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用于改善 信号检测的化合物和系统

阅读：39发布：2024-01-01

专利汇可以提供用于改善信号检测的化合物和系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用于通过向反应混合物中加入一种或多种信号检测测定(SDA)增强剂来增加光照分析反应中的信噪比 (SNR)和/或增强光保护的组合物、装置、系统和方法。，下面是用于改善信号检测的化合物和系统专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种改进信号检测测定的方法，所述方法包括：
提供包含荧光或发荧光反应物和未标记的反应物的反应混合物；
向所述反应混合物中添加信号检测测定(SDA)增强剂，其中所述SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分，其中所述SDA增强部分包含下式的偶氮基团：
Ra-N＝N-Rb
其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中亲水部分与Ra共价连接；
用激发照射对反应混合物进行光照；和
检测来自光照反应的发射信号，其中与不存在SDA增强剂的光照反应混合物相比，SDA增强剂导致信噪比(SNR)增加，光保护增强，或两者。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未标记的反应物被固定在反应位点。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应位点在零模式波导内。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法还包括在照射反应混合物时监测荧光或发荧光反应物与未标记反应物之间的反应的步骤。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述光照反应是碱基延伸反应。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述未标记的反应物是酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶是聚合酶、解旋酶、外切核酸酶、核糖体或连接酶。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应混合物还包含模板核酸分子。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光或发荧光底物包含核苷多磷酸盐或其类似物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，Ra和Rb的芳族部分相同。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，Ra和Rb的芳族部分不同。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，Ra和Rb的芳族部分选自：芳基化合物，杂环芳族化合物，多环芳族化合物及其组合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，SDA增强剂包括：偶氮二芳基化合物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，SDA增强剂具有选自下组的式：
其中，各式包括至少一个包含亲水部分的R基团。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，亲水部分包含：磺酰基，磺酸/磺酸盐/磺酸酯基，羧酸/羧酸盐/羧酸酯基，磷酸/磷酸盐/磷酸酯基，膦酸/膦酸盐/膦酸酯基，NH2，NR””2，OH，N-磺酰基烷基，O-磺基烷基，其盐以及其组合。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，亲水部分包含至少一个磺酰基。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，SNR增强部分还包含将SNR增强部分与亲水部分连接的接头。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，接头包含至少两个碳的烷基链。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，接头包含聚乙二醇链。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，SDA增强剂选自下组：
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于，SDA增强剂导致以下任何结果或它们的组合：(i)增加光学信号，(ii)降低背景噪声，(iii)减轻对未标记的反应物的光致损伤(PID)，和(iv)减少荧光或发荧光反应物的闪烁或光漂白，其中(i)至(iv)是与不存在SDA增强剂时的光照反应混合物相比较的。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其特征在于，与不存在SDA增强剂的光照反应混合物相比，SDA增强剂导致SNR增加和光保护增强。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述信号检测测定是光照测序反应，其中所述测序反应的准确度与不存在SDA增强剂的光照测序反应相比得到增加。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述反应混合物包含：聚合酶，模板核酸，以及荧光或发荧光核苷酸或核苷酸类似物。
25.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括在照射反应混合物时监测聚合酶与荧光或发荧光核苷酸或核苷酸类似物之间的反应的步骤。
26.如权利要求24或25中任一项所述的方法，其特征在于，所述光照测序反应是碱基延伸反应。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合酶被限制在零模式波导内。
28.一种反应混合物，其包含：
荧光或发荧光反应物；
未标记的反应物；和
信号检测测定(SDA)增强剂，所述SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分，其中SDA增强部分包含下式的偶氮基：
Ra-N＝N-Rb
其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中亲水部分与Ra共价连接。
29.如权利要求28所述的反应混合物，其特征在于，所述荧光反应物的荧光包含一种或多种标记的核苷酸多磷酸盐，所述未标记的反应物包含聚合酶，所述SDA增强剂选自表1。
30.一种试剂盒，其包含：
荧光或发荧光反应物；
未标记的反应物；和
信号检测测定(SDA)增强剂，所述SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分，其中SDA增强部分包含下式的偶氮基：
Ra-N＝N-Rb
其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中亲水部分与Ra共价连接。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光反应物的荧光包含一种或多种标记的核苷酸多磷酸盐，所述未标记的反应物包含聚合酶，所述SDA增强剂选自表1。

说明书全文

用于改善信号检测的化合物和系统

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2015年11月19日提交的标题为“用于改善信号检测的化合物和系统(Compounds and Systems for Improving Signal Detection)”的美国临时专利申请62/257,581的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

[0003] 发明背景

[0004] 在分析化学、生物化学和生物学领域中，广泛使用光学可检测的标记基团，尤其是那些具有高量子产率的标记基团，例如荧光、磷光、发光或化学发光基团。特别是通过提供高度可见的与特定反应有关的信号，人们能够更好地监测反应和任何该反应的可能效应物。这样的分析是基因组学、诊断学、药物研究和相关领域中生命科学研究的基础工具。

[0005] 例如，利用荧光染料标记的基于荧光的光学测定经常用于科学分析。在基于荧光的光学测定中检测到的荧光是存在于反应混合物中的荧光团或荧光染料中发生的三阶段过程的结果。第一阶段是激发，其中提供来自特定波长的外部光源(例如来自激光器)的具有量化能量的光子，并被荧光团吸收，产生激发的电子单重态(S1')。第二阶段是激发的荧光团经历几种不同变化以释放其能量至最低单重态(S1)的激发态寿命。在第三阶段从S1态可以发生几种可能的机理，荧光(其中发射能量光子(S1-S0))使荧光团返回到其基态。通常会发生成千上万的这些激发和发射的三阶段过程，以产生可通过标准光学传感器检测到的信号。

[0006] 耗散激发电子单重态的能量的许多途径之一是系间窜越(ISC)，涉及自旋多重性的变化，将电子从S1过渡到激发三重态(T1)。在许多荧光染料分子中，寿命明显更长的三重态物质的形成大大降低了荧光发射的亮度。此外，它在这种状态下表现出高度的化学反应性，这经常导致光漂白和产生有害的自由基。

[0007] 通常在反应物量相对于所研究的反应所需量远远过量的情况下进行使用光学可检测的标记基团的分析。这种过量的结果是提供了高度可检测性，以及补偿由于检测系统导致的任何损失，并且能够进行信号检测而对反应物的冲击最小。例如，基于荧光标记基团的分析通常需要使用针对反应混合物的激发辐射源以激发荧光标记基团，然后可对其进行单独检测。然而，使用光学可检测标记基团的一个缺点是化学和生物化学反应物单独或存在其它成分(例如荧光基团)时长时间接触这样的光源，会损伤这些反应物，例如蛋白质，酶等。这种缺陷的传统解决方案是存在的反应物远远过量，使得未损伤的反应物分子数远超损伤的反应物分子，从而使得光致损伤的效果最小或消除。

[0008] 目前使用的各种分析技术已偏离了传统技术。特别是，许多反应基于越来越小量的试剂，例如在微流体或纳米流体反应容器中或通道中，或在“单分子”分析中。这些分析系统一次只能观察一个或几个“事件”。例如，这样的事件可以是抗原与抗体的结合，针对受体的配体结合，聚合物(例如，核酸，蛋白质或糖聚合物)的裂解，单元掺入聚合物(例如，氨基酸掺入蛋白质，核苷酸掺入核酸等)。这种低反应物体积在许多高通量应用中越来越重要，因此它们可以提供当在更传统的整体方法中观察多个分子时无法获得的数据。

[0009] 在进行包含标记反应物的单分子(或少数分子)反应时，一个挑战是能够区分参与观察事件的标记反应物与反应混合物中游离的其他标记反应物。这对于需要高浓度反应物的分子间事件尤其重要，例如确保与催化反应的酶的充分结合。这样，反应混合物中的标记反应物可以发出“背景”噪声，其模糊了反应混合物中感兴趣事件的信号的检测。在这样的分析中，术语“信噪比”是指将期望信号(“信号”)的水平与背景信号或“噪声”的水平进行比较的测量。

[0010] 基于越来越小量的试剂进行反应的另一挑战是这种反应受光致损伤(例如光漂白和自由基形成)的影响更严重。例如，单分子反应中酶组分的光致损害可以完全停止反应并阻止进一步的数据采集。

[0011] 因此，本公开非排它性地涉及方法和组合物，该方法和组合物导致在光照反应期间(i)反应混合物中信噪比(SNR)增加；(ii)光保护作用增加，或两者。SNR的增加可以有助于在反应物参与观察事件时检测反应物(例如，在反应位点)，从而为目前可用的方法和组合物提供有用的改进。例如，提高信噪比的方法和组合物不仅能够增强对感兴趣信号的检测，而且还能够在各种分析系统中允许较高浓度的反应物。光照反应中增加的光保护作用可以增强感兴趣信号的检测并且允许反应进行较长时间段或在更强烈的照明条件下进行，由此增加数据采集和/或允许采用更高强度的照明信号。SNR和光保护的这些改进可以导致信号检测测定法(例如单分子测序反应)中的准确度提高。

[0012] 发明概述

[0013] 本发明一般涉及用于改进光照反应中的信号检测测定的化合物、组合物、方法、装置和系统，所述改进通过在光照反应中(i)提高信噪比(SNR)，(ii)增强光保护，或两者来实现。本文所用的术语“光照反应”指暴露于光学能源的反应。通常，提供这种光照以观察反应物或产物的产生和/或消耗，反应物或产物具有特别的指示其存在的光学特征，例如反应混合物或其组分的吸收光谱和/或发射光谱的变化(强度、波长等方面的变化)。

[0014] 增加SNR可以通过减少或限制背景噪声的影响和/或增强在光照反应期间检测到的一个或多个光学信号来实现，特别是使用荧光或发荧光反应物的反应。这种增加的SNR可用于提高参与观察到的分子间事件的标记反应物的可检测性。通过防止、消除、减少或限制(也称为“减轻”)光致损伤(PID)对混合物中一种或多种反应组分的影响和/或减少光学可检测的分子或部分(例如荧光部分)的闪烁或光漂白可以实现光保护的增强。在光照反应中增加SNR、增强光保护或两者可导致这些反应的性能的改善，例如改善基于荧光的单分子测序反应的准确度。

