技术领域
[0001] 本
发明涉及一种二价靶向多肽探针及其制备方法。
背景技术
[0002]
恶性肿瘤严重威胁着人类的生命与健康，由于其发病机制尚未完全阐明，一直存在着早期诊断难、源头创新药物少和有效
治疗手段缺乏等问题。恶性肿瘤的早期诊断和治疗可显著提高患者生存期和治愈率。目前基于
抗体与肿瘤标志物特异性识别原理的诊断与治疗方法是肿瘤诊疗中非常有效的手段，抗体具有亲和
力高，特异性强等优点，然而，其体积大，组织穿透能力差，容易产生免疫原性。因此，近年来越来越多的小分子靶向配体，例如多肽配体、核酸适配体等受到研究人员的广泛关注，蓬勃发展起来，并有望应用于肿瘤的靶向诊疗中。多肽靶向配体具有分子量小，组织穿透能力强，不易引起免疫反应等优点，且可通过化学合成方法获得，制备简单，产物性质稳定，价格低廉。然而，相比于抗体，多肽与靶分子的亲和力相对较弱，因此，提高肿瘤靶向多肽的亲和力是亟待解决的科学问题。
发明内容
[0003] 本发明的一个目的是提供一种二价靶向多肽探针。
[0004] 本发明所提供的二价靶向多肽探针，其结构包括四个组成部分：
[0005] A)两个肿瘤特异性靶向多肽；B)两个PEG连接臂；C)骨架核心肽；D)
荧光分子；
[0006] 其中，每个所述肿瘤特异性靶向多肽与PEG连接臂通过式I所示的基团相连；
[0007]
[0008] 所述骨架核心肽其
氨基酸序列如下所示：KGGKG(SEQ ID NO:1)；
[0009] 所述骨架核心肽与所述肿瘤特异性靶向多肽是通过PEG连接臂偶联的；
[0010] 所述荧光分子与所述骨架核心肽通过化学键相连。
[0011] 其中，所述肿瘤特异性靶向多肽适用于将所述偶联物靶向至肿瘤细胞，并以所述肿瘤细胞表面携带的标志蛋白LAPTM4B作为特异性靶标。
[0012] 本发明所述肿瘤特异性靶向多肽的具体氨基酸序列无特别限制，凡是能够有效识别LAPTM4B，并能将其所连接的抗肿瘤药物靶向至表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞即可。具体的，所述肿瘤特异性靶向多肽可为AP2H多肽，其氨基酸序列如下所示：IHGHHIISVG(SEQ ID NO:2)。
[0013] 所述PEG连接臂的长度不固定，可以依据实际效果进行调节，优选PEG9；
[0014] 所述荧光分子可选自荧光素、罗丹明、尼罗红、
萘酰亚胺、菁染料中的至少一种，优选荧光素。
[0015] 当所述肿瘤特异性靶向多肽为AP2H时，所述二价靶向多肽探针具有下式所示的结构：
[0016]
[0017] 本发明还提供了上述二价靶向多肽探针的制备方法。
[0018] 本发明所提供的二价靶向多肽探针的制备方法，包括下述步骤：
[0019] 1)采用固相多肽合成法制备骨架核心肽：用FMOC固相多肽合成法在Fmoc-Gly-Wang
树脂上由C端开始合成多肽KGGKG，将氨基酸逐个偶联到树脂上，随后在N末端赖氨酸的α氨基与ε氨基上偶联Fmoc-PEG9-CH2-CH2-COOH分子，然后再连接叠氮乙酸，在C末端赖氨酸的ε氨基上偶联FITC，将产物从树脂上裂解下来，得到叠氮修饰的骨架核心肽；
[0020] 2)采用固相多肽合成法制备肿瘤特异性靶向多肽，然后在固相多肽
合成树脂上，通过5-己炔酸原位衍生法在所述肿瘤特异性靶向多肽的氨基端修饰炔基，将产物从树脂上裂解下来，得到炔基修饰的肿瘤特异性靶向多肽；
[0021] 3)通过液相click反应将步骤1)制备的骨架核心肽与步骤2)制备的肿瘤特异性靶向多肽相连，得到二价靶向多肽探针。
[0022] 上述步骤1)中，制备骨架核心肽的具体方法如下：
[0023] a1)以Fmoc-Gly-Wang树脂为起始原料，体积分数20％六氢吡啶/DMF为脱保护
