一种植物乳杆菌X7022的应用、黑蒜酵素及其制备方法与应用
阅读：867发布：2024-01-15
专利汇可以提供一种植物乳杆菌X7022的应用、黑蒜酵素及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种 植物 乳杆菌X7022的应用，用于 发酵 黑蒜，其保藏号为：CCTCC NO:M2016505。还提供一种黑蒜酵素，通过植物乳杆菌X7022发酵黑蒜获得。还提供黑蒜酵素的制备方法：活化后的植物乳杆菌X7022菌液按2～6％体积比接种于黑蒜浆中，于37℃±2℃静置培养12～30h，得到黑蒜酵素；其中：制备黑蒜浆的原料包括黑蒜、 水 和蛋白粉，所述黑蒜与水的 质量 比为1:8～12，蛋白粉的质量为水的1.5～2.5wt％；黑蒜浆的发酵起始pH为6.5～7.5。并提供了黑蒜酵素在抗 氧 化、便秘中的应用。本发明通过植物乳杆菌X7022发酵黑蒜，得到的黑蒜益生产品的SAC含量显著提高，抗氧化和抗炎功能显著增强；同时显著提高了原料黑蒜的润肠通便功效，能够满足广大消费者对健康的需求，具有广阔的市场应用价值。，下面是一种植物乳杆菌X7022的应用、黑蒜酵素及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种植物乳杆菌X7022的应用，其特征在于，用于发酵黑蒜，所述植物乳杆菌X7022的保藏号为：CCTCC NO:M2016505。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵黑蒜包括如下工艺步骤：
活化后的植物乳杆菌X7022菌液接种于黑蒜浆中，于30℃～40℃静置培养，当发酵体系的pH为4.0～5.5时发酵结束，得到黑蒜益生产品；制备所述黑蒜浆的原料包括黑蒜、水和氮源；所述黑蒜浆的发酵起始pH为6.5～7.5。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氮源为蛋白粉；所述黑蒜与水的质量比为1:8～12，所述蛋白粉的质量为水的1.5～2.5wt％；所述植物乳杆菌X7022菌液的接种比例为2～6％体积比，发酵12～30h，得到所述黑蒜益生产品为黑蒜酵素。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌X7022菌液的接种体积比为5％，所述蛋白粉的质量为水2.0wt％，于37±2℃静置培养12～24h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黑蒜与水的质量比为1:10；所述蛋白粉为大豆蛋白或酪蛋白。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黑蒜浆的pH通过碳酸氢钠，氢氧化钠或有机碱调节。
7.一种黑蒜酵素，其特征在于，通过植物乳杆菌X7022发酵黑蒜获得，所述植物乳杆菌X7022的保藏号为：CCTCC NO:M2016505。
8.根据权利要求7所述的黑蒜酵素的制备方法，包括如下步骤：
活化后的植物乳杆菌X7022菌液按2～6％体积比接种于黑蒜浆中，于37℃±2℃静置培养12～30h，得到黑蒜酵素；其中：
制备所述黑蒜浆的原料包括黑蒜、水和蛋白粉，所述黑蒜与水的质量比为1:8～12，所述蛋白粉的质量为水的1.5～2.5wt％；所述黑蒜浆的pH为6.5～7.5。
9.权利要求8所述的黑蒜酵素在抗氧化中的应用。
10.权利要求9所述的黑蒜酵素在便秘中的应用。
一种植物乳杆菌X7022的应用、黑蒜酵素及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 乳酸菌及其发酵得到的代谢产物有很多的益生功能，因此也叫益生菌。乳酸菌的发酵温度通常为30℃～40℃，乳酸菌发酵的食品被公认为功能性食品。目前益生菌70％用于乳制品的生产中，如酸奶，奶酪，干酪以及冰淇淋等。现有技术中，也存在乳酸菌的其他发酵载体，如蔬菜，水果以及谷物等。研究发现，有些食品发酵后，能够检测到明显降亚硝酸盐，降血糖和抗氧化活性等。因此，进一步研发乳酸菌发酵的益生产品，以利于人类的健康就具有十分重要的意义。