[0015] 一方面，本发明提供了包含光学可检测分子或部分和信号检测测定(SDA)增强剂的反应混合物。当本公开的SDA增强剂在光照反应中以有效量存在时，该SDA增强剂(i)增加SNR，(ii)增强光保护或两者。在照射反应混合物中，SDA增强剂可以通过增加待检测信号的亮度或强度和/或减少背景噪声来增加SNR，从而导致检测到的信号(例如，荧光)的SNR的整体提高。SDA增强剂可通过减轻PID对混合物中一种或多种反应组分的影响和/或减少光学可检测分子或部分(例如荧光部分)的闪烁或光漂白来增强光保护。在某些实施方式中，单独一种SDA增强剂既在光照反应中增加SNR又增强光保护作用。包含SDA增强剂的光照反应中信号检测的改进是基于与缺乏SDA增强剂的对照光照反应的比较。因此，本发明的反应混合物包括SDA增强剂，其在光照反应混合物时：(i)增加来自光学可检测分子或部分的光学信号(例如增加荧光标记的亮度)，(ii)减少背景噪声量，(iii)减轻PID，(iv)减少闪烁或光漂白，或其任何组合，包括(i)至(iv)的全部，否则这些现象在没有SDA增强剂时会发生。

[0016] 在某些实施方式中，光照反应中的光学可检测分子或部分是荧光或发荧光分子或部分。

[0017] 在某些实施方式中，SDA增强剂包含SDA增强部分，其中SDA增强部分包含式Ra-N＝N-Rb的偶氮基，其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中Ra包含例如共价连接的亲水部分。在某些实施方式中，Ra和Rb均包含亲水部分(相同的亲水部分或不同的亲水部分)。在某些实施方式中，Ra和Rb的芳族部分相同，而在其他实施方式中，芳族部分不同。在某些实施方式中，Ra和Rb的芳族部分选自：芳基化合物，杂环芳族化合物，多环芳族化合物及其组合。在某些实施方式中，SDA增强剂包含偶氮二芳基化合物。在某些实施方式中，SDA增强剂具有选自以下的式：

[0018]

[0019] 其中每种SDA增强剂包括至少一个R基团(R、R’、R”和R”’中的一个或多个)，并且其中至少一个R基团包含亲水部分。考虑任何亲水部分，其中在某些实施方式中，亲水部分选自：磺酸/磺酸盐/磺酸酯，羧酸/羧酸盐/羧酸酯，磷酸/磷酸盐/磷酸酯，膦酸/膦酸盐/膦酸酯，酰胺，NH2，NR””2，OH，N-磺酰基烷基，O-磺基烷基及其组合。在某些实施方式中，SDA增强剂的单个芳族基团包含多于一个亲水部分。尽管不受理论束缚，但似乎二芳基偶氮部分起到增加SNR，增强光保护作用或两者的作用。

[0020] 在某些实施方式中，亲水部分通过接头连接到SDA增强部分上。

[0021] 在某些实施方式中，SDA增强剂具有选自下表1的式：

[0022] 表1：代表性SDA增强剂

[0023]

[0024]

[0025]

[0026]

[0027]

[0028] 在一些实施方式中，包括在反应混合物中的是核苷多磷酸盐(或其类似物)和/或酶，例如聚合酶，解旋酶，外切核酸酶，核糖体或连接酶。该混合物还可以包含模板核酸分子。可以将反应混合物的至少一种组分限制在光学或结构限制内，例如零模式波导，纳米孔，微米或纳米通道等。在某些实施方式中，反应混合物的至少一种组分连接至荧光或发荧光分子。在某些具体的实施方式中，包含荧光标记的反应混合物的组分是酶，核苷酸多磷酸盐，多核苷酸，tRNA，氨基酸或其类似物。

[0029] 另一方面，本公开内容提供了用于改进光照反应中的信号检测的方法，所述方法包括获得包含SDA增强剂的反应混合物，用激发照射对反应混合物进行照射，并检测来自照射的反应混合物的信号。与不存在SDA增强剂时的相同反应混合物相比，SDA增强剂增加了SNR和/或增强了反应混合物中的光保护作用。这样，在某些实施方式中，通过将信号的亮度增加到大于不存在SNR增强剂时的信号的亮度的水平，以及/或者将背景噪声量减少到小于不存在SDA增强剂时将发生的量，将SNR增加到大于不存在SDA增强剂时的SNR的水平。在进一步的实施方式中，与不存在SDA增强剂的相同光照反应相比，SDA增强剂在光照反应中通过减轻PID对反应混合物中的组分(例如酶)的影响和/或减少荧光标记的闪烁或光漂白或两者而具有光保护活性。因此，在某些实施方式中，包含含有光保护部分的SDA增强剂可以增加光照反应的PID阈值时间段(即，在PID明显影响反应物呈现该分析无用之前光照分析可以进行的时间量)，可以从反应中收集更多的数据。在该方法是对多核苷酸进行测序的方法的情况下，SDA增强剂的SNR增强和光保护作用增加了反应的测序准确度。

[0030] 在某些实施方式中，本发明的方法还包括在照射反应混合物的同时监测酶与荧光或发荧光底物之间的反应的步骤。在一些优选的实施方式中，光照反应是碱基延伸反应，并且该酶任选的是聚合酶。这样的反应通常包括至少一个多核苷酸(例如模板)和多个核苷酸多磷酸盐。在其他优选的实施方式中，光照反应是合成多肽期间的翻译反应。这样的反应通常包括核糖体和mRNA，以及多个带有氨基酸的tRNA。优选地，反应混合物中的一种或多种组分被限制在基材上，例如在零模式波导或微流体通道内，或靠近纳米孔/在纳米孔内。

[0031] 另一方面，本发明提供了制备包含荧光化合物的荧光的光照反应混合物(例如测序或碱基延伸反应混合物)的方法。该方法包括将本文所述的SDA增强剂(参见上述SDA增强剂的描述)添加至反应混合物中，SDA增强剂包括SNR增强部分，光保护部分或两者。

[0032] 另一方面，本发明提供了用于增加光照测序反应的准确度和/或从光照测序反应获得更多的测序数据的方法。该方法包括提供包含聚合酶、模板核酸、一种或多种荧光或发荧光核苷酸或核苷酸类似物和SDA增强剂(如本文详细描述)的反应混合物。将反应混合物暴露于激发照射并检测来自反应混合物的发射信号，例如在暴露于激发照射期间监测反应混合物期间。在某些实施方式中，SDA增强剂的存在增强了荧光或发荧光核苷酸的准确检测，从而提高了所得测序反应数据的准确度。例如，SDA增强剂可以(i)减少背景噪声的量和/或增加被检测信号的强度，(ii)增强光保护，或两者，其中对光照反应的增强是与没有SDA增强剂的相同反应进行比较。在某些优选的实施方式中，光照测序反应是碱基延伸反应，例如模板介导的新生链延伸反应。任选地，反应混合物的至少一种组分(例如聚合酶或模板核酸)被限制在反应位点处，例如在零模式波导内，在纳米孔处或纳米孔近侧，或在微流体通道内。

[0033] 在某些方面，本发明提供了在光照反应中提高SNR和/或增强光保护的方法。在优选的实施方式中，该方法包括提供包含荧光或发荧光反应物和未标记反应物的反应混合物，其中未标记反应物固定在反应位点；向所述反应混合物添加SDA增强剂，其中所述SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分(如本文所述)；并用激发照射对反应混合物进行照射。在某些实施方式中，如上所述，SDA增强部分可以通过接头连接至亲水部分。SDA增强剂可以(i)将背景噪声的量降低至小于不存在SDA增强剂时将发生的量，(ii)将从反应混合物中检测到的信号的强度增加到超过在不存在SDA增强剂时将发生的水平，(iii)与没有SDA增强剂的相同反应相比，减轻由于在激发照射下未标记反应物与荧光或发荧光反应物相互作用而对未标记反应物的PID，和/或(iv)与没有SDA增强剂的相同反应相比，减少荧光反应物的荧光的闪烁或光漂白。在一些实施方式中，未标记反应物是酶，例如聚合酶，解旋酶，外切核酸酶或连接酶。在一些实施方式中，光照反应是碱基延伸或合成测序反应。在一些实施方式中，光照反应包括荧光或发荧光反应物靠近或穿过纳米孔、纳米通道或微通道的通道。在某些实施方式中，光照反应发生在受限制的反应位点中，例如在纳米孔或零模式波导附近或之内。在优选的实施方式中，荧光或发荧光反应物包含核苷多磷酸盐或其类似物。该方法还可以包括在照射反应混合物时监测荧光或发荧光反应物与未标记反应物之间的反应。

[0034] 本发明还提供了掺入SDA增强剂或其混合物以及任选的其他有用试剂的试剂盒。这样的试剂盒通常包括包装的本发明的SDA增强剂，使得所述SDA增强剂能够用于参与与一种或多种荧光或发荧光反应组分反应的各种分析反应组分中的任何一种。例如，本发明的SDA增强剂可以与参与与一种或多种荧光或发荧光底物反应的各种酶中的任一种一起包装。或者，本发明的SDA增强剂可以与参与与一种或多种荧光或发荧光抗原反应的各种抗体中的任一种一起包装，反之亦然。在另一些实施方式中，本发明的SDA增强剂可以与参与与一种或多种荧光或发荧光配体反应的各种蛋白质受体中的任一种一起包装。显然，本文所述的方法、组合物和系统可用于多种其他类型的分析反应，包括但不限于杂交测定，结合测定(例如抗体测定)，核酸测序测定，蛋白质测序测定，聚合测定，连接反应，催化反应等。取决于期望的应用，本发明的试剂盒任选地包括例如缓冲溶液和/或盐溶液，二价金属离子，++ ++ ++ ++ ++
即Mg 、Mn 、Ca 、Zn 和/或Fe ，酶辅因子，底物，标准溶液，例如用于检测器校准的染料标准物等。试剂盒可以任选地包括用于制备SDA增强剂混合物的试剂和说明书。这样的试剂盒通常还包括根据所需的应用方法(例如核酸测序等)使用化合物和其他试剂的说明。

