一种芳基取代噁二嗪酮类化合物及其制备方法和应用
阅读：438发布：2021-04-12
专利汇可以提供一种芳基取代噁二嗪酮类化合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种芳基取代噁二嗪 酮 类化合物及其制备方法和应用。所述化合物的结构如式Ⅰ所示；本发明所述化合物结构新颖，制备过程简单，以廉价易得的化合物为原料，反应条件温和、步骤少、反应快、成本低、产生的废弃物少、操作简单安全、 原子 经济性高、选择性高、收率高；所述化合物具有成药性好的母核，通过对靶点FabH的共价修饰作用达到显著的活性抑制，且化合物对FabH靶点具有很高的选择性，抑制作用强，能够很好地抑制金黄色葡萄球菌等细菌，甚至对于耐甲 氧 西林金黄色葡萄球菌等耐药菌也同样表现出很好的抑制作用，可制备成为对细菌具选择性而对人体无毒的抗菌药进行运用。，下面是一种芳基取代噁二嗪酮类化合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种芳基取代噁二嗪酮类化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式Ⅰ所示：
其中R1为C1～6烷基、C1～6环烷基、苄基、取代苄基、苯乙基或取代苯乙基；
R2为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、取代或非取代C1～4烷基、取代或非取代C1～4烷氧基、取代或非取代C1～4环烷基、取代或非取代C1～4环烷氧基、取代或非取代苯基、取代或非取代苯氧基、取代或非取代苄基、取代或非取代五杂环基；
所述取代是指至少1个位点被以下取代基取代：卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、C1～4烷基、C1～4卤代烷基、C1～4烷氧基、C1～4卤代烷氧基、苯基、苄基、苯氧基或甲硫基；
所述杂环基为含氧、硫或氮原子的C5～6的芳基或环烷基。
2.根据权利要求1所述芳基取代噁二嗪酮类化合物，其特征在于，所述R1为C1～6直链烷基或支链烷基、C1～6环烷基、苯基、苄基或苯乙基。
3.根据权利要求2所述芳基取代噁二嗪酮类化合物，其特征在于，所述R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、甲基环丙烷、正戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、甲基环丁基、正己基、异己基、叔己基、环己基、苯基或苄基。
4.根据权利要求1所述芳基取代噁二嗪酮类化合物，其特征在于，所述R2为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、取代或非取代苯基、取代或非取代苯氧基、取代或非取代苄基、取代或非取代吡啶基、取代或非取代4-四氢吡啶基；
所述取代是指至少1个位点被以下取代基取代：卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、甲基、乙基、丙基、丁基、甲氧基、乙氧基、苯基或甲硫基。
5.根据权利要求4所述芳基取代噁二嗪酮类化合物，其特征在于，所述R2为氢、氟、氯、溴、碘、苯基、苄基、苯氧基、苄氧基、硝基苯基、甲氧基苯基、乙氧基苯基、氨基苯基、羟基苯基、吡啶基、4-四氢吡啶基或N-叔丁基-4-四氢吡啶基。
6.权利要求1至5任一所述芳基取代噁二嗪酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.式1所示酰胺化合物在胺基上发生取代反应，制备式2化合物；
S2.式2化合物与三乙胺、甲基磺酰氯混合反应，制备式3化合物；
S3.式3化合物与式4化合物在碱性条件下，反应制备式5化合物；
S4.式5化合物与三光气混合反应，然后再加入吡啶，加热回流反应，制备式Ⅰ所示目标化合物。
7.根据权利要求6所述芳基取代噁二嗪酮类化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中的反应温度为-30～50℃；步骤S3中的反应温度为-50～50℃；
步骤S4中，式5化合物与三光气反应的温度为-30～50℃；步骤S4中的加热回流条件的温度为40～130℃。
8.权利要求1至5任一所述芳基取代噁二嗪酮类化合物、其异构体或其药学上可接受的盐在制备抑菌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述抑菌药物为抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物。
10.权利要求1至5任一所述芳基取代噁二嗪酮类化合物、其异构体或其药学上可接受的盐在制备细菌FabH酶抑制剂中的应用。
一种芳基取代噁二嗪酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 抗生素用于治疗各种病原微生物感染已有70多年的历史，并逐渐发展为包含β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和多肽类、多烯类等几个大类的药物家族。作为一种基础用药，抗生素是我国临床用药中最大的种类之一，与国民生活以及我国制药行业的稳定发展紧密相关。然而，值得警醒的是，我国也是滥用抗生素的重灾区，由于过度使用抗生素而引起的病原菌日益广泛的耐药性已成为我国乃至全球关注的严重医疗问题。其中，作为超级细菌之一的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，在国内临床治疗中的检出率达到40％～70％，并有逐年增加的趋势，对我国人民的生命健康构成极大威胁。因此，临床治疗中迫切需要能克服病原菌耐药性的下一代抗生素，而针对新机制和新靶点的抗菌药物研发已然成为克服细菌耐药性的关键途径。
[0003] 抗菌素耐药性问题正迫使我们对旧的抗生素进行更新，以便寻求新的靶标以应对新出现的威胁。随着分子生物学技术的发展，科学家确定了很多抗菌药物的靶点并开展了较为深入的研究。近年来，细菌脂肪酸生物合成途径所涉及的关键酶引起了科学家们的广泛关注。研究发现，脂肪酸的从头合成对细菌的生存与致病性至关重要。并且，高等动物和微生物的脂肪酸合成酶有着很大的差异：在真核细胞中，脂肪酸合成由多个亚基组成的I型合成酶(FASI)完成，而大多数细菌则是采用II型脂肪酸合成酶系统(FASII)每一步反应由独立的，具有单一功能的酶催化完成。这些发现说明：细菌脂肪酸合成(Fatty acid synthesis,FAS)途径上的关键酶是非常有潜力的新型抗菌药物靶点。其中β-酮脂酰-ACP合成酶(FabH)控制着细菌脂肪酸生物合成的起始步骤,普遍存在于病原体中且在人体中无其同源蛋白，成为新型抗菌药物靶标研究的热点。抑制与FASII通路相关FabH酶活性的小分子抑制剂作为一种应对诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等耐药菌的策略，正变得越来越有吸引；有望成为对细菌具选择性而对人体无毒的抗菌药。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种芳基取代噁二嗪酮类化合物。本发明所述化合物结构新颖，具有高效的抑菌作用，尤其是对于具有耐药性的菌株同样表现出良好的抑制作用，它的抑菌机理是通过共价结合细菌脂肪酸生物合成的FabH酶，通过抑制其催化活性影响脂肪酸合成；所述化合物对靶标具有高选择性，且具有成药性好的母核。
[0005] 本发明的另一目的在于提供所述芳基取代噁二嗪酮类化合物的制备方法。
[0006] 本发明的再一目的在于提供所述芳基取代噁二嗪酮类化合物的应用。
[0007] 本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
[0008] 一种芳基取代噁二嗪酮类化合物，所述化合物的结构如式Ⅰ所示：
[0009]
[0010] 其中R1为C1～6烷基、C1～6环烷基、苄基、取代苄基、苯乙基或取代苯乙基；
[0011] R2为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、取代或非取代C1～4烷基、取代或非取代C1～4烷氧基、取代或非取代C1～4环烷基、取代或非取代C1～4环烷氧基、取代或非取代苯基、取代或非取代苯氧基、取代或非取代苄基、取代或非取代五杂环基；
[0012] 所述取代是指至少1个位点被以下取代基取代：卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、C1～4烷基、C1～4卤代烷基、C1～4烷氧基、C1～4卤代烷氧基、苯基、苄基、苯氧基或甲硫基；
[0013] 所述杂环基为含氧、硫或氮原子的C5～6的芳基或环烷基。
[0014] 优选地，所述R1为C1～6直链烷基或支链烷基、C1～6环烷基、苯基、苄基或苯乙基。
[0015] 更优选地，所述R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、甲基环丙烷、正戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、甲基环丁基、正己基、异己基、叔己基、环己基、苯基或苄基。
