〜25の核酸塩基、11〜20の核酸塩基、11〜15の核酸塩基、12〜50の核酸塩基、12〜40の核酸塩基、12〜35の核酸塩基、12〜30の核酸塩基、12〜25の核酸塩基、12〜20の核酸塩基、あるいは12〜15の核酸塩基からなる。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の標的部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、あるいは100%相補的である。

1つの態様では、本明細書に記載された組成物のいずれかのアンチセンスオリゴマーと賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に提供される。

1つの態様では、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって本明細書に記載された医薬組成物を投与することにより、被験体を処置する方法が本明細書に提供される。

1つの態様において、以下を含む医薬組成物が本明細書で提供される:不足しているAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のmRNA転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、不足しているAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5mRNA転写産物が、保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが、不足しているAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5転写産物から保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容可能な賦形剤。

いくつかの実施形態において、不足しているAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のmRNA転写産物は、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体転写産物である。

いくつかの実施形態において、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+500〜保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−500の領域内で保持されたイントロン中にある。

幾つかの実施形態では、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の転写産物は、SEQ ID NO:1−31のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。

幾つかの実施形態では、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の転写産物は、SEQ ID NO:32−130のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、2’−O−メチル、2’−フルオロ、または2’−O−メトキシエチル部分を含む。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも1つの修飾された糖部を含む。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、8〜50の核酸塩基、8〜40の核酸塩基、8〜35の核酸塩基、8〜30の核酸塩基、8〜25の核酸塩基、8〜20の核酸塩基、8〜15の核酸塩基、9〜50の核酸塩基、9〜40の核酸塩基、9〜35の核酸塩基、9〜30の核酸塩基、9〜25の核酸塩基、9〜20の核酸塩基、9〜15の核酸塩基、10〜50の核酸塩基、10〜40の核酸塩基、10〜35の核酸塩基、10〜30の核酸塩基、10〜25の核酸塩基、10〜20の核酸塩基、10〜15の核酸塩基、11〜50の核酸塩基、11〜40の核酸塩基、11〜35の核酸塩基、11〜30の核酸塩基、11〜25の核酸塩基、11〜20の核酸塩基、11〜15の核酸塩基、12〜50の核酸塩基、12〜40の核酸塩基、12〜35核酸塩基、12〜30核酸塩基、12〜25の核酸塩基、12〜20の核酸塩基、または12〜15の核酸塩基を含む。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の転写産物の標的部分に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%か、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%相補的である。

幾つかの実施形態では、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の転写産物の標的部分は、SEQ ID NO:78349−78501から選択される配列内にある。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、SEQ ID NO:131−78348のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、SEQ ID NO:131−78348から選択されるヌクレオチド配列を含む。

幾つかの実施形態では、医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射のために製剤される。

一態様において、本明細書には、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のタンパク質の機能形態をコードする、十分に処理されたAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物を産生するために、保持されたイントロンの除去を促進する、不足したAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物の処理を誘発する方法が提供され、該方法は、アンチセンスオリゴマーを被験体の標的細胞に接触させる工程;アンチセンスオリゴマーを、不足したAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物にハイブリダイズさせる工程であって、不足したAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物が、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のタンパク質の機能形態をコードすることができ、少なくとも1つの保持されたイントロンを含む、工程;AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のタンパク質の機能形態をコードする、十分に処理されたAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物を産生するために、不足したAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物から少なくとも1つの保持されたイントロンを除去する工程;および十分に処理されたAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物から、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のタンパク質の機能形態を翻訳する工程を含む。

幾つかの実施形態では、保持されたイントロンは、保持されたイントロン全体である。

幾つかの実施形態では、不足したAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNAの転写産物は、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の転写産物である。

一態様において、本明細書には、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のタンパク質の量のまたは活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体を処置する方法が提供され、該方法は、SEQ ID NO:131−78348のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む。

<引用による組み込み> 本明細書で言及されるすべての公報、特許、および特許出願は、個々の公報、特許、特許出願が引用によって組み込まれるように具体的且つ個々に示される程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。

本発明の新規な特徴は、特に添付の請求項に明記されている。本発明の原則が利用される例示の実施形態について説明する以下の詳細な記載と、添付の図面を参照することで、本発明の特徴および利点についてのよりよい理解が得られるであろう。

図1は、典型的な保持されたイントロン含有(RIC)mRNA前駆体の転写産物の概略図を示す。5’スプライス部位コンセンサス配列は、−3eから−1eおよび+1から+6(「e」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである)まで下線を引かれた文字(文字はヌクレオチドである;大文字:エクソン部分、および小文字:イントロン部分)で示されている。3’スプライス部位コンセンサス配列は、−15から−1および+1e(「e」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである)まで下線を引かれた文字(文字はヌクレオチドである;大文字:エクソン部分、および小文字:イントロン部分)で示されている。ASOスクリ−ニングのためのイントロン標的領域は、保持されたイントロンの5’スプライス部位(左の矢印)に対するヌクレオチド+6から、保持されたイントロンの3’スプライス部位(右の矢印)に対するヌクレオチド−16までを含む。実施形態では、ASOスクリ−ニングのためのイントロン標的領域は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対するヌクレオチド+6から+100、および保持されたイントロンの3’スプライス部位に対するヌクレオチド−16から−100を含む。エクソン標的部位は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける+2eから−4e、および保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける+2eから−4eのヌクレオチドを含む。「n」または「N」はヌクレオチドを表し、「y」はピリミジンを表す。図示された配列は、哺乳動物のスプライス部位に対するコンセンサス配列を表わし、個々のイントロンおよびエクソンは、すべての位置でコンセンサス配列に一致する必要はなない。

図2Aは、核内遺伝子出力の標的とされた増強(TANGO)の典型的な概略図を示す。図2Aは、核と細胞質の区画に分割された細胞を示す。核内では、エクソン(長方形)およびイントロン(接続線)から成る標的遺伝子のmRNA前駆体の転写産物が、mRNAを産生するためにスプライシングを受け、このmRNAは、細胞質に輸送され、標的タンパク質に翻訳される。この標的遺伝子に関して、イントロン1のスプライシングは非効率的であり、保持されたイントロン含有(RIC)mRNA前駆体は、主として核内に蓄積し、細胞質に輸送された場合は劣化し、標的タンパク質の産生にはつながらない。

図2Bは、核内遺伝子出力の標的とされた増強(TANGO)の典型的な概略図を示す。図2Bは、核と細胞質の区画に分割された図2Aと同じ細胞の一例を示す。アンチセンスオリゴマー(ASO)での処置は、イントロン1のスプライシングを促進し、結果としてmRNAの増加をもたらし、これは順に、高レベルの標的タンパク質に翻訳される。

図3Aは、NM_001164710、NM_00116471.1、NM_001164712、NM_000481およびNR_028435に対応するAMTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲まれたイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される。

図3Bは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン4−エクソン5のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン4なしでのAMT mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図3Cは、NM_001164710、NM_00116471.1、NM_001164712、NM_000481およびNR_028435に対応するAMTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲まれたイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される。

図4Aは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン2、NM_000155)。

図4Bは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン3、NM_000155)。

図4Cは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン4、NM_000155)。

図4Dは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン4−エクソン5のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン4なしでのGALT mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図4Eは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン5、NM_000155)。

図4Fは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン7、NM_000155)。

図4Gは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン8、NM_000155)。

図4Hは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン8−エクソン9のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン8なしでのGALT mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図4Iは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン9、NM_000155)。

図4Jは、GALT:NM_000155およびNM_001258332に対応するGALTに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(GALTイントロン10、NM_000155)。

図5Aは、PC:NM_000920、NM_022172およびNM_001040716に対応するPCに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PCイントロン16、NM_022172)。

図5Bは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン16−エクソン17のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン16なしでのPC mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図6Aは、FAH:NM_000137に対応するFAHに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(FAHイントロン1、NM_000137)。

図6Bは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン1−エクソン2のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン1なしでのFAH mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図7Aは、PPARD:NM_006238、NM_177435、NM_001171818、NM_001171819およびNM_001171820に対応するPPARDに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPARDイントロン3、NM_006238)。

図7Bは、偽処理した細胞と比較した、80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン3なしでのPPARD mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図7Cは、PPARD:NM_006238、NM_177435、NM_001171818、NM_001171819およびNM_001171820に対応するPPARDに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPARDイントロン4、NM_006238)。

図7Dは、PPARD:NM_006238、NM_177435、NM_001171818、NM_001171819およびNM_001171820に対応するPPARDに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPARDイントロン5、NM_006238)。

図7Eは、PPARD:NM_006238、NM_177435、NM_001171818、NM_001171819およびNM_001171820に対応するPPARDに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPARDイントロン6、NM_006238)。

図7Fは、偽処理した細胞と比較した、80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン6なしでのPPARD mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図7Gは、PPARD:NM_006238、NM_177435、NM_001171818、NM_001171819およびNM_001171820に対応するPPARDに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPARDイントロン7、NM_006238)。

図8Aは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン3、NM_000018)。

図8Bは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン5、NM_000018)。

図8Cは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン8、NM_000018)。

図8Dは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン9、NM_000018)。

図8Eは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン10、NM_000018)。

図8Fは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン13、NM_000018)。

図8Gは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン18、NM_000018)。

図8Hは、ACADVL:NM_001270448、NM_001270447、NM_000018およびNM_001033859に対応するACADVLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ACADVLイントロン19、NM_000018)。

図9Aは、HMBS:NM_000190、NM_001258208、NM_001024382およびNM_001258209に対応するHMBSに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HMBSイントロン10、NM_000190)。

図9Bは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン10−エクソン11のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン10なしでのHMBS mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図9Cは、HMBS:NM_000190、NM_001258208、NM_001024382およびNM_001258209に対応するHMBSに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HMBSイントロン11、NM_000190)。

図10Aは、UROD:NM_000374およびNR_036510に対応するURODに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(URODイントロン3、NM_000374)。

図10Bは、UROD:NM_000374およびNR_036510に対応するURODに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(URODイントロン4、NM_000374)。

図10Cは、UROD:NM_000374およびNR_036510に対応するURODに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(URODイントロン5、NM_000374)。

図10Dは、UROD:NM_000374およびNR_036510に対応するURODに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(URODイントロン6、NM_000374)。

図10Eは、UROD:NM_000374およびNR_036510に対応するURODに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(URODイントロン7、NM_000374)。

図11Aは、ALMS1:NM_015120に対応するALMS1に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ALMS1イントロン21、NM_015120)。

図11Bは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン21−エクソン22のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたHuh7細胞におけるイントロン21なしでのALMS1 mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図12Aは、ASL:NM_000048、NM_001024943、NM_001024944およびNM_001024946に対応するASLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ASLイントロン7、NM_000048)。

図12Bは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン7−エクソン8のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン7なしでのASL mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図12Cは、ASL:NM_000048、NM_001024943、NM_001024944およびNM_001024946に対応するASLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ASLイントロン8、NM_000048)。

図12Dは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン8−エクソン9のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン8なしでのASL mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図12Eは、ASL:NM_000048、NM_001024943、NM_001024944およびNM_001024946に対応するASLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ASLイントロン9、NM_000048)。

図12Fは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン9−エクソン10のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン7なしでのASL mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図12Gは、ASL:NM_000048、NM_001024943、NM_001024944およびNM_001024946に対応するASLに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ASLイントロン16、NM_000048)。

図13Aは、ATP7B1:NM_001243182、NM_000053、NM_001005918、NM_001330579およびNM_001330578に対応するATP7B1に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ATP7B1イントロン7、NM_000053)。

図13Bは、ATP7B1:NM_001243182、NM_000053、NM_001005918、NM_001330579およびNM_001330578に対応するATP7B1に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(ATP7B1イントロン13、NM_000053)。

図13Cは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン13−エクソン14のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン13なしでのATP7B1 mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図14は、HFE:NM_139007、NM_139006、NM_139004、NM_139003、NM_001300749、NM_139009、NM_139008およびNM_000410に対応するHFEに対するRefSeq遺伝子の概略図を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HFEイントロン2、NM_000410)。

図15Aは、HSD3B7:NM_001142777、NM_001142778およびNM_025193に対応するHSD3B7に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HSD3B7イントロン1、NM_001142777)。

図15Bは、HSD3B7:NM_001142777、NM_001142778およびNM_025193に対応するHSD3B7に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HSD3B7イントロン1、NM_001142777)。

図15Cは、偽処理した細胞と比較した、(エクソン2−エクソン3のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン2なしでのHSD3B7 mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図15Dは、HSD3B7:NM_001142777、NM_001142778およびNM_025193に対応するHSD3B7に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HSD3B7イントロン3、NM_001142777)。

図15Eは、HSD3B7:NM_001142777、NM_001142778およびNM_025193に対応するHSD3B7に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HSD3B7イントロン4、NM_001142777)。

図15Fは、偽処理した細胞と比較した(エクソン4−エクソン5のスプライスジャンクションに及ぶ)80nMの示されたASOで24時間処置されたARPE−19細胞におけるイントロン4なしでのHSD3B7 mRNAの発現レベルの平均(n=3)倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはRPL32発現に正規化される。

図15Gは、HSD3B7:NM_001142777、NM_001142778およびNM_025193に対応するHSD3B7に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HSD3B7イントロン5、NM_025193)。

図15Hは、HSD3B7:NM_001142777、NM_001142778およびNM_025193に対応するHSD3B7に対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(HSD3B7イントロン6、NM_025193)。

図16は、NCOA5:NM_020967に対応するNCOA5に対するRefSeq遺伝子の概略図を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(NCOA5イントロン2、NM_020967)。

図17Aは、PPOX:NM_000309およびNM_001122764に対応するPPOXに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPOXイントロン3、NM_000309)。

図17Bは、PPOX:NM_000309およびNM_001122764に対応するPPOXに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPOXイントロン4、NM_000309)。

図17Cは、PPOX:NM_000309およびNM_001122764に対応するPPOXに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPOXイントロン5、NM_000309)。

図17Dは、PPOX:NM_000309およびNM_001122764に対応するPPOXに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPOXイントロン7、NM_000309)。

図17Eは、PPOX:NM_000309およびNM_001122764に対応するPPOXに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPOXイントロン8、NM_000309)。

図17Fは、PPOX:NM_000309およびNM_001122764に対応するPPOXに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPOXイントロン10、NM_000309)。

図17Gは、PPOX:NM_000309およびNM_001122764に対応するPPOXに対するRefSeq遺伝子の概略を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率(PIR)が示される(PPOXイントロン12、NM_000309)。

肝臓疾患は、米国だけで1年当たり概算で60,000人の死亡を結果的にもたらす、衰弱した疾病である。多くの場合では、肝不全を患う人にとって唯一の望みは、肝臓移植であるが、ドナープールは、およそ4,000のみであると推測される。それ故、移植を受ける確率は低く、移植を受けることができない人の状態を改善することができる処置はほとんどない。それ故、肝臓疾患を処置するための組成物および方法が必要とされている。

1つまたは1つを超えるイントロンを有するタンパク質コード遺伝子の一次転写産物における個々のイントロンは、異なる効率性を有する一次転写産物からスプライシングされる。ほとんどの場合、完全にスプライシングされたmRNAだけが、続く細胞質での翻訳のために核膜孔を通って輸送される。スプライシングされていない及び部分的にスプライシングされた転写産物は、核内で検出可能である。完全にスプライシングされていない転写産物の核内蓄積が、タンパク質に翻訳され得る細胞質中の有害である可能性のあるmRNAの蓄積を防ぐメカニズムであると一般的に考えられる。幾つかの遺伝子に関して、最も効率性の低いイントロンのスプライシングは、細胞質中での翻訳に先立つ、遺伝子発現における転写後の律速の工程である。