[0035] 附图简要说明

[0036] 图1是SDA增强剂的各种通用结构的示意图。

[0037] 图2是说明与缺乏SDA增强剂的反应相比，SDA增强剂(来自表1的1号)存在下SNR增加的图。

[0038] 图3是说明与缺乏SDA增强剂的反应相比，SDA增强剂(来自表1的1号)存在下SNR增加的图。

[0039] 图4是说明与缺乏SDA增强剂的反应相比，SDA增强剂(来自表1的1号)存在下SNR增加的图。

[0040] 图5是显示在存在SDA增强剂(来自表1的1号)时信号强度增加的图。

[0041] 图6提供了显示包含SDA增强剂(来自表1的1号)的实验中的噪声降低的数据。

[0042] 图7提供了显示包含SDA增强剂(来自表1的1号)的实验中的噪声降低的数据。

[0043] 图8显示了在不存在和存在SDA增强剂(来自表1的1号)的情况下，对来自包含多种不同荧光染料的测序反应的测序读数的总体准确度度量。

[0044] 发明详述

[0045] 除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解一致。所有在本文中提到的出版物在此出于描述的目的引入本文以供参考，而所公开的在出版物中描述的装置、配方和方法可能与本文所述的发明相关使用。

[0046] 应注意到，在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”、“所述”包括复数指示物，除非上下文中有明确的另外说明。因此，例如，提到“一种聚合酶”可以指一种试剂或试剂的混合物，而提到“一种方法”可包括引用本领域技术人员已知的等价步骤和方法等。当提供一个数值范围时，应理解在本发明的范围内包括该范围上下限之间的每一个中间值，以及在该提到的范围内的任何其它所提到的或中间数值。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。所述范围包括一个或两个限值时，排除这一个或两个所包括限值的范围也包括在本发明范围中。

[0047] 在以下说明部分，陈述了大量具体细节以便更透彻地理解本发明。但是，对本领域技术人员显而易见的是，本发明可以在没有这些具体细节中的一些或更多的情况下实施。在其它情况下，为了避免混淆本发明，并没有描述本领域技术人员熟知的公知特征和方法。

[0048] I.概述

[0049] 本发明一般涉及用于改进光照反应中的信号检测测定的化合物、组合物、方法、装置和系统，所述改进通过在光照反应中(特别是在使用荧光或发荧光反应物的反应中)使用SDA增强剂(i)提高信噪比(SNR)，(ii)增强光保护，或两者来实现。荧光或发荧光反应物通常包括与荧光或发荧光分子或“标记物”连接的反应组分。此类反应组分包括但不限于酶，酶底物，辅因子，反应蛋白，结合伴侣，配体和在分析反应过程中希望检测的其他类型的分子。此外，在一些实施方式中，荧光或发荧光分子可以连接至反应位点，而不是连接至反应组分，或者连接至反应位点外还连接至少反应组分。本发明提供了用于通过以下方式改善光照反应的方法和组合物：(i)将背景噪声的量降低至小于不存在SDA增强剂时将发生的量，(ii)将从反应混合物中检测到的信号强度增加到高于不存在SDA增强剂时会发生的水平，(iii)与不含SDA增强剂的相同反应相比，减轻对未标记反应物的PID，以及/或者(iv)与没有SDA增强剂的相同反应相比，减少可检测部分的闪烁或光漂白。本文所用的术语“光照反应”指暴露于光学能源的反应。

[0050] 通常在光照反应中，提供照射以观察具有指示其存在的特定光学特征的反应物或产物的存在(例如，产生，结合，活性和/或消耗)，所述特定光学特征例如是反应混合物或其组分的吸收光谱和/或发射光谱的偏移，或例如在反应位点的荧光强度的变化。感兴趣的信号被检测到，其给出关于反应事件的信息。检测这些信息信号的能力受到同样被检测到的背景噪声量的影响。如果噪声过高，则信号会被淹没，即使有可能检测到，也非常困难。

[0051] 某些光照反应检测一种或多种荧光标记的反应物的荧光。在这种基于荧光的光学测定中检测到的荧光是存在于反应混合物中的荧光团或荧光染料中发生的三阶段过程的结果。第一阶段是激发，其中提供来自特定波长的外部光源(例如来自激光器)的具有量化能量的光子，并被荧光团吸收，产生激发的电子单重态(S1')。第二阶段是激发的荧光团经历几种不同变化以释放其能量至最低单重态(S1)的激发态寿命。在第三阶段从S1态可以发生几种可能的机理，其中发射能量光子(S1-S0)的荧光使荧光团返回到其基态。通常会发生成千上万的这些激发和发射的三阶段过程，以产生可通过标准光学传感器检测到的信号。

[0052] 耗散激发电子单重态(S1)的能量的许多途径之一是系间窜越(ISC)，其涉及自旋多重性的变化，将体系从S1过渡到激发三重态(T1)。在许多荧光染料分子中，寿命明显更长的三重态物质的形成与荧光发射竞争，大大降低了荧光发射的亮度。此外，荧光染料在该状态下表现出高度的化学反应性，这经常导致光漂白和产生有害的自由基和活性中间体，例如自由基离子，碳烯，碳阳离子，碳负离子等。此外，还有证据表明即使是S1状态的荧光团也可以与反应组分反应，例如通过介导非反应性中间体的产生负面影响分析反应。

[0053] 本发明的一个目的是提高信噪比，也称为SNR，其是将期望信号(“信号”)的水平与背景信号或“噪声”的水平进行比较的度量。它被定义为信号功率与噪声功率的比率。如果背景噪声过高，例如接近信号的水平，则信号可能无法在噪声上检测到。尽管在本领域中背景噪声有时被称为“背景信号”，但是在本文中通常将其称为“噪声”，“背景”或“基线”以将其与分析期间希望检测的信号区分开，分析期间希望检测的信号通常是提供关于分析过程信息的信号。例如，如果分析过程是测序反应，则提供关于该过程的信息的信号将包括识别被测序的模板核酸中的核苷酸的信号。类似地，如果分析过程是结合反应，则提供关于该过程信息的信号将包括指示结合事件的信号。

[0054] 在分析测定中有改善SNR的各种策略。一种提高SNR使得可以在噪声上检测到信号的方法是增加信号的亮度(通常也称为“强度”或“密度”)，但是这也会增加背景噪声。例如，如果配体用荧光染料标记并以适合于与受体结合的浓度置于反应混合物中，则自由扩散的标记配体和任何与受体结合的配体都将具有相同的标记，因此，发出相同的信号。这样，如果结合配体上标记的亮度增加，背景噪声的亮度也会增加。提高SNR的另一种方法是通过在检测参与反应事件的试剂期间从反应混合物中除去自由扩散标记试剂来减少背景。在去除不干扰配体-受体复合物的情况下，这可能是有效的，但是这种方法对于正在进行并且需要持续供应反应物的测定，例如随时间的结合和解离的动力学研究或正在进行的酶促反应(例如实时进行的合成测序反应)并不能很好地适用。增加SNR的另一种方法是通过减少整个反应混合物的照射来降低背景，即仅照射一部分反应混合物和/或将反应事件与自由扩散试剂分离。这样做时，未被照射的反应混合物部分中的标记反应物将不会影响背景噪声。例如，如果发生反应的位置(“反应位点”)处于有限的区域内，使得只有少量的反应混合物被照射，则大多数自由扩散试剂在反应事件检测期间不会被照射。反应混合物的一种或多种组分可以固定在反应位点，因此观察限于该反应位点周围的反应混合物的体积，并且观察体积外的标记反应物不可检测。这种策略的一个例子是使用零模式波导，其极大地限制了观察体积并且提供了用于单分子检测的系统。零模式波导在例如美国专利第6,917,726号，第7,013,054号，第7,170,050号，第7,315,019号，第7,486,865号，第7,907,800号和第
8,247,216号中详细描述，为了所有目的，其全部内容通过引用整体并入本文。这将有效地降低干扰信号检测的噪声，但是一些自由扩散的反应物可能仍会进入反应位点并引入一定程度的噪声。在标记配体或其他反应物浓度高的反应中，照射体积内仍可能有足够的未结合配体，从而阻碍任何结合的检测。降低标记反应物的浓度可以帮助减少背景噪声，但降低的浓度也可能对正在进行的反应产生负面影响。猝灭剂也可以用来减少背景噪声，但是它们也可以猝灭被检测的信号，从而在SNR中没有净增益或者净增益非常低。根据分析系统的具体反应条件，这些不同的策略可以独立或组合使用。

[0055] 本发明的另一个目的是通过减少反应中荧光部分的闪烁和/或光漂白和/或减轻反应组分的PID从而增加允许有效进行分析的时间量来提高光照反应分析的性能。在一些实施方式中，SDA增强剂防止、减缓或消除一种或多种反应组分的破坏性激发三重态形式的积聚。例如，在具体实施方式中，使用本发明的SDA增强剂减慢荧光团的激发三重态的积聚，例如通过减少T1寿命并将荧光团恢复到其基态(S0)(由此促进荧光团能够吸收另一个光子并再次发出荧光)，大大改善了染料的光物理性质。三重态寿命的这种减少还降低了其他反应组分将经历与三重态染料相互作用引起的光致损伤的可能性，从而基本上保护其他反应组分并且可能延长反应产生有用数据的时间。这些光保护作用导致光照反应的性能提高，包括增加合成反应如单分子测序反应的测序准确度。

[0056] 在某些实施方式中，加入光照反应的SDA增强剂同时具有SNR增强和光保护活性。

[0057] 一般来说，本发明涉及光照分析测定的性能，其中这样的测定以允许有效进行分析的方式进行。例如，分析不应该受到反应物次优浓度的阻碍。此外，指示反应进程的来自分析的信号应该容易与发自反应混合物中游离且不积极参与反应事件的反应物的背景噪声区分开来。应该理解的是，虽然这样的测定有时称为“反应”或“分析反应”，其使用包含称为“反应物”的组分的“反应混合物”进行，但这些术语不一定意味着正在发生化学反应。例如，即使结合伴侣(反应物)没有发生化学变化，结合事件也可以被认为是反应。同样，在通入或穿过微通道、纳米孔或其他受限空间期间的检测也可以称为分析反应。

[0058] 在某些方面，本发明提供了一组称为“SDA增强剂”的添加剂，其已经显示出对提高光照反应的SNR、增强光保护或两者都具有意想不到的作用。

[0059] 在某些实施方式中，这些添加剂可以降低这些反应中的背景噪声，并且还可以增加待检测信号的亮度，从而以两种不同方式提高反应的SNR。单个分子的信号增强和降噪的组合与上面讨论的传统SNR增强策略有很大不同，并且与只着重于SNR挑战的一个方面的方法相比，提供了明显的改进。由这些添加剂提供的SNR的提高允许在反应混合物中存在高浓度标记反应物的情况下更容易地检测来自反应事件的信号，由此提高反应效率以及收集和分析的反应数据的准确度。