试剂，脱去Fmoc保护基；然后加入4倍摩尔量氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH、HOBt、HBTU，以及活化试剂N-甲基吗啡啉/DMF，进行偶联反应；通过乙酸酐对未反应完全的甘氨酸树脂进行封端；脱去已偶联上的Fmoc-Lys(Dde)-OH中的Fmoc保护基，再称取4倍摩尔量的Fmoc氨基酸、HOBt和HBTU，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Lys(Fmoc)-OH；
[0024] b1)按照每个氨基2倍摩尔量称取Fmoc-PEG9-CH2CH2-COOH、HOBt和HBTU，偶联后脱去Fmoc保护，按照每个氨基4倍摩尔量称取叠氮乙酸、HOBt和HBTU进行固相偶联；随后脱去赖氨酸的Dde保护基；按照每个氨基称取2倍摩尔量的荧光分子、4倍摩尔量的DIPEA(N，N’-二异丙基乙胺)，进行偶联反应；
[0025] c1)利用裂解液将骨架核心肽从树脂上裂解下来，即得；其中所述裂解液由体积分数为95％三氟乙酸，2.5％
水，2.5％三异丙基
硅烷组成。
[0026] 上述步骤2)中，所述肿瘤特异性靶向多肽为AP2H多肽；所述炔基修饰的肿瘤特异性靶向多肽的制备方法具体如下：
[0027] a2)以FMOC-Gly-Wang树脂为起始原料，以体积分数20％六氢吡啶/DMF为脱保护试剂，N-甲基吗啡啉和HBTU为活化试剂，合成AP2H多肽序列；
[0028] b2)脱去所述AP2H多肽序列N端的FMOC保护基团，加入4倍摩尔量的5-己炔酸、HBTU和HOBt进行偶联反应，得到炔基修饰的肿瘤特异性靶向多肽；
[0029] c2)利用裂解液将炔基修饰的肿瘤特异性靶向多肽从树脂上裂解下来，即得；其中所述裂解液由体积分数为95％三氟乙酸，2.5％水，2.5％三异丙基硅烷组成。
[0030] 上述步骤3)中，所述Click反应在Cu(I)的催化作用下进行；所述Click反应在
溶剂中进行，所述溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)。
[0031] 所述骨架核心肽与所述肿瘤特异性靶向多肽的摩尔比为1:2.4。
[0032] 本发明再一个目的是提供上述二价靶向多肽探针的应用。
[0033] 本发明所提供的二价靶向多肽探针的应用包括下述两方面：
[0034] 1)在制备真核
生物肿瘤细胞检测试剂中的应用；
[0035] 2)在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0036] 所述真核生物为
哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为肝癌细胞、
乳腺癌细胞、
肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、
宫颈癌细胞、鼻咽癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、
皮肤癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞。
[0037] 靶向多肽AP2H(IHGHHIISVG)对肿瘤标志蛋白LAPTM4B第二胞外区多肽
片段具有高特异性的亲和识别作用。根据本课题组之前发表的工作，AP2H多肽不但能够特异性识别肿瘤细胞膜表面过表达的LAPTM4B蛋白，而且能够随LAPTM4B蛋白的动态转运进入
细胞质。在此
基础上，我们设计并制备了二价靶向多肽探针，为测定多肽探针与LAPTM4B蛋白高表达肿瘤细胞的亲和力，我们在靶向多肽上修饰荧光分子FITC，赋予了靶向多肽荧光性质，这样即可实现高灵敏度荧光定量，通过流式细胞仪可对多肽探针与肿瘤细胞的
