一种来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白及其应用
阅读：323发布：2023-12-20
专利汇可以提供一种来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种来源于球形赖 氨 酸芽孢杆菌的纳米 银 合成蛋白，并公开了该纳米银合成蛋白的具体序列，本发明揭示了球形赖氨酸芽孢杆菌制备纳米银的合成机制，并成功扩增出其相应DNA，经过重组载体和原核表达，可以大量制备具有高效合成 生物 纳米银能 力 的细菌，具有极其广阔的应用前景和工业价值。，下面是一种来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白及其应用专利的具体信息内容。
1.一种来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白，其特征在于，所述纳米银合成蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白，其特征在于，所述纳米银合成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，该载体中包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.一种重组细胞，其特征在于，该细胞中包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
5.权利要求1或2所述细菌来源的纳米银合成蛋白在生物法制备纳米银中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，制备纳米银的合成反应温度35～45℃，转速150～200rpm，底物硝酸银浓度15～25mM，pH为9.0～12.0，反应时间24h。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，制备的纳米银形状为球形，粒径大小30～
50nm。
一种来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 纳米材料是由纳米粒子组成的固体材料，自80年代纳米材料的概念形成后，这种材料就一直受到人们极大的关注，金属纳米材料是纳米材料的一个重要分支，它以贵金属金、银、铜为代表，其中纳米银的研究结果最多。纳米银材料是一类重要的新型纳米材料，其制备方法主要有物理、化学、生物法三种。随着绿色、环保观念的普及，利用生物系统合成纳米银粒子的生物法备受关注。生物纳米银在生物分子的保护下稳定性和分散性得到了较大提高，具有良好的生物相容性、特殊的理化性质及优异的抗菌、抗炎作用和较低的生物毒性，在生物医用材料领域内具有独特的优势和举足轻重的地位。研究纳米银颗粒的最佳合成条件，深入了解纳米银的合成机制，对于制备更加高效、高产的抗菌银纳米产品意义重大。
[0003] 纳米银用于癌症诊断：癌症早期诊断有助于控制癌症的发展及肿瘤细胞的扩散，对于癌症的治疗至关重要。纳米银具有局部表面等离子体共振效应(localized surface plasmon resonance，LSPR)，即入射光子与纳米银表面自由电子发生共振，在紫外-可见区域具有很强的光吸收和散射能力，其消光谱图除受到纳米银自身的性质如尺寸、形貌、取向等影响外，还与其所处的电介质环境有关。纳米银与生物分子相互作用能够引起局部折射率的微小变化，而这一变化能够非常敏感地反映在纳米银的LSPR消光谱中。这一光学特性使得纳米银能够作为生物传感器将难以检测的生物识别信息转化为可测的LSPR谱峰位移信号。相比传统的免疫检测方法(如酶联免疫吸附剂测定法)，纳米银LSPR生物传感器具有操作简便、响应迅速、无需生物标记的显著优势。
[0004] 此外，纳米银具有表面增强拉曼散射效应(surface-enhanced Raman scattering， SERS)，能够使待测物质的拉曼信号产生极大增强，从而实现痕量检测甚至单分子检测。JUN等设计了磁性纳米银核壳型复合纳米材料能够进行癌细胞的靶向、分离以及SERS成像。BAMRUNGSAP等设计了荧光标记适配体耦合Au-Ag纳米棒，实现了对Hela 细胞SERS和荧光检测及成像。