肝臓疾患のサブセットにおいて不足しているタンパク質をコードする、かなりのレベルの遺伝子の部分的にスプライシングされた転写産物が、ヒト細胞の核内で発見されてきた。これらのmRNA前駆体の種は、少なくとも1つの保持されたイントロンを含む。本発明は、完全にスプライシングされた成熟mRNAの安定した状態の産生を増加させる、およびそれ故、翻訳されたタンパク質レベルを増加させるために、遺伝子発現の核段階に対して律速的である1つ以上の保持されたイントロンのスプライシングをアップレギュレートするための組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、核内に蓄積する保持されたイントロン含有mRNA前駆体のイントロンスプライス部位で構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマー(ASO)を活用する。したがって、実施形態では、タンパク質不足によって引き起こされた疾病を処置するために本発明の方法を使用して、タンパク質が増加される。

本明細書に記載される本発明によって処置することができる肝臓疾患は、被験体において遺伝子産物が不足している疾患であり、ここで遺伝子産物の不足は肝臓疾患を引き起こす。

これらのAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2およびNCOA5のmRNA前駆体の種は、少なくとも1つの保持されたイントロンを含む。本発明は、完全にスプライシングされた成熟mRNAの安定した状態の産生を増加させる、およびそれ故、翻訳されたアミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソヴァレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子1−αアルブミン近接因子、タンパク質O−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子β−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2または核内受容体コアクチベーター5タンパク質のレベルを増加させるために、遺伝子発現の核段階に対して律速的である1つ以上の保持されたAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2およびNCOA5のイントロンのスプライシングをアップレギュレートするための組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、核内に蓄積する保持されたイントロン含有AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2およびNCOA5のmRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)のイントロンスプライス部位での構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマー(ASO)を利用することができる。したがって、実施形態では、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソヴァレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子1−αアルブミン近接因子、タンパク質O−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子β−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2または核内受容体コアクチベーター5タンパク質は、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソヴァレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子1−αアルブミン近接因子、タンパク質O−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子β−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2または核内受容体コアクチベーター5の不足によって引き起こされた疾病を処置するために本発明の方法を使用して増加され得る。

幾つかの実施形態では、本明細書には、完全にスプライシングされた成熟mRNAの安定した状態の産生を増加させる、およびそれ故、翻訳されたAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、CERS2またはNCOA5のタンパク質レベルを増加させるために、遺伝子発現の核段階に対して律速的である1つ以上の保持されたAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のイントロンのスプライシングをアップレギュレートするための組成物および方法が開示される。これらの組成物および方法は、核内に蓄積する保持されたイントロン含有AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のmRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)のイントロンスプライス部位での構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマー(ASO)を利用することができる。したがって、実施形態では、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のタンパク質は、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5の不足によって引き起こされた疾病を処置するために本発明の方法を使用して増加され得る。

他の実施形態では、本発明の方法は、必要としている被験体内の疾病を処置するために、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソヴァレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子1−αアルブミン近接因子、タンパク質O−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子β−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2または核内受容体コアクチベーター5の産生を増加させるために使用され得る。実施形態では、被験体は、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソヴァレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子1−αアルブミン近接因子、タンパク質O−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子β−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2または核内受容体コアクチベーター5が、野生型と比較して必ずしも不足していないが、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソヴァレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子1−αアルブミン近接因子、タンパク質O−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子β−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2または核内受容体コアクチベーター5の増加が、それにもかかわらず疾病を軽減する、疾病を有する。実施形態では、疾病は、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2およびNCOA5のハプロ不全によって引き起こされ得る。

実施形態では、記載される組成物および方法は、標的タンパク質の不足によって引き起こされる肝疾患を有する被験体または患者を処置するために使用される。実施形態では、記載される組成物および方法は、標的タンパク質の不足によって引き起こされない肝疾患を有する被験体または患者を処置するために使用される。実施形態では、肝疾患を有する被験体または患者は、標的タンパク質の正常な産生を補足することによって標的タンパク質の産生の増加から恩恵を得ることができる。関連する実施形態では、肝疾患を有する被験体または患者は、成熟mRNA産生を増加させる及び/又は標的タンパク質の正常な産生を補足することによって、標的タンパク質の産生の増加から恩恵を得ることができる。特定の実施形態では、必ずしも標的タンパク質の不足によって引き起こされないが、それにもかかわらず、本発明の方法を使用して標的タンパク質の産生を増加することによって処置される疾病において、標的タンパク質は、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、PPARD、IL6、CERS2またはNCOA5である。実施形態では、標的タンパク質は、被験体の肝疾患を改善または処置するために、二次標的に作用する。実施形態では、被験体において二次標的タンパク質が不足している。実施形態では、被験体において二次標的タンパク質は不足していない。

<グリシン脳症> 幾つかの実施形態では、本明細書に記載される本発明は、常染色体劣性肝臓障害であるグリシン脳症(GCE)を処置するために使用され得る。GCEの優位な表現型は、生涯の早期に現われる、新生児表現型である。この表現型の症状は、嗜眠、筋緊張低下、ミオクローヌス発作、発作、精神遅滞、無呼吸およびしばしば死亡を含む。他の事例では、GCEは、軽度精神遅滞、せん妄、舞踏病、および垂直注視麻痺を含む症状とともに、小児期に現われる。GCEの遅発型は、痙攣性両側麻痺および視神経萎縮を結果としてもたらすが、典型的には精神遅滞または発作にはつながらない。

GCEは、肝臓におけるグリシン切断系における欠乏症の結果明示することができる。 タンパク質アミノメチルトランスフェラーゼ(AMT)の不足はGCEの進行に関係する。また、試験はAMT欠乏症およびGCEの進行をリンクした。AMTは、肝細胞のミトコンドリア内のグリシン切断系の構成要素である。AMTタンパク質をコードするAMT遺伝子は、3p21.2に位置する9つのエクソンに及ぶ6kb遺伝子である。AMT遺伝子の突然変異は、GCEに関係する臨床表現型を引き起こすと示された。1つの試験では、患者はG269D突然変異に対してヘテロ接合性である。他の試験は、GCEの進行を結果としてもたらすAMTの他のミスセンス変異を検査し、それによって、AMT不足とGCEの進行との間の明確な関係(positive link)を確立する。

<ツェルヴェーガー症候群/ハイムラー症候群> 幾つかの実施形態では、本明細書に記載される本発明は、常染色体劣性肝臓障害のツェルヴェーガー症候群を処置するために使用され得る。ツェルヴェーガー症候群は、重度の神経機能障害、頭蓋顔面奇形、および肝機能障害を特徴とする、重度のペルオキシソーム形成異常症である。標準的なツェルヴェーガー症候群の表現型に罹患した患者は、典型的に1年以内に死亡する。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載される本発明は、常染色体劣性肝臓障害のハイムラー症候群を処置するために使用され得る。ハイムラー症候群は、感音性聴力損失、第二生歯のエナメル質形成不全および爪異常を特徴とするペルオキシソーム形成異常症の最も軽度な形態である。

<アデノシンデアミナーゼ欠損症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性肝疾患のアデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症を処置するために使用されうる。ADA欠損症は一般的には幼児期に現われ、かつ一般的には命取りになるが、患者の小さなサブセット、一般的には乳児型よりも軽度なその病気の遅発型を示す。ADA欠損症の遅発型に悩む患者は、典型的には、緩やかに免疫学的劣化を示し、それは多数の二次感染を導く。

ADAタンパク質の欠損症はADA欠損症において示される臨床症状を結果として生じる。20q13に位置し、10エクソンに及ぶADA遺伝子は、ADAタンパク質をコードする。不十分な量のADAタンパク質を結果としてもたらすADA遺伝子の変異が、ADA欠損症の進行の原因であることが示されてきた。ある研究では、ADA欠損症と診断された1組の子供たちが調査された。両方の親が中レベルのADAタンパク質を持つと分かっていたが、両方の子供はADAタンパク質の濃度が減少したことが分かった。この発見は、その病気のために提案された遺伝の劣性パターンを立証し、減少したADAタンパク質とADA欠損症の臨床症状との間の明確な関係を提供する。

<異型ポルフィリン症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、異型ポルフィリン症(porphyria variegate)(VP)を処置するために使用されうる。VPは、増加した光線過敏症、水疱形成、皮膚脆弱性および炎症後色素沈着などの皮膚症状によって特徴づけられる。更なる病状は、急性の肝性ポルフィリン症を特徴づける腹痛症、暗色尿、および精神神経症状を含む。

プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPOX)タンパク質の欠損症は、VPにおいて示される臨床症状を結果として生じる。1q23.3に位置し、13エクソンに及ぶPPOX遺伝子は、PPOXタンパク質をコードする。不十分な量のPPOXタンパク質を結果としてもたらすPPOX遺伝子の変異が、VPの進行の原因であることが示されてきた。VPのホモ接合型もまれに存在しているが、「古典的な」VPは、PPOX遺伝子の単一の対立遺伝子における突然変異によって特徴づけられ、したがって、ハプロ不全の機構によって進行する。いくつかの研究では、PPOXにおけるヘテロ接合変異がVPの進行に関連付けられてきており、この進行は、VPに悩む患者において発見されたPPOXタンパク質の減少したレベルの結果である。

<晩発性皮膚ポルフィリン症> いくつかの実施形態では、本明細書に記載された本発明は常染色体優性肝疾患の晩発性皮膚ポルフィリン症(PCT)を処置するために使用することができる。PCTは、尿中のウロポルフィリンの排出および感光性皮膚炎によって特徴づけられる。

ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ(UROD)タンパク質の欠損症は、PCTにおいて示される臨床症状を結果として生じる。1p34.1に位置し、10エクソンに及ぶUROD遺伝子は、URODタンパク質をコードする。不十分な量のURODタンパク質を結果としてもたらすUROD遺伝子の変異が、PCTの進行の原因であることが示されてきた。ある研究では、UROD遺伝子におけるG381V突然変異は、PCTの家族性バージョン(familial version of PCT)を持つ患者において示され、これがURODタンパク質の減少したレベルを結果としてもたらした。他の研究では、減少したURODタンパク質のレベルとPCTの進行との間の相互関係も示されてきた。

<急性間欠性ポルフィリン症> いくつかの実施形態では、本明細書に記載された本発明は常染色体優性肝疾患の急性間欠性ポルフィリン症(AIP)を処置するために使用することができる。AIPは、ヘム生合成の欠損によって特徴づけられる。AIPの臨床症状は、腹痛症、消化管障害、および死に至る精神異常を含む。

ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(HMBS)タンパク質(非赤血球、あるいは赤血球および非赤血球の両方)の欠損症は、AIPにおいて示される臨床症状を結果としてもたらす。1q23.3に位置し、15エクソンに及ぶHMBS遺伝子は、HMBSタンパク質をコードする。HMBSはポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(PBGD)とも呼ばれる。不十分な量のHMBSタンパク質を結果としてもたらすHMBS遺伝子の変異が、AIPの進行の原因であることが示されてきた。ある研究では、HMBSにおける19の独立した突然変異がAIPを示す28組の家族で発見され、HMBS欠損症とAIPとの間の関係をさらに提供した。

<超長鎖アシルCoA脱水素酵素欠損症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性肝疾患の超長鎖アシルCoA脱水素酵素(VLCAD)欠損症を処置するために使用されうる。VLCADは、ミトコンドリアの脂肪酸酸化の欠損に起因する病状であると考えられる非ケトン性低血糖症、心肺停止、肝腫大、心臓肥大、および低血圧症に特徴づけられる。

VLCADタンパク質の欠損症はVLCAD欠損症において示される臨床症状を結果として生じる。17p13.1に位置し、20エクソンに及ぶACADVL遺伝子は、VLCADタンパク質をコードする。不十分な量のVLCADタンパク質を結果としてもたらすACADVL遺伝子の変異が、VLCAD欠損症の進行の原因であることが示されてきた。ある研究では、VLCAD欠損症を示す2人の患者が、ACADVL遺伝子中の105bpの欠損部分を有することが分かった。別の研究では、21つの様々なミスセンス変異が、VLCAD欠損症を示す18人の子供で見つかった。全体として、これらのような研究は、VLCADの不足と、VLCAD欠損症を示す患者で見られる臨床症状との間の明確な関係を示してきた。

<ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性肝疾患のピルビン酸カルボキシラーゼ(PC)欠損症を処置するために使用されうる。PC欠損症は3つの表現型のサブタイプへと分類される。北アメリカにおいてより流行しているタイプAの患者は、乳酸血症(lactic academia)および精神運動発達遅滞を示す。タイプAよりも重症で、フランスと英国においてより流行しているタイプBの患者は、増加した血清乳酸、アンモニア、シトルリン、およびリジン、ならびに死の確率がより高い細胞内酸化還元の障害を示す。タイプCは、より軽度のPC欠損症であり、一般的には良性である。

ピルビン酸カルボキシラーゼ(PC)タンパク質の不足は、PC欠損症において示される臨床症状を結果として生じる。11q13.2に位置し、19エクソンに及ぶPC遺伝子は、PCタンパク質をコードする。家族性の遺伝は常染色体劣性の機構を介して進行すると考えられ、かつ保因頻度は、特定の家族中10人に1人と同じくらい高いと推測される。不十分な量のPCタンパク質を結果としてもたらすPC遺伝子の変異が、PC欠損症の進行の原因であることが示されてきた。ある研究では、タイプA PC欠損症に苦しむ患者のPC遺伝子においてミスセンス変異が発見され、それによってPCタンパク質レベルの不足と、PC欠損症に関係する臨床症状との間の関係が提供される。

<イソ吉草酸血症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性肝疾患のイソ吉草酸血症(isovaleric academia)(IVA)を処置するために使用されうる。IVAは2つの表現型のサブタイプへと分類される:急性・慢性のサブタイプ。急性のサブタイプは、大規模な代謝性アシドーシスを引き起こし、最終的に死に至る。慢性のサブタイプは、無症状の期間の後に、重症のケトアシドーシスの発作の期間を結果としてもたらす。IVAの臨床症状は、特異臭、食物タンパク質に対する嫌悪感、および嘔吐を含む。

イソバレリルCoAデヒドロゲナーゼ(IVD)タンパク質の不足は、IVAにおいて示される臨床症状を結果として生じる。15q13に位置し、12エクソンに及ぶIVD遺伝子は、IVDタンパク質をコードする。不十分な量のIVDタンパク質を結果としてもたらすIVD遺伝子の変異が、IVA欠損症の進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、IVD欠損症を結果としてもたらすIVDの多数の様々な突然変異が調査され、突然変異がIVAで見られる臨床症状を引き起こすIVDタンパク質の量の欠失を結果としてもたらすことを示してきた。

<高カイロミクロン血症/高トリグリセリド血症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体優性肝疾患の高カイロミクロン血症を処置するために使用されうる。高カイロミクロン血症は、血漿中の、カイロミクロンおよび超低密度リポタンパク質(VLDL)の量の増加、並びにLDLおよび高密度リポタンパク質(HDL)の低下によって特徴づけられる。

いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体優性肝疾患の高トリグリセリド血症を処置するために使用されうる。高トリグリセリド血症に苦しむ患者は、一般的には、コレステロールのレベルが正常であるが、トリグリセリドのレベルの上昇を示す。トリグリセリドの上昇以外は、患者は一般的には無症状である。

アポリポタンパク質A−V(APOA5)タンパク質の不足は、高カイロミクロン血症と高トリグリセリド血症との両方において示される臨床症状を結果として生じる。11q23.3に位置し、4エクソンに及ぶAPOA5遺伝子は、APOA5タンパク質をコードする。不十分な量のAPOA5 タンパク質を結果としてもたらすAPOA5 遺伝子の変異が、高カイロミクロン血症および高トリグリセリド血症の両方の進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、高カイロミクロン血症および高トリグリセリド血症の両方を結果としてもたらすAPOA5の多数の様々な突然変異が調査されてきた。例えば、ある研究では、APOA5におけるS19Wの突然変異は、APOA5のタンパク質の量の欠損を結果としてもたらすことが示され、これは患者の家族において高カイロミクロン血症として現われた。

<ガラクトース血症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性肝疾患のガラクトース血症を処置するために使用されうる。ガラクトース血症は一般的には新生児の発達中に現われ、黄疸、肝脾腫、肝細胞機能不全、食物不耐性、低血糖症、腎尿細管機能障害、筋緊張低下、敗血症、および白内障によって特徴づけられる。経時的に、ガラクトース血症に悩む患者は、精神遅滞、言語協調障害、運動異常、および高ゴナドトロピン性性腺機能低下症を経験する。

ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ(GALT)タンパク質の不足は、ガラクトース血症において示される臨床症状を結果として生じる。15q11.2に位置し、11エクソンに及ぶGALT遺伝子は、GALTタンパク質をコードする。不十分な量のGALTタンパク質を結果としてもたらすGALT遺伝子の変異が、ガラクトース血症の進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、ガラクトース血症を結果としてもたらすGALTの多数の様々な突然変異が調査され、突然変異がガラクトース血症で見られる臨床症状を引き起こすGALTタンパク質の量の欠失を結果としてもたらすことを示してきた。ある研究では、M142K突然変異が、正常なレベルのおよそ4%までGALTタンパク質の量を低下させることが分かり、これによって、GALTタンパク質の量の不足と、ガラクトース血症の臨床的進行との間の明確な関係が提供される。

<高コレステロール血症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性肝疾患の高コレステロール血症(ARH )を処置するために使用されうる。ARHは、ひどく上昇した血漿低密度リポタンパク質(LDL)のコレステロール、結節状のおよび腱の黄色腫、ならびに早発性アテローム動脈硬化症によって特徴づけられる。

低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1(LDLRAP1)であるタンパク質の不足は、ARHにおいて示される臨床症状を結果として生じる。1p36.11に位置し、9エクソンに及ぶLDLRAP1遺伝子は、LDLRAP1タンパク質をコードする。不十分な量のLDLRAP1タンパク質を結果としてもたらすLDLRAP1遺伝子の変異が、ARHの進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、ARHを結果としてもたらすLDLRAP1の多数の様々な突然変異が調査され、LDLRAP1タンパク質の量の欠失を結果としてもたらす突然変異が、ARHで見られる臨床症状を引き起こすことを示してきた。多くの研究で、LDLRAP1タンパク質の量の実質的な減少を結果としてもたらすLDLRAP1遺伝子における保存されたナンセンス変異を検査する、すなわちARHに関係する臨床症状が検査された。

<糖尿病> いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は、若年発症成人型糖尿病タイプ1(MODY1)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、若年発症成人型糖尿病タイプ2(MODY2)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、若年発症成人型糖尿病タイプ3(MODY3)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、インスリン依存性糖尿病1(IDDM1)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、インスリン依存性糖尿病20(IDDM20)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、若年発症成人型糖尿病と共にファルコーニ腎尿細管症候群4(Falconi renotubular syndrome 4 )(FRTS4)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、家族性高インスリン性低血糖症3(HHF3)を処置するために使用することができる.他の実施形態では、本明細書に記載された発明は、永続型新生児糖尿病(PNDM)を処置するために使用することができる.糖尿病は、頻尿症、多渇症、空腹の増長、糖尿病性ケトアシドーシス、循環器疾患、脳卒中、慢性腎不全、足潰瘍、目への損傷を含む症状と共に、高血糖によって特徴づけられる代謝疾患のグループである。

糖尿病の進行の一因となりうる多数の因子が存在する一方、タンパク質である肝細胞核因子4アルファ(HNF4A)の不足は、MODY1、NIDDM、およびFRTS4の発生率に相互に関連することが示されてきた。20q13.12に位置し、12エクソンに及ぶHNF4A遺伝子は、HNF4Aタンパク質をコードする。不十分な量のHNF4Aタンパク質を結果としてもたらすHNF4A遺伝子の変異が、MODY1、NIDDM、およびFRTS4の進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、MODY1、NIDDM、およびFRTS4を結果としてもたらすHNF4Aの多数の様々な突然変異が調査され、HNF4Aタンパク質の量の欠失を結果としてもたらす突然変異が、糖尿病で見られる臨床症状を引き起こすことを示してきた。例えば、1つの研究はそれを実証した。Q268におけるナンセンス変異は、MODY1に悩む大規模な患者の集団において存在した。別の研究では、著者は、HNF4Aにおける突然変異が増大した出生時体重および巨人症に関連し、その突然変異は、最終的には糖尿病で悩む患者において見られる高インスリン血症へと発展すると、結論を下した。このような研究およびその他の研究は、発現したHNF4Aタンパク質の量の不足と、糖尿病の進行との相互関係を明確に示した。

タンパク質であるグルコキナーゼ(GCK)の不足は、NIDDM、MODY2、HHF3、およびPNDMの発生率に相互に関連することが示されてきた。7p13に位置し、12エクソンに及ぶGCK遺伝子は、GCKタンパク質をコードする。不十分な量のGCKAタンパク質を結果としてもたらすGCK遺伝子の変異が、NIDDM、MODY2、HHF3、およびPNDMの進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、NIDDM、MODY2、HHF3、およびPNDMを結果としてもたらすGCK の多数の様々な突然変異が調査され、発現したGCKタンパク質の量の不足と、糖尿病の進行との相互関係が明確に示されてきた。

タンパク質である、肝核因子−1−アルファアルブミン近位因子(albulim proximal factor )(HNF1A)の不足は、MODY3、IDDM20、IDDM1、およびNIDDMの発生率に相互に関連すると示されてきた。12q24.31に位置し、10エクソンに及ぶHNF1A遺伝子は、HNF1Aタンパク質をコードする。不十分な量のHNF1Aタンパク質を結果としてもたらすHNF1A遺伝子の変異が、MODY3、IDDM20、IDDM1、およびNIDDMの進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、MODY3、IDDM20、IDDM1、およびNIDDMを結果としてもたらすHNF1Aの多数の様々な突然変異が調査され、発現したHNF1Aタンパク質の量の不足と、糖尿病の進行との相互関係が明確に示されてきた。

タンパク質である核受容体コアクチベーター5(NCOA5)の不足は、タイプII糖尿病、耐糖能障害、および最終的には肝臓癌の発生率に相互に関連すると示されてきた。20q13.12に位置し、8エクソンに及ぶNCOA5遺伝子は、NCOA5タンパク質をコードする。不十分な量のNCOA5タンパク質を結果としてもたらすNCOA5遺伝子の変異が、糖尿病の進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、糖尿病を結果としてもたらす糖尿病の多数の様々な突然変異が調査され、発現した糖尿病タンパク質の量の不足と、糖尿病の進行との相互関係が明確に示されてきた。

<肝腺腫> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体優性肝疾患の肝腺腫を処置するために使用されうる。肝腺腫は、悪性転換のリスクが非常に低い珍しい良性の肝腫瘍である。肝腺腫に悩む患者は、腫瘍が出血し始めなければ一般的には無症状であるが、出血すれば、低血圧症、頻脈症、および発汗を引き起こす可能性がある。

HNF1Aタンパク質中の不足は、肝腺腫の進行を結果としてもたらしうる。不十分な量のHNF1Aタンパク質を結果としてもたらすHNF1A遺伝子の変異が、肝腺腫の進行の原因であることが示されてきた。

<ダウリング−デゴス病4> いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は常染色体優性肝疾患のダウリング−デゴス病4(DDD4)を処置するために使用することができる。DDD4は、成人期に、特に皮膚のひだに現れる網様色素沈着(retricular pigmentation )によって特徴づけられる。病状が体細胞に影響を与えている一方、色素沈着は肝臓の機能不全に起因する。

タンパク質であるO−グルコシルトランスフェラーゼ1(LDLRAP1)の不足は、DDD4において示される臨床症状を結果として生じる。3q13.33に位置し、11エクソンに及ぶPOGLUT1遺伝子は、POGLUT1タンパク質をコードする。不十分な量のPOGLUT1タンパク質を結果としてもたらすPOGLUT1遺伝子の変異が、DDD4の進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究では、DDD4を結果としてもたらすPOGLUT1の多数の様々な突然変異が調査され、POGLUT1タンパク質の量の欠失を結果としてもたらす突然変異が、DDD4で見られる臨床症状を引き起こすことを示してきた。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発明は、SHORT症候群を治療するために使用される。SHORT症候群は、低身長、関節の過伸展および/または鼡径ヘルニア、眼球陥凹、リーガー異常、および歯生遅延を含む疾病に関係する臨床症状のアクロニムである。SHORT症候群に特有な他の症状は、三角形の顔、くぼみのある小さなあご、皮下脂肪の欠損、耳の異常な位置、聴力損失、および言語障害を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は、常染色体優性の疾患である免疫不全36(IMD36)を処置するために使用することができる。IMD36は、損なわれたB細胞の機能、低ガンマグロブリン血症、および反復感染によって特徴づけられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は、常染色体劣性の疾患である無ガンマグロブリン血症7(AGM7)を処置するために使用することができる。AGM7は、損なわれたB細胞の機能、低ガンマグロブリン血症、および反復感染によって特徴づけられる。AGM7は、低血清抗体および低循環のB細胞によって特徴づけられる免疫不全疾患であり、反復感染を結果としてもたらす。

タンパク質であるホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1(PIK3R1)の不足は、SHORT症候群、IMD36、およびAGM7において示される臨床症状を結果として生じる。5q13.1に位置し、16エクソンに及ぶPIK3R1遺伝子は、PIK3R1タンパク質をコードする。不十分な量のPIK3R1タンパク質を結果としてもたらすPIK3R1遺伝子の変異がSHORT症候群、IMD36、およびAGM7の進行の原因であることが示されてきた。いくつかの研究ではSHORT症候群、IMD36、およびAGM7を結果としてもたらすPIK3R1の多数の様々な突然変異が調査されてきた。ある研究では、PIK3R1におけるR649Wの突然変異は、SHORT症候群と診断された無関係な個体の集団において発見された。同じ突然変異が感染していた母および彼女の2人の息子において見つかり、これにより、SHORT症候群の遺伝の常染色体優性パターンの証拠がもたらされた。

<脂質代謝障害> いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は、タンパク質であるTribbles−1(TRIB1)の不足によって引き起こされる脂質代謝欠損症を処置するために使用することができる。8q24.13に位置し、3エクソンに及ぶTRIB1遺伝子によりコードされるTRIB1タンパク質の量の欠失は、アテローム動脈硬化症の増大したリスクに関連づけられることが示されてきた。TRIB1が欠如したマウスは、脂肪分解の増加に伴って脂肪組織量を減少させることが示され、これにより、TRIB1の減少したレベルと、脂質代謝の機能不全とが明確に関連付けられた。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は、タンパク質であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ(PPARD)の不足によって引き起こされる脂質代謝欠損症を処置するために使用することができる。染色体6に位置し、8エクソンに及ぶPPARD遺伝子によりコードされるPPARDタンパク質の量の欠失は、増大した脂質代謝の機能障害に関連づけられることが示されてきた。

<肝臓炎> いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発明は、タンパク質である形質転換増殖因子ベータ−1(TGFB1)の不足によって引き起こされる肝臓炎を処置するために使用することができる。19q13.2に位置し、7エクソンに及ぶTGBF1遺伝子によりコードされるTGBF1タンパク質の量の欠失は、アテローム動脈硬化症の増大したリスクに関連づけられることが示されてきた。TGBF1(−/−)遺伝子型を示すノックアウトマウスは、CD4(+)T細胞媒介性炎症により重度の肝臓炎を発現させることが示された。そのような研究によって、TGBF1タンパク質の量の不足と、肝臓炎の増加した発生率との間の正相関が提供された。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は、タンパク質であるインターロイキン6(IL6)の不足によって引き起こされる脂質炎症を処置するために使用することができる。7p15.3に位置し、5エクソンに及ぶIL6遺伝子によりコードされるIL6タンパク質の量の欠失は、した脂質炎症に関連づけられることが示されてきた。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された発明は、セラミドシンターゼ2(CERS2)タンパク質の不足によって引き起こされる脂質代謝または脂肪性肝炎を処置するために使用することができる。1q21.3に位置し、11エクソンに及ぶCERS2遺伝子によりコードされるCERS2タンパク質の量の欠失は、脂肪性肝炎およびインスリン抵抗性に関連づけられることが示されてきた。

<ヘモクロマトーシス2B型> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性肝疾患のヘモクロマトーシス2B型(HFE2B)を処置するために使用されうる。HFE2B(そうでなければ鉄過剰として知られる)は、関節痛、疲労および脱力感によって特徴づけられ、最終的に器官障害を結果としてもたらす。

タンパク質であるヘプシジン抗菌ペプチド(HAMP)の不足は、HFE2Bにおいて示される臨床症状を結果として生じる。19q13.12に位置し、3エクソンに及ぶHAMP遺伝子は、HAMPタンパク質をコードする。不十分な量のHAMPタンパク質を結果としてもたらすHAMP遺伝子の変異が、HFE2Bの進行の原因であることが示されてきた。HFE2Bに悩む患者のG93およびR56のナンセンス変異が報告されてきたが、G71Dなどのミスセンス変異も発見されてきた。減少した量のHAMPタンパク質を結果としてもたらすこれらの突然変異がHFE2Bの直接的な原因であることが提唱され、それによってHAMPのレベルの減少と、HFE2Bの発生率との間の直接的な相関が提供された。

<血小板減少症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体優性の血小板減少症を処置するために使用されうる。血小板減少症は、血液中の血小板の量の減少によって特徴づけられる。血小板減少症の多くの場合が無症状であるが、いくらかの患者は鼻出血などの外出血、倦怠感、疲労および一般的な脱力感を経験する。

タンパク質であるトロンボポイエチン(THPO)の不足は、血小板減少症の発生率に関連づけられると示されてきた。3q27.1に位置し、6エクソンに及ぶTHPO遺伝子は、THPOタンパク質をコードする。不十分な量のTHPOタンパク質を結果としてもたらすTHPO遺伝子の変異が、血小板減少症の進行の原因であることが示されてきた。ある研究では、単一のヌクレオチド欠失が、血小板減少症に悩む家族の3世代で見られた。この研究によって、欠損の結果としてのTHPOタンパク質レベルの不足と、血小板減少症の発生率とは関連づけられた。

<非アルコール性脂肪性肝疾患> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を処置するために使用されうる。NAFLDは、肝臓における過剰なトリグリセリドの蓄積によって特徴づけられ、インスリン抵抗性および脂質異常症などの有害な代謝結果と関係しうる。NAFLDの進行に影響を与えうる因子は、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性を含む。いくつかの例では、肝臓に凝集した脂肪性沈着物よって炎症反応が促進される可能性があり、硬変または肝臓癌に進行しうる。

タンパク質であるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3(PNPLA3)の不足は、NAFLDの発生率に関連づけられることが示された。22q13に位置し、9エクソンに及ぶPNPLA3遺伝子は、PNPLA3タンパク質をコードする。不十分な量のPNPLA3タンパク質を結果としてもたらすPNPLA3遺伝子の変異が、NAFLDの進行の原因であることが示されてきた。C99G、G115C、I148M、T216P、およびK434Eなどの多型は、NAFLDの症状を表わす集団で発見された。これらのミスセンス変異はPNPLA3のレベルの減少を結果としてもたらすと示され、これにより、PNPLA3タンパク質の不足とNAFLDの進行との間の相関が提供される。

<ウィルソン病> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性障害のウィルソン病を処置するために使用されうる。ウィルソン病は、細胞内の肝銅の劇的な蓄積と、続いて起こる肝臓異常および神経異常によって特徴づけられる。ウィルソン病はそれ自体で、患者において、疲労、出血傾向もしくは錯乱の増加(肝性脳症による)、および門脈圧亢進症を示すこともある。

タンパク質である銅輸送ATPアーゼ2(ATP7B)の不足は、ウィルソン病の発生率に関連づけられることが示されてきた。13q14.3に位置し、21エクソンに及ぶATP7B遺伝子は、ATP7Bタンパク質をコードする。不十分な量のATP7Bタンパク質を結果としてもたらすATP7B遺伝子の変異が、ウィルソン病の進行の原因であることが示されてきた。L492S、Y532H、G591D、R616Q、およびG626AなどのATP7Bの突然変異は、ウィルソン病の症状を表わす集団で発見された。これらのミスセンス変異はATP7Bのレベルの減少を結果としてもたらすと示され、これにより、ATP7Bタンパク質の不足とウィルソン病の進行との間の相関が提供される。

