荧光细胞标记
专利汇可以提供荧光细胞标记专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐的合成方法，加入 氨 基取代基和硝基取代基得到四种化合物诸如NBQ-38(7-乙基-3-硝基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎓)、NBQ-95(2-氯-10-甲基-3-硝基氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎓)、ABQ-38(3-氨基-7-乙基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎓)和ABQ-95(3-氨基-2-氯-10-甲基氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎓)，其中所述方法提供了化合物 生物 活性的增加。所述化合物还用于细胞内结合、通过由线粒体损伤和胱天蛋白酶3和7活化介导的凋亡活化对恶性细胞的细胞毒性、细胞器结合及损伤，和由于自体 荧光 性质的标记。，下面是荧光细胞标记专利的具体信息内容。
1.一种氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，所述化合物由如下组成
其中R1是硝基且X选自由硫和NR组成的组，所述方法包括如下步骤：
a.硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成；
b.硝基的还原；和
c.所述硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的光诱导环化过程以产生生物荧光的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐。
2.如权利要求1所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中硝基的还原包括利用硼化镍作为催化剂的肼。
3.如权利要求1所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成包括：
a.将等摩尔混合物溶解于摩尔过量的醋酐中并回流18h至24h，其中所述等摩尔混合物由2-氯取代的苯甲醛和2-甲基吲哚衍生物组成；
b.使所述等摩尔混合物在23℃-25℃之间的温度冷却，其中沉淀出固体；和c.分离沉淀的固体并将所述固体进行重结晶过程。
4.如权利要求3所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所述沉淀的固体通过过滤分离，用醋酐或冷的2∶1己烷/丙酮混合物洗涤。
5.如权利要求3所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所述重结晶过程包括选自丙酮、己烷/丙酮1∶1混合物、环己烷或甲苯的有机非质子溶剂。
6.如权利要求1所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成包括：
a.在23℃-25℃之间的温度和恒定搅拌下，将等摩尔溶液加入50％氢氧化钠溶液，其中所述等摩尔溶液由在大约10mL二甲基亚砜中的2-甲基苯并噻唑和2-氯-6-取代的苯甲醛组成；
b.搅拌所述等摩尔溶液额外的5-15min；
c.加入水并搅拌约5min直到固体沉淀；和
d.分离沉淀的固体并将所述固体进行重结晶过程。
7.如权利要求6所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所述沉淀的固体通过真空过滤分离。
8.如权利要求6所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所述重结晶过程包括甲苯或丙酮。
9.如权利要求6所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中加入所述等摩尔混合物的步骤包括在沸腾的醋酐中回流所述等摩尔溶液与小量的
2-甲基吲哚衍生物，持续48h至168h之间的反应时间。
10.如权利要求1所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成包括如下步骤，
a.向一份(E)-2-苯乙烯基吲哚中加入二甲氧基乙烯中的2.2当量的NaH，产生第一反应混合物；
b.在23℃-25℃之间的温度搅拌所述第一反应混合物30min；
c.用烷化剂烷基化，其中所述烷化剂卤代烷在23℃-25℃之间的温度缓慢地加入，产生第二反应混合物，其中所述第二反应混合物由每当量(E)-苯乙烯基苯并咪唑1.5当量的烷化剂组成；
d.在氮气气氛下搅拌所述第二反应混合物6-24h；
e.在冰水浴中冷却所述第二反应混合物并加入水直到固体沉淀；和
f.在真空下过滤所述固体沉淀，用1∶1丙酮/己烷混合物洗涤并风干。
11.如权利要求1所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所述光诱导环化过程包括：
a.选择能透过350nm波长的容器和辐照装置，其中所述辐照装置装配有350nm波长灯；
b.将优选的量的(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚放置于所述容器内；和