[0006] 抗菌活性：银会使细菌细胞产生高度的形态和结构改变而导致细胞死亡。纳米银会附着在细菌细胞壁和含硫元素的细胞膜上，一旦与膜结构结合，在膜上的纳米银形成的银-硫相互作用会使膜的半透性发生改变，细胞内容物因为渗透压而流出。一部分的纳米银粒子会进入到细菌内部，与DNA和RNA等含磷结构产生作用，使DNA浓缩，抑制细菌繁殖，而且溶液中的纳米银粒子会释出微量的银离子，抑制细菌中酶的活性和产 ATP相关蛋白质的表达，由于其卓越的抗菌活性，纳米银被广泛应用于医疗器械和耗材中。
[0007] 抗癌特性：纳米技术最有希望引入医药领域的是改善癌症成像技术和治疗药物的设计标准，在纳米尺度上揭示生物系统的组织、形态和功能，用包埋技术结合纳米银粒子和靶向药物治疗癌症是未来纳米粒子在医药领域的重要研究方向。通过镀膜技术，纳米银粒子能够呈现出一种标准的功能化表面，这种表面可以添加各种基质。例如，用二氧化硅镀膜的纳米银粒子，可以通过稳定的醚键和酯键连接基质，避免了基质被自然代谢的酶分解。
[0008] 纳米银的制备方法按反应机理分主要可以分为两大类：物理方法和化学方法。物理方法主要是用物理手段如机械研磨、辐射等来使银单质变为纳米级尺寸。虽然各种物理方法原理简单，但由于仪器设备的要求高，生产费用昂贵，使其使用受到限制。化学方法是被广泛应用于制备纳米银的方法，主要有化学还原法、物理还原法和生物还原法。化学还原法是目前实验室和工业上使用比较广泛的方法之一。用还原剂将银从它的化合物或盐中还原出来，采用的银盐主要是AgNO3或其配合物，还原剂主要有硼氢化钠、水合肼、甲醛、多元醇、抗坏血酸以及比Ag活泼的金属等，常加入分散剂或保护剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、山梨醇、聚乙烯醇等控制生成物的粒径及形状。化学还原中所用试剂在使用过程中可能对环境或者生物体有危害作用，因此，环境友好、绿色的银纳米粒子制备方案亟待出现。
发明内容
[0009] 发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白，得到编码该蛋白的核苷酸序列。
[0010] 本发明还要解决的技术问题是提供上述来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的纳米银合成蛋白在生物法制备纳米银中的应用。
[0011] 技术方案：一种细菌来源的纳米银合成蛋白，所述纳米银合成蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。
[0012] 一种细菌来源的纳米银合成蛋白，所述纳米银合成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013] 一种重组载体，该载体中包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0014] 一种重组细胞，该细胞中包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0015] 上述细菌来源的纳米银合成蛋白在生物法制备纳米银中的应用。
[0017] 作为优选，制备的纳米银形状为球形，粒径大小30～50nm。
[0018] 有益效果：
[0019] 本发明公开了球形赖氨酸芽孢杆菌中一种能够高效合成生物纳米银的蛋白，名称为 hypothetical protein(Lysinibacillus sphaericus)，该假定蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1 所示。另外，由于NCBI并没有记载该蛋白对应的核苷酸序列，所以本发明以蛋白序列为模板设计出兼并引物，提取Lysinibacillus sphaericus基因组作为PCR反应模板，摸索 PCR反应条件，成功扩增出该蛋白相应的DNA并测序，故本发明也首次公开了 hypothetical protein(Lysinibacillus sphaericus)所对应的核酸序列。本发明的hypothetical protein(Lysinibacillus sphaericus)在pH为9.0～12.0，35～45℃条件下对纳米银的合成效率较高，合成时间1天左右，得到的生物纳米银溶液呈淡黄色，性质稳定，大小均一，粒径分布在30～50nm。并且附着胞外蛋白质，具有良好的生物学功能。本发明提纯和发现了球形赖氨酸芽孢杆菌合成纳米银反应中起作用的关键蛋白，揭示了这种细菌制备纳米银的合成机制，并成功扩增出其相应DNA，经过重组载体和原核表达，可以大量制备具有高效合成生物纳米银能力的细菌，具有极其广阔的应用前景和工业价值。附图说明
[0021] 图2是80％饱和度下透析蛋白溶液的SDS-PAGE蛋白电泳图；