[0016] 更优选地，所述R1为异丙基、异戊基、甲基环丙烷或甲基环丁基。
[0017] 优选地，所述R2为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、取代或非取代苯基、取代或非取代苯氧基、取代或非取代苄基、取代或非取代吡啶基、取代或非取代4-四氢吡啶基；
[0018] 所述取代是指至少1个位点被以下取代基取代：卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、甲基、乙基、丙基、丁基、甲氧基、乙氧基、苯基或甲硫基。
[0019] 更优选地，所述R2为氢、氟、氯、溴、碘、苯基、苄基、苯氧基、苄氧基、硝基苯基、甲氧基苯基、乙氧基苯基、胺基苯基、羟基苯基、吡啶基、4-四氢吡啶基或N-叔丁基-4-四氢吡啶基。
[0020] 更优选地，所述R2为氢、氟、氯、溴、碘、羟基、甲氧基、乙氧基、2-甲氧基苯基、2-硝基苯基、2-胺基苯基、3-吡啶基或N-叔丁基-4-四氢吡啶基。
[0021] 更优选地，所述芳基取代噁二嗪酮类化合物如以下结构式之一所示：
[0022]
[0023] 本发明同时还保护所述芳基取代噁二嗪酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0024]
[0025] S1.式1所示酰胺化合物在胺基上发生取代反应，制备式2化合物；
[0026] S2.式2化合物与三乙胺、甲基磺酰氯混合反应，制备式3化合物；
[0027] S3.式3化合物与式4化合物在碱性条件下，反应制备式5化合物；
[0028] S4.式5化合物与三光气混合反应，然后再加入吡啶，加热回流反应，制备式Ⅰ所示目标化合物。
[0029] 优选地，步骤S2中的反应温度为-30～50℃；步骤S3中的反应温度为-50～50℃；
[0030] 步骤S4中，式5化合物与三光气反应的温度为-30～50℃；步骤S4中的加热回流条件的温度为40～130℃。
[0031] 更优选地，步骤S2中的反应温度为-30～0℃；步骤S3中的反应温度为-50～0℃；
[0032] 步骤S4中，式5化合物与三光气反应的温度为-10～0℃；步骤S4中的加热回流条件的温度为60～80℃。
[0033] 更优选地，步骤S2中的反应温度为-10～0℃；步骤S3中的反应温度为-30～-10℃。
[0035] 更优选地，步骤S1中加热的温度为60℃。
[0037] 优选地，步骤S1所述后处理过程为：待反应结束后，浓缩去除溶剂，然后用二氯甲烷和水萃取，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后经柱层析分离，即可得到式2化合物。
[0038] 更优选地，所述柱层析分离过程的流动相为体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇。
[0039] 优选地，步骤S2的后处理过程为：待反应结束后，去除溶剂，经柱层析分离，即可得到式3化合物；更优选地，所述柱层析分离过程的流动相为体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇。
[0040] 优选地，步骤S2所述反应的溶剂为无水THF。
[0041] 优选地，步骤S3所述反应的溶剂为二氯甲烷；所述碱性条件为加入碳酸钾。
[0042] 优选地，步骤S3的后处理过程为：待反应结束后，去除溶剂，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，然后经柱层析分离，即可得到式4化合物；更优选地，所述柱层析分离过程的流动相为体积比为30:1的二氯甲烷和甲醇。
[0043] 优选地，步骤S4所述反应的溶剂为无水THF。
[0044] 优选地，步骤S4的后处理过程为：待反应结束后，冷却至室温，然后过滤，去除溶剂后，经柱层析分离，即可得到式4化合物。
[0045] 所述芳基取代噁二嗪酮类化合物、其异构体或其药学上可接受的盐在制备抑菌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0046] 优选地，所述抑菌药物为抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物。
[0047] 本发明还保护所述芳基取代噁二嗪酮类化合物、其异构体或其药学上可接受的盐在制备细菌FabH酶抑制剂中的应用。
[0048] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0049] 本发明所述化合物结构新颖，且具有成药性好的母核，能共价结合细菌脂肪酸生物合成的FabH酶，抑制作用强，选择性好，能够很好地抑制金黄色葡萄球菌等细菌，甚至对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等耐药菌也同样表现出很好的抑制作用，可制备成为对细菌具选择性而对人体无毒的抗菌药进行运用。
[0051] 图1为实施例1化合物的氢谱图。
[0052] 图2为实施例1化合物的碳谱图。
[0053] 图3为实施例9化合物的氢谱图。
[0054] 图4为实施例9化合物的碳谱图。
[0055] 图5为实施例10化合物的氢谱图。
[0056] 图6为实施例10化合物的碳谱图。
[0057] 图7为实施例14化合物的氢谱图。
[0058] 图8为实施例14化合物的碳谱图。
[0059] 图9为实施例15化合物的氢谱图。
[0060] 图10为实施例15化合物的碳谱图。
[0061] 图11为化合物Oxa1抑制FabH的IC50曲线图。
[0062] 图12为化合物Oxa4抑制FabH的IC50曲线图。
[0063] 图13为化合物Oxa1与FabH共孵育的MALDI-TOF质谱分析。
[0064] 图14为化合物Oxa1与FabH共孵育蛋白降解肽段LC-MS表征。
[0065] 图15为化合物Oxa1与FabH C112A突变体共孵育的MALDI-TOF质谱分析。
具体实施方式
[0066] 下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0067] 实施例1
[0068] 6-(4-氯苯基)-3-(环丙基甲基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa1)的结构如下所示：
[0069]
[0070] 具体制备过程为：
[0071] 步骤1：制备4-氯-N-(羟甲基)苯甲酰胺
[0072]
[0073] 将对氯苯甲酰胺(1.00g，6.42mmol，1.00eq)溶解于乙醇水溶液(乙醇：水＝20mL：10mL，V/V)中，加入37％甲醛水溶液(0.7mL，9.63mmol，1.50eq)和碳酸钾(0.89g，6.42mmol，
1.00eq)，60℃搅拌过夜。停止加热搅拌，将乙醇浓缩旋干，用二氯甲烷和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:
1，V/V)得到白色固体1.12g，产率为95％。
1.00eq)，60℃搅拌过夜。停止加热搅拌，将乙醇浓缩旋干，用二氯甲烷和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:
1，V/V)得到白色固体1.12g，产率为95％。
[0074] 步骤2：制备(4-氯苯甲酰胺基)甲磺酸甲酯
[0075]
[0076] 将4-氯-N-(羟甲基)苯甲酰胺(1.12g，6.10mmol，1.00eq)溶解于无水THF(10mL)中，冰浴下缓慢加入三乙胺(1.70mL，12.2mmol，2.00eq)和甲基磺酰氯(0.7mL，9.15mmol，1.50eq)。反应30分钟，旋干溶剂后柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1，V/V)得到粘稠液体
1.20g，产率为85％。
1.20g，产率为85％。
[0077] 步骤3：4-氯-N-(((环丙基甲基)氨基)甲基)苯甲酰胺
[0078]
[0079] 将环丙基甲胺(0.65g，9.18mmol，2.00eq)溶解于二氯甲烷，加入碳酸钾0.95g，6.88mmol，1.50eq)，-30℃搅拌下，缓慢加入(4-氯苯甲酰胺基)甲磺酸甲酯(1.20g，
4.59mmol，1.00eq)，继续搅拌30分钟。旋干溶剂，用二氯甲烷和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析(二氯甲烷:甲醇＝30:1，V/V)得到白色固体0.22g，产率80％。
4.59mmol，1.00eq)，继续搅拌30分钟。旋干溶剂，用二氯甲烷和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析(二氯甲烷:甲醇＝30:1，V/V)得到白色固体0.22g，产率80％。
[0080] 步骤4：制备6-(4-氯苯基)-3-(环丙基甲基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮[0081]