c.用所述辐照装置照射所述容器预选的以一定间隔分开的时间，其中每个间隔将溶液过滤以移出部分纯形式的硝基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物并提取残留在容器壁上的剩余的所述硝基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物。
12.如权利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中放置于所述容器内的所述优选的量包括溶解于150-250mL的3∶1苯∶二噁烷混合物中的0.2-1.0克所述(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚且所述照射时间是间隔4-6小时的
10-18小时。
13.如权利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中放置于所述容器内的所述优选的量包括溶解于150-250mL的2∶1∶1苯∶溴苯∶二噁烷混合物中的0.2-1.0g所述(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚。
14.如权利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中放置于所述容器内的所述优选的量包括溶解于150-250mL的3∶1苯∶二噁烷混合物中的0.2-1.0g所述(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚(II)，其中所述混合物首先用氩气脱气，然后以4-5h的间隔照射5-18h。
15.如权利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中残留在所述容器壁上的所述硝基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物用蒸馏水提取并过滤。
16.如权利要求15所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所过滤的水经冷冻干燥以分离纯的BQS。
17.如权利要求1所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所述光诱导环化过程包括：
a.选择具有搅拌棒的烧瓶和辐照装置，其中所述辐照装置装配有350nm灯；
b.用混合物填充所述烧瓶，其中所述混合物包括3mL甲基亚砜；
c.将2-苯乙烯基苯并噻唑加入所述混合物中；
d.将所述烧瓶置于所述辐照装置处，并在磁力搅拌下照射所述混合物4-6h的时间，直到固体完全溶解并在23℃-25℃之间的温度下固化，产生反应混合物；
e.将所述反应混合物加入到含有50-75mL蒸馏水的烧杯中并搅拌约15min直到第一固体沉淀；
f.移出第一沉淀固体并将所述第一沉淀固体放入干燥器中；
g.使所述第一沉淀固体干燥选定的时间；和
h.将所述第一沉淀固体溶解于100mL干燥的苯中并干燥所述第二固体。
18.如权利要求17所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中所述选定的时间是24小时且在所述第一沉淀固体溶解于100mL干燥的苯中之后用无水硫酸钠干燥。
19.如权利要求18所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中干燥所述沉淀固体之后，所述硫酸钠通过过滤除去并将得到的溶液放置于辐照容器中并在所述辐照装置处暴露于350nm光。
20.如权利要求17所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中移出所述第一沉淀固体包括通过真空蒸馏移出所述第一沉淀固体并用蒸馏水洗涤所述第一沉淀固体。
21.如权利要求17所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓盐化合物的合成方法，其中放置于烧瓶中的所述混合物包括0.15-0.3g待异构化的2-苯乙烯基苯并噻唑。
荧光细胞标记
10所示，系列4(X＝Se)包括在环C和环D中结合了苯并硒唑部分的氯化苯并硒唑并[3，
2-a]喹啉鎓。系列1-4进一步特征在于在环A中包括硝基或氨基取代基，这些分别被确定为NBQ和ABQ。如图2所示，从NBQ和ABQ表中选择的一些是获自系列1和2的NBQ-38、ABQ-38、NBQ-95和ABQ-95。
1 13
(Melt-Temp)仪器在毛细管中测定熔点。在诸如以下的分光计上记录 H和 C nmr光谱：
1 13
通用电气QE-300(利用5mm C/H双探头)，在对 H为300.15MHz的观测频率和对 C为
75.48MHz的观测频率下操作，并安装处理和分析由观测获得的数据的软件诸如Nicolet
1
1280数据系统和293-C脉冲编程器；或BrukerDRX500(利用5mm宽谱带探头)，在对 H为
13
500.13MHz的可观测频率和对 C为125.77MHz的可观测频率下操作。质子数据参考在δ0.0ppm的四甲基硅烷(TMS)，在δ7.26ppm的氯仿(CDCl3)或在δ2.49ppm的二甲亚砜
13
