消化泥鳅多糖调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的用途
阅读：174发布：2023-12-31
专利汇可以提供消化泥鳅多糖调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及消化泥鳅多糖调节免疫功能或 治疗 免疫相关 疾病 的用途。特别是，本发明涉及消化泥鳅多糖在制备药物或保健食品中的用途，所述药物或保健食品用于调节免疫功能，特别是增强免疫功能，或治疗免疫相关疾病。，下面是消化泥鳅多糖调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的用途专利的具体信息内容。
1.消化泥鳅多糖在制备药物或保健食品中的用途，所述药物或保健食品用于调节免疫功能，特别是增强免疫功能，或治疗免疫相关疾病，例如免疫系统疾病。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述消化选自：
酸消化，所述酸可以为无机酸例如盐酸，或有机酸例如醋酸，或其组合；
碱消化，所述碱可以为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠；
酶消化，所述酶可以选自唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶或其任何组合；
细菌消化，所述细菌可以为肠道细菌，或由肠道细菌改造而成的细菌中的一种或多种，或其任何组合；或
上述消化的任何组合，
用于酸消化的pH值可以为1-5，例如1、2、3、4或5。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述消化选自：模拟胃液消化、模拟肠液消化、肠菌液消化或其任何组合；模拟胃液例如包含胃蛋白酶或胃脂肪酶，pH可以为1-3；模拟肠液例如包含胰酶，pH可以为6-8。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于治疗胸腺损伤、改善巨噬细胞吞噬指数、改善巨噬细胞吞噬率、改善T淋巴细胞增殖率、改善B淋巴细胞增殖率、改善NK细胞活力、改善抗体生成能力或其任何组合。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述消化泥鳅多糖为益生元。
6.一种消化泥鳅多糖。
7.制备消化泥鳅多糖的方法，所述方法包括将泥鳅多糖进行消化，所述消化选自：
酸消化，所述酸可以为无机酸例如盐酸，或有机酸例如醋酸，或其组合；
碱消化，所述碱可以为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠；
酶消化，所述酶可以选自唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶或其任何组合；
细菌消化，所述细菌可以为肠道细菌，或由肠道细菌改造而成的细菌中的一种或多种，或其任何组合；或
上述消化的任何组合，
用于酸消化的pH值可以为1-5，例如1、2、3、4或5。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述消化选自：模拟胃液消化、模拟肠液消化、肠菌液消化或其任何组合；模拟胃液例如包含胃蛋白酶或胃脂肪酶，pH可以为1-3；模拟肠液例如包含胰酶，pH可以为6-8。
9.包含消化泥鳅多糖的药物或保健食品。
消化泥鳅多糖调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及消化泥鳅多糖调节免疫功能，特别是增强免疫功能，或治疗免疫相关疾病，例如免疫系统疾病的用途。
背景技术
[0003] 泥鳅多糖可以用现有技术已知的方法获得，该方法描述于例如钦传光等(钦传光，黄开勋，徐辉碧，泥鳅多糖的免疫作用研究，中国药学杂志，2002年8月第37卷第8期)。该方法还描述于例如中国专利申请 。
[0004] 环磷酰胺(Cyclophosphamide)是一种抑制免疫系统的细胞毒性剂药物，已被用于治疗多种疾病，例如治疗血管炎、多发性硬化症、红斑狼疮和韦格纳肉芽肿等免疫系统疾病。另外，环磷酰胺也可诱导患者的免疫抑制，导致患者的免疫功能低下，形成免疫缺陷状态。
[0005] 尽管已知泥鳅多糖具有免疫调节作用，仍需要改善的调节免疫功能或治疗免疫相关疾病，例如免疫系统疾病的产品和方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供改善的调节免疫功能，特别是增强免疫功能，或治疗免疫相关疾病，例如免疫系统疾病的产品和方法，以及该产品的制备方法。
[0007] 在一个方面，本发明提供了消化泥鳅多糖在制备药物或保健食品中的用途，所述药物或保健食品用于调节免疫功能，特别是增强免疫功能，或治疗免疫相关疾病，例如免疫系统疾病。
[0008] 在一个方面，所述消化可以包括：酸消化，所述酸可以为无机酸例如盐酸，或有机酸例如醋酸，或其组合；
碱消化，所述碱可以为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠；