[0003] 黑蒜又名发酵黑蒜，是用新鲜生蒜，经过高温发酵后制成的食品。黑蒜在高温生产过程中随着蒜氨酸酶的失活，抑制了蒜氨酸向大蒜素的转化，所以黑蒜中的S-烯丙基-L-半胱氨酸(蒜氨酸，SAC)含量丰富。研究报道，S-烯丙基-L-半胱氨酸具有多种功效，最为显著的为抗氧化和抗炎功能，同时，也可以用于中枢神经系统、外周神经和外周疾病的预防和治疗。目前已知的黑蒜对糖尿病、高血压、高血脂、癌等疾病有疗效，特别是具有抗氧化、抗酸化、促进胃肠蠕动以预防和治疗便秘等多种功效。便秘是现代社会的一种常见疾病。便秘对身体健康具有极大的潜在危害，便秘患者肠道内容物腐败作用加强，会产生硫化氢、氨等有害物质，这些物质在肠道内被二次吸收，对人体造成危害。因此，研发新型的黑蒜产品，以提高其抗氧化和治疗便秘等功效，以利于人类的健康就具有十分重要的意义。
[0004] 现有技术中，目前还没有以黑蒜为发酵载体，采用单一的乳酸菌发酵制备黑蒜益生产品(例如黑蒜酵素)的技术。且现有技术中乳酸菌的种类繁多，并不是每一种乳酸菌都能够用于发酵黑蒜，得到益生效果好的黑蒜益生产品。从自然界中筛选出一株能够发酵黑蒜且得到的黑蒜益生产品的功效非常好的乳酸菌，是很不容易的。因此，进一步对乳酸菌和黑蒜发酵载体的结合进行研究，以完美融合黑蒜和乳酸菌的功效，并试图产生优异的益生功效，就具有十分重要的意义。
发明内容
[0005] 本发明的发明人经过长期的研究发现，植物乳杆菌X7022用于发酵黑蒜，能够有效促进黑蒜中功效成分的增加，得到具有更好益生功效的黑蒜益生产品。本发明的第一个目的就在于提供植物乳杆菌X7022的应用，将黑蒜和植物乳杆菌X7022的生物活性有机地结合在一起，具有更高的S-烯丙基-L-半胱氨酸含量、抗氧化以及更好的润肠通便功效，具有最佳益生活性。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种植物乳杆菌X7022的应用，用于发酵黑蒜，所述植物乳杆菌X7022的保藏号为：CCTCC NO:M2016505。
[0008] 根据本发明，所述的发酵黑蒜包括如下工艺步骤：
[0009] 活化后的植物乳杆菌X7022菌液接种于黑蒜浆中，于30℃～40℃静置培养10～ 30h，得到黑蒜益生产品；
[0010] 制备所述黑蒜浆的原料包括黑蒜、水和氮源；所述黑蒜浆的发酵起始pH为6.5～ 7.5。
[0011] 需要说明的是，本方案中以黑蒜为发酵载体。由于黑蒜中含有大量的糖分，氮含量较少，因此，通过补充适量的氮源来增加发酵体系中的氮源，以利于植物乳杆菌 X7022的生长和确保发酵体系的发酵质量。
[0012] 由于所述黑蒜浆本身具有一定的酸度，而发酵过程中随着发酵时间的延长，发酵体系的pH值不断降低，因此，需要在发酵起始时将黑蒜浆的pH调节至合适的pH范围6.5～7.5。超过这个pH范围，则植物乳杆菌X7022的生长受到限制，无法发酵得到口感良好，益生功效性好的黑蒜益生产品。
[0013] 优选地，所述氮源为蛋白粉；所述黑蒜与水的质量比为1:8～12，所述蛋白粉的质量为水的1.5～2.5wt％；所述植物乳杆菌X7022菌液的接种比例为2～6％体积比；得到的所述黑蒜益生产品为黑蒜酵素。
[0015] 根据本发明，优选地，所述植物乳杆菌X7022菌液的接种体积比为5％，所述蛋白粉的质量为水2.0wt％，于37±2℃静置培养12～24h。在上述参数条件下，可在合适的发酵时间条件下得到益生功效好的黑蒜益生产品，且植物乳杆菌X7022活菌数量较多。
[0016] 进一步优选地，所述黑蒜与水的质量比为1:10。
[0017] 根据本发明，所述蛋白粉可以为植物性蛋白，例如大豆蛋白，也可以为动物性蛋白，例如酪蛋白。
[0018] 优选地，所述蛋白粉为大豆蛋白。大豆蛋白与黑蒜都属于植物性来源，得到的黑蒜酵素属于纯植物性益生产品，因此具有更加环保益生的功效，也更加容易被人们所接受，有利于产品的推广。
[0020] 由于碳酸氢钠价格便宜且易得，因此进一步优选地，所述黑蒜浆的pH通过碳酸氢钠调节。
[0021] 本发明的第二个目的在于提供一种黑蒜酵素，通过植物乳杆菌X7022发酵黑蒜获得，所述植物乳杆菌X7022的保藏号为：CCTCC NO:M2016505。
[0022] 根据本发明，所述的黑蒜酵素的制备方法，包括如下步骤：
[0023] 活化后的植物乳杆菌X7022菌液按2～6％体积比接种于黑蒜浆中，于37℃±2℃静置培养12～30h，得到黑蒜酵素；其中：