[0060] 在分析SDA增强剂时，出乎意料地发现它们在光照反应混合物中也具有光保护活性。SDA增强剂的这种双重活性允许显著提高某些光照测定的准确度(参见下面的附加描述和实施例)。不受限于特定的操作理论或机制，相信独立或组合的几种机制是这些添加剂的有效性的基础。

[0061] 一种机制是通过SDA增强剂和自由扩散的标记反应物之间的碰撞猝灭来降低背景噪声，这导致SNR的净增加。还可以发生靠近反应位点和/或一种或多种试剂的SDA增强剂的一些局部结合。另一种机制是通过能量转移猝灭，这是一种暗猝灭机制，其中标记反应物的发射与SDA增强剂的吸收光谱之间存在足够的重叠。另一机制是通过与具有多种染料(例如FRET染料)的标记物相互作用，所述染料任选地具有多于一个供体荧光团和/或多于一个受体荧光团。与这种多染料标记物的相互作用可能导致组分染料以增加激发、转移和发射效率的构象排列。

[0062] 在另一种机制中，SDA增强剂可以起三重态猝灭剂和/或自由基猝灭剂的作用，提供明显的光保护活性，例如，防止、减缓或除去一种或多种反应组分的破坏性激发三重态形式的累积和/或减少荧光部分的闪烁或光漂白。减少激发三重态的累积降低了其他反应组分将经历由与三重态染料相互作用引起的光致损伤的可能性。该活性保护其他反应组分并延长反应产生有用数据的时间。减少闪烁和光漂白提高了荧光检测和分析，特别是在随时间监测的光照反应中，例如测序反应。

[0063] 在某些优选的实施方式中，本发明提供了一种或多种SDA增强剂，其包含SDA增强部分和亲水部分(例如，带正电荷或带负电荷的部分)，用作反应混合物中的添加剂用于光照反应。在某些实施方式中，亲水部分可以直接连接至SDA增强部分或可以通过接头连接至SDA增强部分。

[0064] 可以使用具有不同长度和化学性质的各种不同类型的接头。术语“接头”涵盖用于将一种或多种分子或化合物(例如，SDA增强部分和亲水部分)例如彼此连接，连接至反应混合物的其他组分，和/或连接至反应位点的任何部分。例如，接头可以将SDA增强剂连接至反应位点或反应；接头可以将报道分子或“标记物”(例如荧光染料)附着到反应位点或反应组分(例如酶，底物，配体，结合伴侣等)；并且接头可以将SNR增强和/或光保护部分共价连接至亲水部分以形成SDA增强剂。接头也可以是分支的，以连接反应混合物的三种或更多种组分，例如连接到三齿，四齿或更高级结构。用于选择、合成和连接接头到反应物和表面的方法是本领域普通技术人员熟知的，并且进一步的讨论和示例性接头部分见述于例如U.S.S.N.61/026,992(2008年2月7日提交)，12/367,411(2009年2月6日提交)和美国公开专利申请第2009/0233302号，为了所有目的将其公开内容通过引用整体并入本文。

[0065] 在某些实施方式中，接头是选自以下的单元：取代或未取代的烷基(例如2-5碳链)，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的环烷基和取代或未取代的杂环烷基。在一个实例中，接头部分选自直链和支链碳链，任选地包含至少一个杂原子(例如至少一个官能团，例如醚，硫醚，酰胺，磺酰胺，碳酸酯，氨基甲酸酯，脲和硫脲)，并且任选地包含至少一个芳族、杂芳族或非芳族环结构(例如环烷基，苯基)。在某些实施方式中，使用具有三功能连接能力的分子，包括但不限于：三聚氰氯，三聚氰胺，二氨基丙酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，焦谷氨酸，S-乙酰巯基琥珀酸酐，苄氧羰基赖氨酸，组氨酸，赖氨酸，丝氨酸，高丝氨酸，酪氨酸，哌啶基-1,1-氨基羧酸，二氨基苯甲酸等。在某些具体实施方式中，使用亲水性PEG(聚乙二醇)接头。

[0066] 在某些实施方式中，接头衍生自包含至少两个反应性官能团(例如每个末端上一个)的分子，并且这些反应性官能团可以与各种反应组分上的互补反应性官能团反应或用于在反应位点固定一种或多种反应组分。本文所用的“反应性官能团”是指包括但不限于以下的基团：烯烃，炔烃，醇，酚，醚，氧化物，卤化物，醛，酮，羧酸，酯，酰胺，氰酸酯，异氰酸酯，硫氰酸酯，异硫氰酸酯，胺，肼，腙，酰肼，重氮，重氮鎓，硝基，腈，硫醇，硫化物，二硫化物，亚砜，砜，磺酸，亚磺酸，缩醛，缩酮，酸酐，硫酸酯，次磺酸异腈，脒，酰亚胺，亚氨酸酯，硝酮，羟胺，肟，异羟肟酸，硫代异羟肟酸，丙二烯，原酸酯，亚硫酸酯，烯胺，炔胺，脲，假脲，氨基脲，碳二亚胺，氨基甲酸酯，亚胺，叠氮化物，偶氮化合物，氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物偶联物的那些，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，马来酰亚胺等。制备这些官能团中的每一个的方法在本领域中是众所周知的，并且其用于特定目的的应用或修改在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Sandler和Karo编辑的有机官能团制备(ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS)，Academic Press，San Diego，1989)。

[0067] 一般而言，SDA增强剂的SDA增强部分包含式Ra-N＝N-Rb的偶氮基，其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中Ra包含亲水部分。N＝N基称为偶氮基。在某些实施方式中，Ra和Rb均包含亲水部分(相同的亲水部分或不同的亲水部分)。在某些实施方式中，Ra和Rb的芳族部分相同，而在其他实施方式中，芳族部分不同。在某些实施方式中，Ra和Rb的芳族部分选自：芳基化合物，杂环芳族化合物，多环芳族化合物及其组合。在某些实施方式中，SDA增强剂包含偶氮二芳基化合物。在某些实施方式中，SDA增强剂具有选自以下的式：

[0068]

[0069] 其中，每种SDA增强剂包括至少一个R基团(R、R’、R”和R”’中的一个或多个)，并且其中R、R’、R”和R”’包含亲水部分。任何亲水部分都可以考虑。在某些优选的实施方式中，亲水部分具有负电荷。在其他实施方式中，亲水部分具有正电荷或中性电荷。在某些实施方式中，亲水部分选自：磺酸/磺酸盐/磺酸酯，羧酸/羧酸盐/羧酸酯，磷酸/磷酸盐/磷酸酯，膦酸/膦酸盐/膦酸酯，NH2，NR””2，OH，N-磺酰基烷基，O-磺基烷基，其盐以及其组合。在某些实施方式中，SDA增强剂的单个芳族基团包含多于一个亲水部分。尽管不受理论束缚，但似乎二芳基偶氮部分起到增加SNR，增强光保护作用或两者的作用，同时亲水部分增加SDA增强剂的水溶性。

[0070] 图1中显示了可用作SDA增强剂的偶氮化合物的代表性结构。这些结构并不意味着限制，而仅用于说明具有不同结构特征的SDA增强剂的实例的某些方面，例如，不同的芳族部分在不同位置上具有亲水部分。在这些结构中，SDA增强部分是偶氮连接的芳族化合物，R、R’、R”和R”’表示含有亲水部分的基团的可能位置。(第一行从左到右第二个式中的虚线框表示SDA增强部分)。如本文所讨论的，SDA增强剂具有至少一个亲水部分(即在任何一个R、R’、R”和R”’中的至少一个亲水部分)。在某些实施方式中，SDA增强剂包括另外部分(即其具有至少两个R基团)，所述另外部分可包含另一亲水部分或可包含具有不同性质或功能(例如疏水性或结合活性)的另一部分。例如，在某些实施方式中，另外的R基团(即，除含有亲水部分的第一R基团之外)包含非亲水部分，例如疏水部分，结合对的成员(例如生物素，链霉亲和素等)，或两者。非亲水部分的实例包括例如：酰胺，NO2，O-烷基，烷基及其组合。在一些情况中，另外的R基团提供额外的水溶性、亲水性和/或调整电子密度以控制或“调节”吸收光谱，例如取决于反应混合物中荧光团的发射波长。任何R基团还可以包括另外的部分，例如接头，结合对的成员，诸如生物素等，或其组合。在图1中，顶行左边第二个和第三个式分别是顶行最左边式的一个子集，其中一个R基团位于顶部芳环的4位，另一个的R基团位于顶部芳环的2位。如上所述，示例性亲水部分包含一个或多个带电荷基团，包括但不限于羧酸基团，磺酸基团，磷酸酯基团，膦酸酯基团及其盐。

[0071] 在某些具体的实施方式中，本发明的SDA增强剂是苯基偶氮苯甲酸，第二SNR增强部分是苯基偶氮苯甲酸的盐，例如苯基偶氮苯甲酸钾或苯基偶氮苯甲酸钠。

[0072] 在某些实施方式中，图1中列出的任何R基团(即，R、R’、R”和R”’中的任一个)，如果存在的话，还可以包含连接SDA增强部分与R基团(例如包含亲水部分的R基团)的接头。在某些实施方式中，接近SDA增强部分的接头末端可以包含与芳环结合的羰基，磺酰基或膦酰基。接头可以包含沿其长度的带电荷基团，并且在这种情况下将被认为是亲水部分的一部分。或者，亲水部分的带电荷部分可以在接头的一个末端连接，例如远离SDA增强部分的末端。

[0073] 在某些实施方式中，SDA增强部分的特征在于可提供SDA增强剂在反应位点附近(例如观察体积内或附近)的瞬时定位的亲脂性。在一些实施方式中，SDA增强剂位于限制的反应位点(例如零模式波导，纳米通道，纳米孔等)的表面上。SDA增强剂在反应位点附近的定位降低了来自扩散的标记反应物在它们在观察体积内扩散时的背景噪声(又称“扩散背景”)。例如，在某些实施方式中，相对亲脂的芳基偶氮苯甲酸或苯基偶氮苯甲酸或其盐(例如其钾或钠盐)用作SDA增强部分。此外，SNR增强部分的吸收波长和亲脂性可以通过芳基部分上的取代基来改变。例如，向芳基部分添加二甲基氨基使得吸收从约300nm红移至450nm，并且预计也会增加分子的亲脂性。