[0082] 将4-氯-N-(((环丙基甲基)氨基)甲基)苯甲酰胺(0.22g，0.93mmol，1.00eq)溶于THF(5mL)中，在冰浴中，三光气(0.11g，0.37mmol，0.40eq)与THF(5mL)溶解，缓慢滴入反应溶液中，室温搅拌。2小时后，冰浴下将吡啶(0.15mL，1.86mmol，2.00eq)滴入反应溶液中，70℃回流3小时，冷却至室温后过滤。溶剂旋干后柱层析得到白色固体产物0.18g，产率为84％。
[0083] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝7.7Hz,2H),7.41(d,J＝7.7Hz,2H),5.05(s,2H),3.32(d,J＝7.1Hz,2H),1.20–0.93(m,1H),0.61(d,J＝8.0Hz,2H),0.31(d,J＝4.8Hz,
2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ152.57,147.85,138.33,128.99,128.76,128.31,62.78,
50.74,8.58,3.59.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H13N2O2Cl[M+Na]+,287.0558；found
287.0568.
2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ152.57,147.85,138.33,128.99,128.76,128.31,62.78,
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287.0568.
[0084] 实施例2
[0085] 3-苄基-6-(4-氯苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa2)的结构如下所示：
[0086]
[0087] 具体制备过程为：将环丙基甲胺换成苄胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1中的步骤。得到白色固体，产率为88％。
[0088] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝7.6Hz,2H),7.40(d,J＝7.7Hz,2H),7.38–7.31(m,5H),4.86(s,2H),4.62(s,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ152.39,148.14,138.43,134.72,129.04,129.00,128.79,128.33,128.22,62.32,49.63.HRMS(ESI)m/z calculated for C16H13N2O2Cl[M+Na]+,323.0558；found 323.0547.
[0089] 实施例3
[0090] 6-(4-氟苯基)-3-(环丙基甲基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa3)的结构如下所示：
[0091]
[0092] 具体制备过程为：将对氯苯甲酰胺换成对氟苯甲酰胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1中的步骤。得到白色固体，产率为93％。
[0093] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.13–7.93(m,2H),7.11(t,J＝8.2Hz,2H),5.05(s,2H),3.32(d,J＝7.1Hz,2H),1.14–0.97(m,1H),0.61(d,J＝7.4Hz,2H),0.31(d,J＝4.7Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ166.17,164.16,150.26,130.01,126.00,115.62,62.75,50.75,
8.61,3.60.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H13N2O2F[M+Na]+,271.0853；found
271.0860.
8.61,3.60.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H13N2O2F[M+Na]+,271.0853；found
271.0860.
[0094] 实施例4
[0095] 3-丁基-6-(4-氯苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa4)的结构如下所示：
[0096]
[0097] 具体制备过程为：将环丙基甲胺换成正丁基胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1中的步骤。得到白色固体，产率为90％。
[0098] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95(d,J＝7.5Hz,2H),7.41(d,J＝7.5Hz,2H),4.94(s,2H),3.40(t,J＝7.4Hz,2H),1.69–1.59(m,2H),1.39(dd,J＝14.9,7.3Hz,2H),0.97(t,J＝
7.3Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ151.79,146.73,137.36,128.00,127.76,127.26,
61.90,45.09,27.77,18.92,12.71.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H15N2O2Cl[M+Na]+,
289.0714；found 289.0697.
7.3Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ151.79,146.73,137.36,128.00,127.76,127.26,
61.90,45.09,27.77,18.92,12.71.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H15N2O2Cl[M+Na]+,
289.0714；found 289.0697.
[0099] 实施例5
[0100] 6-(4-氯苯基)-3-异丙基-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa5)的结构如下所示：
[0101]
[0102] 具体制备过程为：将环丙基甲胺换成异丙基胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1中的步骤。得到白色固体，产率为91％。
[0103] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95(d,J＝8.3Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),4.89(s,2H),4.57–4.31(m,1H),1.29(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ152.98,147.44,
138.35,129.01,128.77,128.28,57.41,46.86,19.01.HRMS(ESI)m/z calculated for C12H13N2O2Cl[M+Na]+,275.0558；found 275.0583.
138.35,129.01,128.77,128.28,57.41,46.86,19.01.HRMS(ESI)m/z calculated for C12H13N2O2Cl[M+Na]+,275.0558；found 275.0583.
[0104] 实施例6
[0105] 6-(4-氯苯基)-3-(环丁基甲基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa6)的结构如下所示：
[0106]
[0107] 具体制备过程为：将环丙基甲胺换成环丁基甲胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1中的步骤。得到白色固体，产率为89％。
[0108] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝8.7Hz,2H),7.40(d,J＝8.7Hz,2H),4.91(s,2H),3.45(d,J＝7.5Hz,2H),2.78–2.61(m,1H),2.21–2.04(m,2H),1.99–1.88(m,2H),1.86–
1.73(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ152.76,147.98,138.35,129.01,128.76,128.28,
63.18,51.48,33.43,26.45,18.45.HRMS(ESI)m/z calculated for C14H15N2O2Cl[M+Na]+,
301.0714；found 301.0721.