吸附性能进行考察。我们设计并合成了单价多肽探针FITC-AP2H(探针-1)，合成流程如图1所示。为了提高多肽探针在水溶液中的溶解性，我们在多肽探针的结构中引入亲水性好的PEG手臂，合成了单价多肽探针FITC-PEG9-AP2H(探针-2)，合成流程如图2所示。为提高AP2H与肿瘤细胞的亲和力，我们提出了多价协同靶向的策略，设计并制备了多价靶向多肽探针FITC-2PEG9-2AP2H(探针-3)，两个靶向配体AP2H通过PEG链与骨架核心肽偶联，PEG链不仅能提高靶向多肽探针在水溶液中的溶解性，还增加了靶向多肽探针的柔性，有利于与目标物的识别与结合。该方法同样适用于提高其他多肽配体与靶分子的亲和力。
附图说明
[0038] 图1为探针-1：FITC-AP2H的合成
流程图。
[0039] 图2为探针-2：FITC-PEG9-AP2H的合成流程图。
[0040] 图3为探针-3：FITC-2PEG9-2AP2H的合成流程图。
[0041] 图4为探针-1的液相色谱-质谱图；(a)HPLC图(b)质谱图，标星号的质谱峰均为目标多肽探针的多电荷峰。
[0042] 图5为探针-2的液相色谱图。
[0043] 图6为探针-2的高分辨质谱图；(a)全扫描，标星号的质谱峰均为目标多肽探针的多电荷峰，(b)目标多肽带3电荷质谱
信号的同位素峰。
[0044] 图7为探针-3的液相色谱图。
[0045] 图8为探针-3的高分辨质谱图；(a)全扫描，标星号的质谱峰均为目标多肽探针的多电荷峰，(b)目标多肽带3电荷质谱信号的同位素峰。
[0046] 图9为探针-1的流式分析结果；(a)不同多肽探针浓度对应细胞荧光强度的直方图，(b)细胞平均荧光值与多肽探针浓度的拟合曲线。
[0047] 图10为探针-2的流式分析结果；(a)不同多肽探针浓度对应细胞荧光强度的直方图，(b)细胞平均荧光值与多肽探针浓度的拟合曲线。
[0048] 图11为探针-3的流式分析结果；(a)不同多肽探针浓度对应细胞荧光强度的直方图，(b)细胞平均荧光值与多肽探针浓度的拟合曲线。
具体实施方式
[0049] 下面通过具体
实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0050] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0051] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052] 对比例1、FITC-APH的合成(探针-1)
[0053] 合成流程如图1所示。
[0054] 1、AP2H的合成。称取Fmoc-Gly-Wang树脂50mg于多肽合成管中(键合量为0.6mmol/g)，加5mL DMF溶胀30min。加入2mL的20％(v/v)六氢吡啶/DMF溶液，搅拌反应7min以脱去Fmoc保护基，重复两次，抽滤并用DMF洗涤数次。从C端起始，按组成多肽的氨基酸顺序偶联氨基酸。称取4倍量的Fmoc氨基酸、HOBt和HBTU，并溶解于1-2mL的N-甲基吗啡啉/DMF(0.4mol/L)溶液中，将上述反应液加入多肽合成管中反应1-2h。偶联完AP2H后脱去N端保护基，随后分别用二氯甲烷、甲醇各清洗树脂3次，收缩树脂。将树脂放入
真空干燥箱，室温真空干燥4h。多肽裂解液配方为：95％TFA、2.5％水和2.5％TIS。将配制好的裂解液放入
冰浴中，按照25mL/g树脂的比例将树脂加入裂解液中，冰浴中裂解10min，随后室温下裂解2h。将裂解体系经砂芯漏斗过滤，滤液收集至梨形瓶中，37℃旋蒸至剩余少量TFA，加入预冷的乙醚沉淀多肽探针，乙醚反复离心清洗3次后真空干燥得到AP2H多肽粗品28.3mg。通过SHIMADZU Prominence半制备液相色谱体系纯化探针粗品，色谱柱型号为 C18，5μm，250×10mm，流动相为：A,H2O+0.1％TFA，B,CH3CN+0.1％TFA，梯度为：15％-35％B,20min，流速3mL/min。收集目标物色谱峰后，旋蒸除去大部分
有机溶剂，
冷冻干燥后得到AP2H多肽纯品19.2mg。
[0055] 2、FITC的标记。AP2H多肽用