[0074] 在某些优选的实施方式中，亲水部分用于排斥输入的带负电荷的标记反应物并增加SDA增强剂的水溶性和亲水性。在具体的实施方式中，亲水部分包含一个或多个磺酰基，例如至少两个或三个磺酰基。磺酰基会增加标记的核苷多磷酸酯的体积及其亲水性。可以包括在亲水部分中的其他带电荷基团包括但不限于：磷酸/磷酸盐/磷酸酯基团，膦酸/膦酸盐/膦酸酯基团，羧酸/羧酸盐/羧酸酯基团等。此外，可以使用这些带电荷基团的不同盐，例如带电荷基团的钾盐或钠盐。

[0075] 在某些实施方式中，包含SDA增强部分和亲水部分的SDA增强剂可连接至另一种反应组分或连接至反应位点以使SDA增强剂空间上紧密接近承受照射的反应混合物的体积。例如，SDA增强剂可以与反应物(例如，酶的底物(例如，核酸，多肽，糖或其单体)、荧光或发荧光标记物(例如，荧光染料或量子点)、酶或其他反应蛋白或其辅助因子(例如聚合酶，连接酶，受体，抗体或核酸酶))、反应将发生的反应位点(例如，在孔、芯片、纤维、珠子、微米或纳米通道、纳米孔、光限制(例如，零模式波导(ZMW))等内)或其组合中的一种或多种连接。
(参见例如美国专利公开号20090325260，出于所有目的通过引用将其全文并入本文)。优选地，SDA增强剂不直接连接到意欲在分析反应期间被检测到的标记分子。在某些实施方式中，本发明提供了用于核酸分析的方法和组合物，其中SDA增强剂连接到与包含荧光染料的底物或配体相互作用的酶或反应蛋白。例如，在通过接头构造将这种酶或反应蛋白固定在反应位点的情况下，可以以不干扰标记反应物的检测的方式将SDA增强剂整合到接头构造的结构中，或者任选地可以在远离活性位点的位置连接至酶或反应蛋白。在其他实施方式中，SDA增强剂在溶液中是游离的，扩散到整个反应混合物中，这简化了试剂的使用，因为不需要与其他试剂、表面、接头等连接，但是可能需要更高浓度的该反应混合物中的试剂。

[0076] 在某些实施方式中，SDA增强剂选自表1中列出的化合物(即，表1中第1至28号的任何SDA增强剂)。

[0077] 本发明通常适用于涉及化学基团(例如荧光团)的光照和/或光激活转化或激发的各种光学测定中的任何一种，以检测涉及少数(例如，一种)标记反应物在许多标记反应物的背景中(例如，在溶液中游离)的特定事件。例如，本文提供的组合物和方法可以与荧光显微镜、光阱和光镊、分光光度测定、荧光相关光谱学、共聚焦显微镜、近场光学方法、荧光共振能量转移(FRET)、结构化光照显微镜，全内反射荧光显微镜(TIRF)等一起使用，所有这些都是本领域技术人员常规使用的公知技术。

[0078] 虽然在本文所述的实施例中使用花青染料3.5和5，但使用SDA增强剂不限于这些染料。其他花青染料也可以考虑用于本文提供的SNR增强剂，例如Cy2，Cy3，Cy3B，Cy5.5和Cy7。此外，还可以考虑本领域众所周知的其它类型的染料，包括但不限于：香豆素染料，来自例如GE医疗集团(GE Healthcare)的基于罗丹明和荧光素的染料和可购自生命技术公司(Life Technologies，Inc)的染料。本领域先前已经描述了各种各样的有机染料结构。

[0079] 特别适合于从本发明受益的测定的一个例子是单分子生物测定，其中尤其包括单分子核酸测序测定，单分子酶测定，杂交或结合测定(例如抗体测定)，核酸杂交测定，核酸测序测定，蛋白质测序测定，聚合测定，连接反应，催化反应，小体积(例如微流体通道或纳米孔等)内的反应物的检测，其中主要进口的试剂经历照射并在包含大量标记试剂的反应混合物内光学观察。在某些实施方式中，所述方法、组合物和系统用于依赖荧光或发荧光试剂(例如染料标记的核苷酸或其类似物)的检测的核酸测序过程。此类核酸测序技术的实例包括例如核酸测序(描述于例如美国专利号6,399,335，6,056,661，7,052,847，7,033,764，7,056,676，7,361,466，7,416,844；美国专利公布号20100311061；以及在Eid等人(2009)Science323:133-138，其全部公开内容通过引用以其整体结合于此以用于所有目的)，非实时或“一次一个碱基”测序方法，可得自例如亿明达公司(Illumina,Inc,San Diego,CA)和螺旋生物科学公司(Helicos BioSciences，Cambridge,MA)，克隆单分子阵列TM，利用光学可检测标记物的纳米孔测序(吉尼亚技术公司(Genia Technologies)(罗氏测序(Roche Sequencing)的一部分)和牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore,Oxford，UK))，以及SOLiDTM测序(生命技术公司(Life Technologies))。用于单分子蛋白质测序的方法在例如美国专利公开号20100317116中提供，其出于所有目的通过引用整体并入本文。

[0080] 在SDA增强剂同时具有SNR增强和光保护活性的实施方式中，在反应混合物中不存在另外的SNR和/或光保护添加剂。

[0081] 在其他实施方式中，例如在SDA增强剂主要具有SNR增强活性的情况下，一种或多种光致损伤减轻剂(例如还原剂，氧化剂，三重态猝灭剂，自由基猝灭剂，氧清除剂和/或其组合)可与本文提供的SDA增强剂一起包括在光照反应中。在美国专利公开号2007/0128133、2007/0161017、2010/0136592和2015/0079603中提供了光致损伤减轻剂的某些实例，出于所有目的，这些专利文献的全部内容通过引用整体并入本文。此外，还原和氧化系统(ROXS)可以有效地最大程度减少荧光染料的光漂白和闪烁。(Agnew.Chem.Int.Ed,2008,
47,5465-5469,出于所有目的通过引用整体并入本文)。这种光漂白和闪烁会不利地影响染料发射的可检测性，因此存在ROXS至少可以通过减少这些光化学现象来促进检测。通常，ROXS是多组分体系，例如包含一对TSQ试剂，其包含还原剂和氧化剂，其可协同工作以加速染料从其三重态到其基态的弛豫。这样的体系的例子包括甲基紫精和抗坏血酸的混合物；
硝基苯甲酸或其盐和巯基乙胺的组合，例如2-巯基乙胺HCL和2-，3-和/或4-硝基苯甲酸钠；
以及硝基苯甲酸或其盐(如2-硝基苯甲酸钾)和其他还原剂如DTT(二硫苏糖醇)或DMAPA(二甲基氨基丙胺)的混合物。将这些试剂加入光照反应中可以用于减轻对其他反应物(例如酶)的光致损伤，并且还改善其他反应指标。在某些实施方式中，可将单分子ROX化合物与本文提供的SNR增强剂组合加入到分析反应中。某些优选的单分子ROX化合物在美国专利申请公开号2015/0079603中有详细描述，出于所有目的通过引用将其全部内容并入本文。

[0082] 本文中的SDA增强剂还可以与用于提高分析数据中的SNR的其他策略组合使用，所述策略包括但不限于通过使用更亮的荧光团来提高信号强度，将反应事件从大部分反应混合物中分离出来，仅照射小体积的包含反应位点的反应混合物，在反应位点固定一种或多种试剂，调节反应混合物中标记的反应物的浓度，添加一种或多种猝灭剂，或它们的组合。

[0083] II.改善光照分析中的信号检测

[0084] 本发明的某些方面通常涉及在光照分析期间增加SNR，增加光保护，或两者。术语“光照分析”和“光照反应”可以互换使用，通常指在照射下(例如用激发辐射)发生的分析反应，从而评估发光(例如荧光或发荧光)反应物和/或产物的产生、消耗和/或转化。本文所用术语“反应物”和“试剂”可以互换使用。在某些优选的实施方式中，光照反应是测序反应，并且由于在反应混合物中存在大量荧光标记的核苷多磷酸盐而直接或间接地导致次优SNR，光保护或两者。在其他实施方式中，光照反应是多肽测序反应、结合测定或杂交测定，并且由于在反应混合物中分别存在大量荧光标记的tRNA或氨基酸、结合伴侣(例如抗体，抗原，配体，受体等)或核酸而导致次优SNR，光保护或两者。

[0085] 在本发明的一个方面中，本文描述的SDA增强剂特别适用于提高小反应体积浓度的反应的SNR，增强其光保护作用或两者，其中可能存在一些反应物，但是浓度非常有限。如本文通常所提到的，这种有限量的试剂或反应物可存在于溶液中，但其浓度非常有限，例如小于200nM，在一些情况下小于10nM，或在另一些情况下，小于10pM。然而，在优选的方面中，这种有限量的试剂或反应物是指被固定或以其他方式限制在给定区域内(反应位点，例如在限定范围内，例如在孔、纳米通道或微通道或零模式波导内)的反应物，从而在该给定区域中提供有限量的试剂，并且在某些情况下，在该给定区域内提供少量这种试剂的分子，例如1至1000个单独的分子，优选1至10个分子。

[0086] 在本发明的某些方面，对于具有高浓度标记反应物(例如至少50、100、150、200、250、300、350、400、450或500nM的标记反应物或多种标记反应物中的每一种)的反应混合物中的反应，本文所述的SDA增强剂特别适用于提高SNR，增强光保护作用或两者。

[0087] 在本发明的其它方面，对于具有极小观察体积的反应混合物中的反应(例如总反应体积大得多的情形)，本文描述的SDA增强剂特别适用于提高SNR，增强光保护作用或两者。例如，观察体积优选不超过1纳升、皮升、飞升、阿托升(attoliter)或仄普托升(zeptoliter)。在某些优选的实施方式中，观察体积小于一阿托升且大于一仄普托升。

[0088] 在某些实施方式中，本文所述的SDA增强剂通过将背景噪声降低至少5％，包括至少10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％来增加分析反应的SNR。在另一些实施方式中，本文所述的SNR增强剂通过将信号增加至少5％，包括至少10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％来增加分析反应的SNR。在优选的实施方式中，本文所述的SDA增强剂通过同时降低噪声和增加信号来增加分析反应的SNR。在某些实施方式中，增加的信号具有可见光谱中的波长，优选大于300、400、500、550、600或650nm。这些实施方式在本文的实例中进一步描述。