(DMSO-d6)。 C核参考在δ77.0ppm的氘代氯仿的1∶1∶1多重峰的峰中心或分配在δ39.5ppm的六氘代甲基亚砜的多重峰的中心峰。
在大约0.50mL至0.75mL的相应的氘取代的溶剂中。H和 C nmr光谱的测量条件如下：脉冲宽度，分别是8.75μs(90°)和9.60μs(90°)；谱宽分别是3311Hz和14705Hz；数据点分别是16K和32K。
延迟时间是3.0ms(1/2JCH＝Δ1)以阻止单键反应，和50ms(1/JCH＝Δ2)以展开远程偶合(10Hz)。
量)持续48h至168h之间的延长的反应时间。通过TLC和 H NMR光谱监视反应过程。
450W-Hanovia汞汽灯作为光源。重要的是理解照射的特异性是为了避免不期望的反应。照射溶解于150-250mL 3∶1苯∶二噁烷混合物中的0.2-1.0g相应的(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚(II)样品10-18h的间隔。在每次中断后，过滤溶液以移出部分产物。在滤纸上获得纯形式的固体材料。用蒸馏水(大约15mL)提取残留在管壁上的剩余的产物。滤纸也用水洗涤以移出水溶性产物。过滤来自一些照射的合并的水提取物并经冷冻干燥以分离纯的BQS。重新使用前，辐照容器依次用丙酮、乙醇、硫酸(1.0M)、水、稀释的碳酸钠溶液(10％)、蒸馏水和丙酮洗涤。最后，在烘箱中干燥不少于24h。
450W-Hanovia汞汽灯作为光源。照射前将0.2-1.0g相应的(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚(II)样品溶解于150-250mL 2∶1∶1苯∶溴苯∶二噁烷混合物中。在每次中断后，过滤溶液以移出部分产物。在滤纸上获得纯形式的固体材料。用蒸馏水(大约15mL)提取残留在管壁上的剩余的产物。滤纸也用水洗涤以移出水溶性产物。过滤来自一些照射的合并的水提取物并经冷冻干燥以分离纯的BQS。重新使用前，辐照容器依次用丙酮、乙醇、硫酸(1.0M)、水、稀释的碳酸钠溶液(10％)、蒸馏水和丙酮洗涤。最后，在烘箱中干燥不少于
24h。
450W-Hanovia汞汽灯作为光源。首先将溶解于150-250mL 3∶1苯∶二噁烷混合物中的
0.2-1.0g相应的(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚(II)样品用氩气脱气，然后照射5-18h。在
4-5h的间隔之间，过滤溶液以移出部分产物。在滤纸上获得纯形式的固体材料。用蒸馏水(大约15mL)提取残留在管壁上的剩余的产物。滤纸也用水洗涤以移出水溶性产物。过滤来自一些照射的合并的水提取物并经冷冻干燥以分离纯的BQS。在开始的过程中BOS高氯酸盐通过加入高氯酸水溶液或饱和高氯酸钠溶液通过其沉淀来分离。重新使用前，辐照容器依次用丙酮、乙醇、硫酸(1.0M)、水、稀释的碳酸钠溶液(10％)、蒸馏水和丙酮洗涤。最后，在烘箱中干燥不少于24h。
1.8mmol)经光环化(BQS方法1)得到0.45g(75％)NBQ-38：H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.43(d，J＝9.0Hz，1H，芳族的)，9.40(d，J＝3.0Hz，1H)，9.20(d，J＝9.0Hz，1H芳族的)，9.06(d，J＝9.0Hz，1H，芳族的)，8.78(dd，J＝9.0，3.0Hz，1H，芳族的)，8.69(d，J＝
9.0Hz，1H芳族的)，8.43(d，J＝9.0Hz，1H芳族的)，8.05-7.94(m，2H，芳族的)，5.01(q，J
13
＝7.5Hz，2H，CH2)，1.50(t，J＝ 7.5Hz，3H，Me)；C NMR(DMSO-d6，300MHz)δ31.3，111.7，
113.6，-116.4，118.9，123.9，126.2，126.4，126.8，127.6，128.6，132.7，136.1，139.1，
143.9，144.8；IR(KBr)3400.0，3350.0，3025.0，3000.0，2950.0，2925.0，1618.0，1570.2，
1527.6，1473.2，1451.0，1427.2，1384.3，1346.5，1373.0，1253.0，1253.4，1208.8，1161.4，-1
1088.8，987.0，913.1，812.9，763.2，737.6，696.7，601.7，584.5，556.3，507.4，455.6cm 。
化合物分析为高氯酸盐衍生物。C17H14Cl-N3O6的分析计算值：C，52.12；H，3.60；N，10.73。实测值：C，52.08；H，3.63；N，10.67。
1
体：mp 236-240℃(dec.)；H NMR(300.15MHz，DMSOd6)：δppm 9.54(s，1H)，9.37(s，1H)，
9.06(s，1H)，9.00(s，2H)，8.59 和 7.86(AB，2H，J ＝ 8.4Hz)，2.74(s，3H)；UV-vis(95 ％EtOH)λmax/nm(e)：389(11196)，380(11363)，270(14858)，225sh(21441) 和 202(28390)；
C16H10Cl2N2O2SH2O的分析计算值：C，50.14；H，3.16；N，7.31％。实测值：C，49.85；H，3.35；N，
7.00％。
1