[0024] 制备所述黑蒜浆的原料包括黑蒜、水和蛋白粉，所述黑蒜与水的质量比为1:8～12，所述蛋白粉的质量为水的1.5～2.5wt％；所述黑蒜浆的pH为6.5～7.5。
[0025] 本发明的第三个目的在于提供上述黑蒜酵素在抗氧化中的应用。
[0026] 本发明的黑蒜酵素，与原料黑蒜相比，显著提高了抗氧化功效，可用于抗氧化的应用。例如，可直接作为抗氧化产品，或与辅料制备成抗氧化产品生产销售。
[0027] 本发明的第四个目的在于提供上述黑蒜酵素在便秘中的应用。
[0028] 本发明的黑蒜酵素，与原料黑蒜相比，显著提高了润肠通便功效，可用于预防和治疗便秘，具有明显更好的益生功效。
[0029] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0030] (1)本发明的植物乳杆菌X7022的应用，采用单一的一种植物乳杆菌X7022对黑蒜进行发酵，完美融合了黑蒜和植物乳杆菌X7022的功效，得到的黑蒜益生产品的 S-烯丙基-L-半胱氨酸含量显著提高，抗氧化和抗炎功能显著增强；同时显著提高了原料黑蒜的润肠通便功效。黑蒜益生产品的功能性作用比原料黑蒜明显更好，能够满足广大消费者对健康的需求，具有广阔的市场应用价值。
[0031] (2)本发明的黑蒜酵素，采用植物乳杆菌X7022发酵黑蒜得到，作为一种黑蒜益生产品，具有十分优异的抗氧化和抗炎功效，能够使便秘模型小鼠的各项指标与空白组的未便秘小鼠相当，甚至效果更好，因此具有十分优异的润肠通便功效。因此，能够满足广大消费者对健康的需求，具有广阔的市场应用价值。
[0033] 图1为发酵生长曲线。
[0034] 图2为发酵前后对照图。
[0035] 图3为蒜氨酸标准曲线。
[0036] 图4为发酵前、发酵后的样品的细胞存活率柱形图。
[0037] 图5为荧光强度值随时间的变化曲线。
[0038] 图6为细胞抗氧化动力学曲线。
[0039] 图7为首颗黑便排出时间柱形图。
[0040] 图8为6小时排便颗粒数柱形图。
[0041] 图9为6小时排便重量柱形图。
[0042] 图10为小肠墨汁推进率柱形图。
[0043] 保藏说明
[0044] 本发明的植物乳杆菌X7022(Lactobacillus plantarum X7022)菌株，已于2016年 9月21日保存在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2016505。
具体实施方式
[0045] 以下结合具体的优选实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
[0046] 本发明中应用的植物乳杆菌X7022来源于臭豆腐卤液中。本发明的其他原料和设备均为市售。
[0047] 实施例1、植物乳杆菌X7022菌株的活化
[0048] MRS培养基的配方为：称取4.8g MRS粉末，加入100mL蒸馏水中，溶解后分装，115℃高压灭菌20min备用。
[0049] 从保存有植物乳杆菌X7022的甘油管中吸取部分菌液，分别在MRS平板上进行划线涂板操作，于37℃的培养箱培养24～48h后挑取单菌落至10mL的MRS液体培养基，于37℃的摇床中培养18h。从中吸取部分菌液，按2％(v/v)的接菌量接种于MRS液体培养基中进行活化。
[0050] 实施例2、植物乳杆菌X7022发酵黑蒜
[0051] (1)、适量的黑蒜与5倍黑蒜质量的水混合，搅拌成浆，于115℃，20min灭菌，得到黑蒜原浆，备用；
[0052] (2)、在5倍黑蒜质量的水中，加入适量大豆蛋白和NaHCO3,于115℃，20min 灭菌，得到大豆蛋白溶液，备用；
[0053] (3)、步骤(1)的黑蒜原浆和(2)的大豆蛋白溶液混合均匀，得到黑蒜浆；其中，所述大豆蛋白的加入量为水总量的2wt％，NaHCO3的加入量为水总量的0.85％，最终得到的黑蒜浆的发酵初始pH为7.4；
[0054] (4)、将活化后的植物乳杆菌X7022菌液按5％体积比接种至步骤(3)的黑蒜浆中，于37±2℃静置培养24h，得到黑蒜酵素。
[0055] 其中，步骤(1)培养期间每4h取样，测定活菌数与pH的变化，制作生长曲线以观察植物乳杆菌X7022于黑蒜浆中的生长情况，生长曲线如图1所示。