[0089] 光致损伤实质上影响反应物以致于分析无用(例如，当反应过早终止时)之前可以进行的光照分析的时间量称为“光致损伤阈值期”。光致损伤阈值期是测定依赖性的，并且受到各种因素的影响，所述因素包括但不限于测定中反应物(例如，酶，底物，结合伴侣等)的特征(例如，对光致损伤的敏感性和这种损伤对酶活性/持续性的影响)，辐射源的特性(例如波长，强度)，信号生成分子的特性(例如发射类型，对光致损伤的敏感性，进入三重态的倾向性，以及这种损伤对信号的亮度/持续时间的影响)以及测定中其他组分的类似特征。该特征还依赖于测定系统的各种组成部分，例如信号传输和检测，数据收集和分析程序等。普通技术人员完全有能力确定给定测定的可接受的光致损伤阈值期，例如通过监测在存在光损伤剂的情况下测定的信号衰减以及确认信号对于测定来说是可靠测量的时间段来确定该光致损伤阈值期，并且这样的分析可以任选地包括时程反应，滴定等。在本发明的某些优选实施方式中，光致损伤阈值期是光照分析期，在此期间发生这种光致损伤，以致于主题反应的速率、持续性、保真度、产物形成或错误频率与不存在这种光照的相同反应相比下降不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。对主题反应的这种影响通常是由于对一种或多种反应组分的直接或间接损害，特别感兴趣的是以限制量存在的那些，例如低浓度。例如，某些单分子反应包含在给定反应位点作为单分子存在的固定的反应物。尽管溶液中的其他反应物可以扩散进出反应位点，但这种固定的反应物在反应混合物中不是“可交换的”。因此，对这些固定的反应物的损害通常对给定反应位点处的主题反应有害，并且甚至可能导致在反应位点处监测的单一反应的提前终止。

[0090] 在某些实施方式中，本发明提供SDA增强剂，其在存在时增加光照反应中的光致损伤阈值期，从而增加反应进行到完成的时间量，同时对反应物的损害最小，从而延长可检测信号是反应进程的准确度量的时间。具体而言，其目的是减少对限制浓度的反应物的损害，例如固定的反应物，特别是在反应位点作为单一分子存在的反应物。

[0091] 在一些情况下，包含一种或多种已经受到光致损伤的组分的反应可能会产生假性活性，因此比期望的更具活性。在这种情况下，可以理解的是，感兴趣的光致损伤阈值期的特征在于光照分析期，在此期间这样的假性活性(例如通过反应速率的增加或者非特异性反应速率的增加测得的)与非光照反应相比不超过10％，与非光照反应相比不超过20％，与非光照反应相比不超过50％，并且在一些情况下与非光照反应相比不超过90％。在一个非限制性例子中，当由于光损伤事件核酸聚合酶开始不正确地在模板介导的合成过程中掺入核苷酸(或其类似物或衍生物)时，这种活性会影响上述的光致损伤阈值期。在这种情况下，本发明的SDA增强剂和方法将提高光致损伤阈值期，从而增加在上述假性活性发生前反应能够被照射的时间量。

[0092] 对于核酸分析来说，已经观察到用荧光核苷酸类似物作为底物的核酸模板介导的合成中，延长光照会导致聚合酶合成DNA新生链的能力明显下降，如之前在例如美国公开专利申请号2007/0161017中所述，其在此出于任何目的完整引入以供参考。对聚合酶、模板序列和/或引物序列的损伤会显著阻碍聚合酶处理较长核酸链的能力。例如，聚合酶处理能力的下降导致基于序列成分掺入新生链对其进行鉴定的测序过程读取长度的缩短。如基因分析领域所理解的，序列连续读取的长度直接影响由基因组DNA的片段装配基因组信息的能力。除了测序反应外，酶活性的这种下降还会对许多不同类型的反应产生显著影响，例如连接、切割、消化、磷酸化、其它类型的聚合等。

[0093] 试图通过本发明的方法和组合物预防的光致损伤不仅是对荧光试剂的光致损害，例如光漂白，而且还涉及预防或减少这种荧光试剂的光活化的下游效应，例如在与其他试剂相互作用或接近其他试剂的过程中，特别是所述其他试剂是在反应混合物中有限量的那些，因此，即使由于光致损害引起的轻微损失，它们的有限存在也受到很大的影响。例如，并且不受操作理论的束缚，对反应蛋白、酶或其他反应物的光致损害可能包括对反应物的损害或这些反应物与光致损伤试剂之间的不可逆相互作用。这种相互作用可以是共价或非共价相互作用，结合相互作用，瞬时相互作用，催化相互作用等。如上所提到的，光致损伤一般指给定试剂、反应物等中由于光诱导反应直接或间接造成的改变，其导致试剂在所需反应中的功能性改变，例如活性下降，特异性降低，或与其它分子反应、被其它分子转换或修饰的能力降低，例如，光诱导反应产生与一种或多种其它反应物相互作用并导致其损伤的反应物。通常，这种光反应直接影响感兴趣的反应物，例如直接光致损伤，或影响这种感兴趣反应物的一个、两个或三个反应步骤内的反应物。另外，这种光反应可直接影响感兴趣的反应，例如导致反应的速率、持续时间、处理能力、产物形成或可靠性改变。

[0094] 一般来说，本文所述的SDA增强剂以足以提供有益影响(例如，增加SNR(降低噪声和/或增加光学信号)和/或提供增强的光保护)的含量存在于反应混合物中，但是其含量不能明显干扰感兴趣的反应，例如测序反应。在某些优选的实施方式中，SDA增强剂在反应混合物中的浓度为例如10mM或更低，8mM或更低，6mM或更低，4mM或更低，2mM或更低，1mM或更低，900μM或更低，500μM或更低，200μM或更低，或100μM或更低。在一些优选的实施方式中，在反应混合物中SNR增强剂的浓度为约300μM至1mM，例如300μM，400μM，500μM，600μM，700μM，800μM，900μM或1mM。然而，这些浓度仅仅是示例性的并且可以根据各种因素进行改变，这些因素包括例如反应中存在的特定荧光或发荧光标记，添加该荧光或发荧光标记的反应类型，进行这种反应的条件，等等。这种调整完全在普通技术人员的能力范围内。

[0095] 存在于光照反应中的SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分(如上所述)。简而言之，在某些实施方式中，SDA增强剂包含SDA增强部分，其中SDA增强部分包含式Ra-N＝N-Rb的偶氮基，其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中Ra包含亲水部分。N＝N基称为偶氮基。在某些实施方式中，Ra和Rb均包含亲水部分(相同的亲水部分或不同的亲水部分)。在某些实施方式中，Ra和Rb的芳族部分相同，而在其他实施方式中，芳族部分不同。在某些实施方式中，Ra和Rb的芳族部分选自：芳基化合物，杂环芳族化合物，多环芳族化合物及其组合。在某些实施方式中，SDA增强剂包含偶氮二芳基化合物。在某些实施方式中，SDA增强剂具有选自以下的式：

[0096]

[0097] 其中，每种SDA增强剂包括至少一个R基团(R、R’、R”和R”’中的一个或多个)，并且其中R、R’、R”和R”’包含亲水部分。任何亲水部分都可以考虑。在某些优选的实施方式中，亲水部分具有负电荷。在其他实施方式中，亲水部分具有正电荷或中性电荷。在某些实施方式中，亲水部分选自：磺酸/磺酸盐/磺酸酯，羧酸/羧酸盐/羧酸酯，磷酸/磷酸盐/磷酸酯，膦酸/膦酸盐/膦酸酯，NH2，NR””2，OH，N-磺酰基烷基，O-磺基烷基，其盐以及其组合。在某些实施方式中，SDA增强剂的单个芳族基团包含多于一个亲水部分。尽管不受理论束缚，但似乎二芳基偶氮部分起到增加SNR，增强光保护作用或两者的作用，同时亲水部分增加SDA增强剂的水溶性。

[0098] 本发明的SNR增强剂包括但不限于选自表1中列出的化合物(即，SDA增强剂编号1至28)的化学式的化合物。

[0099] 任选地，所述方法还包括将反应混合物的至少一种组分限制在基材上，例如限制在包含一个或多个零模式波导的基材上。

[0100] 由于包含一种或多种SDA增强剂或用一种或多种SDA增强剂进行处理而得到SNR或光保护增加的测量可以以适于正在进行的测定的任何方式来表征。

[0101] 例如，增加的SNR可以表征为提供以下情况中的至少一种：信号亮度相对于在未处理反应中检测到的亮度增加，和使噪声低于在未处理反应中检测到的噪声的背景噪声降低。优选SDA增强剂的特征在于同时增加信号和减少背景。此外，SNR增加的表征通常利用在反应过程中信号亮度和基线噪声的测量，并将包含SDA增强剂的反应中观察到的信噪比与缺乏SDA增强剂的对照反应混合物中观察到的信噪比进行比较。这些分析通常涉及完善的实验室方法，如时程反应，滴定等。

[0102] 在本发明的情况下，包含增加SNR的本发明SDA增强剂通常导致与缺乏SDA增强剂的反应相比，SNR增加超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。在本发明的情况下，包含增加SNR的本发明SDA增强剂通常导致与缺乏SDA增强剂的反应相比，亮度增加超过5％、10％、15％、20％、25％或30％。在本发明的情况下，包含增加SNR的本发明SDA增强剂通常导致与缺乏SDA增强剂的反应相比，背景噪声下降超过5％、10％、15％、20％或25％。

[0103] 由于包含一种或多种具有光保护活性的SDA增强剂或用一种或多种具有光保护活性的SDA增强剂进行处理而导致的光致损伤降低的测量可以表征为提供光致损伤水平相比缺乏SDA增强剂的对照反应降低。此外，表征光致损伤的减少通常利用例如酶活性的反应速率、持续时间、处理能力、产物形成或可靠性的测量，和/或经过处理的反应混合物与未处理的反应混合物之间光致损伤阈值期的比较。这些分析通常涉及完善的实验室方法，如时程反应，滴定等。

[0104] 在本发明的情况下，包含具有光保护活性的本发明SDA增强剂通常导致在给定反应中一种或多种反应物的光致损伤的减少，如按照系统中“防止的反应性损失”所测定的。使用本领域已知的方法，防止的活性损失的量可以是反应性损失减少至少10％，优选大于
20％、30％、或40％和更优选至少50％，而且在许多情况下大于90％，并且反应性损失的减少可以最高达99％或超过99％。为了说明和纯粹是举例目的，当用光致损伤的减少作为存在和不存在本发明的具有光保护活性的SDA增强剂下酶活性的量度时，如果一个反应包括具有100单位酶活性的反应混合物，其在无SDA增强剂的情况下，在光照分析后，将产生仅具有50单位活性的反应混合物，则光致损伤中10％的减少将产生具有55单位的最终反应混合物(例如本来会损失的50单位的10％将不再损失)。类似地，可以根据给定分析反应的反应速率、产物形成、处理能力、可靠性和其他度量来计算“防止的反应性损失”。SDA增强剂的光保护活性还可以增加光照反应中的光信号的亮度和/或改善光信号的检测特性(如上所述)。