<チロシン血症> いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発明は、チロシン血症を治療するために使用される。チロシン血症は、進行性の肝疾患、および低リン血症性くる病を引き起こす続発性の腎尿細管機能障害によって特徴づけられる。発現は幼時から青年期までと様々である。最も急性な型において、患者は出生後に数週間以内にひどい肝不全を示す一方で、くる病が慢性のチロシン血症における主要症状でありうる。未処置の場合、患者は硬変または肝細胞癌によって若くして死亡する。

タンパク質であるフマリルアセトアセターゼ(FAH)の不足は、チロシン血症の発生率に関連づけられると示されてきた。15q25.1に位置し、14エクソンに及ぶFAH遺伝子は、FAHタンパク質をコードする。不十分な量のFAHタンパク質を結果としてもたらすFAH遺伝子の変異が、FAHの進行の原因であることが示されてきた。N16I、A134D、C193R、D233V、およびQ279Rなどの多型は、FAHの症状を表わす集団で発見された。これらのミスセンス変異はFAHのレベルの減少を結果としてもたらすと示され、これにより、チロシン血症タンパク質の不足とFAHの進行との間の相関が提供される。

<アルギニノコハク酸分解酵素欠損症> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性障害のアルギニノコハク酸分解酵素欠損症を処置するために使用されうる。アルギニノコハク酸分解酵素欠損症は、精神遅滞および発育障害、肝腫大、皮膚病変、結節性裂毛症を微視的に示しかつ赤色蛍光を発するぱさつく毛、痙攣、ならびに一時的な意識消失によって特徴づけられる。

タンパク質であるフマリルアセトアセターゼ(ASL)の不足は、アルギニノコハク酸分解酵素欠損症の発生率に関連づけられると示されてきた。7q11.21に位置し、17エクソンに及ぶASL遺伝子は、ASLタンパク質をコードする。不十分な量のASLタンパク質を結果としてもたらすASL遺伝子の変異が、アルギニノコハク酸分解酵素欠損症の進行の原因であることが示されてきた。R113Q、V178M、R182Q、R236W、Q286R、およびR456Wなどの多型は、アルギニノコハク酸分解酵素欠損症の症状を表わす集団で発見された。これらのミスセンス変異はASLのレベルの減少を結果としてもたらすと示され、これにより、ASLタンパク質の不足とアルギニノコハク酸分解酵素欠損症の進行との間の相関が提供される。

<ヘモクロマトーシス1型> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性障害のヘモクロマトーシス1型を処置するために使用されうる。ヘモクロマトーシス1型は鉄過剰によって特徴づけられる。過剰な鉄分は、様々な器官に蓄積しそれらの機能不全を引き起こし、かつ硬変、肝細胞癌、糖尿病、心筋症、関節炎、および低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を含む深刻な病気を結果としてもたらす。進行性の鉄分蓄積の数十年間後まで、通常その病気の重大な影響は現われない。

遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質の不足は、ヘモクロマトーシス1型の発生率に関連づけられると示されてきた。6p22.2に位置し、6エクソンに及ぶHFE遺伝子は、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質をコードする。不十分な量の遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質を結果としてもたらすASL遺伝子の変異が、ヘモクロマトーシス1型欠損症の進行の原因であることが示されてきた。S65C、Q127H、A176V、C282Y、Q283P、およびV295Aなどの多型は、ヘモクロマトーシス1型の症状を表わす集団で発見された。これらのミスセンス変異は遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質のレベルの減少を結果としてもたらすと示され、これにより、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質の不足とヘモクロマトーシス1型の進行との間の相関が提供される。

<アルストレーム症候群> いくつかの実施形態では、本明細書において記載された本発明は、常染色体劣性障害のアルストレーム症候群を処置するために使用されうる。アルストレーム症候群は、進行性の錐体杆体網膜ジストロフィー、感音難聴、幼児期の肥満症、および2型糖尿病によって特徴づけられる。拡張型心筋症、黒色表皮腫、男性性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、発育遅延、および肝機能障害はまた、その症候群に関連付けられうる。

タンパク質であるアルストレーム症候群タンパク質1の不足は、アルストレーム症候群の発生率に関連づけられると示されてきた。2p13.1に位置し、23エクソンに及ぶALMS1遺伝子は、アルストレーム症候群タンパク質をコードする。不十分な量のアルストレーム症候群タンパク質1を結果としてもたらすALMS1遺伝子の変異が、アルストレーム症候群の進行の原因であることが示されてきた。V671G、G1412A、I1875V、S2111R、D2672H、およびK3434Eなどの多型は、アルストレーム症候群の症状を表わす集団で発見された。これらのミスセンス変異はアルストレーム症候群タンパク質1のレベルの減少を結果としてもたらすと示され、これにより、アルストレーム症候群タンパク質1の不足とアルストレーム症候群の進行との間の相関が提供される。

<先天性胆汁酸合成障害1> いくつかの実施形態では、本明細書において記述される発明は、常染色体劣性障害の先天性胆汁酸合成障害1(CBAS1)を処置するために使用することができる。CBAS1は、進行性の肝疾患を引き起こす胆汁合成の一次欠陥である。臨床的特徴は、新生児黄疸、重度の肝内胆汁うっ滞、硬変を含む。

タンパク質である3β−水酸化ステロイド脱水素酵素7型(3BHS7)の不足は、CBAS1の発生率に関連づけられると示されてきた。16p11.2に位置し、6エクソンに及ぶHSD3B7遺伝子は、3BHS7タンパク質をコードする。不十分な量の3BHS7タンパク質を結果としてもたらすHSD3B7遺伝子の変異が、CBAS1の進行の原因であることが示されてきた。G19S、E147K、T250A、およびL347Pなどの多型はCBAS1の症状を表わす集団で発見された。これらのミスセンス変異は3BHS7のレベルの減少を結果としてもたらすと示され、これにより、3BHS7タンパク質の不足とCBAS1の進行との間の相関が提供される。

<保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)> 実施形態では、本明細書の方法は、細胞核において、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5の遺伝子から転写され、かつアミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ヒドロキシメチルビランシンターゼ、超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼイソバレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4−アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子1−αアルブミン近接因子、タンパク質であるO−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子ベータ−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギニノコハク酸分解酵素、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3β−水酸化ステロイド脱水素酵素7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2、または核受容体コアクチベーター5タンパク質をコードする、保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)の存在を活用しうる。成熟し、完全にスプライスされたAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のmRNAを産生するための、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2またはNCOA5のRIC mRNA前駆体種のスプライシングは、保持されたイントロンのスプライシングアウトを刺激するASOを使用して誘発させることができる。結果としてもたらされる成熟したAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のmRNAは、細胞質に輸送され、翻訳され、それによって、患者の細胞中で、アミノメチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、超長鎖アシルCoA脱水素酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼイソバレリルCoAデヒドロゲナーゼ、アポリポタンパク質A−V、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1、肝細胞核因子4アルファ、グルコキナーゼ、肝核因子−1−αアルブミン近位因子、タンパク質であるO−グルコシルトランスフェラーゼ1、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット1、Tribbles−1、形質転換増殖因子ベータ−1、ヘモクロマトーシス2B型、トロンボポイエチン、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3、タンパク質銅輸送ATPアーゼ2、フマリルアセトアセターゼ、アルギノコハク酸分解酵素、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質、アルストレーム症候群タンパク質1、3β−水酸化ステロイド脱水素酵素7型、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ、インターロイキン6、セラミドシンターゼ2、または核受容体コアクチベーター5タンパク質の量を増大させ、各タンパク質の不足により引き起こされた、CNSの疾患または疾病の症状を緩和することができる。この方法は、以下で更に説明され、核内遺伝子出力の標的化増大(TANGO)として知られる。

AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5の遺伝子によって、イントロン保持事象を分析することができる。場合によっては、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、CERS2、またはNCOA5の遺伝子によって、イントロン保持事象を分析することができる。RNA配列決定(RNAseq)は、UCSCゲノムブラウザにおいて視覚化することができる、ヒト肝細胞中で発現し、細胞質または核分画のいずれかにおいて局在する、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、CERS2、またはNCOA5の転写産物を示しうる。いくつかの実施形態では、保持されたイントロンを含有するmRNA前駆体転写産物は、核中に保持され、細胞質に輸送されない。

実施形態では、保持されたイントロンは、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%あるいは少なくとも約50%の保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンはすなわち、約5%から約100%、約5%から約95%、約5%から約90%、約5%から約85%、約5%から約80%、約5%から約75%、約5%から約70%、約5%から約65%、約5%から約60%、約5%から約65%、約5%から約60%、約5%から約55%、約5%から約50%、約5%から約45%、約5%から約40%、約5%から約35%、約5%から約30%、約5%から約25%、約5%から約20%、約5%から約15%、約10%から約100%、約10%から約95%、約10%から約90%、約10%から約85%、約10%から約80%、約10%から約75%、約10%から約70%、約10%から約65%、約10%から約60%、約10%から約65%、約10%から約60%、約10%から約55%、約10%から約50%、約10%から約45%、約10%から約40%、約10%から約35%、約10%から約30%、約10%から約25%、約10%から約20%、約15%から約100%、約15%から約95%、約15%から約90%、約15%から約85%、約15%から約80%、約15%から約75%、約15%から約70%、約15%から約65%、約15%から約60%、約15%から約65%、約15%から約60%、約15%から約55%、約15%から約50%、約15%から約45%、約15%から約40%、約15%から約35%、約15%から約30%、約15%から約25%、約20%から約100%、約20%から約95%、約20%から約90%、約20%から約85%、約20%から約80%、約20%から約75%、約20%から約70%、約20%から約65%、約20%から約60%、約20%から約65%、約20%から約60%、約20%から約55%、約20%から約50%、約20%から約45%、約20%から約40%、約20%から約35%、約20%から約30%、約25%から約100%、約25%から約95%、約25%から約90%、約25%から約85%、約25%から約80%、約25%から約75%、約25%から約70%、約25%から約65%、約25%から約60%、約25%から約65%、約25%から約60%、約25%から約55%、約25%から約50%、約25%から約45%、約25%から約40%、あるいは約25%から約35%の保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。複数の実施形態では、この目的に有用な他のASOは、例えば、本明細書に記載の方法を用いて特定される。

実施形態では、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のイントロンの番号付けは、表1または表2に示される1以上のmRNA配列に対応する。実施形態では、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分は、表1または表2に示されるような1以上のイントロン中にある。実施形態では、RIC mRNA前駆体の標的部分に対するASOのハイブリダイゼーションは、表1または表2に示されるような1以上の保持されたイントロンのスプライス部位(5’スプライス部位または3’スプライス部位)のスプライシングの増強を結果としてもたらし、その後、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のタンパク質産生を増大させる。イントロンの番号付けは、様々なAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のアイソフォーム配列を参照して変化することが理解される。当業者は、本明細書で提供されるイントロン配列に基づき、あるいは表1または表2において示される1以上のmRNA配列を参照して得られる番号を使用することで、任意のアイソフォームにおける対応するイントロン番号を判定することができる。当業者は、本発明の方法を使用して、本明細書において提供されるイントロン配列に基づいて、または表1または表2に示される1以上のmRNA配列を参照して得られるイントロンの番号を使用して、標的とするためのAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のアイソフォームに隣接するエクソンの配列を判定することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるASOは、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のゲノム配列から転写されるRIC mRNA前駆体を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるASOは、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の配列を標的とする。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるASOは、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のゲノム配列によってコードされるRIC mRNA前駆体転写産物の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるASOは、表1または表2に示されるような保持されたイントロンを含む、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のゲノム配列によってコードされるRIC mRNA前駆体転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、SEQ ID NO:1−31よってコードされたRIC mRNA前駆体を標的とする。

幾つかの実施形態では、ASOは、SEQ ID NO:32−130のRIC mRNA前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示されるような保持されたイントロンを含む、SEQ ID NO:32−130のRIC mRNA前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるASOは、SEQ ID NO:78349−78501を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、SEQ ID NO:131−78348のうちいずれか1つの配列を含む。

いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、表1または表2に示される保持されたイントロン上流のエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、表1または表2に示される保持されたイントロンの5’スプライス部位から上流(あるいは5’)のエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、5’スプライス部位から約4から約1000のヌクレオチド上流(あるいは5’)のエクソン配列を標的とする。

いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、表1または表2に示される保持されたイントロン上流のイントロン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、表1または表2に示される保持されたイントロンの5’スプライス部位から下流(あるいは3’)のイントロン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の、5’スプライス部位よりも約6から約500のヌクレオチド下流(あるいは3’)のエクソン配列を標的とする。

いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、表1または表2に示される保持されたイントロン下流のエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、表1または表2に示される保持されたイントロンの3’スプライス部位から下流(あるいは3’)のエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ASOは、表1または表2に示される保持されたイントロンを含むAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の、3’スプライス部位よりも約2から約1000のヌクレオチド下流(あるいは3’)のエクソン配列を標的とする。 タンパク質発現

実施形態では、本明細書に記載される方法は、機能的タンパク質産生を増加させるために使用される。本明細書において使用されるように、用語「機能的」は、処置される疾病の1つ以上の症状を除去するのに必要なタンパク質の活性または機能の量を指す。実施形態では、部分的機能的タンパク質の産生を増加させるために、前記方法は使用される。本明細書において使用されるように、用語「部分的機能的」は、疾患または疾病の1つ以上の症状を除去あるいは予防するために必要な活性または機能の量未満の、タンパク質の活性または機能の量を指す。いくつかの実施形態では、部分的機能的タンパク質またはRNAは、完全な機能的タンパク質またはRNAに比して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、85%、少なくとも90%、または少なくとも95%少ない活性を持つだろう。

実施形態では、該方法は、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体を有する被験体の細胞によって、タンパク質の発現を増加させる方法であり、該被験体は、本明細書に記載されたタンパク質の活性量の不足に起因する、本明細書に記載の疾病を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質量の不足は、タンパク質のハプロ不全に起因する。そのような実施形態では、被験体は、機能的タンパク質をコードする第1の対立遺伝子と、タンパク質が産生されない第2の対立遺伝子とを有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的タンパク質をコードする第1の対立遺伝子と、非機能的タンパク質をコードする第2の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的タンパク質をコードする第1の対立遺伝子と、部分的機能的タンパク質をコードする第2の対立遺伝子を有する。これらの実施形態のいずれの場合でも、アンチセンスオリゴマーは、第1の対立遺伝子(機能的タンパク質をコードする)から転写されたRIC mRNA前駆体の標的部分に結合し、それによって、RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、機能的タンパク質をコードする成熟mRNAレベルの増加と、被験体の細胞中のタンパク質発現の増加をもたらす。

実施形態では、被験体は、機能的タンパク質をコードする第1の対立遺伝子と、部分的機能的タンパク質をコードする第2の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第1の対立遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の標的部分、あるいは第2の対立遺伝子(部分的機能的タンパク質をコードする)から転写されたRIC mRNA前駆体の標的部分に結合し、それによって、RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、タンパク質をコードする成熟mRNAレベルの増加と、被験体の細胞中の機能的あるいは部分的機能的タンパク質発現の増加をもたらす。

関連する実施形態では、前記方法は、タンパク質あるいは機能的RNAの発現を増加させるためにASOを用いる方法である。実施形態では、ASOは、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体を有する被験体の細胞における、本明細書に記載のタンパク質の発現を増加させるために使用され、該被験体は、タンパク質の量または機能の不足を有する。

実施形態では、疾患または疾病の原因となる、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の転写産物は、本明細書に記載されるASOによって標的化される。いくつかの実施形態では、疾患の原因ではない、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の転写産物は、ASOによって標的化される。例えば、特定の経路における第1のタンパク質の突然変異または不足の結果として生じる疾患は、第2のタンパク質をコードするRIC mRNA前駆体を標的とすることによって改善され得、それによって第2のタンパク質産生は増加する。いくつかの実施形態では、第2のタンパク質の機能は、(疾患または疾病の原因である)第1のタンパク質の突然変異または不足を補うことができる。