[0022] 图3是各组洗脱液和淋洗液的纳米银合成峰图；
[0023] 图4是200mM洗脱蛋白溶液的SDS-PAGE蛋白电泳图；
[0024] 图5是扩增出的目的基因的琼脂糖凝胶电泳；
[0025] 图6是重组菌上清液和对照组的SDS-PAGE蛋白电泳图；
[0026] 图7是重组菌上清液和对照组的纳米银合成峰图。
具体实施方式
[0027] 下面结合实施步骤和附图对本发明做进一步的说明。
[0028] 以下实施方式中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0029] 实施例1：
[0030] 样品菌株发酵液上清的制备。取出样品菌株(球形赖氨酸芽孢杆菌)放入冰盒缓慢融化，按照2％的接种量接种于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于 37℃，200rpm摇床培养24h。之后按照2％的接种量将上述种子液接种于发酵培养基中。 37℃，
200rpm摇床发酵48h后，测发酵液的pH。用台式高速冷冻离心机在常温、10000 rpm下离心
10min，收集发酵液上清。
200rpm摇床发酵48h后，测发酵液的pH。用台式高速冷冻离心机在常温、10000 rpm下离心
10min，收集发酵液上清。
[0031] 实施例2：
[0032] 使用硫酸铵分级沉淀法，对发酵液上清蛋白进行初步纯化。做7组(20％，40％，50％， 60％，70％，80％，90％)饱和度，每组100mL发酵上清。按照调整硫酸铵溶液饱和度计算表向各个反应体系内缓慢加入相应量的硫酸铵固体。4℃，磁力搅拌器上搅拌过夜，使蛋白质充分沉淀。所得溶液10000×g，30min离心，分组保留上清和沉淀。将各饱和度下盐析得到的沉淀蛋白溶于少量(10ml左右)超纯水中，沉淀溶解后分别放入透析袋对纯水体系透析
24～48h，每隔3～6小时换透析缓冲液一次(以滴管或移液枪移取少量溶液用BaCl2检测是否有BaSO4沉淀)，确保除去硫酸根离子。收集7组不同饱和度下的透析蛋白溶液。各装入EP管中，4℃冰箱放置保存。
24～48h，每隔3～6小时换透析缓冲液一次(以滴管或移液枪移取少量溶液用BaCl2检测是否有BaSO4沉淀)，确保除去硫酸根离子。收集7组不同饱和度下的透析蛋白溶液。各装入EP管中，4℃冰箱放置保存。
[0033] 实施例3：
[0034] 对各饱和度下的透析蛋白溶液进行纳米银合成能力的测定。通过不断摸索尝试，改变硝酸银底物浓度，温度，pH等影响因素，优化合成条件，最终确定反应条件为：5mL 透析蛋白溶液(浓度50ug/mL左右，pH为9.0～12.0)+AgNO3(底物浓度15～20mM) 反应(水浴摇床35～45℃，转速150～200r)24h。
[0035] 准备7个试管，将7组不同饱和度下的透析蛋白液按5ml体系，浓度均调至50ug/mL 左右，按照上述反应条件反应24h,然后取上层液体。按照状态稀释合适倍数(20和40 饱和度无需稀释，50和60饱和度稀释10倍，70和80饱和度稀释50倍)，稀释后各组室温放置12h左右，待颜色变为黄色或黄棕色时，即说明纳米银生成。第二天各组反应液颜色如图1(A)所示。将7组反应液分别进行全波长扫描，得到纳米银合成峰图1(B) 所示。比较可知，只有80％饱和度下沉淀蛋白透析液所得反应液颜色为黄色，在420nm 处有明显的银纳米特征峰，故最佳饱和度选择80％来进行后续实验。将80％饱和度下所得透析液进行SDS-PAGE凝胶电泳，如图2所示，根据条带数目确定目前透析蛋白液的纯度，可见还需要进一步纯化。
[0036] 实施例4：
[0037] 使用离子交换层析法，对80％饱和度下透析蛋白溶液进一步纯化。
[0038] (1)装柱(预处理)：
[0039] 取一洁净烧杯，加入适量的填料(需提前计算柱体积，装柱后填料沉降面应距离柱顶端5cm左右，由此确定填料加入量),加5倍柱体积的纯水，倒去上清，重复3次，洗去填料中含有的20％乙醇，柱底连接上蠕动泵，在柱底注入1cm左右的纯水，扎紧下管，然后将烧杯中填料混匀用玻璃棒沿柱内壁缓慢引流到柱中，待填料沉积下来，用吸管吸去上层水层，填料面离柱顶3cm左右。
[0040] (2)平衡：
[0041] 在填料面上加入Tris-HCl缓冲液到柱顶部，将柱上管口接上蠕动泵，柱下管口连入检测器，恒定流速0.5～1.0mL/min，下管口松开，做好收集，泵入5倍柱体积的Tris-HCl 缓冲液(时间由5倍柱体积/流速确定)平衡柱子，最后填料面上要确保有1cm左右的 Tris-HCl缓冲液，下管口扎紧。