酶消化，所述酶可以选自唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶或其任何组合；
细菌消化，所述细菌可以为肠道细菌，或由肠道细菌改造而成的细菌中的一种或多种，或其任何组合；或
上述消化的任何组合，
用于酸消化的pH值可以为1-5，例如1、2、3、4或5。
碱消化，所述碱可以为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠；
酶消化，所述酶可以选自唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶或其任何组合；
细菌消化，所述细菌可以为肠道细菌，或由肠道细菌改造而成的细菌中的一种或多种，或其任何组合；或
上述消化的任何组合，
用于酸消化的pH值可以为1-5，例如1、2、3、4或5。
[0009] 在一个方面，所述消化可以包括：模拟胃液消化、模拟肠液消化、肠菌液消化或其任何组合。模拟胃液例如包含胃蛋白酶或胃脂肪酶，pH可以为1-3。模拟肠液例如包含胰酶，pH可以为6-8。
[0011] 在一个方面，所述消化泥鳅多糖为益生元。
[0012] 在一个方面，本发明提供了消化泥鳅多糖。
[0013] 在一个方面，本发明提供了制备消化泥鳅多糖的方法，所述方法包括将泥鳅多糖进行消化，所述消化可以包括：酸消化，所述酸可以为无机酸例如盐酸，或有机酸例如醋酸，或其组合；
碱消化，所述碱可以为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠；
酶消化，所述酶可以选自唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶或其任何组合；
细菌消化，所述细菌可以为肠道细菌，或由肠道细菌改造而成的细菌中的一种或多种，或其任何组合；或
上述消化的任何组合，
用于酸消化的pH值可以为1-5，例如1、2、3、4或5。
碱消化，所述碱可以为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠；
酶消化，所述酶可以选自唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶或其任何组合；
细菌消化，所述细菌可以为肠道细菌，或由肠道细菌改造而成的细菌中的一种或多种，或其任何组合；或
上述消化的任何组合，
用于酸消化的pH值可以为1-5，例如1、2、3、4或5。
[0014] 在一个方面，在制备消化泥鳅多糖的方法中，所述消化可以包括：模拟胃液消化、模拟肠液消化、肠菌液消化或其任何组合。模拟胃液例如包含胃蛋白酶或胃脂肪酶，pH可以为1-3。模拟肠液例如包含胰酶，pH可以为6-8。
[0015] 在一个方面，本发明提供了包含消化泥鳅多糖的药物或保健食品。
[0016] 本发明提供了相对于现有技术改善的调节免疫功能，特别是增强免疫功能，或治疗免疫相关疾病，例如免疫系统疾病的产品和方法。
[0018] 图1是小鼠注射环磷酰胺后体重变化的图；图2是显示小鼠免疫器官指数测定结果的图；
图3A-3F是显示小鼠巨噬细胞吞噬实验的照片的图；
图4A是小鼠巨噬细胞吞噬率测定结果图；
图4B是小鼠巨噬细胞吞噬指数测定结果图；
图5A是显示小鼠T淋巴细胞增殖率的图；
图5B是显示小鼠B淋巴细胞增殖率的图；
图6是显示小鼠NK细胞活性的图；
图7是显示小鼠血清溶血实验HC50结果的图。
图3A-3F是显示小鼠巨噬细胞吞噬实验的照片的图；
图4A是小鼠巨噬细胞吞噬率测定结果图；
图4B是小鼠巨噬细胞吞噬指数测定结果图；
图5A是显示小鼠T淋巴细胞增殖率的图；
图5B是显示小鼠B淋巴细胞增殖率的图；
图6是显示小鼠NK细胞活性的图；
图7是显示小鼠血清溶血实验HC50结果的图。
具体实施方式
[0019] 除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以包括定义在内的本文件为准。下面描述优选的方法和材料，但是与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制。
[0020] 发现消化泥鳅多糖能够调节免疫功能，特别是增强免疫功能，或治疗免疫相关疾病，例如免疫系统疾病，提供改善的效果。
[0021] 本公开所述泥鳅多糖可用本领域已知的方法得到。该方法描述于例如钦传光等(钦传光，黄开勋，徐辉碧，泥鳅多糖的免疫作用研究，中国药学杂志，2002年8月第37卷第8期)。
[0022] 泥鳅多糖还可通过包含以下步骤的方法得到：(i)用高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；(ii)加入酶，得到酶解液；(iii)使酶解液静置沉淀；(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。高温水的温度可以是50℃-100℃，优选70℃-90℃。步骤(ii)中的酶可以选自木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或它们的混合物。在所述步骤(ii)中还可包括在高温下使酶灭活及去除蛋白的步骤。在所述步骤(iv)中可通过过滤或离心去除沉淀物，可用膜设备或在真空下进行浓缩。所述步骤(v)中的醇可以是高浓度乙醇，优选乙醇与水的浓度比是70%-100%: 0-30%。该方法描述于中国专利申请 ，在此通过引用全文并入本文。