[0105] 通过包含本发明的SDA增强剂提供的信号检测方面的改进可用于增强许多不同的信号检测分析。例如，SDA增强剂的增加SNR和/或增强光保护的效应可直接导致测序反应的准确度增加，例如单分子测序反应，例如，如在太平洋生物科学股份有限公司(Pacific Biosciences,Menlo Park CA)的测序平台上实施的。与缺乏SDA增强剂的对照测序反应相比，准确度的提高可以最高达15％，例如1％，2％，3％，4％，5％，7％，10％，12％，15％以及其间的任何值。

[0106] 根据本发明，SDA增强剂通常可作为反应混合物的组分提供，或者通过作为液体或固体添加剂添加，并且可以预置和/或固定在反应发生的区域内，或者可以以允许它们自由地与水性体系组分相互作用的形式提供，具体是通过将这些试剂包含在一定结构内或连接到该结构(例如笼蔽基团，三齿结构等)，使得试剂悬浮在水性体系中并且另外可用于与反应混合物的相关部分(例如标记反应物)相互作用。举例来说，在感兴趣的反应局限于特定区域或位置的情况下，可能需要将SDA增强剂固定或以其他方式定位在该区域内或其附近，例如在基材或反应井的表面上。

[0107] 如本文所使用的，基材可以包括各种形式中的任一种，包括平面基材，例如玻璃载玻片或较大结构内的平面表面，所述较大结构例如多孔板(诸如96孔，384孔和1536孔板)，或规则间隔的微米或纳米多孔基材(例如，零模式波导的阵列)。此类基材还可以包含更多不规则多孔材料，例如膜，气凝胶，纤维垫等，或者它们可以包括颗粒基材，例如珠粒，球体，金属或半导体纳米粒子，光纤等。

[0108] 在某些实施方式中，本文提供的化合物可以彼此组合使用，以及/或者与各种还原剂、抗褪色剂、自由基猝灭剂/清除剂、氧清除剂、单重态氧猝灭剂、光保护化合物和/或三重态猝灭剂(例如6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)组合使用，包括例如在美国专利公开号2007/0161017和2010/0136592中提供的那些，该文献通过引用结合于此，该文献提供的方法可减轻光致损害对给定分析操作结果的影响，可与本文提供的化合物和方法一起使用。这些化合物的添加在光学反应探询中是特别有用的，其中易受光致损伤影响的反应组分通过存在结构限制、光学限制和/或通过组分的固定而被空间限制在测定板或基材上。这些受限制的试剂的例子包括表面固定或局部化的试剂，例如表面固定或关联的酶、受体、抗体等，所述试剂例如通过荧光扫描显微镜或扫描共焦显微镜、全内反射显微镜或荧光测定法、表面成像等在表面上被探询。

[0109] 除了前述之外，应该理解的是，给定的感兴趣反应中的其他试剂可以以各种不同构型中的任何一种提供。例如，它们可以游离在溶液中提供，或与其他材料例如其他试剂和/或固体载体复合。同样地，可以将这些试剂与珠粒、颗粒、纳米晶体或其他纳米颗粒偶联提供，或者可以将它们束缚在较大的固体载体，例如基质或平面表面。这些试剂可以与其他试剂进一步偶联或复合在一起，或者作为单独的试剂群，或者甚至作为单独的分子，例如与反应空间内的其他分子可检测地拆分。无论特定的试剂由于其自由移动的结构障碍而被限制，还是被化学地束缚或固定到基材的表面，都将其理解为被限制。例如，在一些优选的实施方式中，测定系统中的一种或多种试剂被限制在空间限制内，所述空间限制可以是内反射限制(IRC)或外反射限制(ERC)，零模式波导，纳米孔，微通道或纳米通道，或替代结构，例如包含具有折射率介质的多孔膜或使用折射率匹配固体的限制的结构。在例如国际申请公开号WO/2006/083751，美国专利号6,917,726和美国专利号7,170,050中提供了对各种类型的限制的更详细的描述，所述专利文献的全部公开内容以引用的方式整体并入本文中用于所有目的。

[0110] III.示例性应用

[0111] 如上所述，本发明的方法和组合物可用于宽范围的光照分析反应，特别是那些使用光致发光或荧光反应物的光照分析反应，特别是那些标记试剂浓度高到足以产生足够的背景噪声而干扰反应过程中信息信号的检测的反应。本文所述的方法和组合物的一个示例性应用是在单分子分析反应中，其中在分析中观察单分子(或非常有限数量的分子)的反应，例如观察单个酶、受体或抗体分子的作用。已经显示本文提供的SDA增强剂具有以下方面：(i)通过既降低背景噪声又增加信号来增加SNR，这改善了信号的检测，和/或(ii)提供光保护活性。这样做时，本发明的SDA增强剂提高了所收集数据的准确度和/或数量。

[0112] 在一个示例性实施方式中，本文提供的SDA增强剂用于单分子分析的光照反应，包括通过在模板介导的聚合酶基合成期间观察核苷酸或核苷酸类似物结合到新生核酸序列中来对核酸进行测序。通常称为“通过结合进行测序(sequencing-by-incorporation)”的此类方法通常涉及对以模板依赖性方式添加核苷酸或核苷酸类似物的观察以确定模板链的序列。参见例如美国专利号6,780,591、7,037,687、7,344,865、7,302,146；美国专利公开号20100075327和20070036511；2010年4月26日提交的美国专利申请号12/767,673；2009年12月10日提交的美国专利申请号12/635,618；和Eid等人(2009)Science 323：133-138，为了所有目的，其全部内容通过引用整体并入本文。进行这种检测的方法通常包括在限定的观察区内，例如纳米级孔内和/或直接或间接束缚在表面上，使用荧光标记的核苷酸类似物。通过使用激发照射(即，合适波长的照射以激发荧光标记物并诱导可检测信号)，荧光标记的碱基可以在其结合到新生链中时被检测，从而鉴定结合的碱基的性质，进而鉴定模板链中的互补碱基。应该理解的是，通过使用本文提供的方法、组合物和系统，许多不同种类的反应也可以受益，例如，包括在美国专利申请号12/813,968和12/814,075中描述的那些反应，这两篇专利文献均于2010年6月11日提交，为了所有目的通过引用整体并入本文。

[0113] 本发明的一个特别优选的方面是与通过将核酸结合到结构或光学限制(例如微通道或纳米通道，纳米孔或零模式波导)内进行的测序相结合。这样的反应包括观察极小的反应体积，其中可以存在一个或仅有少数聚合酶及其荧光底物。在美国专利号6,917,726和7,033,764中总体描述了零模式波导及其在测序应用中的用途，在公开的美国专利申请号
2003/0044781中总体描述了通过结合进行测序的优选方法，这些专利文献的全部公开内容是出于所有目的通过引用整体并入本文，并且尤其是关于这些测序应用和方法的教导。简而言之，根据本发明配置的零模式波导(“ZMW”)阵列可以用作单分子分析反应的光学限制，例如用于核酸(例如DNA，RNA)序列测定。特别是，如上所述，这些ZMW在透明基材表面(也被称为ZMW的“基底”)处或附近提供极小的观察体积。然后可以在合成过程中特异性地观察固定在ZMW基底的核酸合成复合物，例如模板序列，聚合酶和引物，从而监测以模板依赖性方式结合的核苷酸或核苷酸类似物，由此提供模板链中的核苷酸或核苷酸类似物的识别和序列。这种识别通常通过在核苷酸或核苷酸类似物上提供可检测的标记基团(例如荧光标记分子)来完成。在测序(太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences))中，反应混合物中的核苷多磷酸盐通过与多磷酸盐尾部结合的接头与荧光染料连接。这样，当碱基结合到新生核酸链中时，标记物与多磷酸盐(不包括α磷酸盐)和接头一起释放。

[0114] 根据本发明，上述测序反应可以在本文提供的一种或多种SDA增强剂存在下进行，其单独使用或与其他反应混合物添加剂如还原剂、抗褪色剂、自由基猝灭剂、三重态猝灭剂、单重态氧猝灭剂或用于耗尽氧物质的酶体系(例如包含氧化酶)组合使用。

[0115] 应理解上述说明是示例性的而非限制性的。对本领域的普通技术人员而言，显而易见的是，可以对该申请中公开的本发明进行各种实施方式和修改而不会偏离本发明的范围和精神。例如，在某些实施方案中，各种光致损伤减轻剂和体系可以在单一反应混合物内组合，特别是其作用模式彼此不同和/或互补的情况下。因此，本发明的范围不应参照以上的说明决定，而应参照所附权利要求以及该权利要求所确定等同方案的全部范围决定。为了描述和公开可结合本发明使用的试剂，方法和概念，引用本文提及的所有出版物。本文中没有应被认为是承认这些文献是本文所述的发明的现有技术。在公开内容中，引用了各种专利、专利申请和出版物。除非另外说明，每篇都完整引入出于全部目的以供参考。

[0116] IV.实施方式

[0117] 本公开的方面包括以下非限制性实施方式。

[0118] 1.一种改进信号检测测定的方法，该方法包括：提供包含荧光或发荧光反应物和未标记的反应物的反应混合物；向所述反应混合物中添加信号检测测定(SDA)增强剂，其中所述SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分，其中所述SDA增强部分包含下式的偶氮基团：Ra-N＝N-Rb，其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中亲水部分与Ra共价连接；用激发照射对反应混合物进行光照；检测来自光照反应的发射信号，其中与不存在SDA增强剂的光照反应混合物相比，SDA增强剂导致信噪比(SNR)增加，光保护增强，或两者。

