卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用
阅读：588发布：2023-12-29
专利汇可以提供卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且卡非佐米在制备用于 治疗 骨肉瘤药物中的应用，本 发明 提出蛋白酶体 抑制剂 卡非佐米的新功能：能够诱导骨肉瘤发生定向成骨分化，可用于治疗骨肉瘤。通过实验证实，中、高剂量的卡非佐米能够诱导骨肉瘤细胞凋亡，而低浓度卡非佐米还可以有效诱导骨肉瘤细胞发生成骨分化，具体表现为：引起骨肉瘤细胞F5M2、U-2OS中 钙 化结节增多； 碱 性 磷酸 酶活性增加；成骨分化标志物(ALP、OPN、Runx2)的表达增加。，下面是卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用专利的具体信息内容。
1.卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，卡非佐米在制备用于诱导骨肉瘤细胞发生成骨分化的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，卡非佐米在制备用于诱导骨肉瘤细胞凋亡的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，骨肉瘤细胞为F5M2或U-2OS细胞系。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，卡非佐米在制备用于对骨肉瘤细胞具有杀伤作用的药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，卡非佐米在制备用于引起骨肉瘤细胞中钙化结节增多的药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，卡非佐米在制备用于引起骨肉瘤细胞中碱性磷酸酶活性增加的药物中的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，卡非佐米在制备用于引起骨肉瘤细胞中成骨分化标志物的表达增加的药物中的应用。
卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用
背景技术
[0002] 泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是生物体细胞内一个重要的蛋白水解通路。该水解过程主要发生在26S蛋白酶体内，后者由两个19S调节复合体和一个20S催化核心体组成。20S催化核心体负责将多泛素化标记的底物蛋白分解成为多肽片段，它是由含有不同α和β亚基的堆叠六叶环所组成的一种管状结构，其中的活性亚基为β1、β2和β5。研究证实，蛋白酶体参与多种蛋白的降解(如NF-κB、p53、cyclin等)，间接调控着细胞有丝分裂、细胞凋亡、信号转导、蛋白跨膜定位等生物过程，从而与阿尔斯海默症、癌症等多种疾病有着非常密切的关联。目前，蛋白酶体已经成为抗肿瘤药物研发的新热点。第二代蛋白酶体抑制剂卡非佐米(Carfilzomib，CFZ)是一种环氧酮类药物，能够不可逆地与蛋白酶体20S催化核心体的N-末端苏氨酸活性位点相结合，发挥对β5亚基活性的靶向抑制作用。多项研究显示，卡非佐米在针对复发性、难治性的多发性骨髓瘤患者的治疗中具有持久的抗瘤活性，2012年正式被美国FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤，成为多发性骨髓瘤的一线特效靶向药物。
[0003] 骨肉瘤(Osteosarcoma)是一种好发于青少年的常见恶性骨肿瘤，发病率居原发性骨肿瘤的第一位，70％-80％的患者发病年龄为10-25岁。骨肉瘤主要发生于长骨干骺端，少见于脊柱、骨盆和骶骨，且单发病灶患者占大多数。骨肉瘤不仅容易复发而且早期转移率高。在初诊的骨肉瘤患者中，约有10％-20％的患者已经出现远处转移，且90％为肺转移，骨肉瘤一旦发生转移和复发，往往预示着预后不良，其5年整体生存率为20％-30％。近年来随着外科手术技术的进步、有效化疗药物的研究、术前术后的放化疗辅助治疗等技术的应用，骨肉瘤患者的5年生存率得到了大幅提高，然而复发性和转移性骨肉瘤仍是一种不治之症，亟待攻克。