[0056] 由图1可以看出，随着发酵时间的延长，植物乳杆菌X7022在黑蒜浆中菌浓不断上升，于20～24h停止上升，发酵20h时植物乳杆菌X7022在黑蒜浆中菌浓最高，约为10×109CFU/mL，发酵24h后的菌浓为9.5×109CFU/mL。随着发酵时间的延长，黑蒜酵素发酵体系的pH逐渐下降，发酵12～24h时，发酵体系的pH范围为4.3-5.4。该pH范围时的黑蒜酵素的食用口感比较好。其中发酵20h时，pH为4.9。
[0057] 对发酵前的黑蒜浆和发酵24h后的黑蒜酵素分别进行拍照，如图2所示。由图 2可见，发酵前的黑蒜浆和发酵后的黑蒜酵素在表观上有一定的区别，发酵后的黑蒜酵素的颜色变浅，因此具有更好的外观，能够刺激消费者的购买欲。
[0058] 实施例4、黑蒜酵素性质检测
[0059] 分别取100mL发酵前的黑蒜浆和发酵后的黑蒜酵素，并用质构仪进行质构特性的测试。测试条件如下：测前速度与测中速率均为1.00mm/s，测后速率为10.00mm/s，目标距离为20.00mm，触发力为5gf。测试结果如表1所示。
[0060] 表1 发酵前黑蒜浆、发酵后黑蒜酵素的质构数值
[0061]
[0062] 发酵前的黑蒜浆为一种发酵液，表面硬度、黏聚度、黏性和稠性均比较低，属于一种液态状态。由表1的数据可知，黑蒜浆经植物乳杆菌X7022发酵后的质构发生变化，其表面硬度、黏聚度、黏性和稠性均明显上升，最终呈现出一种半固体状态。其口感更加适宜于作为一种益生食品食用，其市场接受度提高。
[0063] 实施例5、黑蒜酵素中SAC含量检测
[0064] 黑蒜酵素中SAC含量检测，包括如下步骤：
[0065] (1)、适量实施例2的发酵前的黑蒜浆，及发酵后的黑蒜酵素于8000r/min离心 10min，分别取发酵上清液，用0.22μm的滤膜过滤，备用。
[0066] (2)、采用高效液相色谱法分别测定两种发酵上清液中的SAC含量。
[0067] 高效液相色谱检测条件为：C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，安捷伦反相液相。
[0068] 检测方法为：流动相：磷酸盐缓冲溶液(含20mM磷酸二氢钠、10mM庚烷磺酸钠，用85％磷酸调pH到2.1)与乙腈的体积比为85:15，流速：1mL/min；进样量： 20μL，检测波长：
214nm。
214nm。
[0069] 标准曲线：精确称取SAC标准品5.0mg，置10mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，得到蒜氨酸溶液。分别吸取上述蒜氨酸溶液适量，用流动相稀释成浓度分别为250、100、50、25、10、5.0、2.0、1.0μg/mL的稀释溶液，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图，以蒜氨酸的色谱峰面积(A)，分别对其浓度(C，μg/mL)进行线性回归，得到蒜氨酸标准曲线如图3所示。图3表明，蒜氨酸的色谱峰面积与浓度在 1.0～250μg/mL范围内线性关系良好。
[0070] 经检测，发酵前的黑蒜浆与发酵后的黑蒜酵素的发酵上清液中蒜氨酸含量如表2 所示。
[0071] 表2 发酵前的黑蒜浆与发酵后的黑蒜酵素中SAC含量的比较
[0072]
[0073] 由表2可知，黑蒜浆经植物乳杆菌X7022发酵后得到的黑蒜酵素中，SAC显著提升(p<0.001)，发酵24h后，SAC含量约为发酵前的2.45倍，说明发酵后的黑蒜酵素具有优异的抗氧化和抗炎功效，与发酵前的黑蒜浆先比，其抗氧化和抗炎功能显著增强。
[0074] 实施例6、黑蒜酵素中DPPH自由基清除率检测
[0075] 黑蒜酵素中DPPH自由基清除率检测，包括如下步骤：
[0077] (2)、样品制备：取未发酵的黑蒜浆、新鲜发酵完成(发酵24h)的黑蒜酵素，8000 r/min离心10min，取上清液稀释50倍，作为样品备用。
[0078] (3)、在2mL的EP管中，配置如表3所示的反应体系：
[0079] 表3 反应体系条件
[0080]
[0081] 配置完反应体系后，在避光处反应30min，各组取200μL反应溶液加入酶标板，于517nm处检测其吸光度。DPPH自由基清除率的计算公式如下：