[0119] 2.如实施方式1所述的方法，其中未标记的反应物被固定在反应位点。

[0120] 3.如实施方式2所述的方法，其中，所述反应位点在零模式波导内。

[0121] 4.如实施方式1-3中任一实施方式所述的方法，该方法还包括在照射反应混合物时监测荧光或发荧光反应物与未标记反应物之间的反应的步骤。

[0122] 5.如实施方式1-4中任一实施方式所述的方法，其中所述光照反应是碱基延伸反应。

[0123] 6.如实施方式1-5中任一实施方式所述的方法，其中，未标记的反应物是酶。

[0124] 7.如实施方式6所述的方法，其中，酶是聚合酶、解旋酶、外切核酸酶、核糖体或连接酶。

[0125] 8.如实施方式1-7中任一方面所述的方法，其中，反应混合物还包含模板核酸分子。

[0126] 9.如实施方式1-8中任一实施方式所述的方法，其中，荧光或发荧光底物包含核苷多磷酸盐或其类似物。

[0127] 10.如实施方式1-9中任一实施方式所述的方法，其中，Ra和Rb的芳族部分相同。

[0128] 11.如实施方式1-9中任一实施方式所述的方法，其中，Ra和Rb的芳族部分不同。

[0129] 12.如实施方式1-11中任一实施方式所述的方法，其中，Ra和Rb的芳族部分选自：芳基化合物，杂环芳族化合物，多环芳族化合物及其组合。

[0130] 13.如实施方式1-12中任一实施方式所述的方法，其中，SDA增强剂包括：偶氮二芳基化合物。

[0131] 14.如实施方式1-13中任一实施方式所述的方法，其中，SDA增强剂具有选自下组的式：

[0132]其中，各式包括至少一个包含亲水部分的R基团。

[0133] 15.如实施方式1-14中任一实施方式所述的方法，其中，亲水部分包括：磺酰基，磺酸/磺酸盐/磺酸酯基，羧酸/羧酸盐/羧酸酯基，磷酸/磷酸盐/磷酸酯基，膦酸/膦酸盐/膦酸酯基，NH2，NR””2，OH，N-磺酰基烷基，O-磺基烷基，其盐以及其组合。

[0134] 16.如实施方式15所述的方法，其中，亲水部分包含至少一个磺酰基。

[0135] 17.如实施方式1-16中任一实施方式所述的方法，其中，SNR增强部分还包含将SNR增强部分与亲水部分连接的接头。

[0136] 18.如实施方式17所述的方法，其中，接头包括至少两个碳的烷基链。

[0137] 19.如实施方式17所述的方法，其中，接头包括聚乙二醇链。

[0138] 20.如实施方式1-19中任一实施方式所述的方法，其中，SDA增强剂选自下组：

[0139]

[0140]

[0141]

[0142] 21.如实施方式1-20中任一实施方式所述的方法，其中，SDA增强剂导致以下任何结果或它们的组合：(i)增加光学信号，(ii)降低背景噪声，(iii)减轻对未标记的反应物的光致损伤(PID)，和(iv)减少荧光或发荧光反应物的闪烁或光漂白，其中(i)至(iv)是与不存在SDA增强剂的光照反应混合物相比较的。

[0143] 22.如实施方式1至21中任一实施方式的方法，其中，与不存在SDA增强剂的光照反应混合物相比，SDA增强剂导致SNR增加和光保护增强。

[0144] 23.如实施方式1至22中任一实施方式的方法，其中，信号检测测定是光照测序反应，该测序反应的准确度与不存在SDA增强剂的光照测序反应相比得到增加。

[0145] 24.如实施方式23所述的方法，其中，反应混合物包含：聚合酶，模板核酸，以及荧光或发荧光核苷酸或核苷酸类似物。

[0146] 25.如实施方式24所述的方法，该方法还包括在照射反应混合物时监测聚合酶与荧光或发荧光核苷酸或核苷酸类似物之间的反应的步骤。

[0147] 26.如实施方式24或25中任一实施方式所述的方法，其中，光照测序反应是碱基延伸反应。

[0148] 27.如实施方式24-26中任一实施方式所述的方法，其中，所述聚合酶被限制在零模式波导内。

[0149] 28.一种反应混合物，其包含：荧光或发荧光反应物；未标记的反应物；和信号检测测定(SDA)增强剂，该SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分，其中SDA增强部分包含式Ra-N＝N-Rb的偶氮基，其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中亲水部分与Ra共价连接。

[0150] 29.如实施方式28所述的反应混合物，其中，荧光反应物的荧光包含一种或多种标记的核苷酸多磷酸盐，未标记的反应物包含聚合酶，SDA增强剂选自表1。

[0151] 30.一种试剂盒，其包含：荧光或发荧光反应物；未标记的反应物；和信号检测测定(SDA)增强剂，该SDA增强剂包含SDA增强部分和亲水部分，其中SDA增强部分包含式Ra-N＝N-Rb的偶氮基，其中Ra和Rb均包含芳族部分，并且其中亲水部分与Ra共价连接。

[0152] 31.如实施方式30所述的试剂盒，其中，荧光反应物的荧光包含一种或多种标记的核苷酸多磷酸盐，未标记的反应物包含聚合酶，SDA增强剂选自表1。

[0153] V.实施例

[0154] SDA增强剂存在下的测序性能

[0155] 根据制造商的10分钟视频的说明，使用 SequelTM测序仪器(太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences，Menlo Park，CA))进行实验。使用测序法对小模板核酸(～300bp SMRTbellTM模板)进行测序，该测序是单分子实时测序方法，其中测序读数通过在单模板分子上执行通过合成进行测序的反应并观察碱基结合来产生。反应中的核苷酸具有与磷酸盐尾部连接的荧光标记物，使得在结合碱基后，标记物与多磷酸盐一起释放。反应中核苷酸上的标记物如下：花青3.5标记的脱氧胸苷(Cy3.5-dT)；花青5-标记的脱氧腺苷(Cy5-dA)；花青3.5标记的脱氧鸟苷(Cy3.5-dG)；和花青5-标记的脱氧胞苷(Cy5-dC)。从用相同标记物标记的核苷酸发射的荧光水平在数量上是不同的，因此可以在反应中彼此区分。因此，在光照反应期间从Cy3.5-dT和Cy3.5-dG发射的荧光水平的区别足以在测序反应中区分它们，对于Cy5-dA和Cy5-dC也是如此。应注意，可以使用不同的标记物(即，不同于花青3.5和花青5)和/或不同的标记配置。因此该测定配置不意味着限制，可以改变并包括花青染料3.5和5。每种染料的荧光特征(波长，强度等)对于一种特定的脱氧核苷酸是独特的，因此可以进行分析以在其结合到增长的核酸链中时积极地识别。虽然只有非常小体积的反应混合物被照射，但是聚合酶活性所需的相对高浓度的核苷酸导致背景噪声，这会干扰结合事件的检测。发现添加SDA增强剂可提高测序反应的SNR和准确度。我们之前已经表明三重态猝灭剂是提供反应组分光稳定性所需要的，但是出乎意料的是，即使没有已知的三重态猝灭剂，仍然保持这种准确度增加(见下文)。因此，SDA增强剂不仅提高了SNR，而且为这些反应提供了意想不到的光保护功能。即使在不存在单独的光保护剂(例如三重态猝灭剂)的情况下，这种双重活性导致更好的结合检测和更准确的序列读数。

[0156] 实施例1:同时具有增加SNR的活性和光保护活性的SDA增强剂。

[0157] 图2-4显示包含表1的1号SDA增强剂的测序反应和缺乏SDA增强剂的完全相同的测序反应之间的SNR差异。1号SDA增强剂的结构式如下：

[0158]

[0159] 用于图2中SNR图的荧光团是Cy3.5-dT。观察到SNR增加约25％。图3显示了Cy3.5-dG的结果，表明存在该SDA增强剂时SNR增加约14％。图4提供了测序反应中Cy5-dC的SNR增益数据，显示SNR增加1-2％。

[0160] 图5是显示存在1号SDA增强剂时Cy3.5-dT的信号强度增加的图，信号的亮度增加约15％。

[0161] 图6提供的数据显示，当存在1号SDA增强剂时，来自Cy5-dC的噪声降低大约10％。同样，图7显示了在这种SDA增强剂存在下，来自Cy3.5-dT的相似的噪声降低。

[0162] 该SDA增强剂也显示出增加了测序读数的整体准确度。图8显示了在不存在和存在1号SDA增强剂的情况下，包含用不同类型的荧光染料标记的脱氧核苷酸(每种不同核苷酸上不同的染料)的测序反应的测序读数的总体准确度度量。该SDA增强剂使测序数据的准确度提高了大约2-3％，这对于单分子测序反应来说是非常显著的增加。

[0163] 在一系列的后续实验中，进一步评估了这种SDA增强剂的SNR增加活性。滴定实验表明，该试剂的SNR增加活性在测序反应中从100μM到1mM有效，并且在该宽范围内对测序反应的动力学没有显示负面影响。

[0164] 然后，在之前已显示具有光保护活性的三重态猝灭剂(TSQ)存在下(参见美国专利8,834,847关于该光保护分子的详细描述)，在测序反应中测试1号SDA增强剂：

[0165]

[0166] 如上所述，在300μM、600μM和900μM的1号SDA增强剂存在下进行测序反应，并且滴定的TSQ量在0μM、300μM、600μM和900μM(因此总共进行12次反应)。我们意外地发现，仅包含该SDA增强剂对测序反应的准确度的增加(即相对于不含添加剂的对照反应)与既包含DQ123又包含TSQ的测序反应的准确度的增加一样多(数据未显示)。该实验显示，除了其SNR增加活性外，DQ-123还具有光保护活性。因此，不需要向含有SDA增强剂的反应中添加另一种光保护剂(例如TSQ)。

[0167] 实施例2:其他化合物的SDA增强活性的测试

[0168] 在如上所述进行的测序反应中测试其它化合物的SDA增强活性。下表2显示了在存在指定量的每种化合物的情况下测序反应结果的准确度的相对提高。如上所述，测序反应中SNR的提高和光保护效应的增加导致测序准确度(即通过已知序列的模板分子的单次测序的准确度)的提高。提供DQ-123作为阳性对照，并提供不含任何SDA增强剂的反应作为阴性对照。相对于阴性对照提供准确度。这些反应不含有任何额外的SNR增加或光保护化合物。

[0169] 表2：SDA增强剂存在下的相对测序准确度

[0170]

[0171] 1相对于在相同实验中进行的DQ123准确度的准确度。

[0172] 从上表清楚地看出，与不含SDA增强剂的反应(第一行)相比，在测序反应混合物中包含化合物1至28中的任一种改善了其准确度。因此，这些化合物中的每一种都包括在本文描述为本发明的SDA增强剂的化合物组中。

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