[0023] 还可以在任选的杀死泥鳅的步骤之后，通过刮擦(例如用刀片)的方式，剥离泥鳅多糖。
[0024] 本公开所述消化泥鳅多糖可通过将泥鳅多糖进行消化制备。
[0025] 所述消化可以是酸消化。所述酸可以为无机酸例如盐酸，或有机酸例如醋酸，或其组合等。
[0026] 所述消化可以是碱消化。所述碱可以为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠等。
[0027] 所述消化可以是酶消化。所述酶可以选自唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶或其任何组合。
[0028] 所述消化可以是细菌消化。所述细菌可以为肠道细菌，或由肠道细菌改造而成的细菌中的一种或多种，或其任何组合。
[0029] 所述消化可以是上述消化的任何组合。
[0030] 用于酸消化的pH值可以为1-5，例如1、2、3、4或5。
[0031] 在一个方面，所述消化可以包括：模拟胃液消化、模拟肠液消化、肠菌液消化或其任何组合。
[0032] 模拟胃液可以包含胃电解质，例如NaCl、KCl、CaCl2或NaHCO3；和酶，例如胃蛋白酶或胃脂肪酶。模拟胃液的pH可以为1-3，例如2。可用酸(可以为无机酸例如盐酸，或有机酸例如醋酸，或其组合)，例如HCl调pH值。例如，模拟胃液可以如下配制：制备胃电解质溶液，将1.55g NaCl、0.55g KCl、0.075g CaCl2、0.3g NaHCO3溶于0.5L的去离子水中；187.5mg胃蛋白酶和165mg胃脂肪酶中加入250 mL胃电解质溶液，混合均匀，用1mol/L HCl调pH值至2。
[0033] 模拟肠液可以包含肠电解质，例如NaCl、KCl或CaCl2；和酶，例如胰酶。模拟肠液的pH可以为6-8，例如7。可用碱，例如NaHCO3调pH值。例如，模拟肠液可以如下配制：制备肠电解质溶液，将0.54g NaCl、0.065g KCl、0.033g CaCl2溶于100 mL的去离子水；制备7g/100mL胰酶，将7g胰酶溶于100mL水，4800×g离心10min，取上清液待用；向90mL胰酶溶液中加入90mL肠电解质溶液，混合均匀，用1mol/L NaHCO3调节pH值至7。
[0034] 肠菌液可以按本领域已知的方法制备，例如，可以按实施例中所述方法制备。
[0035] 可以将泥鳅多糖与用于消化的酸、碱、酶或细菌混合进行消化。消化的温度可以为20-50摄氏度，例如30-40摄氏度，例如37摄氏度。消化的时间可以为1-24小时，例如1-12小时，或1-8小时。消化后任选将酶灭活，任选过滤，浓缩滤液，任选干燥。
[0036] 在一个实施方案中，可以组合进行两种或更多种消化。例如，可以先进行模拟胃液消化，可以将pH调节至约7，再进行模拟肠液消化，还可以再进行肠菌液消化。
[0037] 所述消化泥鳅多糖可以用于制备药物或保健食品。
[0038] 所述药物可以用于治疗胸腺损伤、改善巨噬细胞吞噬指数、改善巨噬细胞吞噬率、改善T淋巴细胞增殖率、改善B淋巴细胞增殖率、改善NK细胞活力、改善抗体生成能力或其任何组合。
[0039] 所述药物可以用于治疗免疫缺陷。免疫缺陷是指与正常状况相比，机体的免疫受损、减弱和/或降低的状况。在一个实施方案中，免疫缺陷是由免疫抑制剂诱导的。在一个优选实施方案中，免疫抑制剂是环磷酰胺。在另一个优选实施方案中，免疫缺陷是由环境因素引起的，例如是由新装修房屋中超标的甲醛引起的。在另一个实施方案中，免疫缺陷是由食物中毒引起的。
[0040] 作为一个非限制性实例，所述免疫缺陷例如原发性免疫球蛋白缺乏症、继发性免疫球蛋白缺陷病和自身免疫性疾病，例如X连锁低免疫球蛋白血症、常见变异型免疫缺陷病、免疫球蛋白G亚型缺陷病、重症感染、新生儿败血症、原发性血小板减少性紫癜和川崎病。
[0041] 所述消化泥鳅多糖可以作为益生元。
[0043] 在一个方面，所述消化泥鳅多糖的剂量或治疗有效量是50 450mg/kg体重/天，例~如50mg/kg体重/天、75mg/kg体重/天、100mg/kg体重/天、125mg/kg体重/天、150mg/kg体重/天、175mg/kg体重/天、200mg/kg体重/天、225mg/kg体重/天、250mg/kg体重/天、275mg/kg体重/天、300mg/kg体重/天、325mg/kg体重/天、350mg/kg体重/天、375mg/kg体重/天、400mg/kg体重/天、425mg/kg体重/天或450mg/kg体重/天。所述剂量或治疗有效量可由主治医师根据患者的疾病严重程度、年龄、性别、体重、一般健康状况等适宜地确定。
[0044] 在一个方面，基于所述药物的总重量，泥鳅多糖的含量为1-100%，例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、
24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、
43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、