[0082] DPPH清除率(％)＝(1-(ASample-AControl)/ABlank)×100％，
[0083] 检测结果如表4所示。
[0084] 表4 黑蒜酵素的DPPH清除率
[0085]
[0086] 由表4可看出，黑蒜酵素稀释50倍后的DPPH清除率较发酵前显著提升(p< 0.001)。其中，发酵24h后，DPPH清除率约为发酵前的4.76倍。说明本发明的黑蒜酵素具有优异的抗氧化功效，与黑蒜原料相比，其抗氧化功效得到显著提高。
[0087] 实施例7、黑蒜酵素的细胞抗氧化活性检测
[0088] 细胞培养：HepG2细胞在含10％胎牛血清，50U/mL青霉素和50μg/mL的DMEM 培养液中培养，培养条件为37℃、5％CO2。
[0089] 样品的制备：分别取发酵前、发酵后的新鲜样品，于8000r/min离心10min，取上清液并调节pH至中性，-40℃预冻后冷冻干燥。将干燥得到的粉末样品用无血清的 DMEM培养液分别配制成5mg/mL与10mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜过滤，得到浓度分别为5mg/mL、10mg/mL的发酵前的、发酵后的样品，备用。
[0090] (一)、细胞毒性检测：采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT) 法进行检测。
[0091] 将对数生长期的HepG2细胞按照2×105个/mL的浓度接种到96孔板中，每孔100μL，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，将样品分别与HepG2细胞孵育6小时，以不加样品的DMEM作为对照。孵育结束后，吸取培养液用PBS清洗一遍，后加入100μL 含有0.5mg/mL MTT的PBS溶液，培养4小时后去除培养基，加入150μL二甲基亚砜，轻微振荡使孔板内的紫色结晶溶解，在570nm处检测吸光值，分别计为实验组 A570和对照组A570。按如下公式计算细胞存活率：
[0092]
[0093] 浓度分别为5mg/mL、10mg/mL的发酵前、发酵后的样品的细胞存活率柱形图如图4所示。
[0094] 如图4所示，与对照相比，发酵前、后的样品在5mg/mL与10mg/mL两个浓度下对HepG2细胞的存活率均无显著性的影响，说明样品在两个浓度下均对细胞无毒害作用。
[0095] (二)、CAA法测定细胞抗氧化活性
[0096] 按照6×104个细胞/mL的浓度将HepG2细胞接种到96孔板，37℃培养24h后除去培养液，用PBS清洗每个接种孔，然后每孔加入100μL的样品处理液，样品处理液为浓度分别为5mg/mL、10mg/mL的发酵前的、发酵后的样品分别含有25μM的2',7'- 二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)；以含有25μM的DCFH-DA的DMEM培养液作为空白对照；以含谷胱甘肽(浓度为2mg/mL)与25μM的DCFH-DA的DMEM培养液作为阳性对照。在37℃孵育1小时，培养结束后吸取上层残液，不用PBS清洗，直接加入100μL Hank's平衡盐溶液(HBSS，含600μM的2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐 (AAPH))。
[0097] 将96孔板放入荧光酶标仪中扫描，保持恒温37℃，在波长485nm处激发，每10min 在波长528nm处释放测定1h，得到荧光强度值随时间的变化曲线，如图5所示。
[0098] 除去空白荧光强度值和初始荧光强度值后，每个样品对应时间-荧光值曲线下的积分面积即样品的荧光单位(CAA单位)。CAA单位的计算公式如下：
[0099] CAA单位＝100-(∫SA/∫CA)*100
[0100] 式中：∫SA—时间-样品荧光值曲线下完整面积；∫CA—时间-对照荧光值曲线下完整面积。
[0101] 根据CAA单位绘制细胞抗氧化动力学曲线，如图6所示。