[0004] 诱导分化治疗是肿瘤治疗的新热点，旨在通过诱导分化剂的作用将肿瘤细胞通过诱导分化为正常细胞，从而治疗及治愈肿瘤。在已有体外研究中，通过诱导分化能达到治疗透明细胞肉瘤、髓母细胞瘤和粒细胞白血病等疾病的目的。近期也有诱导分化在骨肉瘤治疗中的研究报道。Sramek M等研究发现氨甲喋呤能促进骨肉瘤细胞成骨分化及成骨分化相关基因的表达，并且氨甲蝶呤联合全反式维甲酸具有治疗骨肉瘤的疗效(Sramek M.et al.Cancer Cell Int.2016Feb；16:14)。Liu C等发现高良姜素能显著抑制人骨肉瘤细胞的增殖，并促进骨肉瘤细胞成骨分化及成骨分化标记物的表达(Liu C.et al.Biomed Pharmacother.2017May；89:1415-1421)。因此，寻找通过诱导分化从而治疗骨肉瘤的高效药物，具有非常重要的理论与临床意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提出卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用，发现中、高剂量蛋白酶体抑制剂卡非佐米能够有效诱导骨肉瘤细胞凋亡，低浓度卡非佐米还可以诱导骨肉瘤细胞发生成骨分化。本发明有望为骨肉瘤治疗提供一种新的临床治疗模式：通过诱导骨肉瘤发生定向成骨分化达到治疗骨肉瘤的目的。
[0006] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 卡非佐米在制备用于治疗骨肉瘤药物中的应用。
[0008] 本发明进一步的改进在于，卡非佐米在制备用于诱导骨肉瘤细胞发生成骨分化的药物中的应用。
[0009] 本发明进一步的改进在于，卡非佐米在制备用于诱导骨肉瘤细胞凋亡的药物中的应用。
[0010] 本发明进一步的改进在于，骨肉瘤细胞为F5M2或U-2 OS细胞系。
[0011] 本发明进一步的改进在于，卡非佐米在制备用于对骨肉瘤细胞具有杀伤作用的药物中的应用。
[0012] 本发明进一步的改进在于，卡非佐米在制备用于引起骨肉瘤细胞中钙化结节增多的药物中的应用。
[0014] 本发明进一步的改进在于，卡非佐米在制备用于引起骨肉瘤细胞中成骨分化标志物的表达增加的药物中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
[0016] 本发明提出蛋白酶体抑制剂卡非佐米的新功能：能够诱导骨肉瘤发生定向成骨分化，可用于治疗骨肉瘤。通过实验证实，中、高剂量的卡非佐米能够诱导骨肉瘤细胞凋亡，而低浓度卡非佐米还可以有效诱导骨肉瘤细胞发生成骨分化，具体表现为：引起骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中钙化结节增多；碱性磷酸酶活性增加；成骨分化标志物(ALP、OPN、Runx2)的表达增加。
[0018] 图1为不同浓度卡非佐米(CFZ)诱导骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS凋亡的结果。图中，A为不同浓度卡非佐米诱导F5M2细胞凋亡的流式检测结果，B为不同浓度卡非佐米诱导U-2 OS细胞凋亡的流式检测结果，C为图A的三次独立实验的统计结果，D为图B的三次独立实验的统计结果。
[0019] 图2为茜素红染色低检测浓度卡非佐米(CFZ)加药处理后的骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS细胞，可见红色钙化结节显著增多。其中，成骨诱导培养基(OIM)作为阳性对照。
[0020] 图3为Gomori钙钴法染色检测低浓度卡非佐米(CFZ)加药处理后的骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS细胞，可见细胞中碱性磷酸酶活性显著增强。其中，成骨诱导培养基(OIM)作为阳性对照。
[0021] 图4为Western blotting检测发现低浓度卡非佐米(CFZ)处理后骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中成骨分化标志物(ALP、OPN、Runx2)的表达水平显著升高。
具体实施方式
[0022] 本发明公开了蛋白酶体抑制剂卡非佐米可用于治疗骨肉瘤的新功能。卡非佐米不仅能够诱导骨肉瘤细胞凋亡，而且低浓度卡非佐米还可以诱导骨肉瘤细胞发生成骨分化，具体表现为引起骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中钙化结节增多；碱性磷酸酶活性增加；成骨分化标志物(ALP、OPN、Runx2)的表达增加。