1.73(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ152.76,147.98,138.35,129.01,128.76,128.28,
63.18,51.48,33.43,26.45,18.45.HRMS(ESI)m/z calculated for C14H15N2O2Cl[M+Na]+,
301.0714；found 301.0721.
[0109] 实施例7
[0110] 6-(4-溴苯基)-3-(环丙基甲基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa7)的结构如下所示：
[0111]
[0112] 具体制备过程为：将对氯苯甲酰胺换成对溴苯甲酰胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1中的步骤。得到白色固体，产率为87％。
[0113] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.29–7.67(m,2H),7.67–7.39(m,2H),5.04(s,2H),3.32(d,J＝7.2Hz,2H),1.08(m,1H),0.75–0.49(m,1H),0.31(q,J＝4.9Hz,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ152.69,147.83,131.79,129.17,128.78,126.90,62.80,50.76,8.58,3.60.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H13N2O2Br[M+Na]+,331.0053；found331.0057.
[0114] 实施例8
[0115] 6-(4-氯苯基)-3-异戊基-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa8)的结构如下所示：
[0116]
[0117] 具体制备过程为：将环丙基甲胺换成异戊基胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1中的步骤。得到白色固体，产率为89％。
[0118] 1H NMR(400MHz,Acetone)δ8.09–7.88(m,2H),7.65–7.33(m,2H),5.04(s,2H),3.63–3.29(m,2H),1.65(tt,J＝15.2,7.7Hz,1H),1.56(dd,J＝14.8,7.2Hz,2H),0.95(d,J＝6.5Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ152.81,147.66,138.37,129.02,128.76,128.30,
62.79,44.74,35.40,25.87,22.41.HRMS(ESI)m/z calculated for C14H17N2O2Cl[M+Na]+,
303.0871；found 303.0870.
62.79,44.74,35.40,25.87,22.41.HRMS(ESI)m/z calculated for C14H17N2O2Cl[M+Na]+,
303.0871；found 303.0870.
[0119] 实施例9
[0120] 3-(环丙基甲基)-6-(4-(N-BOC-1,2,5,6-四氢吡啶)苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa9)的结构如下所示：
[0121]
[0122] 具体制备过程为：将6-(4-溴苯基)-3-(环丙基甲基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(100mg，0.32mmol，1.00eq)，N-BOC-1,2,5,6-四氢吡啶-4-硼酸频哪醇酯(117mg，0.38mmol，1.20eq)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯络合物(26mg，0.03mmol，
0.10eq)，碳酸钠(102mg，0.96mmol，3.00eq)置于干燥烧瓶。将烧瓶抽真空并用N2换气三次。
加入无水1,4-二氧六环(3mL)。加热至110℃回流搅拌18小时。冷却至室温后，反应物用EtOAc稀释并通过SiO2过滤。滤液旋干，用EtOAc和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析得到白色固体105mg,产率80％。
0.10eq)，碳酸钠(102mg，0.96mmol，3.00eq)置于干燥烧瓶。将烧瓶抽真空并用N2换气三次。
加入无水1,4-二氧六环(3mL)。加热至110℃回流搅拌18小时。冷却至室温后，反应物用EtOAc稀释并通过SiO2过滤。滤液旋干，用EtOAc和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析得到白色固体105mg,产率80％。
[0123] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.99(d,J＝8.5Hz,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),6.18(s,1H),5.07(s,2H),4.12(s,2H),3.66(t,J＝5.4Hz,2H),3.33(d,J＝7.1Hz,2H),2.56(s,2H),
1.51(s,9H),1.23–0.97(m,1H),0.62(q,J＝5.4Hz,2H),0.44–0.18(q,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.78,153.25,148.16,144.10,128.47,127.80,124.83,79.78,62.80,50.72,
28.48,27.20,8.61,3.57.HRMS(ESI)m/z calculated for C23H29N3O4Cl[M+Na]+,434.2050；
found 434.2059.
1.51(s,9H),1.23–0.97(m,1H),0.62(q,J＝5.4Hz,2H),0.44–0.18(q,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.78,153.25,148.16,144.10,128.47,127.80,124.83,79.78,62.80,50.72,
28.48,27.20,8.61,3.57.HRMS(ESI)m/z calculated for C23H29N3O4Cl[M+Na]+,434.2050；
found 434.2059.
[0124] 实施例10
[0125] 3-(环丙基甲基)-6-(4-(吡啶-3-基)苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa10)的结构如下所示：
[0126]
[0127] 步骤1：制备3-(环丙基甲基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮
[0128] 具体制备过程为：将6-(4-溴苯基)-3-(环丙基甲基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(1.40g，4.50mmol，1.00eq)，联硼酸频那醇酯(1.70g，6.70mmol，1.50eq)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯络合物(329mg，0.45mmol，0.10eq)，碳酸钾(1.3g，13.50mmol，3.00eq)置于干燥烧瓶。将烧瓶抽真空并用N2换气三次。加入无水DMF(18mL)。加热至80℃搅拌过夜。冷却至室温后，反应物用EtOAc稀释并通过SiO2过滤。滤液旋干，用EtOAc和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析得到白色固体1.4g,产率87％。
[0129] 步骤2：制备3-(环丙基甲基)-6-(4-(吡啶-3-基)苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮
[0130] 具体制备过程为：将3-(环丙基甲基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(50mg，0.14mmol，1.00eq)，3-碘吡啶(43mg，
0.21mmol，1.50eq)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯络合物(10mg，0.014mmol，
0.10eq)，碳酸钾(41mg，0.42mmol，3.00eq)置于干燥烧瓶。将烧瓶抽真空并用N2换气三次。
加入无水DMF(1mL)。加热至80℃搅拌过夜。冷却至室温后，反应物用EtOAc稀释并通过SiO2过滤。滤液旋干，用EtOAc和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析得到白色固体39mg,产率为93％。
0.21mmol，1.50eq)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯络合物(10mg，0.014mmol，
0.10eq)，碳酸钾(41mg，0.42mmol，3.00eq)置于干燥烧瓶。将烧瓶抽真空并用N2换气三次。
加入无水DMF(1mL)。加热至80℃搅拌过夜。冷却至室温后，反应物用EtOAc稀释并通过SiO2过滤。滤液旋干，用EtOAc和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析得到白色固体39mg,产率为93％。
[0131] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.89(s,1H),8.64(d,J＝4.6Hz,1H),8.13(d,J＝7.7Hz,2H),7.92(d,J＝7.3Hz,1H),7.66(d,J＝7.6Hz,2H),7.42–7.38(m,1H),5.09(s,2H),3.34(d,J＝7.1Hz,2H),1.16–1.03(m,1H),0.62(d,J＝7.6Hz,2H),0.33(d,J＝4.7Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ153.04,149.16,148.29,148.04,141.30,135.55,134.45,129.54,
128.42,127.13,123.66,62.87,50.77,8.62,3.61.HRMS(ESI)m/z calculated for C18H17N3O2[M+H]+,308.1394,found 308.1395.