[0102] 由图5可知，空白对照组因不含抗氧化剂，随着时间的延长，细胞内的荧光强度逐渐增大。发酵前、发酵后的样品在5mg/mL与10mg/mL两个浓度下均能够抑制荧光强度增加的趋势，说明黑蒜浆及黑蒜酵素均具有抗氧化的作用。其中，在60分钟内，在相同浓度条件下，发酵后的黑素酵素的荧光强度明显更低，说明其抗氧化功效明显提高。尤其是，在发酵时间为60分钟时，浓度为5mg/mL黑蒜浆的荧光强度为2016.7，同等浓度的黑蒜酵素的荧光强度为1763.2，降低了12.6％；浓度为10mg/mL黑蒜浆的荧光强度为1662，同等浓度的黑蒜酵素的荧光强度为1484，降低了10.7％。如图6可知，发酵后的样品在5mg/mL与10mg/mL两个浓度下细胞的CCA值均比发酵前的样品显著增加，说明经植物乳杆菌X7022发酵后的黑蒜酵素样品较发酵前的抗氧化性显著提升(p<0.05)。
[0103] 实施例8、小鼠排便实验
[0104] 实验组灌胃用的受试物制备：黑蒜与水的质量比为1:8，制备黑蒜浆，其中大豆蛋白的含量为水总量的2wt％，NaHCO3的加入量为水总量的0.85wt％，经植物乳杆菌 X7022于37℃发酵24h。
[0105] 墨汁配置：阿拉伯树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明；称取活性炭粉状50 g加至上述溶液中煮沸3次，溶液冷却后加水定容到1000mL，4℃保存，用前摇匀。
[0106] 实验动物的准备：
[0107] (a)、动物房条件为：保持温度为20±2℃，湿度为50±5％，每3天换一次垫料。控制12h光照，12h黑暗的循环标准，每天早上7点开灯。
[0109] 灌胃方法：按体重将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、发酵前组(20mL/kg BW)、发酵后组(20mL/kg BW)、发酵前组(40mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW) 共7组，每组6只小鼠。
[0110] 阳性对照组给予受试药物酚酞含片，灌胃量为20mg/kg，一天一次；
[0111] 4组实验组分别给予受试物，灌胃量为0.2mL/10g，发酵前组(40mL/kg BW)和发酵后组(40mL/kg BW)一天两次，即总的灌胃量为0.4mL/10g，发酵前组(20mL/kg BW)和发酵后组(20mL/kg BW)一天一次。
[0112] 空白组和模型组给予受试物等量的生理盐水。
[0113] 灌胃14天后，将各组小鼠禁食不禁水16h。模型组，阳性对照组和四组实验组均灌胃给予盐酸洛哌丁胺(10mg/kg BW)，空白组给予等量的生理盐水。
[0114] 30min后，给予墨汁灌胃。动物均单笼饲养，正常饮水进食，从灌胃墨汁悬液起开始计时，记录每只动物排首粒黑便时间、6h内排粪便粒数及重量，如图7至图9所示。
[0115] 根据图7至图9，与空白组的正常小鼠相比，模型组排首粒黑便时间显著延长(p< 0.001)。模型组的6h排便粒数、6h排便质量均显著减少(p<0.001)。说明使用盐酸洛哌丁胺构建小鼠便秘模型成功。
[0116] 与模型组相比，四组实验组的排首粒黑便时间均有不同程度的缩短，其中发酵后组 (20mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW)差异最为显著(p<0.001)，发酵后组(20 mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW)排首粒黑便时间分别相比模型组缩短56.6％、 57.0％。且与正常小鼠(空白组)没有显著性差异(p>0.05)。
[0117] 四组实验组的6h排便粒数也有显著的增加，其中发酵后组(20mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW)差异最为显著(p<0.001)，发酵后组(20mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW)6h排便粒数分别相比模型组增加了347％、359％。且与正常小鼠 (空白组)没有显著性差异(p>0.05)。