実施形態では、被験体は: a) i)タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、 ii)タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは iii)タンパク質または機能的RNAが産生されない、第1の変異対立遺伝子;および b) i)タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、 ii)タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは iii)タンパク質が産生されない、第2の変異対立遺伝子を有し; ここでRIC mRNA前駆体は、第1の対立遺伝子および/または第2の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、ASOは、第1の対立遺伝子または第2の対立遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の標的部分に結合することで、RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、タンパク質をコードするmRNAレベルの増加を引き起こし、被験体の細胞中の標的タンパク質または機能的RNAの発現の増加をもたらす。これらの実施形態では、RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングの結果として生じる、発現レベルの増加を有する標的タンパク質あるいは機能的RNAは、同等の野性型タンパク質と比較して機能性の低い形態(部分的機能的)、あるいは同等の野性型タンパク質と比較して完全な機能性を有する(完全機能的)、のいずれかで有り得る。

実施形態では、本明細書に記載のタンパク質をコードするmRNAのレベルは、例えば、アンチセンスオリゴマーで処置されない、あるいはRIC mRNA前駆体の標的部分と結合しないアンチセンスオリゴマーで処置された対照細胞内で産生されたタンパク質をコードするmRNAの量と比較した場合、1.1倍から10倍に増加する。

実施形態では、タンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、ASOが標的とされる保持されたイントロンの選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。実施形態では、タンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体内の保持されたイントロンの選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。実施形態では、選択的スプライシングあるいは異常スプライシングが、遺伝子から転写されたmRNA前駆体に生じ得る。しかしながら、本発明の組成物および方法は、mRNA前駆体内の選択的スプライシングあるいは異常スプライシングを予防しないし、修正しない。

実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、1つの対立遺伝子から部分的機能的タンパク質を発現し、その部分的機能的タンパク質は、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、あるいは部分的な遺伝子欠失に起因する。実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、1つの対立遺伝子から非機能的タンパク質を発現し、その非機能的タンパク質は、1つの対立遺伝子におけるフレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、部分的な遺伝子欠失に起因する。実施形態では、本発明の方法を用いて処置された被験体は、1つの対立遺伝子に全遺伝子欠失を有する。 タンパク質発現を増加させるためのTANGOの使用

前述したように、実施形態では、核内遺伝子出力の標的とされた増強(TANGO)は、タンパク質の発現を増加させるために、本発明の方法において使用される。これらの実施形態では、タンパク質をコードする保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)は、細胞の核内にある。タンパク質をコードする、保持されたイントロン、5’スプライス部位に隣接するエクソン、および3’スプライス部位に隣接するエクソンを含むRIC mRNA前駆体を有する細胞を、RIC mRNA前駆体の標的部分に対して相補的なアンチセンスオリゴマー(ASO)と接触させる。RIC mRNA前駆体の標的部分へのASOのハイブリダイゼーションは、保持されたイントロンのスプライス部位(5’スプライス部位あるいは3’スプライス部位)のスプライシングを増強し、その後の標的タンパク質産生を増加させる。

用語「mRNA前駆体」および「mRNA前駆体の転写産物」は、交換可能に使用され、少なくとも1つのイントロンを含むmRNA前駆体種を指す。実施形態では、mRNA前駆体またはmRNA前駆体の転写産物は、5’−7−メチルグアノシンキャップ、および/またはポリA末端を含む。実施形態では、mRNA前駆体またはmRNA前駆体の転写産物は、5’−7−メチルグアノシンキャップおよびポリA末端の両方を含む。いくつかの実施形態では、mRNA前駆体の転写産物は、5’−7−メチルグアノシンキャップ、および/またはポリA末端を含まない。タンパク質に翻訳されない場合(あるいは核から細胞質へと輸送された場合)、mRNA前駆体の転写産物は非生産的メッセンジャーRNA(mRNA)分子である。

本明細書において使用されるように、「保持されたイントロン含有mRNA前駆体」(「RIC mRNA前駆体」)は、少なくとも1つの保持されたイントロンを含むmRNA前駆体の転写産物である。RIC mRNA前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、標的タンパク質をコードする。「標的タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体」は、完全にスプライシングされた場合に、標的タンパク質をコードすると解される。「保持されたイントロン」は、同じ遺伝子によってコードされた、隣接するイントロン等の1つ以上の他のイントロンが、同じmRNA前駆体の転写産物からスプライシングアウトされた場合に、mRNA前駆体の転写産物に存在するイントロンである。いくつかの実施形態では、保持されたイントロンは、標的タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体において最も豊富なイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞内の標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の集団において最も豊富なイントロンであり、当該RIC mRNA前駆体の集団は2つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の集団において最も豊富なイントロンに標的とされたアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とされた、あるいは結合する保持されたイントロンを含む集団内の、2つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。実施形態では、標的タンパク質をコードする成熟mRNAは、それによって産生される。「成熟mRNA」および「完全にスプライシングされたmRNA」の用語は、標的タンパク質をコードする完全に処理されたmRNA(例えば、核から細胞質へと輸送され、標的タンパク質に翻訳されたmRNA)、あるいは完全に処理された機能的RNAを記載するように、本明細書において交換可能に使用される。用語「生産的mRNA」もまた、標的タンパク質をコードする完全に処理されたmRNAについて記載するように使用することができる。実施形態では、標的領域は、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体に最も豊富に存在する保持されたイントロンにある。

本明細書において使用されるように、用語「含む(comprise)」、あるいは「含む(comprises)」または「含む(comprising)」等の変化形は、列挙された特徴(例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、定義された核酸塩基配列)を含むが、他のいかなる特徴をも除外しないことを示すと解されるべきである。したがって、本明細書において使用されるように、用語「含む(comprising)」は包含的で、追加の列挙されていない特徴(例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、追加の列挙されていない核酸塩基の存在)を除外しない。

本明細書において提供される組成物および方法のいずれかの実施形態において、「含む(comprising)」は「から本質的に成る(consisting essentially)」または「から成る(consisting of)」と置換可能である。「から本質的に成る(consisting essentially)」という句は、特定された特徴(例えば核酸塩基配列)と共に、請求される本発明の性質または機能に実質的に影響しない特徴も必要とするために本明細書で使用される。本明細書で使用されるように、用語「成る(consisting)」は、列挙された特徴(例えば核酸塩基配列)単独の存在を示すために使用される(その結果、特定された核酸塩基配列から成るアンチセンスオリゴマーの場合には、追加の列挙されていない核酸塩基の存在は除外される)。

実施形態では、標的領域は、本明細書に記載のタンパク質をコードするRIC mRNA前駆体に2番目に豊富に存在するイントロンである保持されたイントロンにある。例えば、2番目に豊富な保持されたイントロンは、最も豊富な保持されたイントロンよりむしろ標的とされ得る。その要因は、2番目に豊富な保持されたイントロンのヌクレオチド配列の独自性、特定のヌクレオチド配列を標的とするASO設計の容易さ、および/またはASOによりイントロンを標的とすることから生じるタンパク質産生量の増加である。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞内の標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体集団において2番目に豊富なイントロンであり、そのRIC mRNA前駆体集団は、2つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体集団における2番目に豊富なイントロンを標的とするアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とする、または結合する保持されたイントロンを含む集団において、2つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする完全にスプライシングされた(成熟)RNAが産生される。

実施形態では、ASOは、RIC mRNA前駆体の保持されていないイントロン内にある標的領域に相補的である。実施形態では、RIC mRNA前駆体の標的部分は:保持されていないイントロンの5’スプライス部位に対する+6から+100の領域;または保持されていないイントロンの3’スプライス部位に対する−16から−100の領域内にある。実施形態では、RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されていないイントロンの5’スプライス部位に対する+100の領域から、保持されていないイントロンの3’スプライス部位に対する−100の領域内にある。領域または配列の位置を特定するために使用されるように、「内(within)」は、列挙される位置の残基を含むと理解される。例えば、+6から+100の領域は、+6および+100の位置の残基を含む。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする完全にスプライシングされた(成熟)RNAが産生される。

実施形態では、RIC mRNA前駆体の保持されたイントロンは、非効率的にスプライシングされたイントロンである。本明細書で使用されるように、「非効率的にスプライシングされた」は、RIC mRNA前駆体における別のスプライス部位でのスプライシングの頻度と比較して、保持されたイントロンに隣接するスプライス部位(5’スプライス部位または3’スプライス部位)でのスプライシングの頻度が比較的低いことを指し得る。用語「非効率的にスプライシングされた」はまた、スプライス部位でのスプライシングの相対速度または動態(kinetics)を指し得る。この「非効率的にスプライシングされた」イントロンは、RIC mRNA前駆体における別のイントロンと比較して、より遅い速度でスプライシングあるいは除去され得る。

実施形態では、5’スプライス部位に隣接するエクソンの−3eから−1e、および保持されたイントロンの+1から+6の9−ヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。実施形態では、保持されたイントロンの−15から−1および3’スプライス部位に隣接するエクソンの+1eの16ヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。本明細書で使用される「野生型配列」は、生体および科学の情報のNCBIリポジトリ(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine,8600 Rockville Pike,Bethesda,MD USA 20894によって運営される)に寄託された公開された参照ゲノムにおける標的遺伝子に対するヌクレオチド配列を指す。さらに本明細書で使用されるように、「e」で示されたヌクレオチド位置は、ヌクレオチドがエクソン(例えば、5’スプライス部位に隣接するエクソン、または3’スプライス部位に隣接するエクソン)の配列中に存在することを示す。

該方法では、細胞を、本明細書に記載のタンパク質をコードするmRNA前駆体の一部に相補的であるASOと接触させる工程であって、結果としてタンパク質発現が増加する工程を含む。本明細書で使用されるように、細胞に「接触させる」または投与することは、ASOと細胞が相互作用するように、ASOを細胞に即座に近接させる方法を指す。ASOと接触させられる細胞は、ASOを細胞へと取り込む又は輸送する。該方法は、疾病または疾患に関係する、あるいは疾病または疾患に関連する細胞を、ASOと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ASOは、ASOを細胞型に対して標的とする、ASOと疾病または疾患に関係する又は疾病または疾患に関連する細胞との間の接触を増強する、またはASOの取り込みを増強するために、さらに修飾され得るかまたは別の分子に結合され得る(例えば、共有結合される)。

本明細書で使用されるように、用語「タンパク質産生を増加させる」または「標的タンパク質の発現を増加させる」は、細胞中のmRNAから翻訳されるタンパク質の量を増加させることを意味する。「標的タンパク質」は、発現/産生の増加が望まれるタンパク質で有り得る。

実施形態では、例えば、RIC mRNA前駆体を発現する細胞を、RIC mRNA前駆体の転写産物の標的部分に相補的であるASOと接触させる工程は、結果として、mRNA前駆体によってコードされるタンパク質(例えば標的タンパク質)の量の測定可能な増加をもたらす。タンパク質の産生を測定または検出する方法は、当業者に明白となり、あらゆる既知の方法、例えば、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびELISAを含む。

実施形態では、細胞を、RIC mRNAの転写産物の標的部分に相補的であるASOに接触させる工程は、結果として、ASOの欠如/処置の欠如下における細胞によって産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、または1000%の、産生されたタンパク質の量の増加をもたらす。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞によって産生されたタンパク質の合計量は、対照化合物により産生された標的タンパク質の量と比較して、約1.1倍から約10倍、約1.5倍から約10倍、約2倍から約10倍、約3倍から約10倍、約4倍から約10倍、約1.1倍から約5倍、約1.1倍から約6倍、約1.1倍から約7倍、 約1.1倍から約8倍、約1.1倍から約9倍、約2倍から約5倍、約2倍から約6倍、約2倍から約7倍、約2倍から約8倍、約2倍から約9倍、約3倍から約6倍、約3倍から約7倍、約3倍から約8倍、約3倍から約9倍、約4倍から約7倍、 約4倍から約8倍、約4倍から約9倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍に増加する。対照化合物は、例えば、RIC mRNA前駆体の標的部分に相補的でないオリゴヌクレオチドで有り得る。

いくつかの実施形態では、細胞を、RIC mRNA前駆体の転写産物の標的部分に相補的であるASOと接触させる工程は、結果として、標的タンパク質をコードする成熟mRNAを含む、タンパク質をコードするmRNA量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするmRNA、またはタンパク質をコードする成熟mRNAの量はASOの欠如/処置の欠如下における細胞によって産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、または1000%増加する。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするmRNA、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞において産生されたタンパク質をコードする成熟mRNAの合計量は、例えば、処置されていない細胞または対照化合物で処置された細胞などの、処置されていない細胞で産生された成熟RNA量と比較して、約1.1倍から約10倍、約1.5倍から約10倍、約2倍から約10倍、約3倍から約10倍、約4倍から約10倍、約1.1倍から約5倍、約1.1倍から約6倍、約1.1倍から約7倍、約1.1倍から約8倍、約1.1倍から約9倍、約2倍から約5倍、約2倍から約6倍、約2倍から約7倍、約2倍から約8倍、約2倍から約9倍、約3倍から約6倍、約3倍から約7倍、約3倍から約8倍、約3倍から約9倍、約4倍から約7倍、約4倍から約8倍、約4倍から約9倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍に増加する。対照化合物は、例えば、RIC mRNA前駆体の標的部分に相補的でないオリゴヌクレオチドでもよい。 RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシング

本明細書で提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、タンパク質をコードするmRNA、またはタンパク質をコードする成熟mRNAのレベルを増加させることによって、例えば、本明細書に記載のタンパク質の量または活性の不足がもたらす本明細書に記載の疾病を有する被験体において、細胞内のタンパク質の発現を増加させることに有用である。特に、本明細書に記載される方法および組成物は、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の転写産物からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、それによって、タンパク質をコードするmRNA、またはタンパク質をコードする成熟mRNAのレベルが増加し、タンパク質の発現が増加する。

RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、保持されたイントロンをRIC mRNA前駆体から正しく除去し、ここで保持されたイントロンは、野生型スプライス配列を有する。構成的スプライシングは、本明細書で使用されるように、遺伝子または対立遺伝子から転写されたmRNA前駆体の選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有する遺伝子または対立遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンのスプライシングを包含しない。例えば、本明細書で提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して誘発された、保持されたイントロンの構成的スプライシングは、mRNA前駆体における異常スプライシングを訂正しない、またはmRNA前駆体の選択的スプライシングに影響せず、結果的に標的タンパク質または機能的RNAの発現が増加する。

実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをRIC mRNA前駆体から正しく除去し、ここでRIC mRNA前駆体は、野生型の遺伝子または対立遺伝子、あるいは多形性の遺伝子または対立遺伝子から転写され、完全に機能的な標的タンパク質または機能的RNAをコードし、遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。

いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体から、保持されたイントロンを正しく除去し、ここでRIC mRNA前駆体は、野生型対立遺伝子からの産生と比較して減少したレベルで標的遺伝子あるいは機能的RNAを産生する遺伝子または対立遺伝子から転写され、および遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。これらの実施形態では、構成的スプライシングをされた保持されたイントロンの正しい除去は、結果として、同等の野生型タンパク質または機能的RNAと比較したときに機能的である標的タンパク質または機能的RNAの産生をもたらす。

他の実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをRIC mRNA前駆体から正しく除去し、ここでRIC mRNA前駆体は、同等の野生型タンパク質または機能的RNAと比較して、機能の低下した形態で産生された標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子または対立遺伝子から転写され、遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。これらの実施形態では、構成的にスプライシングされた保持されたイントロンの正しい除去は、結果として、部分的に機能的な標的タンパク質、または同等の野生型タンパク質または機能的RNAと比較したときに部分的に機能的である機能的RNAの産生をもたらす。

構成的スプライシングによる保持されたイントロンの「正しい除去」は、エクソンのいかなる部分も除去することのない、全イントロンの除去を指す。

実施形態では、本明細書に記載されるような、または本明細書に記載される方法に使用されるアンチセンスオリゴマーは、遺伝子から転写されたmRNA前駆体の選択的スプライシングまたは異常スプライシングを調節することによって、タンパク質をコードするmRNAの量、またはタンパク質の量を増加させない。選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、RNA種の配列および長さを解析する既知の方法を使用して、例えば、RT−PCRによって、および本明細書および文献中で別記される方法を使用して測定することができる。実施形態では、選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、対象となるスプライシングされた種の量の、少なくとも10%または1.1倍の増加または減少に基づいて判定される。実施形態では、調節は、本発明の方法においてタンパク質をコードするmRNAの増加の判定に関して本明細書に記載されるように、少なくとも10%から100%または1.1倍から10倍のレベルでの増加または減少に基づいて判定される。