碳酸盐缓冲(0.09mol/L NaHCO3,0.01mol/LNa2CO3,0.126mol/L NaCl；pH 9.0)溶解至浓度为2mg/mL；FITC用DMSO配置成浓度为12.5mg/mL的溶液。将多肽溶液与FITC溶液以体积比2:1混合，室温避光反应2h。反应液通过SHIMADZU Prominence半制备液相色谱体系纯化，得到目标多肽探针FITC-AP2H 5.2mg。
[0056] 探针1的结构表征
[0057] 纯化所得多肽探针通过HPLC进行纯度分析，并通过质谱进行分子量鉴定。探针-1的HPLC分析结果如图4(a)所示，纯度大于95％。图4(b)为ESI-IT MS质谱图，图中标星号的质谱峰均为目标多肽探针的多电荷峰。
[0058] 对比例2、FITC-PEG9-AP2H的合成(探针-2)
[0059] 合成流程如图2所示。
[0060] 用FMOC固相多肽合成法在Fmoc-Gly-Wang树脂上由C端开始合成多肽探针，具体方法为：将组成多肽的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，随后在N端偶联Fmoc-PEG9-CH2-CH2-COOH分子，最后偶联异硫氰酸荧光素，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解，同时去除
侧链保护基团。具体操作步骤如下：
[0061] 称取Fmoc-Gly-Wang树脂50.3mg于多肽合成管中(键合量为0.321mmol/g)，加5mL DMF溶胀30min。加入2mL的20％(v/v)六氢吡啶/DMF溶液，搅拌反应7min以脱去Fmoc保护基，重复两次，抽滤并用DMF洗涤数次。从C端起始，按组成多肽的氨基酸顺序偶联氨基酸。称取4倍量的Fmoc氨基酸、HOBt和HBTU，并溶解于1-2mL的N-甲基吗啡啉/DMF(0.4mol/L)溶液中，将上述反应液加入多肽合成管中反应1-2h。偶联完AP2H后脱去N端保护基，称取2倍量的Fmoc-PEG9-CH2CH2-COOH，4倍量的HOBt和HBTU，以0.4mol/L N-甲基吗啡啉/DMF溶液溶解，将上述反应液加入多肽合成管中反应2h。最后，脱去Fmoc-PEG9-CH2CH2-COOH的Fmoc保护基。称取2倍量的FITC、4倍量的DIPEA，溶解在400μL的DMF中，室温避光搅拌反应2h。固相合成完成后分别用二氯甲烷、甲醇各清洗树脂3次，收缩树脂；将树脂放入真空干燥箱，室温真空干燥4h。多肽裂解液配方为：95％TFA、2.5％水和2.5％TIS。将配制好的裂解液放入冰浴中，按照
25mL/g树脂的比例将树脂加入裂解液中，冰浴中裂解10min，随后室温下裂解2h。将裂解体系经砂芯漏斗过滤，滤液收集至梨形瓶中，37℃旋蒸至析出淡黄色固体，加入预冷的乙醚沉淀多肽探针，乙醚反复离心清洗3次后真空干燥得到探针的粗品45.2mg。通过SHIMADZU Prominence半制备液相色谱体系纯化探针粗品，色谱柱型号为 C18，5μm，250×
10mm，流动相为：A,H2O+0.1％TFA，B,CH3CN+0.1％TFA，梯度为：30％-50％B,20min，流速3mL/min。收集目标物色谱峰后，旋蒸除去大部分有机溶剂，冷冻干燥后得到纯品7.1mg。
[0062] 探针2的结构表征
[0063] 纯化所得多肽探针通过HPLC进行纯度分析，并通过质谱进行分子量鉴定。
[0064] 探针-2的HPLC分析结果如图5所示，纯度大于98％。图6(a)为探针-2的ESI-FTICR MS质谱图，图中标星号的质谱峰均为目标多肽探针的多电荷峰。图6(b)为目标多肽带3电荷质谱信号的同位素峰。
[0065] 实施例1、FITC-2PEG9-2AP2H的合成(探针-3)
[0066] 该多肽探针的合成主要分为三个步骤，即骨架核心肽的合成、分支靶向肽的合成以及液相条件下的Click反应。
[0067] 合成流程如图3所示。