128.42,127.13,123.66,62.87,50.77,8.62,3.61.HRMS(ESI)m/z calculated for C18H17N3O2[M+H]+,308.1394,found 308.1395.
[0132] 实施例11
[0133] 3-(环丙基甲基)-6-(2'-硝基-[1,1'-联苯]-4-基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa11)的结构如下所示：
[0134]
[0135] 具体制备过程为：将3-碘吡啶换成2-碘硝基苯，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例10中的步骤2。得到黄色固体，产率为85％。
[0136] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.08(d,J＝7.9Hz,2H),7.92(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.4Hz,1H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.45(d,J＝7.5Hz,1H),7.39(d,J＝7.9Hz,2H),5.08(s,2H),3.33(d,J＝7.0Hz,2H),1.15–1.03(m,1H),0.61(d,J＝7.3Hz,2H),0.32(d,J＝4.3Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ152.98,148.96,148.04,141.25,135.58,132.58,
131.83,129.67,128.79,128.08,127.99,124.38,62.85,50.75,8.62,3.60.HRMS(ESI)m/z calculated for C19H17N3O4[M+Na]+,374.1111,found 374.1105.
131.83,129.67,128.79,128.08,127.99,124.38,62.85,50.75,8.62,3.60.HRMS(ESI)m/z calculated for C19H17N3O4[M+Na]+,374.1111,found 374.1105.
[0137] 实施例12
[0138] 3-(环丙基甲基)-6-(2'-甲氧基-[1,1'-联苯]-4-基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa12)的结构如下所示：
[0139]
[0140] 具体制备过程为：将3-碘吡啶换成2-碘苯甲醚，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例10中的步骤2。得到白色固体，产率为92％。
[0141] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.05(d,J＝7.8Hz,2H),7.61(d,J＝7.8Hz,2H),7.34(d,J＝7.9Hz,2H),7.04(t,J＝7.4Hz,1H),7.00(d,J＝8.1Hz,1H),5.07(s,2H),3.82(s,3H),3.33(d,J＝7.0Hz,2H),1.17–1.02(m,1H),0.61(d,J＝7.4Hz,2H),0.32(d,J＝4.4Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ156.49,153.49,148.29,142.46,130.76,129.61,129.32,
128.17,127.34,120.95,111.36,62.84,55.59,50.74,8.65,3.60.HRMS(ESI)m/z +
calculated for C20H20N2O3[M+Na] ,359.1366,found 359.1365.
128.17,127.34,120.95,111.36,62.84,55.59,50.74,8.65,3.60.HRMS(ESI)m/z +
calculated for C20H20N2O3[M+Na] ,359.1366,found 359.1365.
[0142] 实施例13
[0143] 3-(环丙基甲基)-6-(2'-氨基-[1,1'-联苯]-4-基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa13)的结构如下所示：
[0144]
[0145] 具体制备过程为：将3-碘吡啶换成2-碘苯胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例10中的步骤2。
[0146] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09(d,J＝7.6Hz,2H),7.55(d,J＝7.6Hz,2H),7.18(t,J＝7.6Hz,1H),7.14(d,J＝7.5Hz,1H),6.84(t,J＝7.4Hz,1H),6.78(d,J＝8.0Hz,1H),5.08(s,2H),3.77(s,2H),3.34(d,J＝7.0Hz,2H),1.16–1.03(m,1H),0.62(d,J＝7.4Hz,2H),13
0.33(d,J＝4.5Hz,2H). C NMR(126MHz,CDCl3)δ153.26,148.13,143.51,143.43,130.31,
129.13,129.08,128.54,128.15,126.37,118.78,115.84,62.83,50.75,8.63,3.60.HRMS(ESI)m/z calculated for C19H19N3O2[M+Na]+344.1369,found344.1354.
0.33(d,J＝4.5Hz,2H). C NMR(126MHz,CDCl3)δ153.26,148.13,143.51,143.43,130.31,
129.13,129.08,128.54,128.15,126.37,118.78,115.84,62.83,50.75,8.63,3.60.HRMS(ESI)m/z calculated for C19H19N3O2[M+Na]+344.1369,found344.1354.
[0147] 实施例14
[0148] 3-(环丙基甲基)-6-(4-羟基苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa14)的结构如下所示：
[0149]
[0150] 具体制备过程为：将3-(环丙基甲基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(500mg，1.37mmol，1.00eq)，过硼酸钠四水合物(630mg，4.09mmol，3.00eq)溶解于THF(5.0mL)/H2O(5.0mL)中，在室温下反应1小时后，反应液用饱和NH4Cl溶液稀释，用EtOAc萃取两次，将合并的有机相用饱和NaHCO3溶液，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析得到白色固体286mg，产率为85％。
[0151] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝7.8Hz,2H),7.09(s,1H),6.89(d,J＝7.9Hz,2H),5.03(s,2H),3.32(d,J＝6.6Hz,2H),1.07(s,1H),0.60(d,J＝6.7Hz,2H),0.31(d,J＝
3.7Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ159.85,153.30,148.87,129.73,121.55,115.56,
62.62,50.79,8.62,3.61.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H14N2O3[M+Na]+269.0897,found 269.0909.
3.7Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ159.85,153.30,148.87,129.73,121.55,115.56,
62.62,50.79,8.62,3.61.HRMS(ESI)m/z calculated for C13H14N2O3[M+Na]+269.0897,found 269.0909.
[0152] 实施例15
[0153] 3-(环丙基甲基)-6-(4-甲氧基苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa15)的结构如下所示：
[0154]
[0155] 具体制备过程为：将3-(环丙基甲基)-6-(4-羟基苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(30mg，0.12mmol，1.00eq)，碘甲烷(52mg，0.36mmol，3.00eq)，碳酸钾(66mg，0.48mmol，4.00eq)，将烧瓶抽真空并用N2换气三次。加入无水DMF(1mL)。室温搅拌0.5小时，反应液用EtOAc稀释并通过SiO2过滤。滤液旋干，用EtOAc和水萃取三次后，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后柱层析得到白色固体25mg，产率为80％。
[0156] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝9.0Hz,2H),6.92(d,J＝9.0Hz,2H),5.02(s,2H),3.85(s,3H),3.31(d,J＝7.1Hz,2H),1.20–0.89(m,1H),0.76–0.37(m,2H),0.38–0.23(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.66,153.23,148.37,129.47,122.15,113.79,62.71,
55.42,50.69,8.65,3.57.HRMS(ESI)m/z calculated for C14H16N2O3[M+Na]+,283.1053,found 283.1057.
55.42,50.69,8.65,3.57.HRMS(ESI)m/z calculated for C14H16N2O3[M+Na]+,283.1053,found 283.1057.