実施形態では、該方法は、RIC mRNA前駆体が、野生型mRNA前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、該方法は、RIC mRNA前駆体が、全長の野生型mRNA前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、RIC mRNA前駆体は、全長のmRNA前駆体の部分的スプライシングによって産生された。これらの実施形態では、全長のmRNA前駆体は、野生型スプライス部位配列を有する保持されたイントロンのスプライシングと比較して、保持されたイントロンの正しいスプライシングを損なわない保持されたイントロンのスプライス部位に多型を有し得る。

実施形態では、タンパク質をコードするmRNAは、全長の成熟mRNAまたは野生型成熟mRNAである。これらの実施形態では、全長の成熟mRNAは、野生型成熟mRNAによってコードされたタンパク質の活性と比較して、成熟mRNAによってコードされた標的タンパク質または機能的RNAの活性に影響しない多型を有し得る。 アンチセンスオリゴマー

本開示の一態様は、RIC mRNA前駆体の標的部分に結合することによってスプライシングを増強するアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。本明細書で使用されるように、用語「ASO」および「アンチセンスオリゴマー」は交換可能に使用され、ワトソン・クリック塩基対またはゆらぎ塩基対(G−U)によって標的核酸(例えば、RIC mRNA前駆体)配列にハイブリダイズする、核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドなどのオリゴマーを指す。ASOは、標的配列に相補的な、またはほぼ相補的(例えば、標的配列に結合し、スプライス部位でスプライシングを増強させるのに十分な相補性)である正確な配列を有し得る。ASOは、標的核酸(例えば、mRNA前駆体の転写産物の標的とされた部分)に結合し(ハイブリダイズし)、生理学的条件下でハイブリダイズされたままであるように設計されている。典型的に、ASOは、意図した(標的とされた)核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合、標的核酸でない限られた数の配列に(標的核酸以外の少数の部位に)ハイブリダイズする。ASOの設計は、mRNA前駆体の転写産物の標的とされた部分の核酸配列、あるいはゲノムまたは細胞のmRNA前駆体またはトランスクリプトームにおける他の場所での十分に類似した核酸配列の発生を考慮に入れることができ、その結果、ASOが他の部位に結合し「オフターゲット」効果を引き起こす可能性は限定される。例えば、発明の名称「Reducing Nonsense−Mediated mRNA Decay」のWO2015/035091として公開されたPCT国際出願番号PCT/US2014/054151におけるものなどの、当業者に既知のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に記載される方法を実施するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、ASOは、標的核酸またはRIC mRNA前駆体の標的とされた部分に「特異的にハイブリダイズする」または「特異的である」。典型的に、そのようなハイブリダイゼーションは、37℃より実質的に高い融解温度(Tm)で、好ましくは少なくとも50℃で、および典型的に60℃からおよそ90℃の間で生じる。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、厳しいハイブリダイゼーション条件に対応している。与えられたイオン強度およびpHで、Tmは、標的配列の50%が相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。

オリゴヌクレオチドなどのオリゴマーは、ハイブリダイゼーションが2つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行構成で生じるときに、互いに「相補的」である。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第1のポリヌクレオチドの鎖の1つと第2のポリヌクレオチドの鎖の1つとの間に生じる場合に、別のポリヌクレオチドに「相補的」であり得る。相補性(1つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度)は、一般に容認された塩基対合則に従って、互いに水素結合を形成すると予期される対向する鎖における塩基の割合(例えばパーセンテージ)の点から数量化できる。アンチセンスオリゴマー(ASO)の配列は、ハイブリダイズするその標的核酸の配列に100%相補的である必要はない。特定の実施形態では、ASOは、標的とされる標的核酸配列内の標的部分に対する、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列相補性を含み得る。例えば、オリゴマー化合物の20の核酸塩基のうちの18が標的領域に相補的であり、それゆえに特異的にハイブリダイズするASOは、90パーセントの相補性を表わす。この例において、残りの相補的でない核酸塩基は、ともにクラスター化され得るか、または相補的な核酸塩基と分散され(interspersed)、互いに又は相補的な核酸塩基に隣接している必要はない。ASOの標的核酸の領域とのパーセント相補性は、BLASTプログラム(基礎的なローカルアライメント検索ツール)および当該技術分野で既知のPowerBLASTプログラム(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403−410;Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649−656)を慣例的に使用して判定され得る。

ASOは、標的配列におけるすべての核酸塩基にハイブリダイズする必要はなく、それがハイブリダイズする核酸塩基は、隣接しているか又は隣接していないこともある。ASOは、mRNA前駆体の転写産物の1つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし得、その結果、介在する又は隣接するセグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関係しない(例えば、ループ構造またはヘアピン構造が形成され得る)。特定の実施形態では、ASOは、標的mRNA前駆体の転写産物において隣接していない核酸塩基にハイブリダイズする。例えば、ASOは、ASOがハイブリダイズしない1つ以上の核酸塩基によって分離される、mRNA前駆体の転写産物における核酸塩基にハイブリダイズすることができる。

本明細書に記載されるASOは、RIC mRNA前駆体の標的部分に存在する核酸塩基に相補的である核酸塩基を含む。用語「ASO」は、オリゴヌクレオチド、および標的mRNA上の相補的な核酸塩基にハイブリダイズすることができる核酸塩基を含むが、ペプチド核酸(PNA)などの糖部を含まない、他のオリゴマー分子を具体化する。ASOは、自然発生のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾されたヌクレオチド、またはそれらの2つ又は3つの任意の組み合わせを含み得る。用語「自然発生のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾された又は置換された糖類及び/又は修飾された骨格を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ASOのヌクレオチドのすべてが、修飾されたヌクレオチドである。本明細書に記載される方法および組成物と適合性のあるASOの化学修飾およびASOの成分は、当業者に明白となり、例えば、米国特許第8,258,109号 B2、米国特許第5,656,612号、米国特許公開番号2012/0190728、およびDias and Stein,Mol.Cancer Ther.2002,347−355に見出すことができ、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。

ASOの核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどの自然発生の未修飾の核酸塩基、または標的mRNA前駆体上に存在する核酸塩基との水素結合が可能であるように未修飾の核酸塩基に十分に類似している合成または修飾された核酸塩基であり得る。修飾された核酸塩基の例としては、限定されないが、ヒポキサンチン、キサンチン、7−メチルグアニン、5,6−ジヒドロウラシル、5−メチルシトシン、および5−ヒドロキシメチルシトシンが挙げられる。

本明細書に記載されるASOはまた、オリゴマーの成分に結合する骨格構造を含む。用語「骨格構造」および「オリゴマー結合」は、交換可能に使用され、ASOの単量体間の結合を指し得る。自然発生のオリゴヌクレオチドでは、骨格は、オリゴマーの糖部を結合する3’−5’ホスホジエステル結合を含む。本明細書に記載されるASOの骨格構造またはオリゴマー結合は、(限定されないが)ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート(phosphoraniladate)、ホスホラミデート(phosphoramidate)などを含む。例えば、LaPlanche et al.,Nucleic Acids Res.14:9081(1986);Stec et al.,J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984),Stein et al.,Nucleic Acids Res.16:3209(1988),Zon et al.,Anti Cancer Drug Design 6:539(1991);Zon et al.,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,pp.87−108(F.Eckstein,Ed.,Oxford University Press,Oxford England(1991));Stec et al.,米国特許第5,151,510号;Uhlmann and Peyman,Chemical Reviews 90:543(1990)を参照されたい。幾つかの実施形態では、ASOの骨格構造は、亜リン酸を含有していないが、例えば、ペプチド核酸(PNA)、またはカルバミン酸塩、アミド、および直鎖および環式の炭化水素基を含む連結基において、ペプチド結合を含有している。幾つかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホロチオエート結合である。幾つかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホラミデート結合である。

実施形態では、ASO骨格のリンヌクレオチド間の結合の各々での立体化学は、ランダムである。実施形態では、ASO骨格のリンヌクレオチド間の結合の各々での立体化学は、制御され、ランダムではない。例えば、引用によって本明細書に組み込まれた米国特許公開番号2014/0194610、「Methods for the Synthesis of Functionalized Nucleic Acids」は、核酸オリゴマーにおいて各リン原子でキラリティーの利き手(handedness)を独立して選択する方法について記載している。実施形態では、本発明の方法において使用されるASOは、ランダムではないリンヌクレオチド間の結合を有するASOを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、純粋なジアステレオマーASOを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、約100%、約90%から約100%、約91%から約100%、約92%から約100%、約93%から約100%、約94%から約100%、約95%から約100%、約96%から約100%、約97%から約100%、約98%から約100%、または約99%から約100%のジアステレオマー純度を有するASOを含む。

実施形態では、ASOは、そのリンヌクレオチド間の連鎖でRpおよびSpの構成のランダムでない混合物を有している。例えば、RpとSpの混合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、優れた活性とヌクレアーゼ安定性との間のバランスを達成するために必要であることが示唆されてきた(Wan,et al.,2014,「Synthesis,biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages」Nucleic Acids Research 42(22):13456−13468、引用によって本明細書に組み込まれる)。実施形態では、本発明の方法において使用されるASOは、約5〜100%のRp、少なくとも約5%のRp、少なくとも約10%のRp、少なくとも約15%のRp、少なくとも約20%のRp、少なくとも約25%のRp、少なくとも約30%のRp、少なくとも約35%のRp、少なくとも約40%のRp、少なくとも約45%のRp、少なくとも約50%のRp、少なくとも約55%のRp、少なくとも約60%のRp、少なくとも約65%のRp、少なくとも約70%のRp、少なくとも約75%のRp、少なくとも約80%のRp、少なくとも約85%のRp、少なくとも約90%のRp、または少なくとも約95%のRpと、残りのSp、あるいは約100%のRpを含む。実施形態では、本発明の方法で使用されるASOは、約10%から約100%のRp、約15%から約100%のRp、約20%から約100%のRp、約25%から約100%のRp、約30%から約100%のRp、約35%から約100%のRp、約40%から約100%のRp、約45%から約100%のRp、約50%から約100%のRp、約55%から約100%のRp、約60%から約100%のRp、約65%から約100%のRp、約70%から約100%のRp、約75%から約100%のRp、約80%から約100%のRp、約85%から約100%のRp、約90%から約100%のRp、約95%から約100%のRp、約20%から約80%のRp、約25%から約75%のRp、約30%から約70%のRp、約40%から約60%のRp、または約45%から約55%のRpと、残りのSpを含む。

実施形態では、本発明の方法で使用されるASOは、約5〜100%のSp、少なくとも約5%のSp、少なくとも約10%のSp、少なくとも約15%のSp、少なくとも約20%のSp、少なくとも約25%のSp、少なくとも約30%のSp、少なくとも約35%のSp、少なくとも約40%のSp、少なくとも約45%のSp、少なくとも約50%のSp、少なくとも約55%のSp、少なくとも約60%のSp、少なくとも約65%のSp、少なくとも約70%のSp、少なくとも約75%のSp、少なくとも約80%のSp、少なくとも約85%のSp、少なくとも約90%のSp、または少なくとも約95%のSpと、残りのRp、あるいは約100%のSpを含む。実施形態では、本発明の方法で使用されるASOは、約10%から約100%のSp、約15%から約100%のSp、約20%から約100%のSp、約25%から約100%のSp、約30%から約100%のSp、約35%から約100%のSp、約40%から約100%のSp、約45%から約100%のSp、約50%から約100%のSp、約55%から約100%のSp、約60%から約100%のSp、約65%から約100%のSp、約70%から約100%のSp、約75%から約100%のSp、約80%から約100%のSp、約85%から約100%のSp、約90%から約100%のSp、または約95%から約100%のSp、約20%から約80%のSp、約25%から約75%のSp、約30%から約70%のSp、約40%から約60%のSp、または約45%から約55%のSpと、残りのRpを含む。

本明細書に記載されるASOのいずれかは、自然発生のヌクレオチド中に存在するような、リボースまたはデオキシリボースを含む糖部、あるいはモルホリン環を含む、修飾された糖部または糖アナログを含有し得る。修飾された糖部の限定しない例は、2’−O−メチル(2’−O−Me)、2’−O−メトキシエチル(2’MOE)、2’−O−アミノエチル、2’F;N3’−>P5’ホスホラミデート、2’ジメチルアミノオキシエトキシ、2’ジメチルアミノエトキシエトキシ、2’−グアニジニウム(guanidinidium)、2’−O−グアニジニウムエチル、カルバミン酸塩修飾した糖、および二環式修飾した糖などの、2’置換基を含む。幾つかの実施形態では、糖部修飾は、2’−O−Me、2’F、および2’MOEから選択される。幾つかの実施形態では、糖部修飾は、ロックド核酸(LNA)におけるような追加の架橋結合である。幾つかの実施形態では、糖アナログは、ホスホロジアミデートモルホリノ(PMO)などのモルホリン環を含有している。幾つかの実施形態では、糖部は、リボフラノシルまたは2’デオキシリボフラノシルの修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、2’4’抑制された(constrained)2’O−メチルオキシエチル(cMOE)修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、cEt 2’,4抑制された2’−OエチルBNA修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、トリシクロDNA(tcDNA)修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、エチレン核酸(ENA)修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、MCE修飾を含む。修飾は当該技術分野では既知であり、例えば、この目的のための参照によって本明細書に組み込まれた文献、Jarver, et al.,2014,「A Chemical View of Oligonucleotides for Exon Skipping and Related Drug Applications」Nucleic Acid Therapeutics 24(1):37−47に記載されている。

幾つかの例では、ASOの各単量体は、同じ方法で修飾され、例えば、ASOの骨格の各結合はホスホロチオエート結合を含み、または各リボース糖部は2’O−メチル修飾を含む。ASOの単量体成分の各々の上に存在する、そのような修飾は、「均一な修飾」と呼ばれる。幾つかの例では、異なる修飾の組み合わせが望まれ得、例えば、ASOは、ホスホロジアミデート結合とモルホリン環を含む糖部(モルホリノ)との組み合わせを含み得る。ASOへの異なる修飾の組み合わせは、「混合修飾」または「混合化学作用」と呼ばれる。

幾つかの実施形態では、ASOは、1つ以上の骨格修飾を含む。幾つかの実施形態では、ASOは、1つ以上の糖部修飾を含む。幾つかの実施形態では、ASOは、1つ以上の骨格修飾および1つ以上の糖部修飾を含む。幾つかの実施形態では、ASOは、2’MOE修飾およびホスホロチオエート骨格を含む。幾つかの実施形態では、ASOは、ホスホロジアミデートモルホリノ(PMO)を含む。幾つかの実施形態では、ASOは、ペプチド核酸(PNA)を含む。本明細書に記載されるASOのいずれか又はASOの成分(例えば、核酸塩基、糖部、骨格)は、ASOの望ましい特性または活性を達成するために、あるいはASOの望ましくない特性または活性を減少させるために修飾されてもよい。例えば、ASOまたはASOの1つ以上の成分は、mRNA前駆体の転写産物上の標的配列への結合親和性を増強する;非標的配列への結合を減少させる;細胞のヌクレアーゼ(つまり、RNase H)による分解を減少させる;細胞および/または細胞の核へのASOの取り込みを改善する;ASOの薬物動態(pharmacokinetics)または薬力(pharmacodynamics)を変更する;およびASOの半減期を調節するために修飾され得る。

いくつかの実施形態では、ASOは、2’−O−(2−メトキシエチル)(MOE)ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで構成される。そのようなヌクレオチドで構成されたASOは、特に、本明細書で開示される方法によく適しており、そのような修飾を有するオリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する著しく増強された耐性および増加したバイオアベイラビリティを有すると示されており、これによって、例えば、本明細書に記載される幾つかの実施形態における経口送達に適するようになる。例えば、Geary et al.,J Pharmacol Exp Ther.2001;296(3):890−7;Geary et al.,J Pharmacol Exp Ther.2001;296(3):898−904を参照。