基-7-乙基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎓(ABQ-38)黄色固体：H NMR(500.13MHz，DMSO-d6)：δppm 9.05(d，1H，J＝8.50Hz)，8.88(d，1H，J＝9.0Hz)，8.56(d，1H，J＝9.5Hz，
8.27(d，1H，J＝8.5Hz)，8.23(d，1H，J＝9.50Hz)，7.90(t，1H，J＝7.5Hz)，7.81(t，1H，J＝7.5Hz)，7.43(dd，1H，J＝8.5，2.5)，7.27(d，1H，J＝2.5Hz)，4.83(q，2H，J＝7.0Hz)，
1.48(t，3H，J＝7.0Hz)；UV-vis(95％EtOH)λmax/nm(e)：409(1410)，351(8104)，336(9815)和271(20866)；C17H16N3的HRMS计算值(化合物没有氯化物平衡离子)262.1，在m/z
261.9实测ESI。(E)-5-甲基-2-(5-氨基-2，4-二氯苯乙烯基)苯并噻唑IId如所述(BQS方法1)经光环化得到3-氨基-2-氯-10-甲基氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎓(ABQ-95)
1
黄色固体：H NMR(500.13MHz，DMSO-d6)：δppm 9.17(s，1H)，8.92(s，1H)，8.63(AB四重峰，2H，J＝9.5Hz)，8.48(d，1H，J＝8.5Hz)，7.76(d，1H，J＝8.5Hz)，7.53(s，1H)，6.50(m，
2H)，2.70(s，3H)；UV-vis(95 ％ EtOH)λmax/nm(e)：429(4417)，380(10 387)，282(22 568)+
和214(2650)；C16H12ClN2S 299.0的HRMS计算值(没有氯化物平衡离子)，在m/z 299.0M实测ESI。
1640。细胞暴露于IC50浓度的ABQS和玫瑰树碱，孵育并在72小时期间通过倒置显微镜监视。具有U滤光镜、40X物镜的Olympus CKX41倒置荧光显微镜(50w Hg灯)。利用Q捕获软件获取暴露13-17秒时的照片。利用阴性和阳性对照作为参考来区分自体荧光细胞和非自体荧光细胞。图11和图12用荧光显微镜(Olympus CKX41)显示了A431肿瘤细胞的ABQ38的自体荧光。图像清楚地显示了ABQ作为细胞相互作用的标记的自体荧光能力。
25cm 的烧瓶中。每个平板的最终体积是9mL含有细胞整份试样、介质和本发明的BQS的修饰的RPMT 1640。然后孵育细胞4小时，使细胞粘附在烧瓶上。用范围5uM至100uM的浓度的BQS培养细胞48小时。在每个实验中包括了用超纯水(媒介物)处理的阴性对照。用不同浓度的每个化合物处理培养的细胞以通过测定IC50或50％的细胞群的抑制来测定其生长抑制效价。在暴露期末，除去介质并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗培养物两次以除去溶液中的化合物。用5％胰蛋白酶分离细胞，离心，在新鲜的介质中再悬浮并通过细胞存活力方案诸如锥蓝排除分析计数。计算细胞存活并用Microsoft Excel 软件对时间绘图。图
12显示了与其硝基取代类似物相比获得的ABQ的IC50％如下：NBQ38：36uM；ABQ38：32uM；
NBQ95：28uM和ABQ95：36uM。
515-570nm之间的发射；关于所述滤光镜的高荧光强度揭示了受损的线粒体膜。绿色滤光镜捕获范围为580-640nm的发射并检测健康细胞(590nm)；在此通道中的高荧光强度揭示了健康的线粒体。因为ABQ在荧光染料的发射波长附近微弱地发射荧光，我们用两种滤光镜(蓝色和绿色)来测量染色的整份试样和未染色的整份试样的荧光用于本底测定和数据标准化。计算了数据并通过扣除来自阴性对照的任何本底荧光进行了两次标准化。计算了凋亡细胞的百分数并用Microsoft Excel 软件对药物绘图。图13说明了选择的BQS(NBQ-38、ABQ-38、NBQ-95和ABQ-95)对线粒体膜渗透性的能力之间的比较。
2003)。利用Magic Red 测定，具有非活性胱天蛋白酶3和7的凋亡细胞不发荧光，而具有活性胱天蛋白酶3和7的细胞发红色荧光，表明阴性或阳性凋亡。文献表明十字孢碱和顺铂诱导涉及胱天蛋白酶3和7的凋亡(Zhang，X.D.等人2004；Blanc，C.等人2000)，使顺铂和十字孢碱成为合适该测定的阳性对照。
细菌污染的额外的营养素和添加剂诸如胎牛血清和抗生素来改进。5×10 个细胞的细胞培
2
养物接种在25cm 细胞培养瓶中(两份)。每个平板上的最终体积是9mL含有细胞整份试样、介质和药物的修饰的RPMT 1640。对于凋亡诱导能力，顺铂(3uM)和十字孢碱(1uM)用作阳性对照且未处理的细胞作为阴性对照。在处理时间结束时，细胞用PBS洗涤，用5％胰蛋白酶分离细胞并离心。计数细胞并用甲酚紫(荧光染料)染色整份试样一小时。用倒置显微镜定性地监视活性胱天蛋白酶3和7，在用40X物镜暴露9秒时用G滤光镜捕获细胞图像。利用阴性和阳性对照作为参照区分凋亡细胞(红色)和未凋亡的细胞(无荧光的)。
5
制备最近的5×10 个暴露细胞的整份试样并根据生产商说明书(进行稍微的修改)用染料染色。
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