62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%。
24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、
43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、
62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%。
[0045] 在一个实施方案中，本发明的药物为注射剂、片剂、丸剂、锭剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂以及任何其他合适的剂型。在一个实施方案中，本发明的药物可口服施用。在一个实施方案中，本发明的药物可肠胃外施用，例如经腹膜内、肌内、动脉内、静脉内、皮下、皮内等途径。
[0046] 在一个实施方案中，除了泥鳅多糖之外，本发明的药物还包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，例如可举出润滑剂、粘合剂、填充剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、乳化剂、助悬剂、稀释剂、胶凝剂、崩解剂、pH调节剂、增溶剂等。本领域技术人员知晓，这些载体可根据合适的剂型适当选择，并视具体需要改变其含量。
[0047] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，参考以下的非限制性实施例进一步描述本发明。实施例
[0048] 实施例1. 消化泥鳅多糖的制备实施例中所用泥鳅多糖可按中国专利申请 中所述方法制备。或按钦传
光等(钦传光，黄开勋，徐辉碧，泥鳅多糖的免疫作用研究，中国药学杂志，2002年8月第37卷第8期)方法制备。
光等(钦传光，黄开勋，徐辉碧，泥鳅多糖的免疫作用研究，中国药学杂志，2002年8月第37卷第8期)方法制备。
[0049] 1.1 体外模拟胃液和模拟肠液的配制：胃电解质溶液：1.55g NaCl、0.55g KCl、0.075g CaCl2、0.3g NaHCO3溶于0.5L的去离子水中。体外模拟胃液：187.5mg胃蛋白酶和
165mg胃脂肪酶中加入250 mL胃电解质溶液，混合均匀，用1mol/L HCl调pH值至2。肠电解质溶液：0.54g NaCl、0.065g KCl、0.033g CaCl2溶于100 mL的去离子水。7g/100mL胰酶：7g胰酶溶于100mL水，4800×g离心10min，取上清液待用。体外模拟肠液：90mL胰酶溶液中加入
90mL肠电解质溶液，混合均匀，用1mol/L NaHCO3调节pH值至7。
165mg胃脂肪酶中加入250 mL胃电解质溶液，混合均匀，用1mol/L HCl调pH值至2。肠电解质溶液：0.54g NaCl、0.065g KCl、0.033g CaCl2溶于100 mL的去离子水。7g/100mL胰酶：7g胰酶溶于100mL水，4800×g离心10min，取上清液待用。体外模拟肠液：90mL胰酶溶液中加入
90mL肠电解质溶液，混合均匀，用1mol/L NaHCO3调节pH值至7。
[0050] 1.2 胃消化泥鳅多糖制备取其中1份泥鳅多糖，20 ml纯化水溶解，80 mL体外模拟胃液充分混合后，于150 r/
min，37℃的摇床中消化。4 h后取出，于95℃加热15分钟灭活酶，过滤，滤液浓缩后60℃鼓风干燥，作为药物2组。
min，37℃的摇床中消化。4 h后取出，于95℃加热15分钟灭活酶，过滤，滤液浓缩后60℃鼓风干燥，作为药物2组。
[0051] 1.3 胃肠消化泥鳅多糖制备取其中1份泥鳅多糖，20 ml纯化水溶解，80 mL体外模拟胃液充分混合后，于150 r/
min，37℃的摇床中消化。2 h后取出，用1 mol/L NaHCO3调节溶液pH值为7，然后向锥形瓶中加入48mL的体外模拟的肠消化液，充分混合后，于150 r/min，37℃的摇床中消化。4 h后取出，于95℃加热15分钟灭活酶，过滤，滤液浓缩后60℃鼓风干燥，作为药物3组。
min，37℃的摇床中消化。2 h后取出，用1 mol/L NaHCO3调节溶液pH值为7，然后向锥形瓶中加入48mL的体外模拟的肠消化液，充分混合后，于150 r/min，37℃的摇床中消化。4 h后取出，于95℃加热15分钟灭活酶，过滤，滤液浓缩后60℃鼓风干燥，作为药物3组。
[0052] 1.4 肠菌液消化泥鳅多糖制备厌氧培养基制备培养基组成：
A为7.5 mL(1% K2HPO4.3H2O)；B为37.5 mL(0.47% KH2PO4、1.18% NaCl、1.2% (NH4)
2SO4、0.16% CaCl2.H2O、0.45% MgSO4·7H2O)；C为50 mL(8% Na2CO3)；0.5g L-半胱氨酸，2 mL(25% L-抗坏血酸)，1 g牛肉浸膏，1 g蛋白胨。以上加超纯水适量，1 mol/L HCl调节pH至
7.5～7.7，定容至1000mL，所得培养基分配于管，115℃下以0.07 MPa高压灭菌30 min，4℃下贮存或立即使用。