ASOを合成する方法は当業者に既知である。代替的に又は加えて、ASOは商用源から得てもよい。

他に明記されない限り、一本鎖核酸(例えば、mRNA前駆体の転写産物、オリゴヌクレオチド、ASOなど)配列の左端は、5’末端であり、一本鎖または二本鎖の核酸配列の左方向は、5’方向と呼ばれる。同様に、核酸配列(一本鎖または二本鎖)の右端または右方向は、3’末端または3’方向である。一般に、核酸中の基準点に対する5’にある領域または配列は、「上流」として言及され、核酸中の基準点に対する3’にある領域または配列は、「下流」として言及される。一般に、mRNAの5’方向または5’末端は、開始コドン(initiation or start codon)が位置する場所であり、一方で、3’末端または3’方向は、終止コドンが位置する場所である。幾つかの態様では、核酸中の基準点の上流にあるヌクレオチドは、負の数によって指定され、基準点の下流にあるヌクレオチドは、正の数によって指定され得る。例えば、基準点(例えば、mRNA中のエクソン−エクソン連結)は「ゼロ」部位として指定され得、基準点に直接隣接し且つその上流にあるヌクレオチドは、「マイナス1」、例えば「−1」と指定され、一方で、基準点に直接隣接し且つその下流にあるヌクレオチドは、「プラス1」、例えば「+1」と指定される。

いくつかの実施形態では、ASOは、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体内に保持されたイントロンの5’スプライス部位の下流(3’方向)である、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD5B7、CERS2、またはNCOA3 RIC mRNA前駆体の標的部分(例えば、5’スプライ部位に対して、正の数で示された方向)に対して相補的である(および結合する)(図1)。いくつかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+16から+100の領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、あるいはNCOA5 RIC mRNA前駆体の標的部分に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ASOは、5’スプライス部位に対して、+1から+5までのヌクレオチド(5’スプライス部位の下流に位置付けられた最初の5つのヌクレオチド)に対して相補的ではない。いくつかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して、+6から+50までのヌクレオチドの領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体の標的部分に対して相補的であり得る。いくつかの態様では、ASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6から+500、+6から+400、+6から+300、+6から+200、あるいは+6から+90、+6から+80、+6から+70、+6から+60、+6から+50、+6から+40、+6から+30、あるいは+6から+20の領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5 RIC mRNA前駆体標的部分に対して相補的である。

幾つかの実施形態では、ASOは、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体における保持されたイントロンの3’スプライス部位の上流(5’の方向(relative))である、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的領域(例えば、負の数により示された方向)に相補的である(図1)。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して領域−16〜−500、−16〜−400、−16〜−300、−6〜−200、または−16〜−100の内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ASOは、3’スプライス部位に対して、−1〜−15までのヌクレオチド(3’スプライス部位の上流に位置付けられた最初の15のヌクレオチド)には相補的ではない。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−50の領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの態様では、ASOは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−90、−16〜−80、−16〜−70、−16〜−60、−16〜−50、−16〜−40、または−16〜−30の領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。

幾つかの実施形態では、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+100の領域から、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−100までの領域内にある。

幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位(上流)に隣接するエクソン内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソンの+2e〜−4eの領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対するヌクレオチド−1e〜−3eに相補的ではない。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して−4e〜−100e、−4e〜−90e、−4e〜−80e、−4e〜−70e、−4e〜−60e、−4e〜−50e、−4e〜−40e、−4e〜−30e、または−4e〜−20eの領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。

幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソン内(下流)にあるRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である(図1)。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソンの+2e〜−4eの領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対するヌクレオチド+1eに相補的ではない。幾つかの実施形態では、ASOは、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して+2e〜+100e、+2e〜+90e、+2e〜+80e、+2e〜+70e、+2e〜+60e、+2e〜+50e、+2e〜+40e、の+2e〜+30e、または+2e〜+20eの領域内にある、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、APOA5、GALT、LDLRAP1、HNF4A、GCK、POGLUT1、PIK3R1、HNF1A、TRIB1、TGFB1、HAMP、THPO、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、またはNCOA5のRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的である。ASOは、スプライシングの特異的結合および効果的な増強作用に適する任意の長さでもよい。幾つかの実施形態では、ASOは8から50の核酸塩基から成る。例えば、ASOは、長さが、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、45または50の核酸塩基でもよい。幾つかの実施形態では、ASOは50より多くの核酸塩基から成る。幾つかの実施形態では、ASOは、長さが8〜50の核酸塩基、8〜40の核酸塩基、8〜35の核酸塩基、8〜30の核酸塩基、8〜25の核酸塩基、8〜20の核酸塩基、8〜15の核酸塩基、9〜50の核酸塩基、9〜40の核酸塩基、9〜35の核酸塩基、9〜30の核酸塩基、9〜25の核酸塩基、9〜20の核酸塩基、9〜15の核酸塩基、10〜50の核酸塩基、10〜40の核酸塩基、10〜35の核酸塩基、10〜30の核酸塩基、10〜25の核酸塩基、10〜20の核酸塩基、10〜15の核酸塩基、11〜50の核酸塩基、11〜40の核酸塩基、11〜35の核酸塩基、11〜30の核酸塩基、11〜25の核酸塩基、11〜20の核酸塩基、11〜15の核酸塩基、12〜50の核酸塩基、12〜40の核酸塩基、12〜35の核酸塩基、12〜30の核酸塩基、12〜25の核酸塩基、12〜20の核酸塩基、12〜15の核酸塩基、13〜50の核酸塩基、13〜40の核酸塩基、13〜35の核酸塩基、13〜30の核酸塩基、13〜25の核酸塩基、13〜20の核酸塩基、14〜50の核酸塩基、14〜40の核酸塩基、14〜35の核酸塩基、14〜30の核酸塩基、14〜25の核酸塩基、14〜20の核酸塩基、15〜50の核酸塩基、15〜40の核酸塩基、15〜35の核酸塩基、15〜30の核酸塩基、15〜25の核酸塩基、15〜20の核酸塩基、20〜50の核酸塩基、20〜40の核酸塩基、20〜35の核酸塩基、20〜30の核酸塩基、20〜25の核酸塩基、25〜50の核酸塩基、25〜40の核酸塩基、25〜35の核酸塩基、または25〜30の核酸塩基である。幾つかの実施形態では、ASOは長さが30のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが29のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが28のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが27のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが26のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが25のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが24のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが23のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが22のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが21のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが20のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが19のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが18のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが17のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが16のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが15のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが14のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが13のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが12のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが11のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ASOは長さが10のヌクレオチドである。

幾つかの実施形態では、異なる化学的性質を有するが、RIC mRNA前駆体の同じ標的部分に対して相補的である2つ以上のASOが使用される。幾つかの実施形態では、RIC mRNA前駆体の異なる標的部分に対して相補的である2つ以上のASOが使用される。

実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的部分または他の抱合体に化学的に連結される。そのような部分には、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、または、アダマンタン酢酸として、脂質部分が含まれる。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えばN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N−Ac−グルコサミン(GluNAc)、またはマンノース(例えばマンノース6−リン酸)、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む部分と結合する。当該技術分野で理解され且つ文献に記載されるように、例えばリンカーを用いて、抱合体は、糖、塩基またはリン酸基上のいくつかの位置のうちのいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む任意のヌクレオチドの1つ以上に連結することができる。リンカーは二価または三価の分枝リンカーを含み得る。実施形態では、抱合体はアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端に付けられている。オリゴヌクレオチド抱合体を調製する方法は、例えば、米国特許第8,450,467号「Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides」に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。

幾つかの実施形態では、ASOによって標的とされる核酸は、真核細胞などの細胞内に発現したRIC mRNA前駆体である。幾つかの実施形態では、用語「細胞」は、細胞の集団を指すこともある。幾つかの実施形態では、細胞は被験体内に存在する。幾つかの実施形態では、細胞は被験体から単離されている。幾つかの実施形態では、細胞はエクスビボである。幾つかの実施形態では、細胞は疾病関連細胞もしくは疾患関連の細胞、または細胞株である。幾つかの実施形態では、細胞はインビトロである(例えば細胞培養液中にある)。

<医薬組成物> 記載された組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、上記方法のいずれかにおいて使用するための医薬組成物または製剤は、医薬品産業において周知の従来技術に従って調製することができ、且つ公開文献においても記載されている。実施形態において、被験体を処置するための医薬組成物または医薬製剤は、上記のような任意のアンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、またはエステルの有効量、および薬学的に許容可能な希釈剤を含む。医薬製剤のアンチセンスオリゴマーはさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含み得る。

薬学的に許容可能な塩は、過度の毒性反応、刺激反応、アレルギー反応等を持たないヒトおよび下等動物の組織に接する使用に適しており、かつ適切なベネフィット・リスク比に相応している(例えば、この目的のための参照によって本明細書に組み込まれる、S. M. Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1−19 (1977)を参照)。塩は、化合物の最終的な分離および精製中にインサイチュで、または遊離基機能を適切な有機酸と反応させることによって別々に調製され得る。薬学的に許容可能で無毒な酸付加塩の例は、塩化水素、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸か、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸か、またはイオン交換などの他の文書で立証された方法を用いることによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸、チオシアン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属の塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。更に薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成された、無毒なアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンのカチオンを含む。

実施形態において、組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬および浣腸剤などの多くの可能な剤形いずれかへと製剤される。実施形態において、組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体状の懸濁液として製剤される。水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含むこともある。その懸濁液は、安定化剤も含むこともある。実施形態において、本発明の医薬製剤または組成物は、限定されないが、溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、発泡体またはリポソーム含有製剤(例えばカチオンリポソームまたは非カチオンリポソーム)を含む。

本発明の医薬組成物または製剤は、適切で且つ当業者に周知なように、または公開文献において記載されているように、1つ以上の透過促進剤、担体、賦形剤、または他の有効成分もしくは非有効成分を含むこともある。実施形態において、リポソームは立体的に安定したリポソーム、例えば1つ以上の特定の脂質を含むリポソームも含む。これらの特定の脂質は、循環寿命が増強されたリポソームを結果としてもたらす。実施形態において、立体的に安定したリポソームは、1つ以上の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール(PEG)部分などの1つ以上の親油性高分子を用いて誘導される。実施形態において、界面活性剤は医薬製剤または医薬組成物中に含まれる。薬物製品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、当技術分野で周知である。実施形態では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達を達成する、例えば、細胞膜にわたる拡散を助ける及び/又は脂溶性薬物の浸透性を増強するために、浸透促進剤を利用する。実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、または非キレート性の非界面活性剤である。

実施形態において、医薬製剤は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは他の薬物または治療剤と組み合わせて投与される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において知られている任意の方法によって、血液脳関門を介する主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる1つ以上の薬剤と共に投与される。例えば、筋組織内の運動ニューロンへアデノウイルスベクターを投与することによる薬剤の送達は、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,632,427号「Adenoviral−vector−mediated gene transfer into medullary motor neurons」に記載されている。脳、例えば、線条体、視床、海馬、または黒質への直接のベクターの送達は、例えば、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,756,523号「Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain」に記載される。

実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい薬理学的性質または薬力学的性質を提供する薬剤に結合されるか抱合される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門を介する浸透または輸送を促進すると当技術分野において知られている物質、例えばトランスフェリン受容体の抗体に結合される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス化合物をより効果的にするために、または血液脳関門を介する輸送を増加させるためにウイルスベクターに結合される。実施形態において、浸透性の血液脳関門の崩壊は、砂糖、例えばメソエリスリトール、キシリトール、D(+)ガラクトース、D(+)ラクトース、D(+)キシロース、ズルシトール、ミオ−イノシトール、L(−)フルクトース、D(−)マンニトール、D(+)グルコース、D(+)アラビノース、D(−)アラビノース、セロビオース、D(+)マルトース、D(+)ラフィノース、L(+)ラムノース、D(+)メリビオース、D(−)リボース、アドニトール、D(+)アラビトール、L(−)アラビトール、D(+)フコース、L(−)フコース、D(−)リキソース、L(+)リキソース、およびL(−)リキソース、または アミノ酸、例えばグルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンを注入することにより促進される。血液脳関門浸透を増強する方法及び材料は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4866042号「Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier」、第6,294,520号「Material for passage through the blood−brain barrier」、及び第6,936,589「Parenteral delivery systems」に記載される。

実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的部分または他の抱合体に化学的に連結される。そのような部分には、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、または、アダマンタン酢酸として、脂質部分が含まれる。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えばN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N−Ac−グルコサミン(GluNAc)、またはマンノース(例えばマンノース6−リン酸)、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む部分と結合する。抱合体は、例えばリンカーを使用して、当技術分野において理解され且つ文献中に記載されるように、砂糖、塩基またはリン酸基上のいかなるいくつかの位置においても、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む任意のヌクレオチドの1つ以上に連結され得る。リンカーは二価または三価の分枝したリンカーを含むことができる。実施形態において、抱合体はアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端に結合している。オリゴヌクレオチド抱合体を調製する方法は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第8,450,467号の「Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides」に記載されている。

被験体の処置 本明細書に提供される組成物のうちのいずれかが個体に投与されうる。「個体」は、「被験体」または「患者」と互換的に使用されてもよい。個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、またはヒト以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、またはヒツジなどの動物であってもよい。実施形態では、個体はヒトである。実施形態では、個体は胎児、多型、または小児である。他の実施形態では、個体は植物などの別の真核生物かもしれない。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される化合物は細胞にエクスビボで投与される。

幾つかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、疾患または障害を処置する方法として個体に投与される。幾つかの実施形態では、個体は、本明細書に記載された疾患のいずれかなどの遺伝病を有する。幾つかの実施形態では、個体は、本明細書に記載された疾患のいずれかなどの疾患を有するリスクがある。幾つかの実施形態では、個体は、不十分な量のタンパク質または不十分な活性のタンパク質により引き起こされる疾患または障害を有するリスクが増加している。個体が、不十分な量のタンパク質または不十分な活性のタンパク質により引き起こされる疾患または障害を有するリスクが増加している場合、方法は防止的または予防的な処置を含む。例えば、個体は、その疾患の家族歴のために、そのような疾患または障害を有するリスクが増加している場合がある。典型的には、そのような疾患または障害を有するリスクが増加している個体は、予防的処置(例えば、疾患または障害の発症または悪化を予防するかまたは遅らせることによる)から利益を受ける。

本発明のASOの投与に適切な経路は、ASOの送達が所望される細胞型に応じて変わり得る。多数の組織および器官は本明細書に記載される疾病にて影響を受け、肝臓が最も著しく影響を受ける組織である。本発明のASOは、例えば、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射または静脈内注射によって、患者に非経口的に投与されてもよい。実施形態では、送達は心臓または肝臓に対して行なわれる。実施形態では、胎児は、例えばASO組成物を胎児に対して直接または間接的(例えば母体を介して)に投与することにより、子宮内で処置される。

スプライシングを増強する追加のASOを識別する方法 本発明の範囲内にはまた、特に標的イントロンにおけるRIC mRNA前駆体のスプライシングを増強する追加のASOを識別する(判定する)方法がある。mRNA前駆体の標的領域内で様々なヌクレオチドを特異的にハイブリダイズさせるASOは、標的イントロンのスプライシングの速度および/または程度を改善するASOを識別する(判定する)ためにスクリーニングされてもよい。幾つかの実施形態では、ASOはスプライシング抑制因子/サイレンサーの結合部位で遮断または妨害することもある。当該技術分野において既知の任意の方法は、イントロンの標的領域にハイブリダイズされた時に所望の効果(例えばスプライシング、タンパク質または機能的RNAの生産の向上)をもたらすASOを識別する(判定する)ために使用されてもよい。これらの方法はまた、保持されたイントロンに隣接するエクソン中、または保持されていないイントロン中の標的領域へ結合することにより、保持されたイントロンのスプライシングを増強するASOを識別するために使用することができる。使用され得る方法の一例が下記に提供される。

mRNA前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたASOを用いて、ASO「walk」と呼ばれる1ラウンドのスクリーニングを行うこともある。例えば、ASO walkに使用されるASOは、保持されたイントロンの5’スプライス部位のおよそ100のヌクレオチド上流(例えば、標的とされた/保持されたイントロンの上流に位置するエクソンの配列の一部)から標的とされた/保持されたイントロンの5’スプライス部位のおよそ100のヌクレオチド下流まで、および/または、保持されたイントロンの3’スプライス部位のおよそ100のヌクレオチド上流から標的とされた/保持されたイントロンの3’スプライス部位のおよそ100のヌクレオチド下流(例えば、標的とされた/保持されたイントロンの下流に位置するエクソンの配列の一部)まで、5つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。例えば、15のヌクレオチドの長さの第1のASOは、標的とされた/保持されたイントロンの5’スプライス部位に対するヌクレオチド+6〜+20まで特異的にハイブリダイズするように設計され得る。第2のASOは、標的とされた/保持されたイントロンの5’スプライス部位に対するヌクレオチド+11〜+25まで特異的にハイブリダイズするように設計されている。ASOは、mRNA前駆体の標的領域に及ぶように設計されている。実施形態では、ASOは、より密に、例えば、1、2、3、または4つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。さらに、ASOは、5’スプライス部位の下流の100のヌクレオチドから3’スプライス部位の上流の100のヌクレオチドまで敷き詰められ得る。