[0157] 实施例16
[0158] 3-(环丙基甲基)-6-(4-乙氧基苯基)-3,4-二氢-2H-1,3,5-恶二嗪-2-酮(Oxa16)的结构如下所示：
[0159]
[0160] 具体制备过程为：将碘甲烷换成碘乙烷，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例15中的步骤。得到白色固体，产率为94％。
[0161] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95(d,J＝7.7Hz,2H),6.91(d,J＝7.8Hz,2H),5.02(s,2H),4.08(q,J＝6.8Hz,2H),3.31(d,J＝7.0Hz,2H),1.43(t,J＝6.8Hz,3H),1.14–0.94(m,
1H),0.59(d,J＝7.0Hz,2H),0.31(d,J＝3.5Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.08,
153.28,148.39,129.45,121.94,114.23,63.66,62.71,50.68,14.70,8.66,3.57.HRMS(ESI)m/z calculated for C15H18N2O3[M+Na]+,297.1210,found 297.1201.
1H),0.59(d,J＝7.0Hz,2H),0.31(d,J＝3.5Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.08,
153.28,148.39,129.45,121.94,114.23,63.66,62.71,50.68,14.70,8.66,3.57.HRMS(ESI)m/z calculated for C15H18N2O3[M+Na]+,297.1210,found 297.1201.
[0162] 实施例17生物活性部分
[0163] 一、测定化合物对靶标FabH的抑制作用。
[0164] 1、实验方法
[0165] 通过酶对底物催化活力测试的方法测定化合物抑制作用。测试酶FabH从大肠杆菌中表达并纯化出来；底物Malonyl-ACP是由holoACP与manonyl-CoA经FabD催化得到；
[0166] 实验方法如下：
[0167] 1.1N端带有His6标记的金黄色葡萄球菌FabH是从大肠杆菌中表达并纯化出来，具体方法如下：
[0168] 采用Phusion high-fidelity PCR从金黄色葡萄球菌ATCC29213中扩增得到FabH(SAOUHSC_00920，GenBankTM检索号3920807)，用于表达N端6xHis标记的FabH。采用菌落PCR法获得金黄色葡萄球菌FabH DNA：从LB琼脂平板上挑取单克隆，加入20μL 0.2％SDS裂解液后涡旋10s，98℃煮10min后离心，收集上清，构建NheI/HindIII(FabH)-pET28b(+)重组质粒(正向引物:5’-AAAAAAGCTAGCATGAACGTGGGTATTAAAGGTT-3’反向引物:5'-AAAAAAAAGCTTCTATTTTCCCCATTTTATTGTCA-3')。PCR程序为：(1)预变性：95℃，3min；(2)变性：94℃，30s；(3)退火：58.7℃,30s；(4)引物延伸：72℃，2min。步骤(2)至(4)循环30次；(5)延伸：72℃，5min。PCR产物通过NheI/HindIII酶切后使用T4DNA连接酶连接得到重组质粒pET28b(+)-S.a FabH，将质粒导入DH5α中挑取阳性单克隆测序，提取质粒并纯化。将pET28b(+)-S.a FabH重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基
37℃过夜培养，将过夜培养的菌液倒入1L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD600＝0.8，加入IPT G终浓度为1.0mM，37℃诱导3h，15000rpm离心30min，弃上清，用Buffer A(20mM Tris-HCl,pH 8.0、500mM NaCl)重悬菌沉淀，加入蛋白酶抑制剂、DnaseI，然后通过细胞超声破碎仪超声15min(幅度50％，2s开，2s关)。细胞裂解液以15000rpm、4℃离心
30min。用Binding Buffer(Buffer A，10mM咪唑)预平衡1mL镍柱，将上清液用0.45μm滤膜过滤后上样。用5mL Wash Buffer(Buffer A，30mM咪唑，1mM DTT)洗涤，最后蛋白用3mL Elution Buffer(Buffer A，200mM咪唑，1mM DTT)洗脱。通过SDS-PAGE分析蛋白纯度，将纯化后的S.a FabH进行浓缩，并置换到含有20mM Tris-HCl，pH8.0、100mM NaCl、1mM TCEP、
15％(v/v)甘油的缓冲液中，用液氮速冻后，-80℃储存。
37℃过夜培养，将过夜培养的菌液倒入1L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD600＝0.8，加入IPT G终浓度为1.0mM，37℃诱导3h，15000rpm离心30min，弃上清，用Buffer A(20mM Tris-HCl,pH 8.0、500mM NaCl)重悬菌沉淀，加入蛋白酶抑制剂、DnaseI，然后通过细胞超声破碎仪超声15min(幅度50％，2s开，2s关)。细胞裂解液以15000rpm、4℃离心
30min。用Binding Buffer(Buffer A，10mM咪唑)预平衡1mL镍柱，将上清液用0.45μm滤膜过滤后上样。用5mL Wash Buffer(Buffer A，30mM咪唑，1mM DTT)洗涤，最后蛋白用3mL Elution Buffer(Buffer A，200mM咪唑，1mM DTT)洗脱。通过SDS-PAGE分析蛋白纯度，将纯化后的S.a FabH进行浓缩，并置换到含有20mM Tris-HCl，pH8.0、100mM NaCl、1mM TCEP、
15％(v/v)甘油的缓冲液中，用液氮速冻后，-80℃储存。
[0169] 1.2FabD的表达与纯化：采用Phusion high-fidelity PCR从BL21-pLySs中扩增得到FabD(NC_000913.3，GenBankTM检索号945766)，用于表达N端His6标记的FabD。20uL BL21-pLySs，用ddH2O洗涤两次，加入25mM NaOH、0.2mM EDTA混合液,98℃煮1h，于冰盒上冷却，加入70uL 40mM Tris-HCl离心，收集上清于-20℃保存。构建NdeI/BamHI(FabD)-pET28b(+)重组质粒，设计正向引物:5'-AAAAAACATATGATGACGCAATTTGCATTTGTG-3’(NdeⅠ)反向引物:5'-AAAAAAGGATCCTTAAAGCTCGAGCGCCGC-3'(BamHⅠ)。PCR程序为：(1)预变性：95℃，3min；(2)变性：94℃，30s；(3)退火：54.3℃,30s；(4)引物延伸：72℃，2min,步骤(2)至(4)循环30次；(5)延伸：72℃，5min。PCR产物通过NdeI/BamHI酶切后使T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pET28b(+)–FabD，将质粒导入DH5α中挑取阳性单克隆测序，提取质粒并纯化。