A为7.5 mL(1% K2HPO4.3H2O)；B为37.5 mL(0.47% KH2PO4、1.18% NaCl、1.2% (NH4)
2SO4、0.16% CaCl2.H2O、0.45% MgSO4·7H2O)；C为50 mL(8% Na2CO3)；0.5g L-半胱氨酸，2 mL(25% L-抗坏血酸)，1 g牛肉浸膏，1 g蛋白胨。以上加超纯水适量，1 mol/L HCl调节pH至
7.5～7.7，定容至1000mL，所得培养基分配于管，115℃下以0.07 MPa高压灭菌30 min，4℃下贮存或立即使用。
[0053] 粪便采集与处理（所用器具均经高压蒸汽121℃灭菌20min）：筛选6例健康人体(男女各3例)收集新鲜粪便1次，将所得标本尽快置于－80℃冰箱中。
取1个离心管，充满氮气，装入4 g粪便并加入40mL生理盐水，涡旋混合制成悬浊液，5000 r/min离心10 min后得上清液，作为肠菌液。取肠菌液10 mL置于培养瓶中，加入30 mL厌氧培养液，混匀，作为肠菌培养液（整个过程于N2流下操作），迅速置于厌氧培养罐中，加入1个厌氧产气袋后盖上培养罐盖，置于37℃恒温培养箱中培养24 h，使肠菌培养液中的肠道菌充分成长。
取1个离心管，充满氮气，装入4 g粪便并加入40mL生理盐水，涡旋混合制成悬浊液，5000 r/min离心10 min后得上清液，作为肠菌液。取肠菌液10 mL置于培养瓶中，加入30 mL厌氧培养液，混匀，作为肠菌培养液（整个过程于N2流下操作），迅速置于厌氧培养罐中，加入1个厌氧产气袋后盖上培养罐盖，置于37℃恒温培养箱中培养24 h，使肠菌培养液中的肠道菌充分成长。
[0054] 取其中1份泥鳅多糖，20 ml纯化水溶解，80 mL体外模拟胃液充分混合后，于150 r/min，37℃的摇床中消化。2 h后取出，用1 mol/L NaHCO3调节溶液pH值为7，然后向锥形瓶中加入48 mL的体外模拟的肠消化液，充分混合后，于150 r/min，37℃的摇床中消化。4 h后取出，将离体肠道菌液与泥鳅多糖经胃肠消化后的溶液，混合均匀，立即置于于厌氧培养罐中，加入1个厌氧产气袋后迅速盖上培养罐盖，置于37℃恒温培养箱，分别培养4 h后，高压蒸汽121℃灭菌20 min，过滤，滤液浓缩后60℃鼓风干燥，作为药物4组。
[0055] 实施例2. 动物实验2.1动物实验方案
2.1.1 实验动物
雄性清洁级Bclb/c小鼠，18g±2g(5w),90只，6组，每组15只。
2.1.1 实验动物
雄性清洁级Bclb/c小鼠，18g±2g(5w),90只，6组，每组15只。
[0056] 2.1.2 饲养条件12h交替光照，充足食物和水供给。
[0057] 2.1.3 实验分组2.1.3.1小鼠适应性培养一周后，造模小鼠（随机选取75只）按照80mg/kg/d剂量腹腔注射环磷酰胺，对照组给予相同体积的生理盐水。
[0058] 2.1.3.2注射3天后，按照不同组给予药物/生理盐水，各组均自由进食进水。
[0059] 2.1.3.3随机分成6组如下：A：正常组：生理盐水200ul/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
B：模型组：生理盐水200ul/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
C：药物1组（没有经过消化的泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
D：药物2组（胃消化泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
E：药物3组（胃肠消化泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
F：药物4组（胃肠、肠菌消化泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
2.1.3.4末次给药24h后，各个小鼠称重，各个随机选取3只小鼠用于小鼠巨噬细胞吞噬实验；3只用于脾淋巴细胞转化实验；3只用于NK细胞活力检测，3只小鼠摘取眼球取血清于后续检测，同时，此3只小鼠颈脱臼处死，取脾脏和胸腺称重；3只用于检测血清溶血素测定（给药前五天每天腹腔注射2%SRBC 0.2ml，连续五天）。
B：模型组：生理盐水200ul/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
C：药物1组（没有经过消化的泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
D：药物2组（胃消化泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
E：药物3组（胃肠消化泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
F：药物4组（胃肠、肠菌消化泥鳅多糖）：剂量250mg/kg/d，连续灌胃28天，每天灌胃一次；
2.1.3.4末次给药24h后，各个小鼠称重，各个随机选取3只小鼠用于小鼠巨噬细胞吞噬实验；3只用于脾淋巴细胞转化实验；3只用于NK细胞活力检测，3只小鼠摘取眼球取血清于后续检测，同时，此3只小鼠颈脱臼处死，取脾脏和胸腺称重；3只用于检测血清溶血素测定（给药前五天每天腹腔注射2%SRBC 0.2ml，连续五天）。