[0023] 本发明采用Annexin V-FITC/7-AAD双染流式细胞术检测卡非佐米对骨肉瘤细胞的杀伤作用。采用茜素红染色实验用于检测低浓度卡非佐米对骨肉瘤细胞中钙化结节生成的影响。采用Gomori钙钴法染色实验用于检测低浓度卡非佐米对骨肉瘤细胞中碱性磷酸酶活性的影响。采用免疫印迹实验用于检测低浓度卡非佐米对骨肉瘤细胞中成骨分化标志物表达水平的影响。下面结合具体的实施例(实验所用人骨肉瘤细胞系为F5M2、U-2 OS)对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0024] 1、采用Annexin V-FITC/7-AAD双染流式细胞术检测卡非佐米对骨肉瘤细胞的杀伤作用。
[0025] 1)不同浓度卡非佐米处理骨肉瘤细胞
[0027] ②24h后，给处于对数期生长的骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中加入卡非佐米，使得药物终浓度为0，5，10，25，50，100nmol/L。继续培养细胞24h。
[0028] 2)Annexin V-FITC/7-AAD双染流式细胞术检测骨肉瘤细胞凋亡
[0029] ①收集各组细胞培养基上清至离心管中。
[0030] ②胰酶消化细胞，收集各组细胞悬液至离心管中，与上一步收集的培养基上清合并，置于台式离心机1200rpm离心5min，弃上清。
[0031] ③每管中加入2-3mL预冷的PBS缓冲液重悬细胞，充分斡旋，置于台式离心机1200rpm离心5min，弃上清，充分洗掉培养基中的血清，减少对后续染色的干扰。
[0032] ④将细胞重悬于50μL的Binding buffer中，每管加入2.5μL的Annexin V-FITC染液及0.5μL的7-AAD染液，斡旋混匀后于冰上避光染色15min。
[0033] ⑤检测前，每管补加300μL的Binding buffer。
[0034] ⑥上机检测。相同实验重复三次。流式检测数据采用Flowjo v7.6.2分析作图，并计算各组细胞凋亡比例。
[0035] 实验结果如图1所示，中、高浓度卡非佐米能够诱导骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS凋亡，而低浓度卡非佐米不能诱导骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS凋亡。
[0036] 2、采用茜素红染色实验检测低浓度卡非佐米对骨肉瘤细胞中钙化结节生成的影响。
[0037] ①收集骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS，显微镜下观察并计数细胞，调整细胞密度为0.1×106/mL，接种至6孔板，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。
[0038] ②24h后，给处于对数期生长的骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中加入卡非佐米，使得药物终浓度为0，5，10，25，50，100nmol/L。
[0039] ③继续培养细胞6天，每3天更换一次对应培养基。
[0040] ④轻轻吸净培养皿中的培养基，用PBS缓冲液清洗细胞2次。然后加入1mL的4％多聚甲醛溶液，室温固定细胞15min。将多聚甲醛溶液弃去，用PBS缓冲液清洗细胞2次。
[0042] ⑥除去染液，用PBS清洗细胞3次。将染色结束的培养皿开盖后置于细胞倒置显微镜下，低倍镜(×10、×20)观察钙化结节的染色效果，并拍照记录。钙化结节呈鲜红色。
[0043] 实验结果如图2示，以成骨诱导培养基(OIM)作为阳性对照，低浓度卡非佐米引起骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中钙化结节增多。
[0044] 3、采用Gomori钙钴法染色实验检测低浓度卡非佐米对骨肉瘤细胞中碱性磷酸酶活性的影响。
[0045] ①培养骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS到对数生长期，显微镜下观察并计数细胞，调整细胞密度为0.1×106/mL，接种至35mm皿，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。