[0170] 将pET28b(+)-FabD重组质粒导入大肠杆菌BL21-pLySs，挑取单克隆于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基37℃过夜培养，将过夜培养的菌液倒入1L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD600＝0.8，加入IPT G终浓度为1.0mM，37℃诱导4h，15000rpm离心30min，弃上清，用Buffer A(50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl)重悬菌沉淀，加入蛋白酶抑制剂、DnaseI，然后通过细胞超声破碎仪超声15min(幅度50％，2s开，2s关)。细胞裂解液以15000rpm、4℃离心30min。用Binding Buffer(Buffer A，10mM咪唑)对
1mL镍柱预平衡，将上清液用0.45μm滤膜过滤后上样。用5mL Wash Buffer(Buffer A，30mM咪唑，1mM DTT)洗涤，最后蛋白用3mL Elution Buffer(Buffer A，60mM咪唑，1mM DTT)洗脱。通过SDS-PAGE分析蛋白纯度，将纯化后的FabD进行浓缩，并置换到含有20mM HEPES，pH
7.0、100mM NaCl、0.5mM TCEP、50％(v/v)甘油的缓冲液中，用液氮速冻后，-80℃储存。
1mL镍柱预平衡，将上清液用0.45μm滤膜过滤后上样。用5mL Wash Buffer(Buffer A，30mM咪唑，1mM DTT)洗涤，最后蛋白用3mL Elution Buffer(Buffer A，60mM咪唑，1mM DTT)洗脱。通过SDS-PAGE分析蛋白纯度，将纯化后的FabD进行浓缩，并置换到含有20mM HEPES，pH
7.0、100mM NaCl、0.5mM TCEP、50％(v/v)甘油的缓冲液中，用液氮速冻后，-80℃储存。
[0171] 1.3Holo-ACP的表达与纯化：采用Phusion high-fidelity PCR从BL21-pLySs中扩增得到ACP(NC_000913.3,Gene ID:944805)、ACPs(NC_000913.3,Gene ID:947037)，用于表达N端His6标记的holo-ACP。20uL BL21-pLySs，用ddH2O洗涤两次，加入25mM NaOH、0.2mM EDTA混合液，98℃煮1h，于冰盒上冷却，加入70uL 40mM Tris-HCl离心，收集上清于-20℃保存。构建ACP-ACPs-pETDuet-1重组质粒，分别设计ACP正向引物:5’-AAAAAAGGATCCATGAGCACTATCGAAGAACG(BamHI)反向引物:5’-AAAAAAGAATTCTTACGCCTGGTGGCCGTT(EcoRI)；ACPs正向引物:5’-AAAAAACATATGGCAATATTAGGTTTAGGCA(NdeI)反向引物:5’-AAAAAACTCGAGTTAACTTTCAATAA TTACCGTGG(XhoI)。PCR程序均为：(1)预变性：95℃，3min；
(2)变性：94℃，30s；(3)退火：58.5℃，30s；(4)引物延伸：72℃，2min，步骤(2)至(4)循环30次；(5)延伸：72℃，5min。PCR产物依次通过相应酶切后用T4DNA连接酶连接得到重组质粒ACP-ACPs-pETDuet-1，将质粒导入DH5α中挑取阳性单克隆测序，提取质粒并纯化。将ACP-ACPs-pETDuet-1重组质粒导入大肠杆菌BL21-pLySs，挑取单克隆于5mL含有75μg/mL氨苄西林的LB液体培养基37℃过夜培养，将过夜培养的菌液倒入1L含有75μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养至OD600＝0.5，加入IPT G终浓度为0.5mM，37℃诱导4h，15000rpm离心
30min，弃上清，用BufferA(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl)重悬菌沉淀，加入蛋白酶抑制剂、DnaseI，然后通过细胞超声破碎仪超声15min(幅度50％，5s开，5s关)。细胞裂解液
15000rpm、4℃离心30min。将上清液用0.45μm滤膜过滤后上样于1mL镍柱，准备Buffer A：
20mM Tris-HCl，pH＝8.0、500mM NaCl、1mM DTT；Buffer B：20mM Tris-HCl，pH＝8.0、500mM NaCl、1mM DTT、500mM咪唑。设置蛋白纯化仪流速为0.5mL/min，用10倍柱体积、2％Buffer B、98％Buffer A洗涤，然后用2％-22％Buffer B以10倍柱体积进行梯度洗脱，最后用22％Buffer B以5倍柱体积等度洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE确定蛋白纯度，将收集到的目的蛋白先用20mM Tris-HCL(pH 8.0)稀释20倍，配制Buffer A:20mM HEPES、1mM DTT、pH7.0；
Buffer B：1M KCl、1mM DTT、20mM HEPES，pH7.0，使用5mL离子交换柱Hip Trap FF分离holo-ACP-ACPs二聚体，纯化步骤如下：依次用MilliQ H2O、100％Buffer B(1M KCl)、2％Buffer B冲洗Hip Trap FF柱子，上样，然后用200mM KCl-600mM KCl，15CV梯度洗脱，再以
100％Buffer B(1M KCl)，5CV等度洗脱，最后依次用5-10CV，100％Buffer A、5-10CV，MilliQ H2O、5-10CV，20％乙醇冲洗柱子。将纯化后的holo-ACP进行浓缩，并置换到含有
20mM HEPES(pH 7.0)、100mM NaCl的缓冲液中，将浓缩后的holo-ACP通过MALDI-TOF-MS进行分子量检测，然后测定holo-ACP中巯基含量以确定holo-ACP浓度，方法如下：分别设置实验组和对照组，实验组为50uL holo-ACP+950uL 200uM DTNB，空白组为50uL(20mM HEPES+
100mM NaCl)+950uL 200uM DTNB，室温下反应30min，在412nm处测定吸光度A。-SH浓度测定：-SH(uM)＝73.53*(Asample-A空白)*稀释倍数，holo-ACP测定完浓度后再加入TCEP终浓度为1mM，分装后于-80℃保存。
(2)变性：94℃，30s；(3)退火：58.5℃，30s；(4)引物延伸：72℃，2min，步骤(2)至(4)循环30次；(5)延伸：72℃，5min。PCR产物依次通过相应酶切后用T4DNA连接酶连接得到重组质粒ACP-ACPs-pETDuet-1，将质粒导入DH5α中挑取阳性单克隆测序，提取质粒并纯化。将ACP-ACPs-pETDuet-1重组质粒导入大肠杆菌BL21-pLySs，挑取单克隆于5mL含有75μg/mL氨苄西林的LB液体培养基37℃过夜培养，将过夜培养的菌液倒入1L含有75μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养至OD600＝0.5，加入IPT G终浓度为0.5mM，37℃诱导4h，15000rpm离心
30min，弃上清，用BufferA(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl)重悬菌沉淀，加入蛋白酶抑制剂、DnaseI，然后通过细胞超声破碎仪超声15min(幅度50％，5s开，5s关)。细胞裂解液
15000rpm、4℃离心30min。将上清液用0.45μm滤膜过滤后上样于1mL镍柱，准备Buffer A：