[0060] 2.2 小鼠体重增长变化分别于实验注射环磷酰胺前、1d、4d、9d、14d、21d和28d对小鼠进行称重，观察小鼠的体重变化和精神状态。
[0061] 实验结果显示，造模小鼠注射环磷酰胺后，均出现不同程度的体重下降、活动减少的情况，停止注射后体重开始上升，状态开始好转。结果见图1。
[0062] 2.3小鼠免疫器官指数测定小鼠免疫器官指数测定结果显示于图2。**表示和正常组相比，具有显著性差异；^^表示和模型组相比，具有显著性差异。
[0063] 2.3.1 和正常组相比，模型组、药物1-4组对脾指数影响无差异，提示对脾脏影响有限；2.3.2 和模型组相比，药物1-4组均能一定程度的改善由环磷酰胺造成的小鼠胸腺损
伤。
伤。
[0064] 2.4小鼠巨噬细胞吞噬指数测定2.4.1实验步骤
2.4.1.1用生理盐水将4%的鸡红细胞稀释成1%的鸡红细胞；
2.4.1.2每只受试小鼠腹腔注射上述鸡红细胞1ml，轻揉腹部使其分散；
2.4.1.3 30min后处死小鼠，固定小鼠后轻轻剪开小鼠表皮层并将其撕裂（切勿剪破腹膜层）；
2.4.1.4注射5ml的生理盐水并轻柔腹部使其充分分散；
2.4.1.5用10ml注射器针头刺入腹部，并吸出腹腔液；
2.4.1.6 取200ul腹腔液置于载玻片上并分散，37度培养箱孵育30min；
2.4.1.7 生理盐水从玻片一端滴下，使废液从另外一端流出，轻轻洗涤2min；
2.4.1.8丙酮：甲醇（1:1）固定液固定5min后晾干玻片；
2.4.1.9 滴加吉姆萨染色液固定5min左右；
2.4.1.10自来水从玻片一端滴下，使废液从另外一端流出，轻轻洗涤3min；
2.4.1.11将洗涤好的片子放到片架上，放入冰箱使其自然干燥；
2.4.1.12显微镜观察玻片，随机选取视野计算100个巨噬细胞（深紫色，个体较大，形状不定，核大），并计算其中的鸡红细胞（细胞核淡紫色，个体小，被吞噬的鸡红细胞部分可见裂解，核小（需要区分小鼠单核细胞））；
2.4.1.13分别计算吞噬率（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/计数的巨噬细胞*100%）和吞噬
指数（被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞）
2.4.1.14照片见图3A-图3E（400x）
图3A是正常组的结果，图3B是模型组的结果，图3C是药物1组的结果，图3D是药物2组的结果，图3E是药物3组的结果，图3F是药物4组的结果。
2.4.1.1用生理盐水将4%的鸡红细胞稀释成1%的鸡红细胞；
2.4.1.2每只受试小鼠腹腔注射上述鸡红细胞1ml，轻揉腹部使其分散；
2.4.1.3 30min后处死小鼠，固定小鼠后轻轻剪开小鼠表皮层并将其撕裂（切勿剪破腹膜层）；
2.4.1.4注射5ml的生理盐水并轻柔腹部使其充分分散；
2.4.1.5用10ml注射器针头刺入腹部，并吸出腹腔液；
2.4.1.6 取200ul腹腔液置于载玻片上并分散，37度培养箱孵育30min；
2.4.1.7 生理盐水从玻片一端滴下，使废液从另外一端流出，轻轻洗涤2min；
2.4.1.8丙酮：甲醇（1:1）固定液固定5min后晾干玻片；
2.4.1.9 滴加吉姆萨染色液固定5min左右；
2.4.1.10自来水从玻片一端滴下，使废液从另外一端流出，轻轻洗涤3min；
2.4.1.11将洗涤好的片子放到片架上，放入冰箱使其自然干燥；
2.4.1.12显微镜观察玻片，随机选取视野计算100个巨噬细胞（深紫色，个体较大，形状不定，核大），并计算其中的鸡红细胞（细胞核淡紫色，个体小，被吞噬的鸡红细胞部分可见裂解，核小（需要区分小鼠单核细胞））；
2.4.1.13分别计算吞噬率（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/计数的巨噬细胞*100%）和吞噬
指数（被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞）
2.4.1.14照片见图3A-图3E（400x）
图3A是正常组的结果，图3B是模型组的结果，图3C是药物1组的结果，图3D是药物2组的结果，图3E是药物3组的结果，图3F是药物4组的结果。
[0065] 2.4.2实验结果实验结果见图4A-4B。**表示和正常组相比，具有显著性差异；^^表示和模型组相比，具有显著性差异。
[0066] 2.4.3实验结论2.4.3.1药物1-4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬指数下
降问题，提示药物1-4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物2-4组具有显著性差异；
2.4.3.2药物1-4组均一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬率下降问
题，提示药物1-4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物2-4组具有显著性差异。