[0068] 1、骨架核心肽的合成
[0069] 用FMOC固相多肽合成法在Fmoc-Gly-Wang树脂上由C端开始合成多肽KGGKG，将氨基酸逐个偶联到树脂上，随后在N末端赖氨酸的α氨基与ε氨基上偶联Fmoc-PEG9-CH2-CH2-COOH分子，然后再连接叠氮乙酸，在C末端赖氨酸的ε氨基上偶联FITC。然后在强酸下将肽链从树脂上裂解，同时去除其余的侧链保护基团。具体实验步骤如下：
[0070] 取100mg Fmoc-Gly-Wang树脂，DMF溶胀20min，称取4倍量氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，4倍量HOBt、HBTU，按照合成探针-2所述方案进行偶联。通过乙酸酐对未反应完全的甘氨酸树脂进行封端。封端试剂配方为Acetic anhydride：DIPEA：DMF＝1：1：8(v：v：v)。取2.5mL封端试剂加入多肽合成管中反应5min。脱保护后称取4倍量的Fmoc氨基酸、HOBt和HBTU，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。按照每个氨基2倍量称取Fmoc-PEG9-CH2CH2-COOH、HOBt和HBTU，偶联后脱保护，按照每个氨基4倍量称取叠氮乙酸、HOBt和HBTU以上述相同方式进行固相偶联。随后脱去赖氨酸的Dde保护基，脱保护试剂配方为：1.25g
盐酸羟胺(1.80mmol)、0.918g咪唑(1.35mmol)溶于5mL的N-甲基吡咯烷
酮(NMP)中，置于-27℃
冰箱中，使用时取1mL加入0.2mL DMF，混匀加入合成管树脂中，室温搅拌反应3h。称取2倍量的FITC、4倍量的DIPEA，溶解在400μL的DMF中，室温避光搅拌反应2h。最后以与探针-2所述相同裂解方案进行裂解得到粗品并进行纯化。
[0071] 2、分支靶向肽的合成
[0072] 靶向配体AP2H多肽的合成方法与探针-2相同。用FMOC固相多肽合成法在Wang树脂上由C端开始合成多肽探针，随后进行Fmoc脱保护，称取4倍量的5-己炔酸、HBTU和HOBt溶于1-2mL的N-甲基吗啡啉/DMF(0.4mol/L)进行偶联。随后以与探针-2相同裂解方案对产物进行裂解并纯化。
[0073] 3、Click反应
[0074] 以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，以Cu(I)为催化剂，在液相中进行炔基和叠氮的Click反应。具体为：称取3mg骨架分子(1当量)，加入2.4当量分支靶向多肽，1.2当量的CuSO4溶液(0.1mol/L)，2.4当量的
抗坏血酸钠溶液(0.1mol/L)，总体积1％的三乙胺，反应溶剂为H2O：DMF＝3：1(v：v)，反应体系总体积为600μL。反应时，首先将除抗坏血酸钠以外的其他组分称取在同一密封瓶中混匀，通入N2除
氧10min，同时在另一密封瓶中配制抗坏血酸钠溶液并除氧10min。微量进样器
抽取抗坏血酸钠溶液10μL加入上述反应体系，常温密闭搅拌反应3h。液相色谱纯化前，先用H2O(0.1％TFA)：CH3CN(0.1％TFA)＝5:1(v：v)将反应液稀释10倍。通过SHIMADZU Prominence半制备液相色谱体系纯化探针粗品，色谱柱型号为C18，5μm，250×10mm，流动相为：A,H2O+0.1％TFA，B,CH3CN+0.1％TFA，梯度为：25％-45％B,20min，流速3mL/min。旋蒸除去大部分有机溶剂，冷冻干燥后得到二价靶向多肽探针FITC-2PEG9-2AP2H(探针-3)的纯品。
[0075] 探针3的结构表征
[0076] 纯化所得多肽探针通过HPLC进行纯度分析，并通过质谱进行分子量鉴定。
[0077] 探针-3的HPLC分析结果如图7所示，纯度大于98％。图8(a)为探针-3的ESI-FTICR MS质谱图，图中标星号的质谱峰均为目标多肽探针的多电荷峰。图8(b)为目标多肽带5电荷质谱信号的同位素峰。