1つ以上のASO、または1つの対照ASO(標的領域にハイブリダイズするとは予期されていない配列である、スクランブル配列を有するASO)は、例えばトランスフェクションによって、標的mRNA前駆体(例えば、本明細書で別記されるRIC mRNA前駆体)を発現する疾患関連の細胞株へと送達される。ASOの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素(RT)−PCRによって評価され得る(「イントロン保持事象の特定」を参照)。対照ASOで処理された細胞と比較して、ASOで処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたRT−PCR産物が減少または欠如することは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。幾つかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないmRNA前駆体に対するスプライシングされたmRNA前駆体の比率、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるASOを使用して改善され得る。標的mRNA前駆体によってコードされるタンパク質または機能的RNAの量も、各ASOが所望の効果(例えば、タンパク質生成の増強)を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびELISAなどの、タンパク質生成を評価し及び/又は定量するための、当該技術分野で既知の方法も使用することができる。

ASO「ミクロウォーク」(micro−walk)と呼ばれる第2ラウンドのスクリーニングは、mRNA前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたASOを使用して実行され得る。ASOマイクロウォークに使用されるASOは、ASOでハイブリダイズされたときに結果的にスプライシングを増強させるmRNA前駆体のヌクレオチド酸配列をさらに改良する(refine)ために、1つのヌクレオチドごとに敷き詰められる。

標的イントロンのスプライシングを促進するASOによって定義される領域は、1−ntステップ(1−nt steps)で配置されたASO、ならびに、典型的には18−25ntである、より長いASOを含む、ASO「ミクロウォーク」によって、より詳細に調査される。

上記でASO walkに関して記載されたように、1つ以上のASO、または対照ASO(標的領域にハイブリダイズすると予期されていない配列である、スクランブル配列を有するASO)を、例えばトランスフェクションによって、標的mRNA前駆体を発現する疾患関連細胞株へと送達することにより、ASOミクロウォークが実行される。ASOの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素(RT)−PCRによって評価され得る(「イントロン保持事象の特定」を参照)。対照ASOで処理された細胞と比較して、ASOで処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたRT−PCR産物が減少または欠如することは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。幾つかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないmRNA前駆体に対するスプライシングされたmRNA前駆体の比率、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるASOを使用して改善され得る。標的mRNA前駆体によってコードされるタンパク質または機能的RNAの量も、各ASOが所望の効果(例えば、タンパク質生成の増強)を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびELISAなどの、タンパク質生成を評価し及び/又は定量するための、当該技術分野で既知の方法も使用することができる。

mRNA前駆体の領域にハイブリダイズされたときに、結果的にスプライシングを増強させ、タンパク質生成を増加させるASOは、動物モデル、例えば、全長ヒト遺伝子がノックインされたトランスジェニックマウスモデルまたは疾患のヒト化マウスモデルを使用して、インビボで試験され得る。ASOの投与に適した経路は、ASOの送達が望まれる疾患及び/又は細胞型に応じて変化し得る。ASOは、例えば、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射または静脈内注射によって投与されてもよい。投与後に、モデル動物の細胞、組織、及び/又は臓器は、当該技術分野に既知の方法および本明細書に記載される方法によって、例えば、スプライシング(効率、速度、程度)およびタンパク質生成を評価することにより、ASO処置の効果を判定するために評価され得る。動物モデルはまた、疾患または疾患重症度の表現型または行動的徴候であり得る。本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。

本発明は、以下の実施例によってより具体的に例証されるだろう。しかしながら、本発明がいかなる方法においてもこれらの実施例によって限定されないことが理解されるべきである。

実施例1:次世代配列決定を使用するRNAseqによる、AMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、GALT、LDLRAP1、POGLUT1、PIK3R1、TRIB1、TGFB1、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、およびNCOA5の転写産物のイントロン保持事象の特定 全体のトランスクリプトームショットガン配列決定は、イントロン保持事象を特定するために、本明細書に記載されるAMT、ADA、PPOX、UROD、HMBS、ACADVL、PC、IVD、GALT、LDLRAP1、POGLUT1、PIK3R1、TRIB1、TGFB1、PNPLA3、ATP7B、FAH、ASL、HFE、ALMS1、PPARD、IL6、HSD3B7、CERS2、およびNCOA5の遺伝子により生成された転写産物のスナップショットを明らかにするための次世代配列決定を使用して実行された。この目的のために、ポリA+RNAをTHLE−3(ヒトの肝臓上皮)細胞の核および細胞質の分画から分離し、Illumina’s TruSeq Stranded mRNA library Prep Kitを使用して、cDNAライブラリを構築した。ライブラリに対してペア−エンド配列決定(pair−end sequence)を行い、結果として、ヒトゲノム(2009年2月、GRCh37/hg19アセンブリ)にマッピングされた100のヌクレオチドの読み取りをもたらした。マッピングされた読み取りは、(UCSC Genome Informatics Group(Center for Biomolecular Science & Engineering, University of California, Santa Cruz, 1156 High Street, Santa Cruz, CA 95064)によって操作され、且つ、例えばRosenbloom, et al., 2015,“The UCSC Genome Browser database: 2015 update,”Nucleic Acids Research 43, Database Issue (doi:10.1093/nar/gku1177)に記載された)UCSCのゲノムブラウザを使用して視覚化され、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論された。ピークの高さは、特定の領域における読み取り密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークがエクソンおよびイントロンの領域に一致することができるように、遺伝子の概略図をUCSCゲノムブラウザにより提供した。このディスプレイに基づいて、イントロンは、THLE−3細胞の核分画に高度な読み取り密度を持つと特定されたが、これら細胞の細胞質分画には非常に低い読み取り〜読み取りなしであったことが特定された(得られたパーセントイントロン保持(PIR)データについては表1および2、そして図面を参照)。このことは、これらのイントロンが保持されること、およびイントロン含有転写産物が細胞核中に残存していることを示し、且つ、それらが細胞質へと運び出されないため、これらの保持されたRIC mRNA前駆体は非生産的であることを示唆している。

実施例2:次世代配列決定を使用したRNAseqによるAPOA5、HNF4A、GCK、HNF1A、HAMP、およびTHPOの転写産物のイントロン保持事象の特定 全体のトランスクリプトームショットガン配列は、イントロン保持事象を特定するために、転写産物、例えば、本明細書に記載されるAPOA5、HNF4A、GCK、HNF1A、HAMP、およびTHPOの遺伝子により生成されるもののスナップショットを明らかにするための次世代配列決定を使用して実行された。この目的のために、ポリA+RNAをTHLE−3(ヒトの肝臓上皮)細胞の核および細胞質の分画から分離し、Illumina’s TruSeq Stranded mRNA library Prep Kitを使用して、cDNAライブラリを構築した。ライブラリに対してペア−エンド配列決定(pair−end sequence)を行い、結果として、ヒトゲノム(2009年2月、GRCh37/hg19アセンブリ)にマッピングされた100のヌクレオチドの読み取りをもたらした。マッピングされた読み取りは、(UCSC Genome Informatics Group(Center for Biomolecular Science & Engineering, University of California, Santa Cruz, 1156 High Street, Santa Cruz, CA 95064)によって操作され、且つ、例えばRosenbloom, et al., 2015,“The UCSC Genome Browser database: 2015 update,”Nucleic Acids Research 43, Database Issue (doi:10.1093/nar/gku1177)に記載された)UCSCのゲノムブラウザを使用して視覚化され、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論された。ピークの高さは、特定の領域における読み取り密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークがエクソンおよびイントロンの領域に一致することができるように、遺伝子の概略図をUCSCゲノムブラウザにより提供した。このディスプレイに基づいて、イントロンは、THLE−3細胞の核分画に高度な読み取り密度を持つと特定されたが、これら細胞の細胞質分画には非常に低い読み取り〜読み取りなしであったことが特定された(得られたパーセントイントロン保持(PIR)データについては表1および2、そして図面を参照)。このことは、これらのイントロンが保持されること、およびイントロン含有転写産物が細胞核中に残存したことを示し、且つ、それらが細胞質へと運び出されないため、これらの保持されたRIC mRNA前駆体は非生産的であったことを示唆している。

実施例3:保持されたイントロンを標的とするASO walkの設計 ASO walkは、本明細書に記載される方法を使用して、保持されたイントロンを標的とするように設計された。イントロン5’スプライス部位の直ぐ下流、例えばヌクレオチド+6〜+69に及ぶ領域、及び、イントロン3’スプライス部位の直ぐ上流、例えばヌクレオチド−16〜−79に及ぶ領域を、2’−O−Me RNA、PS骨格、5のヌクレオチド間隔でシフトされた18−mer ASOを用いて標的とした。表1は、THLE−3細胞中の対象の遺伝子において保持されたイントロンを列挙する。表2は、設計された例示的なASOおよびそれらの標的配列を列挙する。

実施例4:保持されたイントロンのASO標的化により改善したスプライシング効率はAMT転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、AMTの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用された。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、AMT標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図3Aおよび図3B)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してAMT遺伝子転写レベルを増大させることを示した。AMTを標的とするASOトランスフェクトされた細胞からのCt値はRPL32に対し正規化され、偽処理細胞からの正規化されたqPCR産物に対してプロットされる。この分析の結果は、いくつかのAMT標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてAMT遺伝子中の律速のイントロンのスプライシング効率を改善すると、AMT遺伝子発現が増加することを示している。

実施例5:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はGALT転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、GALTの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、GALT標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図4CおよびD、図4Gおよび4H)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してGALT遺伝子転写レベルを増大させることを示した。GALT標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのGALT標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてGALT遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、GALT遺伝子発現が増加することを示している。

実施例6:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はPC転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、PCの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、PC標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図5AおよびB)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してPC遺伝子転写レベルを増大させることを示した。PC標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのPC標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いでPC遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、PC遺伝子発現が増加することを示している。

実施例7:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はFAH転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、FAHの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、FAH標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図6AおよびB)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してFAH遺伝子転写レベルを増大させることを示した。FAH標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのFAH標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてFAH遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、FAH遺伝子発現が増加することを示している。

実施例8:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はPPARD転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、PPARDの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、PPARD標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図7AおよびB、図7EおよびF)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してPPARD遺伝子転写レベルを増大させることを示した。PPARD標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのPPARD標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてPPARD遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、PPARD遺伝子発現が増加することを示している。

実施例9:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はHMBS転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、HMBSの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、HMBS標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図9AおよびB)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してHMBS遺伝子転写レベルを増大させることを示した。HMBS標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのHMBS標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてHMBS遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、HMBS遺伝子発現が増加することを示している。

実施例10:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はALMS1転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、ALMS1の発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、ALMS1標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図11AおよびB)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してALMS1遺伝子転写レベルを増大させることを示した。ALMS1標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのALMS1標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてALMS1遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、ALMS1遺伝子発現が増加することを示している。

実施例11:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はASL転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、ASLの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、ASL標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図12AおよびB、図12CおよびD、図12EおよびF)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してASL遺伝子転写レベルを増大させることを示した。ASL標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのASL標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてASL遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、ASL遺伝子発現が増加することを示している。

実施例12:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はATP7B転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、ATP7Bの発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、ATP7B標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図13BおよびC)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してATP7B遺伝子転写レベルを増大させることを示した。ATP7B標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのATP7B標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてATP7B遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、ATP7B遺伝子発現が増加することを示している。

実施例13:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率はHSD3B7転写レベルを増大させる ASOを使用して保持されたイントロンのスプライシング効率を改善することにより、HSD3B7の発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法が使用される。ARPE−19細胞は、独立してRNAiMAX(Invitrogen)送達試薬を使用し、偽トランスフェクト(mock−transfect)され、または、HSD3B7標的化ASOまたは非標的化ASO対照でトランスフェクトされた。実験は80nM ASOを使用して24時間行なわれた(図15BおよびC、図15EおよびF)。Taqman qPCRの結果は、いくつかの標的化ASOが、偽トランスフェクトされたものと比較してHSD3B7遺伝子転写レベルを増大させることを示した。HSD3B7標的化ASOトランスフェクト細胞からのCt値をRPL32に対して正規化し、偽処理細胞からの正規化qPCR産物と比較してプロットする。この分析の結果は、いくつかのHSD3B7標的化ASOが遺伝子転写レベルを増大させることを示した。これらの結果は、ASOを用いる遺伝子中の保持されたイントロンのスプライシングの誘発が、遺伝子発現の増加をもたらすことを示す。全体的に、これらの結果は、ASOを用いてHSD3B7遺伝子中の律速イントロンのスプライシング効率を改善すると、HSD3B7遺伝子発現が増加することを示している。

実施例14:保持されたイントロンのASO標的化による改善したスプライシング効率は転写レベルを増大させる ASOでのイントロンスプライシング効率の改善により標的遺伝子の発現の増加を達成しうるかどうかを判定するために、本明細書に記述された方法を使用した。ARPE−19細胞、すなわちヒトの網膜の上皮細胞株(American Type Culture Collection(ATCC),USA)、またはHuh−7、すなわちヒトの肝細胞腫細胞株(NIBIOHN、Japan)、またはSK−N−AS、すなわちヒトの神経芽細胞腫細胞株(ATCC)は、図3−17、および表1および2に記載の標的化ASOで偽トランスフェクトされるか、またはトランスフェクトされる。細胞を、供給元の仕様書に従って、Lipofectamine RNAiMaxトランスフェクション試薬(Thermo Fisher)を用いてトランスフェクトした。簡潔に述べると、ASOを96ウェル組織培養プレートに播種し、Opti−MEM中に希釈したRNAiMaxと組み合わせた。トリプシンを用いて細胞を剥離し、完全培地に再懸濁し、約25,000個の細胞をASOトランスフェクション混合物に加えた。トランスフェクション実験は三通りのプレート複製において実行された。最終的なASO濃度は80nMであった。供給元の仕様書に従って、培地をトランスフェクションの6時間後に交換し、細胞をCells−to−Ct溶解試薬を用い、DNAse(Thermo Fisher)で試薬を補充し、24時間で採取した。供給元の仕様書に従い、cDNAをCells−to−Ct RT試薬(Thermo Fisher)で生成した。対象のイントロンでのスプライシングの量を定量化するために、表1および2に列挙した、保持されたイントロンの対応するエクソン−エクソンジャンクションに及ぶプローブによるTaqmanアッセイ(Thermo Fisher)を用いて、定量PCRが実行される。Taqmanアッセイは、QuantStudio 7Flex Real−Time PCRシステム(Thermo Fisher)上で、供給元の仕様書に従い実行される。標的遺伝子アッセイ値を、RPL32(deltaCt)およびプレート一致偽トランスフェクションサンプル(delta−delta Ct)に対して正規化し、モック定量(2 ^−(delta−delta Ct)に対して倍率変化を生成する。3つのプレート複製のモックに対する平均倍率変化をプロットした。(図3B、図4D、図4H、図5B、図6B、図7F、図9B、図11B、図12B、図12D、図12F、図13C、図15Cおよび図15F)。標的遺伝子発現を増加させるいくつかのASOが特定され、その標的イントロンでのスプライシングの増加が示唆された。標的イントロン(図3−17)の保持を示す全トランスクリプトームデータと共に、これらの結果は、ASOが律速イントロンのスプライシング効率を改善し得ることを確認する。