降问题，提示药物1-4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物2-4组具有显著性差异；
2.4.3.2药物1-4组均一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬率下降问
题，提示药物1-4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物2-4组具有显著性差异。
[0067] 2.5、小鼠脾淋巴细胞转化实验2.5.1实验步骤
2.5.1.1颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精中浸泡5min；
2.5.1.2在生物安全柜中解剖小鼠，分离出脾脏；
2.5.1.3用眼科手术剪取部分脾脏（绿豆大小），用注射器的注射器芯（橡胶部分）在200目的不锈钢筛上研磨，同时滴加pbs，收集透过不锈钢筛的细胞悬液；
2.5.1.4离心收集细胞，用完全培养基重悬细胞，计数；
2.5.1.5将细胞调整成1*106次方/ml，取100ul培养基加入到96孔细胞培养板中；
2.5.1.6每个样本设置3组（对照组、LPS组、ConA组），每组三重复，LPS的终浓度为1ug/ml，ConA的终浓度为5ug/ml；
2.5.1.7 37度，5%CO2的培养箱中培养68h；
2.5.1.8 每孔加入10ul cck8试剂，继续培养4h；
2.5.1.9 酶标仪450nm处测定OD值；
2.5.1.10 计算细胞增值率（（1-对照组OD值/实验组OD值）*100%）。
2.5.1.1颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精中浸泡5min；
2.5.1.2在生物安全柜中解剖小鼠，分离出脾脏；
2.5.1.3用眼科手术剪取部分脾脏（绿豆大小），用注射器的注射器芯（橡胶部分）在200目的不锈钢筛上研磨，同时滴加pbs，收集透过不锈钢筛的细胞悬液；
2.5.1.4离心收集细胞，用完全培养基重悬细胞，计数；
2.5.1.5将细胞调整成1*106次方/ml，取100ul培养基加入到96孔细胞培养板中；
2.5.1.6每个样本设置3组（对照组、LPS组、ConA组），每组三重复，LPS的终浓度为1ug/ml，ConA的终浓度为5ug/ml；
2.5.1.7 37度，5%CO2的培养箱中培养68h；
2.5.1.8 每孔加入10ul cck8试剂，继续培养4h；
2.5.1.9 酶标仪450nm处测定OD值；
2.5.1.10 计算细胞增值率（（1-对照组OD值/实验组OD值）*100%）。
[0068] 2.5.2实验结果实验结果见图5A-5B。**表示和正常组比较有显著性差异；^^表示和模型组比较有显著性差异。
[0069] 2.5.3实验结论2.5.3.1药物1-4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的T淋巴细胞增值率下降
问题，提示药物1-4有恢复小鼠T淋巴细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物1-4组具有显著性差异；
2.5.3.2药物1-4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的B淋巴细胞增值率下降
问题，提示药物1-4有恢复小鼠B淋巴细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物1-4组具有显著性差异。
问题，提示药物1-4有恢复小鼠T淋巴细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物1-4组具有显著性差异；
2.5.3.2药物1-4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的B淋巴细胞增值率下降
问题，提示药物1-4有恢复小鼠B淋巴细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物1-4组具有显著性差异。
[0070] 2.6 NK细胞活力测定2.6.1实验步骤
2.6.1.1.颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，用无菌HANK’S液清洗数次；
2.6.1.2. 用手术剪刀剪碎脾脏（尽量剪成小块）后研磨，用HANK’S液洗涤数次，将洗涤液过200目无菌不锈钢网筛；
2.6.1.3. 1000rpm/min离心5分钟，弃上清，用完全培养液重悬细胞，台酚蓝染色计数（活细胞在95%以上），调整细胞浓度为2*105个/ml；
2.6.1.4. 将培养好的靶细胞（YAC-1细胞），调整细胞浓度为1*107个/ml；
2.6.1.5. 靶细胞和脾淋巴细胞各取50ul（数量比50:1），加入准备好的96孔板中，混匀，37度，5%CO2，培养4小时；（设立靶细胞自发释放组（不含效应细胞，用完全培养基代替）和靶细胞最大释放组（额外添加2.5%triton））
2.6.1.6. 1000rpm/min，离心5min，收集上清液待测LDH含量