[0046] ②在处于对数期生长的骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中加入卡非佐米，使得药物终浓度为0，2.5，5，10nmol/L。以成骨诱导培养基(OIM)作为阳性对照。
[0047] ③继续应用不同浓度卡非佐米处理细胞6天，每3天更换一次对应培养基。
[0048] ④轻轻吸净培养皿中的培养基，用PBS缓冲液清洗细胞2次。加入1mL的70％乙醇溶液，室温固定细胞10min。用蒸馏水清洗细胞1次。再将l mL的β-甘油磷酸钠溶液加入每个培养皿，37℃孵育6h。蒸馏水冲洗数次。
[0049] ⑤将1mL的硝酸钴溶液加入每个培养皿，室温静置3-5min。蒸馏水冲洗数次。
[0050] ⑥将1mL的硫化铵溶液加入每个培养皿，室温静置2min。
[0051] ⑦蒸馏水冲洗细胞后，倒置显微镜下观察，并拍照记录。
[0052] 实验结果如图3所示，以成骨诱导培养基(OIM)作为阳性对照，低浓度卡非佐米引起骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中碱性磷酸酶活性增加。
[0053] 4、采用免疫印迹实验检测低浓度卡非佐米对骨肉瘤细胞中成骨分化标志物表达水平的影响。
[0054] 1)低浓度卡非佐米处理骨肉瘤细胞
[0055] ①收集骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS，显微镜下观察并计数细胞，调整细胞密度为0.2×106/mL，接种至6孔板，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。
[0056] ②24h后，给处于对数期生长的骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中加入卡非佐米，使得药物终浓度为0，5，10，25，50，100nmol/L。继续培养细胞24h。
[0057] 2)Western blotting检测骨肉瘤细胞成骨分化标志物表达
[0058] ①提取蛋白：吸除各组培养皿内培养基，加入1mL的PBS缓冲液，轻轻摇晃冲洗后弃去。加入100μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的商品化RIPA裂解液，细胞刮刀刮取细胞，转移溶液至标记好样品名称的1.5mL EP管中，置于冰上裂解20min。将样品置于4℃预冷的低温离心机中12000rpm离心15min。结束后将蛋白上清吸出并转移至新的1.5mL EP管中。
[0059] ②蛋白定量：采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，根据标准曲线计算出各样品蛋白的浓度，在高浓度样品中补加相应体积RIPA裂解液，调整至浓度相同。根据各蛋白样品最终体积，将其与5×Loading Buffer按照4：1的比例混合，置于100℃沸水中煮10min进行蛋白变性。
[0061] ④转膜：电泳结束后，利用转膜装置将蛋白转印至PVDF膜上，调整电流为200mA，根据分子量不同调整转膜时长。
[0063] ⑥抗体孵育：将牛奶弃掉，PBST洗涤3次，每次5min。添加对应的商品化抗体ALP、OPN、Runx2和β-actin，4℃摇床孵育过夜。次日，回收一抗，PBST洗涤3次，每次5min。添加对应的鼠或兔二抗，置于摇床常温孵育1h。
[0064] ⑦化学发光。
[0065] 实验结果如图4所示，低浓度卡非佐米引起骨肉瘤细胞F5M2、U-2 OS中成骨分化标志物(ALP、OPN、Runx2)的表达增加。
[0066] 5、统计学分析
[0067] 实验结果采用GraphPad Prism 5进行统计分析，组间比较采用双尾非配对t检验(Two-tailed unpaired t-test)，P＜0.05认为具有统计学意义。
[0068] 以上实验结果充分证明，中、高剂量蛋白酶体抑制剂卡非佐米能够诱导骨肉瘤细胞凋亡，而低浓度卡非佐米还表现出诱导骨肉瘤细胞发生成骨分化的作用。
[0069] 本发明中卡非佐米可以是各种形式的卡非佐米及其衍生物。
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