[0042] (3)上样：
[0043] 松开下管口，缓冲液液面下降到与填料高度平齐时，扎紧下口，用玻璃棒沿内壁缓慢上样(透析蛋白液，上样前，需要用0.45μm膜过滤)，松开下口，蛋白液面下降到与填料高度平齐，扎紧下口，加适量的Tris-HCl缓冲液将内壁残留的样品冲下去，松开下口，平齐，重复3次.最后确保填料面上有1cm左右的Tris-HCl缓冲液。
[0044] (4)洗脱：
[0045] 加满Tris-HCl缓冲液到柱顶，连接管插入Tris-HCl缓冲液，约1～2倍柱体积，流速 1mL/min，开始淋洗未挂柱的蛋白，有检测器读数(出峰区段)做好收集(淋洗液)，准备含不同NaCl浓度(100mM，200mM，400mM)的Tris-HCl缓冲液,连接好装置，流速1mL/min，开始洗脱挂柱蛋白，有检测器读数(出峰区段)收集不同的纯化蛋白(洗脱液)，用考马斯亮蓝检测并跑电泳检测其纯度。以及验证其合成纳米银的能力。对得到的淋洗液和各盐浓度下的洗脱蛋白液，进行纳米银合成能力的测定：合成条件均控制为：5mL蛋白液(浓度50ug/mL左右，PH为9.0～12.0)+AgNO3(15～20mM)水浴摇床35～45℃，150～200r反应一天。反应完成后，无需稀释。将各组洗脱液和淋洗液进行全波长扫描。经过测定，发现只有200mM洗脱液反应后(图3中C所示)有明显纳米银峰，颜色为黄色。将200mM洗脱液进行蛋白电泳，可知与上述现象一致，200mM洗脱蛋白基本为单条带，如图4所示。蛋白纯度较高，并具有合成纳米银的能力。
[0046] 实施例5：
[0047] 纳米银合成蛋白的鉴定。初步断定，这条大小在120kDa左右的蛋白(即200mM洗脱蛋白液)，很可能是合成纳米银的关键蛋白，将考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶状态的蛋白拿干净小刀割下。放入灭菌后的1.5mL Eppendorf管内，用超纯水将条带反复冲洗两至三次，最后吸干离心管中所有水分，封盖保存并做好标记冷链送往生工生物工程股份有限公司武汉分部进行Maldi-TOF测序。测得目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。这种蛋白鉴定为hypothetical protein(Lysinibacillus sphaericus)假定蛋白(球形赖氨酸芽孢杆菌)，通过将其输入NCBI，通过blastp比对，得到了完全匹配的相应蛋白，确定了目的蛋白为球形赖氨酸芽孢杆菌中的假定蛋白。大小为1083aa。NCBI上并没有记载这种假定蛋白相应的核酸序列。其相关的功能也没有记录。假定蛋白作为功能尚不明确的一类蛋白，具有生物合成纳米银的还原效应可能就是本实验所发现的它的功能之一。为了得到其相应的核酸序列，直接以其氨基酸序列为模板，设计上下游兼并引物为：
[0048] 上游引物：F：5’-AACGATATGGCAAAGCAAAACAAAGGC-3’
[0049] 下游引物：R：5’-NGCNACNGTRAANCCRTCNGCNGC-3’
[0050] (注：兼并碱基代码为通用代码)
[0051] 然后将设计好的兼并引物送往上海杰李生物技术有限公司进行合成。提取球形赖氨酸芽孢杆菌的基因组为PCR体外扩增的模板，采用SDS法提取目的菌基因组DNA。准备好上述所得的基因组模板，上下游引物，以及2×PCR Master Mix缓冲液和ddH2O，通过不断尝试和摸索反应条件，改变温度进行梯度PCR等，最后成功扩增出目的基因如图5所示。对PCR扩增产物进行胶回收处理，将上述回收好的目的基因冷链寄往上海杰李生物技术有限公司进行测序。测得的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。输入NCBI，通过blastx(translated nucleotide to protein)比对，直接99.63％高匹配度比对到上述测得的 hypothetical protein(Lysinibacillus sphaericus)氨基酸序列。
[0052] 实施例6：
[0053] 进行原核表达。通过DNAMAN对核酸序列SEQ ID NO.2进行分析，确定使用PET 20b(+)载体，限制性核酸内切酶Nde I和Xho I。设计含有这两种酶切位点的引物如下：
[0054] F：5’-aacgatcatatgatggctaaacaaaataaagga-3’
[0055] R：5’-aacgatctcgagagcaactgtaaaaccatcagcagc-3’