2.6.1.7. 取20ul待测样本，分别加入25ul基质缓冲液和5ul辅酶I，混匀，37度温育
15min。
2.6.1.1.颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，用无菌HANK’S液清洗数次；
2.6.1.2. 用手术剪刀剪碎脾脏（尽量剪成小块）后研磨，用HANK’S液洗涤数次，将洗涤液过200目无菌不锈钢网筛；
2.6.1.3. 1000rpm/min离心5分钟，弃上清，用完全培养液重悬细胞，台酚蓝染色计数（活细胞在95%以上），调整细胞浓度为2*105个/ml；
2.6.1.4. 将培养好的靶细胞（YAC-1细胞），调整细胞浓度为1*107个/ml；
2.6.1.5. 靶细胞和脾淋巴细胞各取50ul（数量比50:1），加入准备好的96孔板中，混匀，37度，5%CO2，培养4小时；（设立靶细胞自发释放组（不含效应细胞，用完全培养基代替）和靶细胞最大释放组（额外添加2.5%triton））
2.6.1.6. 1000rpm/min，离心5min，收集上清液待测LDH含量
2.6.1.7. 取20ul待测样本，分别加入25ul基质缓冲液和5ul辅酶I，混匀，37度温育
15min。
[0071] 2.6.1.8. 加入2,4-二硝基苯肼25ul，混匀，37度温育15min；2.6.1.9. 加入250ul 0.4M NaOH溶液，混匀，室温放置5min；
2.6.1.10. 酶标仪450nm测定OD值。
2.6.1.10. 酶标仪450nm测定OD值。
[0072] 2.6.2实验结果实验结果见图6。**表示和正常组比较有显著性差异；^^表示和模型组比较有显著性差异。
[0073] 2.6.3实验结论药物1-4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的NK细胞活力下降问题，提示药
物1-4有恢复小鼠NK细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物3-4组具有显著性差异。
物1-4有恢复小鼠NK细胞活力的作用，药物1组效果最差，药物4组效果最好，其中药物3-4组具有显著性差异。
[0074] 2.7、小鼠血清溶血素测定2.7.1实验步骤
2.7. 1.1在小鼠给药结束前5天，受试小鼠每组5只腹腔注射2%的SRBC 200ul；
2.7.1.2五天后，摘除眼球取全血，室温放置1h后，2500rpm/min 10min分离血清；
2.7.1.3取血清，用SA缓冲液200x稀释至1ml；
2.7.1.4加入用SA缓冲液稀释（1：8）的补体1ml；
2.7.1.5 加入10%SRBC 0.5ml，轻轻混匀，37度孵育30min；
2.7.1.6冰浴终止反应，2000rpm离心10min；
2.7.1.7取1ml上清液，加入3ml氰化高铁血红蛋白检测液（南京建成，C021-1），同时取
10%SRBC 0.25ml加入3.75ml氰化高铁血红蛋白检测液；
2.7.1.8 充分混匀后，放置10min，以对照管为空白，于540nm处测定OD值；
2.7.1.9计算HC50,HC50=样品OD值/SRBC半数溶血值OD值*稀释倍数。
2.7. 1.1在小鼠给药结束前5天，受试小鼠每组5只腹腔注射2%的SRBC 200ul；
2.7.1.2五天后，摘除眼球取全血，室温放置1h后，2500rpm/min 10min分离血清；
2.7.1.3取血清，用SA缓冲液200x稀释至1ml；
2.7.1.4加入用SA缓冲液稀释（1：8）的补体1ml；
2.7.1.5 加入10%SRBC 0.5ml，轻轻混匀，37度孵育30min；
2.7.1.6冰浴终止反应，2000rpm离心10min；
2.7.1.7取1ml上清液，加入3ml氰化高铁血红蛋白检测液（南京建成，C021-1），同时取
10%SRBC 0.25ml加入3.75ml氰化高铁血红蛋白检测液；
2.7.1.8 充分混匀后，放置10min，以对照管为空白，于540nm处测定OD值；
2.7.1.9计算HC50,HC50=样品OD值/SRBC半数溶血值OD值*稀释倍数。
[0075] 2.7.2实验结果实验结果见图7。**表示和正常组比较有显著性差异；^^表示和模型组比较有显著性差异。
[0076] 2.7.3实验分析2.7.3.1和正常组相比，模型组的HC50低于正常组，且显著性差异，提示模型组的小鼠抗体生成能力低于正常组；
2.7.3.2和正常组相比，各个药物组的HC50逐渐升高，但无差异。
2.7.3.2和正常组相比，各个药物组的HC50逐渐升高，但无差异。
[0077] 2.7.3.3和模型组相比，正常组的HC50高于模型组，且显著性差异，提示模型组造模成功；2.7.3.4和模型组相比，各个药物组的HC50逐渐升高，且具有显著性差异，提示药物1-4不同程度的有修复/提高小鼠免疫力的作用。
[0078] 3结论胃消化泥鳅多糖，胃肠消化泥鳅多糖，胃肠、肠菌消化泥鳅多糖均具有增强免疫功能的效果；其中胃肠消化泥鳅多糖，胃肠、肠菌消化泥鳅多糖具有极好的增强免疫功能的效果。
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