[0118] 四组实验组的6h排便质量也有显著的增加，其中发酵后组(20mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW)差异最为显著(p<0.001)，发酵后组(20mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW)6h排便质量分别相比模型组增加了368％、369％；且与正常小鼠 (空白组)没有显著性差异(p>0.05)。
[0119] 发酵后组(20mL/kg BW)与发酵前组(20mL/kg BW)相比，排首粒黑便时间缩短42.8％；发酵后组(40mL/kg BW)组与发酵前组(40mL/kg BW)相比，排首粒黑便时间缩短
33.8％；
33.8％；
[0120] 发酵后组(20mL/kg BW)与发酵前组(20mL/kg BW)相比，6h排便质量增加 61.5％；发酵后组(40mL/kg BW)与发酵前组(40mL/kg BW)相比，6h排便质量分别相比模型组增加
21.6％；
21.6％；
[0121] 发酵后组(20mL/kg BW)与发酵前组(20mL/kg BW)相比，6h排便粒数增加 55.1％；发酵后组(40mL/kg BW)与发酵前组(40mL/kg BW)相比，6h排便粒数增加23.8％；
[0122] 上述实验结果说明，经植物乳杆菌X7022发酵后的黑蒜酵素具有显著的润肠通便作用，且发酵后的黑蒜酵素与空白组无显著差异，甚至在6h排便粒数和6h排便质量方面均已超过空白组，说明发酵后的黑蒜酵素能够使便秘模型小鼠恢复到未便秘的正常小鼠状态，因此，发酵后的黑蒜酵素在润肠通便效果上比发酵前明显更好。本发明的黑蒜酵素可用于作为预防和治疗便秘的食物。
[0123] 实施例9、小鼠小肠墨汁推进实验
[0124] 灌胃方法：按体重将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、发酵前组(20mL/kg BW)、发酵后组(20mL/kg BW)、发酵前组(40mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW) 共7组，每组6只小鼠。
[0125] 阳性对照组给予受试药物酚酞含片，灌胃量为20mg/kg，一天一次；
[0126] 4组实验组分别给予受试物，灌胃量为0.2mL/10g，发酵前组(40mL/kg BW)和发酵后组(40mL/kg BW)一天两次，即总的灌胃量为0.4mL/10g，发酵前组(20mL/kg BW)和发酵后组(20mL/kg BW)一天一次。
[0127] 空白组和模型组给予受试物等量的生理盐水。
[0128] 灌胃14d后，将各组小鼠禁食不禁水16h。模型组、阳性对照组和各实验组灌胃给予盐酸洛哌丁胺(5mg/kg BW)，空白对照组给予等量的生理盐水。
[0129] 30min后，给予墨汁灌胃。25min后，脱颈椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，计算墨汁推进率公式如下：
[0130]
[0131] 小肠墨汁推进率柱形图如图10所示。由图10可知，与空白组相比，模型组墨汁推进率显著降低(p<0.001)，说明使用盐酸洛哌丁胺构建小鼠便秘模型成功。
[0132] 与模型组相比，各实验组墨汁推进率均显著升高，其中发酵后组(20mL/kg BW)、发酵后组(40mL/kg BW)的墨汁推进率最为明显(p<0.001)，分别相比模型组升高 108％、109％，说明发酵后的黑蒜酵素可显著促进便秘模型小鼠的小肠蠕动。
[0133] 发酵后组(20mL/kg BW)与发酵前组(20mL/kg BW)相比，墨汁推进率升高 38.8％，已超过空白组的墨汁推进率；发酵后组(40mL/kg BW)与发酵前组(40mL/kg BW)相比，墨汁推进率升高22.8％，已经超过空白组的墨汁推进率，说明发酵后的黑蒜酵素能够使便秘模型小鼠恢复到未便秘的正常小鼠状态。因此，与发酵前的黑蒜浆相比，发酵后的黑蒜酵素的促进小肠蠕动的作用明显增加，具有更好的促进便秘模型小鼠的小肠蠕动的作用。本发明的黑蒜酵素可用于作为预防和治疗便秘的食物或药物。
[0134] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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