[0056] 以目的菌基因组DNA为模板，准备上下游引物SEQ ID NO.5-6，2×PCR Master Mix 缓冲液和ddH2O，PCR体系与反应条件均与实施例5中相同，进行PCR扩增。成功扩增出目的基因与图5所示结果相同，并将目的基因进行割胶回收。然后分别对PET 20b (+)载体和目的基因，加入限制酶Nde I和Xho I进行双酶切，然后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切产物。将回收的酶切产物使用T4 DNA连接酶进行连接。反应体系如下：PET 20b(+)载体(酶切过)50ng，目的基因(酶切过)100ng，T4 DNA 连接酶0.2μL，补齐超纯水至20μL体系。在22℃下孵育10分钟，65℃下热失活10min。然后将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示连接成功。然后准备好事先冻存的大肠杆菌BL21的感受态细胞两管(每管100μL)，室温解冻后立即置于冰上。在一管内加入PET 20b(+)载体(空质粒)，另一管内加入含有目的基因的PET 20b(+)载体(重组载体)，开始转化。转化完成后，分别向转化后的离心管加入37℃预热的800μL LB液体培养基(不含Amp)，37℃温和振荡培养45min后，将两管菌液5000rpm离心 5min，每管弃去600μL的上清液，留取约200μL的沉淀细菌。取上述每管菌液100μL，均匀涂布于含Amp的筛选平板上，37℃倒置培养12～18h。然后挑取抗性LB平板上长出的重组菌，并接种于LB培养基中(含Amp100μg/mL),37℃，200rpm过夜培养。取 1.5mL菌液进行质粒提取，应用限制酶对提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳，显示目的基因已插入载体，大小正确。随后取适量菌液送往上海杰李生物技术有限公司进行测序，测序结果与之前一致。将过夜培养的按1:100的比例接种于5mL含有Amp的LB液体培养基中，
37℃，200rpm振荡培养3～4h，至OD600达到 0.8时，加入IPTG至终浓度1mM/mL于37℃诱导6h，取100μL样品离心，取上清液和未转化的大肠杆菌上清液进行SDS-PAGE电泳，结果如图6所示(图中蛋白marker条带大小从上到下依次为180，130，100，70，55，40kDa。1：含有重组载体的大肠杆菌上清液；2：未转化的大肠杆菌上清液。由图可得，成功表达的蛋白大小在125kDa左右，与纳米银合成蛋白大小一致)，确定重组蛋白已经表达。最后将未转化的大肠杆菌BL21，含有重组载体的大肠杆菌BL21菌液分别离心，取上清液，按照5mL上清液(浓度 50ug/mL左右，pH为9.0～12.0)+AgNO3(底物15～25mM)反应(水浴摇床35～45℃， 150～200r)条件反应24h进行胞外合成AgNPs，并对反应后溶液分别进行全波长扫描，结果如图7所示(A：
含有重组载体的大肠杆菌上清液；B：未转化的大肠杆菌上清液。由图可知，只有A中的上清液参与胞外合成AgNPs，在413nm处出现了纳米银特征峰)，显示纳米银合成蛋白原核表达成功。
37℃，200rpm振荡培养3～4h，至OD600达到 0.8时，加入IPTG至终浓度1mM/mL于37℃诱导6h，取100μL样品离心，取上清液和未转化的大肠杆菌上清液进行SDS-PAGE电泳，结果如图6所示(图中蛋白marker条带大小从上到下依次为180，130，100，70，55，40kDa。1：含有重组载体的大肠杆菌上清液；2：未转化的大肠杆菌上清液。由图可得，成功表达的蛋白大小在125kDa左右，与纳米银合成蛋白大小一致)，确定重组蛋白已经表达。最后将未转化的大肠杆菌BL21，含有重组载体的大肠杆菌BL21菌液分别离心，取上清液，按照5mL上清液(浓度 50ug/mL左右，pH为9.0～12.0)+AgNO3(底物15～25mM)反应(水浴摇床35～45℃， 150～200r)条件反应24h进行胞外合成AgNPs，并对反应后溶液分别进行全波长扫描，结果如图7所示(A：
含有重组载体的大肠杆菌上清液；B：未转化的大肠杆菌上清液。由图可知，只有A中的上清液参与胞外合成AgNPs，在413nm处出现了纳米银特征峰)，显示纳米银合成蛋白原核表达成功。
[0057] 实施例7：生物纳米银的应用。
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