20mM Tris-HCl，pH＝8.0、500mM NaCl、1mM DTT；Buffer B：20mM Tris-HCl，pH＝8.0、500mM NaCl、1mM DTT、500mM咪唑。设置蛋白纯化仪流速为0.5mL/min，用10倍柱体积、2％Buffer B、98％Buffer A洗涤，然后用2％-22％Buffer B以10倍柱体积进行梯度洗脱，最后用22％Buffer B以5倍柱体积等度洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE确定蛋白纯度，将收集到的目的蛋白先用20mM Tris-HCL(pH 8.0)稀释20倍，配制Buffer A:20mM HEPES、1mM DTT、pH7.0；
Buffer B：1M KCl、1mM DTT、20mM HEPES，pH7.0，使用5mL离子交换柱Hip Trap FF分离holo-ACP-ACPs二聚体，纯化步骤如下：依次用MilliQ H2O、100％Buffer B(1M KCl)、2％Buffer B冲洗Hip Trap FF柱子，上样，然后用200mM KCl-600mM KCl，15CV梯度洗脱，再以
100％Buffer B(1M KCl)，5CV等度洗脱，最后依次用5-10CV，100％Buffer A、5-10CV，MilliQ H2O、5-10CV，20％乙醇冲洗柱子。将纯化后的holo-ACP进行浓缩，并置换到含有
20mM HEPES(pH 7.0)、100mM NaCl的缓冲液中，将浓缩后的holo-ACP通过MALDI-TOF-MS进行分子量检测，然后测定holo-ACP中巯基含量以确定holo-ACP浓度，方法如下：分别设置实验组和对照组，实验组为50uL holo-ACP+950uL 200uM DTNB，空白组为50uL(20mM HEPES+
100mM NaCl)+950uL 200uM DTNB，室温下反应30min，在412nm处测定吸光度A。-SH浓度测定：-SH(uM)＝73.53*(Asample-A空白)*稀释倍数，holo-ACP测定完浓度后再加入TCEP终浓度为1mM，分装后于-80℃保存。
[0172] 1.4Malonyl-ACP是由holoACP与manonyl-CoA经FabD催化得到，具体方法如下：
[0173] Malonyl-ACP的合成与纯化：准备125uM holo-ACP、2.0mM malonyl-CoA、6uM FabD、20mM HEPES(PH7.0)、100mM NaCl、1mM TCEP，0℃反应16-20h，并通过MALDI-TOF-MS进行分子量检测。Malonyl-ACP通过分子筛纯化，配制缓冲液：100mM NaCl、20mM HEPES，pH7.0,通过SDS-PAGE确定纯度后浓缩，用BCA法测定malony-ACP浓度后加入甘油终浓度为15％，分装后于-80℃保存。
[0174] 1.5FabH IC50测定
[0175] 各反应组分以分批方式混合在一起，然后根据所进行的分析的数量平均分配。所有实验均以6份重复进行。所述的量相当于一个单一的反应。将20μM isobutyryl-CoA、0.05μg FabH、不同浓度的Oxa1、100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)混匀，分别加入黑色384孔板中反应5min，再加入8μM malonyl-ACP，混匀后吸取40μL CPM(溶于100％DMSO)终止反应，测定
384nm，470nm处的荧光。
384nm，470nm处的荧光。
[0176] 2、实验结果
[0177] 测试结果如图11、图12所示，化合物Oxa1作用于FabH的IC50值为2.6μM，化合物Oxa4作用于FabH的IC50值为1.16μM，表明系列化合物对细菌脂肪酸生物合成的FabH酶表现出很好的抑制作用。
[0178] 二、测定化合物对FabH抑制机理
[0179] 1、实验方法
[0180] 通过对化合物与FabH蛋白进行共孵育和MALDI-TOF质谱分析，并且通过胰蛋白酶对其进行消化来进行肽谱分析来表征肽段修饰。
[0181] 实验方法如下：
[0182] 使用100μM系列化合物与50μM FabH反应，并在室温下孵育4小时。使用10mM乙酸溶液制备成0.25μg/μL胰蛋白酶储备液，并在-80℃下储存。准备7.5μg蛋白，50mM NH4HCO3，MS级纯水(添加至50μL)的混合物，然后向混合物中添加0.15μg胰蛋白酶(质量比为1:50)并在37℃下孵育过夜，使用2-layer stage-tips(C18/C18)按照以下步骤进行纯化：(A)润湿吸头：添加100μL 100％甲醇并以1200g离心10分钟3次，然后添加100μL 0.1％TFA甲醇溶液(50％MeOH)并以4000g离心4分钟3次。(B)平衡：加入100μL 0.1％TFA，并以6000g离心4分钟，离心3次。(C)加载样品并在2000g离心12分钟2次。(D)洗去盐：加入100μL 0.1％TFA，并以6000g离心4分钟。(E)洗去TFA：加入100μL 0.1％甲酸溶液并以6000g离心4分钟2次。(F)洗脱：加入50μL 50％MeOH 0.1％甲酸溶液，并以2000g离心4分钟2次。(G)在speed-vac中干燥20分钟，然后冻干，干燥后的溶液溶于40μL 0.1％甲酸溶液中，用于LC-MS分析。
[0183] 2、实验结果
[0184] 共孵育的FabH的MALDI-TOF质谱分析显示有+268加合物，这意味着化合物分子可能对FabH进行了1:1的共价修饰(如图13)。为了确定修饰位点，对经化合物处理的FabH进行胰蛋白酶消化和随后的LC-MS分析。鉴定出1个系列化合物加合物所对应的分子量肽，MS2片段提示其修饰位点为半胱氨酸112(图14)，为了进一步确定共价修饰位点，我们通过定点突变将半胱氨酸112突变为丙氨酸。与野生型FabH相同的条件下，FabH C112A突变体在不能在与Cys112为相同修饰位点上形成系列化合物加合物(图15)。综上所述，化合物抑制FabH通过对其半胱氨酸112进行共价修饰进而产生抑制作用。
[0185] 三、测定化合物细菌水平对FabH靶标细菌的影响。
[0186] 1、实验方法
[0187] 通过化合物对敏感性金黄色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和大肠杆菌(E.coli)MIC测试的方法来测定化合物抗菌活性。
[0188] 实验方法如下：
[0189] 采用LB肉汤微量稀释法测定Oxa1-16的最低抑菌浓度MIC。用接种环挑取37℃过夜培养的LB琼脂板上形态相似待检菌落3-5个，接种于5mL的LB肉汤培养基中，37℃、225rpm培养4h,测OD600值，将原菌液稀释若干倍，使其OD600值为0.1左右，菌液浓度108cfu/mL，再将108cfu/mL的菌液稀释100倍，得到106cfu/mL的菌液备用。先取50uL不同浓度化合物和对照化合物加至96孔板，再取50uL稀释好的菌液，37℃培16-20h,读取结果。
[0190] 2、实验结果
[0191] 表1.Oxa系列化合物MIC值
[0192]
[0193] 表2.Oxa4及各抗生素对于临床分离的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC值[0194]
[0195]
[0196] 测试结果如表1、表2所示，系列化合物对金黄色葡萄球菌的MIC测量结果中表现出很好的抗菌活性。而且，相对比与甲氧西林、万古霉素和利奈唑胺抗生素，Oxa4对于临床分离的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC值表现出更好的抑制活性。由以上所测定的数据可知，该系列化合物，特别是该系列中化合物Oxa1、Oxa3、Oxa4、Oxa6、Oxa7具有显著的抑制金黄色葡萄球菌活性，并且其母核具有成药性好，物理性质适合等优点，可以深入研究其构效关系，进行改进。
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