[0078] 实施例2、流式细胞术表征多肽配体与肿瘤细胞的亲和力
[0079] 实验方法：
[0080] 配制EDTA细胞消化液。称取EDTA-2Na盐固体3.639g，加入到19.55mL的PBS溶液(pH 7.4)，加入适量NaOH调节缓冲溶液pH至EDTA-2Na完全溶解，此时pH约为8.0，于是得到EDTA母液(浓度为0.5mol/L)。实验中消化细胞时，用PBS稀释EDTA母液至5mmol/L。
[0081] 将HepG2细胞用5mmol/L的EDTA溶液消化10min，吹打细胞使得贴壁细胞均匀悬浮于消化液中，使用1000r/min(
离心力180g)的离心机对细胞悬液离心5min，弃去上清液，将细胞重悬于PBS中，洗涤2次。最终将细胞悬浮于含有
钙、镁离子的Hanks
葡萄糖缓冲液(HBSS)中。
[0082] 将细胞悬浮液吹打分散均匀，通过细胞计数板对悬浮HepG2细胞进行计数，并分装在1.5mL的离心管中，保证每管细胞数均约为5×105个，随后加入终浓度为1mg/mL的BSA，对细胞表面的非特异性位点进行封闭。
[0083] 使用HBSS配置不同浓度的多肽探针溶液，并分别加入到上述细胞悬浮液中，使多肽探针的终浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1、2.5μmol/L。将孵育液置于冰水浴中孵育1h。随后使用离心力180g的离心机对细胞进行离心5min，弃去上清液，用500μL的HBSS洗涤2次，重悬于100-200μL的HBSS缓冲液中。通过BD Accuri C6流式细胞仪对上述细胞悬液进行分析。以488nm
激光器激发，以FL1通道(520/30nm滤光片)接收信号。所有细胞吸附实验均是2-3次重复实验的结果。多肽探针与细胞的平衡解离常数Kd可通过以下公式1进行拟合：
[0084] Y＝BmaxX/(Kd+X) 公式1
[0085] 其中Y为实验组细胞的荧光值减去对照组细胞背景荧光值，X为孵育溶液中多肽探针的浓度，Bmax为饱和吸附时细胞的理论荧光值，Kd是多肽探针与细胞的平衡解离常数。
[0086] 多肽探针与细胞表面靶蛋白的吸附行为符合单分子层表面吸附模型，通过公式1对细胞荧光值与孵育液中多肽探针的平衡浓度进行拟合，可得到多肽探针与细胞上靶蛋白的平衡解离常数Kd值。如图9所示，随着探针浓度的增加，细胞表面的荧光值升高，并有饱和的趋势，拟合得到FITC-AP2H(探针-1)与HepG2细胞的平衡解离常数Kd值为1.4μmol/L。在多肽探针的结构中引入PEG9手臂，得到FITC-PEG9-AP2H(探针-2)，实验结果如图10所示，此探针与HepG2细胞的平衡解离常数Kd值为1.5μmol/L，这表明PEG9手臂对多肽探针与HepG2细胞的结合力无明显影响，FITC-PEG9-AP2H仍能保持与靶细胞较高的亲和力。如图11所示，二价多肽探针FITC-2PEG9-2AP2H(探针-3)与HepG2细胞的平衡解离常数Kd值为0.38μmol/L，这表明二价多肽探针能显著提高与靶细胞的亲和力，这是多价配体协同作用的结果。PEG9柔性手臂的引入保证了多肽荧光探针良好的
水溶性，有利于生物应用。此外，PEG9将荧光基团FITC与识别配体进行了有效分离，减少了AP2H多肽对FITC荧光性质的影响，同时也减少了FITC荧光基团对AP2H多肽与靶蛋白识别的影响。
[0087] 本发明构建了多价协同型靶向多肽探针FITC-2PEG9-2AP2H。该二价多肽探针由两个靶向多肽AP2H通过亲水性PEG与荧光报告分子FITC相连。流式细胞实验结果表明，与单价多肽探针相比，该协同型二价多肽探针与LAPTM4B蛋白高表达的肿瘤细胞HepG2具有更高的亲和力，平衡解离常数Kd值为0.38μmol/L。该方法同样适用于提高其他多肽配体与靶分子的亲和力。
